NO330262B1 - Fremgangsmate for in vitro molekylaer utvikling av antistoff virkning, in vitro. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelsen angår en framgangsmåte for molekylær utvikling av antistoff virkning, in vitro.

Bakgrunn

WO 98/32845, Soderlind et al (1999) og Jirholt et al (1998) beskriver in vitro molekylær utvikling av antistoff-utledete proteiner, ved å implantere naturlig forekommende komplementær-bestemmende regioner (CDRer) inn i ei definert og utvalgt ("hoved") ramme, omfattende ramme-regionene fra kjønnscellelinje-genet DP-47 i VH3 familien. Oligonukleotidprimere, basert på sekvensene som koder for deler av ramme-regionene av DP-47 som umiddelbart flankerer CDRene, blir brukt for å amplifisere nukleinsyre-sekvenser som koder for CDRer fra et DNA-bibliotek framstilt av perifere blod-B-celler. Enkelt-trådet DNA fra amplifiserings-reaksjonen blir deretter kombinert med overlappende oligonukleotider som koder for det gjenværende av hovedramma i en overlapps-ekspansjons PCR-reaksjon, for å produsere sekvenser i full lengde som koder for VH antistoff områder, som hver inneholder ramme-regioner av DP-47 kjønnscellelinje-genet, og CDRer fra kjønnscellelinje-genene i VH3 familien.

Denne teknikken framskaffer et verdifullt hjelpemiddel for å øke mangfoldet i antistoffbibliotek (f.eks. fagdisplay-bibliotek), særlig ettersom det tillater rekombinasjon av CDR1 og CDR2, som vanligvis blir forbundet in vivo og ikke gjennomgår rekombinasjon i løpet av rearrangeringen av kjønnscellelinje-genet.

Dessuten har CDRene blitt korrekturlest in vivo og det er lite trolig at disse er immunogene, hvilket gir en fordel i forhold til kunstig muterte CDR-sekvenser. Hovedrammene som er benyttet (fra kjønnscellelinje DP-47 og DPL3) er også valgt for å være svært kompatible med bakterie-ekspresjonen og fagsystemet som er benyttet, og en høy grad av funksjonelt protein-display er derfor sikret.

Et annet viktig aspekt ved oppbyggingen av biblioteket var et krav til ramma om å kunne holde spesifisiteter med høy affinitet, mot en lang rekke forskjellige typer antigener. Ettersom systemet tillater at variabilitet kan introduseres i hvilket som helst nummer av CDR posisjonene, blir den oppnådde variabiliteten stor, langt utover det som kan oppnås med tidligere etablerte kombinasjons-teknologier. Endelig gjør modulprosjekteringen, dvs. det faktum at variabilitet er introdusert i en vanlig ramme-struktur, påfølgende modifikasjoner og studier av utvalgte kloner enkelt og effektivt.

Ved bruk av denne teknologien, forsøksvis kalt CDR-implantasjon, har et stort fag-display antistoff-bibliotek basert på enkelt-trådet Fv (scFv) format, blitt dannet. Biblioteket blir brukt for å velge en gruppe høy-affinitets antistoff mot en rekke ligand-typer, inkludert proteiner (av human og ikke-human opprinnelse), peptider, karbohydrater og lav-molekylvekts haptener. Fra et funksjonelt synspunkt er det derfor klart at ei enkel, utvalgt hovedramme kan holde antistoff spesifisiteter med høy affinitet mot ganske forskjellige typer antigener, hvilket antyder at topologien på overflatene kan variere stort mellom antistoffene.

Det gjenstår imidlertid et generelt behov innen faget for å øke mangfoldet i antistoff-bibliotekene.

Oppfinnelsen

I samsvar med foreliggende oppfinnelse blir nukleinsyrer som koder for et CDR som vanligvis finnes i ei ramme (den "opprinnelige ramma"), som er forskjellig fra ei utvalgt hovedramme, amplifisert fra et immunoglobulin-gen og satt inn i en nukleinsyre som koder for den utvalgte hovedramma.

Amplifisering kan være gjennomført som for vanlige CDR-implantasjoner som beskrevet ovenfor, ved PCR ved bruk av primere basert på ramme-regioner som flankerer CDRene. I den foreliggende oppfinnelsen er det imidlertid forskjell mellom den opprinnelige ramma og hovedramma. I motsetning til tidligere beskrevne CDR implantasjons-metoder blir derfor nukleinsyrer som koder for CDR ikke amplifisert ved bruk av primere basert eksklusivt på hovedramma. Det blir heller benyttet primere som skiller seg fra sekvensen som koder for hovedramma. Primerne kan være basert på en spesifikt gitt annen ramme, f.eks. fra et annet kjønnscellelinje-gen, eller en konsensus-sekvens av en kjønnscellelinje-genfamilie, eller de kan være degenererte, f.eks. for å amplifisere CDRer fra en rekke kjønnscellelinje-familier.

I et første aspekt framskaffer derfor foreliggende oppfinnelse en framgangsmåte for produksjon av en polynukleotid-sekvens som koder for et antistoff-variabelt område, det variable området omfatter komplementær-bestemmende regioner (CDRer) plassert inne i ei valgt ramme ("hovedramma"), framgangsmåten omfatter trinnene: a) framskaffing av i det minste ett nukleinsyre-molekyl som koder for en eller flere CDRer og tilhørende ramme-regioner (den opprinnelige ramma); b) amplifisering av i det minste en CDR-kodende del av nukleinsyre-molekylet (ene) i trinn a) ved bruk av ett eller flere par oligonukleotider som amplifiserings-primere, og c) sammensetting av en polynukleotid-sekvens som koder for et antistoff-variabelt område ved å kombinere de amplifiserte CDR kodende nukleotid-sekvensene produsert i trinn b) med

nukleinsyre-sekvenser som koder for hovedramma,

idet oligonukleotid-primerne fra trinn b) omfatter nukleotid-sekvenser som er forskjellig fra de tilsvarende nukleotid-sekvensene som koder for hovedramma.

Et andre aspekt av oppfinnelsen framskaffer en framgangsmåte for produksjon av et bibliotek av polynukleotid-sekvenser som hver koder for et antistoff-variabelt område som omfatter komplementær-bestemmende regioner (CDRer) plassert inne i ei felles valgt ramme (hovedramma), framgangsmåten omfatter trinnene: a) framskaffing av en populasjon av nukleinsyre-molekyl som koder for et eller flere komplementær-bestemmende regioner (CDRer) og tilhørende ramme-regioner (den opprinnelige ramma); b) amplifisering av i det minste en CDR-kodende del av nukleinsyre-molekylet (ene) i trinn a) ved bruk av ett eller flere par oligonukleotider som amplifiserings-primere, og c) sammensetting av en polynukleotid-sekvens som koder for et antistoff-variabelt område ved å kombinere de amplifiserte CDR-kodende nukleotid-sekvensene produsert i trinn b) med

nukleinsyre-sekvenser som koder for hovedramma,

idet oligonukleotid-primerne fra trinn b) omfatter nukleotid-sekvenser som er forskjellig fra de tilsvarende nukleotid-sekvensene som koder for hovedramma.

Med "tilhørende ramme-regioner" slik det benyttes i forhold til nukleinsyre-molekylene framskaffet i trinn a), er det ment aminosyre-rester av ramme-regionen som umiddelbart flankerer CDRen. For eksempel kan nukleinsyre-molekylet (ene) i trinn a) kode for en CDR sammen med opptil 5, 10,15 eller flere aminosyre-rester i ramma som flankerer en av sidene av CDRen. På denne måten kan nukleinsyre-molekylet(ene) kode for en antistoff-variabel region eller til og med et helt antistoff.

Med "forskjellig fra" i forbindelse med nukleotid-sekvenser av oligonukleotid-primerne i trinn b) er det ment at regionene av oligonukleotid-primerne i trinn b) som koder for ramme-rester (dvs de regionene av oligonukleotid-primerne som er komplementære med regioner på nukleinsyre-molekylene som er framskaffet i trinn a) som koder for ramme-rester), ikke har 100 % sekvens-identitet med de tilsvarende regionene på nukleinsyre-molekylene som koder hovedramma.

I en foretrukket utførelse av de første og andre aspektene av oppfinnelsen, omfatter framgangsmåten trinnene: i) framskaffing av i det minste ett par oligonukleotider;

ii) bruk av hvert nevnte oligonukleotid-par som amplifiserings-primere for å amplifisere nukleotid-sekvenser som koder for ulike CDRer, og

iii) sammensetting av polynukleotid-sekvenser som koder for antistoff-variable områder ved å inkorporere nukleotid-sekvenser utledet fra trinn ii) ovenfor med nukleotid-sekvenser som koder for ramme-sekvenser (FRer) av en valgt type,

idet oligonukleotidene i trinn (i) har sekvenser som er forskjellig fra de tilsvarende sekvensene som koder for den nevnte hovedramma.

For å unngå tvil, "ramma" av en variabel region, slik det benyttes her, er vanligvis dannet av opptil fire individuelle ramme-regioner, som flankerer de tre CDRene av den variable regionen:

"Ramme-regionene (FRene) av en valgt type" framskaffer til sammen ei "hovedramme".

Det vil forstås av fagpersoner at fremgangsmåtene i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan benyttes for å produsere en polynukleotid-sekvens som koder for et variabelt område av ulike typer antistoff. For eksempel kan det variable området være et IgG, IgM, IgA, IgD eller IgE variabelt område.

Polynukleotid-sekvensen som er satt sammen i trinn c) koder fortrinnsvis for et IgG variabelt område. Fortrinnsvis koder polynukleotid-sekvensen(e) som er satt sammen i trinn c) en IgG tung kjede eller lett kjede. Det er hensiktsmessig dersom polynukleotid-sekvensen(e) som er satt sammen i trinn c) koder for et unaturlig forekommende antistoff-variabelt område.

Polynukleotid-sekvensen(e) som er satt sammen i trinn c) koder fortrinnsvis for et antistoff-variabelt område som omfatter i det minste en CDR som har en kanonisk struktur som er atypisk for antistoff-variable områder som omfatter hovedramma. Med "atypisk" er det ment at CDRen har en kanonisk struktur som er funnet i mindre en 10 % av de naturlig forekommende antistoff-variable områdene som omfatter den valgte hovedramma. CDRen har fortrinnsvis en kanonisk struktur som er funnet i mindre enn 5 %, 2 % eller 1% av de naturlig forekommende antistoff-variable områdene som omfatter den valgte hovedramma. Mer foretrukket har CDRen en kanonisk struktur som ikke er funnet i noen naturlig forekommende antistoff-variable områder som omfatter den valgte hovedramma.

I en foretrukket utførelse av framgangsmåtene i samsvar med oppfinnelsen, koder i det minste en av polynukleotid-sekvensen(e) som er satt sammen i trinn c), for et antistoff-variabelt område

som omfatter i det minste en CDR utledet i en forskjellig kjønnscellelinje-genfamilie i forhold til den av hovedramma. For eksempel kan polynukleotid-sekvensen(e) som er satt sammen i trinn c) kode for et antistoff-variabelt område som omfatter en eller flere CDRer som er utledet fra en lett kjede i ei ramme av en tung kjede, eller omvendt.

Trinn a) omfatter fortrinnsvis framskaffing av en populasjon av nukleinsyre-molekyler som hver koder for et antistoff-variabelt område. Nukleinsyre-molekylene kan med fordel hver kode for et antistoff-variabelt område fra den samme kjønnscellelinje-genfamilien. Selektivitet for CDRene som skal inkorporeres i hovedramma kan på denne måten oppnås, og i det minste delvis, ved å framskaffe en valgt populasjon av nukleinsyre-molekyler i trinn a).

Alternativt, eller i tillegg, kan selektivitet for CDRene som skal inkorporeres i hovedramma oppnås ved å bruke oligonukleotid-primerpar i trinn b) som selektivt hybridiserer med en målsatt del-populasjon av nukleinsyre-molekyler som er framskaffet i trinn a). Med "selektiv hybridisering" er det ment at oligonukleotid-primerparene hybridiserer selektivt med en målsatt del-populasjon av nukleinsyre-molekylene under strenge forhold. Oligonukleotid-hybridiseringsforhold er beskrevet i Molecular Cloning: A Laboratory Manual (tredje utgave), Sambrook og Russell (eds.), Cold Spring Harbor, Laboratory Press.

Det vil forstås av fagpersoner at primernes evne til å selektivt hybridisere med målsatte nukleinsyre-molekyl i stor grad avhenger av graden av sekvens-komplementaritet mellom primerne og mål-sekvensene.

Det er fordelaktig at oligonukleotid-primerparene i trinn b) hybridiserer selektivt med en målsatt del-populasjon av nukleinsyre-molekyler som er framskaffet i trinn a), som hver koder for et antistoff-variabelt område fra den samme kjønnscellelinje-genfamilien.

Ved å framskaffe en valgt populasjon av nukleinsyre-molekyler i trinn a) og/eller ved å bruke oligonukleotid-primerpar i trinn b) som selektivt hybridiserer med en målsatt del-populasjon av nukleinsyre-molekylene som er framskaffet i trinn a) er det på denne måten mulig å velge CDRene som skal inkorporeres i hovedramma.

I en foretrukket utførelse blir CDRene som skal inkorporeres i hovedramma utledet fra nukleinsyre-molekylene som koder for et antistoff-variabelt område fra den samme kjønns-cellelinje-genfamilien, så som VH3 familien. CDRene som skal inkorporeres i hovedramma er med fordel utledet fra nukleinsyre-molekylene som koder for et antistoff-variabelt område fra det samme kjønnscellelinje-genet, så som DP-29 og DP-73.

Hovedramma er med fordel utledet fra et kjønnscellelinje-gen som er valgt fra gruppen som omfatter DP-47 og DPL-3.

I en foretrukket utførelse av framgangsmåtene i samsvar med oppfinnelsen, omfatter trinn c) bruken av overlapp-ekspansjons PCR (se Sambrook og Russell, supra). I dette tilfellet er det nødvendig å isolere enkelt-trådet nukleinsyre-molekyl fra de amplifiserte CDR-kodende nukleinsyre-molekylene produsert i trinn b). Dette kan oppnås ved å bruke oligonukleotid-primerpar idet en av primerne er biotinylert, og dermed kan nukleinsyre-tråden som er produsert ved ekspansjon av den biotinylerte primeren isoleres på basis av dets affinitet for streptavidin. Bruken av biotinylerte primere og overlapp-ekspansjons PCR er beskrevet i Jirholt et al., 1998, supra.

Som en konsekvens av forskjellene i nukleinsyre-sekvensen mellom regionene av amplifiserings-primerne som koder for ramme-rester og nukleinsyre-sekvenser som koder for de tilsvarende regionene av hovedramma, kan ikke alltid de amplifiserte CDRene inkorporeres direkte i hovedramma, ved overlapp-ekspansjons PCR, ettersom nukleotidene som koder for de amplifiserte CDRene ikke kobles (eng. anneal) tilstrekkelig sammen med nukleinsyren som koder for hovedramma. Dette er særlig tilfellet når (som i eksempel IB) det er betydelige feil-pasninger

(eng. mismatches) i enden av amplifiserings-primeme (særlig ved enden nærmest CDR). Som et resultat kan det være nødvendig å endre regionene av de amplifiserte nukleotid-sekvensene som koder for ramme-regionene som flankerer CDRene, for å gjøre dem mer lik i sekvens med regionene av nukleinsyre-molekyler som koder for de tilsvarende regionene på hovedramma.

I en foretrukket utførelse av framgangsmåtene i samsvar med oppfinnelsen, omfatter derfor framgangsmåtene et ytterligere trinn, utført etter trinn b) og før trinn c), for modifisering av nukleotid-sekvensen for de amplifiserte CDR-kodende molekylene i trinn b) slik at delene av de amplifiserte molekylene som koder for ramme-regioner har større sekvens-identitet med de tilsvarende delene av hovedramma. Nukleotid-sekvensene er fortrinnsvis modifisert slik at de har 100 % sekvens-identitet med de tilsvarende delene av hovedramma.

En måte å gjennomføre dette på er, for eksempel, å initielt amplifisere CDR og tilstøtende deler av de flankerende ramme-regionene ved bruk av PCR-primere som er identiske eller svært like med den opprinnelige ramma av CDRen. Deretter kan man i påfølgende runder PCR-amplifisering, modifisere regionene av de amplifiserte nukleinsyre-sekvensene som koder for ramme-regioner, ved bruk av primere som inneholder feilpasninger (eng. mismatch) i forhold til den opprinnelige ramma, feilpasningene framskaffer restene som er tilstede på de tilsvarende posisjonene i hovedramma. Alternativt kan ramme-regionene bli tilstrekkelig like, eller identiske, med hovedramma til å kunne inkorporeres ved bruk av overlapps-ekspansjons PCR.

Alternativt kan en enkelt runde PCR-amplifisering ved bruk av primere som representerer et kimære av den opprinnelige ramma og hovedramma være tilstrekkelig til å amplifisere CDRer som kan benyttes i overlapp-ekspansjons PCR-prosessen, og i et slikt tilfelle vil ikke tilleggs-trinnet være nødvendig.

I den første runden av PCR (trinn b) kan det derfor være fordelaktig, uavhengig av hvorvidt nevnte tilleggs-trinn skal utføres, å inkludere feilpasninger i primerne relativt til den opprinnelige ramma, for å inkludere så mange baser som mulig som er felles med den valgte hovedramma. Antallet feilpasninger som kan inkluderes avhenger av et antall faktorer inkludert antall baser som er forskjellig mellom rammene, lengden av primerne, og risikoen for å kobles sammen med andre sekvenser enn de som var tiltenkt.

Det kan være mulig for CDRer som er amplifisert av primere som er identiske med den opprinnelige ramma, å kunne inkorporeres direkte inn i hovedramma (dvs. produktet av trinn b), ved overlapp-ekspansjons PCR. Alternativt kan det være nødvendig med ytterligere PCR-trinn (som beskrevet ovenfor) slik at ramme-sekvensene som er forbundet med den amplifiserte CDR - koder mer likt de tilsvarende sekvensene i hovedramma.

I en foretrukket utførelse av det første aspektet av oppfinnelsen, omfatter framgangsmåten et ytterligere trinn for innsetting av polynukleotid-sekvensen(e) som er satt sammen i trinn c) i en ekspresjonsvektor. Ekspresjonsvektoren en fortrinnsvis en sekresjons-vektor.

Polynukleotid-sekvensene produsert med framgangsmåtene i samsvar med oppfinnelsen kan på denne måten benyttes i samsvar med kjente teknikker, hensiktsmessig modifisert med hensyn til lærdommen som er gitt her, for å konstruere en ekspresjonsvektor, som deretter blir benyttet for å transformere en egnet vertscelle for ekspresjon og produksjon av antistoff-variable områder. Slike teknikker inkluderer de som er beskrevet i US patent 4,440,859, utstedt 3 april 1984 til Rutter et al, 4,530,901 utstedt 23 juli 1985 til Weissmann, 4,582,800 utstedt 15 april 1986 til Crowl, 4,677,063 utstedt 30 juni 1987 til Mark et al, 4,678,751 utstedt 7 juli 1987 til Goeddel, 4,704,362 utstedt 3 november 1987 til Itakura et al, 4,710,463 utstedt 1 desember 1987 til Murray, 4,757,006 utstedt 12 juli 1988 til Toole, Jr. et al, 4,766,075 utstedt 23 august 1988 til Goeddel et al og 4,810,648 utstedt 7 mars 1989 til Stalker.

Polynukleotid-sekvensene produsert med framgangsmåter i samsvar med oppfinnelsen, kan være forbundet med en lang rekke andre DNA-sekvenser for introduksjon i en egnet vert. Ledsager DNA vil avhenge av vertens natur, på hvilken måte DNA introduseres inn i verten, og hvorvidt episomalt vedlikehold eller integrasjon er ønsket.

Vanligvis blir polynukleotid-sekvensen satt inn i en ekspresjonsvektor, så som et plasmid, i riktig orientering og med korrekt leseramme for ekspresjon. Dersom det er nødvendig kan polynukleotid-sekvensen bindes til egnete transkripsjons- og translasjons- regulerings-nukleotid-sekvenser gjenkjent av den ønskete verten, selv om slike kontroller vanligvis er tilgjengelige i ekspresjonsvektoren. Polynukleotid-sekvens-innsettet kan på denne måten bli operativt forbundet med en egnet promoter. Bakterie-promotorer inkluderer E. coli lad og lacZ promotorer, T3 og T7 promotorer, gpt promotoren, fag Å. PR og PL promotorene phoA promotoren og trp promotoren. Eukaryotiske promotorer inkluderer den umiddelbare tidlige CMV promotoren, HSV thymidine kinase promotoren, tidlig og sein SV40 promotoren og promotorene av retrovirale LTR'er. Andre egnete promotorer vil være kjent for fagpersoner. Det er ønskelig at ekspresjons-konstruksjonene også inneholder seter for transkripsjons-initiering og -terminering, og i transkripsjons-regionen, et ribosom bindings-sete for translasjon (Hastings et al., Internasjonal patent nr. WO 98/16643, publisert 23 april 1998).

Vektoren blir deretter introdusert i verten med standardteknikker. Vanligvis vil ikke alle vertene bli transformert av vektoren, og det vil derfor være nødvendig å velge ut de transformerte vertscellene. En utvelgelses-teknikk involverer innlemmelse av en DNA-sekvens-markør med ethvert nødvendig kontroll-element, som koder for et utvelgbart trekk i den transformerte cellen, inn i ekspresjons-vektoren. Slike markører inkluderer dihydrofolat reduktase, G418 eller neomycin resistens for eukaryotiske cellekulturer, og tetracyclin, kanamycin eller ampicillin resistente gener for dyrking i E. coli og andre bakterier. Alternativt kan genet for et slikt utvelgbart trekk være en annen vektor, som benyttes for å sam-transformere deønskete cellene.

Vertsceller som er transformert av ekspresjons-vektoren blir deretter dyrket i tilstrekkelig tid og under egnete forhold som er kjent for fagpersoner med hensyn til lærdommen som er gitt her, for å tillate ekspresjon av det kodete antistoff-variable området, som deretter kan gjenvinnes.

Det antistoff-variable området kan gjenvinnes og renses fra rekombinante cellekulturer ved velkjente framgangsmåter, inkludert ammoniumsulfat- eller etanol-utfelling, syre-ekstraksjon, anion- eller kation-bytter-kromatografi, fosfocellulose-kromatografi, hydrofobisk-vekselvirknings kromatografi, affinitets-kromatografi, hydroksylapatitt-kromatografi og lectin-kromatografi. Høy-ytelses væske-kromatografi ("HPLC") blir fortrinnsvis benyttet for rensing.

Det er kjent mange ekspresjons-systemer, inkludert systemer som benytter: bakterier (f.eks. E. coli og Bacillus subtilis) transformert med, for eksempel, rekombinante bakteriofag, plasmid eller cosmid DNA ekspresjons-vektorer; gjær (f.eks. Saccaromyces cerevisiae) transformert med, for eksempel, gjær-ekspresjonsvektorer; insektcelle-systemer transformert med, for eksempel, virale ekspresjonsvektorer (f.eks. baculovirus), plantecelle-systemer transfektert med, for eksempel, virale eller bakteriale ekspresjons-systemer, dyrecelle-systemer transfektert med, for eksempel, adenovirus ekspresjons-vektorer.

Vektorene kan inkludere et prokaryotisk replikon, så som Col El ori for forplantning i en prokaryot, selv om vektoren skal brukes for ekspresjon i andre ikke-prokaryotiske celletyper. Vektorene kan også inkludere en egnet promoter så som en prokaryotisk promoter som kan dirigere ekspresjonen (transkripsjon og translasjon) av gener i en bakterie vertscelle, så som E. coli, transformert med denne.

En promotor er et ekspresjons-kontroll-element dannet av en DNA-sekvens som tillater binding av RNA polymerase og transkripsjon. Promotor-sekvenser som er forenlige med eksemplariske bakterie-verter er vanligvis framskaffet i plasmid vektorer som inneholder hensiktsmessige restriksjons-seter for innsetning av et DNA segment i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

Vanlige prokaryotiske vektorplasmider er: pUC18, pUC19, pBR322 og pBR329 tilgjengelig fra Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA), p7rc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 og pRIT5 tilgjengelig fra Pharmacia (Piscataway, NJ; USA), pBS vektorer, Fagskript (eng. Phagescript) vektorer, Bluskript (eng. Bluescript) vektorer, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A tilgjengelig fra Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, USA).

Et vanlig mammalsk cellevektor-plasmid er pSVLfra Pharmacia (Piscataway, NJ, USA). Denne vektoren benytter SV40 sein promotor for å drive ekspresjon av klonete gener, det høyeste nivået av ekspresjon ble funnet i T antigen-produserende celler så som COS-1 celler. Et eksempel på en induserbar mammalsk ekspresjonsvektor er pMSG, også tilgjengelig fra Pharmacia (Piscataway, NJ, USA). Denne vektoren benytter den glukokortikoid-induserbare promotoren av musebryst-svulst virusets lange terminale repetisjon, for å drive ekspresjon av det klonete genet.

Nyttige gjærplasmid vektorer er pRS403-406 og pRS413-416 og er vanligvis tilgjengelig fra Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, USA). Plasmider pRS403, pRS404, pRS405 og pRS406 er Yeast Integrating (gjær integrerende) plasmider (Ylp'er) og inkorporerer de gjær-selekterbare markørene HIS3, TRP1, LEU2 og URA3. Plasmidene pRS413-416 er Yeast Centromere (gjær-sentromer) plasmider (YCp'er).

Framgangsmåter som er velkjente for fagpersoner kan benyttes for å konstruere ekspresjons-vektorer som inneholder den kodende sekvensen, og, for eksempel, egnete transkripsjons- og translasjons-kontroller. En slik framgangsmåte involverer ligering via homopolymer haler. Homopolymer polydA (eller polydC) haler er tilføyd eksponerte 3'OH grupper på DNA fragmentet som skal klones, ved terminal deoksynukleotid transferaser. Fragmentet blir deretter i stand til å kobles sammen med polydT (eller polydG) haler som er satt til endene av en linearisert plasmidvektor. Gapene etter den følgende sammenkoblingen kan fylles med DNA polymerase og de frie endene sammenføyes med DNA ligase.

En annen framgangsmåte involverer ligering via kohesive ender. Kompatible kohesive ender kan genereres på DNA fragmentet og vektoren, av egnete restriksjons-enzymer. Disse endene vil raskt kobles sammen gjennom komplementær base-paring og gjenværende innsnitt kan lukkes av DNA ligase.

En ytterligere framgangsmåte benytter syntetiske molekyler kalt linkere og adaptorer. DNA fragmenter med stumpe ender (eng. blunt ends) genereres av bakteriofagen T4 DNA polymerase, eller E. coli DNA polymerase I som fjerner framskytende 3'ender og fyller inn tilbaketrukkete 3'ender. Syntetiske linkere, deler av stump-endet dobbelt-trådet DNA som inneholder gjenkjennings-sekvenser for definerte restriksjons-enzymer, kan ligeres med stump-endete DNA fragmenter med T4 DNA ligase. De blir deretter brutt ned med egnete restriksjons-enzymer for å danne kohesive ender, og ligeres til en ekspresjons-vektor med kompatible ender. Adaptorer er også kjemisk syntetiserte DNA fragment som inneholder en stump ende brukt for ligering, men inneholder også en forhands-dannet kohesiv ende.

Syntetiske linkere som inneholder en rekke restriksjons endonuklease-seter er kommersielt tilgjengelig fra et antall kilder, inkludert International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA.

En ønsket måte å modifisere det DNA kodende polypeptidet i samsvar med oppfinnelsen på, er å bruke polymerase-kjede-reaksjonen som omtalt av Saiki et al (1988) Science 239, 487-491.1 denne framgangsmåten er DNA'et som skal amplifiseres enzymatisk flankert av to spesifikke oligonukleotid-primere som selv blir inkorporert i det amplifiserte DNA'et. De nevnte spesifikke primerne kan inneholde restriksjons-endonuklease gjenkjennings-seter som kan benyttes for kloning inn i ekspresjons-vektorer, ved bruk av framgangsmåter som er kjente innen faget.

Et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse framskaffer derfor en polynukleotid-sekvens som kan frambringes og/eller produseres ved en framgangsmåte i samsvar med det første eller andre aspektet av oppfinnelsen.

Et fjerde aspekt av oppfinnelsen framskaffer et polypeptid som er kodet for i en polynukleotid-sekvens i samsvar med det tredje aspektet av oppfinnelsen, for eksempel et antistoff eller et fragment av det (f.eks. enkelt-trådet ScFv antistoff).

Oppfinnelsen framskaffer videre en vektor som inkorporerer en polynukleotid-sekvens i samsvar med det andre aspektet av den foreliggende oppfinnelsen, og vertsceller transformert med slike vektorer. Eksemplariske vertsceller inkluderer mammalske celler så som eggstokk celler fra kinesiske hamstere.

I en foretrukket utførelse er ekspresjons-vektoren en fag-display vektor.

Framvisningen av proteiner og polypeptider på overflata av bakteriofag (fag), koblet sammen med en av fag-beleggs-proteinene, framskaffer et kraftig verktøy for utvelgelse av spesifikke ligander. Denne "fag framvisnings" teknikken ble opprinnelig benyttet av Smith i 1985 ( Science 228, 1315-7), for å danne store antistoff-bibliotek for det formål å kunne velge de med høy affinitet for et gitt antigen. I det siste har framgangsmåten blitt brukt for å presentere peptider, områder av proteiner og intakte proteiner på overflata av fag for å identifisere ligander som har deønskete egenskapene.

Prinsippene bak fag-display teknologi er som følger:

(i) En nukleinsyre som koder for proteinet eller polypeptidet for display, er klonet inn i et fag; (ii) Den klonete nukleinsyren blir uttrykt og koblet sammen (eng. expressed fused) med den beleggs-ankrende delen av en av fag-beleggs proteinene (vanligvis p3 eller p8 beleggs-proteinet i tilfellet for et filamentøst fag), slik at det fremmede proteinet eller polypeptidet blir vist fram på overflata av faget; (iii) Faget som viser fram proteinet eller polypeptidet med deønskete egenskapene blir deretter valgt (f.eks. ved affinitets-kromatografi), og framskaffer dermed en genotype (bundet til en fenotype) som kan sekvenseres, multipliseres og overføres til andre ekspresjons-systemer.

Alternativt kan det fremmede proteinet eller polypeptidet uttrykkes ved bruk av en fagmid vektor (dvs. en vektor omfattende startpunktet for replikasjon utledet fra et fag og et plasmid) som kan pakkes som en enkelt-trådet nukleinsyre i et bakteriofag belegg. Når plasmidvektorene blir benyttet, blir et "hjelperfag" brukt for å framskaffe funksjonene av replikasjon og pakking av fagmid-nukleinsyren. Den resulterende fagen vil uttrykke både vill-type beleggs-proteinet (kodet for av hjelperfagen) og det modifiserte beleggs-proteinet (kodet for av fagmidet), mens bare det modifiserte beleggs-proteinet blir uttrykt når en fagvektor blir benyttet.

Framgangsmåter for å velge ut fag som uttrykker et protein eller peptid med en ønsket spesifisitet, er kjent innen faget. For eksempel er en mye brukt framgangsmåte "panning", hvorved fag-beholdninger som viser fram ligander blir eksponert for fastfase koblete mål-molekyler, f.eks. ved bruk av affinitets-kromatografi.

Alternative framgangsmåter for utvelgelse av aktuelle fag inkluderer SAP (Selection og Amplification of Phages, som beskrevet i WO 95/16027) og SIP (Selectively-lnfective Phages, EP 614989 A, WO 99/07842) som benytter seleksjon basert på amplifisering av fag, hvorved den framviste liganden bindes spesifikt til en ligand-binder. I en utførelse av SAP framgangsmåten, blir dette oppnådd ved bruk av ikke-infeksiøse fag og ved å forbinde den aktuelle ligand-binderen til den N-terminale delen av p3. Dersom ligand-binderen spesifikt bindes til den framviste liganden, blir på denne måten det ellers ikke-infeksiøse ligand-uttrykkende faget forsynt med de delene av p3 som er nødvendig for infeksjon. Ettersom denne samvirkningen er reversibel, kan dermed seleksjon baseres på kinetiske parametre (se Duenas et al., 1996, Mol. Immunol. 33, 279-285).

Bruken av fag-display for å isolere ligander som binder biologisk relevante molekyler er gjennomgått i Felici et al., (1995) Biotechnol. Annual. Rev. 1,149-183, Katz (1997) Annual Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 27-45 og Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4(1), 1-20. Flere randomiserte kombinasjons-peptid-bibliotek er utformet for å velge ut polypeptider som binder ulike mål, f.eks. celleoverflate-reseptorer eller DNA (gjennomgått av Kay, 1995, Perspect. Drug Discovery Des. 2, 251-268; Kay og Paul, 1996, Mol. Divers. 1139-140). Proteiner og multimeriske proteiner er med suksess fag-displayed som funksjonelle molekyler (se EP 0349578A, EP 0527839 A, EP 0589877 A; Chiswell og McCafferty, 1992, Trends in Biotechnol. 10, 80-84). I tillegg har funksjonelle antistoff-fragmenter (f.eks. Fab, enkelt-trådet Fv [scFv]) blitt uttrykt (McCafferty et al., 1990, Nature 348, 552-554; Barbas et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88, 7978-7982; Clackson et al., 1991, Nature 352, 624-628) og noen av svakhetene ved den humane monoklonale antistoff-teknologien er erstattet ettersom humane høy-affinitets antistoff-fragmenter er isolert (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol, 222, 581-597; Hoogenboom og Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227, 381-388). Ytterligere informasjon om prinsippene og framgangsmåten av fag-display er omtalt i Phage diplay ofpeptides and proteins: a laboratory manual Ed Kay, Winter og McCafferty (1996) Academic Press, Inc ISBN 0-12-402380-0.

I en foretrukket utførelse av det første og andre aspektet av oppfinnelsen, omfatter derfor framgangsmåten ytterligere trinnet for å uttrykke polynukleotid-sekvensen(e) som er satt sammen i trinn c) og screene de(n) resulterende polypeptiden(e) omfattende et antistoff-variabelt område, forønskete egenskaper. Deønskete egenskapene er fortrinnsvis lett selekterbare med kjente teknikker. For eksempel kan antistoff screenes for ønsket affinitet ved bruk av affinitets-kromatografi-metoder.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen framskaffer et polynukleotid-bibliotek som kan produseres med en framgangsmåte i samsvar med et andre aspekt av oppfinnelsen, dvs. omfattende polynukleotider som kan framskaffes med en framgangsmåte i samsvar med et første aspekt av oppfinnelsen. Et slikt bibliotek vil omfatte polynukleotider som koder for en populasjon av antistoff-variable områder, hvor hvert av disse deler et felles rammeverk ("hovedramma").

Fortrinnsvis er polynukleotid-biblioteket et ekspresjonsvektor-bibliotek. Det er hensiktsmessig dersom polynukleotid-biblioteket er et fagdisplay-bibliotek.

Oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen representerer en utvikling av teknologien som er presentert i WO 98/32845, Soderlind et al., (1999) Immunotechnology, 4, 279-285, og Jirholt et al. (1998) Gene 215, 471-476. Det refereres til disse for generell beskrivelse av framgangsmåtene og forholdene som benyttes for å amplifisere CDRer fra et cDNA-bibliotek som inneholder antistoff-kodende sekvenser, og framgangsmåter, materialer og forhold for å igjen sette sammen CDRene som på denne måten blir amplifisert inn i hovedramma ved overlapp-ekspansjons PCR.

Framgangsmåten kan videre omfatte trinnet for å uttrykke det resulterende antistoffet som den sammensatte nukleotid-sekvensen koder for, og å screene etter ønskete egenskaper. Igjen er dette beskrevet i detalj i de ovenfor nevnte referansene.

Det resulterende uttrykte antistoffet kan screenes forønskete egenskaper. For eksempel kan det væreønskelig å endre dets evne til spesifikt å bindes til et antigen eller å bedre dets bindings-egenskaper i forhold til mor-antistoffet. Nok en gang er dette beskrevet i detalj i de ovenfor nevnte referansene.

Oligonukleotidene som benyttes som amplifiserings-primerne har fortrinnsvis i det minste to nukleinsyre-rester som er forskjellig fra en tilsvarende del av nukleinsyre-sekvensen som koder for hovedramma. Mer fordelaktig er det i det minste 3, 4, 5, 6, 7, 8,10 eller 12 ulike nukleinsyre-rester. I en alternativ definisjon, har amplifiserings-primerne fortrinnsvis ikke mer enn omtrent 95% sekvens-identitet med en tilsvarende del av nukleinsyre-sekvensen som koder for hovedramma, mer fordelaktig ikke mer enn omtrent 90%, 85%, 80%, 70% eller 60 % sekvens-identitet.

I tradisjonell CDR implantasjon, kan amplifiserings-primerne inkludere et lite antall nukleotider som koder en eller flere aminosyre-rester av den tilstøtende enden av CDRen (f.eks. tre nukleotider, som koder for en CDR-rest). Dette gjelder også for den foreliggende oppfinnelsen, og i slike tilfeller kan nukleotidene av CDRen ses bort fra når antallet nukleotid-forskjeller mellom primeren og hovedramma, bestemmes.

Med hensyn til lærdommen som er gitt her og i de siterte referansene, om basis CDR implantasjons-teknikk, vil en fagperson være i stand til å utforme primere for å amplifisere CDRene og, dersom det er nødvendig ellerønskelig, modifisere amplifiserings-produktene for å gjøre ramme-regionene mer lik den valgte hovedramma.

Når et gitt kjønnscellelinje-gen skal målsettes, kan høy-spesifiserte primere være ønskelig, for eksempel basert nøyaktig på sekvensen som koder for delene av ramme-regionene av det genet som flankerer CDRen eller CDRene som skal amplifiseres. Sekvensene av ulike kjønnscellelinje-gen er tilgjengelig fra VBASE sekvens-katalogen (URL: http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/lNTRO.html) eller fra DNAplot katalogen (URL: http://www.genetik.uni-koeln.de:80/dnaplot/vsearch_human.html).

På lignende måte kan primere utformes for å amplifisere CDRer fra en gitt kjønnscellelinje-genfamilie, ved å utforme primere basert på konsensus-sekvensen av genene i den familien. For eksempel kan en konsensus-sekvens være definert som base-sekvensen som er funnet ved >90 % av locus av en gitt kjønnscellelinje familie. Slike sekvenser kan inkludere degenerasjons-seter, som antyder at ulike individuelle sekvenser har ulike nukleotider i det setet. Det kan ikke desto mindre være noen felles trekk av nukleotid-rester som framkommer ved slike degenerasjons-seter, slike seter er designert R (purine; baser G og A), Y (pyrimidine; C og T), M (amino; A, C), K (keto, T, G), S (sterk; C, G), W (svak, A, T), B (ikke A), D (ikke C), H (ikke G) eller V (ikke T). Et sete hvor ingen felles trekk er tydelig er markert N (om noen).

Primere basert på konsensus-sekvenser som inkluderer slik designasjoner kan være degenererte, dvs. en populasjon av primere er dannet for å inkludere alle mulige kombinasjoner som er samsvarende med konsensus-sekvensen, eller hvor egnete kunstige baser som etteraper gitte sett av baser kan inkluderes i en homogen populasjon av primere.

Informasjon som henfører kjønnscellelinje-gener til kjønnscellelinje-genfamilier (så som de variable tunge kjønnscellelinje-genfamiliene VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, og VH7) er tilgjengelig fra VBASE katalogen som det er referert til ovenfor.

På samme måte er det mulig å utforme primerne til å amplifisere CDRer fra en rekke kjønnscellelinje-genfamilier, ved bruk av en konsensus-sekvens av kjønnscellelinje-gener fra en rekke familier. Det vil imidlertid generelt være foretrukket å målsette et bestemt kjønnscellelinje-gen eller familie.

Med dette i betraktning vil en fagperson være i stand til å utforme egnete primere som avhenger av spesifisiteten som er nødvendig. Fortrinnsvis er i det minste en primer av det, eller hvert, par(et) som benyttes for å initielt amplifisere CDRene, i det minste 15 nukleotider langt, mer foretrukket i det minste 18, enda mer foretrukket i det minste 21 eller 24, valgfritt i det minste 30, 36 eller 42. Primeren er imidlertid ikke mer enn 42 nukleotider lang, mer foretrukket ikke mer enn

36 eller 30, mer fordelaktig ikke mer enn 27.

Framgangsmåten vil fortrinnsvis bli benyttet for å implantere CDRer i alle tre posisjonene i det variable området, ettersom dette fører til maksimal variabilitet, og endelig mer nyttige bibliotek. Framgangsmåten kan dersom det erønskelig (f.eks. for å optimalisere et tidligere oppnådd antistoff), benyttes for å implantere bare en eller to CDRer. I slike tilfeller vil nukleinsyren som koder for invarians CDRen bli inkludert i overlapp-ekspansjons PCR-trinnet, i tillegg til de nylig amplifiserte CDRene og nukleinsyren som koder for den valgte hovedramma.

En foretrukket utførelse av oppfinnelsen er å implantere CDRer fra immunoglobulin gener av den samme generelle type som hovedramma (f.eks. implantere VHCDRer i VH hovedramme). Oppfinnelsen omfatter imidlertid også implantering av en CDR kodende nukleinsyre fra enhver type av immunoglobulin-gen som har en variabel region som definert ovenfor, inn i ei hovedramme som er uavhengig av enhver slik type av immunoglobulin-superfamilie gen. For eksempel kan VA CDRer settes inn i en VH hovedramme, og omvendt. Dessuten kan ethvert medlem av immunoglobulin superfamilien som har analoge strukturer med CDRer og FRer framskaffe CDRene og/eller hoved FRene i samsvar med oppfinnelsen, beskrivelsen ovenfor er anvendelig mutatis mutandis.

Begrepet "antistoff" er her benyttet i dets bredeste betydning, også for å inkludere antistoff fragmenter med et variabelt område som inkluderer CDRer flankert av ramme-regioner. Eksempler på antistoff-fragmenter som har slike variable områder er Fab fragmentet som omfatter Vl, Vh, Clog CH1 områder; Fd fragment omfattende VH og CH1 områder; Fv fragment omfattende VLog VH områder av en enkel arm av et antistoff; dAb fragmentet som omfatter et VH område; og F(ab')2 fragmentet, et bivalent fragment omfattende to Fab fragmenter forbundet av en disulfid-bru ved hengsel-regionen. Enkelt-trådet Fv fragmenter er også inkludert.

Alleønskete hovedramme-regioner (eller "ramme-regioner (FR'er) av en valgt type") kan benyttes i foreliggende oppfinnelse. De kan særlig velges til å være svært kompatible med bakterie ekspresjons-systemet og fagsystemet som skal benyttes, og sikrer dermed en høy grad av funksjonelt protein display. Foretrukne eksempler er ramme-regioner fra DP-47 og DPL-3 kjønns-cellelinje-genene (henholdsvis av VH3 og VÅ. kjønnscellelinje-genfamiliene).

Det er nå generell enighet om at CDR-løkker, som bygger opp overflata i antistoff kombinasjons-setene, kan grupperes inn i et begrenset antall såkalte kanoniske strukturer, avhengig av konformasjonen deres etter folding. Pioner-arbeidet i dette området ble utført av Cothia og Lesk (1987) som klassifiserte CDR1 og 2 i den tunge kjeden, og CDR 1-3 i den lette kjeden, i få basiske strukturer.

Konseptet med kanoniske strukturer er resultatet av utstrakte analyser av empirisk bestemte og analyserte antistoff-strukturer. Determinantene for kanoniske konformasjoner er lengden av løkkene, nøkkel-rester i løkkene og nøkkel-rester i de tilstøtende ramme-sekvensene (Chothia et al. 1992; Tomlinson et al. 1995; Al-Lazikani et al 1997). For eksempel kan de humane V* sekvensene grupperes i 6 kanoniske strukturer for CDRL1 løkka, 1 kanonisk struktur for CDRL2 løkka, og 5 kanoniske strukturer for CDRL3 løkka. På samme måte kan de humane VH sekvensene grupperes i 3 kanoniske strukturer for CDRH1 løkka og 4 kanoniske strukturer for CDRH2 løkka.

CDRH3 løkka har ennå ikke blitt klassifisert i distinkte kanoniske klasser, mest sannsynlig på grunn av dens naturlige lengde-variasjon som fører til unike egenskaper med hensyn til fleksibilitet. Nylig er det imidlertid blitt demonstrert at også denne CDRen også er bygd opp av struktur-elementer som danner en basis torso, nært og i noen grad inkluderende i ramme-området, og en topp-hode region som av og til inkluderer en ytterligere skulder (Morea et al. 1998).

Det er tenkelig at naturen har utviklet ulike typer kanoniske strukturer for å håndtere de mangfoldige antigen-strukturene som immun-systemene kan støte på. Naturen presenterer også disse strukturene i sammenheng med forskjellige ramme-strukturer. Ei gitt CDR løkke er på denne måten funnet i kombinasjon med ei gitt ramme (VBASE). Det ser også ut til å være en tilbøyelighet til at kanoniske strukturer blir benyttet for å danne egnete overflater, komplementære til ulike typer antigener. Særlig ser det ut til at løkker med kanonisk struktur som bygger opp ei flat overflate bindes godt til store protein antigener. Disse løkkene har en tilbøyelighet til å være heller korte, mens lengre løkker fortrinnsvis er funnet i antistoff som er spesifikk for mindre molekyler, f.eks. haptener (Lara-Ochoa et al. 1996). Ikke alle løkkene ser ut til å være like viktige for å danne variabilitet i overflatene. H3 er selvsagt særlig viktig i dette henseende, men også H2 og LI bestemmer i stor grad overflata (Vargas-Madrazo et al. 1995).

Ved bruk av CDR implantasjons-teknologi har det uventet blitt oppdaget at noen av de valgte antistoffene omfattet CDRer med kanoniske strukturer som vanligvis ikke finnes i den brukte ramma. Disse antistoffene er funksjonelle ettersom de binder antigenet med høy affinitet (eksempel 1). Ved bruk av et enkelt rammeverk er det på denne måten mulig å danne funksjonell variabilitet i antistoff kombinasjons-seter som er basert på kanoniske løkker som er uvanlige i forbindelse med ei gitt ramme. Et bibliotek basert på et slikt konsept ville ha fordeler i forhold til mer konvensjonelle bibliotek ettersom det kan romme antistoffer med stor variasjon i topologier og samtidig være svært effektiv i det valgte verts-systemet (f.eks. E. coli).

Bindings-egenskapene av antistoffer kunne dessuten bli forbedret ved å framskaffe (eng. shufffling) valgte CDRer for å kunne rekombinere de mest optimale CDRene inn i et enkelt antistoff-molekyl. Som det vil forstås, tillater CDR implantasjons-teknologi framskaffing av 1 til 6 CDRer samtidig og har blitt brukt på basis av biblioteket som er presentert her i eksemplene, for å bedre affiniteter av valgte antistoff mer enn 30 ganger i ett enkelt trinn.

Foreliggende oppfinnelse kan derfor føre til nye kombinasjoner av klasser av kanonisk struktur, for eksempel ved å kombinere kanoniske strukturer av klasser som vanligvis ikke er funnet i gener av den sammen kjønnscellelinje-familien. For eksempel ved å inkorporere CDRH2 CDRer inn i CDRL2 posisjonen i en VKkjede, variabilitet fra 4 klasser kanonisk struktur er tilgjengelig i denne posisjonen, mens i det naturlige VKantistoffet er det bare en klasse kanonisk struktur som er benyttet i CDRL2 posisjonen.

Amplifiserings-primerne er fortrinnsvis utformet for å amplifisere CDRer av et større antall klasser kanonisk struktur, enn antallet klasser kanonisk struktur som er funnet i kjønnscellelinje-genfamilien som hovedramma tilhører, eller CDRer av andre klasser kanonisk struktur enn de som er funnet i kjønnscellelinje-genfamilien som hovedramma tilhører. Forutsigelser av den kanoniske strukturen som en gitt CDR inntar, kan bestemmes ved bruk av et online verktøy på URL: http://www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/chothia.html.

Hovedramma trenger ikke å være ei som er naturlig forekommende, men kan, for eksempel, ha vært optimalisert, for eksempel, for ekspresjonen eller fagsystemet som skal benyttes, eller for å redusere antigenisitet in vivo.

CDRene som har blitt amplifisert kan bli utsatt for mutagenese, for eksempel ved bruk av utstrakt-feil PCR (eng. error-prone), før de inkorporeres inn i hovedramma (f.eks. som beskrevet i WO 98/32845), selv om dette vanligvis ikke er foretrukket ettersom det er mindre sjanse for at naturlig forekommende CDRer er antigene enn kunstige.

"Prosent (%) nukleinsyre-sekvens-identitet" er definert som en prosent av nukleinsyre-restene i en kandidat-sekvens som er identisk med nukleinsyre-restene i sekvensen som den sammenlignes med, etter at sekvensene er stilt kant i kant og gap er introdusert, om nødvendig, for å oppnå maksimal prosent sekvens-identitet, og uten å vurdere noen konservative substitusjoner som del av sekvens-identiteten. Prosentvis identitets-verdiene som er gitt her, ble generert av BLASTN modulen av WU-BLAST-2 (som ble oppnådd fra Altschul et al (1996);

URL:http://blast.wustl/edu/blast/README.html).WU-BLAST-2 benytter flere søke-parametre, hvor de fleste er satt til default verdier. De justerbare parameterene er satt med de følgende verdiene: overlapp spenn = 1, overlapp fraksjon = 0,125. En prosent nukleinsyre-sekvens identitets-verdi blir bestemt av antallet samsvarende identiske rester delt på det totale antallet rester av den "lengste" sekvensen i den innrettete regionen, multiplisert med 100. Den "lengste" sekvensen er den som har flest faktiske rester i den innrettete regionen (gap introdusert av WU-BLAST-2 for å maksimere innstillings-bedømmingen blir ignorert).

De følgende eksemplene er framskaffet for en bedre forståelse av oppfinnelsen, og refererer til de vedlagte figurene, hvor

figur 1 (del A til D) viser inkorporeringen av ei CDRH2 løkke fra kjønnscellelinje-genet DP29 i ei ramme av DP-47, og

figur 2 (del A til E) viser inkorporeringen av ei CDRH2 løkke fra kjønnscellelinje-genet DP-73 inn

i ei ramme av DP-47.

Eksempler Utførelse av primere og sammensetting av antistoff- gener

Primere som er forskjellig fra de tilsvarende sekvensene i DP-47 ramma, blir benyttet for å amplifisere CDRer fra ulike kjønnscellelinje-gener. I eksempel IA er hovedramma og ramma for genet hvorfra CDRen blir amplifisert (DP-29) tilstrekkelig like til at den på denne måten amplifiserte sekvensen kan inkorporeres i ei DP-47 ramme uten ytterligere modifikasjon. I eksempel IB er rammene mer ulike, og sekvensen som blir amplifisert på denne måten blir ytterligere modifisert for å bli mer lik med DP-47 ramma før den inkorporeres deri. Dette blir oppnådd ved bruk av primere som suksessivt fører ramme-regionene som flankerer CDRene til konformitet med den valgte ramma i en utformet og planlagt iterativ prosess. På denne måten blir det mulig å plukke opp CDR-løkker som har kanoniske strukturer som er atypiske for den valgte DP-47 ramma.

Når det, som her, erønskelig å inkorporere en spesifikk CDR i hovedramma, kan det være fordelaktig å bestemme homologien (dvs prosentvis identitet) mellom den valgte ramma og ramma som omgir den atypiske CDRen som skal inkorporeres inn i den valgte ramma. Dersom det benyttes primere med en kjent sekvens for å "fiske" etter CDRer i et bibliotek, er det selvsagt mer viktig å bestemme homologien mellom primerne og ramme-sekvensen.

Graden av homologi bestemmer antallet PCR-amplifiserings-trinn som er nødvendig for å få den atypiske CDRen inn i den valgte ramma. Dette betyr at lavere grad av homologi vil resultere i flere sekvensielle PCR-trinn for å konvertere de opprinnelige FR som flankerer den atypiske CDRen, til sekvensen for den valgte FR.

Eksempel IA

Figur 1 viser sekvensene og trinnene som er involvert i amplifiseringen av DP-29 CDRH2, og inkorporeringen inn i nukleinsyren som koder for ramma av DP-47.

Del A viser nukleinsyre-sekvenser som koder for deler av ramme-regionene som flankerer DP-47 og DP-29 CDRH3 løkkene og de utledete aminosyre-sekvensene. Nukleotid-samsvar er merket med symbolet I. Som det vil framgå er det noen feilpasninger (eng. mismatches): henholdsvis 8 av

36 nukleotider og 7 av 27 nukleotider, i de to flankerende delene.

Del B viser amplifiserings-primere ("#primere") som er identiske med de nukleinsyre kodende delene av ramme-regionene som flankerer DP-29 CDRH2 løkkene, stilt kant i kant med den dobbelt-trådete DP-29 kodende sekvensen.

Del C viser amplifiserings-produktet ("#lprodukt") av det første PCR-trinnet (som var vist i del B). Forholdene for amplifisering er som for CDR amplifisering i WO 98/32845. #1 produktet er identisk med den kodende sekvensen av DP-29. Stilt kant i kant med dette er primere ("#2primere") for et andre PCR-trinn. Disse er identiske med nukleinsyren som koder for tilsvarende deler av ramme-regionene som flankerer DP-47 CDRH2 løkkene. Som en konsekvens av dette er de samme feilpasningene synlige som i del A.

Del D viser produktet ("#2 produkt") av det andre PCR-trinnet. Dette har ramme-regionene av DP-47 (hovedramma) og CDRH2 løkka av DP-29.

Det er derfor tilstrekkelig sekvens-identitet mellom ramme-regionene av DP-47 og DP-29 som flankerer CDRH2 løkka til at løkka kan byttes fra ei ramme til den andre i et enkelt PCR-trinn.

DP-29 kjønnscellelinje-genet koder for et CDHR2 av kanonisk klasse 4 (VBASE), mens CDRH2'en av DP-47 er av kanonisk klasse 3 (VBASE).

Det andre PCR-trinnet kan utføres som et overlapp-ekspansjons PCR-trinn, ettersom primeren som benyttes er identisk med hovedramme-sekvensen hvorved CDRen er tenkt å inkorporeres, for eksempel ved bruk av forhold (og andre primere) som er omtalt i WO 98/32845.

Eksempel IB

En iterativ prosess av sekvensielle PCR-amplifiseringer blir brukt for å sette inn en CDR i ei DP-47 hovedramme fra et kjønnscellelinje-gen (DP-73) som har betydelig forskjellige sekvenser som koder for delene av ramme-regionene som flankerer CDRen. I dette eksemplet er homologien mellom DP-47 VH ramma, tilstøtende CDRH2 og DP-73 ramma for lav til å tillate direkte amplifisering (f.eks. i en overlapp-ekpansjons PCR-trinn) ved bruk av primere som er helt identiske med DP-47. Flere individuelle PCR-trinn blir derfor benyttet, hvert trinn benytter et unikt primerpar. Primerne blir suksessivt modifisert for å bli mer homologe med DP-47 primeren.

I denne prosessen er det viktig å velge den egnete distribusjonen av base modifikasjonene med omhu. Figur 2 viser denne prosessen. Den understrekete sekvensen er hvor de største forskjellene mellom DP-47 og DP-73 er. Fete bokstaver angir rester i primerne som er identiske med de i DP-47, hovedramma.

Del A og B er analoge med de samme delene i figur 1. Igjen er det feilpasninger mellom sekvensene som koder for delene av ramma som flankerer DP-47 og DP-73 CDRH2 løkkene, henholdsvis 13 feilpasninger av 42 nukleotider og 9 feilpasninger ut av 27 i de to flankerende sekvensene.

I del C blir det benyttet primere som er kimære av DP-47 og DP-73 i stedet for å bruke primere som er identiske med DP-47, for å introdusere endringer i ramme-regionene av det amplifiserte DP-73 fragmentet, for å føre dem delvis til konformitet med de av DP-47. Så, i stedet for at det ikke er noen feilpasninger mellom primerne og DP-47 sekvensene (som i eksempel IA), er det fremdeles noen feilpasninger, dog mindre enn tidligere, dvs 2 i hver flankerings-sekvens.

Del D viser amplifiserings produktet ("#2 produkt") av det andre PCR-trinnet, stilt opp sammen med primere ("#3primere") identisk med tilsvarende deler av DP-47 ramma. Som for eksempel IA kan slike primere benyttes i overlapp-ekspansjons PCR. Det tredje amplifiserings trinnet (analogt med det andre i eksempel IA) fører til et fragment som inkorporerer CDRH2 av DP-73 inn i ei ramme av DP-47.

Særlig i det andre PCR-trinnet (som bruker #2 primeren, vist i del C) ble de følgende base-substitusjonene gjort i den øvre PCR-primeren, i forhold til #1 primeren brukt i det første PCR-trinnet (vist i del B): I posisjon 35 (regnet fra 5'er enden av primeren) ble G endret til C; i posisjon 37 ble A endret til G og i posisjon 38 ble T endret til C. Dette resulterer i høyere grad av homologi enn dersom en primer homolog med DP-47 skulle blitt benyttet direkte i det andre PCR-trinnet.

PCR-mellom-produktet fra det andre PCR-trinnet inneholder derfor fremdeles baser som er homologe med DP73 sekvensen (G36 og C39). Disse basene vil dermed ikke fylles på (eng. prime) i det tredje PCR-trinnet, ettersom den øvre primeren som ble benyttet i dette trinnet er 100 % homolog med DP47 sekvensen. Basene 34, 37 og 38 av amplifiserings-produktet ("#2 produkt) fra det andre amplifiseringstrinnet er imidlertid nå homolog med DP-47 sekvensen og denne homologien vil gi en sammenkobling av 6 av 8 baser ved 3'er enden (understreket) av den øvre primeren i det tredje PCR-trinnet (vist i del D). Dette skal sammenlignes med 3 av 8 baser ved 3'er enden mellom DP47 og DP73. En slikøkning i homologi letter i stor grad den suksessfulle produksjonen av en DNA-sekvens som omfatter DP-73 CDRH2'en i DP-47 ramma.

Ved bruk av prinsippene i denne framgangsmåten kan ethvert CDR overføres til enhver gitt og valgt ramme som resulterer i sammensatte antistoff-molekyler som innehar kombinasjoner av naturlige CDR-løkker, og kan dermed også ha kanoniske strukturer som ikke finnes naturlig. Kombinasjoner av atypiske men naturlige CDR-løkker gir derfor en basis for generering av en enorm variasjon i antistoff kombinasjons-setet og de dannete variantene kan fanges i store bibliotek f.eks. ved bruk av fag (Marks et al, 1991), ribosom- (Hanes og Pluckthun, 1997) eller kovalente (WO 98/37186) display teknologier.

Referanser

Adkins JC, Spencer CM (1998) Drugs 56 (4): 619-26; discussion 627-8.

Al-Lazikani B, Lesk AM, Chothia C (1997) JMol Biol 273 (4): 927-48

Chothia C, Lesk AM (1987) JMol Biol 186 : 651-663

Chothia C et al. (1987) JMol Biol 196 : 901-917

Chothia C et al. (1989) Nature 342: 877-883

Chothia C, Lesk AM, Gherardi E, Tomlinson IM, Walter G, Marks JD, Llewelyn MB, Winter G (1992) JMol Biol 227 (3): 799-817

D'haens G, Van Deventer S, Van Hogezand R, et al. (1999) Gastroenterology 116 (5): 1029-34 Duenas M, Borrebaeck CA (1994) Biotechnology (NY) 12 (10): 999-1002

Griffiths AD et al. (1993) EMBO J 12 (2): 725-734

Griffiths AD et al. (1994) EMBO J 13 (14): 3245-3260

Griffiths AD and Duncan AR (1998) Curr Opin Biotechnol 9:102-108

Hanes J and Pluckthun A (1997) Proe Nati Acad Sei USA 94 (10): 4937-42

Hoogenboom HR, Winter G (1992) JMol Biol 227 (2): 381-8

Jirholt P, Ohlin M, Borrebaeck CAK, Soderlind E (1998) Gene 215 (2): 471-476

Kobayashi N, Soderlind E, Borrebaeck CAK (1997) Biotechniques 23 (3): 500-503

Lara-Ochoa F, Almagro JC, Vargas-Madrazo E, Conrad M (1996) Mol envol 43: 678-684

Larrick JW, Danielsson L, Brenner Ca, et al. (1989) Bio/Technology 7: 934

Malmborg AC, Duenas M, Ohlin M, et al. (1996) Jlmmunol Methods 198 (1): 51-7

Malmborg AC, Soderlind E, Frost L, Borrebaeck CA (1997) J Mol Biol 273 (3): 544-51

Marks JD, Hoogenboom HR, BonnertTP, et al. (1991) JMol Biol 222 (3): 581-597

McLaughlin P, White CA, Grillo-Lopez AJ, Maloney DG (1998) Oncology (Huntingt) 12 (12): 1763-9; discussion 1769-70,1775-7

Morea V, Tramontano A, Rustici M, Chothia C, Lesk AM (1998) JMol Biol 275: 269-294

Nissim A, Hoogenboom HR, Tomlinson IM, et al. (1994) EMBO J13: 692-698

Palares et al. (1999) Exp. Clin. Immunogenet. 16: 36-60

Pini A, Viti F, Santucci A, Carnemolla B, et al. (1998) J Biol Chem 273 (34): 21769-21776 Sheets MD, Amersdorfer P, Finnern R, et al. (1998) Proe Nati Acad Sei USA 95 (11): 6157-6162

Soderlind et al. (1999) Immunotechnology 4, 279-285

Tomlinson IM, Cox JP, Gherardi E, et al. (1995) EMBO J 14 (18): 4628-38

Vargas-Madrazo E, Lara-Ochoa F, Almagro JC (1995) JMol Biol 254:497-504

Vaughan TJ, Williams AJ, Pritchard K, et al. (1996) Nat Biotechnol 14 (3): 309-314

Williamson RA, Burioni R, Sanna PP, et al. (1993) Proe Nati Acad Sei USA 90: 4141-4145

Zebedee SL et al. (1992) Proe Nati Acad Sei USA 89 : 3175-3179

Claims (18)

1. Framgangsmåte for produksjon av en polynukleotid-sekvens som koder for et antistoff-variabelt område, det variable området omfatter komplementær-bestemmende regioner (CDRer) plassert inne i ei valgt ramme ("hovedramma"),karakterisert vedå omfatte trinnene: a) framskaffing av i det minste ett nukleinsyre-molekyl som koder en eller flere CDRer og forbundete ramme-regioner ("opprinnelige ramma"); b) amplifisering av i det minste en CDR kodende del av nukleinsyre-molekylet(ene) i trinn (a) ved bruk av ett eller flere oligonukleotid-par som amplifiserings-primere, og c) sammensetting av en polynukleotid-sekvens som koder for et antistoff-variabelt område ved å kombinere de amplifiserte CDR-kodende nukleotid-sekvenser produsert i trinn b) med nukleotid-sekvensene som koder for hovedramma, hvor oligonukleotid-primerne i trinn b) omfatter nukleotid-sekvenser som er forskjellig fra de tilsvarende nukleotid-sekvensene som koder for hovedramma.

2. Framgangsmåte for å produsere et bibliotek av polynukleotid-sekvenser som hver koder for et antistoff-variabelt område omfattende komplementær-bestemmende regioner (CDRer) plassert inne i ei felles valgt ramme ("hovedramma"),karakterisert vedå omfatte trinnene: a) framskaffing av en populasjon av nukleinsyre-molekyl som koder for en eller flere komplementær-bestemmende regioner (CDRer) og forbundete ramme-regioner (den "opprinnelige ramma"); b) amplifisering av i det minste en CDR-kodende del av nukleinsyre-molekylene i trinn a) ved bruk av ett eller flere oligonukleotid-par som amplifiserings-primere, og c) sammensetting av en polynukleotid-sekvens som koder for et antistoff-variabelt område ved å kombinere de amplifiserte CDR kodende nukleotid-sekvensene produsert i trinn b) med nukleotid-sekvensene som koder for hovedramma, hvor oligonukleotid-primerne i trinn b) omfatter nukleotid-sekvenser som er forskjellig fra de tilsvarende nukleotid-sekvensene som koder for hovedramma.

3. Framgangsmåten i samsvar med krav 1 eller 2,karakterisert vedå omfatte trinnene i) framskaffing av i det minste ett oligonukleotid-par, ii) bruk av oligonukleotid-paret som amplifiserings-primere for å amplifisere nukleotid-sekvenser som koder for ulike CDRer, og iii) sammensetting av polynukleotid-sekvenser som koder for antistoff-variable områder ved å inkorporere nukleotid-sekvenser utledet fra trinn ii) ovenfor, med nukleotid-sekvenser som koder for hovedramma, hvor oligonukleotidene i trinn i) har sekvenser som er forskjellig fra tilsvarende sekvenser som koder for hovedramma.

4. Framgangsmåte i samsvar med krav 1 eller 2,karakterisert vedat polynukleotid-sekvensen(e) satt sammen i trinn c) koder for et immunoglobulin G (IgG) variabelt område, en IgG tung kjede eller lett kjede, et ikke naturlig forekommende antistoff-variabelt område, et antistoff-variabelt område som omfatter i det minste en CDR med en kanonisk struktur som er uvanlig for CDRer i naturlig forekommende antistoff-variable områder som omfatter hovedramma, eller et antistoff-variabelt område som omfatter i det minste en CDR utledet fra en annen kjønnscellelinje-genfamilie enn hovedramma.

5. Framgangsmåte i samsvar med krav 1 eller 2,karakterisert vedat trinn a) omfatter framskaffing av en populasjon av nukleinsyre-molekyl som hver koder for et antistoff-variabelt område.

6. Framgangsmåte i samsvar med krav 5,karakterisert vedat nukleinsyre-molekylene hver koder for et antistoff-variabelt område fra den samme kjønnscellelinje-genfamilien.

7. Framgangsmåte i samsvar med krav 5,karakterisert vedat oligonukleotid-primerparene i trinn b) selektivt hybridiserer med en målsatt sub-populasjon av nukleinsyre-molekylene som ble framskaffet i trinn a).

8. Framgangsmåte i samsvar med krav 7,karakterisert vedat den målsatte sub-populasjonen av nukleinsyre-molekyler hver koder for et antistoff-variabelt område fra den samme kjønnscellelinje-genfamilien.

9. Framgangsmåte i samsvar med krav 6 eller 8,karakterisert vedat nukleinsyre-molekylene hver koder for et antistoff-variabelt område som er utledet fra det samme kjønnscellelinje-genet.

10. Framgangsmåte i samsvar med krav 9,karakterisert vedat kjønnscellelinje-genet er valgt fra gruppen omfattende DP-29 og DP-73.

11. Framgangsmåte i samsvar med krav 1 eller 2,karakterisert vedat hovedramma er utledet fra et kjønnscellelinje-gen valgt fra gruppen omfattende DP-47 og DPL-3.

12. Framgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-11,karakterisert vedå omfatte et ytterligere trinn, utført etter trinn b) men før trinn c), for modifisering av nukleotid-sekvensen av de amplifiserte CDR-kodende molekylene i trinn b), slik at de delene av de amplifiserte molekylene som koder for ramme-regioner deler større sekvens-identitet med de tilsvarende delene av hovedramma.

13. Framgangsmåte i samsvar med krav 12,karakterisert vedat nukleotid-sekvensen av de amplifiserte CDR-kodende molekylene i trinn b) modifiseres slik at de delene av de amplifiserte molekylene som koder for ramme-regioner deler 100 % sekvens-identitet med de tilsvarende delene av hovedramma.

14. Framgangsmåte i samsvar med krav 12 eller 13,karakterisert vedat det ytterligere trinnet omfatter en enkelt runde PCR-amplifisering ved bruk av oligonukleotid-primere som omfatter en nukleotid-sekvens som er et kimær av nukleotid-sekvensen som koder for den opprinnelige ramma og hovedramma.

15. Framgangsmåte i samsvar med krav 12 eller 13,karakterisert vedat det ytterligere trinnet omfatter utføring av en eller flere runder PCR-amplifisering av de CDR-kodende nukleinsyre-molekylene produsert i trinn b), hver tilleggs-runde av amplifisering utføres ved bruk av oligonukleotid-primere omfattende en nukleotid-sekvens som har et økt antall nukleotid-feilpasninger (eng. mismatches) i forhold til den opprinnelige ramme-sekvensen, feilpasningene deler sekvens-identitet med de tilsvarende nukleotidene i hovedramma.

16. Framgangsmåte i samsvar med krav 1 eller 2,karakterisert vedat trinn c) omfatter bruk av overlapp-ekspansjons PCR.

17. Framgangsmåte i samsvar med krav 1 eller 2,karakterisert vedå omfatte et ytterligere trinn for innsetting av polynukleotid-sekvensen satt sammen i trinn c) inn i en ekspresjons-vektor, fortrinnsvis en fag-display vektor.

18. Framgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-17,karakterisert vedå ytterligere omfatte trinnet for å uttrykke polynukleotid-sekvensen(e) satt sammen i trinn c) og å screene de resulterende polypeptidene, omfattende et antistoff-variabelt område, for deønskete egenskaper.