DE60103988T2

DE60103988T2 - Verfahren zur molekularen evolution der antikörperfunktion

Info

Publication number: DE60103988T2
Application number: DE60103988T
Authority: DE
Inventors: Mats Ohlin; Eskil Soderlind; Roland Carlsson
Original assignee: Bioinvent International AB
Current assignee: Bioinvent International AB
Priority date: 2000-04-05
Filing date: 2001-04-04
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2021-04-05
Also published as: ATE269900T1; US20120077710A1; DE60103988D1; EP1268801A2; AU2001252253B2; CA2402240C; JP4842490B2; JP2003529368A; WO2001075091A3; GB0008419D0; IL151743A; AU5225301A; WO2001075091A2; IL151743A0; CA2402240A1; EP1268801B1; NO20024723L; NO20024723D0; US20030153038A1; NO330262B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur molekularen Evolution einer Antikörperfunktion in vitro.
Hintergrund der Erfindung
WO 98/32845, Söderlind et al. (1999) und Jirholt et al. (1998) beschreiben die molekulare Evolution von Proteinen, die von Antikörpern abstammen, in vitro über das Implantieren natürlich vorkommender Complementarity determining regions (CDRs) in ein definiertes und ausgewähltes Framework („Master-Framework"), das die Framework-Bereiche des Keimbahn-Gens DP-47 der V_H3-Familie umfasst. Oligonucleotidprimer, die auf den Sequenzen basieren, die für Teile der Framework-Bereiche von DP-47 codieren, die die CDRs unmittelbar flankieren, werden verwendet, um Nucleinsäuresequenzen zu amplifizieren, die für CDRs aus einer cDNA-Bibliothek codieren, die aus B-Zellen des peripheren Blutes gewonnen wurde. Einzelsträngige DNA aus der Amplifizierungsreaktion wird dann in einer Overlap-Extension-PCR-Reaktion mit überlappenden Oligonucleotiden kombiniert, die für den Rest des Master-Framework codieren, so dass vollständige Sequenzen erzeugt werden, die für V_H-Antikörperdomänen codieren, die jeweils die Framework-Bereiche des DP-47-Keimbahn-Gens sowie CDRs von Keimbahn-Genen der V_H3-Familie enthalten.
Diese Technik stellt ein wertvolles Verfahren zur Erhöhung der Diversität in Antikörperbibliotheken (z. B. Phage-Display-Bibliotheken) bereit, insbesondere deshalb, weil sie die Rekombination der CDR1 und der CDR2 ermöglicht, die normalerweise in vivo verknüpft sind und während der Neuanordnung von Keimbahn-Genen keine Rekombination durchlaufen.
Weiterhin wurden die CDRs in vivo einem Proof-Reading unterzogen, und es erscheint unwahrscheinlich, dass sie immunogen sind, was gegenüber künstlich mutierten CDR-Sequenzen einen Vorteil darstellt. Auch wurden die verwendeten Master-Framework (aus dem Keimbahn-DP-47 und -DPL3) so ausgewählt, dass sie besonders kompatibel mit der eingesetzten bakteriellen Expression und dem Phagensystem sind, wodurch ein Display funktioneller Proteine in großem Umfang sichergestellt wird.
Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Konstruktion der Bibliothek war die Anforderung an das Framework, dass es imstande ist, Spezifitäten mit hohen Affinitäten für eine große Vielzahl verschiedener Antigentypen zu bewahren. Da es das System ermöglicht, eine Variabilität in eine beliebige Anzahl der CDR-Positionen einzuführen, ist die erzielbare Variabilität riesig und geht weit über das hinaus, das mittels bisher etablierter kombinatorischer Techniken erzielt werden konnte. Schließlich macht das modulare Design, d. h. die Tatsache, dass die Variabilität in eine gemeinsame Framework-Struktur eingeführt wird, nachfolgende Modifikationen und Untersuchungen an ausgewählten Klonen einfach und effizient.
Mittels dieser Technologie, die vorläufig CDR-Implantation genannt wird, wurde eine große Phage-Display-Antikörperbibliothek, die auf dem Format der Einzelkette Fv (scFv) basiert, erzeugt. Die Bibliothek wurde dazu verwendet, verschiedene hochaffine Antikörper gegen verschiedene Ligandentypen, einschließlich von Proteinen (menschlichen und nicht-menschlichen Ursprungs), Peptiden, Kohlenhydraten und niedermolekularen Haptenen, zu selektieren. Somit ist es vom funktionellen Gesichtspunkt aus klar, dass ein einzelnes ausgewähltes Master-Framework Antikörperspezifitäten mit hohen Affinitäten für ganz verschiedene Antigentypen aufweisen kann, was nahe legt, dass sich die Oberflächentopologie bei den verschiedenen Antikörpern erheblich unterscheiden kann.
Es besteht jedoch nach wie vor auf diesem Gebiet ein genereller Bedarf an einer Erhöhung der Diversität von Antikörperbibliotheken.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Nucleinsäure, die für eine CDR codiert, die normalerweise in einem Framework (dem „ursprünglichen Framework") enthalten ist, das sich von einem ausgewählten Master-Framework unterscheidet, von einem Immunglobulin-Gen amplifiziert und in eine Nucleinsäure eingefügt, die für das ausgewählte Master-Framework codiert.
Die Amplifizierung kann, wie bei der herkömmlichen CDR-Implantation, wie sie oben beschrieben wurde, über einer PCR erreicht werden, und zwar unter Verwendung von Primern, die auf den Framework-Bereichen, die die CDRs flankieren, basieren. Jedoch unterscheiden sich bei der vorliegenden Erfindung das ursprüngliche Framework und das Master-Framework. Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Verfahren der CDR-Implantation wird deshalb die für die CDRs codierende Nucleinsäure nicht unter Verwendung von Primern, die ausschließlich auf dem Master-Framework basieren, amplifiziert. Statt dessen werden Primer verwendet, die sich von der Sequenz unterscheiden, die für das Master-Framework codiert. Die Primer können spezifisch auf einem bestimmten anderen Framework basieren, z. B. demjenigen eines anderen Keimbahn-Gens oder einer Konsensussequenz einer Keimbahn-Genfamilie, oder sie können degeneriert sein, um z. B. CDRs aus verschiedenen Keimbahn-Familien zu amplifizieren.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Erzeugung einer Polynucleotidsequenz, die für eine variable Antikörperdomäne codiert, bereit, wobei die variable Domäne Complementarity-determining regions (CDRs) umfasst, die in einem ausgewählten Framework (dem „Master-Framework") lokalisiert sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellen wenigstens eines Nucleinsäuremoleküls, das für eine CDR oder mehrere CDRs und assoziierte Framework-Regionen (das „ursprüngliche Framework") codiert,
b) Amplifizieren wenigstens eines CDR-codierenden Abschnittes des Nucleinsäuremoleküls/der Nucleinsäuremoleküle des Schrittes (a) unter Verwendung eines Oligonucleotidpaares oder mehrerer Oligonucleotidpaare als Primer für die Amplifizierung, und
c) Zusammensetzen einer Polynucleotidsequenz, die für eine variable Antikörperdomäne codiert, durch das Kombinieren der amplifizierten, CDR-codierenden Nucleotidsequenzen, die im Schritt (b) erzeugt wurden, mit Nucleotidsequenzen, die für das genannte Master-Framework codieren,

Ein zweiter Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung einer Bibliothek von Polynucleotidsequenzen bereit, von denen jede für eine variable Antikörperdomäne codiert, die Complementarity-determining regions (CDRs) umfasst, die in einem gemeinsamen ausgewählten Framework (dem „Master-Framework") lokalisiert sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellen einer Population von Nucleinsäuremolekülen, die für eine oder mehrere Complementarity-determining region(s) (CDR(s)) und assoziierte Framework-Regionen (das „ursprüngliche Framework") codieren,
b) Amplifizieren wenigstens eines CDR-codierenden Abschnittes der Nucleinsäuremoleküle des Schrittes (a) unter Verwendung eines Oligonucleotidpaares oder mehrerer Oligonucleotidpaare als Primer für die Amplifizierung, und
c) Zusammensetzen einer Polynucleotidsequenz, die für eine variable Antikörperdomäne codiert, durch das Kombinieren der amplifizierten, CDR-codierenden Nucleotidsequenzen, die im Schritt (b) erzeugt wurden, mit Nucleotidsequenzen, die für das genannte Master-Framework codieren,

Mit „assoziierte Frameworkbereiche", wie der Begriff in Bezug auf die Nucleinsäuremoleküle, die im Schritt (a) bereit gestellt werden, verwendet wird, meinen wir die Aminosäurereste des Frameworkbereiches, der die CDR unmittelbar flankiert. Zum Beispiel kann das Nucleinsäuremolekül oder können die Nucleinsäuremoleküle aus dem Schritt (a) für eine CDR zusammen mit bis zu 5, 10, 15 oder mehr Aminosäureresten des Framework codieren, das die beiden Seiten der CDR flankiert. Somit kann das Nucleinsäuremolekül oder können die Nucleinsäuremoleküle aus dem Schritt (a) für einen variablen Bereich eines Antikörpers oder sogar für einen ganzen Antikörper codieren.
Mit „sich unterscheiden von" im Zusammenhang mit den Nucleotidsequenzen der Oligonucleotidprimer des Schrittes (b) meinen wir, dass die Bereiche der Oligonucleotidprimer des Schrittes (b), die für Framework-Reste codieren (d. h. diejenigen Bereiche der Oligonucleotidprimer, die komplementär zu Bereichen der Nucleinsäuremoleküle sind, die im Schritt (a) bereit gestellt wurden und die für Frameworkreste codieren) keine 100%ige Sequenzübereinstimmung mit den entsprechenden Bereichen der Nucleinsäuremoleküle aufweisen, die für das Master-Framework codieren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsformen des ersten und zweiten Aspektes der Erfindung umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: Bei einer bevorzugten Ausführungsform des ersten und des zweiten Aspektes der Erfindung umfasst das die folgenden Schritte:

i) Bereitstellen wenigstens eines Oligonucleotidpaares,
ii) Verwenden jedes der genannten Oligonucleotidpaare als Primer für die Amplifizierung von Nucleotidsequenzen, die für unterschiedliche CDRs codieren, und
iii) Zusammensetzen von Polynucleotidsequenzen, die für variable Antikörperdomänen codieren, durch das Inkorporieren von Nucleotidsequenzen, die aus dem obigen Schritt (ii) stammen, in Nucleotidsequenzen, die für das genannte Master-Framework codieren,

Das „Framework" eines variablen Bereiches, wie der Begriff hier verwendet wird, besteht, um Zweifel auszuschließen, typischerweise aus vier einzelnen Frameworkbereichen, die die drei CDRs des variablen Bereiches flankieren:
[---FR1---][CDR1][---FR2---][CDR2][---FR3---][CDR3][---FR4---]
Die „Frameworkbereiche (FRs) eines ausgewählten Typs" stellen zusammen ein „Master-Framework" bereit.
Es wird Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein, dass die erfindungsgemäßen Verfahren dazu verwendet werden können, eine Polynucleotidsequenz zu erzeugen, die für eine variable Domäne verschiedener Antikörpertypen codiert. Zum Beispiel kann die variable Domäne eine variable Domäne eines IgG, IgM, IgA, IgD oder IgE sein.
Vorzugsweise codiert die im Schritt (c) zusammengesetzte Polynucleotidsequenz für eine variable Domäne eines IgG. Vorteilhafterweise codiert die im Schritt (c) zusammengesetzte Polynucleotidsequenz oder codieren die im Schritt (c) zusammengesetzten Polynucleotidsequenzen für eine schwere Kette oder eine leichte Kette eines IgG. Passenderweise codiert die im Schritt (c) zusammengesetzte Polynucleotidsequenz oder codieren die im Schritt (c) zusammengesetzten Polynucleotidsequenzen für eine nicht natürlich vorkommende variable Domäne eines Antikörpers.
Vorteilhafterweise codiert die im Schritt (c) zusammengesetzte Polynucleotidsequenz bzw. codieren die im Schritt (c) zusammengesetzten Polynucleotidsequenzen für eine variable Domäne eines Antikörpers, die wenigstens eine CDR aufweist, die eine kanonische Struktur besitzt, die untypisch für variable Domänen von Antikörpern ist, die das Master-Framework aufweisen. Mit „atypisch" meinen wird, dass die CDR eine kanonische Struktur besitzt, die in weniger als 10% der natürlich vorkommenden variablen Domänen von Antikörpern, die das ausgewählte Master-Framework aufweisen, gefunden wird. Vorzugsweise hat die CDR eine kanonische Struktur, die in weniger als 5%, 2% oder 1% der natürlich vorkommenden variablen Domänen von Antikörpern, die das ausgewählte Master-Framework aufweisen, gefunden wird. Am bevorzugtesten hat die CDR eine kanonische Struktur, die nicht in irgendwelchen natürlich vorkommenden variablen Domänen von Antikörpern, die das ausgewählte Master-Framework aufweisen, gefunden wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren codiert wenigstens eine der Polynucleotidsequenzen, die im Schritt (c) zusammengesetzt wurden, für eine variable Domäne eines Antikörpers, die wenigstens eine CDR aufweist, die von einer anderen Keimbahn-Genfamilie als derjenigen des Master-Framework stammt. Zum Beispiel könnte(n) die im Schritt (c) zusammengesetzte(n) Polynucleotidsequenz(en) für eine variable Domäne eines Antikörpers codieren, die eine oder mehrere CDRs aufweist, die von einer leichten Kette in einem Framework einer schweren Kette stammt, oder umgekehrt.
Vorteilhafterweise umfasst der Schritt (a) das Bereitstellen einer Population von Nucleinsäuremolekülen, die jeweils für eine variable Domäne eines Antikörpers codieren. Passenderweise codieren die Nucleinsäuremoleküle jeweils für eine variable Domäne eines Antikörpers aus der gleichen Keimbahn-Genfamilie. Somit kann eine Selektivität für die CDRs, die in das Master-Framework inkorporiert werden sollen, zumindest teilweise über das Bereitstellen einer ausgewählten Population von Nucleinsäuremolekülen im Schritt (a) erreicht werden.
Alternativ oder zusätzlich kann eine Selektivität bezüglich der CDRs, die in das Master-Framework inkorporiert werden sollen, über die Verwendung von Oligonucleotidprimerpaaren im Schritt (b) erreicht werden, die selektiv mit einer Ziel-Subpopulation von Nucleinsäuremolekülen, die im Schritt (a) bereit gestellt wurden, hybridisieren. Mit „selektiv hybridisieren" meinen wird, dass die Oligonucleotidprimerpaare selektiv mit einer Ziel-Subpopulation von Nucleinsäuremolekülen unter hoch stringenten Bedingungen hybridisieren. Bedingungen für die Oligonucleotid-Hybridisierung werden in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (dritte Ausgabe), Sambrook und Russell (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Fachleuten auf diesem Gebiet dürfte klar sein, dass die Fähigkeit der Primer, selektiv mit den Ziel-Nucleinsäuremolekülen zu hybridisieren, in starkem Umfang vom Ausmaß der Sequenzkomplementarität zwischen den Primern und den Zielsequenzen abhängt.
Vorzugsweise hybridisieren die Oligonucleotidprimerpaare im Schritt (b) selektiv mit einer Ziel-Subpopulation von Nucleinsäuremolekülen, die im Schritt (a) bereit gestellt wurden und jeweils für eine variable Domäne eines Antikörpers aus der gleichen Keimbahn-Genfamilie codieren.
Somit ist es durch das Bereitstellen einer ausgewählten Population von Nucleinsäuremolekülen im Schritt (a) und/oder durch das Verwenden von Oligonucleotidprimerpaaren im Schritt (b), die selektiv mit einer Ziel-Subpopulation von Nucleinsäuremolekülen, die im Schritt (a) bereit gestellt wurden, hybridisieren, möglich, die CDRs zu selektieren, die in das Master-Framework inkorporiert werden sollen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform stammen die CDRs, die in das Master-Framework inkorporiert werden sollen, von Nucleinsäuremolekülen, die für eine variable Domäne eines Antikörpers aus der gleichen Keimbahn-Genfamilie, beispielsweise der V_H3-Familie, codieren. Passenderweise stammen die CDRs, die in das Master-Framework inkorporiert werden sollen, von Nucleinsäuremolekülen ab, die für eine variable Domäne eines Antikörpers des gleichen Keimbahn-Gens, zum Beispiel DP29 und DP-73, codieren.
Vorteilhafterweise stammt das Master-Framework von einem Keimbahn-Gen ab, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DP-47 und DPL-3 besteht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren umfasst der Schritt (c) den Einsatz einer Overlap-Extension-PCR (siehe Sambrook & Russel, oben). In diesem Falle ist es erforderlich, einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle aus den amplifizierten, für die CDR-codierenden Nucleinsäuremoleküle, die im Schritt (b) erzeugt wurden, zu isolieren. Das kann erreicht werden, indem Oligonucleotidprimerpaare verwendet werden, bei denen einer der Primer biotinyliert ist, was es möglich macht, den Nucleinsäurestrang, der durch die Verlängerung des biotinylierten Primers erzeugt wurde, auf der Basis seiner Affinität für Streptavidin zu isolieren. Die Verwendung von biotinylierten Primern und einer Overlap-Extension-PCR wird bei Jirholt et al. 1998, oben, beschrieben.
Als Konsequenz der Unterschiede zwischen den Nucleotidsequenzen der Bereiche der Amplifizierungsprimer, die für Frameworkreste codieren, und den Nucleinsäuresequenzen, die für die entsprechenden Bereiche des Master-Framework codieren, können die amplifizierten CDRs nicht immer direkt über einer Overlap-Extension-PCR in das Master-Framework inkorporiert werden, da die Nucleotide, die für die amplifizierten CDRs codieren, möglicherweise nicht richtig mit den Nucleinsäuren hybridisieren, die für das Master-Framework codieren. Das ist insbesondere dann der Fall, wenn (wie im Beispiel 1B) signifikante Fehlpaarungen an den Enden der Amplifizierungsprimer vorliegen (insbesondere an dem Ende, das der CDR näher liegt). Als Ergebnis davon kann es erforderlich sein, die Bereiche der amplifizierten Nucleotidsequenzen zu verändern, die für die Frameworkbereiche codieren, die die CDRs flankieren, um sie bezüglich ihrer Sequenz den Bereichen der Nucleinsäuremoleküle ähnlicher zu machen, die für die entsprechenden Bereiche des Master-Framework codieren.
Somit umfassen bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren die Verfahren einen weiteren Schritt, der nach dem Schritt (b) und vor dem Schritt (c) durchgeführt wird, und zwar die Modifizierung der Nucleotidsequenz der amplifizierten, für die CDR codierenden Moleküle aus dem Schritt (b), so dass die Abschnitte der genannten amplifizierten Moleküle, die für Frameworkbereiche codieren, eine größere Sequenzübereinstimmung mit den entsprechenden Bereichen des Master-Framework zeigen. Vorzugsweise werden die Nucleotidsequenzen so modifiziert, dass diejenigen Abschnitte der genannten amplifizierten Moleküle, die für Frameworkbereiche codieren, eine 100%ige Sequenzübereinstimmung mit den entsprechenden Bereichen des Master-Framework aufweisen.
Zum Beispiel besteht ein Weg zur Erreichung dieses Ziels darin, zunächst die CDR und die angrenzenden Abschnitte der flankierenden Frameworkbereiche mittels PCR-Primern zu amplifizieren, die mit dem ursprünglichen Framework der CDR identisch oder diesem sehr ähnlich sind. Dann kann man in nachfolgenden PCR-Amplifizierungsrunden diejenigen Bereiche der amplifizierten Nucleinsäuresequenzen modifizieren, die für Frameworkbereiche codieren, und zwar unter Verwendung von Primern, die Fehlpaarungen bezüglich des ursprünglichen Framework aufweisen, wobei diese Fehlpaarungen die Reste bereit stellen, die in den entsprechenden Positionen des Master-Framework vorliegen. Schließlich werden die Frameworkbereiche demjenigen Master-Framework in ausreichendem Umfang ähnlich oder mit ihm identisch, das über eine Overlap-Extension-PCR inkorporiert werden soll.
Alternativ kann eine einzige Runde einer PCR-Amplifizierung unter Verwendung von Primern, die eine Schimäre aus den ursprünglichen und den Master-Framework darstellen, ausreichen, um CDRs zu amplifizieren, die im Prozess der Overlap-Extension-PCR eingesetzt werden können, wobei in diesem Falle der zusätzliche Schritt nicht erforderlich ist.
Bei der ersten Runde der PCR (Schritt „b") kann es deshalb unabhängig davon, ob die genannten zusätzlichen Schritte durchgeführt werden sollen, bevorzugt sein, Fehlpaarungen im Primer bezüglich des ursprünglichen Framework zu inkorporieren, um so viele Basen wie möglich einzuarbeiten, die mit dem ausgewählten Master-Framework übereinstimmen. Die Zahl der Fehlpaarungen, die eingearbeitet werden können, hängt von verschiedenen Faktoren ab, zu denen die Zahl der Basen, die sich zwischen den Framework unterscheiden, die Länge der Primer und das Risiko einer Hybridisierung mit Sequenzen, die nicht die gewünschten sind, gehören.
Es kann möglich sein, CDRs, die mittels Primern amplifiziert wurden, die mit dem ursprünglichen Framework identisch sind, direkt in das Master-Framework zu inkorporieren (d. h. die Produkte des Schrittes „b"), und zwar über eine Overlap-Extension-PCR. Alternativ kann die Einarbeitung weiterer PCR-Schritte (wie es oben beschrieben wurde) erforderlich sein, um die Framework-Sequenzen, die mit den amplifizierten CDRs assoziiert sind, den entsprechenden Sequenzen im Master-Framework ähnlicher zu machen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspektes der Erfindung umfasst das Verfahren einen weiteren Schritt des Einfügens der Polynucleotidsequenz(en), die im Schritt (c) zusammengesetzt wurde(n), in einen Expressionsvektor. Vorteilhafterweise ist der Expressionsvektor ein Sekretionsvektor.
Somit können Polynucleotidsequenzen, die mittels der erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt wurden, gemäß bekannten Techniken, die im Hinblick auf den Inhalt dieser Patentanmeldung geeignet modifiziert wurden, dazu eingesetzt werden, einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann dazu eingesetzt wird, eine geeignete Wirtszelle für die Expression und Erzeugung von variablen Domänen von Antikörpern zu transformieren. Zu diesen Techniken gehören diejenigen, die beschrieben wurden in den US-Patenten Nr. 4 440 859, das am 3. April 1984 an Rutter et al. erteilt wurde, 4 530 901, das am 23. Juli 1985 an Weissman erteilt wurde, 4 582 800, das am 15. April 1986 an Crowl erteilt wurde, 4 677 063, das am 30. Juni 1987 an Mark et al. erteilt wurde, 4 678 751, das am 7. Juli 1987 an Goeddel erteilt wurde, 4 704 362, das am 3. November 1987 an Itakura et al. erteilt wurde, 4 710 463, das am 1. Dezember 1987 an Murray erteilt wurde, 4 757 006, das 12. Juli 1988 an Toole Jr. et al. erteilt wurde, 4 766 075, das am 23. August 1988 an Goeddel et al. erteilt wurde, und 4 810 648, das am 7. März 1989 an Stalker erteilt wurde, wobei all diese hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen werden.
Die Polynucleotidsequenzen, die mittels der erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt werden, können für die Einführung in einen geeigneten Wirt mit einer großen Vielzahl anderer DNA-Sequenzen verknüpft werden. Die begleitende DNA hängt von der Art des Wirtes, der Art der Einführung der DNA in den Wirt und davon ab, ob eine episomale Beibehaltung oder eine Integration gewünscht wird.
Im allgemeinen wird die Polynucleotidsequenz in einen Expressionsvektor, beispielsweise ein Plasmid, in der korrekten Orientierung und dem korrekten Leserahmen für die Expression eingefügt. Wenn es erforderlich ist, kann die Polynucleotidsequenz mit den geeigneten Kontroll-Nucleotidsequenzen für die Regulation der Transkription und Translation, die vom gewünschten Wirt erkannt werden, verknüpft werden, obwohl derartige Kontrollen im allgemeinen im Expressionsvektor verfügbar sind. So kann die insertierte Polynucleotidsequenz operativ mit einem geeigneten Promotor verknüpft werden. Zu bakteriellen Promotoren gehören die E.-coli-lacI- und -lacZ-Promotoren, die T3- und T7-Promotoren, der gpt-Promotor, die PR- und PL-Promotoren des λ-Phagen, der phoA-Promotor und der trp-Promotor. Zu den eukaryotischen Promotoren gehören der CMV-immediate-early-Promotor, der HSV-Thymidinkinase- Promotor, die frühen und die späten SV40-Promotoren und die Promotoren retroviraler LTRs. Weitere geeignete Promotoren sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Die Expressionskonstrukte enthalten erstrebenswerterweise auch Stellen für eine Initiation und Termination der Transkription und in der transkribierten Region eine Ribosomen-Bindungsstelle für die Translation (Hastings et al., Internationales Patent Nr. WO 98/16643, veröffentlicht am 23. April 1998).
Der Vektor wird dann mittels Standardtechniken in den Wirt eingeführt. Im allgemeinen werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert, und es ist deshalb erforderlich, die transformierten Wirtszellen zu selektieren. Eine Selektionstechnik beinhaltet die Einarbeitung eines DNA-Sequenzmarkers mit beliebigen erforderlichen Kontrollelementen, der für eine selektierbare Eigenschaft der transformierten Zelle codiert, in den Expressionsvektor. Zu diesen Markern gehören die Gene der Dihydrofolat-Reduktase, der G418- oder Neomycin-Resistenz für eukaryotische Zellkulturen und die Gene für die Tetracyclin-, Kanamycin- oder Ampicillin-Resistenz für die Kultivierung in E. coli oder anderen Bakterien. Alternativ kann das Gen für eine derartige selektierbare Eigenschaft ein weiterer Vektor sein, der für eine Cotransformation der gewünschte Wirtszelle eingesetzt wird.
Wirtszellen, die mittels des Expressionsvektors transformiert wurden, werden dann für eine ausreichende Zeit unter geeigneten Bedingungen, die Fachleuten auf diesem Gebiet im Hinblick auf den Inhalt dieser Anmeldung klar sind, kultiviert, um die Expression der codierten variablen Domäne des Antikörpers zu ermöglichen, die dann gewonnen werden kann.
Die variable Domäne des Antikörpers kann aus den rekombinanten Zellkulturen mittels gut bekannter Verfahren gewonnen und gereinigt werden, zu denen eine Fällung mit Ammoniumsulfat oder Ethanol gehören, eine Säureextraktion, eine Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, eine Phosphocellulose-Chromatographie, eine hydrophobe Chromatographie, eine Affinitätschromatographie, eine Hydroxylapatit-Chromatographie und eine Lectin-Chromatographie. Am bevorzugtesten wird eine Hochleistungsflüssigchromatographie („HPLC") für die Reinigung eingesetzt.
Es sind viele Expressionssysteme bekannt, zu denen Systeme gehören, die einsetzen: Bakterien (z. B. E. coli und Bacillus subtilis), die z. B. mit einem rekombinanten Bakteriophagen, Plasmid oder Cosmid-DNA-Expressionvektor transformiert werden; Hefen (z. B. Saccharomyces cerevisiae), die z. B. mit Hefe-Expressionsvektoren transformiert werden; Systeme aus Insektenzellen, die z. B. mit viralen Expressionsvektoren (z. B. Baculovirus) transformiert werden; Systeme aus Pflanzenzellen, die z. B. mit viralen oder bakteriellen Expressionsvektoren transfiziert werden; und Systeme aus tierischen Zellen, die z. B. mit Adenovirus-Expressionsvektoren transfiziert werden.
Die Vektoren können ein prokaryotisches Replikon enthalten, beispielsweise das Col E1 ori zur Vermehrung in einem Prokaryoten, sogar wenn der Vektor für die Expression in anderen, nicht-prokaryotischen Zelltypen eingesetzt werden soll. Die Vektoren können auch einen geeigneten Promotor enthalten, z. B. einen prokaryotischen Promotor, der imstande ist, die Expression (Transkription und Translation) der Gene in einer bakteriellen Wirtszelle, wie zum Beispiel E. coli, die mit ihnen transformiert wurden, zu steuern.
Ein Promotor ist ein Element zur Steuerung der Expression, der aus einer DNA-Sequenz besteht, die die Bindung der RNA-Polymerase und den Ablauf der Transkription ermöglicht. Promotorsequenzen, die mit beispielhaften bakteriellen Wirten kompatibel sind, sind typischerweise in Plasmidvektoren enthalten, die geeignete Restriktionsstellen für die Insertion eines erfindungsgemäßen DNA-Segments enthalten.
Typische prokaryotische Vektorplasmide sind: pUC18, pUC19, pBR322 und pBR329, die von Biorad Laboratories (Richmond, Kalifornien, USA) bezogen werden können; pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 und pRIT5, die von Pharmacia (Piscataway, New Jersey, USA) bezogen werden können; pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, die von Stratagene Cloning Systems (La Jolla, Kalifornien 92037, USA) bezogen werden können.
Ein typisches Vektorplasmid einer Säugetierzelle ist pSVL, das von Pharmacia (Piscataway, New Jersey, USA) bezogen werden kann. Dieser Vektor verwendet den späten SV40 Promotor, um die Expression klonierter Gene zu steuern, wobei das höchste Expressionsniveau in Zellen, die das T-Antigen erzeugen, beispielsweise COS-1-Zellen, gefunden wird. Ein Beispiel für einen induzierbaren Säugetier-Expressionsvektor ist pMSG, der ebenfalls von Pharmacia (Piscataway, New Jersey, USA) bezogen werden kann. Dieser Vektor verwendet den Glucocorticoid-induzierbaren Promotor des Long Terminal Repeat des Brustkrebs-Tumorvirus der Maus für die Steuerung der Expression des klonierten Gens.
Nützliche Plasmidvektoren der Hefe sind pRS403–406 und pRS413–416, die generell bei Stratagene Cloning Systems (La Jolla, Kalifornien 92037, USA) bezogen werden können. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind „Yeast Integrating Plasmids" (Ylps) und enthalten die selektierbaren Marker HIS3, TRP1, LEU2 und URA3 der Hefe. Die Plasmide pRS413–416 sind „Yeast Centromere Plasmids" (YCps).
Es können Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, dazu eingesetzt werden, Expressionsvektoren zu konstruieren, die die codierende Sequenz und z. B. geeignete Steuerelemente für die Transkription oder Translation enthalten. Ein derartiges Verfahren beinhaltet eine Ligation über Homopolymerschwänze. Homopolymerschwänze aus polydA (oder polydC) werden an freie 3'-OH-Gruppen des DNA-Fragments, das kloniert werden soll, mittels terminaler Desoxynucleotidyltransferasen angefügt. Das Fragment ist dann imstande, mit den polydT-Schwänzen (oder polydG-Schwänzen) zu hybridisieren, die an die Enden des linearisierten Plasmidvektors angefügt wurden. Lücken, die nach der Hybridisierung zurückbleiben, können mit DNA-Polymerase ausgefüllt und die freien Enden mit DNA-Ligase verbunden werden.
Ein weiteres Verfahren beinhaltet eine Ligation über kohäsive Enden. Kompatible kohäsive Enden können auf dem DNA-Fragment und dem Vektor mit Hilfe der Aktivität geeigneter Restriktionsenzyme erzeugt werden. Diese Enden hybridisieren schnell über eine Paarung komplementärer Basen, und zurückbleibende Lücken können mittels der DNA-Ligase geschlossen werden.
Ein weiteres Verfahren setzt synthetische Moleküle ein, die Linker und Adapter genannt werden. DNA-Fragmente mit stumpfen Enden werden über die DNA Polymerase des Bakteriophagen T4 oder die DNA-Polymerase 1 von E. coli erzeugt, die überstehende 3'-Enden entfernen und zurückgesetzte 3'-Enden auffüllen. Synthetische Linker, Stücke aus doppelsträngiger DNA mit stumpfen Enden, die Erkennungssequenzen für definierte Restriktionsenzyme aufweisen, können mittels der T4-DNA-Ligase mit DNA-Fragmenten mit stumpfen Enden ligiert werden. Sie werden anschließend mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, um kohäsive Enden zu erzeugen, und in einen Expressionsvektor mit kompatiblen Enden ligiert. Adapter sind auch chemisch synthetisierte DNA-Fragmente, die ein stumpfes Ende enthalten, das für die Ligation eingesetzt wird, die aber auch ein vorgeformtes kohäsives Ende besitzen.
Synthetische Linker, die eine Vielzahl von Stellen für Restriktionsendonucleasen enthalten, können von einer Vielzahl kommerzieller Quellen bezogen werden, zu denen International Biotechnologies Inc., New Haven, Connecticut, USA, gehört.
Ein erstrebenswerter Weg zur Modifizierung der DNA, die für das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, besteht im Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion, wie es von Saiki et al. (1988), Science 239, 487–491, offenbart wurde. Bei diesem Verfahren wird die DNA, die enzymatisch amplifiziert werden soll, mit zwei spezifischen Oligonucleotidprimern flankiert, die selbst in die amplifizierte DNA inkorporiert werden. Die genannten spezifischen Primer können Erkennungs stellen für die Restriktionsendonucleasen aufweisen, die für die Klonierung in Expressionsvektoren mittels Verfahren, die in diesem Gebiet bekannt sind, verwendet werden können.
Die Präsentation („Display") von Proteinen und Polypeptiden auf der Oberfläche eines Bakteriophagen (Phage), wobei sie mit einem der Hüllproteine des Phagen fusioniert sind, stellt eine wirkungsvolle Technik zur Selektion spezifischer Liganden bereit. Diese „Phage-Display"-Technik wurde ursprünglich von Smith 1985 (Science 228, 1315–7) zur Erzeugung großer Bibliotheken von Antikörpern verwendet, mit dem Zweck diejenigen auszuwählen, die eine hohe Affinität für ein bestimmtes Antigen zeigten. In jüngerer Zeit wurde das Verfahren dazu eingesetzt, Peptide, Domänen von Proteinen und intakte Proteine auf der Oberfläche von Phagen zu präsentieren, um Liganden, die gewünschte Eigenschaften zeigen, zu identifizieren.
Die folgenden Prinzipien liegen der Technologie des Phage-Display zugrunde:

(i) Eine Nucleinsäure, die für das Protein oder Polypeptid codiert, das präsentiert werden soll, wird in einen Phagen kloniert;
(ii) Die klonierte Nucleinsäure wird als Fusion mit dem Teil eines der Phagen-Hüllproteine exprimiert, der es auf der Hülle verankert (typischerweise der Hüllproteine p3 oder p8 im Falle filamentärer Phagen), so dass das fremde Protein oder Polypeptid auf der Oberfläche des Phagen präsentiert wird;
(iii) Der Phage, der das Protein oder Polypeptid mit den gewünschten Eigenschaften präsentiert, wird dann selektiert (z. B. mittels Affinitätschromatographie), wodurch ein Genotyp (verknüpft mit einem Phänotyp) bereit gestellt wird, der sequenziert, vervielfältigt und in andere Expressionssysteme transferiert werden kann.

Alternativ kann das fremde Protein oder Polypeptid mittels eines Phagemid-Vektors (d. h. eines Vektors, der Replikationsursprünge aufweist, die von einem Phagen und einem Plasmid stammen) exprimiert werden, der als ein einzelsträngiges Nucleinsäuremolekül in eine Bakteriophagenhülle verpackt werden kann. Wenn Phagemid-Vektoren eingesetzt werden, dann wird ein „Helferphage" verwendet, um die Funktionen der Replikation und der Verpackung der Phagemid-Nucleinsäure zu liefern. Der resultierende Phage exprimiert sowohl das Wildtyp-Hüllprotein (codiert durch den Helferphagen) als auch das modifizierte Hüllprotein (codiert durch das Phagemid), während nur das modifizierte Hüllprotein exprimiert wird, wenn ein Phagenvektor verwendet wird.
Verfahren zur Selektion von Phagen, die ein Protein oder Polypeptid mit einer gewünschten Spezifität exprimieren, sind in diesem Gebiet bekannt. Zum Beispiel ist ein häufig eingesetztes Verfahren das „Panning", bei dem eine bestimmte Menge von Phagen, die Liganden präsentieren, an eine feste Phase gekoppelten Zielmolekülen ausgesetzt werden, zum Beispiel unter Einsatz der Affinitätschromatographie.
Zu alternativen Verfahren für die Selektion interessanter Phagen gehören SAP (Selection and Amplification of Phages; wie es in WO 95/16027) beschrieben wird und SIP (Selectively-Infective Phage; EP 614989A, WO 99/07842), die jeweils eine Selektion einsetzen, die auf der Amplifizierung von Phagen beruht, bei denen der präsentierte Ligand spezifisch an einen Ligandenbinder bindet. Bei einer Ausführungsform der SAP-Methode wird dies über die Verwendung eines nicht-infektiösen Phagen und das Verbinden des interessierenden Ligandenbinders mit dem N-terminalen Teil von p3 erreicht. Dadurch werden, wenn der Ligandenbinder spezifisch an den präsentierten Liganden bindet, dem ansonsten nicht-infektiösen Liganden-exprimierenden Phagen diejenigen Teile von p3 bereit gestellt, die für die Infektion benötigt werden. Da diese Wechselwirkung reversibel ist, kann die Selektion dann auf kinetischen Parametern basieren (siehe Duenas et al., 1996, Mol. Immunol. 33, 279–285).
Die Verwendung des Phage-Display zur Isolierung von Liganden, die biologisch relevante Moleküle binden, wurde in Übersichtsartikeln dargestellt von Felici et al. (1995) Biotechnol. Annual. Rev. 1, 149–183, Katz (1997) Annual Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 27–45 und Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4 (1), 1–20. Es sind verschiedene randomisierte kombinatorische Peptid-Bibliotheken konstruiert worden, um Polypeptide zu selektieren, die verschiedene Ziele binden, zum Beispiel Zelloberflächenrezeptoren oder DNA (Übersichtsartikel siehe Kay, 1995, Perspect. Drug Discovery Des., 2, 251–268; Kay und Paul, 1996, Mol. Divers. 1, 139–140). Proteine und multimere Proteine wurden erfolgreich über ein Phage-Display als funktionelle Moleküle präsentiert (siehe EP 0349578A, EP 0527839A, EP 0589877A; Chiswell und McCafferty, 1992, Trends Biotechnol. 10, 80–84). Außerdem wurden funktionelle Antikörperfragmente (z. B. Fab, single chain Fv [scFv]) exprimiert (McCafferty et al., 1990, Nature 348, 552–554; Barbas et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978–7982; Clackson et al., 1991, Nature 352, 624–628), und es wurden einige der Nachteile der Technologie der humanen molekularen Antikörper überwunden, da humane Antikörperfragmente mit hoher Affinität isoliert wurden (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222, 581–597; Hoogenboom und Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227, 381–388). Weitere Informationen über die Prinzipien und die Druchführung des Phage-Display finden sich in Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Hrsg. Kay, Winter und McCafferty (1996), Academic Press Inc., ISBN 0-12-402380-0, wobei diese Literaturstelle hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen wird.
Somit umfasst das Verfahren bei einer bevorzugten Ausführungsform des ersten und zweiten Aspektes der Erfindung ferner den Schritt der Expression der Polynucleotidsequenz(en), die im Schritt (c) zusammengefügt wurde(n), und das Screenen des resultierenden Polypeptids bzw. der resultierenden Polypeptide, das bzw. die eine variable Domäne des Antikörpers umfasst bzw. umfassen, bezüglich gewünschter Eigenschaften. Vorzugsweise können die gewünschten Eigenschaften mittels bekannter Techniken leicht selektiert werden. Zum Beispiel können Antikörper bezüglich einer gewünschten Affinität unter Einsatz affinitätschromatographischer Verfahren gescreent werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Weiterentwicklung der Technologie dar, die in WO 98/32845, bei Söderlind et al. (1999) Immunotechnology 4, 279–285 und Jirholt et al. (1998) Gene 215, 471–476, dargestellt wurde, wobei alle diese Literaturstellen hier in voller Länge aufgenommen werden, insbesondere zu dem Zweck, generell die Methoden und Bedingungen zu beschreiben, die zur Amplifizierung von CDRs aus einer cDNA-Bibliothek, die für Antikörper codierende Sequenzen enthält, verwendet werden, sowie der Methoden, Materialien und Bedingungen für den erneuten Einbau der so amplifizierten CDRs in das Master-Framework mittels einer Overlap-Extension-FCR.
Das Verfahren kann ferner den Schritt der Expression des resultierenden Antikörpers, der durch die zusammengefügte Nucleotidsequenz codiert wird, und das Screenen bezüglich gewünschter Eigenschaften umfassen. Dieses wird wiederum detailliert in den oben erwähnten Literaturstellen beschrieben.
Der resultierende exprimierte Antikörper kann bezüglich gewünschter Charakteristika gescreent werden. Zum Beispiel kann es erstrebenswert sein, seine Fähigkeit zur spezifischen Bindung an ein Antigen zu verändern oder seine Bindungseigenschaften im Vergleich zum Ausgangsantikörper zu verbessern. Dies wird wiederum detailliert in den oben erwähnten Literaturstellen beschrieben.
Vorzugsweise haben die Oligonucleotide, die als Amplifizierungsprimer verwendet werden, wenigstens zwei Nucleinsäurereste, die sich vom entsprechenden Abschnitt der Nucleinsäuresequenz, die für das Master-Framework codiert, unterscheiden. Bevorzugter liegen wenigstens 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 oder 12 unterschiedliche Nucleinsäurereste vor. Bei einer alternativen Definition zeigen die Amplifizierungsprimer vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 95% Sequenzübereinstimmung mit einem entsprechenden Teil der Nucleinsäuresequenz, die für das Master-Framework codiert, bevorzugter nicht mehr als ungefähr 90%, 85%, 80%, 70% oder 60% Sequenzübereinstimmung.
Bei der herkömmlichen CDR-Implantation können die Amplifizierungsprimer eine kleine Zahl von Nucleotiden aufweisen, die für einen oder mehrere Aminosäurerest(e) des angrenzenden Endes der CDR codiert (z. B. drei Nucleotide, die für einen CDR-Rest codieren). Das gilt auch für die vorliegende Erfindung, und in solchen Fällen können die Nucleotide der CDR unberücksichtigt bleiben, wenn die Zahl der Nucleotidunterschiede zwischen dem Primer und dem Master-Framework bestimmt wird.
Unter Berücksichtigung des Inhaltes dieser Erfindung und der zitierten Literaturstellen zur grundlegenden Technik der CDR-Implantation wird ein Fachmann auf diesem Gebiet imstande sein, Primer zur Amplifizierung der CDRs zu konstruieren, und, wenn es notwendig oder gewünscht ist, zur Modifizierung der Amplifizierungsprodukte, um ihre Framework-Bereiche dem ausgewählten Master-Framework ähnlicher zu machen.
Wenn auf ein bestimmtes Keimbahn-Gen abgezielt wird, dann können hochspezifische Primer gewünscht sein, die sich zum Beispiel eng an die Sequenz anlehnen, die für die Teile der Framework-Bereiche dieses Gens codieren, die die CDR oder CDRs, die amplifiziert werden soll(en), flankieren. Die Sequenzen verschiedener Keimbahn-Gene sind aus dem VBASE Sequence Directory erhältlich (URL: http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html) oder aus dem DNAplot Directory (URL: http://www.genetik.uni-koeln.de:80/dnaplot/vsearch_human.html).
Ähnlich können die Primer so konstruiert werden, dass sie CDRs aus einer bestimmten Keimbahn-Genfamilie amplifizieren, indem Primer auf der Basis der Konsensussequenz von Genen dieser Familie konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Konsensussequenz als diejenige Sequenz von Basen definiert werden, die sich bei > 90% der Loci einer bestimmten Keimbahn-Familie finden. Derartige Sequenzen können degenerierte Stellen einschließen, was anzeigt, dass unterschiedliche einzelne Sequenzen unterschiedliche Nucleotide an dieser Stelle aufweisen. Es können trotzdem gewisse gemeinsame Merkmale der Nucleotidreste, die an einer solchen degenerierten Stelle vorliegen, vorhanden sein; solche Stellen werden bezeichnet als R (Purin; Basen G und A), Y (Pyrimidin; C, T); M (Amino; A, C), K (Keto; T, G), S (stark; C, G), W (schwach, A, T), B (nicht A), D (nicht C), N (nicht G) oder V (nicht T). Eine Stelle, an der kein gemeinsames Merkmal vorliegt, wird als N (beliebig) bezeichnet.
Primer, die auf Konsensussequenzen basieren, die derartige Bezeichnungen einschließen, können degeneriert sein, d. h. es wird eine Population von Primern so hergestellt, dass alle möglichen Kombinationen, die mit der Konsensussequenz konsistent sind, eingeschlossen sind, oder wobei geeignete künstliche Basen, die bestimmte Basengruppen nachahmen, in einer homogenen Population von Primern enthalten sein können.
Informationen, die Keimbahn-Gene Keimbahn-Genfamilien zuordnen (beispielsweise den variablen schweren Keimbahn-Genfamilien V_H1, V_H2, V_H3, V_H4, V_H5, V_H6 und V_H7) sind über das oben erwähnte VBASE-Directory verfügbar.
Ähnlich ist es auch möglich, die Primer für die Amplifizierung der CDRs einer Vielzahl von Keimbahn-Genfamilien zu konstruieren, wobei eine Konsensussequenz von Keimbahn-Genen aus der genannten Vielzahl von Familien verwendet wird. Jedoch wird es im allgemeinen bevorzugt, auf ein bestimmtes Keimbahn-Gen oder eine bestimmte Keimbahn-Genfamilie abzuzielen.
Unter Berücksichtigung des Gesagten ist es für einen Fachmann möglich, die geeigneten Primer in Abhängigkeit von der benötigen Spezifität zu konstruieren. Vorzugsweise hat wenigstens ein Primer des Paares oder eines jeden Paares, das eingesetzt wird, um zunächst die CDRs zu amplifizieren, eine Länge von wenigstens 15 Nucleotiden, bevorzugter von wenigstens 18 Nucleotiden und noch bevorzugter von wenigstens 21 oder 24, gegebenenfalls wenigstens 30, 36 oder 42 Nucleotiden. Vorzugsweise hat der Primer jedoch eine Länge von nicht mehr als 42 Nucleotiden, bevorzugter von nicht mehr als 36 oder 30 und noch bevorzugter von nicht mehr als 27 Nucleotiden.
Vorzugsweise wird das Verfahren zur Implantierung von CDRs in allen drei Positionen der variablen Domäne eingesetzt, da das zu einer maximalen Variabilität und letztlich zu nützlicheren Bibliotheken führt. Das Verfahren ist jedoch nicht darauf beschränkt, und wenn es gewünscht wird (zum Beispiel zur Optimierung eines zuvor erhaltenen Antikörpers), dann kann die Methode eingesetzt werden, um lediglich eine CDR oder zwei CDRs zu implantieren. In solchen Fällen ist eine Nucleinsäure, die für die invariante(n) CDR(s) codiert, im Schritt der Overlap-Extension-PCR eingeschlossen, zusätzlich zu den neu amplifizierten CDRs und der Nucleinsäure, die für das ausgewählte Master-Framework codiert.
Die vorliegende Erfindung soll nicht so ausgelegt werden, dass sie auf das Implantieren von CDRs aus Immunglobulin-Genen des gleichen allgemeinen Typs wie dem des Master-Framework beschränkt ist (z. B. das Implantieren von V_H-CDRs in ein V_H-Master-Framework), obwohl dieses eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt. Statt dessen schließt die Erfindung in ihren weiteren Aspekten die Implantation einer für eine CDR codierenden Nucleinsäure aus einem beliebigen Typ von Immunglobulin-Genen ein, die eine variable Region, wie sie oben definiert ist, in einem Master-Framework enthalten, das unabhängig von jedem derartigen Typ eines Gens der Immunglobulin-Superfamilie ist. Zum Beispiel können Vλ-CDRs in ein V_H-Master-Framework eingefügt werden und umgekehrt. Darüber hinaus können beliebige Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie, die zu CDRs und FRs analoge Strukturen aufweisen, die erfindungsgemäßen CDRs und/oder Master-FRs bereit stellen, wobei die obige Beschreibung mutatis mutandis anwendbar ist.
Der Begriff „Antikörper" wird hier in seinem weitesten Sinne verwendet, und er soll auch Antikörperfragmente einschließen, die eine variable Domäne aufweisen, die CDRs enthält, die von Framework-Bereichen flankiert sind. Beispiele für Antikörperfragmente, die derartige variable Domänen enthalten, sind das Fab-Fragment, das aus den V_L-, V_H-, C_L- und C_H1-Domänen besteht, das Fd-Fragment, das aus den V_H- und C_H1-Domänen besteht, das Fv-Fragment, das aus den V_L- und V_H-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht, das dAb-Fragment, das aus einer V_H-Domäne besteht, und das F(ab')2-Fragment, ein bivalentes Fragment, das zwei Fab-Fragmente enthält, die über ein Disulfidbrücke in der Hinge-Region verknüpft sind. Einzelkettige Fv-Fragmente sind ebenfalls eingeschlossen.
Alle beliebigen gewünschten Master-Framework-Bereiche (oder „Framework-Bereiche (FRs) eines ausgewählten Typs") können in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Insbesondere können sie so ausgewählt werden, dass sie mit dem bakteriellen Expressionssystem und dem Phagensystem, die eingesetzt werden sollen, besonders kompatibel sind, wodurch ein hohes Ausmaß eines Displays von funktionellem Protein sicher gestellt wird. Bevorzugte Beispiele sind Framework-Bereiche aus den DP-47- und DPL-3-Keimbahn-Genen (der V_H3- bzw. Vλ-Keimbahn-Genfamilien).
Es wird mittlerweile allgemein davon ausgegangen, dass die CDR-Schleifen, die die Oberflächen der Bindungsstellen des Antikörpers ausmachen, in Abhängigkeit von ihrer Konformation nach der Faltung in eine begrenzte Anzahl sogenannter kanonischer Strukturen eingruppiert werden können. Die Pionierarbeiten auf diese Gebiet wurden von Chothia und Lesk (1987) durchgeführt, die die CDR1 und 2 in der schweren Kette und die CDR 1–3 in der leichten Kette in wenige grundlegende Strukturen einteilten.
Das Konzept der kanonischen Strukturen ist das Ergebnis extensiver Analysen empirisch bestimmter und analysierter Antikörperstrukturen. Die Determinanten für die kanonischen Konformationen sind die Längen der Schleifen, Schlüsselreste in den Schleifen und Schlüsselreste in den angrenzenden Framework-Sequenzen (Chothia et al. 1992; Tomlinson et al. 1995; Al-Lazikani et al. 1997). Beispielsweise können die humanen V_K-Sequenzen in 6 kanonische Strukturen für die CDRL1-Schleife, 1 kanonische Struktur für die CDRL2-Schleife und 5 kanonische Strukturen für die CDRL-3-Schleife eingruppiert werden. Ähnlich können die humanen V_H-Sequenzen in 3 kanonische Strukturen für die CDRH1-Schleife und 4 kanonische Strukturen für die CDRH2-Schleife eingruppiert werden.
Die CDRH3-Schleife ist noch nicht in einzelne kanonische Klassen eingeteilt worden, höchstwahrscheinlich aufgrund ihrer vererbten Längenvariation, die zu besonderen Eigenschaften bezüglich der Flexibilität führt. Kürzlich wurde jedoch gezeigt, dass diese CDR ebenfalls aus Strukturelementen, die einen grundlegenden Torso in der Nähe des Framework-Bereiches bilden und diesen in gewissem Umfang einschließen, sowie aus einem apikalen Kopfbereich, der manchmal eine zusätzlische Schulter einschließt, aufgebaut ist (Morea et al. 1998).
Es ist vorstellbar, dass die Natur unterschiedliche Typen kanonischer Strukturen entwickelt hat, um mit der Vielzahl antigener Strukturen umgehen zu können, denen Immunsysteme begegnen können. Die Natur präsentiert diese Strukturen auch im Kontext unterschiedlicher Framework-Strukturen. So findet sich eine spezifische CDR-Schleife in Kombination mit einem bestimmten Framework (VBASE). Es gibt offenbar auch einen Bias bezüglich der Verwendung kanonischer Strukturen, um geeignete Oberflächen, die komplementär zu unterschiedlichen Antigen-Typen sind, zu erzeugen. Im einzelnen scheinen Schleifen mit kanonischen Strukturen, die eine flache Oberfläche aufbauen, Oberflächen zu ergeben, die gut an große Proteinantigene binden. Diese Schleifen neigen dazu, ziemlich kurz zu sein, während sich längere Schleifen vorzugsweise in Antikörpern finden, die spezifisch für kleinere Moleküle, z. B. Haptene, sind (Lara-Ochoa et al. 1996). Nicht alle Schleifen sind anscheinend für die Erzeugung einer Variabilität der Oberflächen von gleicher Bedeutung. Natürlich ist H3 von besonderer Bedeutung in dieser Beziehung, aber auch H2 und L1 bestimmen die Oberflächen in großem Ausmaß (Vargas-Madrazo et al. 1995).
Beim Einsatz der CDR-Implantationstechnik wurde unerwarteterweise gefunden, dass einige der ausgewählten Antikörper CDRs mit kanonischen Strukturen umfassten, die man normalerweise nicht im verwendeten Framework findet. Diese Antikörper sind funktionell, da sie ihr Antigen mit hoher Affinität binden (Beispiel 1). Somit ist es bei Verwendung nur eines Framework möglich, eine funktionelle Variabilität der Bindungsstellen von Antikörpern zu erzeugen, die auf kanonischen Schleifen basiert, die im Kontext eines bestimmten Framework atypisch sind. Eine auf einem solchen Konzept basierende Bibliothek hätte gegenüber konventionelleren Bibliotheken Vorteile, da sie Antikörper mit einer großen Vielzahl von Topologien enthalten kann und gleichzeitig im ausgewählten Wirtssystem (z. B. E. coli) äußerst effektiv sein kann. Weiterhin könnten die Bindungscharakteristika von Antikörpern über ein Shuffling ausgewählter CDRs verbessert werden, um die optimalsten CDRs in nur einem Antikörpermolekül zu rekombinieren. Es dürfte klar sein, dass die CDR-Implantationstechnik das Shuffling von 1 bis 6 CDRs zur gleichen Zeit ermöglicht, und sie wurde auf der Basis der hier präsentierten Bibliothek in den Beispielen eingesetzt, um die Affinitäten ausgewählter Antikörper in einem einzigen Schritt 30-fach zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung kann somit zu neuartigen Kombinationen von Klassen kanonischer Strukturen führen, z. B. über das Kombinieren kanonischer Strukturen von Klassen, die sich normalerweise nicht in Genen der gleichen Keimbahn-Familie finden. Zum Beispiel kann durch das Inkorporieren von CDRH2-CDRs in die CDRL2-Position einer V_K-Kette die Variabilität aus 4 Klassen kanonischer Strukturen in diese Position eingeführt werden, während beim natürlichen V_K-Antikörper nur eine Klasse kanonischer Strukturen in der CDRL2-Position eingesetzt wird.
Vorzugsweise werden die Amplifizierungsprimer so konstruiert, dass sie CDRs einer Anzahl von Klassen kanonischer Strukturen amplifizieren, die größer ist als die Zahl von Klassen kanonischer Strukturen, die sich in der Keimbahn-Genfamilie finden, zu der das Master-Framework gehört, oder CDRs aus anderen Klassen kanonischer Strukturen als denjenigen, die sich in der Keimbahn-Genfamilie finden, zu der das Framework gehört. Vorhersagen der kanonischen Struktur, die von einer bestimmten CDR angenommen wird, können mittels eines online verfügbaren Tools mit der folgenden URL gemacht werden:
http://www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/chothia.html.
Das Master-Framework muss nicht ein natürlich vorkommendes sein, aber es kann beispielsweise optimiert worden sein, zum Beispiel für die Expression oder das verwendete Phagensystem oder um die Antigenität in vivo zu vermindern.
Die CDRs, die amplifiziert wurden, können einer Mutagenese unterzogen werden, zum Beispiel unter Einsatz einer fehlerträchtigen PCR, ehe sie in das Master-Framework inkorporiert werden (z. B. wie es in WO 98/32845 beschrieben wurde), obwohl das nicht generell bevorzugt wird, da natürlich vorkommende CDRs mit geringerer Wahrscheinlichkeit als künstliche antigen sind.
„Die prozentuale (%) Übereinstimmung der Nucleinsäuresequenzen" ist als prozentualer Anteil der Nucleinsäurereste in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Nucleinsäureresten in der Sequenz identisch sind, mit der sie verglichen werden, und zwar nach dem Ausrichten der Sequenzen und der Einführung von Lücken, wenn es erforderlich ist, um die maximale prozentuale Sequenzübereinstimmung zu erzielen, ohne dass mögliche konservative Substitutionen als Teil der Sequenzübereinstimmung in Betracht gezogen werden. Die Werte für die prozentuale Übereinstimmung, die hier verwendet werden, wurden mittels des BLASTN-Moduls von WU-BLAST-2 erzeugt (das von Altschul et al. (1996) erhalten wurde; URL: http://blast.wustl/edu/blast/README.html). WU-BLAST-2 verwendet verschiedene Suchparameter, von denen die meisten voreingestellt sind. Die einstellbaren Parameter sind auf die folgenden Werte eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125. Ein Prozentwert für die Sequenzübereinstimmung der Nucleinsäure wird über die Zahl der übereinstimmenden identischen Reste geteilt durch die Gesamtzahl der Reste der „längeren" Sequenz der ausgerichteten Region multipliziert mit 100 bestimmt. Die „längere" Sequenz ist diejenige, die die meisten Reste in der ausgerichteten Region aufweist (Lücken, die von WU-BLAST-2 eingeführt wurden, um die Ausrichtung zu maximieren, werden dabei ignoriert).
Die folgenden Beispiele werden gebracht, um ein besseres Verständnis der Erfindung zu ermöglichen, und sie beziehen sich auf die folgenden begleitenden Figuren:
1 (Teile A bis D) zeigt die Inkorporation einer CDRH2-Schleife aus dem Keimbahn-Gen DP-29 in ein Framework von DP-47.
2 (Teile A bis E) zeigt die Inkorporation einer CDRH2-Schleife aus dem Keimbahn-Gen DP-73 in ein Framework von DP-47.
BEISPIELE
Konstruktion von Primern und Zusammenbau von Antikörpergenen
Es werden Primer, die sich von den entsprechenden Sequenzen im DP-47-Framework unterscheiden, zur Amplifizierung von CDRs von verschiedenen Keimbahn-Genen verwendet. Im Beispiel 1A sind das Master-Framework und das Framework des Gens, aus dem die CDR amplifiziert wird (DP-29), ausreichend ähnlich, so dass die so amplifizierte Sequenz ohne eine weitere Modifikation in ein DP-47-Framework inkorporiert werden kann. Im Beispiel 1B sind die Framework unterschiedlicher, und die so amplifizierte Sequenz wird weiter modifiziert, um sie dem DP-47-Framework ähnlicher zu machen, ehe sie in dieses inkorporiert wird. Das wird über den Einsatz von Primern erreicht, die sukzessive die Framework-Bereiche, die die CDRs flankieren, in einem konstruierten und geplanten iterativen Prozess an das ausgewählte Framework anpassen. Auf diese Weise ist es möglich, CDR-Schleifen aufzunehmen, die kanonische Strukturen aufweisen, die für das ausgewählte DP-47 Framework atypisch sind.
Wenn es wie hier gewünscht wird, eine spezifische CDR in ein Master-Framework zu inkorporieren, dann kann es vorteilhaft sein, die Homologie (d. h. die prozentuale Übereinstimmung) zwischen dem ausgewählten Framework und dem Framework, das die atypische CDR umgibt, die in das ausgewählte Framework inkorporiert werden soll, zu bestimmten. Natürlich ist es, wenn man Primer einer bekannten Sequenz für das „Fischen" nach CDRs in einer Bibliothek einsetzt, wichtiger, die Homologie zwischen den Primern und der Framework-Sequenz zu bestimmen.
Das Ausmaß der Homologie bestimmt die Zahl der PCR-Amplifizierungsschritte, die erforderlich sind, um die atypische CDR im ausgewählten Framework zu erhalten. Das bedeutet, dass ein geringeres Ausmaß an Homologie zu mehreren sequenziellen PCR-Schritten führt, um das ursprüngliche FR, das die atypische CDR flankiert, in die Sequenz des ausgewählten FR zu überführen.
Beispiel 1A
1 zeigt die Sequenzen und die Schritte, die in die Amplifizierung der CDRH2 von DP-29 involviert sind, sowie deren Inkorporation in eine Nucleinsäure, die für das Framework von DP-47 codiert.
Teil A zeigt die Nucleinsäuresequenzen, die für Teile der Framework-Bereiche codieren, die die CDRH2-Schleifen von DP-47 und DP-29 flankieren, sowie die abgeleiteten Aminosäuresequenzen. Nucleotidübereinstimmungen sind mit dem Symbol I bezeichnet. Wie man sieht, liegen einige Fehlpaarungen vor: 8 von 36 Nucleotiden bzw. 7 von 27 Nucleotiden in den beiden gezeigten flankierenden Abschnitten.
Teil B zeigt die Amplifizierungsprimer („Nr.-1-Primer"), die identisch mit den codierenden Abschnitten der Nucleinsäure der Framework-Bereiche sind, die die CDRH2-Schleifen von DP-29 flankieren, ausgerichtet mit der doppelsträngigen, für DP-29 codierenden Sequenz.
Teil C zeigt das Amplifizierungsprodukt („Nr.-1-Produkt) des ersten PCR-Schrittes (der im Teil B gezeigt wurde). Die Bedingungen für die Amplifizierung sind die gleichen wie die für die CDR-Amplifizierung in WO 98/32845. Das Nr.-1-Produkt ist mit der codierenden Sequenz von DP-29 identisch. Mit dieser ausgerichtet sind die Primer („Nr.-2-Primer") für einen zweiten PCR-Schritt. Diese sind mit den Nucleinsäuren identisch, die für entsprechende Abschnitte der Framework-Bereiche codieren, die die CDRH2-Schleifen von DP-47 flankieren. Dementsprechend liegen die gleichen Fehlpaarungen vor wie im Teil A.
Teil D zeigt das Produkt („Nr.-2-Produkt") des zweiten PCR-Schrittes. Dieses hat die Framework-Bereiche von DP-47 (das Master-Framework) und die CDRH2-Schleife von DP-29.
Somit besteht eine ausreichende Sequenzübereinstimmung zwischen den Framework-Bereichen von DP-47 und DP-29, die die CDRH2-Schleife flankieren, so dass die Schleife in einem einzigen PCR-Schritt von dem einen Framework in das andere übertragen werden kann.
Das Keimbahn-Gen DP-29 codiert für eine CDRH2 der kanonischen Klasse 4 (VBASE), während die CDRH2 von DP-47 zur kanonischen Klasse 3 (VBASE) gehört.
Der zweite PCR-Schritt könnte als eine Overlap-Extension-PCR durchgeführt werden, da der verwendete Primer mit der Master-Framework-Sequenz identisch ist, in die die CDR inkorporiert werden soll, beispielsweise unter Einsatz der Bedingungen (und anderer Primer), die in WO98/32845 dargelegt sind.
Beispiel 1B
Es wird ein iterativer Prozess aus sequenziellen PCR-Amplifizierungen verwendet, um in ein Master-Framework von DP-47 eine CDR aus einem Keimbahn-Gen (DP-73) einzufügen, das in ausreichendem Maß unterschiedliche Sequenzen aufweist, die für die Abschnitte der Framework-Bereiche codieren, die die CDR flankieren. In diesem Beispiel ist die Homologie zwischen dem DP-47-VH-Framework, das an die CDRH2 angrenzt, und dem DP-73 Framework zu gering, als dass sie eine direkte Amplifizierung (z. B. in einem Overlap-Extension-PCR-Schritt) unter Verwendung von Primern, die vollständig identisch mit DP-47 sind, erlauben würde. Somit werden mehrere einzelne PCR-Schritte eingesetzt, wobei jeder Schritt ein anderes Primerpaar einsetzt. Die Primer werden sukzessive so modifiziert, dass sie homologer zum DP-47-Primer werden.
Bei diesem Prozess ist es wichtig, die richtige Verteilung der Basenmodifikationen sorgfältig auszuwählen. 2 zeigt diesen Prozess. Die unterstrichene Sequenz ist diejenige, bei der die größten Unterschiede zwischen DP-47 und DP-73 vorliegen. Fette Buchstaben bezeichnen Reste in den Primern, die identisch mit denjenigen in DP-47, dem Master-Framework, sind.
Die Teile A und B sind den gleichen Teilen in der 1 analog. Wiederum liegen Fehlpaarungen zwischen den Sequenzen vor, die für die Abschnitte des Framework codieren, die die CDRH2-Schleifen von DP-47 und DP-73 flankieren, und zwar 13 Fehlpaarungen in 42 Nucleotiden bzw. 9 Fehlpaarungen in 27 Nucleotiden in den beiden flankierenden Sequenzen.
Im Teil C werden anstelle der Verwendung von Primern, die identisch mit DP-47 sind, Primer verwendet, die Schimären von DP-47 und DP-73 sind, um Veränderungen in die Framework-Bereiche des amplifizierten DP-73-Fragmentes einzuführen und sie zum Teil in Übereinstimmung mit denen von DP-47 zu bringen. So liegen, statt dass keine Fehlpaarungen zwischen den Primern und den DP-47-Sequenzen vorliegen (wie im Beispiel 1A), immer noch einige Fehlpaarungen vor, wenn auch weniger als vorher, d. h. zwei in jeder flankierenden Sequenz.
Teil D zeigt das Amplifizierungsprodukt („Nr.-2-Produkt") des zweiten PCR-Schrittes, ausgerichtet mit Primern („Nr.-3-Primern"), die mit den entsprechenden Abschnitten des DP-47-Framework identisch sind. Wie beim Beispiel 1A könnten solche Primer in einer Overlap-Extension-PCR eingesetzt werden. Der dritte Amplifizierungsschritt (analog dem zweiten im Beispiel 1A) führt zu einem Fragment, das die CDRH2 von DP-73 in einem Framework von DP-47 inkorporiert enthält.
Im einzelnen werden beim zweiten PCR-Schritt (der die Nr. 2-Primer einsetzt, die in Teil C gezeigt sind) die folgenden Basensubstitutionen im oberen PCR-Primer gegenüber dem Nr.-1-Primer, der im ersten PCR-Schritt (gezeigt in Teil B) eingesetzt wurde, eingeführt: In der Position 35 (gezählt vom 5'-Ende des Primers) wird G gegen C ausgetauscht, in der Position 37 wird A gegen G und in der Position 38 T gegen C ausgetauscht. Das führt zu einem höheren Ausmaß an Homologie als wenn ein Primer, der homolog zu DP-47 ist, direkt im zweiten PCR-Schritt eingesetzt würde.
Das mittlere PCR-Produkt aus dem zweiten PCR-Schritt enthält demnach immer noch Basen, die homolog zur DP-73-Sequenz sind (C36 und C39). Diese Basen wirken dann nicht als Primer im dritten PCR-Schritt, da der obere in diesem Schritt eingesetzte Primer zu 100% homolog zur DP-47-Sequenz ist. Jedoch sind die Basen 34, 37 und 38 des Amplifizierungsproduktes („Nr.-2-Produkt") des zweiten Amplifizierungsschrittes nun homolog zur DP-47-Sequenz, und diese Homologie führt zu einer Hybridisierung von 6 der 8 Basen am 3'-Ende (unterstrichen) des oberen Primers im dritten PCR-Schritt (gezeigt im Teil D). Das muss mit 3 von 8 Basen am 3'-Ende zwischen DP-47 und DP-73 verglichen werden. Ein derartiger Anstieg der Homologie erleichtert die erfolgreiche Erzeugung einer DNA-Sequenz, die die CDRH2 von DP-73 im DP-47-Framework aufweist, sehr.
Mittels der Prinzipien dieser Verfahren kann jede beliebige CDR in ein vorgegebenes und ausgewähltes Framework transferiert werden, was zu zusammengesetzten Antikörpermolekülen führt, die Kombinationen aus natürlichen CDR-Schleifen besitzen und somit möglicherweise auch kanonische Strukturen, die in der Natur nicht gefunden werden können. Somit liefert die Kombination atypischer, aber natürlicher CDR-Schleifen eine Basis für die Erzeugung einer enormen Variabilität der Antikörperbindungsstelle, und die erzeugten Varianten können in großen Bibliotheken festgehalten werden, z. B. unter Verwendung von Phage- (Marks et al. 1991), Ribosomen- (Hanes und Pluckthun, 1997) oder kovalenter (WO 98/37186) Display-Technologien.
Literaturstellen

Adkins JC, Spencer CM (1998) Drugs 56 (4): 619–26; Diskussion 627–8
Al-Lazikani B, Lesk AM, Chothia C (1997) J Mol Biol 273 (4): 927–48
Chothia C, Lesk AM (1987) J Mol Biol 186: 651–663
Chothia C et al. (1987) J Mol Biol 196: 901–917
Chothia C et al. (1989) Nature 342: 877–883
Chothia C, Lesk AM, Gherardi E, Tomlinson IM, Walter G, Marks JD, Llewelyn MB, Winter G (1992) J Mol Biol 227 (3): 799–817
D'haens G, Van Deventer S, Van Hogezand R et al. (1999) Gastroenterology 116 (5); 1029–34
Duenas M, Borrebaeck CA (1994) Biotechnology (NY) 12 (10): 999–1002
Griffiths AD et al. (1993) EMBO J 12 (2): 725–734
Griffiths AD et al. (1994) EMBO J 13 (14): 3245–3260
Griffiths AD und Duncan AR (1998) Curr Opin Biotechnol 9: 102–108
Hanes J und Pluckthun A (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 (10): 4937–42
Hoogenboom HR, Winter G (1992) J Mol Biol 227 (2): 381–8
Jirholt P; Ohlin M, Borrebaeck CAK, Soderlind E (1998) Gene 215 (2): 471–476
Kobayashi N, Soderlind E, Borrebaeck CAK (1997) Biotechniques 23 (3): 500–503
Lara-Ochoa F, Almagro JC, Vargas-Madrazo E, Conrad M (1996) J Mol Evol 43: 678–684
Larrick JW, Danielsson L, Brenner CA et al. (1989) Bio/Technology 7: 934
Malmborg AC, Duenas M, Ohlin M et al. (1996) J Immunol Methods 198 (1): 51–7
Malmborg AC, Soderlind E, Frost L, Borrebaeck CA (1997) J Mol Biol 273 (3): 544–51
Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP et al. (1991) J Mol Biol 222 (3): 581–597
McLaughlin P, White CA, Grillo-Lopez AJ, Maloney DG (1998) Oncology (Huntingt) 12 (12): 1763–9; Diskussion 1769–70, 1775–7
Morea V, Tramontano A, Rustici M, Chothia C, Lesk AM (1998) J Mol Biol 275: 269–294
Nissim A, Hoogenboom HR, Tomlinson IM et al. (1994) EMBO J 13: 692–698
Palares et al. (1999) Exp Clin Immunogenet 16: 36–60
Pini A, Viti F, Santucci A, Carnemolla B et al. (1998) J Biol Chem 273 (34): 21769–21776
Sheets MD, Amersdorfer P, Finnern R et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95 (11): 6157–6162
Söderlind et al. (1999) Immunotechnology 4: 279–285
Tomlinson IM, Cox JP, Gherardi E et al. (1995) EMBO J 14 (18): 4628–38
Vargas-Madrazo E, Lara-Ochoa F, Almagro JC (1995) J Mol Biol 254: 497–504
Vaughan TJ, Williams AJ, Pritchard K et al. (1996) Nat Biotechnol 14 (3): 309–314
Williamson RA, Burioni R, Sanna PP et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 4141–4145
Zebedee SL et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 3175–3179

Claims

Verfahren zur Erzeugung einer Polynucleotidsequenz, die für eine variable Antikörperdomäne codiert, wobei die variable Domäne complementarity-determining regions (CDRs) umfasst, die in einem ausgewählten Framework (dem „Master-Framework") lokalisiert sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen wenigstens eines Nucleinsäuremoleküls, das für eine CDR oder mehrere CDRs und assoziierte Framework-Regionen (das „ursprüngliche Framework") codiert, b) Amplifizieren wenigstens eines CDR-codierenden Abschnittes des Nucleinsäuremoleküls/der Nucleinsäuremoleküle des Schrittes (a) unter Verwendung eines Oligonucleotidpaares oder mehrerer Oligonucleotidpaare als Primer für die Amplifizierung, und c) Zusammensetzen einer Polynucleotidsequenz, die für eine variable Antikörperdomäne codiert, durch das Kombinieren der amplifizierten, CDR-codierenden Nucleotidsequenzen, die im Schritt (b) erzeugt wurden, mit Nucleotidsequenzen, die für das genannte Master-Framework codieren, wobei die Oligonucleotidprimer aus Schritt (b) Nucleotidsequenzen umfassen, die sich von den entsprechenden Oligonucleotidsequenzen unterscheiden, die für das genannte Master-Framework codieren.
Verfahren zur Erzeugung einer Bibliothek von Polynucleotidsequenzen, von denen jede für eine variable Antikörperdomäne codiert, die complementarity-de termining regions (CDRs) umfasst, die in einem gemeinsamen ausgewählten Framework (dem „Master-Framework") lokalisiert sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Population von Nucleinsäuremolekülen, die für eine oder mehrere complementarity-determining region(s) (CDR(s)) und assoziierte Framework-Regionen (das „ursprüngliche Framework") codieren, b) Amplifizieren wenigstens eines CDR-codierenden Abschnittes der Nucleinsäuremoleküle des Schrittes (a) unter Verwendung eines Oligonucleotidpaares oder mehrerer Oligonucleotidpaare als Primer für die Amplifizierung, und d) Zusammensetzen einer Polynucleotidsequenz, die für eine variable Antikörperdomäne codiert, durch das Kombinieren der amplifizierten, CDR-codierenden Nucleotidsequenzen, die im Schritt (b) erzeugt wurden, mit Nucleotidsequenzen, die für das genannte Master-Framework codieren, wobei die Oligonucleotidprimer aus Schritt (b) Nucleotidsequenzen umfassen, die sich von den entsprechenden Oligonucleotidsequenzen unterscheiden, die für das genannte Master-Framework codieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, das die folgenden Schritte umfasst: i) Bereitstellen wenigstens eines Oligonucleotidpaares, ii) Verwendung jedes der genannten Oligonucleotidpaare als Primer für die Amplifizierung von Nucleotidsequenzen, die für unterschiedliche CDRs codieren, und iii) Zusammensetzen von Polynucleotidsequenzen, die für variable Antikörperdomänen codieren, durch das Inkorporieren von Nucleotidsequenzen, die aus dem obigen Schritt (ii) stammen, in Nucleotidsequenzen, die für das genannte Master-Framework codieren, wobei die Oligonucleotide aus dem Schritt (i) Sequenzen aufweisen, die sich von entsprechenden Sequenzen unterscheiden, die für das genannte Master-Framework codieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die im Schritt (c) zusammengesetzte(n) Polynucleotidsequenz(en) für eine variable Domäne eines Immunglobulins G (IgG) codiert bzw. codieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die im Schritt (c) zusammengesetzte(n) Polynucleotidsequenz(en) für eine schwere Kette oder eine leichte Kette eines IgG codiert bzw. codieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die im Schritt (c) zusammengesetzte(n) Polynucleotidsequenz(en) für eine nicht natürlich vorkommende variable Antikörperdomäne codiert bzw. codieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei wenigstens eine der im Schritt (c) zusammengesetzten Polynucleotidsequenzen für eine variable Antikörperdomäne codiert, die wenigstens eine CDR umfasst, die eine kanonische Struktur hat, die für CDRs in natürlich vorkommenden variablen Antikörperdomänen, die das Master-Framework umfassen, untypisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei wenigstens eine der im Schritt (c) zusammengesetzten Polynucleotidsequenzen für eine variable Antikörperdomäne codiert, die wenigstens eine CDR umfasst, die von einer anderen Keimbahn-Genfamilie als derjenigen des Master-Frameworks abstammt.
Verfahren gemäß 1 oder 2, wobei der Schritt (a) das Bereitstellen einer Population von Nucleinsäuremolekülen umfasst, von denen jedes für eine variable Antikörperdomäne codiert.
Verfahren gemäß 9, wobei jedes der Nucleinsäuremoleküle für eine variable Antikörperdomäne aus der gleichen Keimbahn-Genfamilie codiert.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Paare der Oligonucleotidprimer aus Schritt (b) selektiv mit einer Ziel-Subpopulation von Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, die im Schritt (a) bereit gestellt wurden.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei jedes Nucleinsäuremolekül der Ziel-Subpopulation für eine variable Antikörperdomäne aus der gleichen Keimbahn-Genfamilie codiert.
Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 12, wobei jedes Nucleinsäuremolekül für eine variable Antikörperdomäne codiert, die vom gleichen Keimbahn-Gen ab stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das Keimbahn-Gen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DP-29 und DP-73 besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Master-Framework von einem Keimbahn-Gen abstammt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DP-47 und DPL-3 besteht.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15, das einen weiteren Schritt, der nach dem Schritt (b) und vor dem Schritt (c) durchgeführt wird, des Modifizierens der Nucleotidsequenz der amplifizierten CDR-codierenden Moleküle aus dem Schritt (b) umfasst, so dass die Abschnitte der genannten amplifizierten Moleküle, die für Framework-Regionen codieren, eine größere Sequenzübereinstimmung mit den entsprechenden Abschnitten des Master-Frameworks zeigen.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Nucleotidsequenzen der amplifizierten CDR-codierenden Moleküle aus dem Schritt (b) so modifiziert werden, dass die Abschnitte der genannten amplifizierten Moleküle, die für Framework-Regionen codieren, eine 100%-ige Sequenzübereinstimmung mit den entsprechenden Abschnitten des Master-Frameworks aufweisen.
Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei der weitere Schritt eine einzige Runde einer PCR-Amplifizierung unter Verwendung von Oligonucleotidprimern umfasst, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die eine Schimäre der Nucleotidsequenzen ist, die für das ursprüngliche Framework und das Master-Framework codieren.
Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei der weitere Schritt das Durchführen einer oder mehrerer zusätzlichen Runde(n) einer PCR-Amplifizierung der CDR-codierenden Nucleinsäuremoleküle umfasst, die im Schritt (b) erzeugt wurden, wobei jede zusätzliche Amplifizierungsrunde unter Verwendung von Oligonucleotidprimern durchgeführt wird, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die eine zunehmende Anzahl von Nucleotid-Fehlpaarungen gegenüber der ursprünglichen Framework-Sequenz aufweist, wobei diese Fehlpaarungen eine Sequenzübereinstimmung mit den entsprechenden Nucleotiden des Master-Frameworks aufweisen.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt (c) den Einsatz einer Overlap-Extension-PCR umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, das einen weiteren Schritt aus dem Einfügen der Polynucleotidsequenz(en), die im Schritt (c) zusammengesetzt wurde(n), in einen Expressionsvektor umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei der Expressionsvektor ein Phage-Display-Vektor ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 22, das ferner den Schritt der Expression der Polynucleotidsequenz(en), die im Schritt (c) zusammengesetzt wurde(n), und das Screenen des resultierenden Polypeptids bzw. der resultierenden Polypeptide, das eine variable Antikörperdomäne aufweist bzw. die eine variable Antikörperdomäne aufweisen, bezüglich gewünschter Eigenschaften umfasst.