DE60209010T2

DE60209010T2 - Chimäre phagen

Info

Publication number: DE60209010T2
Application number: DE60209010T
Authority: DE
Inventors: Erwin Houtzager; Ton Logtenberg; Adriaan Cornelis DE KRUIF
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2001-06-15
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2022-06-15
Also published as: EP1402025B1; US20090017521A1; US7329530B2; US7901919B2; WO2002103012A1; NZ529465A; ATE317009T1; DE60209010D1; CA2449071A1; CA2449071C; DK1402025T3; EP1402025A1; ES2257560T3; US20050014261A1; AU2002345421B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Gebiete der Molekularbiologie und Immunologie. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf das Gebiet der Erzeugung von Helferphagen und von Phagen-Display-Bibliotheken zur Identifizierung von Bindungsmolekülen.
Hintergrund der Erfindung
Ein Individuum muss ein dynamisches Immunsystem haben, das sich schnell anpassen kann, um adäquat auf potentiell schädliche Mikroorganismen reagieren zu können und auf die Einflüsse einer mannigfaltigen und ständig wechselnden Umgebung reagieren zu können. Höhere Organismen haben spezialisierte molekulare Mechanismen entwickelt, um den Einsatz von klonal verteilten, mannigfaltigen Repertoires von Antigen-Rezeptor-Molekülen, die von Zellen des Immunsystems exprimiert werden, zu gewährleisten: Immunglobulin(Ig)-Moleküle auf B-Lymphocyten und T-Zell-Rezeptoren auf T-Lymphocyten. Ein primäres Repertoire von (im Allgemeinen niederaffinen) Ig-Rezeptoren wird während der B-Zell-Differenzierung im Knochenmark als Ergebnis der Neuanordnung von keimliniencodierten Gensegmenten etabliert. Die weitere Verfeinerung der Ig-Rezeptor-Spezifität und -Affinität erfolgt in peripheren lymphatischen Organen, wo antigenstimulierte B-Lymphocyten eine somatische Hypermutationsmaschinerie aktivieren, die spezifisch auf die variablen (V) Bereiche der Immunglobuline abzielt. Während dieses Vorgangs werden B-Zell-Klone mit mutanten Ig-Rezeptoren mit höherer Affinität zu dem auslösenden Antigen zur klonalen Vermehrung und Reifung zu antikörpersezernierenden Plasmazellen stimuliert (Übersicht in Berek und Milstein, 1987).
DNA-Rekombinationstechnik wird verwendet, um viele Aspekte der Vorgänge nachzubilden, die die Erzeugung und Selektion von natürlichen humanen Antikörperrepertoires beherrschen (Übersicht in Winter und Milstein, 1991; Vaughan et al., 1998). Der Aufbau großer Repertoires von Antikörperfragmenten (wie Fab-Fragmente oder Einzelketten-Fv-Fragmente, scFv), die auf der Oberfläche von filamentösen Phagenpartikeln exprimiert werden, und die Selektion solcher Phagen durch "Panning" mit Antigenen wurde als vielseitiges und schnelles Verfahren entwickelt, um Antikörper mit gewünschten Spezifitäten zu erhalten (Übersicht in Burton und Barbas, 1994). Eine anschließende Optimierung der Affinität von einzelnen Phagenantikörpern wurde erreicht, indem man Repertoires mutanter Antikörper der selektierten Phagen erzeugte und durch Selektion in Bezug auf die Bindung an das Antigen unter stringenteren Bedingungen auf Nachkommen mit höherer Affinität testete (Übersicht in Hoogenboom, 1994).
M13 und von M13 abgeleitete Phagen (zuweilen auch Viren genannt) sind filamentöse Phagen, die F-Pili tragende (F-positive) Escherichia-coli-(E. coli)-Zellen selektiv infizieren können. Im Phagengenom sind 11 Proteine codiert, während die Phagenhülle selbst aus 5 dieser Proteine besteht: Gen-3-, -6-, -7-, -8- und -9-(g3, g6, g7, g8 und g9)-Proteine, die an die (zirkuläre) einzelsträngige DNA (ssDNA) des viralen Genoms gebunden sind und diese schützen. Der Lebenszyklus des Virus kann in unterschiedliche Phasen unterteilt werden. Das g3-Protein (g3p) von M13-Phagen und M13-Derivaten umfasst drei funktionelle Domänen: D1, D2 und D3, die über zwei glycinreiche Linker miteinander verknüpft sind. Eine alternative Nomenklatur für g3p-Domänen wurde ebenfalls allgemein akzeptiert; D1, D2 und D3 werden dabei N1, N2 bzw. CT genannt. Die N-terminalen D1/D2-Bereiche treten in Wechselwirkung mit dem C-terminalen D3-Bereich, wie von Chatellier et al. (1999) unter Verwendung von mehreren Deletionsmutanten von g3p herausgefunden wurde. Da die Funktionalität einer D3-Domäne des Proteins für den Zusammenbau stabiler Phagen erforderlich ist, betrifft die Mutation einer weniger oder nicht infektiösen Mutante des Phagenhüllproteins vorzugsweise einen D3-Bereich des g3p oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder Analogon dieses D3-Bereichs. Die D3-Domäne bindet vermutlich an DNA innerhalb des Viruspartikels. Der Verlust der D3-Domäne führt funktionell zu seltenen phagenartigen Partikeln, die sehr lang und sehr zerbrechlich sind (Pratt et al., 1969; Crissman und Smith, 1984; Rakonjac und Model, 1998). Die D1- und die D2-Domäne treten vermutlich miteinander in Wechselwirkung, bis der Phage an die Bakterien bindet, während D1/D2 in bestimmten Stadien auch mit D3 in Wechselwirkung treten (Chatellier et al., 1999). Die Linker, die in g3p zwischen D1, D2 und D3 vorhanden sind, spielen anscheinend auch eine Rolle bei der Infektiosität des Phagenpartikels (Nilsson et al., 2000). Studien, in denen eine Protease-Spaltungsstelle zwischen D1 und D2 eingeführt wurde, zeigten, dass der Phagenpartikel nach der Spaltung nicht mehr infektiös war (Kristensen und Winter, 1998). Eine funktionelle Analyse von g3p zeigte, dass von den N-terminalen Bereichen von g3p die D1-Domäne für die Infektion essentiell ist. Ein Verlust dieser Domäne führt zu Phagen, die keine Bakterien infizieren können (Lubkowski et al., 1998; Nelson et al., 1981; Deng et al., 1999; Riechmann und Holliger, 1997; Holliger und Riechmann, 1997). Es hat sich gezeigt, dass die D2-Domäne auf dem Phagen mit der D1-Domäne von g3p in Wechselwirkung tritt (1). Aufgrund der Konkurrenz von Proteinen, die sich auf dem F-Pilus (auf F-positiven Bakterien) befinden und eine höhere Affinität zu D2 als zu D1 haben, dissoziieren die D1- und die D2-Domäne von g3p voneinander ab. Die Bindung von D2 an den F-Pilus führt zu einem Vorgang, der zum Rückzug des F-Pilus zur Zellmembran von E. coli führt. Aufgrund dieses Vorgangs kommt der Phagenpartikel in engen Kontakt mit der Bakterienmembran. Jetzt kann die dissoziierte D1-Domäne mit bakteriellen Proteinen, wie dem TolA-Rezeptor, in Wechselwirkung treten, was zur Einführung der Phagen-DNA in die E.-coli-Zelle führt (Lubkowski et al., 1999). Die Tatsache, dass die Entfernung der D2-Domäne die Infektion nicht verhindert, aber Phagen in die Lage versetzt, E. coli ohne F-Pili zu infizieren (Riechmann und Holliger, 1997; Deng et al., 1999), zeigt, dass die Anwesenheit der D2-Domäne die Spezifität erhöht und dass D2 eine wichtige Rolle bei der Verhinderung von Infektionen, die von F-Pili unabhängig sind, spielt. Die Bindung von D1 an die spezifischen Rezeptoren auf der Oberfläche der E.-coli-Zelle (ein Merkmal, das nicht F⁺-spezifisch ist) ist in 2 dargestellt. Dieser Vorgang löst die Injektion des viralen Genoms in das Bakterium aus (wie in 3 gezeigt ist). Obwohl der Verlust der D2-Domäne zur Bildung von Phagenpartikeln führt, die E. coli in etwas reduzierter spezifi scher Weise infizieren können, ist das Ausmaß der Infektionen durch eine solche Population von Phagen anscheinend erheblich reduziert. Nach der Infektion von E. coli durch einen Phagenpartikel wird die ssDNA des Virus aufgrund der Einwirkung von mehreren bakteriellen Enzymen doppelsträngig. Das doppelsträngige Phagengenom dient jetzt als Matrize für die Transcription und Translation aller 11 Gene, die sich auf dem Phagengenom befinden. Neben diesen proteincodierenden Bereichen enthält das Phagengenom auch einen intergenischen Bereich: den F1-Replikationsstartpunkt (F1-ORI). Die DNA-Sequenz dieses F1-ORI kann in 2 getrennte Teilbereiche unterteilt werden. Ein Teilbereich ist für die Einleitung und Beendigung der Synthese von ssDNA über den sogenannten "Mechanismus des rollenden Kreises" verantwortlich, und der andere Teilbereich ist für die Einleitung der Verpackung der gebildeten zirkulären ssDNA verantwortlich, die zur Bildung und Freisetzung neuer Viruspartikel führt.
Es hat sich gezeigt, dass Polypeptide, wie Stücke von Aminosäuren, Proteinteile oder auch ganze Proteine, mit Hilfe der Molekulargenetik an die terminalen Enden von mehreren Partikelhüllproteinen addiert werden können, ohne die Funktionalität dieser Proteine im Lebenszyklus des Phagen zu stören (Smith, 1985; Cwirla et al., 1990; Devlin et al., 1990; Bass et al., 1990; Felici et al., 1993; Luzzago et al., 1993).
Dieses Merkmal ermöglicht es Forschern, Peptide oder Proteine auf Phagen zu präsentieren, was zur Erzeugung von Peptid- oder Proteinexpressions-Phagen-Display-Bibliotheken führt. Eines der Proteine, die in der Technik zum Fusionieren mit Polypeptiden für Phagen-Display-Zwecke verwendet werden, ist das g3-Protein (g3p), bei dem es sich um ein Hüllprotein handelt, das für eine effiziente und effektive Infektion und anschließenden Eintritt des viralen Genoms in die E.-coli-Zelle erforderlich ist.
Für die Herstellung von Phagen, die mit dem g3p-Hüllprotein fusionierte Polypeptide präsentieren, führten auf diesem Gebiet bewanderte Forscher ein Plasmid zusammen mit dem Phagengenom in E.-coli-Zellen ein. Dieses Plasmid enthält einen aktiven Promotor stromaufwärts einer rastererhaltenden Fusion zwischen dem g3-codierenden Gen und einem interessierenden Gen (X), das zum Beispiel Polypeptide, wie Proteine, wie Antikörper oder Fragmente, wie Fab-Fragmente oder scFvs, codiert. Die Einführung dieses Plasmids zusammen mit dem Genom des Helferphagen in eine E.-coli-Zelle führt zur Erzeugung von Phagen, die auf ihrer Hülle entweder das Wildtyp-g3p aus dem viralen Genom, das Fusionsprodukt g3p-X aus dem Plasmid oder ein Gemisch der beiden enthalten, da ein Phagenpartikel fünf g3ps auf seiner Oberfläche trägt. Der Vorgang des Einbaus von g3p oder g3p-X erfolgt im Allgemeinen zufällig. Die Anwesenheit einer F1-ORI-Sequenz im g3p-X-Expressionsvektor (Plasmid) führt die Phagensynthesemaschinerie so in die Irre, dass zwei Arten von zirkulärer ssDNA gebildet werden: eine ist vom Genom des Phagen abgeleitet, und die andere ist vom Expressionsvektor abgeleitet. Während der Synthese von neuen Phagen ist die Maschinerie nicht in der Lage, den Unterschied zwischen diesen beiden Formen von ssDNA zu erkennen, was zur Synthese einer gemischten Population von Phagen führt, wobei ein Teil das Phagengenom enthält und ein Teil die Vektor-DNA beherbergt. Aufgrund dieser Vorgänge enthält das Gemisch wenigstens einige Phagen, bei denen die phänotypische Information auf der Außenseite (des g3p-X-Fusionsproteins) innerhalb der genotypischen Information im Innern des Partikels (dem g3p-X-Expressionsvektor) konserviert wird. Ein infektiöser Wildtypphage und ein Phage, der ein an g3P gebundenes Fusionsprotein trägt, sind in 4 abgebildet. Gemäß der einschlägigen Lehre gibt es mehrere Probleme, die die Verwendung dieser Grundanordnungen betreffen.
Der hohe Anteil der genotypischen Wildtypphagen in Phagenpopulationen, die in Bakterien gezüchtet wurden, die sowohl das Phagengenom als auch den Expressionsvektor enthalten, brachten Forscher dazu, mutante F1-ORI-Sequenzen in M13-Genomen zu entwerfen. Solche mutanten M13-Stämme sind in Bezug auf den Einbau ihres Genoms in Phagenpartikel während des Zusammenbaus der Phagen weniger effektiv, was zu einem erhöhten Prozentsatz an Phagen führt, die Vektorsequenzen enthalten, wenn sie coexprimiert werden. Diese mutanten Phagen, wie die kommerziell erhältlichen Stämme R408, VCSM13 und M13KO7, werden "Helferphagen" genannt. Das Genom dieser Helferphagen kann Gene enthalten, die erforderlich sind, um neue (Helfer-)Phagen in E. coli zusammen zubauen und anschließend neues F-Pili exprimierendes E. coli zu infizieren. Sowohl VCSM13 als auch M13K07 wurden mit einem Replikationsstartpunkt (ORI) des P15A-Typs versehen, der zur Vervielfältigung des viralen Genoms in E. coli führt. Außerdem gewährleistet die ORI-Einführung, dass das alte und das neu gebildete E. coli nach der Zellteilung wenigstens eine Kopie des viralen Genoms enthält.
Es wurde vorgeschlagen und schließlich von mehreren Forschern bewiesen, dass die Einführung von Plasmiden, die ein g3p-scFv-Fusionsprodukt zusammen mit dem Genom der Helferphagen enthalten, in E.-coli-Zellen zu ungefähr 99% neu gebildeter Phagen führt, die das g3p-scFv-Fusionsprotein-Expressionsplasmid beherbergen, denen aber die g3p-scFv-Fusion auf der Oberfläche fehlt (Beekwilder et al., 1999). Das Fehlen von g3p-X ist ein erheblicher Nachteil bei der Verwendung von Display-Bibliotheken für die Identifizierung von spezifischen Proteinen oder Peptiden, wie scFv, die an ein interessierendes Ziel (wie Tumorantigene) binden. Dies impliziert, dass im Falle von Phagen-Display-Bibliotheken in einem Experiment wenigstens ein 100facher Überschuss an produzierten Phagen verwendet werden muss, um eine Selektion mit allen möglichen anwesenden Fusionsproteinen durchzuführen. Gemäß der einschlägigen Lehre führt diese Überlastung mit relativ nutzlosen Phagen in einem Experiment zu (zu) vielen falsch positiven Ergebnissen. Zum Beispiel sollten bei einem Panning-Experiment wenigstens 10¹² Phagen hinzugefügt werden, damit 1 Kopie von jeder möglichen Fusion in dem Experiment vorhanden ist, da eine solche Bibliothek ungefähr 10¹⁰ verschiedene g3p-scFv-Fusionen (1%) enthält. Die Phagen in diesen ungefähr 1% exprimieren auf ihrer Hülle im Allgemeinen nur eine einzige g3p-scFv-Fusion zusammen mit vier normalen g3ps (keine Fusionen), während der Rest der Helferphagen (ungefähr 99%) fünf g3ps und keine g3p-scFv-Fusionen exprimiert. Um in einem Panning-Experiment theoretisch die Anwesenheit von 100 Kopien jedes einzelnen Fusionsproteins zu gewährleisten, muss man in einem solchen Experiment ungefähr 10¹⁴ Phagen verwenden. Der Fachmann versucht im Allgemeinen, einen wenigstens 100fachen Überschuss jedes einzelnen einzigartigen Fusionsproteins zu verwenden, um die Anwesenheit einer ausreichenden Anzahl jeder einzelnen Fusion zu gewährleisten und keine relevanten Bindungsmoleküle zu schnell in den ersten Panning-Durchläufen zu verlieren. Die Zahl der Phagen (10¹⁴) entspricht mehr oder weniger der Höchstzahl an Phagenpartikeln, die in einem Milliliter (ml) enthalten sein können. Die Viskosität einer solchen Lösung ist äußerst hoch, und daher ist sie relativ nutzlos. Insbesondere wenn ELISA-Panning-Strategien verwendet werden (bei denen das Volumen eines Napfes nur 200 μl beträgt), können solche Bibliotheken nicht verwendet werden.
Zusätzlich zu diesen Problemen wird angenommen, dass je nach dem Antigen und der Stringenz der Waschverfahren im Allgemeinen durchschnittlich einer von jeweils 10⁷ Phagen aufgrund von unspezifischer Bindung an das Antigen bindet. Für die Anwendung von 10¹² scFv-exprimierenden Ausgangsphagen (1%) auf ein Panning-Verfahren muss man also ungefähr 10¹⁴ Phagen hinzufügen (von denen 99% kein scFv-Fragment exprimieren). Es wird allgemein angenommen, dass von diesen 10¹² Phagen ungefähr 10⁴ Partikel mutmaßlich interessierende Phagen sein könnten. Je nach den Waschbedingungen betrug die Zahl der berechneten Hintergrundphagen, die man bei Verwendung von in der Technik vorhandenen Bibliotheken normalerweise nach einem Panning-Durchlauf findet, ungefähr 10⁶–10⁷, während nur wenige dieser Phagen relevante Bindungseigenschaften zu haben scheinen. Dies ist eines der wichtigsten Probleme, die man in der Technik erkannt hat: Nach dem ersten Panning-Durchlauf treten zu viele Hintergrundphagen als anfängliche Bindungsmoleküle im Phagengemisch auf, während nur wenige signifikante und interessierende Bindungsmoleküle in diesem Gemisch vorhanden sind. Daher ist die absolute Zahl von isolierten Phagen nach einem Panning-Durchlauf eindeutig zu hoch (10⁶–10⁷). Außerdem bleiben auch in anschließenden Panning-Durchläufen unspezifische Hintergrundphagen vorhanden. In Bibliotheken, die in der Technik verwendet werden, vermehren sich die meisten dieser unspezifischen Bindungsmoleküle bei der Vermehrung auf Bakterien und treten so weiterhin in einem zweiten Panning-Durchlauf auf. Daher sind gemäß der einschlägigen Lehre das Hintergrundniveau von unspezifisch bindenden Phagen und die Gesamtzahl der Phagen pro ml in diesen Typen von Bibliotheken unannehmbar hoch und bleibt auch in anschließenden Panning-Durchläufen hoch.
Eine Möglichkeit, die von einschlägigen Forschern als Lösung des Problems, dass man zu viele Hintergrundphagen erhält, denen eine g3p-X-Fusion fehlt, vorgeschlagen wurde, bestand darin, das g3p-codierende Gen ganz aus dem Helferphagengenom zu entfernen. Im Prinzip gewährleistet dieses System, dass während der Phagensynthese in einer E.-coli-Zelle (die das g3-lose Phagengenom und einen g3p-X-Fusionsprotein-Expressionsvektor erhielt) nur g3p-X-Proteine in die neu gebildete Phagenhülle eingebaut werden. Dadurch exprimiert jeder synthetisierte Phage fünf Kopien des g3p-X-Fusionsprodukts, und es werden kaum Phagen synthetisiert, die g3p allein exprimieren oder die weniger als fünf g3p-X-Fusionen exprimieren. R408-d3 und M13MDΔD3 sind zwei Beispiele für g3-negative Helferphagen (Dueñas und Borrebaeck, 1995; Rakonjac et al., 1997). Da das Genom dieser Phagen keine g3p-Synthese unterstützen kann, können kaum Phagenpartikel gebildet werden, die weniger als fünf g3p-X-Fusionsproteine tragen, oder wenn sie gebildet werden, erweisen sie sich aufgrund von Instabilität als nichtinfektiös, da gemäß der einschlägigen Lehre fünf g3ps notwendig sind, um einen stabilen Phagenpartikel zu gewährleisten.
In der Technik wurde anerkannt, dass zur Herstellung von Helferphagen, die das g3-Gen nicht enthalten, aber dennoch infektiös sind und zur Erzeugung von Bibliotheken von Phagen, die fünf g3p-X-Fusionsproteine tragen, verwendet werden können und die keine Phagen mit weniger als fünf g3p-X-Fusionen umfassen, eine externe Quelle für g3p erforderlich ist. Eine solche Quelle kann ein Vektor ohne F1-ORI sein, der aber dennoch einen aktiven Promotor stromaufwärts des vollen offenen Leserasters (ORF) von g3 enthält. Ein Hauptproblem, das vom Fachmann anerkannt wird, besteht darin, dass die Ausbeute nach dem Erzeugungsschritt zur Produktion neu gebildeter Helferphagen, denen ein g3-Gen fehlt, drastisch gering ist. Tatsächlich liegt die Ausbeute aller beschriebenen Systeme unter 10¹⁰ Phagen pro Liter, was bedeutet, dass für eine Bibliothek von 10¹⁰ einzelnen Klonen wenigstens 100 Liter Helferphagenkultur notwendig sind (NB: die Helferphagen müssen gereinigt werden), um die Bibliothek einmal zu kultivieren. Gemäß der einschlägigen Lehre sind also Phagenbibliotheken, die mit so geringen Titern von Helferphagen erzeugt werden, für Phagen-Display-Zwecke nicht geeignet, und daher können diese Bibliotheken nicht für Panning- Experimente verwendet werden. Ein Verfahren zur Komplementierung von g3p-Deletions-Phagen wurde vor kurzem vorgestellt; dabei wurde Wildtyp-g3p durch eine Nucleinsäure, die das Wildtyp-g3p codiert, bereitgestellt, wobei die Nucleinsäure stabil in das Wirtszellgenom eingebaut war (Rondot et al., 2001).
Phagen, die deletierte g3ps exprimieren, die mit heterologen Proteinen fusioniert sind, wurden erzeugt. Für den Aufbau der meisten herkömmlichen Fab-Bibliotheken und einiger scFv-Phagen-Display-Bibliotheken wurden die D1-Domäne und Teile der D2-Domäne entfernt, um ein kürzeres Fusionsprotein zu gewährleisten, das in der Technik als ein Produkt galt, das leichter translatiert werden konnte als ein g3p in voller Länge, das mit einem Fab-Fragment in voller Länge verknüpft ist. Der kürzere g3p-Teil würde die Erzeugung eines lebensfähigen und geeigneten Helferphagen nicht verhindern. Selbstverständlich sind solche Phagen noch von g3ps mit voller Länge abhängig, die für eine funktionelle Infektion von E.-coli-Zellen auf ihrer Oberfläche neben der deletierten g3p-Fusion mit dem Fab-Fragment vorhanden sind. Außerdem wurden Phagen erzeugt, die deletierte g3ps, die mit ligandenbindenden Proteinen fusioniert sind, exprimieren; ihre Infektionsfähigkeit hängt von Antigenen ab, die mit den Teilen von g3p fusioniert wurden, die im nichtinfektiösen Phagenpartikel fehlen (Krebber et al., 1997; Spada et al., 1997). Die Infektiosität dieser Partikel hängt von einer Wechselwirkung zwischen dem ligandbindenden Protein, wie einem Antikörper oder einem Fragment davon, und ihrem jeweiligen Liganden (oder Antigen) ab. Diese Wechselwirkungsabhängigkeit reduziert jedoch die Effizienz der Infektion aufgrund des Wegfalls einer direkten Verknüpfung zwischen den g3p-Domänen und einer allgemeinen hemmenden Wirkung des löslichen N-terminalen Teils von g3p, der mit dem Antigen gekoppelt ist.
Den oben genannten g3-negativen Helferphagen R408-d3 und M13MDΔD3 fehlt in ihrem Genom ein bakterieller ORI und ein Selektionsmarker. Das Fehlen eines Selektionsmarkers in den g3-negativen Genomen hat eine erhebliche Wirkung auf den Produktionsmaßstab von Helferphagen, da es zu einer Überwucherung mit Bakterien führt, die das Helferphagengenom nicht enthalten. Es ist bekannt, dass Bakterien langsamer wachsen, wenn sie mit dem Helferphagen oder Virus infiziert sind. Daher überwuchern Bakterien, denen das Phagengenom fehlt, schnell die anderen Bakterien, die das Genom enthalten. Eine weitere Wirkung des Fehlens eines ORI oder eines Selektionsmarkers besteht darin, dass in sich teilenden Bakterien während der Produktion und Expansion von Phagen-Display-Bibliotheken keine g3-negativen Phagengenome gehalten werden können. Dies ist ein sehr wichtiges negatives Merkmal, da eine Überwucherung mit Bakterien, die das Phagengenom verloren haben oder die nie eines erhielten, anscheinend einen Wachstumsvorteil gegenüber Bakterien hat, die das Phagengenom enthalten. Außerdem sind solche "leeren" Bakterien selbstverständlich auch nicht in der Lage, einen Phagen zu erzeugen, und daher sind die Phagen-Display-Vektoren, die Fusionsproteinfragmente enthalten, in solchen Helferphagen, denen Bakterien fehlen, permanent verloren.
Wie bereits erwähnt, sind die g3ps vermutlich essentiell für den Zusammenbau von stabilen M13-artigen Phagen, und wegen ihrer entscheidenden Rolle bei der Infektion sollten g3ps in sonstiger Weise bereitgestellt werden, wenn g3-negative Helferphagen erzeugt werden sollen. In der Technik gibt es ein Vorurteil gegen die Herstellung von Phagen-Display-Bibliotheken, denen g3ps fehlen, da Phagen, denen g3ps fehlen, nicht stabil sind. Rakonjac et al. (1997) konstruierten einen g3-negativen Helferphagen VCSM13 parallel zu einem g3-negativen Helferphagen R408 und verendeten Helferplasmide mit entweder dem psp- oder dem lac-Promotor stromaufwärts einer g3-Sequenz mit voller Länge, so dass g3 während der Helferphagensynthese substituiert wurde (Model et al., 1997). Gemäß der einschlägigen Lehre hat der lac-Promotor jedoch den Nachteil, dass er nicht vollständig abgeschaltet werden kann, auch nicht in Gegenwart von hohen Konzentrationen an Glucose (3–5%) im Medium (Rakonjac und Model, 1998). Ein zusätzliches Problem, das in der Technik wohlbekannt ist, besteht darin, dass auch sehr geringe Konzentrationen von g3p in E. coli die Infektion von M13-artigen Phagen blockieren können. Außerdem hat sich gezeigt, dass eine gemeinsame Verkapselung von Plasmiden zusammen mit dem Phagengenom auftreten kann (Russel und Model, 1989; Krebber et al., 1995; Rakonjac et al., 1997). Wenn eine gemeinsame Verkapselung mit dem lac-gesteuerten Helferplasmid erfolgt, konkurriert sie mit den lac-gesteuerten Vektoren, die im Phagen-Display verwendet werden, was zur effizienten Produktion von infektiösen Phagenpartikeln führt, die das g3p-X-Fusionsprodukt nicht enthalten. Alles in allem ist der lac-Promotor gemäß der einschlägigen Lehre also nicht der beste in Frage kommende Promotor im Helferplasmidsystem. Der psp-Promotor hat den Vorteil, in E. coli bis zur Infektion relativ inaktiv zu sein (Rakonjac et al., 1997). Nach Infektion mit einem Phagen der M13-Klasse wird der psp-Promotor aktiviert, und jetzt erzeugt das Helferplasmid g3-Proteine. Der Nachteil dieses Promotors besteht jedoch darin, dass das Ausmaß der RNA-Produktion nicht durch externe Faktoren reguliert werden kann, sondern entweder durch Mutierenlassen (und Ändern der Aktivität) des Promotors oder durch Ändern der ribosomalen Bindungsstelle (RBS) oder anderer Elemente, die die Promotoraktivität beeinflussen, reguliert werden muss. Das ideale Niveau der Promotoraktivität in einem speziellen E.-coli-Stamm herauszufinden, kann zeitraubend sein, und es muss für jeden E.-coli-Stamm getrennt optimiert werden. Gemäß der einschlägigen Lehre ist das psp-Promotorsystem auch aufgrund der Inflexibilität von E.-coli-Stämmen, der zeitraubenden Optimierung und des signifikant niedrigen Niveaus der Helferphagenproduktion für eine Produktion von Helferphagen in großem Maßstab nicht sehr attraktiv.
Ein erhebliches problematisches Merkmal aller beschriebenen Helferphagensysteme ist das Auftreten unerwünschter Rekombinationsereignisse zwischen dem Helfergenom und den (Helfer-)Plasmiden. Das Problem, dem sich einschlägige Forscher gegenübersehen, besteht darin, dass die g3-DNA-Sequenzen in den Helferphagen zu den g3-Sequenzen im Phagen-Display-Vektor und/oder im Helferphagenplasmid homolog sind. Dies führt in vielen Fällen zu einer Rekombination zwischen den beiden DNA-Stämmen und daher zu einem Verlust der Funktionalität der Bibliothek als Ganzes.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einige der oben beschriebenen, aus der Technik bekannten Probleme und Nachteile betreffend die Erzeugung von Phagenpartikeln und Helferphagen, die Verwendung von Helferphagen bei der Produktion von Phagen-Display-Bibliotheken und die Probleme und Nachteile, die für die Identifizierung von relevanten Bindungsmolekülen unter Verwendung solcher Bibliotheken bekannt sind, anzugehen.
Kurzbeschreibung der Figuren
1. Schematische Darstellung des g3-Proteins (g3p), das in der Hülle von M13-Phagen vorhanden ist. Die D3-Domäne von g3p ist über das g8-Protein (g8p) mit der einzelsträngigen DNA innerhalb des Partikels verknüpft, während die D1- und D2-Domänen außerhalb des Partikels miteinander in Wechselwirkung treten und für die Fusion zum Beispiel mit scFv verwendet werden können.
2. Schematische Darstellung der Wechselwirkung zwischen der D2-Domäne von g3p und dem F-Pilus auf der Oberfläche von E. coli mit anschließender Wechselwirkung der D1-Domäne mit anderen Komponenten der bakteriellen Oberfläche.
3. Schematische Darstellung der Wechselwirkung der D2-Domäne von g3p mit dem F-Pilus (links) und der D1-Domäne von g3p mit dem TolA-Rezeptor (siehe 2) und des anschließenden Eintritts (rechts) des Phagengenoms in das Cytoplasma des Bakteriums.
4. Schematische Darstellung eines Wildtypphagen, der an seinem infektiösen Ende fünf g3ps exprimiert (links), und eines rekombinanten Phagen, der an seinem infektiösen Ende vier Wildtyp-g3ps und ein g3p-X-Fusionsprotein exprimiert (rechts). Der rekombinante Phage beherbergt auch die genetische Information des auf der Oberfläche vorhandenen Fusionsproteins.
5. Schematische Darstellung des pBAD/gIII-g3-Helfervektors, der das g3-Gen in voller Länge unter der Kontrolle des AraC/BAD-Promotors beherbergt und weiterhin ein Ampicillin-Resistenz-Gen und einen ColE1-Replikationsstartpunkt (ORI) beherbergt.
6. (A) Schematische Darstellung des VCSM13-Helferphagengenoms. Die 11 Gene sowie das Kanamycin-Resistenz-Gen (KanR), das Verpackungssignal (PS) und das große und das kleine Fragment des ursprünglichen intergenischen Bereichs (IG) sind angezeigt. (B) Sequenz des in (A) gezeigten VCSM13-Genoms. Die Translation des g3-Gens ist im Ein-Buchstaben-Code angegeben. (C) Schematische Darstellung des von VCSM13 abgeleiteten g3-negativen Helferphagengenoms, aus dem das offene Leseraster (ORF) des g3-Gens deletiert wurde. (D) Sequenz des Teils des Helferphagengenoms, der die Position der in (C) abgebildeten g3-Deletion umgibt. Die HindIII-Stelle auf Position 3431 ist unterstrichen, und danach folgen die 6 halbfett gedruckten Codons stromaufwärts des TAA-Stopcodons.
7. (A) Schematische Darstellung des von VCSM13 abgeleiteten D3-Helferphagengenoms, aus dem die D1- und die D2-Domäne des g3-Gens deletiert sind. Der D3-Teil des g3-Gens codiert den carboxyterminalen Teil des g3-Proteins, der die Erzeugung von stabilen, aber im Wesentlichen nichtinfektiösen Helferphagen ermöglicht. Das D3-Helferphagengenom ist mit dem CT-Helferphagengenom identisch. (B) Sequenz der D3-Domäne von g3, die in der in (A) gezeigten Nucleinsäure vorhanden ist. Die BamHI-Stelle auf Position 3488 sowie das GTG-Start- und das TAA-Stopcodon sind unterstrichen.
8. Anpassung der Codonverwendung im g3-Gen und der D3-Domäne, um eine homologe Rekombination während der Helferphagenproduktion und während der Amplifikation der Phagen-Display-Bibliothek zu verhindern. Die linke Spalte zeigt die erhaltenen Aminosäuren im Ein-Buchstaben-Code, und die rechte Spalte zeigt die optimalen Codons.
9. Schematische Darstellung des pUC-g3-Helferplasmids, der das g3-Gen in voller Länge unter der Kontrolle des lac-Promotors beherbergt und weiterhin ein Ampicillin-Resistenz-Gen (AmpR) und einen ColE1-Replikationsstartpunkt (ORI) beherbergt.
10. Schematische Darstellung des von VCSM13 abgeleiteten N2CT-Helferphagengenoms, aus dem die N1(D1)-Domäne des g3-Gens, die dem Phagen Infektiosität verleiht, deletiert wurde.
11. Schematische Darstellung des von VCSM13 abgeleiteten p3-negativen Helferphagengenoms, das die g3-Leadersequenz exprimiert, auf die nur sieben Aminosäuren folgen. Auf dem DNA-Niveau sind ein großer Teil der N2(D2)-Domäne und die gesamte CT(D3)-Domäne noch vorhanden. Der frühere C-terminale Bereich von Gen III ist vorhanden, codiert aber wegen Rasterverschiebung kein funktionelles Protein und beinhaltet daher viele ins Raster passende Stopcodons.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Mittel bereit, die im Wesentlichen nicht die oben skizzierten Nachteile aufweisen und die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie neue Phagenpartikel, wie chimärische Phagen, neue Helferphagen, Bibliotheken, die die chimärischen Phagen umfassen, sowie Verfahren und Mittel zur Herstellung der chimärischen Phagen und der Helferphagen liefern.
Die Erfindung stellt einen chimärischen Phagen bereit, der eine Hülle aufweist, die ein Gemisch von Proteinen umfasst, wobei das Gemisch ein Fusionsprotein umfasst, bei dem ein proteinartiges Molekül mit einer funktionellen Form eines Phagenhüllproteins fusioniert ist, wobei das Gemisch weiterhin eine mutante Form des Phagenhüllproteins umfasst, wobei die Bindung der mutanten Form an einen Wirtszellrezeptor beeinträchtigt ist. Die Erfindung stellt auch einen chimärischen Phagen bereit, der eine Hülle aufweist, die ein Gemisch von Proteinen umfasst, wobei das Gemisch ein Fusionsprotein umfasst, bei dem ein proteinartiges Molekül mit einem Phagenhüllprotein oder einem Fragment oder Derivat davon fusioniert ist, und wobei das Fusionsprotein funktionsfähig in Bezug darauf ist, dass es den chimärischen Phagen infektiös macht, wobei das Gemisch weiterhin eine mutante Form des Phagenhüllproteins umfasst, wobei die Bindung der mutanten Form an einen Wirtszellrezeptor beeinträchtigt ist.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung einen Helferphagen bereit, der eine Nucleinsäure umfasst, die Phagenproteine oder funktionelle Äquivalente davon codiert, die für den Zusammenbau des Helferphagen wesentlich sind, wobei die Nucleinsäure weiterhin eine mutante Form eines Phagenhüllproteins codiert, wobei die Bindung der mutanten Form an einen Wirtszellrezeptor beeinträchtigt ist und wobei der Helferphage keine Nucleinsäure umfasst, die eine funktionelle Form des Phagenhüllproteins codiert.
Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren und Mittel bereit, um Phagenpartikel, chimärische Phagen, infektiöse Phagen und Helferphagen gemäß der Erfindung herzustellen. Die Erfindung stellt auch Phagensammlungen bereit, wie Phagen-Display-Bibliotheken, die chimärische Phagen und/oder infektiöse Phagen gemäß der Erfindung umfassen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen chimärischen Phagen bereit, der eine Hülle aufweist, die ein Gemisch von Proteinen umfasst, wobei das Gemisch ein Fusionsprotein umfasst, bei dem ein proteinartiges Molekül mit einer funktionellen Form eines Phagenhüllproteins fusioniert ist, wobei das Gemisch weiterhin eine mutante Form des Phagenhüllproteins umfasst, wobei die mutante Form dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die die mutante Form und keine Kopien der funktionellen Form umfasst, weniger infektiös ist als ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die die mutante Form sowie wenigstens eine Kopie der funktionellen Form umfasst. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die mutante Form dadurch gekennzeichnet, dass ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der die mutante Form und keine Kopien des Fusionsproteins trägt, weniger infektiös ist als ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der zusätzlich zu der mutanten Form wenigstens eine Kopie des Fusionsproteins trägt. Vorzugsweise ist die mutante Form dadurch gekennzeichnet, dass ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der die mutante Form und keine Kopien des Fusionsproteins oder der funktionellen Form trägt, nichtinfektiös ist. Besonders bevorzugt ist die mutante Form weiter dadurch gekennzeichnet, dass ein Phage, der eine Hülle aufweist, die die mutante Form in Anwesenheit oder Abwesenheit von Kopien der funktionellen Form umfasst, stabil ist. "Stabil", wie der Ausdruck hier verwendet wird, bedeutet, dass der Teil von g3p, der in der mutanten Form noch vorhanden ist (und der auch in der funktionellen Form vorhanden ist), Merkmale wie DNA-Bindung und Steifigkeit des Phagen gewährleistet, aber nicht zur Infektiosität des Phagen beiträgt wie die Domänen in der funktionellen Form, die in der mutanten Form nicht vorhanden sind. Die Erfindung stellt auch einen infektiösen Phagen bereit, der wenigstens eine Kopie einer mutanten Form eines Phagenhüllproteins enthält, wobei die mutante Form die Fähigkeit, die Infektion eines natürlichen Wirts durch den infektiösen Phagen zu vermitteln, verloren hat.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Phagenhüllprotein das g3-Protein (g3p), das in der Hülle von Phagen wie M13 und R408 vorhanden ist. Besonders bevorzugt umfasst die mutante Form eine Mutation im D1- und/oder D2-Bereich von g3p. In einem anderen bevorzugten Aspekt der Erfindung sind der chimärische Phage und/oder der infektiöse Phage Bestandteil einer Phagensammlung, wie einer Phagen-Display-Bibliothek. In einem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung besteht eine solche Phagensammlung im Wesentlichen aus chimärischen Phage oder infektiösen Phagen, die durch die Erfindung bereitgestellt werden. Ebenso bevorzugt sind chimärische Phagen oder infektiöse Phagen gemäß der Erfindung, die bindende Struktureinheiten, wie Antikörper oder Fragmente davon, als Bestandteil des Fusionsproteins umfassen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Phagenpartikels bereit, das die folgenden Schritte umfasst: das Versehen einer Wirtszelle mit einer ersten Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein codiert, wobei das Fusionsprotein ein proteinartiges Molekül umfasst, das mit einer funktionellen Form eines Phagenhüllproteins fusioniert ist, das Versehen der Wirtszelle mit einer zweiten Nucleinsäure, die eine mutante Form des Phagenhüllproteins codiert, wobei die mutante Form dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die die mutante Form und keine Kopien der funktionellen Form umfasst, weniger infektiös ist als ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die die mutante Form sowie wenigstens eine Kopie der funktionellen Form umfasst, und wobei die Wirtszelle eine zusätzliche Nucleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens alle anderen Proteine oder funktionellen Äquivalente davon codiert, die für den Zusammenbau des Phagenpartikels in der Wirtszelle wesentlich sind, und das Kultivieren der Wirtszelle, so dass der Phagenpartikel zusammengebaut werden kann. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Phagenpartikels bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: das Versehen einer Wirtszelle mit einer ersten Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein codiert, wobei das Fusionsprotein ein proteinartiges Molekül umfasst, das mit einer funktionellen Form eines Phagenhüllproteins fusioniert ist, das Versehen der Wirtszelle mit einer zweiten Nucleinsäure, die eine mutante Form des Phagenhüllproteins codiert, wobei die Bindung der mutanten Form an einen Wirtszellrezeptor beeinträchtigt ist, und das Kultivieren der Wirtszelle, so dass der Phagenpartikel zusammengebaut werden kann. Vorzugsweise werden diese Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Phagenpartikels angewendet, um den chimärischen Phagen und/oder den infektiösen Phagen herzustellen. Besonders bevorzugt wird das Verfahren angewendet, um einen Phagenpartikel, wie einen chimärischen Phagen oder einen infektiösen Phagen herzustellen, der durch die Erfindung bereitgestellt wird und der Nucleinsäure umfasst, die die mutante Form unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, wie des AraC/BAD-Promotors, des lac-Promotors oder des psp-Promotors, codiert.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Helferphagen bereit, der eine Nucleinsäure umfasst, die Phagenproteine oder funktionelle Äquivalente davon codiert, die für den Zusammenbau des Helferphagen wesentlich sind, wobei die Nucleinsäure weiterhin eine mutante Form eines Phagenhüllproteins codiert, wobei die mutante Form dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die die mutante Form und keine Kopien einer funktionellen Form des Phagenhüllproteins umfasst, weniger infektiös ist als ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die wenigstens eine Kopie der funktionellen Form umfasst, wobei die funktionelle Form dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Phagenpartikel, der die funktionelle Form in seiner Hülle trägt, infektiös macht, und wobei der Helferphage keine exprimierbare Nucleinsäure umfasst, die die funktionelle Form codiert. Die Erfindung stellt einen Helferphagen bereit, der eine Nucleinsäure umfasst, die Phagenproteine oder funktionelle Äquivalente davon codiert, die für den Zusammenbau des Helferphagen wesentlich sind, wobei die Nucleinsäure weiterhin eine mutante Form eines Phagenhüllproteins codiert, wobei die Bindung der mutanten Form an einen Wirtszellrezeptor beeinträchtigt ist, und wobei der Helferphage keine Nucleinsäure umfasst, die eine funktionelle Form des Phagenhüllproteins codiert.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Helferphagen bereit, das die folgenden Schritte umfasst: das Versehen einer Wirtszelle mit einer ersten Nucleinsäure, die eine funktionelle Form eines Phagenhüllproteins codiert, das Versehen der Wirtszelle mit einer zweiten Nucleinsäure, die eine mutante Form des Phagenhüllproteins codiert, wobei die mutante Form dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die die mutante Form umfasst, weniger infektiös ist als ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die wenigstens eine Kopie der funktionellen Form umfasst, wobei die Wirtszelle eine zusätzliche Nucleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens alle anderen Proteine oder funktionellen Äquivalente davon codiert, die für den Zusammenbau des Helferphagen in der Wirtszelle wesentlich sind, und das Kultivieren der Wirtszelle, so dass der Helferphage zusammengebaut werden kann. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Helferphagen bereit, das die folgenden Schritte umfasst: das Versehen einer Wirtszelle mit einer ersten Nucleinsäure, die eine funktionelle Form eines Phagenhüllproteins codiert, das Versehen der Wirtszelle mit einer zweiten Nucleinsäure, die eine mutante Form des Phagenhüllproteins codiert, wobei die Bindung der mutanten Form an einen Wirtszellrezeptor beeinträchtigt ist, wobei die Wirtszelle eine zusätzliche Nucleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens alle anderen Proteine oder funktionellen Äquivalente davon codiert, die für den Zusammenbau des Helferphagen in der Wirtszelle wesentlich sind, und das Kultivieren der Wirtszelle, so dass der Helferphage zusammengebaut werden kann.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren und Mittel bereit, um einen Phagenpartikel, wie einen chimärischen Phagen, einen infektiösen Phagen oder einen Helferphagen gemäß der Erfindung herzustellen, wobei getrennte Nucleinsäuren, die entweder (1) eine funktionelle Form des Phagenhüllproteins allein oder mit einem proteinartigen Molekül fusioniert oder (2) eine mutante Form des Phagenhüllproteins codieren, jeweils Codons in den überlappenden Bereichen zwischen den proteincodierenden Teilen umfassen, die im Wesentlichen kein Ereignis der homologen Rekombination zwischen den getrennten Nucleinsäuren verursachen. In einem bevorzugten Aspekt umfassen die getrennten Nucleinsäuren jeweils einander nicht störende Replikationsstartpunkte und einzigartige Selektionsmarker.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung eines ersten Partners eines Bindungspaars in einem Repertoire aus ersten Partnern von Bindungspaaren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Einzelketten-Fv-Fragment, einem Fab-Fragment, einem variablen Bereich, einem CDR-Bereich, einem Immunglobulin oder einem funktionellen Teil davon besteht, wobei der erste Partner des Bindungspaars spezifisch für einen zweiten Partner des Bindungspaars ist, bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: das In-Kontakt-Bringen einer Phagensammlung, die chimärische oder infektiöse Phagen gemäß der Erfindung umfasst, mit Material, das den zweiten Partner des Bindungspaars umfasst, unter Bedingungen, die eine spezifische Bindung ermöglichen, das Entfernen von unspezifischen Bindungsmolekülen, und das Gewinnen von spezifischen Bindungsmolekülen, wobei die spezifischen Bindungsmoleküle den ersten Partner des Bindungspaars umfassen. Das Material kann zweite Partner von Bindungspaaren, wie gereinigte Proteine, rekombinante Proteine und/oder in oder auf Zellen vorhandene Proteine, umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung eines ersten Partners eines Bindungspaars bereit, wobei das Verfahren weiterhin die folgenden Schritte umfasst: Gewinnen einer DNA-Sequenz, die den ersten Partner des Bindungspaars codiert, aus einem Phagen, das Subklonieren der DNA-Sequenz in einem geeigneten Expressionsvektor, das Exprimieren der DNA-Sequenz in einem geeigneten Wirt und das Kultivieren des geeigneten Wirts unter Bedingungen, bei denen der erste Partner des spezifischen Bindungspaars produziert wird. Ein geeigneter Expressionsvektor kann ein Plasmidvektor sein, der einen aktiven Promotor umfasst, welcher die Expression des ersten Partners des spezifischen Bindungspaars in geeigneten Wirten, wie eukaryontischen Zellen, wie Hefezellen oder Säugerzellen, reguliert.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Sequenz umfasst, die eine mutante Form eines Phagenhüllproteins codiert, wobei die mutante Form dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die die mutante Form und keine funktionelle Form des Phagenhüllproteins umfasst, weniger infektiös ist als ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die die mutante Form sowie wenigstens eine Kopie der funktionellen Form des Phagenhüllproteins umfasst, wobei die funktionelle Form dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Phagen, der die funktionelle Form in seiner Hülle trägt, infektiös macht. Das Nucleinsäuremolekül kann weiterhin alle relevanten Nucleinsäuren umfassen, die Proteine codieren, welche für den Zusammenbau eines Phagen in einer Wirtszelle erforderlich sind.
Die Erfindung stellt einen chimärischen Phagen bereit, der eine Hülle aufweist, die ein Gemisch von Proteinen umfasst, wobei das Gemisch ein Fusionsprotein umfasst, bei dem ein proteinartiges Molekül mit einer funktionellen Form eines Phagenhüllproteins fusioniert ist, wobei das Gemisch weiterhin eine mutante Form des Phagenhüllproteins umfasst, wobei die mutante Form dadurch gekenn zeichnet ist, dass ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die die mutante Form des Phagenhüllproteins und keine Kopie oder Kopien der funktionellen Form des Phagenhüllproteins umfasst, weniger infektiös ist als ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die wenigstens eine funktionelle Form des Phagenhüllproteins umfasst. Der hier verwendete Ausdruck "funktionelle Form" bezieht sich auf ein Phagenhüllprotein, das erheblich zur Infektiosität des Partikels beiträgt, an den es gebunden ist. Das Phagenhüllprotein selbst ist nicht infektiös, aber die funktionelle Form macht den Phagenpartikel, an den sie gebunden ist, infektiös. Neben dem Beitrag zur Infektiosität des Phagenpartikels unterstützt das Phagenhüllprotein auch andere Funktionen, wie die Stabilisierung des Phagenpartikels. Eine mutante Form eines Phagenhüllproteins gemäß der Erfindung kann den Phagenpartikel weniger infektiös oder nichtinfektiös machen, sollte aber immer noch andere Funktionen des Phagenhüllproteins, wie die Stabilisierung des Phagen, unterstützen. Ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der keine funktionellen Formen des Phagenhüllproteins umfasst, sondern nur mutante Formen des Phagenhüllproteins umfasst, ist weniger infektiös als ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine oder mehrere funktionelle Formen des Phagenhüllproteins neben den mutanten Formen des Phagenhüllproteins in seiner Hülle umfasst. Der hier verwendete Ausdruck "weniger infektiös" kann auch nichtinfektiös bedeuten. Obwohl ein chimärischer Phage der Erfindung wenigstens eine Kopie der mutanten Form des Phagenhüllproteins in seiner Hülle umfasst, besitzt der chimärische Phage Infektionsfähigkeit, da er auch wenigstens eine funktionelle Form des Phagenhüllproteins in seiner Hülle umfasst. Der hier verwendete Ausdruck "funktionelle Form eines Phagenhüllproteins" bedeutet auch einen Teil, ein Derivat und/oder ein Analogon davon, das noch insofern Funktionalität beinhaltet, als es den Phagen, an den es gebunden ist, infektiös macht. Der hier verwendete Ausdruck "mutante Form eines Phagenhüllproteins" bedeutet auch einen Teil, ein Derivat und/oder ein Analogon der mutanten Form, wobei die mutante Form dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Phage, der kein Wildtyp- Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die nur mutante Formen des Phagenhüllproteins oder Teile, Derivate und/oder Analoga davon umfasst, weniger infektiös oder nichtinfektiös ist im Vergleich zu einem Phagen, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die wenigstens eine funktionelle Form des Phagenhüllproteins umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Phagenhüllprotein das g3-Protein (g3p), das in einer Wildtyp- oder funktionellen Form einen Phagen, an den es gebunden ist, infektiös macht. Wie in 2 und 3 skizziert ist, sind bestimmte Teile des g3-Proteins an der Erkennung von Wirtszellrezeptoren beteiligt. Die Rezeptorbindung einer mutanten Form ist "beeinträchtigt", wenn eine Veränderung im g3-Protein dafür sorgt, dass der Rezeptor vom g3-Protein oder Teilen davon in geringerem Maße erkannt und gebunden wird, als wenn keine Veränderung vorhanden ist. Daher bedeutet der hier verwendete Ausdruck "beeinträchtigt", dass das Hüllprotein, wie g3p, den Wirtszellrezeptor weniger effizient bindet oder dass g3p seine Fähigkeit, den Wirtszellrezeptor zu binden und/oder zu erkennen, vollständig verloren hat. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die mutante Form des Phagenhüllproteins eine Veränderung im g3-Protein, die aus einer Mutation im D1-Bereich, im D2-Bereich oder in beiden besteht. Der hier verwendete Ausdruck "Veränderung" oder "Mutation" bedeutet eine oder mehrere Punktmutationen, Abschnitte von Mutationen, Deletionen, Substitutionen, Ersetzungen und/oder Austausch von Teilen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Veränderung im g3-Protein eine Deletion im Wesentlichen des gesamten D1- und/oder D2-Bereichs. Diese Veränderung kann auch eine Substitution des deletierten g3-Proteinteils durch ein Protein oder Peptid bedeuten, das nicht zur Infektiosität des Helferphagen, des chimärischen Phagen, des infektiösen Phagen oder des Phagenpartikels beiträgt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst ein chimärischer Phage oder ein infektiöser Phage gemäß der Erfindung eine Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein codiert, bei dem ein proteinartiges Molekül mit einer funktionellen Form des Phagenhüllproteins fusioniert ist, wobei der chimärische Phage der Erfindung einen M13-, M13K07, VCSM13- oder R408-Stamm oder eine Mutante, ein Derivat oder einen analogen Stamm, die von einem dieser Stämme abgeleitet sind, umfasst. Ein proteinartiges Molekül gemäß der Erfindung ist mit der funktionellen Form des Phagenhüllproteins fusioniert und umfasst ein Protein wie eine ligandenbindende Struktureinheit oder ein Immunglobulin (wie einen Antikörper). Ein proteinartiges Molekül kann auch ein Peptid wie eine zufällige Sequenz von Aminosäuren oder eine nichtzufällige Sequenz von Aminosäuren bedeuten, wie ein Antikörperfragment oder Derivate davon (Fab-Fragment, Einzelketten-Fv-Fragment (scFv), variabler Bereich oder CDR-Bereich). Ein proteinartiges Molekül kann auch einen ersten Partner eines spezifischen Bindungspaars bedeuten oder kann Fusionen zwischen verschiedenen Arten von (Fragmenten von) Proteinen und/oder Fusionen zwischen (Fragmenten von) Proteinen und (statistischen oder nichtstatistischen) Peptiden, wie von Antikörpern erkannten Markern, bedeuten.
Ein chimärischer Phage der Erfindung hängt in Bezug auf die Infektion erheblich von der funktionellen Form des Phagenhüllproteins g3p und von der Anwesenheit eines Teils oder von Teilen des Phagenhüllproteins, die zur Infektiosität des Phagen beitragen, ab. Die mutante Form des Phagenhüllproteins ist in denjenigen Teilen des Phagenhüllproteins mutiert, die den Phagen infektiös machen. Beispiele für die Mutation sind unter anderem Deletionen, Substitutionen von Resten oder Fragmenten, Austausche und/oder Ersetzungen durch andere Proteinfragmente, die ihn weniger infektiös machen. Die Proteinfragmente können mit Phagenhüllproteinen oder Fragmenten davon verwandt sein oder auch nicht und sind im Wesentlichen nicht in der Lage, eine Infektion einer Wirtszelle durch den Phagenpartikel zu induzieren.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Phagensammlung bereit, die einen chimärischen Phagen oder einen infektiösen Phagen gemäß der Erfindung umfasst. Phagen der vorliegenden Erfindung sind insbesondere für die Erzeugung von Phagen-Display-Bibliotheken geeignet. Daher ist die Phagensammlung in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Phagen-Display-Bibliothek. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Phagensammlung im Wesentlichen aus chimärischen Phagen oder infektiösen Phagen der Erfindung. Ein proteinartiges Molekül, wie (statistische oder nichtstatistische) Sequenzen von Aminosäuren, Peptide, Proteinteile oder auch ganze Proteine, können mit den Phagenhüllproteinen fusioniert werden und einen ersten Partner eines spezifischen Bindungspaars bilden. Diese Fusion erfolgt typischerweise an den terminalen Enden des Hüllproteins. Die Addition beeinflusst die Funktion des Phagenhüllproteins typischerweise nicht. Außerdem stört sie häufig auch nicht die Funktion der addierten Struktureinheit. So ist es möglich, Bibliotheken zu erzeugen, die zum Beispiel verwendet werden können, um spezifische Bindungsmoleküle zu lokalisieren und zu klonieren. Solche Bibliotheken können Peptide oder größere Moleküle umfassen. Vorzugsweise umfassen die größeren Moleküle ein Protein, wie einen Antikörper oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder Analogon davon, wie schwere und/oder leichte Ketten eines Immunglobulinmoleküls in voller Länge oder Fragmente von Immunglobulinen, wie Fab-Fragmente, Einzelketten-Fv(scFv)-Fragmente, CDR-Bereiche, einzelne variable Bereiche und/oder Kombinationen der obigen.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Phagenpartikels bereit, das die folgenden Schritte umfasst: das Versehen einer Wirtszelle mit einer ersten Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein codiert, wobei das Fusionsprotein ein proteinartiges Molekül umfasst, das mit einer funktionellen Form eines Phagenhüllproteins oder einem funktionellen Teil, Derivat und/oder Analogon des Phagenhüllproteins fusioniert ist, das Versehen der Wirtszelle mit einer zweiten Nucleinsäure, die eine mutante Form des Phagenhüllproteins codiert, wobei die mutante Form durch das oben beschriebene gekennzeichnet ist und wobei "weniger infektiös" auch nichtinfektiös bedeuten kann, und das Kultivieren der Zelle, so dass der Phage zusammengebaut werden kann, wobei die Wirtszelle ansonsten oder zusätzlich Nucleinsäuren umfasst, die wenigstens alle wesentlichen Proteine oder funktionelle Äquivalente der wesentlichen Proteine für den Zusammenbau des Phagenpartikels codieren. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem die Nucleinsäure, die wenigstens alle anderen Proteine oder funktionellen Äquivalente davon, die für den Zusammenbau des Phagenpartikels in der Wirtszelle wesentlich sind, codiert, aus einem Helferphagen besteht und der Helferphage verwendet wird, um die Nucleinsäure an die Wirtszelle abzugeben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nucleinsäure, die durch den Helferphagen abgegeben wird, auch die zweite Nucleinsäure, die die mutante Form des Phagenhüllproteins codiert. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform sind die erste und die zweite Nucleinsäure getrennte Nucleinsäuren, die jeweils getrennte einzigartige Selektionsmarker umfassen können, um zu gewährleisten, dass die Wirtszelle wenigstens eine Kopie von jeder getrennten Nucleinsäure umfasst und dass jede getrennte einzigartige Replikationsstartpunkte umfasst, um zu gewährleisten, dass es während der Replikation keine Störungen gibt. In einem anderen Aspekt der Erfindung ist die Zahl der möglichen homologen Rekombinationsereignisse zwischen überlappenden Stücken von Nucleinsäuresequenzen zwischen den getrennten Nucleinsäuren aufgrund der Verwendung unterschiedlicher Codons innerhalb jeder Nucleinsäure reduziert.
Unter Verwendung eines Verfahrens der Erfindung ist es möglich, Phagenpartikel zu erzeugen, die wenigstens zwei Varianten umfassen, die von demselben Hüllprotein abgeleitet sind. Solche Phagenpartikel wurden in der Technik bisher nicht verwendet. Gemäß der einschlägigen Lehre werden Phagenpartikel verwendet, die eine Hülle haben, die entweder deletierte g3-Proteine, mit heterologen Proteinen verknüpfte g3-Proteine, mit heterologen Proteinen verknüpfte deletierte g3-Proteine oder eine begrenzte Zahl von g3-Proteinen, aber keine Gemische davon enthält. Die vorliegende Erfindung stellt neue Phagenpartikel (chimärische Phagen, infektiöse Phagen und Helferphagen) bereit, bei denen die relative Zahl der in einer Hülle vorhandenen g3p-Varianten (mit einer heterologen Struktureinheit fusioniert oder auch nicht) variieren kann. Typischerweise möchte man die relative Menge der verschiedenen Varianten in der Phagenhülle beeinflussen. Zu diesem Zweck ist die Expression des Fusionsproteins und/oder die Expression der mutanten Form des Phagenhüllproteins vorzugsweise regulierbar (steuerbar). Vorzugsweise wird dies erreicht, indem man die Expression des Gens, das das Phagenhüllprotein codiert, auf dem Transcriptionsniveau reguliert. So steht die Expression des Fusionsproteins und/oder der mutanten Form des Phagenhüllproteins vorzugsweise unter der Kontrolle eines Promotors, der gut steuerbar ist. Beispiele für solche Promotoren sind der lac-Promotor, der psp-Promotor und der AraC/BAD-Promotor, wobei letzterer durch die Konzentration von Glucose oder Arabinose im Medium beeinflusst wird. Besonders vorteilhaft ist der AraC/BAD-Promotor. Der AraC/BAD-Promotor wird bevorzugt, weil es sich um einen Promotor handelt, der sich sehr genau steuern lässt. Dieser Promotor ist in Anwesenheit von Glucose für alle praktischen Zwecke inaktiv und in Abwesenheit von Glucose nur geringfügig aktiv. Dies bedeutet, dass eine geringe Konzentration oder die Abwesenheit von Glucose den Promotor aktiviert, was zur Hochregulation des interessierenden Gens führt, das sich unter der Kontrolle des Promotors befindet. Wenn zum Beispiel die Deletionsmutante von g3 (der die infektiösen Bereiche D1 und D2 fehlen) unter der Kontrolle eines solchen Promotors steht, wäre die relative Zahl von Deletionsmutanten im Vergleich zu g3-Fusionsproteinen der vollen Länge (oder wenigstens funktionellen g3-Fusionsproteinen) gering, wenn die Glucosekonzentration relativ hoch ist. Im Prinzip führt dieses System zu einer genauen Regulation der Anzahl der Deletionsmutanten und funktionellen Hüllproteine, wie g3, auf der Hülle eines Phagenpartikels, und daher kann der Prozentsatz solcher Hüllproteine und Deletionsmutanten reguliert werden. Außerdem kann die Aktivität des AraC/BAD-Promotors durch die Zugabe von Arabinose zum Medium sehr genau reguliert werden. Die verwendete Arabinosekonzentration bestimmt das Expressionsniveau des Proteins in E.-coli-Zellen. Daher wird eine optimale Regulation des Gehalts an Phagenhüllprotein erreicht, indem man diesen AraC/BAD-Promotor verwendet und die Kulturbedingungen der Wirtszelle verändert. Die Verwendung eines Promotors, der von Arabinose abhängt, wie der AraC/BAD-Promotor, anstatt von IPTG, wie das lac-Operon, verhindert mögliche Probleme, die aufgrund der gemeinsamen Verkapselung mit dem Helferplasmid in Viruspartikeln während der Helferphagensynthese auftreten. Wie oben beschrieben wurde, hat sich gezeigt, dass eine gemeinsame Verkapselung von Plasmiden mit dem Phagengenom erfolgt (Russel und Model, 1989; Krebber et al., 1995; Rakonjac et al., 1997). Wenn eine gemeinsame Verkapselung mit einem lac-gesteuerten Helferplasmid erfolgt, kann dieses mit den lac-gesteuerten Vektoren konkurrieren, die im Allgemeinen für das Phagen-Display verwendet werden, was zur Produktion von infektiösen Phagenpartikeln führt, die das g3p-X-Fusionsprodukt nicht enthalten. Dieses Problem tritt am wahrscheinlichsten dann nicht auf, wenn der AraC/BAD-Promotor verwendet wird. In den Studien, die durch die vorliegende Erfindung vorgestellt werden, wurden solche Konkurrenzprobleme mit dem lac-Promotor jedoch nicht beobachtet. Daher könne auch andere regulierbare Promotoren, wie der psp- und der lac-Promotor, verwendet werden, um Phagen gemäß der Erfindung zu erzeugen. Es ist daher auch Bestandteil der Erfindung, solche Promotoren als Alternative zum AraC/BAD-Promotor zu verwenden.
Ein Verfahren der Erfindung zur Herstellung eines Phagenpartikels wird vorzugsweise verwendet, um einen chimärischen Phagen gemäß der Erfindung herzustellen. Der Wirt kann mit jeder geeigneten Methode mit Nucleinsäure versehen werden, die ein Phagenprotein codiert. Vorzugsweise jedoch wird der Wirt mit einem Helferphagen gemäß der Erfindung versehen. Ein Helferphage gemäß der Erfindung umfasst Nucleinsäure, die andere Phagenproteine oder funktionelle Äquivalente davon, die für den Zusammenbau des Helferphagen wesentlich sind, codiert, wobei die Nucleinsäure weiterhin eine mutante Form eines Phagenhüllproteins codiert, wobei die mutante Form dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die mutante Formen des Phagenhüllproteins und keine funktionellen Formen des Phagenhüllproteins umfasst, weniger infektiös ist als ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die wenigstens eine funktionelle Form des Phagenhüllproteins umfasst, und wobei der Helferphage keine Nucleinsäure umfasst, die eine funktionelle Form des Phagenhüllproteins codiert. "Andere Phagenproteine" bedeutet andere als die funktionelle Form des Phagenhüllproteins und als die mutante Form des Phagenhüllproteins. Mit Nucleinsäure, die letztere codiert, kann die Wirtszelle in einer alternativen Weise versehen werden. Der Helferphage kann jedoch weiterhin Nucleinsäure umfassen, die die funktionelle Form des Phagenhüllproteins oder die mutante Form oder beide codiert. Vorzugsweise umfasst der Helferphage keine Nucleinsäure, die das Fusionsprotein codiert. Auf diese Weise ist der Helferphage gleichmäßig und kann verwendet werden, um Phagen zu produzieren, die präferentiell Nucleinsäure, die das Fusionsprotein codiert, in Abwesenheit von Nucleinsäure, die ein anderes erforderliches Helferphagenprotein codiert, umfassen. Somit werden das Fusionsprotein und die mutante Form des Phagenhüllproteins vorzugsweise von getrennten Nucleinsäuren codiert. Vorzugsweise umfasst jede der getrennten Nucleinsäuren einen einzigartigen Selektionsmarker. Vorzugsweise umfassen die getrennten Nucleinsäuren einander nicht störende Replikationsstartpunkte, wobei die Replikationsstartpunkte nicht miteinander konkurrieren, was zu Bakterienzellen führt, die die getrennten Nucleinsäuren für die Erzeugung von neuen Phagenpartikeln tolerieren.
Gemäß der einschlägigen Lehre ist es sehr schwierig, Chargen von Helferphagen zu erzeugen, bei denen die Helferphagen Nucleinsäure beherbergen, die alle wesentlichen Proteine codiert, die für den Zusammenbau eines Phagenpartikels in einer bakteriellen Wirtszelle erforderlich sind, und wobei der Nucleinsäure ein Gen, das g3p codiert, fehlt. Anschließend ist es gemäß der einschlägigen Lehre schwierig, unter Verwendung solcher Helferphagen Phagenbibliotheken zu produzieren. In der Technik sind mehrere Schwierigkeiten bekannt, die eine geeignete Erzeugung solcher Chargen von Helferphagen behindern. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Mittel sowie eine gute Kombination von Merkmalen, wie die Verwendung von spezifischen Replikationsstartpunkten, Selektionsmarkern und Codons in überlappenden DNA-Sequenzen bereit, die die Produktion von Phagenchargen ermöglichen, welche hohe Anteile von geeigneten Helferphagen enthalten und die anschließend für die Erzeugung von chimärischen oder infektiösen Phagen gemäß der Erfindung angewendet werden können. Daher stellt die Erfindung in einer Ausführungsform Verfahren und Mittel zur Herstellung von Helferphagen bereit, die funktionelle Formen und/oder Wildtypformen eines Phagenhüllproteins in ihrer Hülle tragen, denen aber dennoch Nucleinsäure fehlt, die für die funktionelle Form und/oder die Wildtypform des Phagenhüllproteins codiert. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Helferphagen bereit, das die folgenden Schritte umfasst: das Versehen einer Wirtszelle mit einer ersten Nucleinsäure, die eine funktionelle Form eines Phagenhüllproteins codiert, das Versehen der Wirtszelle mit einer zweiten Nucleinsäure, die eine mutante Form des Phagenhüllproteins codiert, wobei die mutante Form dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die mutante Formen des Phagenhüllproteins und keine Kopien der funktionellen Form umfasst, weniger infektiös ist als ein Phage, der kein Wildtyp-Phagenhüllprotein umfasst, von dem die mutante Form abgeleitet ist, und der eine Hülle aufweist, die wenigstens eine funktionelle Form des Phagenhüllproteins umfasst, und das Kultivieren der Wirtszelle, so dass der Helferphage zusammengebaut werden kann, wobei die Wirtszelle zusätzlich Nucleinsäure umfasst, die wenigstens alle anderen Proteine oder funktionellen Äquivalente davon codiert, die für den Zusammenbau des Helferphagen in der Wirtszelle wesentlich sind. Vorzugsweise ist das Phagenhüllprotein das g3-Protein, das in der Hülle der meisten, wenn nicht aller Bakteriophagen vorhanden ist. Vorzugsweise werden die anderen Proteine von der zweiten Nucleinsäure codiert, wobei die Expression der mutanten Form des Phagenhüllproteins und/oder die Expression der funktionellen Form reguliert wird, indem man die Kulturbedingungen der Wirtszelle verändert, und sie sich vorzugsweise unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, wie des AraC/BAD-, psp- und lac-Promotors, befindet, wie es oben beschrieben ist.
Man sagt, ein Phagenhüllprotein trage erheblich zur Infektiosität eines Phagen bei, wenn es nach Einbau in einen Phagen den Phagen in die Lage versetzt, in einer Weise, die mit einer Wildtypversion des Phagenhüllproteins vergleichbar ist, einen bakteriellen Wirt zu erkennen, zu binden und/oder zu infizieren. Die hier verwendeten Ausdrücke "weniger infektiös" oder "nichtinfektiös" beziehen sich auf einen Phagen, der keine funktionelle oder Wildtypform eines Phagenhüllproteins, vorzugsweise g3p, trägt und der im Vergleich zum Wildtypphagen (Partikel) eine erheblich beeinträchtigte, reduzierte Infektionsfähigkeit aufweist, was zum Beispiel in Plaque-Assays, die dem Fachmann wohlbekannt sind, bestimmt werden kann. Die hier verwendeten Ausdrücke "weniger infektiös" und "nichtinfektiös" können sich auch auf eine Abnahme der Wirtszellspezifität beziehen. Im Allgemeinen ist ein nichtinfektiöser Phage nicht in der Lage, eine Bakterienzelle zu erkennen, zu binden und/oder in sie einzutreten, wie es für Wildtypphagen in 2 und 3 skizziert ist, während ein weniger infektiöser Phage dies mit geringerer Effizienz kann. Vorzugsweise infiziert ein Phage, der mutante Formen aufweist, die Wirtszelle mit einer Effizienz, die kleiner als 50% ist im Vergleich zu einem Phagen, der wenigstens eine funktionelle Form trägt, besonders bevorzugt kleiner als 10%, ganz besonders bevorzugt kleiner als 1%, unter ansonsten vergleichbaren Bedingungen.
In Ausführungsformen, bei denen das Phagenhüllprotein ein g3p umfasst, umfasst die mutante Form vorzugsweise wenigstens einen strukturellen Teil, ein Derivat und/oder Analogon des D3-Bereichs. Der strukturelle Teil, das Derivat und/oder Analogon umfasst wenigstens die Funktionalität von g3p, den Zusammenbau von stabilen Phagenpartikeln zu ermöglichen.
Ein Derivat eines Proteins, wie der Ausdruck hier verwendet wird, umfasst dieselbe Aktivität wie das Protein, von dem das Derivat abgeleitet ist. Wenn das Protein eine funktionelle Form eines Phagenhüllproteins ist, umfasst das Derivat dieselbe Funktionalität. Wenn das Protein eine mutante Form eines Phagenhüllproteins ist, ist das Derivat ebenfalls eine mutante Form des Phagenhüllproteins. Wenn das Protein eine mutante Form eines Phagenhüllproteins ist, die einen Phagen, der nur mutante Formen des Phagenhüllproteins trägt, weniger infektiös macht, so ist das Derivat ebenfalls ein Phagenhüllprotein, das einen Phagen, der nur Derivate und/oder mutante Formen des Phagenhüllproteins trägt, weniger infektiös macht. Typische Derivate sind Proteine, die eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen umfassen. Derivate können jedoch auch Insertionen und/oder Deletionen umfassen. Weiterhin können Derivate auch Austausche von Aminosäuren oder von Sequenzen von Aminosäuren innerhalb desselben Proteins oder zwischen zwei oder mehr miteinander verwandten und/oder nicht miteinander verwandten Proteinen umfassen. Ein Analogon eines Proteins, wie der Ausdruck hier verwendet wird, umfasst im Wesentlichen dieselbe Aktivität wie das Protein, zu dem das Analogon analog ist. Wenn das Protein eine funktionelle Form eines Phagenhüllproteins ist, umfasst das Analogon dieselbe Funktionalität.
Vor der Erfindung war es schwierig, eine ausreichende Zahl von Helferphagen zu erzeugen, denen ein funktionelles g3-Gen oder ein Teil, Derivat und/oder Analogon davon in ihrem Genom fehlt, die aber dennoch in einem Infektionsdurchlauf bei E.-coli-Zellen infektiös sind. Der vorliegenden Erfindung gelingt es, solche Helferphagen effizient zu erzeugen. Solche Helferphagen tragen funktionelle Formen und/oder Wildtyp-g3-Proteine (g3ps) auf ihrer Oberfläche, aber dennoch fehlt ihnen eine Nucleinsäure, die die funktionelle Form und/oder das Wildtyp-g3-Protein codiert. Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren und Mittel bereit, um mit Hilfe solcher Helferphagen Bibliotheken zu erzeugen, die chimärische Phagen umfassen. Vorzugsweise werden Phagen-Display-Bibliotheken erzeugt. Besonders bevorzugt präsentieren Bibliotheken eine Vielzahl von Einzelketten-Fv(scFv)-Fragmenten. Unter Verwendung der Mittel und Verfahren der Erfindung können Phagenbibliotheken erzeugt werden, die eine Zahl von infektiösen Phagen enthalten, die im Vergleich zu der Zahl der nicht oder weniger infektiösen Phagen erheblich größer ist, als im Stand der Technik beschrieben und vorhanden. Gleichzeitig werden die Helferphagen, die zur Herstellung solcher Bibliotheken verwendet werden, (über einen Infektionsdurchlauf in E.-coli-Zellen) im Wesentlichen nichtinfektiös, da das g3-Gen in den Phagen nicht in einer zur Infektiosität beitragenden Form vorhanden ist. Nach der Infektion eines bakteriellen Wirts können sich diese Phagen also nicht auf andere Bakterienzellen ausbreiten, außer natürlich durch Teilung des bereits infizierten Wirtes zu Tochterzellen. Solche Bibliotheken werden daher ebenfalls durch die Erfindung bereitgestellt. Die erzeugten Bibliotheken sind besonders nützlich für Panning-Experimente, da die Titer von Phagen pro Milliliter erheblich höher sind, als sie bis zur vorliegenden Erfindung in der Technik verwendet wurden. Außerdem präsentieren Bibliotheken der Erfindung weniger unspezifische Klebrigkeit. Die Bibliotheken präsentieren also weniger falsch positive Ergebnisse als Bibliotheken im Stand der Technik. Außerdem können nach einem Durchlauf des Panning nur Phagen, die eine funktionelle Form auf ihrer Oberfläche präsentieren (vorzugsweise mit einem proteinartigen Molekül fusioniert), in E.-coli-Zellen vermehrt werden, während Phagen, die keine funktionellen Formen des Phagenhüllproteins tragen, sondern nur mutante Formen des Phagenhüllproteins tragen, im Wesentlichen nichtinfektiös sind und in E.-coli-Zellen nicht vermehrt werden können. Daher wird die Zahl der verbleibenden Phagen, die für einen zweiten Panning-Durchlauf verwendet werden können, erheblich reduziert. Infolge der Verwendung der chimärischen Phagen der Erfindung, die in den durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Bibliotheken vorhanden sind, nimmt die Zahl der Panning-Durchläufe ab, und die Zahl der relevanten Bindungsmoleküle wird viel effizienter erhalten, als es vor der vorliegenden Erfindung möglich war.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Nucleinsäuren und Helferphagen, die die Nucleinsäuren umfassen, welche genomische DNA-Sequenzen umfassen, bereit, wobei wenigstens die Domänen von g3p, die für die Infektion verantwortlich sind und zu dieser beitragen, funktionell entfernt sind. Die Erfindung stellt auch genomische Helferphagen-DNA bereit, bei der die Leadersequenz und wenigstens die D3-Domäne unberührt und miteinander fusioniert sind. Diese Nucleinsäuren beruhen vorzugsweise auf genomischen Sequenzen von VCSM13 und M13K07. Aufgrund des Fehlens einer funktionellen D1-Domäne sind Phagenpartikel, die durch diese Nucleinsäuren erzeugt wurden, im Wesentlichen nichtinfektiös. "Im Wesentlichen" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass keine Ausbreitung oder wenigstens erheblich weniger Ausbreitung der Phagen auf andere Bakterienzellen als das Produktionsbakterium durch infektiöse Merkmale, die von g3p geliefert werden, erfolgt. Dieses Fehlen einer Ausbreitung auf andere Bakterienzellen ist auf das Fehlen einer funktionellen Form von g3p zurückzuführen. Wenn während der Produktion eine Quelle für die Wildtypform oder funktionelle Form von g3p bereitgestellt wird, können die erzeugten Phagen ein Bakterium infizieren. Wenn das Bakterium jedoch infolge einer Infektion Phagen produziert, ist der resultierende Phagenpartikel nicht in der Lage, ein anderes Bakterium zu infizieren, es sei denn, dass wiederum während der Produktion eine Quelle für infektiöses g3p bereitgestellt wird. Ein chimärischer Phage oder ein infektiöser Phage der Erfindung umfasst vorzugsweise einen Teil von g3p, der nach einem Infektionsdurchlauf in E.-coli-Zellen die Erzeugung eines stabilen Phagenpartikels gewährleistet. Zu diesem Zweck umfasst der Helferphage vorzugsweise eine Nucleinsäure, die eine mutante Form des g3p codiert. Vorzugsweise umfasst die mutante Form D3 oder einen funktionellen Teil, ein Derivat und/oder ein Analogon davon.
Eine Phagen-Display-Bibliothek kann zum Beispiel erzeugt werden, indem man eine Sammlung von Bakterien mit einer Bibliothek von Nucleinsäuren versieht, die g3p codieren, das mit einer Reihe von verschiedenen proteinhaltigen Molekülen fusioniert ist, und die Bakterien mit Helferphagen der Erfindung infiziert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält eine Bibliothek von Phagen-Display-Partikeln, die mit diesen Helferphagen erzeugt wird, Phagen, die keinen infektiösen Teile von g3p auf ihrer Oberfläche tragen, und Phagen, die eine oder zwei g3p-X-Fusionen in voller Länge tragen, neben nichtinfektiösen oder weniger infektiösen Teilen von g3p-Deletionsproteinen. Phagen in diesen Bibliotheksgemischen, die keine g3p-X-Fusionsproteine exprimieren, können keine Bakterien mehr infizieren, da sie in Abwesenheit von infektiösen g3p-Teilen, die nicht mit X fusioniert sind, erzeugt wurden (X umfasst ein interessierendes proteinartiges Molekül oder einen interessierenden Fusionspartner, wie Immunglobuline oder Fragmente von Immunglobulinen, wie Fab-Fragmente oder scFv-Fragmente).
In einem Aspekt stellt die Erfindung Helferphagen bereit, die die Anwesenheit eines Selektionsmarkers mit der Anwesenheit eines bakteriellen Replikationsstartpunkts (ORI) kombinieren, um die beschriebenen Probleme bei der Produktion von g3-negativen Helferphagen und anschließend bei der Erzeugung von Phagen-Display-Bibliotheken zu überwinden. Die Anwesenheit einer solchen Kombination gewährleistet die Produktion von großen Mengen an Helferphagen und/oder Helfergenomen. g3-negative Helferphagen mit einem ORI und einem Resistenzmarker können aus den Helferphagen VCSM13 und M13K07 hergestellt werden. Diese Helferphagen enthalten im Unterschied zu M13 oder R408 ein Kanamycin-Resistenz-Gen aus dem Tn903-Transposon und einen P15A-ORI, die beide in den intergenischen Bereich des Phagengenoms eingesetzt werden. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Tatsache, dass diese Helferphagen wegen dieses Resistenz-Gens und der Anwesenheit dieses besonderen ORI leicht in großen Mengen wachsen können, während leere oder kein Plasmid oder kein Genom enthaltende Bakterien unter dem Selektionsdruck entfernt werden, und dass keine Störungen zwischen ORIs aus dem Phagengenom und dem Helferplasmid oder zwischen ORIs aus dem Phagengenom und den Plasmiden der Display-Bibliothek auftreten, wenn beide Nucleinsäuren in derselben bakteriellen Wirtszelle vorhanden sind. VCSM13 und M13K07 enthalten den P15A-ORI. Um das Verschwinden des Helfergenoms oder des Helfervektors zu verhindern, sollten die ORIs keine Störungen verursachen, und daher werden von P15A abgeleitete ORIs im Vektor nicht verwendet. Für den auf die Produktion von Helferphagen angewendeten Vektor wurde der ColE1-ORI gewählt. Neben den oben genannten Merkmalen und Effekten ist es auch wichtig, dass der Helfervektor für die Erzeugung von Helferphagen keinen F1-ORI trägt, um den Einbau des Helfervektors anstatt des viralen Genoms in den Phagenpartikel zu verhindern.
Die Erfindung stellt auch Vektoren bereit, die eine regulierte Expression der mutanten Form und/oder der funktionellen Form von g3p durch die Verwendung eines regulierbaren Promotors ermöglichen, die weiterhin ein Resistenz-Gen enthalten, das von dem im Helfergenom vorhandenen Kanamycin-Resistenz-Gen verschieden ist. Diese komplementäre Resistenz wird hier durch das beta-Lactamase(Ampicillin)-Gen bereitgestellt, da dessen Produkt relativ stabil ist und ein vollständiges Abtöten von Bakterien gewährleistet, die das Genprodukt nicht exprimieren.
Der pBAD/gIII-Vektor (Invitrogen) kann als Gerüstvektor für die Produktion von Helfervektoren der Erfindung verwendet werden. Alternativ dazu können Vektoren wie pUC19 verwendet werden. Vorzugsweise bestehen weitere Merkmale dieser Grundhelfervektoren darin, dass Bereiche mit Sequenzhomologie minimiert sind, was die Möglichkeit der homologen Rekombination erheblich reduziert.
Die Erfindung gibt weiterhin die Verwendung der bakteriellen Wirtszellen TOP10, LMG und/oder XL1blue für die Herstellung von Helferphagen an, die ein g3-negatives Genom enthalten, aber aufgrund des g3p, das auf den Phagen vorhanden ist, da es vom Helfervektor geliefert wurde, dennoch infektiös sind. Der Genotyp der TOP10- und LMG-Bakterien gewährleistet, dass sie Arabinose in die Zelle transportieren können, aber dass sie diese nicht metabolisieren können (Genotyp: araABCD– und araEFGH+). Außerdem sind die TOP10-Bakterien recA- und endA-defizitär, was die Wahrscheinlichkeit einer Rekombination und Mutation verringert. Weiterhin sind die TOP10-Bakterien F-negativ, wodurch sie resistent gegen Phagen sind, die interessierende Phagenchargen kontaminieren könnten.
Die vorliegende Erfindung gibt auch die Sequenz des VCSM13-Phagengenoms und deren Verwendung zum Zwecke des Aufbaus einer Phagen-Display-Bibliothek an und stellt Klonierungsphagen und Plasmidmutanten bereit, die bei allgemeinen molekularbiologischen Verfahren und Mitteln nützlich sind.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein partiell deletiertes g3-Gen bereit, das im Helferphagengenom noch vorhanden ist, um stabile, aber im Wesentlichen nichtinfektiöse Helferphagen bereitzustellen, die infektiöse g3ps auf ihrer Hülle beherbergen. Die Erfindung beschreibt dieses partiell deletierte g3-Gen, das synthetisch hergestellt wird, indem man synthetische Primer in einer solchen Weise verwendet, dass das funktionell deletierte g3-Gen auf dem Aminosäureniveau dasselbe Protein codiert wie der andere Teil des g3-Gens, der in demselben Bakterium vorhanden ist, aber die verwendeten Codons nicht zu homologen Rekombinationsereignissen führen. Da die Leadersequenzen in den verschiedenen Ausführungen sehr unterschiedlich sind, brauchen diese Bereiche im Helfergenom, Phagen-Display-Vektor oder Helfervektor (mit den scFv-codierenden Genen) nicht verändert zu werden. Im Prinzip ist es nicht wichtig, ob das g3-Gen im Helfergenom, im Phagen-Display-Vektor oder im Helfervektor verändert wurde, solange die beiden überlappenden (im Aminosäuregehalt) und vorher homologen g3-Teile, die in eine E.-coli-Zelle eingeführt werden, nicht zueinander passen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von Codonveränderungen im g3-Gen für die Herstellung von Helferphagen, die aufgrund von g3ps, die in den Helfervektoren codiert sind, infektiös sind, denen aber ein Wildtyp- oder wenigstens ein infektiöses g3-Gen in ihrem Genom fehlt, und für die Herstellung von chimärischen Phagen gemäß der Erfindung. Die Verwendung von Codonveränderungen gewährleistet eine reduzierte Wahrscheinlichkeit für homologe Rekombinationseffekte, die während des Vorgangs der Erzeugung von Helferphagen auftreten könnten. Die Erfindung gibt vorzugsweise die Verwendung von Codonveränderungen im g3-Gen oder Teilen davon für die Herstellung von Phagen-Display-Bibliotheken an, bei denen das Helferphagengenom, das zusammen mit Nucleinsäuren, die für g3p-X-Fusionsproteine codieren, in eine E.-coli-Zelle gebracht wird, nicht zu dem g3-Gen homolog ist, das in der DNA vorhanden ist, die für das g3p-X-Fusionsprotein codiert. Diese Codonveränderungen gewährleisten, dass die Wahrscheinlichkeit für homologe Rekombinationsereignisse bei der Herstellung von Phagen-Display-Bibliotheken erheblich abnimmt, wodurch die Qualität dieser Bibliotheken und ihre Verwendungen erheblich verbessert werden.
Experimentelle Verfahren
Primer
Die folgenden Primer (von Genset oder Invitrogen erhalten) wurden bei der Erzeugung der verschiedenen Vektoren und genomischen Helferphagenkonstrukte verwendet. Die meisten Restriktionsenzyme bauen DNA kaum oder gar nicht ab, wenn sich ihr entsprechendes Palindrom in der Nähe des Endes der DNA befindet. Daher wurde eine Sequenz von 8 Nucleotiden zum 5'-Ende des D3-, g3-minus- und g3-ORF-Primers addiert, wobei diese Sequenz ein A/T-reiches nichthybridisierendes Octamer ist.
D3-Primer D3 BamHI Forward
D3 BamHI Backward
g3-minus-Primer g3 minus HindIII Forward
g3 minus HindIII Backward
g3-ORF-Primer g3 ORF NcoI Forward
g3 ORF XbaI Backward
CT- und N2CT-Primer SnaBIclon
Bamlead
BglN2
BamCT
PacIclon
pUC-g3-Primer H3leadA
H3leadB
p3endEco
PCR-Reaktionen und Produktisolierung
PCR-Reaktionen mit D3-, g3-minus- und g3-ORF-Primern wurden standardmäßig (abgesehen von der Verlängerungszeit des DNA-Synthesezyklusschritts) unter Verwendung des folgenden 50-μl-Heißstart-PCR-Schemas und des AmpliTaq-PCR-Kits von Perkin Elmer durchgeführt: 1 μl 10 mM dNTP (Roche Diagnostics), 4 μl 25 mM MgCl₂, 5 μl 10 × PCR-Puffer, der mit dem Kit mitgeliefert wird, 5 μl 2,5 μM Forward-Primer, 5 μl 2,5 μM Backward-Primer, 0,3 μl 5 Einheiten/μl AmpliTaq, 10–50 ng Matrize, steriles bidestilliertes Wasser. Alle Komponenten wurden auf Eis gehalten, bis sie in den vorgeheizten PCR-Block gegeben wurden. Das Standardprogramm war wie folgt. 12 Zyklen von 25 s bei 94°C, 52°C Assoziation während 25 s, 72°C Polymerisation, am Ende ein Zyklus von 72°C während 7 min und dann Lagerung bei 4°C. Die Zeit der Polymerisation für die Synthese von neuen Helfergenomen betrug 12 min, und für die g3-Amplifikation und für die Amplifikation des AraC-Gens und des AraC/BAD-Promotors wurde sie auf 90 s eingestellt. PCR-Reaktionen mit pUC-g3-Primern wurden wie oben durchgeführt, aber mit Pwo-Polymerase (Boehringer Mannheim) anstatt AmpliTaq und mit dem folgenden Programm: 30 Zyklen von 45 s bei 94°C, 50°C Assoziation während 30 s und 72°C Polymerisation während 1 min, am Ende ein Zyklus von 68°C während 8 min und dann Lagerung bei 4°C. PCR-Reaktionen mit CT- und N2CT-Primern wurden wie oben durchgeführt, aber mit Taq-Polymerase (Gibco) anstelle von AmpliTaq und mit dem folgenden Programm: 25 Zyklen von 30 s bei 96°C, 53°C Assoziation während 30 s und 72°C Polymerisation während 2 min, am Ende ein Zyklus von 72°C während 10 min und dann Lagerung bei 4°C. Eine Ausnahme war die PCR-Reaktion mit den N2CT-Primern BglN2 und PacIclon, die mit Hilfe von rekombinanter Taq-DNA-Polymerase (Invitrogen) mit dem folgenden Programm durchgeführt wurde: 30 Zyklen von 45 s bei 94°C, 55°C Assoziation während 30 s und 72°C Polymerisation während 2,5 min, am Ende ein Zyklus von 72°C während 10 min und dann Lagerung bei 4°C.
Alle PCR-Produkte wurden auf 0,5%–1% TBE-Agarose-Gelen, die 100 ng/ml Ethidiumbromid enthielten, aufgetrennt. Nach der Bildaufzeichnung wurden die gewünschten Fragmente unter Verwendung von sterilen chirurgischen Einwegmessern herausgeschnitten und mit dem Gel-Reinigungskit von Qiagen gemäß den beiliegenden Anweisungen isoliert.
Ligierungsreaktionen
Ligierungsreaktionen wurden standardmäßig in den folgenden Reaktionsgemischen durchgeführt:
50 ng Vektor- oder Helfergenom
25 ng Insert
4 μl 5 × Ligierungspuffer (Gibco BRL)
1 μl T4-Lipase (Gibco BRL, 200 Einheiten/μl)
steriles bidestilliertes Wasser auf 20 μl
Für den Aufbau des pUC-g3-Helferplasmids wurde jedoch T4-DNA-Lipase (Roche, 1 Einheit/μl) verwendet, während beim Aufbau der Helferphagengenome CT, N2CT und p3-minus T4-DNA-Ligase (NEB, 400 Einheiten/μl) verwendet wurde. Die Gemische wurden über Nacht bei 6–16°C inkubiert. Dann wurden 30 μl steriles Wasser, 5 μl 3 M Kaliumacetat, pH 4,8 mit Essigsäure eingestellt (KAc), 1 μl 10 mg/ml Glycogen und 50 μl Isopropanol oder 96% Ethanol hinzugefügt und gründlich gemischt. Nach 15 min Fällung wurden die Röhrchen 10 min lang bei 4°C mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Das Sediment wurde einmal mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen und nach dem Trocknen in 10 μl sterilem Wasser gelöst. Die Hälfte dieses Volumens wurde zusammen mit 50 μl kompetenten Zellen für die Elektroporation verwendet.
Sequenzierung
Die Sequenzierung der Klone erfolgte gemäß den Anweisungen, die mit dem ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) mitgeschickt wurden, bei einer Assoziationstemperatur von 50°C. Alle Klone wurden sequenziert, um die Richtigkeit der Produkte zu überprüfen. Die Sequenz des VCSM13-Helferphagengenoms wurde nach dem Primer-Walking-Verfahren auf beiden Strängen bestimmt, einem Verfahren, das dem Fachmann allgemein bekannt ist.
Elektroporation
Alle Bakterienstämme außer denjenigen, die für die Produktion von Helferphagen verwendet wurden, wurden von Herstellern als elektroporationskompetente Zellen mit der höchsten verfügbaren Kompetenz erworben und nach den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 0,1-cm-Küvetten (BioRad) transformiert. Die Produktion von Helferphagen hängt jedoch von TOP10- oder LMG-Zellen (Stratagene) ab, die das Helferplasmid (pBAD/gIII-g3) enthalten. Diese Zellen wurden wie folgt kompetent gemacht und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert: Eine Kolonie der Bakterien wurde verwendet, um 10 ml 2 × TY mit Ampicillin (100 μg/ml) und für LMG auch mit Tetracyclin (10 μg/ml) zu beimpfen, und durch kräftiges Schütteln bei 30°C über Nacht kultiviert. Dann wurden die Kulturen 5 min lang mit 3000 U/min sedimentiert. Das Sediment wurde in 500 ml frischem 2 × YT einschließlich der Antibiotika resuspendiert und in einem 2-l-Erlenmeyerkolben auf einem Schüttelbrett bei 37°C bis OD 0,5 kultiviert. Diese Zellen wurden 45 min lang auf Eiswasser abkühlen gelassen und 25 min lang in einer Sorvall-Zentrifuge unter Verwendung eines GLA-3000-Rotors in vorgekühlten Bechern und Rotor mit 3000 U/min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden langsam und vorsichtig in 100 ml eiskaltem 10%igem Glycerin resuspendiert. Die Zentrifugations- und Glycerinschritte wurden zweimal wiederholt. Das endgültige Sediment wurde sehr vorsichtig in 5 ml 10%igem eiskaltem Glycerin aufgenommen und in vorgekühlten Eppendorf-Röhrchen aliquotiert. Dann wurden diese Röhrchen 5 min lang in ein Gemisch von Ethanol und Trockeneis eingetaucht, um ein sehr schnelles Gefrieren der Zellen zu gewährleisten. Die Röhrchen, die die elektrokompetenten Zellen enthielten, wurden bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Ein vergleichbares Verfahren wurde verwendet, um kompetente Zellen von XL-1 (Stratagene) herzustellen, die das Helferplasmid pUC-g3 enthielten.
Phagenproduktion
Der gewünschte F-positive E.-coli-Stamm wird in 2 × YT-Medium, das die erforderlichen Antibiotika enthielt, eingeimpft und bei 37°C mit 220 U/min bis OD 0,2 kultiviert. Der (Helfer-)Phage wird zu der Kultur gegeben und 30–45 min lang bei 37°C in einem nichtschüttelnden Wasserbad inkubiert. Dann wird Kanamycin (50 μg/ml) zu den Zellen gegeben, und die Zellen werden 30–45 min lang bei 37°C mit 220 U/min weiterinkubiert. Anschließend wird diese Lösung 15 min lang bei Raumtemperatur mit 3500 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig entfernt, und das Sediment wird auf das gewünschte Volumen von 2 × YT-Medium, das alle erforderlichen Antibiotika enthält, gebracht. Die Zellen werden für eine Phagen-Display-Bibliothek über Nacht bei 30°C und für reguläre (Helfer-)Phagen bei 37°C auf einem Schüttelbrett kultiviert.
Titerbestimmung
Eine Kolonie von Xl1blue (Stratagene) wird in 5 ml 2 × YT, das 10 μg Tetracyclin pro ml enthält (YT-T), in einem 50-ml-Röhrchen (Falcon) eingeimpft und über Nacht bei 37°C mit 220 U/min kultiviert. 200 μl dieser Kultur werden zu 5 ml YT-T gegeben und bis OD 0,2 kultiviert. Dann wird die Phagen-Stammlösung in YT verdünnt, und nach Bedarf wird eine Verdünnungsreihe hergestellt, um die Zahl der plaquebildenden Einheiten zu bestimmen. Für jeden Verdünnungsschritt werden 100 μl der XL1Blue-Kultur mit OD 0,2 entnommen und zu 100 μl der Phagen gegeben. Dieses Gemisch wird 25 min lang bei 37°C in einem Wasserbad (nichtschüttelnd) inkubiert. Die 200 μl Bakterienzellen werden auf eine Platte mit 2 × YT Brühe, die die erforderlichen Antibiotika enthält, pipettiert. Die Suspension wird unter Verwendung eines sterilen Glasstabs ausgebreitet. Nach dem Trocknen der Platten werden sie umgedreht und in einen Inkubator von 37°C übergeführt. Nach Kultur über Nacht werden die Kolonien gezählt. Jede Kolonie zeigt die Gegenwart von 1 infektiösen Phagenpartikel in der ursprünglichen Phagenlösung an. Die Zahl der infektiösen Partikel pro ml der analysierten Stammlösung wird bestimmt. Die Phagenpartikel werden gemäß den mitgeliefer ten Anweisungen einem ELISA-Test mit Anti-M13 und Anti-M13-HRP-Konjugat (Pharmacia) unterzogen.
Isolierung von DNA aus Phagen
Eine Phagenkultur wird über Nacht kultiviert, wie es oben beschrieben ist. Wenn eine Isolierung von DNA im großen Maßstab erforderlich war, wurde der BioRad Plasmid Maxi Prep Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, abgesehen vom Elutionsschritt, der 10 min lang mit 10 mM Tris pH 8,5 bei 65°C durchgeführt wird. Isolierungen im kleinen oder mittleren Maßstab wurden unter Verwendung des Mini-Prep-Kits von Qiagen gemäß den mit dem Kit mitgelieferten Anweisungen durchgeführt, abgesehen vom Elutionsschritt. Der Elutionsschritt wurde hier 10 min lang bei 65°C durchgeführt.
PEG-Fällung
Das Medium, das Bakterien und Phagen enthält, wird in 450-ml-Bechern aufgefangen. Das Gemisch wird 20 min lang in einer vorgekühlten Sorvall-Zentrifuge unter Verwendung eines GSA-3000-Rotors mit 8000 U/min zentrifugiert. Dann werden 90 ml 20% PEG/2,5 M NaCl in saubere 450-ml-Becher pipettiert. 360 ml des Überstands des zentrifugierten Mediums, der die Phagen enthält, werden in die PEG-haltigen Becher gegeben und gut gemischt. Das Gemisch wird 2 h lang auf Eiswasser oder über Nacht in den Kühlschrank gestellt. Der Niederschlag wird durch 20 min Zentrifugation in einer vorgekühlten Sorvall-Zentrifuge mit 8000 U/min sedimentiert. Der Überstand wird dekantiert, und die Becher werden 5 min lang austropfen gelassen, um so viel Fällungspuffer wie möglich zu entfernen. Anschließend werden 32 ml PBS/1% Rinderserumalbumin (BSA) zu den 450-ml-Bechern, die die sedimentierten Phagen enthalten, gegeben, und die Becher werden 15 min lang auf einem Flaschenroller rotieren gelassen. Die Lösung wird in ein SS-34-kompatibles Zentrifugenröhrchen übergeführt und 25 min lang in einer vorgekühlten Sorvall-Zentrifuge, die einen SS-34-Rotor (oder eine äquivalente Ausrüstung) enthält, mit 13 000 U/min zentrifugiert. In diesem Schritt werden Trümmer und kleine Bakterien aller Art entfernt. Inzwi schen wird der Kolben aus einer 50-ml-Spritze entfernt und an einem 0,45-μm-Filter (Whatman) befestigt. Der zentrifugierte Überstand wird in die Spritze übergeführt und durch den Filter gedrückt. In diesem Schritt werden alle kleinen Bakterien und anderen Zellen entfernt. 8 ml 20% PEG/2,5 M NaCl werden hinzugefügt, und es wird gut gemischt. Die Röhrchen werden 1 h lang auf Eis gestellt. Der Hochgeschwindigkeitszentrifugationsschritt wird so wiederholt, wie es oben beschrieben ist. Der Überstand wird dekantiert, und das Röhrchen wird 5 min lang auf einem Papiertuch austropfen gelassen. Das Phagensediment wird in 5 ml PBS/1% BSA gelöst. Dann werden 5 ml 100%iges Glycerin zu der Phagenlösung gegeben, und es wird gut gemischt. Die Phagen werden bei –20°C gelagert. Typischerweise enthält die Lösung ungefähr 2 bis 5 × 10¹³ infektiöse Phagenpartikel pro ml.
Beispiele
Zur Erläuterung der Erfindung werden die folgenden Beispiele angegeben, die den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.
Beispiel 1
Klonierung des pBAD/9III-g3-Helfervektors
Das volle offene Leseraster (ORF) des g3-Gens wurde erzeugt, indem man M13K07-DNA (Gibco-BRL) als Matrize in einer Standard-PCR-Reaktion zusammen mit den Primern g3 ORF NcoI Forward und g3 ORF XbaI Backward verwendete. Das gereinigte PCR-Produkt und der pBAD/gIII-Vektor wurden beide gleichzeitig 4 h lang bei 37°C in Puffer H (Roche Diagnostics) mit NcoI (NEB) und XbaI (Roche Diagnostics) abgebaut. Nach der Ligierung, Isolierung und Elektroporation in TOP10-(Stratagene) und LMG-Zellen (Stratagene) wurden zwei korrekte Klone durch Sequenzieren ausgewählt und im großen Maßstab kultiviert, und dann wurde die DNA isoliert. Die DNA wurde mit 70% Ethanol in Gegenwart von KAc erneut gefällt, und der Niederschlag wurde zweimal mit 70% Ethanol gewaschen. Nach dem Trocknen wurde die DNA in sterilem bidestilliertem Wasser gelöst und bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt. Das resultie rende Plasmid pBAD/gIII-g3 ist in 5 gezeigt. Dieser Helfervektor enthält als wichtigste Merkmale das g3-Gen in voller Größe unter der Kontrolle des AraC/BAD-Promotors, ein Ampicillin-Resistenz-Gen und einen ColE1-ORI.
Beispiel 2
Klonierung des g3-negativen Helferphagengenoms
VCSM13 (Stratagene) ist ein verbreitet verwendeter Helferphage, doch seine Sequenz ist nicht öffentlich zugänglich. Die volle DNA-Sequenz des VCSM13-Genoms wurde bestimmt und ist schematisch in 6A und als Nucleotidsequenz in 6B gezeigt. Die Verwendung der Primer g3 minus HindIII Forward und g3 minus HindIII Backward sowie M13K07 und VCSM13 als Matrizen in einer Standard-PCR-Reaktion führte zur Bildung eines PCR-Produkts, das HindIII-Stellen an beiden Enden der DNA enthielt. Nach der Trennung, Gelisolierung und Reinigung, Abbau mit HindIII (Roche Diagnostics) und erneuter Reinigung der DNA wurde das Produkt unter Standard-Ligierungsbedingungen selbstligiert, und das resultierende Helferphagengenom, das g3-minus genannt wurde, wurde durch Elektroporation in XL1Blue-Zellen (Stratagene) eingeführt. Die transformierten Zellen wurden in 5 ml 2TY-Medium resuspendiert und 1 h lang einer Schüttelkultur bei 37°C unterzogen. Kanamycin wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml hinzugefügt, und die Zellen wurden weitere 5 h lang unter denselben Bedingungen wachsen gelassen. Die Kultur wurde 15 min lang mit 3000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde durch ein 0,22-μm-Filter passiert, um Bakterien zu entfernen. Gleichzeitig wurde eine Kultur von exponentiell wachsenden XL-1-Blue-Bakterien hergestellt. Fraktionen des Filtrats (50–1000 μl), die Phagenpartikel enthielten, wurden zu 5 ml XL-1-Blue-Bakterien gegeben und 30 min lang bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. Die Kultur wurde erneut zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden auf 2 × YT-K-T-Platten ausgestrichen und zum Wachstum über Nacht in einen Inkubator von 37°C übergeführt. Acht korrekte Klone, denen der g3-ORF fehlt (über die BamHI-Stelle überprüft) und die die eingeführte HindIII-Stelle enthalten, wurden isoliert und für die Produktion von g3-losen Helferphagen in Gegenwart des pBAD/gIII-g3-Helferplasmids verwendet. Nur zwei Klone, die in Gegenwart des Helferplasmids Phagen bilden konnten, wurden behalten. Aus diesen Klonen wurde eine große Menge DNA isoliert und für weitere Experimente aufbewahrt. Das erhaltene, von VCSM13 abgeleitete g3-negative Helferphagengenom, in dem das gesamte g3-Gen außer den letzten sechs Codons durch eine HindIII-Stelle ersetzt wurde, ist schematisch in 6C gezeigt, während die g3-negative Sequenz in 6D gezeigt ist.
Beispiel 3
Klonierung des D3-Helferphagengenoms mit einem partiell deletierten g3-Gen
Die Konstruktion eines Helferphagengenoms, das nur den D3-Teil des g3-Gens exprimiert, war mit den oben beschriebenen g3-negativen Helferphagen vergleichbar, außer dass die verwendeten Primer D3 BamHI Forward und D3 BamHI Backward waren, um das neue Genom zu erzeugen. Alle anderen Verfahren waren dieselben wie bei dem g3-Negativ-Verfahren, abgesehen von der Verwendung von BamHI anstelle von HindIII. Am Ende wurde die DNA von zwei korrekten Klonen behalten und bei –20°C aufbewahrt. Das endgültige, von VCSM13 abgeleitete Konstrukt des Helferphagengenoms (genannt D3: es exprimiert nur diesen Teil des g3-Gens, der nicht zur Infektiosität des Phagenpartikels beiträgt) ist in 7A gezeigt, während die D3-Sequenz in 7B gezeigt ist.
Beispiel 4
Produktion von infektiösen Helferphagen, die kein Gen tragen, das das Wildtyp-g3p codiert
Die Verfahren zur Erzeugung von g3-losen und partiell deletiertes g3 (oder D3) exprimierenden Helferphagen sind identisch. Gefrorene kompetente TOP10- oder LMG-Zellen, die das pBAD/gIII-g3-Helferplasmid enthielten, wurden einer Elektroporation mit Hilfe von 100 ng Helferphagen-DNA unterzogen. Nach der Gewinnung wurden die Zellen in 4 × 250 ml 2 × YT-K-A-Medium übergeführt, das mit 0,05% Arabinose (Sigma) angereichert war. Phagen wurden während der Kultur über Nacht bei 37°C und unter kräftigem Schütteln produziert. Am nächsten Tag wurden die Phagen gemäß den oben beschriebenen Standardverfahren für die Fällung und Lagerung gereinigt und gelagert. Die Zahl der infektiösen Partikel und die Zahl der Phagen wurden durch Titrations- und ELISA-Verfahren, die ebenfalls oben beschrieben wurden, bestimmt. Für g3-lose Helferphagen wurden ungefähr 5 × 10¹¹ infektiöse Partikel synthetisiert, während für D3 unter Verwendung dieser Verfahren ungefähr 5 × 10¹³ infektiöse Phagen gebildet wurden.
Beispiel 5
Vermehrung und Ernte von Phagen-Display-Bibliotheken, die infektiöse Phagen, welche g3p-scFv-Fusionen tragen, und nichtinfektiöse Helferphagen enthalten, mit Hilfe von g3-negativen und partiell g3-deletierten Helferphagen
Eine gefrorene Bibliothek wurde wie folgt eingeimpft. Im Allgemeinen wurden ungefähr 5–10 μl konzentrierte Stammlösungen in 25 ml 2 × YT, das die erforderlichen Antibiotika und 5% Glucose enthielt, eingeimpft und bei 37°C unter kräftigem Schütteln gezüchtet. Bei OD 0,3–0,4 (nach etwa 2–3 h) wurde ein 500- bis 1000facher Überschuss an Helferphage hinzugefügt. Das Medium, das die Helferphagen und Bakterien enthielt, wurde 25 min lang in einem Wasserbad von 37°C ohne Schütteln inkubiert. Die Entfernung von toten Zellen und des Überschusses von Phagenpartikeln erfolgte nach einem Zentrifugationsschritt mit 3000 U/min während 15 min. Das Sediment wurde in 250 ml 2 × YT mit Antibiotika, aber ohne Glucose, resuspendiert und über Nacht bei 30°C mit guter Durchlüftung kultiviert. Am nächsten Tag wurden die gebildeten Phagen unter Verwendung des Standard-PEG/NaCl-Verfahrens isoliert und gelagert.
Beispiel 6
Codonverwendung in g3 und dem partiell deletierten g3-Gen (D3) zur Verhinderung einer homologen Rekombination während der Helferphagenproduktion und Vermehrung der Bibliothek
Um mögliche Rekombinationen zwischen einer genomischen Nucleinsäure, die den Helferphagen-g3-Proteinbereich (oder einen Teil davon, wie die D3-Domäne) codiert, und anderen Nucleinsäuren (wie dem Phagen-Display-Vektor und dem AraC/BAD-Helfervektor) zu verhindern, wird eine Reihe von Helferphagen entworfen, die innerhalb des g3p-Bereichs veränderte Codons enthalten. Neu translatierte g3ps sind mit dem Wildtyp-g3-Protein oder -Proteinteil (D3) identisch. Aufgrund dieser Veränderungen können g3-ORF codierende DNA-Domänen nicht oder kaum mit den Phagen-Display-Vektoren oder dem AraC/BAD-g3-Helfervektor rekombinieren. Die Codons, die verwendet werden, um nichthomologe g3-Gene zu erzeugen, sind in 8 abgebildet und sind für die Transcriptionsmaschinerie von E. coli optimal. Die PCR-Erzeugung von Helferphagengenomen (VCSM13, M13K07, D3, g3-minus oder AraC/BAD) mit g3-Kopf-Rückwärts- und g3-Ende-Vorwärts-Primern mit NotI-Restriktionsstellen gewährleisten die Erzeugung von PCR-Produkten, die alle Helferphagenkomponenten und -gene außer dem g3-ORF enthalten. Neue g3-Bereiche werden mit überlappenden Primern konstruiert und in Helferphagen eingesetzt. Das durch PCR erzeugte g3p oder Teile davon werden mit NotI abgebaut und in das mit NotI angebaute, durch PCR erzeugte Helferphagengenom ligiert. Nach der Transformation und Selektion von korrekten Helfergenomen (mit einem neuen g3-Gen) werden Helferphagen so gezüchtet, wie es beschrieben wurde.
Beispiel 7
Selektion von mit Thyroglobulin wechselwirkenden Phagen unter Verwendung einer Bibliothek, die mit Helferphagen vermehrt wurde, die nur den D3-Teil von g3p in ihrem Genom umfassen
Um die D3-Helferphagen in Standard-Phagenselektionen zu bewerten, wurde eine Selektion durchgeführt, bei der eine Antikörper-Phagen-Display-Bibliothek verwendet wurde, die mit Hilfe der D3-Helferphagen vermehrt wurde, wie es oben beschrieben ist. Die verwendeten Verfahren entsprachen im Wesentlichen den von De Kruif et al. (1995a) beschriebenen. Kurz gesagt, ein Kunststoffröhrchen wurde mit Thyroglobulin beschichtet. Das Röhrchen wurde in PBS, das 2% Milch enthielt (MPBS), blockiert, und danach wurde die ebenfalls in MPBS blockierte Antikörper-Phagen-Display-Bibliothek in das Röhrchen gegeben. Die Phagen wurden 2 h lang binden gelassen, und danach wurden nichtbindende Phagen entfernt, indem man das Röhrchen in PBS, das 0,1% Tween-20 enthielt, wusch, wie es von De Kruif et al. (1995a) beschrieben wurde. Die bindenden Phagen wurden in 50 mM Glycin/HCl, pH 2,2, eluiert (10 min bei RT) und verwendet, um frisch gezüchtete XL-1-Blue-Bakterien zu infizieren. Die Bakterien wurden auf 2TY-Agarplatten, die die geeigneten Antibiotika und Glucose enthielten, ausgestrichen, über Nacht bei 37°C inkubiert und verwendet, um eine angereicherte Phagen-Display-Bibliothek herzustellen; der Phage D3 wurde wiederum als Helferphage verwendet. Das Verfahren wurde einmal wiederholt, und danach wurden einzelne E.-coli-Kolonien verwendet, um monoklonale Phagenantikörper herzustellen. Diese monoklonalen Phagenantikörper wurden in ELISA auf ihre Fähigkeit getestet, spezifisch an das Thyroglobulin-Antigen zu binden. Die Ergebnisse zeigen, dass nach zwei Selektionsdurchläufen 25/46 Kolonien eine positive Bindung an Thyroglobulin zeigen. Vorher fanden wir heraus, dass bei Verwendung eines allgemeinen VCS-M13 als Helferphage in diesem Selektionsformat wenigstens 3 Selektionsdurchläufe erforderlich waren, um spezifische Bindungsmoleküle zu erhalten.
Beispiel 8
Selektion von mit Myelomzellen wechselwirkenden Phagen unter Verwendung einer Bibliothek, die mit Helferphagen vermehrt wurde, die nur den D3-Teil von g3p in ihrem Genom umfassen
Um die D3-Helferphagen in Selektionen an intakten Zellen zu bewerten, wurde eine Selektion durchgeführt, bei der eine Antikörper-Phagen-Display-Bibliothek verwendet wurde, die mit Hilfe des D3-Helferphagen vermehrt wurde. Die verwendeten Verfahren entsprachen im Wesentlichen den von De Kruif et al. (1995a und 1995b) beschriebenen. Kurz gesagt, Myelomzellen (AML, CD33+, CD34+) wurden aus dem Blut eines Patienten erhalten, der an der Utrechter Universitätsklinik (Niederlande) behandelt wurde. 0,5 ml Phagenbibliothek wurden in 3 ml RPMI-Medium, das 10% FCS enthielt (RPMIS), gegeben und 15 min auf Eis inkubiert. Die Myelomzellen wurden hinzugefügt, und die Zellsuspension wurde 2 h lang bei 4°C rotieren gelassen. Die Zellen wurden fünfmal in 50 ml eisgekühltem RPMIS gewaschen, und danach wurden die bindenden Phagen eluiert (in 50 mM Glycin/HCl, pH 2,2, 10 min bei RT) und verwendet, um frisch gezüchtete XL-1-Blue-Bakterien zu infizieren. Die Bakterien wurden auf 2TY-Agarplatten, die die geeigneten Antibiotika und Glucose enthielten, ausgestrichen, über Nacht bei 37°C inkubiert und verwendet, um eine angereicherte Phagen-Display-Bibliothek herzustellen. Wiederum wurden die D3 exprimierenden Helferphagen als Helferphagen verwendet. Das Verfahren wurde einmal wiederholt, und danach wurden einzelne E.-coli-Kolonien verwendet, um monoklonale Phagenantikörper herzustellen. Diese monoklonalen Phagenantikörper wurden in FACS-Verfahren auf ihre Fähigkeit getestet, Myelomzellen zu binden. Die Ergebnisse zeigen, dass 23 von 41 getesteten Klonen spezifisch an Epitope banden, die auf den Myelomzellen exprimiert werden. Im Allgemeinen sind drei oder mehr Selektionsdurchläufe erforderlich, um eine ähnliche Zahl von bindenden Phagen zu erhalten, wobei identische Verfahren verwendet werden, mit der Ausnahme, dass VCS-M13-Helferphagen anstelle der in der Erfindung beschriebenen Helferphagen verwendet wurden.
Beispiel 9
Klonierung des pUC-g3-Helferplasmids
Als Alternative zu dem oben beschriebenen pBAD/gIII-g3-Helferplasmid wurde ein auf pUC19 basierendes Helferplasmid für die Expression von Wildtyp-g3p unter der Kontrolle eines lac-Promotors konstruiert. Die Verwendung der Primer H3leadA und p3endEco sowie VCSM13 als Matrize in einer oben ausführlich beschriebenen PCR-Reaktion führte zur Bildung eines PCR-Produkts, das die g3-Gensequenz mit 28 zusätzlichen Nucleotiden stromaufwärts des Gens und 15 zusätzlichen Nucleotiden einschließlich einer eingeführten EcoRI-Stelle stromab wärts enthielt. Die Verwendung der Primer H3leadB und p3endEco sowie dieses PCR-Produkts als Matrize in einer oben ausführlich beschriebenen PCR-Reaktion führte zur Bildung eines verlängerten PCR-Produkts, das die g3-Gensequenz mit eingeführten HindIII- und EcoRI-Stellen stromaufwärts bzw. stromabwärts des Gens enthielt. Das verlängerte PCR-Produkt wurde in das Plasmid pCR4-BluntII-TOPO einkloniert, wobei man den Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen) verwendete, und die Sequenz des Inserts wurde überprüft. Das Plasmid pUC19 (New England Biolabs) und das pCR4-BluntII-TOPO-Derivat, das das g3-Gen enthielt, wurden beide mit HindIII und EcoRI abgebaut. Das Fragment, das das g3-Gen aus dem pCR4-TOPO-Derivat enthielt, und das Vektorfragment von pUC19 wurden aus Gel gereinigt und ligiert. Das resultierende Plasmid, das pUC-g3 genannt wurde, wurde durch Elektroporation in XL-1-Zellen (Stratagene) eingeführt, und ein korrekter Klon wurde ausgewählt, indem man DNA sequenzierte, die aus den transformierten Zellen isoliert wurde. Der Helfervektor pUC-g3, der das g3-Gen unter der Kontrolle des lac-Promotors enthält, ist schematisch in 9 gezeigt.
Beispiel 10
Alternative Klonierung von Helferphagengenomen mit einem partiell deletierten g3-Gen
Bei den in Beispiel 2 und 3 beschriebenen Klonierungsverfahren wird ein sehr großer Bereich des Phagengenoms durch PCR amplifiziert, mit der Gefahr, aufgrund der eingeschränkten Kopiertreue der DNA-Polymerase künstliche Mutationen einzuführen. Eine alternative Strategie wurde angewendet, um Helfergenome mit einem partiell deletierten g3-Gen zu erzeugen. Bei dieser Strategie wurden ein Teil der g3-Sequenz, der den g3-Leader codiert, und ein Teil der g3-Sequenz, der einen C-terminalen Teil des g3-Proteins codiert, getrennt amplifiziert. Die beiden Fragmente wurden in einem Shuttle-Vektor miteinander kombiniert und anschließend in das Phagengenom kloniert. Um die resultierenden Konstrukte von dem in Beispiel 3 beschriebenen D3-Helferphagen zu unterscheiden, wurde die allgemein akzeptierte alternative Nomenklatur für die g3-Domänen verwendet, wobei D1, D2 und D3 als N1, N2 bzw. CT bezeich net werden. Die Verwendung der Primer SnaBIclon und Bamlead sowie VCSM13 als Matrize in einer oben ausführlich beschriebenen PCR-Reaktion führte zur Bildung eines PCR-Produkts, das die g3-Leadersequenz mit einer nativen SnaBI-Stelle stromaufwärts und einer eingeführten BamHI-Stelle stromabwärts enthielt. Die Verwendung der Primer BamCT und PacIclon sowie VCSM13 als Matrize in einer oben ausführlich beschriebenen PCR-Reaktion führte zur Bildung eines PCR-Produkts, das die g3-CT-Domäne mit einer eingeführten BamHI-Stelle stromaufwärts und einer nativen PacI-Stelle stromabwärts enthielt. Die Verwendung der Primer BglN2 und PacIclon sowie VCSM13 als Matrize in einer oben ausführlich beschriebenen PCR-Reaktion führte zur Bildung eines PCR-Produkts, das die g3-N2- und -CT-Domänen mit einer eingeführten BglII-Stelle stromaufwärts und einer nativen PacI-Stelle stromabwärts enthielt. Alle PCR-Produkte wurden in das Plasmid pCR4-TOPO kloniert, wobei man den TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen) verwendete, und die Sequenzen der Inserts wurden überprüft. Das pCR4-TOPO-Derivat, das die Leadersequenz enthielt, wurde mit NotI und BamHI abgebaut, und das Insert wurde aus Agarose-Gel isoliert. Das pCR4-TOPO-Derivat, das die CT-Domäne enthielt, wurde ebenfalls mit NotI und BamHI abgebaut, und das Vektorfragment wurde isoliert. Das Insert wurde mit dem Vektorfragment ligiert, was zu einem pCR4-TOPO-Derivat führte, das das g3-Gen enthält, bei dem die N1- und die N2-Domäne deletiert sind. Dieses Plasmid und VCSM13 wurden beide mit SnaBI und PacI abgebaut. Nach der Isolierung wurde das Plasmid-Insert mit dem VCSM13-Vektorfragment ligiert. Die Sequenz des Inserts in dem resultierenden Phagemid, das CT genannt wird und mit dem in 7A gezeigten D3 identisch ist, wurde überprüft. Ein vergleichbares Verfahren wurde verwendet, um ein Phagemid zu konstruieren, dem nur die N1-Domäne fehlt. Für dieses Konstrukt wurde das pCR4-TOPO-Derivat, das die N2- und CT-Domänen enthielt, mit NotI und BglII abgebaut, und das Vektorfragment wurde isoliert. Das Insert, das die Leadersequenz enthielt, wurde mit dem Vektorfragment ligiert (die klebrigen Enden von BglII und BamHI sind kompatibel), was zu einem pCR4-TOPO-Derivat führte, das das g3-Gen enthielt, bei dem die N1-Domäne deletiert ist. Dieses Gen wurde in VCSM13 subkloniert, wie es oben beschrieben wurde, und die Sequenz des Inserts in dem resultierenden Phagemid, das N2CT genannt wird, wurde überprüft. Das von VCSM13 abgeleitete Helferphagengenom N2CT ist schematisch in 10 gezeigt.
Beispiel 11
Klonierung des p3-negativen Helferphagengenoms
Bei der Klonierung des in Beispiel 2 beschriebenen g3-negativen Helferphagengenoms wurde fast die gesamte g3-Sequenz deletiert. Das g3-Gen überlappt mit der Ribosomenbindungsstelle des g6-Gens und kann noch andere wichtige Merkmale enthalten. Eine alternative Klonierungsstrategie wurde angewendet, bei der ein Teil der N2-Domäne und die gesamte CT-Domäne auf dem DNA-Niveau beibehalten werden, diese Domänen aber auf dem Proteinniveau durch eine Rasterverschiebung deletiert werden. Das pCR4-TOPO-Derivat, das den g3-Leader enthält, der mit der g3-CT-Domäne (siehe oben) fusioniert ist, und VCSM13 wurden beide mit BamHI und SnaBI geschnitten. Nach der Isolierung aus Gel wurde das Insertfragment des pCR4-TOPO-Derivats, das den g3-Leader enthält, mit dem Vektorfragment von VCSM13 ligiert, das einen C-terminalen Teil der N2-Domäne und die gesamte CT-Domäne von g3 enthält. Die Sequenz des Inserts im resultierenden Phagemid, das p3-minus genannt wird, wurde überprüft. In diesem Konstrukt tritt eine Rasterverschiebung an der BamHI-Stelle auf, die sich zwischen dem g3-Leader und dem C-terminalen Teil der N2-Domäne befindet, was zur Einführung von über 30 Stopcodons stromabwärts der BamHI-Stelle führt. Das von VCSM13 abgeleitete Helferphagengenom p3-minus ist in 11 schematisch gezeigt.
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Claims

Helferphage, der auf seiner Oberfläche ein Gemisch von Proteinen aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch Folgendes umfasst: a) ein g3-Phagenhüllprotein oder ein Teil, Derivat oder Analogon davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den Helferphagen zu vermitteln; und b) eine mutante Form des g3-Phagenhüllproteins, wobei der D1-Bereich, D2-Bereich oder beide Bereiche des g3-Proteins deletiert sind.
Helferphage gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Genom des Helferphagen eine Nucleinsäure umfasst, in der die mutante Form des g3-Phagenhüllproteins codiert ist.
Helferphage gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Genom des Helferphagen keine Nucleinsäure umfasst, in der das g3-Phagenhüllprotein oder ein Teil, Derivat oder Analogon davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den Helferphagen zu vermitteln, codiert ist.
Helferphage gemäß einem der Ansprüche 2 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Genom des Helferphagen weiterhin noch andere Proteine codiert, die für den Zusammenbau des Helferphagen wesentlich sind.
Helferphage gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die genomischen DNA-Sequenzen des Helferphagen auf den genomischen Sequenzen von VCSM13 oder M13K07 beruhen.
Helferphage gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Helferphage infektiös ist.
Verfahren zur Herstellung eines Helferphagen, der auf seiner Oberfläche ein Gemisch von Proteinen aufweist, wobei das Gemisch Folgendes umfasst: ein g3-Phagenhüllprotein oder ein Teil, Derivat oder Analogon davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den Helferphagen zu vermitteln, und eine mutante Form des g3-Phagenhüllproteins, wobei der D1-Bereich, D2-Bereich oder beide Bereiche des g3-Proteins deletiert sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Versehen einer Wirtszelle mit einer ersten Nucleinsäure, die das g3-Phagenhüllprotein oder ein Teil, Derivat oder Analogon davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den Helferphagen zu vermitteln, codiert; b) Versehen der Wirtszelle mit einer zweiten Nucleinsäure, die die mutante Form des g3-Phagenhüllproteins codiert, wobei die zweite Nucleinsäure weiterhin alle anderen Proteine umfasst, die für den Zusammenbau des Helferphagen in der Wirtszelle wesentlich sind; und c) Kultivieren der Wirtszelle, so dass der Helferphage zusammengebaut werden kann.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des g3-Phagenhüllproteins oder des Teils, Derivats oder Analogons davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den Helferphagen zu vermitteln, der mutanten Form des g3-Phagenhüllproteins oder von beiden reguliert werden kann, indem man die Bedingungen bei der Kultur der Wirtszelle verändert.
Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Expression des g3-Phagenhüllproteins oder des Teils, Derivats oder Analogons davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den Helferphagen zu vermitteln, der mutanten Form des Phagenhüllproteins oder von beiden unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors befindet.
Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der regulierbare Promotor den AraC/BAD-Promotor, den psp-Promotor, den lac-Promotor oder ein funktionelles Äquivalent davon umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Nucleinsäure und die zweite Nucleinsäure jeweils einen einzigartigen Selektionsmarker umfassen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Nucleinsäure und die zweite Nucleinsäure jeweils einen einzigartigen Replikationsstartpunkt umfassen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Nucleinsäure und die zweite Nucleinsäure Codons umfassen, die im Wesentlichen nicht zu einem homologen Rekombinationsereignis zwischen der ersten Nucleinsäure und der zweiten Nucleinsäure führen.
Helferphage, der durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 13 erhalten werden kann.
Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Phagenpartikels, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Versehen einer Wirtszelle mit einer ersten Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein codiert, wobei das Fusionsprotein ein proteinartiges Molekül umfasst, das mit einem g3-Phagenhüllprotein oder einem Teil, Derivat oder Analogon davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den chimärischen Phagenpartikel zu vermitteln, fusioniert ist; b) Versehen der Wirtszelle mit einer zweiten Nucleinsäure, die eine mutante Form des g3-Phagenhüllproteins codiert, wobei die mutante Form eine Deletion des D1-Bereichs, des D2-Bereichs oder beider Bereiche des g3-Phagenhüllproteins umfasst, wobei die Wirtszelle weiterhin eine Nucleinsäure umfasst, die alle anderen Proteine codiert, die für den Zusammenbau des chimärischen Phagenpartikels in der Wirtszelle wesentlich sind; und c) Kultivieren der Wirtszelle, so dass der chimärische Phagenpartikel zusammengebaut werden kann, wobei der chimärische Phagenpartikel auf seiner Oberfläche ein Gemisch von Proteinen aufweist, wobei das Gemisch die mutante Form des g3-Phagenhüllproteins und das Fusionsprotein umfasst, wobei das Fusionsprotein über das g3-Phagenhüllprotein oder den Teil, das Derivat oder Analogon davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den chimärischen Phagenpartikel zu vermitteln, an den chimärischen filamentösen Phagenpartikel gebunden ist.
Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Phagenpartikels, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Versehen einer Wirtszelle mit einer ersten Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein codiert, wobei das Fusionsprotein ein proteinartiges Molekül umfasst, das mit einem g3-Phagenhüllprotein oder einem Teil, Derivat oder Analogon davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den chimärischen Phagenpartikel zu vermitteln, fusioniert ist; b) Versehen der Wirtszelle mit einer zweiten Nucleinsäure, die eine mutante Form des g3-Phagenhüllproteins codiert, wobei die mutante Form eine Deletion des D1-Bereichs, des D2-Bereichs oder beider Bereiche des g3-Phagenhüllproteins umfasst, wobei die zweite Nucleinsäure weiterhin alle anderen Proteine codiert, die für den Zusammenbau des chimärischen Phagenpartikels in der Wirtszelle wesentlich sind; und c) Kultivieren der Wirtszelle, so dass der chimärische Phagenpartikel zusammengebaut werden kann, wobei der chimärische Phagenpartikel auf seiner Oberfläche ein Gemisch von Proteinen aufweist, wobei das Gemisch die mutante Form des g3-Phagenhüllproteins und das Fusionsprotein umfasst, wobei das Fusionsprotein über das g3-Phagenhüllprotein oder den Teil, das Derivat oder Analogon davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den chimärischen Phagenpartikel zu vermitteln, an den chimärischen Phagenpartikel gebunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle durch einen Helferphagen mit der zweiten Nucleinsäure versehen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Helferphage ein Helferphage gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder Anspruch 14 ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des Fusionsproteins oder des Teils, Derivats oder Analogons davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den chimärischen Phagenpartikel zu vermitteln, der mutanten Form des g3-Phagenhüllproteins oder von beiden reguliert werden kann, indem man die Bedingungen bei der Kultur der Wirtszelle verändert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Expression des Fusionsproteins oder des Teils, Derivats oder Analogons davon, das in der Lage ist, die Infektion eines Wirts durch den chimärischen Phagenpartikel zu vermitteln, der mutanten Form des g3-Phagenhüllproteins oder von beiden unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors befindet.
Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der regulierbare Promotor den AraC/BAD-Promotor, den psp-Promotor, den lac-Promotor oder ein funktionelles Äquivalent davon umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Nucleinsäure und die zweite Nucleinsäure jeweils einen einzigartigen Selektionsmarker umfassen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Nucleinsäure und die zweite Nucleinsäure jeweils einen einzigartigen Replikationsstartpunkt umfassen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Nucleinsäure und die zweite Nucleinsäure Codons umfassen, die im Wesentlichen nicht zu einer homologen Rekombination zwischen der ersten Nucleinsäure und der zweiten Nucleinsäure führen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das proteinartige Molekül einen Antikörper, ein Fab-Fragment, ein einzelkettiges Fv-Fragment, einen variablen Bereich, einen CDR-Bereich, ein Immunglobulin oder einen funktionellen Teil davon umfasst.
Verwendung eines Helferphagen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder Anspruch 14 zur Erzeugung eines Phagenpartikels oder einer Phagen-Display-Bibliothek.
Verfahren zur Anreicherung eines ersten Partners eines Bindungspaars, der spezifisch für einen zweiten Partner des Bindungspaars ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen einer Phagensammlung, die chimärische Phagen umfasst, die ein Repertoire aus ersten Partnern eines Bindungspaars umfassen, durch das Durchführen eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 15 bis 25; b) das In-Kontakt-Bringen der erhaltenen Phagensammlung mit Material, das den zweiten Partner des Bindungspaars umfasst, unter Bedingungen, die eine spezifische Bindung zwischen dem ersten Partner des Bindungspaars und dem zweiten Partner des Bindungspaars ermöglichen; c) Entfernen von chimärischen Phagen, die nicht an das Material binden; d) Gewinnen von chimärischen Phagen, die an das Material binden.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das Verfahren weiterhin die folgenden Schritte umfasst: a) Gewinnen einer DNA-Sequenz, die den ersten Partner des Bindungspaars codiert, aus den chimärischen Phagen, die an das Material binden; b) Subklonieren der DNA-Sequenz in einem geeigneten Expressionsvektor; c) Exprimieren der DNA-Sequenz in einem geeigneten Wirt unter Bedingungen, die die Produktion des ersten Partners des Bindungspaars ermöglichen.
Verfahren gemäß Anspruch 27 oder 28, wobei der erste Partner des Bindungspaars aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Antikörper oder einem Fragment davon, einem einzelkettigen Fv-Fragment, einem Fab-Fragment, einem variablen Bereich, einem CDR-Bereich und einem Immunglobulin besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 28 oder 29, wobei der Wirt eine Säugerzelle ist.