DE602004012299T2

DE602004012299T2 - Verfahren zur verknüpfung interessierender sequenzen

Info

Publication number: DE602004012299T2
Application number: DE602004012299T
Authority: DE
Inventors: Martin B. Oleksiewicz; Lars S. Nielsen; Peter S. Andersen; Margit H. Hansen
Original assignee: Symphogen AS
Current assignee: Symphogen AS
Priority date: 2003-09-18
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2009-08-13
Anticipated expiration: 2024-09-18
Also published as: US20100310558A1; EP1921144A3; EP1670912A2; EP1921144B1; EP1921144A2; WO2005042774A3; TWI333977B; MY148907A; US7749697B2; ES2375529T3; AU2004286019A1; DK1921144T3; EP1670912B1; CN1856571A; PL1670912T3; CN102199593A; US20070141048A1; WO2005042774A2; JP4651619B2; NZ545936A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Multiplex-Molekülamplifikationsverfahrensweise, die zur Verknüpfung von Nucleotidsequenzen von Interesse im Zusammenhang mit der Amplifikation befähigt ist, insbesondere Polymerasekettenreaktion (Multiplex-PCR). Das Verfahren wird zur Erzeugung von Bibliotheken kognater Paare verwendet.
Hintergrund der Erfindung
Antigen-bindende Proteine, die in die Immunreaktion involviert sind, sind bei Säugern als große polyklonale Repertoires vorhanden, die eine große Diversität von Bindungsspezifitäten wiedergeben. Diese Diversität wird durch Um- bzw. Neuordnung von Gensequenzen, die für variable Regionen dieser Bindungsproteine codieren, erzeugt. Derartige Bindungsproteine mit variablen Regionen ("variable regions binding proteins") umfassen lösliche und Membran-gebundene Formen des B-Zell-Rezeptors (auch als Immunglobuline oder Antikörper bekannt) und die Membran-gebundenen T-Zell-Rezeptoren (TcR). Im Hinblick auf Immunglobuline wird deren Affinität nach der Erkennung eines Antigens durch einen B-Zell-Antigenrezeptor verstärkt durch einen Vorgang, der als Affinitätsreifung bezeichnet wird und Zyklen der somatischen Hypermutation dieser variablen Gene involviert.
Namentlich waren Immunglobuline oder Fragmente davon, wie Fab-Fragmente, Fv-Fragmente und einzelkettige Fv(scFv)-Moleküle, Gegenstand von Klonierung und rekombinanter Expression. Jedoch können alle anderen Bindungsproteine mit variablen Regionen im Prinzip ebenso unter Verwendung der gleichen Konzepte wie bei Antikörpern kloniert und exprimiert werden.
Bekannte Herangehensweisen zur Isolierung von Antikörpern mit einer gewünschten Bindungsspezifität involvieren bzw. umfassen häufigst die Erzeugung von Hybridomen, ausgehend von immunisierten Wirten, gefolgt von Durchmusterung auf spezifische Klone, oder sie involvieren die Erzeugung von kombinatorischen Expressionsbibliotheken in E. coli, bestehend aus variablen Immunglobulindomänen bzw. variablen Domänen von Immunglobulinen, die nachfolgend unter Verwendung von Techniken, wie z. B. Phagendisplay, angereichert werden.
Die Haupteinschränkung bei der Verwendung der Hybridomtechnologie zur Herstellung therapeutischer Antikörper ist das Fehlen eines humanen Lymphoms, das als Fusionspartner für humane B-Lymphozyten geeignet ist. Heterohybridome (d. h., eine Fusion von humanen B-Zellen mit Maus-Lymphomen) sind notorisch instabil und führen somit selten zu stabilen Zelllinien für Produktionszwecke. Humane B-Zellen, die durch eine Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus immortalisiert sind, weisen ähnliche Probleme hinsichtlich der Instabilität auf. Das Fehlen einer robusten zellulären Methodologie zur Herstellung von humanen Antikörpern für Therapie(zwecke) kann durch neuere Vorteile in der Molekularbiologie kompensiert werden.
Die Verwendung von kombinatorischen Bibliotheken und Phagendisplay ermöglicht die Erzeugung großer Repertoires von Antikörperklonen mit einer potentiellen Diversität, die über 10¹⁰ hinausgeht. Ausgehend von diesem Repertoire kann eine Auswahl hinsichtlich der Bindung an ein spezifisches Ziel durchgeführt werden, wodurch eine Unterbibliothek erzeugt wird. Diese Unterbibliothek kann verwendet werden, um entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erzeugen. Die variable-Region-codierenden Sequenzen (z. B. variable-Schwerkettenregion- und variable-Leichtkettenregion-codierende Immunglobulin-Sequenzen), die die Bibliothek aufbauen, können ausgehend von Lymphozyten, Plasmazellen, Hybridomen oder einer beliebigen anderen Immunglobulin-exprimierenden Zellpopulation amplifiziert werden. Gegenwärtige Technologien zum Erzeugen kombinatorischer Bibliotheken involvieren die separate Isolation der variable-Region-codierenden Sequenzen aus einer Zellpopulation. Somit wird die ursprüngliche Paarung von beispielsweise variable-Schwerkettenregion- und variable-Leichtkettenregion-codierenden Immunglobulin-Sequenzen verloren gehen. Vielmehr werden diese Sequenzen in einer kombinatorischen Bibliothek wahllos bzw. statistisch gepaart, und die ursprünglichen Kombinationen dieser variablen Sequenzen werden lediglich zufällig auftreten. Um variable-Region-codierende Sequenzen, die für eine gewünschte Bindungsspezifität verantwortlich sind, zu isolieren, ist somit ein beträchtlicher Screeningaufwand nötig. Dies wird typischerweise in Kombination mit Verfahren zur Anreicherung von Klonen, die eine gewünschte Spezifität aufweisen, wie z. B. Ribosomendisplay oder Phagendisplay, durchgeführt. Selbst dann könnte die erreichte Diversität nicht hinereichend groß sein, um variable-Region-codierende Sequenzpaare zu isolieren, die zu Bindungsproteinen mit gleichermaßen hoher Aktivität, wie jene, die in den ursprünglichen Zellen gefunden werden, führen. Weiterhin führen die Anreicherungsverfahrensweisen, die normalerweise zur Durchmusterung von kombinatorischen Bibliotheken verwendet werden, eine starke Abweichung bzw. Verzerrung ("strong bias"), z. B. für Polypeptide von besonders geringer Toxizität in E. coli, effiziente Faltung, langsame Dissoziationsraten ("slow off-rates") oder andere System-abhängige Parameter ein, die die Diversität der Bibliotheken noch weiter verringern. Zusätzlich werden Klone, die aus derartigen kombinatorischen Bibliotheken stammen, stärker dazu neigen, Bindungsproteine mit Kreuzreaktivität gegen Autoantigene zu erzeugen, da sie als Paare, im Gegensatz zu ursprünglichen Paaren (hiernach als kognate Paare bezeichnet), nie eine negative Selektion in vivo gegen Autoantigene durchlaufen haben, wie es für T- und B-Lymphozyten-Rezeptoren während bestimmter Stadien ihrer Entwicklung der Fall ist. Daher ist die Klonierung von ursprünglichen Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen eine wünschenswerte Herangehensweise. Darüber hinaus wird erwartet, dass die Frequenz bzw. Häufigkeit von Klonen, die eine gewünschte Bindungsspezifität zeigen, innerhalb einer Bibliothek von kognaten Paaren beträchtlich höher ist als in einer herkömmlichen kombinatorischen Bibliothek, insbesondere falls die Ausgangs(material)zellen von einem Spender mit einer hohen Frequenz von Zellen, die für spezifische Bindungspaare codieren, z. B. immune oder immunisierte Spender, stammen. Es folgt, dass die Größe einer Bib liothek von kognaten Paaren nicht so groß sein wird, wie bei einer kombinatorischen Bibliothek: eine Größe einer Bibliothek von kognaten Paaren von 10⁴ bis 10⁵ Klonen oder sogar nur 10² bis 10³ Klonen, die von einem Spender mit einer relevanten aktuellen bzw. anhaltenden Immunreaktion stammen, könnte sehr gut ausreichen, um Bindungsproteine, die für eine große Diversität von gewünschten Bindungsspezifitäten stehen, zu erhalten.
Um Bibliotheken von kognaten Paaren zu erzeugen, ist die Verknüpfung der variable-Region-codierenden Sequenzen, die aus der gleichen Zelle stammen, erforderlich. Gegenwärtig sind zwei unterschiedliche Herangehensweisen, die eine kognate Paarung von variable-Region-codierenden Sequenzen erzielen können, beschrieben worden.
Die In-cell-PCR ist eine Herangehensweise, bei der eine Population von Zellen fixiert und permeabilisiert wird, gefolgt von einer In-cell-Verknüpfung von Schwerkettevariable-Region- und Leichtkette-variable-Region-codierenden Sequenzen aus Immunglobulinen. Diese Verknüpfung kann entweder durch Überlappungsverlängerungs-RT-PCR ( WO 93/03151 ) oder durch Rekombination (Chapal, N. et al., 1997, BioTechniques 23, 518–524) durchgeführt werden. Das Amplifikationsverfahren, wie es in diesen Druckschriften beschrieben ist, ist ein drei- oder vierstufiges Verfahren, bestehend aus: i) einer reversen Transkription unter Verwendung von Primern für die konstante Region, wobei Immunglobulin-cDNA erzeugt wird; ii) einer PCR-Amplifikation der variable-Schwerketten- und variable-Leichtkettenregioncodierenden Sequenzen unter Verwendung von Primersätzen, die entweder ein Überlappungsverlängerungsdesign oder Rekombinationsstellen enthalten, iii) Verknüpfung durch Rekombination, falls diese Herangehensweise gewählt wird, iv) Nested bzw. geschachtelte PCR der Produkte, wobei Restriktionsschnittstellen zur Klonierung erzeugt werden. Da die Zellen permeabilisiert werden, besteht ein beträchtliches Risiko dahingehend, dass Amplifikationsprodukte aus den Zellen austreten könnten, wodurch eine Verwürfelung bzw. Vermischung ("scrambling") der Schwerkette-variable-Region- und Leichtkette-variable-Region-codierenden Sequenzen eingeführt werden könnte, die in einem Verlust der kognaten Paarung resultiert. Daher umfasst die Verfahrensweise Waschschritte nach jeder Reaktion, was das Verfahren arbeitsaufwändig macht und die Effizienz der Reaktionen verringert.
Allgemeiner gesagt, ist die In-cell-PCR notorisch ineffizient, wobei eine geringe Empfindlichkeit resultiert. Demgemäß hat die In-cell-PCR-Verknüpfungstechnik nie eine weit verbreitete Anwendung gefunden, und die ursprüngliche Studie ist tatsächlich nie zuverlässig in einer Weise wiederholt worden, die verwendet werden kann, um zu verifizieren, dass die Verknüpfung tatsächlich innerhalb der Zelle auftritt. Dies ist jedoch absolut ausschlaggebend für die Vermeidung einer Verwürfelung der variable-Schwerkettenregion- und variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen und der dadurch erfolgenden Zerstörung von kognaten Paaren.
Eine andere In-cell-Herangehensweise ist in der WO 01/92291 beschrieben. Diese Herangehensweise basiert auf RNA-Trans-Splicing und erzielt eine Verbindung von V_H- und V_L-codierender mRNA innerhalb der Zelle. Diese Herangehensweise erfordert das Vorhanden sein eines DNA-Konstrukts, das das Trans-Splicing innerhalb der Zellen steuert. Eine Einzelzell-PCR ist eine andere Herangehensweise zum Erzielen einer kognaten Paarung von variable-Schwerkettenregion- und variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen (siehe z. B. Coronella, J.A. et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28, E85; Wang, X, et al., 2000, J. Immunol. Methods 20, 217–225). In diesen Druckschriften wird eine Population von Immunglobulinexprimierenden Zellen durch Verdünnung auf eine Zelle pro Reaktion verteilt, wodurch eine Verwürfelung von variable-Schwerkettenregion- und variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen während des Klonierungsverfahrens eliminiert wird. Grundsätzlich ist das beschriebene Verfahren eine drei- bis vierstufige Verfahrensweise, bestehend aus: i) einer reversen Transkription unter Einsatz von Oligo-dT-Primern, Zufallshexamer-Primern oder Primern für die konstante Region, wodurch cDNA erzeugt wird, ii) Fraktionieren des cDNA-Produkts in mehrere Röhrchen und Durchführen einer PCR-Amplifikation an den einzelnen variable-Kette-codierenden Sequenzen (in separaten Röhrchen) mit Primersätzen, die Restriktionsschnittstellen zur Klonierung enthalten, iii) Nested PCR der Produkte, wobei Restriktionsschnittstellen zur Klonierung erzeugt werden (optional) und iv) Verknüpfung der variable-Schwerkettenregion- und variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen aus den separaten Röhrchen, indem sie in einen geeigneten Vektor kloniert werden, was selbst ein mehrstufiges Verfahren ist.
Bei Menschen gibt es zwei Typen von Leichtketten: lambda (λ) und kappa (κ). Dies bedeutet, dass mit der cDNA, die aus jeder Einzelzelle erzeugt wird, wenigstens drei separate PCR-Reaktionen durchgeführt werden müssen, gefolgt von einer Analyse und Klonierung der geeigneten Fragmente in einen einzelnen Vektor, um die kognate Paarung zu erzielen. Somit erfordert die Einzelzell-PCR-Herangehensweise, wie sie beschrieben ist, eine große Zahl von Handhabungsschritten, um eine Bibliothek von kognaten Paaren zu erzeugen. Obgleich eine Bibliothek von kognaten Paaren nicht so groß sein muss wie eine kombinatorische Bibliothek, um Bindungsproteine zu erhalten, die für eine große Diversität von Bindungsspezifitäten stehen, wäre es noch eine arbeitsaufwändige Aufgabe, eine Bibliothek von z. B. 10⁴ bis 10⁵ Klonen mittels der beschriebenen Einzelzell-PCR-Herangehensweise zu erzeugen. Ferner erhöht die große Zahl von Handhabungsschritten das Risiko der Kontamination und von menschlichen Fehlern in hohem Maße.
Um Bindungsproteine hoher Affinität zu erhalten, die den Affinitäten, die normalerweise während einer Immunreaktion beobachtet werden, entsprechen, ist eine kognate Paarung der Sequenzen variabler Regionen im Zusammenhang mit ihrer Amplifikation in hohem Maße vorteilhaft. Um eine Bibliothek von großer Diversität zu erzeugen, ist es nötig, über eine Klonierungstechnik zu verfügen, die an ein Hochdurchsatzformat angepasst werden kann und bei der das Risiko von Kontamination und Verwürfelung minimal ist.
Eine Verringerung der Anzahl der Klonierungsschritte, die die Anpassung der Erzeugung von kombinatorischen Bibliotheken an ein Hochdurchsatzformat ermöglicht, ist gleichermaßen erwünscht.
Die WO 92/15678 beschreibt anscheinend ein Verfahren des Verknüpfens einer Mehrzahl von nicht-zusammenhängenden Nucleotidsequenzen von Interesse mittels einer Multiplex-Molekülamplifikationsverfahrensweise unter Verwendung einer Matrize aus einer Population von isogenen Zellen.
Die WO 01/89563 beschreibt anscheinend eine Technologie zur Erzeugung von Bibliotheken rekombinanter polyklonaler Antikörper, die die Schaffung und Bewahrung von standardisierten Gemischen von polyklonalen vollständigen Antikörpern, die für ein Multiantigen spezifisch sind, ermöglicht.
Sharon J. et al., (Combinatorial Chemistry and high throughput screening, Hilversum, NL; Juni 2000, Bd. 3, 185–196) beschreiben anscheinend die Verwendung eines rekombinanten oder gereinigten polyklonalen Antikörpers, der zur Reaktion mit einem oder Bindung an ein Allergen befähigt ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Behandlung einer Allergie, für die prophylaktische oder therapeutische Induktion von Toleranz gegenüber dem Antigen oder für die Modulation des Immunsystems.
Offenbarung des Beitrags
Die vorliegende Erfindung stellt ein effizientes Verfahren zum Verknüpfen von zwei oder mehr Nucleotidsequenzen von Interesse, z. B. variable-Region-codierende Sequenzen, bereit, wobei eine Multiplex-Molekülamplifikationsverfahrensweise, wie z. B. eine Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR oder Multiplex-RT-PCR, gefolgt von Verknüpfung mittels Ligation oder Rekombination, eingesetzt wird. Das Verfahren ist auf eine Einzelzelle anwendbar, wodurch die Klonierung von kognaten Paaren in einem Hochdurchsatzformat ermöglicht wird.
Beschreibung der Figuren
1 ist ein Diagramm, das die unterschiedlichen Typen von Überlappungsverlängerungs-Enden illustriert. Die fett gedruckte Linie entspricht einem genspezifischen Teil des Primers, und die normale Linie entspricht dem Überlappungsende. Die vertikalen Balken stellen komplementäre Regionen dar. Die Primer erleichtern die Verknüpfung von zwei Nucleotidsequenzen von Interesse. 1 (I) erläutert zwei Arten von Typ I-Überlappungsverlängerungs-Enden, bei denen nur die Verlängerungsenden überlappen, und zwar entweder vollständig oder partiell; 1 (II) erläutert die Typ II-Überlappungsverlängerungs-Enden, bei denen einige der 5'-Nucleotide des Verlängerungsende des ersten Primers zum genspezifischen Teil des benachbarten Primers komplementär sind. 1 (III) erläutert die Typ III-Überlappungsverlängerungs-Enden, bei denen die gesamten Überlappungsverlängerungs-Enden zur genspezifischen Region des benachbarten Primers komplementär sind.
2 ist ein Diagramm, das eine schematische Übersicht über ein Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch, anwendbar bei der Verknüpfung von Immunglobulin-variable-Region-codierenden Sequenzen, zeigt. Die cDNA, die für die variable- Leichtketten-(LC) und die variable-Schwerkettenregion (V_H), die zu verknüpfen sind, codiert, werden als Röhren dargestellt, wobei sowohl die 5'- und 3'-Enden ihres Sinnstranges als auch die erwartete Größe des amplifizierten Produktes angegeben sind. Die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Sätze, die zum Amplifizieren der codierenden Sequenz verwendet werden, sind mittels der Pfeile dargestellt. Die gebogenen Pfeilenden mit gestrichelten 5'-Überhängen stellen die Klonierungs-Enden dar. Die Überlappungsverlängerungs-Enden sind fett dargestellt. Die in den Enden vorhandenen Restriktionsstellen sind in Verbindung mit dem Ende benannt. Die Gesamtzahl der Primer im Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch beträgt sechzehn, verteilt auf die äußeren Primer, umfassend einen C_κ- und einen C_H1-Primer, und die Überlappungsverlängerungs-Primer, umfassend sechs V_L- und acht V_H-Primer. Der C_H1-Primer lagert sich am 5'-Ende der konstanten Domäne 1 der Schwerkette an. Es wird erwartet, dass das Produkt, das aus der Mulitplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR resultiert, näherungsweise 1070 bp groß ist, wobei es die gesamte kappa-Leichtkette, bestehend aus der konstanten Region, dem Verbindungsgen ("joining gene") und dem variablen Gen (C_κ + J_L + V_L), und die variable Region der Schwerkette, bestehend aus dem variablen Gen, dem Diversitätsabschnitt und dem Verbindungsgen (V_H + D + J_H), darstellt. 5' und 3' weisen auf die Richtung des offenen Leserahmens hin. Nur ein kleiner Teil der C_H1-Region-codierenden Sequenz wird mittels dieses Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisches amplifiziert, da die Anlagerungsposition des C_H1-Primers nahe der Schwerketten-J-Region liegt.
3 ist eine Reihe von Diagrammen, die die unterschiedliche Verknüpfungsrichtung der Produkte, die in Abhängigkeit davon, welche Primer mit dem Verknüpfungsende ausgestattet sind, erhalten werden können, erläutert. Ausgefüllte schwarze Flächen stellen die Überlappungsregion dar. 5' und 3' weisen auf die Richtung des offenen Leserahmens hin. 3A ist ein Diagramm, das eine Kopf-an-Kopf-Orientierung der Produkte erläutert. 3B ist ein Diagramm, das eine Ende-an-Ende-Orientierung erläutert. 3C ist ein Diagramm, das eine Kopf-an-Ende-Orientierung erläutert, wobei die Leichtkette-codierende Sequenz vorne steht. 3D ist ein Diagramm, das eine Kopf-an-Ende-Orientierung erläutert, wobei die Schwerkette-codierende Sequenz vorne steht.
4 ist ein schematisches Diagramm des Immunglobulin-Expressionsvektors pLL113, wobei die codierenden Sequenzen in einer Kopf-an-Ende-Orientierung sind. Der Vektor umfasst die folgenden Elemente: bla = Promotor, der die Expression des Ampicillinresistenzgens ermöglicht. Amp = Gen, das für die Ampicillinresistenz codiert. pUC ori = pUC-Replikationsursprung. AdMLP = später Adenovirus-Hauptpromotor. Humanes IgG1 = Sequenz, codierend für die Schwerkette des Immunglobulins vom Isotyp G1. hGH pA = poly A-Signalsequenz des humanen Wachstumshormons. bGH polyA = poly A-Sequenz des bovinen Wachstumshormons. Humane kappa-LC = Sequenz, die für die Immunglobulin-kappa-Leichtkette codiert. FRT = Eine Flp-Erkennungszielstelle. Hygromycin = Gen, das für die Hygromycinresistenz codiert. SV40 poly A = poly A-Signalsequenz aus dem Simianvirus 40.
5A ist ein Elektrophoresegel, das die Ergebnisse einer zweistufigen Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR, gefolgt von einer Semi-Nested-PCR, zeigt. Die Amplifikationsprodukte stammen von cDNA, die aus Einzelzellen vom Typ CHO Flp-In pLL113 isoliert wurde. Die Bahnen 1–12 sind Probenbahnen und die Pfeile weisen auf korrekte Nested-Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Produkte von 1076 bp hin; M1 ist eine 100 bp-Leiter. W ist Wasser, das als Negativkontrollmatrize verwendet wurde. C ist eine cDNA-Positivkontrollmatrize, die aus der Zelllinie HB-8501 stammt. In einem separaten Feld sind die gleichen Bahnen W, C und die 100 bp-Leiter mit geringerem Kontrast dargestellt worden, um die einzelnen DNA-Fragmente aufzulösen. 5B ist eine Skizze des in 5A gezeigten Gels, die die relevanten Fragmente aus dem Gel darstellt.
6 ist eine Reihe von Photographien und eine graphische Darstellung von Elektrophoresegelen, die die Ergebnisse einer einstufigen Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktion ohne zusätzliche PCR-Amplifikation zeigen. In jedem Feld ist M1 eine 100 bp-Leiter und M2 eine 500 bp-Leiter. 6A ist ein Elektrophoresegel, das die Amplifikationsprodukte zeigt, die aus Lysat, das 100, 10, 1 oder 0 Zelle(n) entspricht, stammen. Der Pfeil weist auf das Überlappungsverlängerungsprodukt hin. 6B ist eine Skizze des Gels in 6A. 6B ist ein Elektrophoresegel, das das Vorliegen von Überlappungsverlängerungsprodukt in den 100- und 1-Zell-Bahnen in 6A verifiziert. 6D ist ein Elektrophoresegel, das die Restriktionsenzymspaltung mit NheI bzw. NcoI des Überlappungsverlängerungsprodukts aus der 1-Zell-Bahn in 6C zeigt.
7 ist ein Elektrophoresegel, das die Ergebnisse aus einer einstufigen Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR, gefolgt von einer Semi-Nested-PCR-Amplifikation, zeigt. M1 ist eine 100 bp-Leiter und M2 ist eine 500 bp-Leiter. Die Ergebnisse (stammen) von Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemischen, die entweder C_H1, C_H2, C_H3, C_H4 oder C_H5 als den äußeren Primer in der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktion enthalten. Die Reaktionen wurden an Zelllysaten, die 100, 10, 1 oder 0 Zelle(n) entsprechen, durchgeführt. Die Größe des Überlappungsverlängerungsprodukts ist mit einem Pfeil angegeben.
8 ist ein Elektrophoresegel, das die Ergebnisse aus einer einstufigen Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR, gefolgt von einer Semi-Nested-PCR-Amplifikation, zeigt, wobei angereicherte humane B-Lymphozyten als Matrize verwendet wurden. M1 ist eine 100 bp-Leiter. Die Bahnen 5 und 6 zeigen Banden der erwarteten Größe für das Überlappungsverlängerungsprodukt.
9A ist ein schematisches Diagramm der Säugerexpressionsvektoren (Em465/01P582/Em465/01P581), die zur Erzeugung von IgG1-lambda-exprimierenden Zelllinien verwendet wurden, wobei die codierenden Sequenzen in einer Kopf-an-Kopf-Orientierung sind. Die Vektoren umfassen die folgenden Elemente: Amp = Gen, das für die Ampicillinresistenz codiert. pUC ori = pUC-Replikationsursprung. AdMLP = Später Adenovirus-Hauptpromotor. EFP = Elongationsfaktor-Promotor. AP Leader = Leadersequenz der alkalischen Phosphatase. VH = Schwerkette-variable-Region-codierende Sequenz. IgG1 HC = Sequenz, die für die konstante Region der Schwerkette des Immunglobulins vom Isotyp G1 codiert. rBG polyA = poly A-Signalsequenz aus dem Kaninchen-beta-Globin. bGH polyA = poly A-Sequenz aus dem bovinen Wachstumshormon. IgK-Leader = Sequenz, die für den murinen kappa-Leader codiert. IgL (1b oder 1c) = Sequenz, die für die Immunglobulin-lambda-Leichtkettenfamilie 1b oder 1c codiert. FRT = Eine Flp-Erkennungszielstelle. Hygromycin = Gen, das für die Hygromycinresistenz codiert. SV40 poly A = poly A-Signalsequenz aus dem Simianvirus 40. Die 9B und 9C sind mit Ethidiumbromid gefärbte Agarosegele, beladen mit PCR-Produkten, die aus den Zelllinien CHO Flp-In/Em464/01P581 bzw. CHO Flp-In/Em464/01P582 isoliert wurden. Die Bahnen 1 bis 4 entsprechen Gesamt-RNA-Matrizenkonzentrationen von 50 pg, 5 pg, 0,5 pg oder 0 pg, verwendet für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktion. M ist eine 100 bp-Leiter (New England Biolabs, New England, USA). Die Pfeile verweisen auf das Überlappungsverlängerungs-PCR-Produkt.
10 ist ein Flussdiagramm, das die Stufen zeigt, die zum Erzeugen einer kognaten Antikörper-Expressionsbibliothek, von der ausgehend polyklonale oder monoklonale Antikörper exprimert werden können, angewendet wurden.
11 ist ein schematisches Diagramm von JSK301, einem E. coli-Vektor, der zum Erzeugen einer Bibliothek von Fab-Vektoren verwendet wurde, indem die Überlappungsverlängerungsfragmente, die die kognaten variable-Region-codierenden Sequenzen umfassen, in den Vektor an den angegebenen NotI/XhoI-Restriktionsschnittstellen eingefügt wurden. Der Vektor umfasst die folgenden Elemente: Amp und Amp pro = Ampicillinresistenzgen und sein Promotor. pUC19 Ori = Replikationsursprung. Humane CH1 = Sequenz, die für die gamma-1-Schwerketten-Domäne 1 von humanem Immunglobulin codiert. Stuffer = ein irrelevantes Sequenzinsert, das bei der Insertion der Überlappungsverlängerungsfragmente ausgeschnitten wird. tac P und lac Z = bakterielle Promotoren, die an den NheI- und AscI-Restriktionsschnittstellen exzidiert werden können.
12 ist ein schematisches Diagramm, das die Erzeugung einer Bibliothek von kognaten Fab-Expressionsvektoren erläutert. Die Stufe I erläutert die Insertion von kognaten Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen (VH₁-VL₁ bis VHx-VLx) in den E. coli-Vektor JSK301 mittels XhoI-NotI-Verdau. Die Stufe II erläutert die Insertion eines bakteriellen Promotors und einer bakteriellen Leaderkassette (pelB-Leader-P tac-Promotor, steuert die Expression von VHx, und P lac-Promotor-pelB-Leader, steuert die Expression von VLx) mittels AscI-NheI-Verdau.
13 erläutert die Verknüpfung von α-, β- und γ-Untereinheiten, die ein G-Protein konstituieren, unter Einsatz einer einstufigen Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR, gefolgt von einer weiteren PCR-Amplifikation. Die Größen der einzelnen codierenden Regionen sind angegeben, ebenso wie die Größe des verknüpften Produkts. Die mittels der Primer-Enden während der Amplifikation eingeführten Restriktionsschnittstellen sind für das Endprodukt angegeben.
14 zeigt "dot plots" bzw. Punktauftragungen einer analytischen FACS-Färbung von (A) PBMC, gereinigt aus Spenderblut; (B) der magnetisch sortierten, unmarkierten CD19-negativen Zellfraktion und (C) der magnetisch sortierten Fraktion von Zellen vom Typ CD19+. Für jede Fraktion ist ein Scatterplot, eine CD19/CD38-Auftragung und eine CD38/CD45-Auftragung gezeigt.
15 zeigt die Fraktion vom Typ CD19+ aus 9C, die in flüssigem Stickstoff gelagert, aufgetaut und mit anti-CD19, anti-CD38 und anti-CD45 gefärbt wurde. Dotplots, die 9C entsprechen, sind gezeigt.
16 zeigt "gates" bzw. Regionen, die zum Sortieren der Zellfraktion vom Typ CD19+ verwendet wurden. Ein "Scattergate" und ein „Fluoreszenz-Gate", basierend auf CD38 und CD45, wurden zum Isolieren der Zellen der Typen CD38high (CD38hi), CD45intermediate (CD45in) verwendet.
17 ist ein Elektrophoresegel, das die erfolgreiche Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktion am Spender TT03 zeigt (Reihe A, Wells 1–12 aus acht 95-Well-Platten). Die Proben sind in zwei Reihen (A und B) mit jeweils 48 Proben auf das Agarosegel aufgebracht worden. Die erwartete Größe des Überlappungsverlängerungsfragments betrug näherungsweise 1070 bp. Die mutmaßlichen Überlappungsverlängerungsfragmente sind mit Pfeilen markiert.
18 zeigt eine ELISA-Analyse von Periplasmaextrakten aus der Platte G060. Die ELISA-Platte wurde mit Ziege (gt)-anti-Human-Kappa beschichtet, und eingefangene bzw. immobilisierte Fab-Fragmente wurden mit einem HRP-konjugierten gt-anti-Human-Fab-spezifischen Antikörper detektiert.
19 zeigt eine ELISA-Analyse von Periplasmaextrakten aus der Platte G060. Die ELISA-Platte wurde mit 10 μg/ml Ovalbumin (Sigma A-5503) beschichtet, und die eingefangenen Fab-Fragmente wurden mit einem HRP-konjugierten gt-anti-Human-Fab-spezifischen Antikörper detektiert.
20 zeigt eine ELISA-Analyse von Periplasmaextrakten aus der Platte G060. Die ELISA-Platte wurde mit Tetanustoxoid beschichtet, und eingefangene Fab-Fragmente wurden mit einem HRP-konjugierten gt-anti-Human-Fab-spezifischen Antikörper detektiert.
21 zeigt eine einstufige kompetitive ELISA-Analyse von Periplasmaextrakten aus der Platte G060. Die ELISA-Platte wurde mit Tetanustoxoid (TT) beschichtet, und lösliches TT wurde zu 10^–7 M zu jedem Well gegeben, um die Bindung von Fab- Fragmenten aus den bakteriellen Überständen mit immobilisiertem TT zu konkurrieren. Eingefangene Fab-Fragmente wurden mit einem HRP-konjugierten gt-anti-Human-Fab-spezifischen Antikörper detektiert.
22 zeigt ein Alignment bzw. eine Anordnung von variablen Schwerketten-Proteinsequenzen aus TT-Antigen-bindenden Klonen aus der Platte G060. Der Grad der Sequenzhomologie wurde mittels unterschiedlicher Schattierungen wiedergegeben; 100%, 80% und 60% wurden mit Schwarz, Grau bzw. Hellgrau dargestellt. Die CDR1 ist an den Positionen 34 bis 41 des Alignments lokalisiert. Die CDR2 ist an den Positionen 55 bis 73 des Alignments lokalisiert. Die CDR3 ist an den Positionen 107 bis 127 des Alignments lokalisiert. Vorzeitige Stoppkodons wurden mittels eines Asteriskus bezeichnet. Das Alignment ist in 8 separate Figuren (a–h) unterteilt, aufgeteilt in zwei Reihen von links nach rechts mit 22a bis d in der oberen Reihe und 22e bis h in der unteren Reihe.
23 zeigt ein Alignment von variablen Leichtketten-Proteinsequenzen aus TT-Antigen-bindenden Klonen aus der Platte G060. Der Grad der Sequenzhomologie wurde mittels unterschiedlicher Schattierungen wiedergegeben; 100%, 80% und 60% wurden mit Schwarz, Grau bzw. Hellgrau dargestellt. Die CDR1 ist an den Positionen 26 bis 42 des Alignments lokalisiert. Die CDR2 ist an den Positionen 58 bis 64 des Alignments lokalisiert. Die CDR3 ist an den Positionen 97 bis 106 des Alignments lokalisiert. Vorzeitige Stoppkodons wurden mittels eines Asteriskus bezeichnet. Das Alignment ist in 8 separate Figuren (a–h) unterteilt, aufgeteilt in zwei Reihen von links nach rechts mit 23a bis d in der oberen Reihe und 23e bis h in der unteren Reihe.
24 zeigt einen kompetitiven ELISA-Assay zur Bestimmung von apparenten Affinitäten für ausgewählte Klone aus der Platte G060. Lösliche TT-Verdünnungen in Konzentrationen von 100 nM bis 25 pM (vierfache Verdünnung) wurden zu den Fab-Fragmenten gegeben, um die Bindung der Fab-Fragmente an immobilisiertes TT zu konkurrieren. Die Ausmaße der Reaktionen werden als das Verhältnis der beobachteten Bindung bei einer gegebenen Konzentration an löslichem TT zu der Bindung, die festgestellt wurde, wenn kein lösliches TT zu den Reaktionen gegeben wurde, angegeben.
25 zeigt eine doppelte phylogenetische Dotmatrixauftragung, die die intra- und intergenetische Beziehung zwischen Sequenzen variabler Domänen von Schwer- und Leichtketten von Antikörpern zeigt. Phylogenetische Stammbäume von V_H- und V_L-Sequenzen werden in einer Dotmatrix gepaart bzw. paarweise angeordnet, um auf die tatsächliche Paarung von speziellen V_H-Genen hinzuweisen. A) TT-bindende Klone, erhalten aus einer kombinatorischen Bibliothek unter Verwendung von Phagendisplay. B) TT-bindende Klone, erhalten aus einer Bibliothek von kognaten Paaren unter Verwendung der vorliegenden Erfindung.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Amplifikations- und Verknüpfungsverfahrens für zwei oder mehr nicht-zusammenhängende Nucleotidsequenzen von Interesse, das die Klonierung derartiger Sequenzen unter Anpassung an ein Hochdurchsatzformat ermöglicht. Dies wird grundsätzlich durch Verringerung der Anzahl der Stufen, die zum Amplifizieren und Verknüpfen von zu klonierenden Sequenzen erforderlichen sind, erzielt.
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Verknüpfen einer Mehrzahl von nicht-zusammenhängenden Nucleotidsequenzen von Interesse, umfassend das Amplifizieren von Nucleotidsequenzen von Interesse in einer Multiplex-Molekülamplifikationsverfahrensweise unter Verwendung einer Matrize, die aus einer isolierten Einzelzelle stammt, und das Bewirken einer nachfolgenden Verknüpfung der amplifizierten Sequenzen. Die Verknüpfung resultiert in einem Nucleinsäureabschnitt, umfassend Nucleotidsequenzen von Interesse, die miteinander auf eine kognate Weise assoziiert sind.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist diese Multiplex-Molekülamplifikationsverfahrensweise eine Multiplex-PCR-Amplifikation, der vorzugsweise eine Stufe der reversen Transkription vorausgeht. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die reverse Transkription, die Amplifikation und die Verknüpfung in einer einzigen Stufe unter Verwendung von Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR oder alternativ in zwei Stufen unter Verwendung von Multiplex-RT-PCR, gefolgt von Verknüpfung mittels Ligation oder Rekombination, durchgeführt.
Die Erfindung betrifft die Erzeugung von Bibliotheken von kognaten Paaren, umfassend verknüpfte variable-Region-codierende Sequenzen, insbesondere Schwerkette-variable-Region- und Leichtkette-codierende Sequenzen oder Sequenzen, die für die alpha-Kette, und Sequenzen, die für die beta-Kette eines T-Zell-Rezeptors (TcR) codieren. Das Verfahren umfasst das Erhalten einer Lymphozyten-enthaltenden Zellfraktion von wenigstens einem geeigneten Donor bzw. Spender und gegebenenfalls das Anreichern bezüglich einer bestimmten Lymphozytenpopulation aus dieser Zellfraktion, z. B. B-Lymphozyten oder T-Lymphozyten, abhängig davon, ob variable-Region-codierende Sequenzen aus Immunglobulinen oder PCRs gewünscht werden. Die Lymphozyten-enthaltende Zellfraktion oder die angereicherte Zellfraktion wird auf ein Array bzw. eine Anordnung von Gefäßen verteilt, wobei in jedem Gefäß eine Zelle erhalten wird. Das Array von Einzelzellen wird einer Stufe der reversen Transkription (RT) oder einer alternativen cDNA-erzeugenden Verfahrensweise unterworfen, wobei die aus der Population von Einzelzellen stammenden Nucleinsäuren als Matrize verwendet werden. Auf die RT-Stufe folgt eine Multiplex-Molekülamplifikationsverfahrensweise und die Verknüpfung von Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen, erzeugt aus jeder Zelle gemäß einem der Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Die Klonierungstechniken, die in der vorliegenden Erfindung offenbart sind, vermeiden arbeitsaufwändige und ineffiziente Klonierungsherangehensweisen und verringern wei terhin das Risiko von Kontamination und Verlust an Diversität während mehrfacher Klonierungsstufen.
Die Erfindung ermöglicht Bibliotheken von kognaten Paaren, hergestellt durch das Multiplex-Molekülamplifikations- und Verknüpfungsverfahren. Die Ausgangsbibliothek ("initial library") von kognaten Paaren (Elternbibliothek), die mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erzeugt wurde, kann einem Screening unterworfen werden, um dadurch eine Unterbibliothek von kognaten Paaren, codierend für variable Domänen von Ziel-spezifischem Bindungsprotein oder Volllängen-Bindungsproteine, zu erzeugen.
Die Bibliotheken und Unterbibliotheken, die durch die vorliegende Erfindung ermöglicht werden, können bei der Expression von rekombinanten monoklonalen oder polyklonalen Proteinen verwendet werden, wobei die ursprünglichen Bindungsaffinitäten und Spezifitäten, die im Donor bzw. Spender vorliegen, konserviert werden bzw. erhalten bleiben.
Definitionen
Der Begriff "kognates Paar" beschreibt ein ursprüngliches Paar von nicht-zusammenhängenden Nucleinsäuren von Interesse, die in einer Einzelzelle enthalten sind oder aus einer Einzelzelle erhalten werden. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst ein kognates Paar zwei variable-Region-codierende Sequenzen, die zusammen für eine variable Domäne eines Bindungsproteins codieren und deren Gensequenzen aus der gleichen Zelle stammen. Somit konservieren sie, wenn sie entweder als ein vollständiges Bindungsprotein oder als ein stabiles Fragment davon exprimiert werden, die Bindungsaffinität und -spezifität des Bindungsproteins, das ursprünglich von dieser Zelle exprimiert wurde. Ein kognates Paar kann z. B. aus einer variable-Schwerkette-codierenden Sequenz eines Antikörpers, assoziiert mit einer variable-Leichtkette-codierenden Sequenz aus der gleichen Zelle oder einer T-Zell-Rezeptor-α-Kettecodierenden Sequenz, assoziiert mit einer β-Kette-codierenden Sequenz aus der gleichen Zelle, bestehen. Eine Bibliothek von kognaten Paaren ist eine Sammlung von derartigen kognaten Paaren.
Der Begriff "Hot-Start-Polymerase" beschreibt Polymerasen, die bei Temperaturen, die für die reverse Transkription verwendet werden, inaktiv sind oder sehr geringe Aktivität besitzen. Derartige Polymerasen müssen durch hohe Temperaturen (90 bis 95°C) aktiviert werden, um funktionell zu werden. Dies ist z. B. ein Vorteil bei einstufigen RT-PCR-Verfahrensweisen, da dies eine störende Wechselwirkung bzw. Interferenz der Polymerase mit der Reaktion der reversen Transkriptase verhindert.
Der Begriff "isogene Population von Zellen" beschreibt eine Population von genetisch identischen Zellen. Insbesondere ist eine isogene Population von Zellen, die mittels klonaler Expansion aus einer isolierten Einzelzelle abgeleitet wird, in der vorliegenden Erfindung von Interesse.
Der Begriff "isolierte Einzelzelle" beschreibt eine Zelle, die physikalisch bzw. physisch aus einer Population von Zellen separiert wurde, entsprechend "einer Einzelzelle in einem einzelnen Gefäß". Wenn eine Population von Zellen einzeln auf eine Mehrzahl von Gefäßen verteilt wird, wird eine Population von isolierten Einzelzellen erhalten. Wie in dem mit "Quellen von Matrizen" betitelten Abschnitt spezifiziert, ist der Anteil von Gefäßen mit einer Einzelzelle nicht notwendigerweise ein 100%iger, um sie eine Population von Einzelzellen zu nennen.
Begriffe, die von "Verknüpfen" oder "Verknüpfung" in Bezug auf die Amplifikation abgeleitet sind, beschreiben die Assoziation der amplifizierten Nucleinsäuresequenzen, die für Nucleinsäuresequenzen von Interesse codieren, zu einem einzigen Abschnitt. In Bezug auf kognate Paare umfasst ein Abschnitt Nucleotidsequenzen, die für eine variable Domäne codieren, z. B. eine variable Schwerkettenregion eines Antikörpers, assoziiert mit einer codierenden Sequenz für die variable Region einer Leichtkette eines Antikörpers, abgeleitet aus der gleichen Zelle. Die Verknüpfung kann entweder gleichzeitig mit der Amplifikation erzielt werden oder als eine Stufe, die unmittelbar auf die Amplifikation folgt. Es gibt keine Einschränkungen hinsichtlich der Form oder Funktionalität des Abschnitts, er kann linear, zirkulär, einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Auch ist die Verknüpfung nicht notwendigerweise dauerhaft, eine der Nucleinsäuresequenzen von Interesse kann aus dem Abschnitt isoliert werden, sofern gewünscht, eine der variable-Region-codierenden Sequenzen kann z. B. aus einem Abschnitt für ein kognates Paar ("a cognate pair segment") isoliert werden. Solange jedoch die ursprünglichen variablen Regionen, die das kognate Paar darstellen, nicht mit anderen variablen Regionen verwürfelt sind, werden sie noch als ein kognates Paar angesehen, obgleich sie nicht miteinander zu einem einzigen Abschnitt verknüpft sind. Die Verknüpfung ist vorzugsweise eine Nucleotid-Phosphodiester-Verknüpfung. Jedoch kann die Verknüpfung auch mittels anderer chemischer Verknüpfungsverfahrensweisen erhalten werden.
Der Begriff "Multiplex-Molekülamplifikation" beschreibt die simultane Amplifikation von zwei oder mehr Zielsequenzen in der gleichen Reaktion. Geeignete Amplifikationsverfahren umfassen die Polymerasekettenreaktion (PCR) ( US 4 683 202 ), die Ligasekettenreaktion (LCR), (Wu und Wallace, 1989, Genomics 4, 560–9), die Strangverdrängungsamplifikations- bzw. Strand-Displacement-Amplifikations-(SDA)Technik (Walker et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20, 1691–6), die selbsterhaltende Sequenzreplikation (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87, 1874–8) und die Nucleinsäure-basierte Sequenzamplifikation (NASBA) (Compton J., 1991, Nature 350, 91–2). Die letzteren zwei Amplifikationsverfahren involvieren isotherme Reaktionen, basierend auf einer isothermen Transkription, die sowohl einzelsträngige RNA (ssRNA) als auch doppelsträngige DNA (dsDNA) erzeugen.
Der Begriff "Multiplex-PCR" beschreibt eine Variante der PCR, bei der zwei oder mehr Zielsequenzen simultan amplifiziert werden, indem mehr als ein Satz von Primern in die gleiche Reaktion eingeschlossen wird, z. B. ein Primersatz, der zur Amplifikation der variablen Region der Schwerkette angepasst ist, und ein Primersatz, der zur Amplifikation der variablen Region der kappa-Kette in der gleichen PCR-Reaktion angepasst ist. Weiterhin kann ein Primersatz, der zur Amplifikation der variablen Region der lambda-Kette angepasst ist, mit diesen Primersätzen kombiniert werden.
Der Begriff "Multiplex-RT-PCR" beschreibt eine Multiplex-PCR-Reaktion, der eine Stufe der reversen Transkription (RT) vorausgeht. Die Multiplex-RT-PCR kann entweder als ein zweistufiges Verfahren mit einer separaten RT-Stufe vor der Multiplex-PCR oder als ein einstufiges Verfahren, bei dem alle Komponenten für sowohl RT als auch Multiplex-PCR in einem einzelnen Röhrchen kombiniert werden, durchgeführt werden.
Die Begriffe "Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR" und "Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR" implizieren, dass die Multiplex-PCR oder die Multiplex-RT-PCR unter Einsatz eines Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisches durchgeführt werden, um die Zielsequenzen zu amplifizieren, wodurch die simultane Amplifikation und Verknüpfung der Zielsequenzen ermöglicht wird.
Der Begriff "eine Mehrzahl von Gefäßen" beschreibt einen beliebigen Gegenstand (oder eine Ansammlung von Gegenständen), der/die die physische bzw. physikalische Abtrennung einer Einzelzelle aus einer Population von Zellen ermöglicht. Es kann sich um Röhrchen, Multiwell-Platten (z. B. 96-Well-, 384-Well-, Mikrotiter-Platten oder andere Well-Platten), Arrays bzw. Anordnungen, Mikroarrays, Mikrochips, Gele oder eine Gelmatrix handeln. Vorzugsweise ist der Gegenstand für die PCR-Amplifikation einsetzbar.
Der Begriff "polyklonales Protein" oder "Polyklonalität", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Proteinzusammensetzung, umfassend unterschiedliche, jedoch homologe Proteinmoleküle, die vorzugsweise aus der Immunglobulin-Superfamilie ausgewählt sind. Somit ist jedes Proteinmolekül zu den anderen Molekülen der Zusammensetzung homolog, enthält jedoch auch einen oder mehrere Bereiche mit variabler Polypeptidsequenz, der/die durch Unterschiede in der Aminosäuresequenz zwischen den einzelnen Mitgliedern des polyklonalen Proteins gekennzeichnet ist/sind. Bekannte Beispiele für derartige polyklonale Proteine umfassen Antikörper- oder Immunglobulinmoleküle, T-Zell-Rezeptoren und B-Zell-Rezeptoren. Ein polyklonales Protein kann aus einer definierten Untermenge von Proteinmolekülen bestehen, die durch ein gemeinsames Merkmal, wie z. B. die gemeinsame Bindungsaffinität gegenüber einem gewünschten Ziel, definiert worden ist, z. B. ein polyklonaler Antikörper, der Bindungsspezifität gegenüber einem gewünschten Ziel-Antigen aufzeigt.
Der Begriff "eine Population von genetisch diversen Zellen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Zellpopulation, bei der sich die einzelnen Zellen in der Population untereinander auf der genomischen Ebene unterscheiden. Eine derartige Population von genetisch diversen Zellen ist z. B. eine Population von Zellen, die aus einem Donor stammen, oder eine Fraktion von derartigen Zellen, z. B. eine B-Lymphozyten- oder T-Lymphozyten-enthaltende Zellfraktion.
Der Begriff "Primersatz" wird mit dem Begriff "Primerpaar" austauschbar verwendet und beschreibt zwei oder mehr Primer, die zusammen zum "Priming" bzw. Initiieren der Amplifikation einer Nucleotidsequenz von Interesse (d. h., ein Mitglied eines kognaten Paares) befähigt sind. Ein Primersatz der vorliegenden Erfindung könnte im Design so sein, dass er ein Primen einer Familie von Nucleotidsequenzen, enthaltend variable-Region-codierende Sequenzen, bewirkt. Beispiele für unterschiedliche Familien sind bei Antikörpern die kappa-Leichtketten, lambda-Leichtketten, die variablen Regionen der Schwerketten und die variablen Regionen von α-, β-, γ- oder δ-T-Zell-Rezeptoren. Ein Primersatz zur Amplifikation einer Familie von Nucleotidsequenzen, enthaltend variable-Region-codierende Sequenzen, stellt häufig eine Mehrzahl von Primer dar, wobei mehrere Primer degenerierte Primer sein können.
Der Begriff "Sequenzidentität" ist als ein Prozentsatz ausgedrückt, der den Grad der Identität zwischen zwei Nucleinsäuresequenzen über die Länge der kürzesten der zwei Sequenzen angibt. Sie kann berechnet werden als (N_ref – N_dif) × 100/N_ref, wobei N_ref die Anzahl der Reste in der kürzeren der Sequenzen ist und wobei N_dif die Gesamtzahl der nicht-identischen Reste in einer N_ref langen, optimal angeordneten Übereinstimmung zwischen den zwei Sequenzen ist. Folglich wird die DNA-Sequenz AGTCAGTC eine Sequenzidentität von 75% mit der Sequenz TAATCAATCGG aufweisen (Ndif = 2 und Nref = 8) (die Unterstreichung zeigt das optimale Alignment bzw. die optimale Anordnung und der Fettdruck gibt die zwei nichtidentischen Reste von 8 an).
Die Begriffe "zufällig" oder "Zufall" beziehen sich im Hinblick auf eine Verknüpfung auf die Verknüpfung von Nucleotidsequenzen, die nicht aus der gleichen Zelle stammen, jedoch transversal innerhalb einer Population von genetisch diversen Zellen verknüpft sind. Falls die Nucleotidsequenzen von Interesse variable-Region-codierende Sequenzen sind, wird dies in einer kombinatorischen Bibliothek von verknüpften Sequenzen resultieren. Falls die Nucleotidsequenzen andererseits für ein nicht-diverses heteromeres Protein codieren, werden die zufällig verknüpften Sequenzen anscheinend ähnlich sein zu Sequenzen, die ausgehend von einer Einzelzelle verknüpft sind.
Der Begriff "Matrize, die aus einer isolierten Einzelzelle stammt" bezieht sich, im Hinblick auf die reverse Transkription, auf Nucleinsäuren innerhalb einer derartigen isolierten Zelle. Die Nucleinsäuren können z. B. in der Form von RNA, mRNA, DNA oder genomischer DNA vorliegen. Die Nucleinsäuren können entweder aus der Zelle isoliert sein oder noch bei den verbleibenden Inhalten der Zelle sein, wobei die Zelle in intakter Form oder lysierter Form vorliegt.
Das Amplifikations- und Verknüpfungsverfahren
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung verringert die Anzahl an Röhrchen, die zum Amplifizieren der Nucleotidsequenzen von Interesse nötig sind, wobei eine PCR-Variante eingesetzt wird, bei der zwei oder mehr Zielsequenzen simultan im gleichen Röhrchen amplifiziert werden, indem mehr als ein Satz von Primer, z. B. alle Primer, die zum Amplifizieren von variable-Region-codierenden Sequenzen nötig sind, in die gleiche Reaktion eingeschlossen wer den. Diese Herangehensweise ist allgemein als Multiplex-Polymerasekettenreaktion (Multiplex-PCR) bekannt.
Die Multiplex-PCR-Amplifikation und die Multiplex-PCR mit vorausgehender reverser Transkription (Multiplex-RT-PCR) sind gut bekannte Techniken auf dem diagnostischen Gebiet, z. B. bei der Analyse von Mutationen, Deletionen und Polymorphismen von DNA, für quantitative Assays von mRNA-Leveln und für die Identifikation von Viren, Bakterien und Parasiten (in der Übersicht dargestellt in Markoulatos, P. et al., 2002, J. Clin. Lab. Anal. 16, 47–51). Jedoch gibt es nur sehr wenige Beispiele, bei denen Immunglobulin-Leichtkette-variable-Region-codierende Sequenzen im gleichen Gefäß wie Immunglobulin-Schwerkette-variable-Region-codierende Sequenzen unter Verwendung eines Multiplex-Primer-Gemisches, bestehend aus mehr als vier Primern, die einen V_κ- und/oder V_λ-Primersatz zusammen mit einem V_H-Primersatz darstellen, amplifiziert wurden (Chapal, N. et al., 1997, BioTechniques 23, 518–524; Liu, A.H. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 7610–7614; Embleton, M.J. et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20, 3831–3837). Der Grund dafür könnte sein, dass Primersätze, die für die Amplifikation von Sequenzen, codierend für die variablen Domänen von Antigen-bindenden Proteinen, angepasst sind, allgemein von einer Mehrzahl von degenerierten Primern dargestellt werden, um die Diversität dieser variable-Region-codierenden Sequenzen zu erfassen. Somit ist die Komplexität der PCR-Reaktion stark erhöht, wenn eine Multiplex-PCR-Amplifikation an variable-Region-codierenden Sequenzen durchgeführt wird.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, dass zwei oder mehr Zielsequenzen, die mittels Multiplex-PCR amplifiziert wurden, sehr nahe am Amplifikationsverfahren verknüpft werden. Insbesondere werden kognate Paare von variable-Region-codierenden Sequenzen mittels dieses Verfahrens verknüpft.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nutzt die Tatsache, dass ein Multiplex-Primer-Gemisch so konzipiert werden kann, dass es in einer Überlappungsverlängerungs-PCR-Verfahrensweise funktioniert, was in einer simultanen Amplifikation und Verknüpfung von Nucleotidsequenzen von Interesse resultiert. Diese Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR-Technik dient dazu, die Anzahl von Reaktionen, die zum Isolieren und Verknüpfen von Nucleotidsequenzen von Interesse, insbesondere kognaten Paaren von verknüpften variablen Regionen, nötig sind, zu verringern.
Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wenden eine Verknüpfung mittels Ligation oder mittels Rekombination als eine Alternative zur Verknüpfung mittels Mulitplex-Überlappungsverlängerungs-PCR an. In diesen Verfahrensweisen wird die Verknüpfung nicht simultan mit der Multiplex-PCR-Amplifikation durchgeführt, sondern als eine Stufe, die unmittelbar auf die Amplifikation folgt. Jedoch kann die Verknüpfung noch im gleichen Röhrchen, wie das, in dem die Multiplex-PCR durchgeführt wurde, durchgeführt werden.
Um eine Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR durchzuführen, ist das Vorhandensein von zwei oder mehr Primersätzen (ein Muliplex-Primer-Gemisch), wobei wenigs tens ein Primersatz mit einem Überlappungsverlängerungsende ausgestattet ist, nötig. Das Überlappungsverlängerungsende ermöglicht die Verknüpfung der Produkte, die von jedem der Primersätze während der Amplifikation erzeugt werden. Ein derartiges Primergemisch wird als Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch bezeichnet. Die Multiplex-Überlappungsverängerungs-PCR unterscheidet sich von einer herkömmlichen Überlappungsverlängerungs-PCR dahingehend, dass die zu verknüpfenden Sequenzen simultan im gleichen Röhrchen erzeugt werden, wodurch eine sofortige Verknüpfung der Zielsequenzen während der Amplifikation ohne jegliche dazwischen liegende Aufreinigung bereitgestellt wird. Ferner erfordert eine herkömmliche Überlappungsverlängerungs-PCR eine separate verknüpfende PCR-Reaktion, entweder mit einem äußeren Primersatz oder einem Primersatz vom Nested-Typ, um das verknüpfte Produkt zu erzeugen (Horton, R.M. et al., 1989, Gene 77, 61–68). Eine derartige zusätzliche Amplifikationsstufe ist in der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR der vorliegenden Erfindung optional.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist eine Stufe der reversen Transkription (RT), die der Multiplex-PCR oder der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR-Amlifikation vorausgeht, wobei eine Matrize eingesetzt wird, die aus einer isolierten Einzelzelle oder einer Population von isogenen Zellen stammt.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Nucleotidsequenzen, die aus einer isolierten Einzelzelle stammen, als Matrize für die Multiplex-PCR-Amplifikation. Vorzugsweise wird RNA aus einer Einzelzelle vor der Multiplex-PCR revers zu cDNA transkribiert. Für die Amplifikation von einigen Nucleinsäuresequenzen von Interesse kann genomische DNA als Alternative zu mRNA verwendet werden. Durch Verwendung von isolierten Einzelzellen als Matrizenquelle ist es möglich, eine Verwürfelung von Nucleotidsequenzen, die für ein heteromeres Protein von Interesse codieren, mit Nucleotidsequenzen, die aus unterschiedlichen Zellen innerhalb einer Population von Zellen stammen, zu vermeiden. Dies ist wichtig, wenn es gewünscht ist, die ursprüngliche Zusammensetzung der Sequenzen von Interesse zu erhalten. Insbesondere für die Erzeugung eines kognaten Paares von variable-Region-codierenden Sequenzen ist die Verwendung einer isolierten Einzelzelle als Matrizenquelle ein wichtiges Merkmal.
Die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR ist eine selten angewendete Technologie. Die WO 99/16904 offenbart die Verknüpfung von Exons aus einer genomischen Sequenz in einer einzigen Reaktion, wodurch cDNA ohne Einsatz einer reversen Transkription erzeugt wird. Das Verfahren setzte, wie es beschrieben ist, einen Primersatz (dargestellt von zwei Primern) pro zu verknüpfendem Exon ein, wodurch ein Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch gebildet wurde. Jeder einzelne Primersatz war zur Überlappung mit dem benachbarten Primersatz durch komplementäre Überlappungsverlängerungs-Enden befähigt. Die cDNA wurde aus einer Matrize von genomischer DNA erzeugt, indem eine Überlappungsverlängerungs-PCR-Reaktion unter Einsatz eines Multiplex- Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisches durchgeführt wurde, gefolgt von einer Nested-PCR, die als notwendige Stufe beschrieben wurde.
Die Erzeugung von cDNA aus den Exons genomischer DNA, wie in der WO 99/16904 beschrieben, ist ein anderes Gebiet als die Klonierung von Sequenzen, die für heteromere Proteine codieren. Zuallererst werden heteromere Proteine im Allgemeinen ausgehend von verschiedenen Genen exprimiert, wohingegen die Exonverknüpfung, wie sie in der WO 99/16904 beschrieben ist, die Verknüpfung von Exons aus einem einzelnen Gen beschreibt. Weiterhin ermöglicht die vorliegende Erfindung die Erzeugung von Bibliotheken von verknüpften Nucleinsäuresequenzen von Interesse, insbesondere kombinatorischen Bibliotheken und Bibliotheken von kognaten Paaren von variablen Regionen; eine vollständig andere Situation als die Verknüpfung einer Reihe von Exons aus einem einzelnen Gen, resultierend in einer einzigen nicht-variablen cDNA. Ferner setzt die vorliegende Erfindung Nucleinsäuren, die aus Einzelzellen stammen, ein, vorzugsweise in der Form von RNA, die nicht aus den verbleibenden Zellinhalten isoliert werden muss, bevor sie als Matrize eingesetzt werden kann.
Es gibt wenige Publikationen, in denen eine Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR hinsichtlich einer Verknüpfung von variable-Region-codierenden Sequenzen beschrieben worden ist.
Die einfachste Form einer Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR wurde für die Isolation einer scFv-codierenden Sequenz als eine Hybridom-Zelllinie beschrieben (Thirion, S. et al., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507–511, und Mullinax, R.L. et al., 1992, BioTechniques 12, 864–869). Die von Thirion und Mullinax beschriebenen Verfahren setzten eine reverse Transkription von mRNA mit Oligo-dT-Primern an Gesamt-RNA, die aus der Hybridom-Zelllinie extrahiert wurde, ein, gefolgt von einer separaten Verknüpfungsstufe. Die Verknüpfungsstufe wurde mit einer Gesamtzahl von vier Primern durchgeführt, die zwei Primerpaare für die Amplifikation von variable-Schwerkettenregion- bzw. variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen darstellen. Der V_L-Vorwärts-Primer und der V_H- oder C_H-Rückwärts-Primer enthielten komplementäre Überlappungsverlängerungsenden, wodurch eine simultane Amplifikation und Verknüpfung der variable-Schwerkettenregion- und variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen ermöglicht wurde. Diese Verfahren verwendeten keine Nested-PCR, um die Empfindlichkeit des Verknüpfungsverfahrens zu erhöhen.
Das andere Beispiel einer Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR in Bezug auf die Verknüpfung von variable-Region-codierenden Sequenzen wurde in der vorstehend erwähnten WO 93/03151 beschrieben, die ein Verfahren zum Klonieren von variable-Schwerkettenregion- und variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen, die aus der gleichen Zelle stammen, bereitstellt, wobei vor der Klonierung keine Einzelzellen isoliert werden müssen. Das in der WO 93/03151 beschriebenen Verfahren erfordert einen Waschschritt zwischen der RT-Stufe und der Stufe der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR. Ferner war es eines der spezifischen Ziele der WO 93/03151 , das Problem der Notwendigkeit des Isolierens von Einzelzellen, um kognate Paare von variable-Region-codierenden Sequenzen zu erhalten, zu lösen.
Keine dieser bekannten Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Techniken war dafür entwickelt, mit einer Matrize, die aus einer isolierten Einzelzelle stammt, zu funktionieren. Auch war keines der Verfahren dazu befähigt, als einstufige RT-PCR-Reaktionen durchgeführt zu werden.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verknüpfung einer Mehrzahl von nicht-zusammenhängenden Nucleotidsequenzen von Interesse. Das Verfahren umfasst das Amplifizieren, in einer Multiplex-PCR- oder Multiplex-RT-PCR-Amplifikationsverfahrensweise, von Nucleotidsequenzen von Interesse unter Verwendung einer Matrize, die aus einer isolierten Zelle oder einer Population von isogenen Zellen stammt, und das Bewirken einer Verknüpfung der amplifizierten Nucleotidsequenzen von Interesse. Ferner umfasst das Verfahren eine optionale Stufe des Durchführens einer zusätzlichen Amplifikation der verknüpften Produkte.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren des Herstellens einer Bibliothek von kognaten Paaren, umfassend verknüpfte variable-Region-codierende Sequenzen. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer Lymphozytenenthaltenden Zellfraktion von einem Donor, die gegebenenfalls hinsichtlich einer bestimmten Lymphozytenpopulation aus der Zellfraktion angereichert ist. Ferner wird eine Population von isolierten Einzelzellen erhalten, indem Zellen aus der Lymphozyten-enthaltenden Zellfraktion oder der angereicherten Zellfraktion individuell auf eine Mehrzahl von Gefäßen verteilt werden. Eine Multiplex-Molekülamplifikation (Multiplex-PCR-Amplifikation) der variable-Region-codierenden Sequenzen, die in der Population von isolierten Einzelzellen enthalten sind, wird durchgeführt, und eine Verknüpfung von Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen, wobei ein individuelles Paar aus einer Einzelzelle innerhalb der Population von isolierten Einzelzellen stammt, wird bewerkstelligt. Ferner umfasst die Technik zwei optionale Stufen: in der ersten Stufe wird die individuelle isolierte Einzelzelle in der Population von Einzelzellen zu einer Population von isogenen Zellen expandiert, bevor die Multiplex-RT-PCR-Amplifikation durchgeführt wird. Dadurch wird eine Mehrzahl von Gefäßen mit einer diversen Population von isogenen Zellen (eine Population von isogenen Zellen in einem Gefäß) erhalten. Die zweite optionale Stufe umfasst die Durchführung einer zusätzlichen Amplifikation der verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist ein individuelles Mitglied der Bibliothek von kognaten Paaren, bestehend aus einer Immunglobulin-Leichtkette-variable-Region-codierenden Sequenz, assoziiert mit einer Immunglobulin-Schwerkettevariable-Region-codierenden Sequenz, die aus der gleichen Zelle stammt, oder, bei Bestehen aus Sequenzen, die für eine T-Zell-Rezeptor-Bindungsdomäne codieren, gebildet durch eine variable alpha-Kettenregion, assoziiert mit einer variablen beta-Kettenregion, oder einer variablen gam ma-Kettenregion, assoziiert mit einer variablen delta-Kettenregion, wobei die assoziierten variablen Regionen aus der gleichen Zelle stammen.
Die Multiplex-RT-PCR-Amplifikation der vorliegenden Erfindung kann entweder als zweistufiges Verfahren durchgeführt werden, wobei die reverse Transkription (RT) getrennt von der Multiplex-PCR-Amplifikation (oder alternativ Multiplex-Molekülamplifikation) durchgeführt wird, oder als ein einstufiges Verfahren, wobei die RT- und Multiplex-PCR-Amplifikationsstufen mit den gleichen Primer in einem Röhrchen durchgeführt werden.
Die reverse Transkription (RT) wird mit einem Enzym, das Reverse-Transkriptase-Aktivität enthält, durchgeführt, resultierend in der Erzeugung von cDNA aus Gesamt-RNA, mRNA oder Ziel-spezifischer RNA aus einer isolierten Einzelzelle. Primer, die für die reverse Transkription eingesetzt werden können, sind z. B. Oligo-dT-Primer, Zufalls-Hexamere, Zufalls-Decamere, andere Zufalls-Primer oder Primer, die für die Nucleotidsequenzen von Interesse spezifisch sind.
Die zweistufige Multiplex-RT-PCR-Amplifikationsverfahrensweise ermöglicht die Verteilung der in der RT-Stufe erzeugten cDNA auf mehr als ein Gefäß, was die Lagerung einer Matrizenfraktion, bevor mit der Amplifikation fortgefahren wird, erlaubt. Zusätzlich ermöglicht die Verteilung von cDNA auf mehr als ein Röhrchen die Durchführung von mehr als einer Multiplex-PCR-Amplifikation von Nucleinsäure, die aus der gleichen Matrize stammt. Obgleich dies in einer erhöhten Anzahl separater Reaktionen resultiert, eröffnet es die Möglichkeit, die Komplexität des Multiplex-Primer-Gemisches zu verringern, falls dies gewünscht sein sollte. Diese zweistufige Herangehensweise kann z. B. angewendet werden, um variable-Schwerkettenregion- und variable-kappa-Kettenregion-codierende Sequenzen in einem Röhrchen und variable-Schwerkettenregion- und variable-lambda-Leichtkettenregion-codierende Sequenzen in einem anderen Röhrchen unter Verwendung der gleichen Matrize zu amplifizieren und zu verknüpfen. Eine Einzelzelle exprimiert üblicherweise nur eine der Leichtketten. Jedoch wird es häufig einfacher sein, die Reaktionen simultan durchzuführen, anstatt das Ergebnis von einer der Reaktionen abzuwarten, bevor die andere durchgeführt wird. Ferner dient die Amplifikation von sowohl kappa als auch lambda als eine interne Negativkontrolle, da erwartet würde, dass nur kappa oder lambda, ausgehend von einer Einzelzelle, amplifiziert (werden).
In der einstufigen Multiplex-RT-PCR-Verfahrensweise werden reverse Transkription und Multiplex-PCR-Amplifikation im gleichen Gefäß durchgeführt. Alle Komponenten, die zum Durchführen von sowohl reverser Transkription als auch Multiplex-PCR in einer einzigen Stufe nötig sind, werden anfänglich in die Gefäß eingegeben, und die Reaktion wird durchgeführt. Im Allgemeinen besteht keine Notwendigkeit, weitere Komponenten zuzugeben, sobald die Reaktion gestartet worden ist. Der Vorteil der einstufigen Multiplex-RT-PCR-Amplifikation ist, dass sie die Anzahl der Stufen, die zum Erzeugen der verknüpften Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung nötig sind, noch weiter verringert. Dies ist besonders nützlich, wenn eine Multiplex-RT-PCR an einem Array von Einzelzellen durchgeführt wird, wobei die gleiche Reaktion in einer Mehrzahl von Gefäßen durchgeführt werden muss. Eine einstufige Multiplex-RT-PCR wird durchgeführt, indem die reversen Primer, die in dem Multiplex-Primer-Gemisch, das für die Multiplex-PCR-Amplifikation benötigt wird, ebenso eingesetzt werden, wie Primer für die reverse Transkription. Im Allgemeinen umfasst die für die einstufige Multiplex-RT-PCR benötigte Zusammensetzung eine Nucleinsäurematrize, ein Enzym mit Reverse-Transkriptase-Aktivität, ein Enzym mit DNA-Polymerase-Aktivität, ein Desoxynucleosidtriphosphat-Gemisch (dNTP-Gemisch, umfassend dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und ein Multiplex-Primer-Gemisch. Die Nucleinsäurematrize ist vorzugsweise Gesamt-RNA oder mRNA, stammend aus einer isolierten Einzelzelle, entweder in einer gereinigten Form, als ein Lysat der Zelle oder noch innerhalb der intakten Zelle. Im Allgemeinen erfordert die genaue Zusammensetzung des Reaktionsgemisches eine gewisse Optimierung hinsichtlich jedes Multiplex-Primer-Gemisches, das mit der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist. Dies gilt sowohl für die zweistufigen als auch für die einstufigen Multiplex-RT-PCR-Verfahrensweisen.
In alternativen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es zweckdienlich sein, genomische DNA anstelle von RNA als Matrize zu verwenden. In derartigen Fällen wird die Stufe der reversen Transkription weggelassen, und die verbleibenden Stufen der Erfindung werden, wie sie über die Anmeldung hinweg beschrieben sind, durchgeführt.
Für einige einstufige Multiplex-RT-PCR-Reaktionen kann es von Vorteil sein, weitere Komponenten während der Reaktion zuzugeben. Z. B. kann die Zugabe der Polymerase auf die RT-Stufe folgen. Andere Komponenten könnten z. B. ein dNTP-Gemisch oder ein Multiplex-Primer-Gemisch, möglicherweise mit einer unterschiedlichen Primerzusammensetzung, sein. Dies kann anschließend als eine Ein-Röhrchen-Multiplex-RT-PCR angesehen werden, die allgemein die gleichen Vorteile aufweist, wie die einstufige Multiplex-RT-PCR, da sie ebenso die Anzahl der Röhrchen, die zum Erhalten der gewünschten verknüpften Produkte nötig sind, beschränkt.
Die Nucleotidsequenzen von Interesse, amplifiziert mittels der Multiplex-RT-PCR, können miteinander mittels mehrerer Verfahren verknüpft werden, wie z. B. Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR, Ligation oder Rekombination, wobei unterschiedliche Multiplex-Primer-Gemische verwendet werden. Vorzugsweise ist das Multiplex-RT-PCR-Amplifikations- und -Verknüpfungsverfahren ein einstufiges oder ein zweistufiges Verfahren. Jedoch kann das Verknüpfungsverfahren auch als ein mehrstufiges Verfahren durchgeführt werden, wobei z. B. ein Füllfragment bzw. Stuffer-Fragment verwendet wird, um die Nucleinsäuresequenzen von Interesse mit einer von PCR, Ligation oder Rekombination zu verknüpfen. Ein derartiges Füllfragment kann cis-Elemente, Promotorelemente oder eine relevante codierende Sequenz oder Erkennungssequenz enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verknüpfungsverfahren im gleichen Gefäß wie die Multiplex-RT-PCR-Amplifikation durchgeführt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verknüpfung einer Mehrzahl von nicht-zusammenhängenden Nucleotidsequenzen von Interesse in Verbindung mit der Multiplex-PCR-Amplifikation durchgeführt, wobei ein Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch eingesetzt wird. Dies resultiert in einer kombinierten Amplifikation und Verknüpfung der Zielsequenzen. Allgemein umfasst die für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR benötigte Zusammensetzung eine Nucleinsäurematrize, ein Enzym mit DNA-Polymerase-Aktivität, ein Desoxynucleosidtriphosphat-Gemisch (dNTP-Gemisch, umfassend dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und ein Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch.
In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verknüpfung einer Mehrzahl von nicht-zusammenhängenden Nucleotidsequenzen von Interesse mittels Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR unter Verwendung einer Matrize, die aus einer isolierten Einzelzelle oder einer Population von isogenen Zellen stammt, durchgeführt. Ferner umfasst das Verfahren eine optionale Stufe der Durchführung einer zusätzlichen Molekülamplifikation von verknüpften Produkten. Vorzugsweise wird die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR als eine einstufige/Ein-Röhrchen-Reaktion durchgeführt.
Ein Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch der vorliegenden Erfindung umfasst wenigstens zwei Primersätze, die zum Priming bzw. zur Initiierung der Amplifikation und Verknüpfung von wenigstens zwei variable-Region-codierenden Sequenzen befähigt sind, z. B. Amplifikation und Verknüpfung von Sequenzen aus Familien der variablen Schwerkettenregion von Immunglobulinen mit Familien der variablen kappa- oder lambda-Leichtkettenregion oder Amplifikation und Verknüpfung von Sequenzen aus den T-Zell-Rezeptor-Familien α, β, γ oder δ.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Mehrzahl von Nucleotidsequenzen von Interesse, die mittels Multiplex-RT-PCR amplifiziert wurden, mittels Ligation verknüpft. Um dies zu bewerkstelligen, ist das für die Multiplex-RT-PCR verwendete Multiplex-Primer-Gemisch so konzipiert, dass die amplifizierten Zielsequenzen mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten werden können und eine kovalente Verknüpfung mittels DNA-Ligation durchgeführt werden kann (das Primer-Design ist im Abschnitt "Primer-Gemische und -Design" beschrieben). Nach einer Multiplex-RT-PCR-Amplifikation mit einem derartigen Multiplex-Primer-Gemisch werden die Restriktionsenzyme, die zur Bildung von kompatiblen Enden der Zielsequenzen benötigt werden, zusammen mit der Ligase zu dem Gemisch gegeben. Vor dieser Stufe ist keine Reinigung der PCR-Produkte erforderlich, obgleich eine Reinigung durchgeführt werden kann. Die Reaktionstemperatur für die kombinierte Restriktionsspaltung und Ligation liegt näherungsweise zwischen 0 und 40°C. Falls jedoch die Polymerase aus der Multiplex-PCR-Reaktion noch im Gemisch vorhanden ist, ist eine Inkubationstemperatur unterhalb der Raumtemperatur bevorzugt, am stärksten bevorzugt sind Temperaturen zwischen 4 und 16°C.
In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Mehrzahl von Nucleotidsequenzen von Interesse, die mittels Multiplex-RT-PCR amplifiziert wurden, mittels Rekombination verknüpft. Bei dieser Herangehensweise können die amplifizierten Zielsequenzen unter Verwendung identischer Rekombinationsstellen verbunden werden. Die Verknüpfung wird anschließend durchgeführt, indem Rekombinasen, die die Rekombination erleichtern, zugegeben werden. Einige geeignete Rekombinasesysteme sind Flp-Rekombinase mit einer Vielfalt von FRT-Stellen, die Cre-Rekombinase mit einer Vielfalt von lox-Stellen, die Integrase ΦC31, die eine Rekombination zwischen der attP-Stelle und der attB-Stelle durchführt, das β-Rekombinase-Six-System, sowie das Gin-gix-System. Eine Verknüpfung mittels Rekombination ist beispielhaft für zwei Nucleotidsequenzen (V_H verknüpft mit V_L) beschrieben worden (Chapal, N. et al., 1997, BioTechniques 23, 518–524), hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die Nucleotidsequenzen von Interesse variable-Region-codierende Sequenzen, und die Verknüpfung erzeugt ein kognates Paar von variable-Region-codierenden Sequenzen. Ein derartiges kognates Paar kann eine oder mehrere konstante-Region-codierende Sequenzen zusätzlich zu den variablen Regionen umfassen.
In einer noch bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Nucleotidsequenzen von Interesse variable-Region-codierende Immunglobulin-Sequenzen, und die Verknüpfung erzeugt ein kognates Paar von variable-Leichtkettenregion- und variable-Schwerkettenregion-codierenden Sequenzen. Ein derartiges kognates Paar kann eine oder mehrere konstante-Region-codierende Sequenzen zusätzlich zu den variablen Regionen umfassen. Ferner kann ein derartiges kognates Paar aus einer Matrize, die aus B-Zellen der B-Lymphozyten-Linie stammt, angereichert aus einer Lymphozyten-enthaltenden Zellfraktion, wie Vollblut, mononukleäre Zellen oder weiße Blutzellen, isoliert sein.
In einer genauso bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Nucleotidsequenzen von Interesse variable-TcR-Region-codierende Sequenzen, und die Verknüpfung erzeugt ein kognates Paar von variable-Region-codierenden Sequenzen der α-Kette und der β-Kette oder von variable-Region-codierenden Sequenzen der γ-Kette und der δ-Kette. Ein derartiges kognates Paar kann eine oder mehrere konstante-Region-codierende Sequenzen zusätzlich zu den variablen Regionen umfassen. Ferner kann ein derartiges kognates Paar aus einer Matrize, die aus Zellen der T-Lymphozyten-Linie stammt, angereichert aus einer Lymphozyten-enthaltenden Zellfraktion, wie Vollblut, mononukleäre Zellen oder weiße Blutzellen, isoliert sein.
Ein effizienter Weg zum Erhöhen der Spezifität, Sensitivität bzw. Empfindlichkeit und Ausbeute des Multiplex-RT-PCR-Verknüpfungsverfahrens besteht in der Durchführung einer zusätzlichen Molekülamplifikation der verknüpften Nucleotidsequenzen, erhalten aus der Multiplex-RT-PCR, gefolgt von einer Verknüpfung mittels Ligation oder Re kombination oder einer Verknüpfung unter Verwendung der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR. Diese zusätzliche Amplifikation wird vorzugsweise mit einer/der PCR-Amplifikation durchgeführt, wobei ein Primergemisch, das zum Amplifizieren der verknüpften Nucleinsäuresequenzen von Interesse angepasst ist, eingesetzt wird. Das eingesetzte Primer-Gemisch kann die äußeren Primer des Multiplex-Primer-Gemisches oder des Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisches umfassen, was die Primer bedeutet, die sich an das äußerste 5'-Ende und 3'-Ende des Sinnstranges der verknüpften variablen-Region-codierenden Sequenzen anlagern, wodurch die Amplifikation des gesamten verknüpften Produkts ermöglicht wird. Die äußeren Primer können auch beschrieben werden als die Primer des Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisches, die keine Überlappungsverlängerungs-Enden enthalten. Alternativ kann ein Primersatz vom Nested- bzw. geschachtelten oder Semi-Nested-Typ für die zusätzliche Amplifikation der verknüpften Nucleotidsequenzen verwendet werden. Eine derartige Nested-PCR dient insbesondere der Erhöhung der Spezifität des Verfahrens sowie der Erhöhung der Menge an verknüpftem Produkt. Für die vorliegende Erfindung wird davon ausgegangen, dass eine Semi-Nested-PCR (wie im Abschnitt mit dem Titel "Primer-Gemische und -Design" beschrieben) ebenso funktioniert wie die Nested-PCR. Es ist somit erwünscht, obgleich für die vorliegende Erfindung nicht nötig, eine zusätzliche PCR-Amplifikation der verknüpften Produkte aus der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR oder der mittels Ligation oder Rekombination verknüpften Produkte durchzuführen, wobei vorzugsweise Nested-PCR oder Semi-Nested-PCR verwendet wird.
Die zusätzliche Amplifikation kann entweder direkt unter Verwendung einer Fraktion oder des gesamten Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktionsprodukts oder Ligationsprodukts oder Rekombinationsprodukts oder einer Fraktion eines beliebigen dieser Produkte oder unter Verwendung partiell gereinigter verknüpfter Produkte aus einer beliebigen dieser Reaktionen durchgeführt werden, z. B. mittels Durchführung einer Agarosegelelektrophorese der verknüpften Produkte und Ausschneiden des Fragments, das der erwarteten Größe der verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen entspricht. Für Produkte, die mittels Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RR-PCR verknüpft wurden, wird die zusätzliche Amplifikation vorzugsweise direkt an einer Fraktion aus der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktion durchgeführt, da dies eine Verknüpfung der individuellen Zielsequenzen, die in der ersten Reaktion nicht verknüpft wurden, unterstützen würde.
Sequenzen von Interesse
Die Nucleotidsequenzen von Interesse gemäß der vorliegenden Erfindung können ausgewählt werden aus Sequenzen, die für unterschiedliche Untereinheiten oder Domänen codieren, die bei Expression ein Protein oder einen Teil eines Proteins bilden. Derartige Proteine, die aus wenigstens zwei nicht-identischen Untereinheiten bestehen bzw. daraus zusammengesetzt sind, sind als heteromere Proteine bekannt. Heteromere Proteine sind in allen Arten von Spezies verbreitet. Einige der Klassen, zu denen solche Proteine gehören, sind z. B. Enzyme, Inhibitoren, Strukturproteine, Toxine, Kanalproteine, G-Proteine, Rezeptorproteine, Proteine der Immunglobulin-Superfamilie, Transportproteine usw. Die Nucleotidsequenzen, die für derartige heteromere Proteine codieren, sind nicht-zusammenhängend, was z. B. bedeutet, dass sie aus unterschiedlichen Genen oder unterschiedlichen mRNA-Molekülen herrühren. Jedoch kann nicht-zusammenhängend, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, auch Nucleotidsequenzen bedeuten, die für Domänen des gleiche Proteins codieren, wobei die Domänen durch Nucleotidsequenzen, die nicht interessieren, getrennt sind.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die Nucleotidsequenzen von Interesse variable-Region-codierende Sequenzen aus der Immunglobulin-Superfamilie, wie z. B. Immunglobuline (Antikörper), B-Zell-Rezeptoren und T-Zell-Rezeptoren (TcRs). Insbesondere sind variable-Region-codierende Sequenzen aus Immunglobulinen von Interesse. Derartige variable-Region-codierende Sequenzen umfassen Volllängen-Antikörper sowie Fabs, Fvs, scFvs und Kombinationen von Fragmenten der variable-Region-codierenden Sequenzen, z. B. Komplementaritäts-bestimmende Regionen (CDRs), Verbindungsgene oder V-Gene oder Kombinationen dieser. Allgemein kann die vorliegende Erfindung mit beliebigen Kombinationen von variable-Region-codierenden Sequenzen und Fragmenten davon angewendet werden. Die vorliegende Anmeldung beschreibt beispielhaft die Verknüpfung der gesamten Leichtkette mit der variablen Domäne der Schwerkette. Jedoch ermöglicht die vorliegende Erfindung auch die Verknüpfung von lediglich den variablen Domänen der Schwer- und Leichtkette, wobei Fv- oder scFv-codierende Sequenzen erzeugt werden, oder die Verknüpfung der gesamten Leichtkette mit der variablen Region der Schwerkette + der Domäne C_H1 der konstanten Region + Teilen der Gelenkregion, wobei Fab, Fab' oder F(ab)₂ erzeugt werden. Ferner ist es möglich, eine beliebige Region der konstante-Schwerkettenregion-Domänen zu der variablen Schwerkette hinzuzufügen, wodurch trunkierte Antikörper-codierende Sequenzen oder Volllängen-Antikörper-codierende Sequenzen erzeugt werden.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen variable-Region-codierende Sequenzen einen Typ von Leichtkette(kappa oder lambda)-codierender Immunglobulin-Sequenz und eine variable-Schwerkettenregion-codierende Immunglobulin-Sequenz.
Variable-Region-codierende Sequenzen, die von T-Zell-Rezeptoren (TcRs) stammen, sind ebenfalls von Interesse. Derartige TcR-codierende Sequenzen umfassen codierende Sequenzen für Volllängen-alpha- und -beta-Ketten oder -gamma- und delta-Ketten sowie lösliche PCRs oder lediglich die variablen Domänen dieser Ketten oder einzelkettige Fusionsproteine davon (Einzelketten-αβ oder Einzelketten-γδ).
Quellen für Matrizen
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Befähigung zum Verknüpfen von Nucleotidsequenzen, die aus einer isolierten Einzelzelle stammen, und zwar ohne Aufteilung auf einzelne Gefäße. Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Zellen können z. B. Bakterien, Hefen, Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen oder Säugerzellen oder Fraktionen derartiger Zellen sein. Aus Säugern stammende Blutzellen sind ein Beispiel für eine Fraktion von Zellen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von isolierten Einzelzellen als Matrizenquelle, da eine Verwürfelung der Nucleinsäuresequenzen von Interesse, insbesondere von variable-Region-codierenden Sequenzen, vermieden wird. Dies ist wichtig, falls das Erhalten eines ursprünglichen Paares von z. B. variable-Region-codierenden Sequenzen gewünscht wird.
Ein weiteres bevorzugtes Merkmal der vorliegenden Erfindung ist das Erhalten einer Einzelzelle aus einer Zellfraktion, umfassend Lymphozyten, wie z. B. B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, Plasmazellen und/oder verschiedene Entwicklungsstufen dieser Zelllinien. Andere Populationen von Zellen, die Bindungsproteine aus der Immunglobulin-Superfamilie exprimieren, könnten auch verwendet werden, um Einzelzellen zu erhalten. Zelllinien, wie Hybridomzellen, Zelllinien der B-Lymphozyten- oder T-Lymphozyten-Linie oder Virus-immortalisierte Zelllinien oder von einem Donor bzw. Spender stammende Zellen, die an der Immunreaktion beteiligt sind, sind in der vorliegenden Erfindung ebenso anwendbar. Von einem Donor stammende, Lymphozyten-enthaltende Zellfraktionen können aus natürlichem Gewebe oder natürlicher Flüssigkeit, die in derartigen Zellen reichlich (vorhanden) ist, z. B. Blut, Knochenmark, Lymphknoten, Milzgewebe, Mandelgewebe, oder aus Infiltrationen in und um Tumore oder aus inflammatorischen Gewebesinfiltrationen erhalten werden. Geeignete Zellspender- bzw. Zell-Donoren für die vorliegende Erfindung können aus Vertebraten, die alle ein erworbenes Immunsystem enthalten, ausgewählt sein. Die Spender können hinsichtlich eines gewünschten Ziels bzw. Targets entweder naiv oder hyperimmun sein. Für die Isolation von Antigen-bindenden Proteinen mit Bindungsspezifitäten gegenüber einem gewünschten Ziel werden hyperimmune Spender bevorzugt. Derartige hyperimmune Spender können entweder Spender, die mit dem Ziel oder Fragmenten des Ziels immunisiert wurden, sein oder sie können rekonvaleszente Patienten oder nicht-gesunde Individuen, die eine natürliche Immunreaktion gegenüber dem Ziel durchlaufen, z. B. Autoimmun-Patienten, Krebs-Patienten, Patienten mit infektiösen Erkrankungen, z. B. HIV-Patienten, Hepatitis A-, B- oder C-Patienten, SARS-Patienten usw., oder Patienten mit chronischen Erkrankungen sein.
Wenn rekombinante Proteine für eine Behandlung eingesetzt werden, ist es bevorzugt, dass sie von Sequenzen, die Spezies-Identität mit dem zu behandelnden Individuum aufweisen (z. B. humane Sequenzen für die Behandlung von Menschen), abgeleitet sind. Erstens, da rekombinante Proteine, die von einer fremden Sequenz (d. h. nicht-human) abgeleitet sind, vom Immunsystem erkannt werden, was zu einer Immunreaktion unter Beteiligung polyklonaler Anti-Protein-Antikörper führt. Diese Anti-Protein-Antikörper können die Wirkung des Wirkstoffs bzw. Arzneimittels blockieren, indem das aktive Zentrum belegt wird, sie werden die Wirkstoffausscheidung bzw. -Clearance beschleunigen und sie könnten potentiell schädliche Nebenwirkungen, wie Überempfindlichkeitsreaktionen nach einer wiederholten Exposition, induzieren.
Eine Immunogenität kann jedoch auch in Fällen festgestellt werden, bei denen das rekombinante Protein von einer Sequenz, die Spezies-Identität aufweist, abgeleitet ist. Eine derartige Immunogenität kann z. B. durch posttranslationale Modifikationen, die sich von denen, die in vivo festgestellt werden, unterscheiden könnten, induziert werden. Kombinatorische Bibliotheken von variable-Region-codierenden Sequenzen könnten auch zur Entstehung von Immunogenität führen, da sie aus Zufallspaaren von variable-Region-codierenden Sequenzen, erzeugt in vitro, bestehen. Die Regeln, die die Bildung von Sequenzpaaren, codierend für die Antikörper-Schwer- und -Leichtkette, (oder T-Zell-Rezeptoren) in vivo lenken, sind nicht vollständig verstanden. Daraus folgt, dass einige der in vitro gebildeten Paare durch das Immunsystem als fremd erkannt werden könnten, selbst wenn beide Sequenzen, die das Paar darstellen, perfekt human sind. Bindungsproteine, die aus kognaten Bibliotheken erhalten werden, erzeugen andererseits diese abnormen Kombinationen nicht und weisen folglich eine geringere potentielle Immunogenität auf als Bindungsproteine aus kombinatorischen Bibliotheken. Dies bedeutet nicht, dass Produkte aus kombinatorischen Bibliotheken für eine Behandlung ungeeignet sind, sie erfordern lediglich eine stärkere Überwachung hinsichtlich der oben erwähnten Nebenwirkungen.
Für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung sollten die Zellspender bzw. -Donoren vorzugsweise von der gleichen Spezies sein wie die Spezies, die mit den Produkten, die ausgehend von den verknüpften Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung erhältlich sind, zu behandeln ist. Vorzugsweise ist ein Zellspender ein domestiziertes Tier, ein Haustier, ein Mensch oder ein transgenes Tier. Transgene Tiere, die humane Immunglobulin-Loci tragen, sind im US-Patent Nr. 6 111 166 und in Kuroiwa, Y et al., Nature Biotechnology, 2002, 20: 889–893, beschrieben. Derartige transgene Tiere sind zur Produktion von Human-Immunglobulinen befähigt. Somit können vollständig humane Antikörper gegen ein spezifisches Ziel mittels üblicher Immunisierungstechniken von derartigen transgenen Tieren erzeugt werden. Dies ermöglicht die Erzeugung von Bibliotheken, die für Bindungsproteine mit Spezifitäten gegenüber schwierigeren Zielen, wie humane Antigene, gegen die keine oder nur eine begrenzte natürliche humane Antikörperreaktion existiert, codieren. Derartige transgene Tiere können gleichermaßen so entwickelt sein, dass sie humane T-Zell-Rezeptoren produzieren.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die Lymphozyten-enthaltende Zellfraktion aus Vollblut, Knochenmark, mononukleären Zellen und weißen Blutzellen, die von einem Donor bzw. Spender erhalten werden. Mononukleäre Zellen können aus Blut, Knochenmark, Lymphknoten, aus der Milz, aus Infiltrationen um Krebszellen und aus inflammatorischen Infiltrationen isoliert werden. Mononukleäre Zellen können mittels Dichte-Zentrifugationstechniken, z. B. (an) Ficoll-Gradienten, isoliert werden. Falls die mono nukleären Zellen aus Proben, die aus Gewebe bestehen, isoliert werden, wird das Gewebe desintegriert, bevor die Gradientenzentrifugation durchgeführt wird. Die Desintegration kann z. B. mittels mechanischer Verfahren, wie z. B. Mahlen, Elektroporation und/oder mittels chemischer Verfahren, wie z. B. Enzymbehandlungen, durchgeführt werden. Die Isolation von weißen Blutzellen kann direkt aus Spendern unter Verwendung von Leukopherese durchgeführt werden. Rohe Präparationen von z. B. Knochenmark oder Gewebe, die Lymphozyten enthalten, können auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Derartige Präparationen müssen desintegriert werden, z. B. wie es oben beschrieben ist, um die Verteilung von Einzelzellen zu erleichtern.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Anreicherung der Lymphozyten-enthaltenden Zellfraktion, z. B. Vollblut, mononukleäre Zellen, weiße Blutzellen oder Knochenmark, hinsichtlich einer bestimmten Lymphozytenpopulation, wie z. B. Zellen aus der B-Lymphozyten- oder T-Lymphozyten-Linie. Eine Anreicherung von B-Lymphozyten kann z. B. unter Verwendung einer Zellsortierung mit magnetischen Kügelchen ("magnetic bead cell sorting") oder einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS), wobei Linienspezifische Zelloberflächen-Markerproteine, wie CD 19 oder andere B-Zell-Linien-spezifische Marker, genutzt werden, durchgeführt werden. Eine Anreicherung von T-Lymphozyten kann z. B. durchgeführt werden, indem ein Zelloberflächenmarker, wie z. B. CD3, oder andere T-Zell-Linien-spezifische Marker eingesetzt werden.
Ein bevorzugtes Merkmal der vorliegenden Erfindung ist es, die angereicherten B-Lymphozyten weiter zu sortieren, um Plasmazellen zu erlangen, bevor die Zellen individuell auf eine Mehrzahl von Gefäßen verteilt werden. Eine Isolation von Plasmazellen wird allgemein mittels FACS-Sortierung durchgeführt, wobei Zelloberflächenmarker, wie CD38, möglicherweise in Kombination mit CD45, eingesetzt werden. Andere Plasmazell-spezifische Oberflächenmarker oder Kombinationen davon können ebenso eingesetzt werden, z. B. CD138, CD20, CD21, CD40, CD9, HLA-DR oder CD62L, wobei die exakte Wahl des Markers von der Plasmazellquelle, z. B. Mandeln, Blut oder Knochenmark, abhängt. Plasmazellen können auch aus einer nichtangereicherten Lympozyten-enthaltenden Zellpopulation, die aus einer beliebigen dieser Quellen erhalten wird, erhalten werden. Die aus Blut isolierten Plasmazellen werden manchmal als frühe Plasmazellen oder Plasmablasten bezeichnet. In der vorliegenden Erfindung werden diese Zellen auch als Plasmazellen bezeichnet, obwohl sie, im Gegensatz zu Plasmazellen, die im Knochenmark sitzen, CD19-positiv sind. Plasmazellen sind für die Isolation von kognaten Paaren von Immunglobulin-codierenden Sequenzen erwünscht, da eine höhere Frequenz bzw. ein höherer Anteil dieser Zellen Antigen-spezifische Antikörper produziert, die die erworbene Immunität gegenüber dem gewünschten Antigen widerspiegeln, und die meisten der Zellen eine somatische Hypermutation durchlaufen haben und daher für Antikörper hoher Affinität codieren. Ferner sind die mRNA-Level in Plasmazellen, verglichen mit der verbleibenden B-Lymphozyten-Population, erhöht, so dass die Verfahrensweise der reversen Transkription effizienter ist, wenn einzelne Plasmazellen verwendet werden. Als eine Alternative zur Plasmazellisolation können Gedächtnis-B-Zellen aus einer Lymphoyzten-enthaltenden Zellfraktion isoliert werden, wobei ein Zelloberflächenmarker, wie z. B. CD22, eingesetzt wird.
Ein alternatives Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Auswahl der angereicherten B-Lymphozyten hinsichtlich einer Antigenspezifität, bevor die Zellen auf eine Mehrzahl von Gefäßen verteilt werden. Eine Isolation von Antigen-spezifischen B-Lymphozyten wird durchgeführt, indem die angereicherten B-Lymphozyten mit dem gewünschten Antigen oder den gewünschten Antigenen in Kontakt gebracht werden, was eine Bindung von Antigen auf dem an der Oberfläche exponierten Immunglobulin ermöglicht, gefolgt von einer Isolation von Bindenden ("binders"). Dies kann z. B. durch Beschichtung von Magnetkügelchen mit dem gewünschten Antigen oder den gewünschten Antigenen, gefolgt von einer Zellsortierung mittels Magnetkügelchen, mittels FACS, mittels Beschichtung einer Säule mit den Antigenen, gefolgt von Affinitätschromatographie, mittels Filter-Screening-Assays oder anderer Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erfolgen. Plasmazellen sowie B-Lymphozyten, nicht-angereicherte mononukleäre Zellen, weiße Blutzellen, Vollblut, Knochenmark oder Gewebezubereitungen können einer Isolation hinsichtlich Antigenspezifität unterworfen werden, falls dies gewünscht wird.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist es, angereicherte T-Lymphozyten (z. B. CD3-positive Zellen) unter Verwendung der Oberflächenmarker CD45R0 und/oder CD27 zu sortieren, um eine Fraktion von Gedächtnis-T-Zellen zu erhalten. T-Lymphozyten können auch hinsichtlich einer MHC-Antigenspezifität unter Verwendung von MHC-Peptidkomplexen selektiert werden (z. B. Callan, M.F. et al., 1998, J. Exp. Med. 187, 1395–1402; Novak, E.J. et al., 1999, J. Clin. Invest 104, R63–R67).
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist eine Immortalisierung einer beliebigen der isolierten Zellfraktionen, die im Obenstehenden beschrieben wurden (z. B. B-Lymphozyten, Plasmazellen, Gedächtniszellen oder T-Lymphozyten). Eine Immortalisierung kann z. B. mit dem Epstein-Barr-Virus (Traggiai, E. et al., 2004, Nat Med 10, 871–875) vor der Zellverteilung durchgeführt werden. Alternativ können isolierte Einzelzellen vor einer reversen Transkription immortalisiert und expandiert werden. Traggai et al., Nat Med., Aug. 2004, 10(8): 871–5.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Verteilung einer Population von gewünschten Zellen (z. B. Hybridomzellen, Zelllinien der B-Lymphozyten- oder T-Lymphozyten-Linie, Vollblutzellen, Knochenmarkzellen, mononukleäre Zellen, weiße Blutzellen, B-Lymphozyten, Plasmazellen, Antigen-spezifische B-Lymphozyten, Gedächtnis-B-Zellen, T-Lymphozyten, Antigen-/MHC-spezifische T-Lymphozyten oder Gedächtnis-T-Zellen) individuell auf eine Mehrzahl von Gefäßen, um eine Population von isolierten Einzelzellen zu erhalten. Diese Isolation von Einzelzellen bezieht sich auf die physikalische Abtrennung von Zellen aus einer Population von Zellen auf eine derartige Weise, dass ein einzelnes Gefäß eine einzelne Zelle enthält oder ein Mikroarray, ein Chip oder eine Gelmatrix auf eine Weise beladen wird, die Einzelzellen erzeugt. Die Zellen können direkt in Mehrzahlen von Gefäßen, wie z. B. Anordnungen bzw. Arrays von einzelnen Gefäßen, verteilt werden, und zwar mittels Grenzwertverdünnung ("limiting delution"). Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten einzelnen Gefäße sind vorzugsweise die, die in der PCR anwendbar sind (z. B. PCR-Röhrchen oder 96-Well- oder 384-Well-PCR-Platten oder größere Anordnungen von Gefäßen). Jedoch können auch andere Gefäße verwendet werden. Beim Verteilen von Einzelzellen auf eine große Anzahl einzelner Gefäße (z. B. 384-Well-Platten) wird eine Population von Einzelzellen erhalten. Eine derartige Verteilung kann z. B. durchgeführt werden, indem ein Volumen in ein einzelnes Gefäß dispensiert wird, das im Durchschnitt eine Zellkonzentration von einer Zelle, 0,5 oder 0,3 Zellen umfasst, wodurch Gefäße erhalten werden, die im Durchschnitt eine Zelle oder weniger enthalten. Da die Verteilung von Zellen mittels Grenzwertverdünnung ein statistisches Ereignis ist, wird eine Fraktion der Gefäße leer sein, eine Hauptfraktion wird eine Einzelzelle enthalten und eine kleinere Fraktion wird zwei oder mehr Zellen enthalten. Wenn zwei oder mehr Zellen in einem Gefäß vorliegen, kann eine gewisse Verwürfelung der variable-Region-codierenden Sequenzen zwischen den Zellen, die in dem Gefäß vorliegen, auftreten. Da dies jedoch ein untergeordnetes Ereignis ("minor event") ist, wird es die insgesamte Nützlichkeit der Erfindung nicht beeinträchtigen. Weiterhin werden Kombinationen von variable-Region-codierenden Sequenzen, die die gewünschte Bindungsaffinität und -spezifität nicht besitzen, höchstwahrscheinlich nicht ausgewählt und folglich während eines Screeningverfahrens eliminiert. Daher werden untergeordnete Ereignisse der Verwürfelung die endgültige Bibliothek der vorliegenden Erfindung nicht signifikant beeinträchtigen.
Es bestehen Alternativen zur Zellverteilung mittels Grenzwertverdünnung, wobei z. B. Zellsortiergeräte, wie z. B. FACS-Geräte oder Roboter, verwendet werden, die so programmiert werden können, dass sie Einzelzellen in genauer Weise in einzelne Gefäße dispensieren. Diese Alternativen sind bevorzugt, da sie weniger arbeitsaufwändig sind und da sie beim gleichförmigen Erhalten einer Verteilung von Einzelzellen auf einzelne Gefäße effizienter sind.
Die Anreicherungs-, Sortierungs- und Isolationsverfahrensweisen, die oben beschrieben wurden, werden so durchgeführt, dass die Mehrheit der Zellen intakt bleibt. Ein Bersten von Zellen während der Anreicherung und Sortierung könnte zu einer Verwürfelung der variable-Region-codierenden Sequenzen führen. Jedoch wird nicht erwartet, dass dies ein Problem darstellt, da erwartet wird, dass die Häufigkeit des Berstens gering ist. Waschen und eine mögliche RNAse-Behandlung der Zellen vor der Verteilung auf einzelne Gefäße wird jegliche RNA, die während des Verfahrens ausgetreten ist, entfernen.
Wenn die obigen Beschreibungen, wie Zellen zu verteilen sind, um eine Population von Einzelzellen in einer Population von einzelnen Gefäßen zu erhalten, berücksichtigt werden, wird es ferner nicht als ein absolut notwendiges Merkmal interpretiert, dass jedes Gefäß eine Einzelzelle enthalten muss. Vielmehr weist dies darauf hin, dass eine Mehrzahl der Gefäße Einzelzellen enthält, z. B. dass die Anzahl von Gefäßen mit zwei oder mehr Zellen unter 25% der Gesamtzahl verteilter Zellen liegt oder sogar besser unter 10% liegt.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Durchführung einer reversen Transkription unter Verwendung einer Matrize, die aus Zellen, die individuell auf eine Mehrzahl von Gefäßen verteilt wurden, stammt.
Für den Zweck der reversen Transkription (RT) werden, gemäß der vorliegenden Erfindung, die Nucleinsäuren innerhalb einer Einzelzelle, die so als Matrizenquelle für die RT dient, als von einer Einzelzelle stammend angesehen, obgleich sie nicht notwendigerweise von den zurückbleibenden Inhalten dieser Einzelzelle getrennt wurden.
Wenn die abschließende Verteilung der Einzelzellen auf ihre einzelnen Gefäße durchgeführt worden ist, können die Einzelzellen expandiert werden, um eine Population isogener Zellen vor der reversen Transkription zu erhalten. Dieses Verfahren liefert mehr mRNA, die als Matrize zu verwenden ist, was wichtig sein könnte, falls ein seltenes Ziel amplifiziert und verknüpft werden soll. Jedoch sollten die Zellen hinsichtlich des Zielgens während der Expansion genetisch identisch bleiben. Die isolierten Zellen oder die Population von isogenen Zellen kann entweder intakt bleiben oder lysiert werden, solange die Matrize für die reverse Transkription nicht abgebaut wird. Vorzugsweise werden die Zellen lysiert, um die folgende reverse Transkription und PCR-Amplifikation zu erleichtern.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das offenbarte Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Verfahren oder die Multiplex-RT-PCR, gefolgt von einer Verknüpfung mittels Ligation oder Rekombination, ebenso bei einer Matrize eingesetzt werden, die aus einer genetisch diversen Population von Zellen stammt, die nicht auf einzelne Gefäße aufgeteilt wurden, sondern als ein Pool bzw. eine Gesamtheit von Zellen zusammenbleiben. Dieses Verfahren kann zur Erzeugung von kombinatorischen Bibliotheken verwendet werden. Eine derartige Herangehensweise wird die Verteilung von Einzelzellen nicht erfordern. Jedoch sind die Zellen, die bei dieser Herangehensweise verwendet werden können, die gleichen, wie sie für die Einzelzell-Herangehensweise beschrieben wurden, z. B. eine Population (Pool) von sortierten B-Lymphozyten oder T-Lymphozyten. Bei Durchführung der einstufigen Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR oder der einstufigen Multiplex-RT-PCR, gefolgt von Verknüpfung mittels Ligation oder Rekombination, bei einer derartigen Population von Zellen, ist es bevorzugt, die Zellen vor der Reaktion zu lysieren, und, sofern gewünscht, kann dann RNA oder mRNA aus dem Lysat isoliert werden.
Die Empfindlichkeit der einstufigen Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Verwendung einer sehr geringen Menge an Matrize. Wie in den Beispielen 2 und 3 gezeigt, kann die einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR mit einer Menge von Matrize durchgeführt werden, die dem Lysat einer Einzelzelle entspricht.
Primer-Gemische und -Design
Die Primer-Gemische der vorliegenden Erfindung umfassen wenigstens vier Primer, die zwei und zwei Primersätze bilden, die zum Amplifizieren von wenigstens zwei unterschiedlichen Zielsequenzen von Interesse befähigt sind. Gemische von zwei oder mehr derartigen Primersätzen stellen ein Multiplex-Primer-Gemisch dar. Vorzugsweise umfasst ein Multiplex-Gemisch wenigstens 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 oder 150 Primersätze (Primerpaare). Insbesondere für die Amplifikation von variable-Region-codierenden Sequenzen kann ein individueller Primersatz innerhalb des Multiplex-Primer-Gemisches etliche Primer, mehr als zwei, darstellen. Vorzugsweise umfasst ein individueller Primersatz wenigstens 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280 oder 300 Primer. Vorzugsweise beträgt die Gesamtzahl an Primern in einem Multiplex-Primer-Gemisch wenigstens 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 oder 200, und höchstens 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 oder 400 Primer.
Alle Primer der vorliegenden Erfindung umfassen eine genspezifische Region, und vorzugsweise sind alle Primer zusätzlich mit einem Primer-Ende ("primer tail") am 5'-Ende des Primers ausgestattet, d. h., 5'-nicht-codierende Sequenzen, die mit dem 3'-Ende des genspezifischen Primerteils fusioniert sind. Ein derartiges Primer-Ende ist näherungsweise von 6 bis 50 Nucleotide lang, es kann jedoch auch länger sein, falls gewünscht. Bei einer Amplifikation werden die Primer-Enden den Zielsequenzen hinzugefügt.
Primer-Enden der vorliegenden Erfindung sind z. B. Klonierungs-Enden und Verknüpfungs-Enden, wie z. B. Enden, die für eine Verknüpfung mittels Ligation angepasst sind, Enden, die für eine Verknüpfung mittels Rekombination angepasst sind, oder Überlappungsverlängerungs-Enden.
Klonierungs-Enden können von 6 bis 20 Nucleotide lang oder länger sein und umfassen Restriktionsschnittstellen und/oder Rekombinationsstellen, die zur Insertion des verknüpften Produkts in einem geeigneten Vektor verwendbar sind.
Um eine Verknüpfung mittels Ligation zu ermöglichen, werden die Primersätze des Muliplex-Primer-Gemisches so konzipiert, dass ein Teil (Vorwärts- oder Rückwärts-Primer) des ersten Primersatzes mit einem Verknüpfungs-Ende ausgestattet ist, enthaltend eine Restriktionsschnittstelle, die bei Spaltung mit einer Restriktionsschnittstelle, die im Verknüpfungs-Ende von einem Teil des zweiten Primersatzes kompatibel sein wird. Für eine Verknüpfung von mehr als zwei Zielsequenzen ist der zweite Teil des zweiten Primersatzes mit einer Restriktionsschnittstelle ausgestattet, die bei Spaltung mit einer Restriktionsschnittstelle, die in einem Teil des dritten Primersatzes lokalisiert ist, kompatibel sein wird. Diese zweite Restriktionsschnittstelle, die im zweiten Primersatz lokalisiert ist, sollte mit der des ersten Primersatzes nicht kompatibel sein. Eine beträchtliche Anzahl von Zielsequenzen kann verknüpft wer den, indem Primersätze auf diese Weise konzipiert werden. Restriktionsschnittstellen mit einer geringen Häufigkeit oder ohne Auftreten in den Zielsequenzen sollten gewählt werden. Ferner ist es bevorzugt, dass kompatible Restriktionsschnittstellen nicht identisch sind, so dass die Stelle der Ligation für die speziellen verwendeten Restriktionsenzyme spaltungsresistent wird. Dies wird die Reaktion in Richtung der Verknüpfung von Zielsequenz eins mit Zielsequenz zwei treiben, da die Verknüpfung zwischen identischen Zielsequenzen durch die Restriktionsenzyme spaltbar sein wird. Geeignete Paare für Restriktionsschnittstellen sind z. B. SpeI mit XbaI (alternativ können NheI oder AvrII eins oder beide von diesen ersetzen), NcoI mit BspHI, EcoRI mit MfeI oder PstI mit NsiI. Für die Verknüpfung kann SpeI z. B in der Zielsequenz eins lokalisiert sein, XbaI kann in Zielsequenz zwei lokalisiert sein, NcoI kann am anderen Ende der Zielsequenz zwei lokalisiert sein und BspHI in Zielsequenz drei usw. Um das Verfahren weiter zu vereinfachen, ist es von Vorteil, wenn die Restriktionsenzyme im gleichen Puffer funktionieren.
Um eine Verknüpfung mittels Rekombination zu ermöglichen, können die Primersätze des Multiplex-Primer-Gemisches z. B. so konzipiert sein, wie es im Artikel von Chapal (1997, BioTechniques 23, 518–524) beispielhaft dargelegt ist, der hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Um die Verknüpfung der Nucleotidsequenzen von Interesse in der gleichen Stufe, wie die Multiplex-PCR-Amplifikation, zu ermöglichen, werden an die Überlappungsverlängerungs-PCR angepasste Enden wenigstens an einen Primer des ersten Primersatzes des Multiplex-Primer-Gemisches addiert, wodurch ein Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch erzeugt wird.
Die Überlappungsverlängerungs-Enden sind typischerweise länger, im Bereich einer Länge von 8 bis 75 Nucleotide, und können Restriktionsstellen oder Rekombinationsstellen enthalten, die eine nachfolgende Insertion von regulatorischen Elementen, wie z. B. Promotoren, Ribosomenbindungsstellen, Terminationssequenzen oder Linkersequenzen, wie z. B. einem scFv, ermöglichen. Das Überlappungsverlängerungs-Ende kann auch ein Stoppkodon enthalten, falls dies gewünscht ist. Allgemein gibt es drei Typen von Überlappungsverlängerungs-Enden, wie in 1 erläutert. Beim Typ I überlappen die Überlappungsverlängerungs-Enden von zwei Primersätzen lediglich miteinander. Nicht alle Nucleotide von Überlappungsverlängerungs-Enden sind notwendigerweise zueinander komplementär. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen die komplementären Nucleotide zwischen 60 und 85% des Überlappungsverlängerungs-Endes dar. Bei Typ II-Überlappungsverlängerungs-Enden sind 4 bis 6 der 5'-Nucleotide zu der genspezifischen Region der benachbarten Zielsequenz komplementär. Bei Typ III-Überlappungsverlängerungs-Enden ist die gesamte Überlappung zur benachbarten Zielsequenz komplementär. Die Typ I- und II-Überlappungsverlängerungs-Enden sind bevorzugt, wenn regulatorische Elemente und dergleichen später zwischen die verknüpften Zielsequenzen inseriert werden sollen. Typ II-Überlappungsverlängerungs-Enden sind bevorzugt, falls die Zielsequenzen über einen definierten Linker verknüpft werden sollen, wie bei scFv. Typ III- Überlappungsverlängerungs-Enden sind bevorzugt, falls die Zielsequenzen miteinander unter Erhalt des Leserasters verknüpft werden sollen.
Das Design von Überlappungsverlängerungs-Enden ist abhängig von Sequenzmerkmalen, wie z. B. der Länge, dem relativen GC-Gehalt (GC%), dem Vorhandensein von Restriktionsschnittstellen, Palindromen, der Schmelztemperatur, dem genspezifischen Teil, an den sie gekoppelt sind, usw. Die Länge der Überlappungsverlängerungs-Enden sollte zwischen 8 und 75 Nucleotide betragen, vorzugsweise sind sie von 15 bis 40 Nucleotide lang. Noch bevorzugter sind sie von 22 bis 28 Nucleotide lang. Die Verwendung von sehr langen Überlappungsverlängerungs-Enden (50 bis 75 Nucleotide) könnte die Verknüpfung der Produkte, die von jedem Primersatz erzeugt werden, begünstigen. Jedoch wird das Verhältnis zwischen der Länge des Überlappungsverlängerungs-Endes und (der Länge) der genspezifischen Region voraussichtlich angepasst werden müssen, wenn sehr lange Überlappungsverlängerungs-Enden verwendet werden. Die GC%-Präferenz ist abhängig von der Länge des Überlappungsverlängerungs-Endes. Da kürzere Enden einen kürzeren Bereich aufweisen, in dem sie komplementär sind, benötigen sie einen höheren GC% zur Verstärkung der Wechselwirkung als längere Enden. Andere Prinzipien des Primer-Designs sollten gleichermaßen beachtet werden, z. B. sollten die Primerdimerisierung und Haarnadelschleifenbildung minimiert werden. Sie sollten auch nicht an einem falschen Priming beteiligt sein. Ferner ist bekannt, dass Taq-DNA-Polymerase häufig ein Adenosin (A) am 3'-Ende des neu synthetisierten DNA-Stranges hinzufügt bzw. addiert, und dies kann beim Überlappungsverlängerungs-Ende-Design berücksichtigt werden, indem es Überlappungsverlängerungs-Enden ermöglicht wird, eine in 3' erfolgende Nicht-Matrizen-A-Addition aufzunehmen.
Die Wahl von Primern, die das Verknüpfungs-Ende, z. B. das Überlappungsverlängerungs-Ende, das Ende, das an eine Verknüpfung mittels Ligation angepasst ist, oder das Ende, das an eine Verknüpfung durch Rekombination angepasst ist, tragen, definiert die Reihenfolge und die Richtung der Verknüpfung der Zielsequenzen. Es ist für die Erfindung nicht wesentlich, ob es der/die Vorwärts-Primer oder der/die Rückwärts-Primer eines Primersatzes oder möglicherweise sowohl Vorwärts- als auch Rückwärts-Primer ist/sind, der/die mit den Verknüpfungs-Ende ausgestattet sind. Jedoch sollte dieser Sachverhalt eine Berücksichtigung finden, da die Reihenfolge und Richtung der Zielsequenzen im Endprodukt relevant sein könnte, z. B. für die Insertion von regulatorischen Elementen, wie Promotoren und Terminationssequenzen, oder für die im Leseraster erzeugte Verknüpfung der individuellen Zielsequenzen.
Für die Verknüpfung von zwei Nucleotidsequenzen von Interesse kann das Verknüpfungs-Ende entweder dem/den Rückwärts-Primer(n) oder dem/den Vorwärts-Primer(n) jedes Primersatzes, verwendet für die PCR-Amplifikation jeder Zielsequenz, hinzugefügt werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt beispielhaft die Addition bzw. Hinzufügung von Überlappungsverlängerungs-Enden und Enden, die an eine Verknüpfung mittels Ligation angepasst sind, an die V_H- und V_L-Vorwärts-Primer jedes Satzes (siehe 2 bzw. Beispiel 9). Dies resultiert in einer Verknüpfungsrichtung der Produkte, die 5' nach 5' ist (Kopf-an-Kopf und bidirektional). Jedoch könnten Verknüpfungs-Enden ebenso dem/den Rückwärts-Primer(n) jedes Satzes hinzugefügt werden (z. B. C_κ und/oder C_λ im ersten Satz und C_H oder J_H im zweiten Satz). Dies resultiert in einer Verknüpfungsrichtung des Produkts, die 3' nach 3' ist (Ende-an-Ende und bidirektional). Eine dritte Option ist die Hinzufügung der Veknüpfungs-Enden zu dem/den Rückwärts-Primer(n) des ersten Primersatzes (z. B. C_κ- und/oder C_λ-Primer) und dem/den Vorwärts-Primer(n) des zweiten Primersatzes (z. B. V_H-Primer) oder umgekehrt. Dies resultiert in einer 3'-nach-5'-Orientierung (Kopf-an-Ende und unidirektional). 3 erläutert die möglichen Richtungen, die in Abhängigkeit davon, welcher Primer jedes Primersatzes mit dem Verknüpfungs-Ende ausgestattet ist, erzeugt werden können.
Wenn mehr als zwei Nucleotidsequenzen von Interesse verknüpft werden, benötigen einige der Primersätze Verknüpfungs-Enden sowohl an den Vorwärts- als auch Rückwärts-Primern, so dass ein Ende komplementär zum Ende des vorhergehenden Primersatzes ist und das andere Ende komplementär zu einem der Primer des nachfolgenden Primersatzes ist. Dieses Prinzip gilt für alle Primersätze, die Zielsequenzen, die zwischen zwei anderen Zielsequenzen verknüpft werden sollen, amplifizieren.
Das Design des genspezifischen Primerteils sollte allgemein unter Beachtung bekannter Primer-Design-Regeln erfolgen, wie z. B. der Minimierung der Primerdimerisierung, der Haarnadelschleifenbildung und der nicht-spezifischen Anlagerung. Ferner sollten mehrfache G- oder C-Nucleotide als die 3'-Basen vermieden werden, wenn dies möglich ist. Die Schmelztemperatur (Tm) der genspezifischen Regionen in einem Primersatz sollte vorzugsweise miteinander gleich sein, plus/minus 5°C. In der vorliegenden Erfindung sind Tm-Werte zwischen 45°C und 75°C wünschenswert, und Tm-Werte von etwa 60°C sind für die meisten Anwendungen optimal. Vorteilhafterweise kann das anfängliche Primer-Design durch Computerprogramme unterstützt werden, die für diese Aufgabe entwickelt wurden. Jedoch benötigen Primer-Designs im Allgemeinen Labortests und Routineoptimierung. Dies kann z. B. erfolgen, indem die unter Verwendung der Primersätze erhaltenen Amplifikationsprodukte hinsichtlich der Größe des Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) analysiert werden, und indem die Amplifikationsprodukte sequenziert werden. Die Verwendung von degenerierten Positionen innerhalb der Primer ist eine nützliche Herangehensweise, wenn Sequenzen mit variablen Regionen amplifiziert werden oder wenn nach neuen Familienmitgliedern, die zu einer spezifizierten Klasse von Proteinen gehören, gesucht wird. Die Anzahl degenerierter Positionen kann ebenfalls eine Optimierung erfordern.
Die vorliegende Erfindung umfasst verbesserte Primersätze, die zusammen in einem hochgradig multiplexierten Format verwendet werden können. Der von de Haard (de Haard, H.J. et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 18218–18230) beschriebene Primersatz wurde als Ausgangspunkt verwendet und wurde mittels Anpassung bzw. Zuschneiden ("trimming") der 3'-Enden der Primer, um unspezifische Wechselwirkungen zu verringern und wurde durch Hin zufügung von Überlappungsverlängerungs-Enden oder Enden, die für eine Verknüpfung mittels Ligation angepasst sind, modifiziert.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung sind Primer-Gemische, bestehend aus wenigstens zwei Primersätzen, die befähigt sind zum Priming der Amplifikation und zur Förderung der Verknüpfung von wenigstens zwei Nucleotidsequenzen von Interesse. Die Primer-Gemische der vorliegenden Erfindung sind befähigt zum Priming der Amplifikation von wenigstens zwei Untereinheiten oder Domänen aus heteromeren Proteinen, z. B. gehörend zur Klasse der Enzyme, Inhibitoren, Strukturproteine, Toxine, Kanalproteine, G-Proteine, Rezeptorproteine, Proteinen der Immunglobulin-Superfamilie, Transportproteine usw.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist ein Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch, umfassend Primersätze, worin wenigstens ein Primersatz Mitglied jedes Primersatzes ein Überlappungsverlängerungs-Ende umfasst, das zur Hybridisierung mit dem Überlappungsverlängerungs-Ende eines Primersatzmitgliedes eines zweiten Primersatzes befähigt ist.
Die Überlappungsverlängerungs-Enden ermöglichen die sofortige Verknüpfung der Nucleotide von Interesse während der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR-Amplifikation, indem jedes einzelne Produkt, das ausgehend von den Primersätzen entsteht, mit einem Ende ausgestattet wird, das zu einem angrenzenden Produkt komplementär ist. Dies bedeutet jedoch nicht, dass die Verknüpfung notwendigerweise während der ersten PCR-Amplifikation erfolgt. In Abhängigkeit vom Reaktionsaufbau kann der Großteil der tatsächlichen Verknüpfung während einer zusätzlichen Amplifikation mit den äußeren Primer der ersten PCR-Amplifikation (Multiplex-PCR-Amplifikation) durchgeführt werden.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist ein Primersatz, konzipiert zum Amplifizieren einer Familie von Nucleotidsequenzen, die variable-Regioncodierende Sequenzen enthalten. Beispiele für derartige Familien sind kappa-Leichtketten (z. B. VKI–VI bei Menschen), lambda-Leichtketten (z. b. VL1–10 bei Menschen) und variable Schwerketten (z. B. VH1–7 bei Menschen und VH1–15 bei Mäusen) aus Immunglobulinen und variable α-, β-, γ- oder δ-TcR-Regionen. Ein Primersatz für die Amplifikation einer Familie von Nucleotidsequenzen, die variable-Region-codierende Sequenzen enthalten, umfasst häufig eine Mehrzahl von Primer, wobei mehrere Primer degenerierte Primer sein können. Die Amplifikation von Familien von Immunglobulin-variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen bzw. Sequenzen, die für die variable Region der Immungloblin-Leichtkette codieren, wird z. B. durchgeführt unter Verwendung eines Primersatzes, der aus einer Mehrzahl von Primer besteht, die komplementär zum 5'-Ende der variablen Region der kappa-Kette (V_Lκ-Primer) oder der kappa-Leadersequenz (V_LκL-Primer) und/oder der lambda-Kette (V_Lλ-Primer) oder der lambda-Leadersequenz (V_LλL-Primer) (Vorwärts-Primer) sind, zusammen mit konstante-Region-kappa-Primern (C_κ-Primer) und/oder -lambda-Primer (C_λ-Primer) (Rückwärtsprimer) oder einer Mehrzahl von derartigen Primer. Alternativ können Leichtkette-Verbindungsregion-Primer (J_Lκ- und/oder J_Lλ-Primer) als Rückwärts-Primer anstelle der konstante-Region-Primer verwendet werden. Alternativ lagern sich Vorwärts-Primer in der UTR-Region, die der Leadersequenz der variablen Leichtkette vorausgeht, an. Gleichermaßen können Familien von Immunoglobulinvariable-Schwerkettenregion-codierenden Sequenzen mit einem Primersatz unter Einsatz zahlreicher Primerkombinationen amplifiziert werden. Z. B. einer Mehrzahl von Primern, komplementär zum 5'-Ende der variablen Region der Schwerkette (V_H-Primer) oder der Leadersequenz dieser Region (V_HL-Primer) (Vorwärts-Primer), zusammen mit einer Mehrzahl von Schwerketten-Verbinungsregion-Primern (J_H-Primer) oder (einem) Primer(n) für die konstante Region der Schwerkette (Rückwärts-Primer). Der C_H-Primer kann Isotyp-spezifisch sein, und im Prinzip kann jeder beliebige CH-Primer eingesetzt werden (z. B. C_H1, C_H2, C_H3 oder C_H4), auch einer der in einer Volllängen-Schwerkette resultieren würde. Alternativ lagern sich Vorwärts-Primer in der UTR-Region, die der Leadersequenz der variablen Schwerkette vorausgeht, an.
Die Verwendung von Vorwärts-Primern, die sich in der Leadersequenz anstelle des 5'-Endes der variablen Region anlagern, ist besonders nützlich, falls eine Kreuzhybridisierung bei den variable-Region-Primern beobachtet wird. Da Mutationen aufgrund einer Kreuzhybridisierung aus dem endgültigen Protein eliminiert werden, weil Leadersequenzen während der Proteinprozessierung in der Zelle abgespalten werden. Beispiel 9 beschreibt das Design von Primern für die variable Schwerkette und den kappa-Leichtketten-Leader von Antikörpern. Der Aspekt, dass die Priming-Stelle im 3'-Ende der Leader-codierenden Sequenz (C-Terminus) lokalisiert ist, ist ein Vorteil gegenüber früheren Antikörper-Leader-Primern, da dies ein Transport ("shuttling") der amplifizierten Sequenzen zwischen bakteriellen und eukaryotischen Expressionsvektoren auf eine Weise, die funktionelle Leadersequenzen in beiden Systemen erlaubt, ermöglicht. Das in Beispiel 9 beschriebene Designsystem kann leicht auf Antikörper-lambda-Leichtketten sowie TcR-alpha-, -beta-, -gamma- oder -delta-Ketten angewendet werden.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung sind Primer, die sich im 3'-Ende der Leader-codierenden Sequenz, die einer variable-Region-codierenden Sequenz vorausgeht, anlagern, und deren Verwendung zur Amplifikation von variable-Region-codierenden Sequenzen.
Ein bevorzugtes Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung von Primern mit wenigstens 90% Sequenzidentität (vorzugsweise wenigstens 95% Identität) mit bzw. zur genspezifischen Region von SEQ ID NO: 86–92, die Primern entsprechen, die sich im C-Terminus von Schwerketten-Leader-codierenden Sequenzen anlagern (V_HL-Primer). Die genspezifische Sequenz dieser SEQ ID NOs entspricht der Rasennummer bzw. -zahl 18 zum 3'-Ende der Sequenzen (siehe auch Tabelle 11).
Ein weiteres bevorzugtes Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung von Primern mit wenigstens 90% Sequenzidentität (vorzugsweise wenigstens 95% Identität) mit der genspezifischen Region von SEQ ID NO: 93 bis 98, die Primern entsprechen, die sich im C-Terminus von kappa-Leichtketten-Leader-codierenden Sequenzen anlagern (V_LκL-Primer). Die genspezifische Sequenz dieser SEQ ID NOs entspricht der Basenzahl 25 zum 3'-Ende der Sequenzen (siehe auch Tabelle 11).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch, das für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR und möglicherweise für die Stufe der reversen Transkription eingesetzt wird, auch a) wenigstens einen C_L- oder J_L-Primer, komplementär zum Sinnstrang einer Immunglobulin-Leichtkettenregion-codierenden Sequenz; b) wenigstens einen V_L-5'-Primer oder V_L-Leader-Primer, komplementär zum Gegensinn-Strang einer Immunglobulin-variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenz, und befähigt zur Bildung eines Primersatzes mit dem/den Primer(n) in a); c) wenigstens einen C_H- oder J_H-Primer, komplementär zum Sinnstrang einer Immunglobulin-konstante-Schwerkettendomäne-codierenden Sequenz oder der Schwerkettenverbindungsregion, und d) wenigstens einen V_H-5'-Primer oder V_H-Leader-Primer, komplementär zum Gegensinn-Strang einer Immunglobulin-variable-Schwerkettenregion-codierenden Sequenz und befähigt zur Bildung eines Primersatzes mit dem/den Primer(n) in c).
Primersätze der vorliegenden Erfindung können z. B. sein: V_Lκ + C_κ, V_Lλ + C_λ, V_Lκ + J_Lκ, V_Lλ + J_Lλ, V_LκL + C_κ, V_LλL + C_κ, V_κL + J_Lκ, V_LλL + J_Lλ, V_H + J_H, V_H + C_H, V_HL + J_H oder V_HL + C_H oder Kombinationen von diesen, befähigt zum Amplifizieren einer variable-Region-codierenden Zielsequenz.
In einer weiteren Ausführungsform sind der/die C_L(J_L)-Primer und der/die V_L(V_LL)-Primer zum Amplifizieren von Sequenzen angepasst, die variable Regionen der kappa-Leichtkette oder variable Regionen der lambda-Leichtkette umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind der/die C_L(J_L)-Primer und der/die V_L(V_LL)-Primer zum Amplifizieren von codierenden Sequenzen für die variable Region der kappa-Leichtkette als auch der lambda-Leichtkette angepasst.
In einer noch bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Vorwärts-Primer für die Leichtkettenamplifikation V_LL-Primer mit wenigstens 90% Sequenzidentität (vorzugsweise wenigstens 95% Identität) mit der genspezifischen Region von SEQ ID 93 bis 98 und sind die Vorwärts-Primer für die Schwerkettenamplifikation V_HL-Primer mit wenigstens 90% Identität (vorzugsweise wenigstens 95%) mit der genspezifischen Region von SEQ ID 86 bis 92.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung tragen die Immunglobulin-V_L/V_LL- und V_H/V_HL-Primer Verknüpfungs-Enden, vorzugsweise in der Form von komplementären Überlappungsverlängerungs-Enden. Dies erzeugt variable-Region-codierende Sequenzen, die in einer Kopf-an-Kopf-Weise verknüpft sind. Zur Verknüpfung von variable-Region-codierenden Sequenzen in einer Kopf-an-Ende-Weise enthalten entweder die C_L/J_L- und die V_H/V_HL-Primer Verknüpfungs-Enden oder die V_L/V_LL- und die C_H/J_H-Primer ent halten Verknüpfungs-Enden, vorzugsweise in der Form von komplementären Überlappungsverlängerungs-Enden. Für die Verknüpfung von variable-Region-codierenden Sequenzen in einer Ende-an-Ende-Weise enthalten die C_L/J_L- und die C_H/J_H-Primer Verknüpfungsenden, vorzugsweise in der Form von komplementären Überlappungsverlängerungs-Enden (3).
Vorzugsweise umfassen die Multiplex-Primer-Gemische, einschließlich Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemische, der vorliegenden Erfindung zwei Primersätze. Somit umfasst ein Multiplex-Primer-Gemisch wenigstens vier unterschiedliche Primer. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Multiplex-Primer-Gemisch mehr als vier unterschiedliche Primer. Ein Multiplex-Primer-Gemisch der vorliegenden Erfindung wird zur Amplifikation von Zielsequenzen in einem einzelnen Gefäß verwendet. Z. B. werden variable Regionen der kappa-, lambda- und Schwerkette alle im gleichen Gefäß amplifiziert. Ein Multiplex-Primer-Gemisch der vorliegenden Erfindung bestand aus 16 verschiedenen degenerierten Primer, die wie folgt verteilt waren: acht V_H-Primer, ein C_H1-Primer, sechs V_Lκ-Primer und ein C_κ-Primer (2). Ein weiterer Satz bestand aus 19 degenerierten Primern, die wie folgt verteilt waren: acht V_H-Primer, vier J_H-Primer, sechs V_Lκ-Primer und ein C_κ-Primer. Ein dritter Satz bestand aus 22 degenerierten Primer, die wie folgt verteilt waren: acht V_H-Primer, ein C_H1-Primer, elf V_Lλ-Primer und zwei C_λ-Primer. Ein vierter Satz bestand aus 27 degenierten Primer, die wie folgt verteilt waren: acht V_H-Primer, ein C_H1-Primer, sechs V_Lκ-Primer, ein C_κ-Primer, elf V_Lλ-Primer und zwei C_λ-Primer.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Primer für eine zusätzliche PCR-Amplifikation der verknüpften Produkte, erhalten mittels Multiplex-RT-PCR, gefolgt von Verknüpfung mittels Ligation oder Rekombination oder mittels Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR. Diese zusätzliche PCR-Amplifikation kann unter Verwendung eines Primer-Gemisches durchgeführt werden, das für das Amplifizieren der verknüpften Zielsequenzen angepasst ist. Ein derartiges Primer-Gemisch kann die äußeren Primer des Multiplex-Primer-Gemisches oder Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisches umfassen, was die Primer bedeutet, die sich am äußersten 5'-Ende und 3'-Ende des Sinnstranges der verknüpften Nucleotidsequenzen anlagern, wodurch die Amplifikation des gesamten verknüpften Produkts ermöglicht wird. Ein Beispiel für Primer, die als Äußere(r) in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind die C_κ/J_κ und/oder C_λ/J_λ-Primer, die einen Primersatz mit den J_H- oder C_H-Primern bilden. Dieses Verfahren dient im Allgemeinen zur Erhöhung der Menge an verknüpftem Produkt, erhalten aus der Multiplex-RT-PCR, gefolgt von Verknüpfung mittels Ligation oder Rekombination, oder aus der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR.
Alternativ kann ein Primersatz, der im Vergleich zu den äußeren Primer, die in der primären Multiplex-RT-PCR- oder Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktion verwendet wurden, geschachtelt bzw. "Nested" ist, für die zusätzliche Amplifikation der verknüpften Nucleotidsequenzen verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wird ein derartiger Primersatz als geschachtelter bzw. Nested-Primersatz bezeichnet. Das Design von geschachtelten Primer berücksichtigt allgemein die gleichen Design-Regeln wie sie zuvor für die genspezifischen Primer beschrieben wurden, abgesehen davon, dass sie ein Priming 3 zur Anlagerungsposition der äußeren Primer, die in der Multiplex-RT-PCR oder der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR verwendet wurden, bewirken. Das Produkt, das aus einer geschachtelten bzw. Nested-PCR resultiert, ist daher kürzer als das verknüpfte Produkt, das mittels der Multiplex-RT-PCR, gefolgt von Verknüpfung mittels Ligation oder Rekombination, oder mittels der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR erhalten wurde. Zusätzlich zur Erhöhung der Menge an verknüpften Produkten dient die geschachtelte PCR weiterhin der Erhöhung der insgesamten Spezifität, insbesondere der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Technologie. Jedoch sollte angemerkt werden, dass nicht alle Multiplex-Primer-Gemische/Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemische, die zuvor beschrieben worden sind, zur Kombination mit einem geschachtelten Primersatz geeignet sind, wenn die zusätzliche Amplifikation durchgeführt wird. In derartigen Fällen können die äußeren Primer des Multiplex-Primer-Gemisches/Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisches für die zusätzliche Amplifikation verwendet werden oder eine PCR vom Semi-Nested-Typ kann wie später beschrieben, angewendet werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Gemisch von J_L- und J_H-Primern als geschachtelte Primer für die zusätzliche Amplifikation der verknüpften Immunglobulin-variable-Region-codierenden Sequenzen verwendet.
Geschachtelte Primersätze der vorliegenden Erfindung können auch aus (einem) äußeren Rückwärts-(oder Vorwärts-)Primer(n) aus dem ersten Multiplex-Primer-Gemisch/Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch und einem zweiten geschachtelten Primer, der ein Priming 3' zur Anlagerungsposition des/der äußeren Vorwärts-(oder Rückwärts-)Primer des ersten Multiplex-Primer-Gemisches/Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisches bewirkt, bestehen. Die Verwendung eines derartigen Primersatzes für eine zusätzliche PCR-Amplifikation ist allgemein als eine Semi-Nested-PCR bekannt. Eine Semi-Nested-PCR kann z. B. angewendet werden, falls es schwierig ist, einen geschachtelten Primer in einer spezifischen Region zu konzipieren, z. B. für die Sequenzen der variablen Region (V- und J-Primer), da sich ein derartiger Primer in den Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) anlagern müsste. Ferner kann eine Semi-Nested-PCR verwendet werden, wenn es wünschenswert ist, ein Ende der verknüpften Sequenzen z. B. zu Klonierungszwecken intakt zu lassen.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung belässt die konstante-Leichtkette-codierende Sequenz während der zusätzlichen Amplifikationsreaktion konstant. Der/die C_L-(Rückwärts-)Primer, verwendet für die zusätzliche Amplifikation, ist nur leicht modifiziert, verglichen mit dem/den äußeren Primer(n), der/die für die primäre Reaktion (die Multiplex-RT-PCR oder Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktion) verwendet wurde(n). Die Modifikation umfasst die Hinzufügung von einigen wenigen Basen zum 3'-Ende des/der C_L- Primer, der/die für die primäre Amplifikation verwendet wurde(n). Ferner könnte dem/den geschachtelten C_L-Primer(n) ein anderes Klonierungs-Ende hinzugefügt werden. Der/die Vorwärts-Primer, der/die bei der zusätzlichen Amplifikation verwendet wird/werden, ist vollständig geschachtelt, verglichen mit dem/den äußeren Primer(n), spezifisch für die konstante Schwerkette, der/die in der primären Reaktion verwendet wurde(n). Die kombinierte Verwendung des/der äußeren Primer(s) in der primären Reaktion und des/der geringfügig modifizierten geschachtelten C_L-Primer zusammen mit dem/den vollständig geschachtelten Vorwärts-Primer(n) in der zusätzlichen Amplifikation resultiert in einer Erhöhung der Spezifität, die mit der vergleichbar ist, die mit einer geschachtelten PCR unter Verwendung eines vollständig geschachtelten Primersatzes erzielt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die geschachtelte PCR mit (einem) J_H-Primer(n) und (einem) modifizierten C_L-Primer(n) durchgeführt, wobei am 3'-Ende zwischen 2 und 10 genspezifische Basenpaare hinzugefügt worden sind, verglichen mit dem/den ersten C_L-Primer(n) des Multiplex-Primer-Gemisches/Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisches.
Optimierung der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR
Die Parameter der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR-Stufe, sowohl der zweistufigen als auch der einstufigen Verfahrensweise, können anhand mehrerer Parameter optimiert werden (siehe z. B. Henegariu, O. et al., 1997. BioTechniques 23, 504–511; Markoulatos, P. et al., 2002. J. Clin. Lab. Anal. 16, 47–51). Im Allgemeinen sind die gleichen Optimierungsparameter bei der Multiplex-RT-PCR anwendbar, obgleich das Verhältnis zwischen äußeren und inneren Primer bei einer derartigen Reaktion weniger wichtig ist.
a. Primerkonzentration
Die Konzentration der Primer, die das Überlappungsverlängerungs-Ende tragen (z. B. die V_H- und V_L-Primer), ist vorzugsweise niedriger als die Konzentration der äußeren Primer ohne Überlappungsverlängerungs-Ende (z. B. J_H- und kappa-Primer).
Falls eine der Zielsequenzen mit einer geringeren Effizienz als die anderen amplifiziert, z. B. als Ergebnis eines höheren GC%, kann es möglich sein, die Amplifikationseffizienz auszugleichen. Dies kann erfolgen, indem eine höhere Konzentration des Primersatzes, der eine Amplifikation mit geringer Effizienz vermittelt, verwendet wird, oder in dem die Konzentration des anderen Primersatzes verringert wird. Z. B. neigen Sequenzen, die für variable Regionen der Schwerkette codieren, dazu, einen höheren GC% und folglich geringere Amplifikationseffizienz als variable Regionen der Leichtkette aufzuweisen. Dies weist auf eine Verwendung von V_L-Primern bei einer geringeren Konzentration als die (der) V_H-Primer hin.
Wenn eine große Zahl von Primer verwendet wird, könnte die Gesamt-Primerkonzentration ein Thema sein. Die Obergrenze wird experimentell mittels Titrationsexperimenten bestimmt. Für das "AmpliTaq Gold"-PCR-System von Applied Biosystems wurde die Obergrenze zu 1,1 μM Gesamt-Oligonucleotidkonzentration festgestellt, für andere Systeme kann sie jedoch bis zu 2,4 μM betragen. Eine derartige Obergrenze der Gesamtdigonucleotidkonzentration beeinflusst die Maximalkonzentration an einzelnen Primern. Falls die einzelne Primerkonzentration zu gering ist, verursacht sie wahrscheinlich eine schlechte PCR-Empfindlichkeit.
Es ist auch festgestellt worden, dass die Qualität der Oligonucleotid-Primer für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR wichtig ist. HPLC-gereinigte Oligonucleotide haben die besten Ergebnisse ergeben.
b. PCR-Zyklusbedingungen:

Vorzugsweise waren die Zyklusbedingungen wie folgt:

Denaturierung:	10–30 s	94°C
Anlagerung:	30–60 s	50–70°C	Näherungsweise 5°C unter der Tm der Primer
Verlängerung:	1 min × EPL	65–72°C	EPL ist die erwartete Produktlänge in kb.
Zyklenzahl:	30–80
Abschließende Verlängerung:	10 min	65–72°C

Für die einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR wurden die folgenden Stufen in das Zyklusprogramm vor den unten dargelegten Amplifikationszyklen eingebaut:

Reverse Transkription:	30 min	42–60°C	Diese Bedingungen werden auch verwendet, wenn eine separate reverse Transkription durchgeführt wird.
Polymerase-Aktivierung:	10–15 min	95°C	Hot-Start-Polymerasen sind bei der einstufigen RT-PCR günstig. Aktivierung gemäß (den Angaben des) Herstellers.

Es ist möglich, Optimierungen an allen diesen Parametern durchzuführen. Insbesondere ist die Anlagerungstemperatur ("annealing temperature") wichtig. Somit sollten anfänglich alle einzelnen Primersätze, die das endgültige Primer-Gemisch darstellen sollen, separat getestet werden, um die optimale Anlagerungstemperatur und -zeit, sowie die Elongations- und Denaturierungszeiten zu identifizieren. Dies wird eine gute Vorstellung über das Fenster geben, in dem diese Parameter für das Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch optimiert werden können.
Probleme mit einer schlechten PCR-Empfindlichkeit, z. B. aufgrund einer geringen Primerkonzentration oder einer geringen Matrizenkonzentration, können überwunden werden, indem eine hohe Anzahl thermischer Zyklen verwendet wird. Eine hohe Anzahl thermischer Zyklen bedeutet zwischen 35 und 80 Zyklen, vorzugsweise etwa 40 Zyklen.
Ferner können längere Verlängerungszeiten das Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR-Verfahren verbessern. Lange Verlängerungszeiten bedeuten 1,5–4 min × EPL, verglichen mit der normalen 1-minütigen Verlängerung.
c. Verwendung von Hilfsstoffen
Multiplex-PCR-Reaktionen können signifikant verbessert werden, indem ein PCR-Additiv, wie z. B. DMSO, Glycerin, Formamid oder Betain, die die DNA relaxieren, wodurch die Denaturierung der Matrize vereinfacht wird, verwendet wird.
d. dNTP und MgCl₂
Die Desoxynucleosidtriphosphat(dNTP)-Qualität und -Konzentration ist für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR wichtig. Die beste dNTP-Konzentration liegt zwischen 200 und 400 μM von jedem dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP), über der die Amplifikation rasch inhibiert wird. Geringere dNTP-Konzentrationen (100 μM von jedem dNTP) genügen, um eine PCR-Amplifikation zu erzielen. dNTP-Stammlösungen sind gegenüber Gefrier/Tau-Zyklen empfindlich. Nach drei bis fünf derartiger Zyklen funktioniert eine Multiplex-PCR häufig nicht gut. Um derartige Probleme zu vermeiden, können kleine dNTP-Aliquote hergestellt und bei –20°C gefroren gehalten werden.
Die Optimierung der Mg²⁺-Konzentration ist kritisch, da die meisten DNA-Polymerasen Magnesium-abhängige Enzyme sind. Zusätzlich zur DNA-Polymerase binden die Matrizen-DNA, die Primer und die dNTPs Mg²⁺. Daher wird die optimale Mg²⁺-Konzentration von der dNTP-Konzentration, der Matrizen-DNA und der Probenpufferzusammensetzung abhängen. Falls Primer- und/oder Matrizen-DNA-Puffer Chelatbildner, wie EDTA oder EGTA, enthalten, kann das scheinbare bzw. apparente Mg²⁺-Optimum verändert sein. Eine übermäßige Mg²⁺-Konzentration stabilisiert den DNA-Doppelstrang und verhindert die vollständige Denaturierung von DNA, was die Ausbeute verringert. Überschüssiges Mg²⁺ kann auch eine fehlerhafte Anlagerung von Primer an inkorrekte Positionen der Matrize stabilisieren, wodurch die Spezifität gesenkt wird. Andererseits verringert eine unzureichende bzw. unangepasste Mg²⁺-Konzentration die Menge an Produkt.
Ein gutes Gleichgewicht zwischen dNTP und MgCl₂ beträgt näherungsweise 200 bis 400 μM dNTP (von jedem) zu 1,5 bis 3 mM MgCl₂.
e. PCR-Pufferkonzentration
Im Allgemeinen genügen KCl-basierte Puffer für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR; jedoch können Puffer, die auf anderen Komponenten, wie (NH₄)₂SO₄, MgSO₄, Tris-HCl oder Kombinationen davon basieren, auch so optimiert werden, dass sie mit der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR funktionieren. Primerpaare, die in die Amplifikation von längeren Produkten involviert sind, funktionieren besser bei geringeren Salzkonzentrationen (z. B. 20 bis 50 mM KCl), wohingegen Primerpaare, die in die Amplifikation von kur zen Produkten involviert sind, besser bei höheren Salzkonzentrationen (z. B. 80 bis 100 mM KCl) funktionieren. Eine Steigerung der Pufferkonzentration auf 2 × anstelle von 1 × kann die Effizienz der Multiplexreaktion verbessern.
f. DNA-Polymerase
Die vorliegende Erfindung wird beispielhaft mit Taq-Polymerase dargestellt. Alternativ können andere Typen von Hitze-resistenten DNA-Polymerasen verwendet werden, einschließlich z. B. Pfu, Phusion, Pwo, Tgo, Tth, Vent, Deep-vent. Polymerasen ohne oder mit 3'-nach-5'-Exonuclease-Aktivität können entweder alleine oder in Kombination miteinander verwendet werden.
Vektoren und Bibliotheken
Die Verknüpfung von Nucleotidsequenzen von Interesse gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt einen Nucleotidabschnitt, der die verknüpften Nucleotidsequenzen von Interesse umfasst. Ferner können Bibliotheken von derartigen verknüpften Nucleinsäuresequenzen von Interesse mittels der Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, insbesondere Bibliotheken von variable-Region-codierenden Sequenzen.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Insertion eines Abschnittes, der verknüpfte Nucleotidsequenzen von Interesse enthält, oder einer Bibliothek von verknüpften Nucleotidsequenzen von Interesse, erzeugt mittels eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung, in geeignete Vektoren. Die Bibliotheken können kombinatorische Bibliotheken oder Bibliotheken von kognaten Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen sein. Die Restriktionsschnittstellen, die mittels der äußeren Primer, geschachtelten Primer oder Semi-Nested-Primer erzeugt werden, sind vorzugsweise so konzipiert, dass sie zu geeigneten Restriktionsschnittstellen des gewählten Vektors passen. Die verknüpften Nucleinsäuresequenzen von Interesse können auch mittels Rekombination in Vektoren inseriert werden, falls einer der Semi-Nested-Primer, geschachtelten Primer oder äußeren Primer mit einer geeigneten Rekombinationsstelle ausgestattet wurde und der gewählte Vektor ebenso eine (solche) enthält.
Grundsätzlich gibt es hinsichtlich der Vektoren, die als Träger bzw. Transporter der Produkte, die mittels eines der Multiplex-RT-PCR-Verknüpfungsverfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, verwendet werden können, keine Beschränkungen. Gewählte Vektoren können die sein, die für eine Amplifikation und Expression in Zellen, einschließlich z. B. Bakterien, Hefe, andere Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen oder Säugerzellen, geeignet sind. Derartige Vektoren können verwendet werden, um weitere Klonierungsstufen, den Transport ("shuttling") zwischen Vektorsystemen, die Präsentation des in den Vektor inserierten Produkts, die Expression des inserierten Produkts und/oder die Integration in das Genom einer Wirtszelle zu erleichtern.
Klonierungs- und Shuttlevektoren sind vorzugsweise bakterielle Vektoren. Jedoch können die anderen Typen von Vektoren ebenso in Klonierungs- und Shuttle-Verfahrensweisen angewendet werden.
Displayvektoren können z. B. Phagenvektoren oder Phagemidvektoren sein, die aus der Klasse der filamentösen Bakteriophagen fd, M13 oder fl stammen. Derartige Vektoren sind dazu befähigt, die Präsentation ("display") eines Proteins, einschließlich z. B. eines Bindungsproteins oder Fragments davon, auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen zu erleichtern bzw. zu begünstigen. Displayvektoren, die für eine Präsentation auf Ribosomen, DNA, Hefezellen oder Säugerzellen geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet ebenso bekannt. Diese umfassen z. B. virale Vektoren oder Vektoren, die für chimäre Proteine codieren.
Expressionsvektoren existieren für alle der genannten Arten bzw. Spezies und der zu Wählende hängt vollständig vom zu exprimierenden Protein ab. Einige Expressionsvektoren sind zusätzlich dazu befähigt, in das Genom einer Wirtszelle zu integrieren, und zwar entweder mittels zufälliger Integration oder mittels ortsspezifischer Integration, wobei zweckdienliche Rekombinationsschnittstellen genutzt werden. Expressionsvektoren können so konzipiert sein, dass sie zusätzliche codierende Sequenzen bereitstellen, die, wenn das verknüpfte Produkt im Leseraster zu diesen Sequenzen inseriert wird, die Expression eines größeren Proteins, z. B. eines monoklonalen Volllängen-Antikörpers, bei Einführung in eine geeignete Wirtszelle ermöglichen. Diese Insertion im Leseraster kann auch die Expression von chimären Proteinen, die die Präsentation auf der Oberfläche eines filamentösen Bakteriophagen oder einer Zelle begünstigen, erleichtern. In einem Bakteriophagen-Displaysystem können die verknüpften Nucleotidsequenzen von Interesse im Leseraster zu einer Sequenz, die für ein Hüllprotein, wie pIII oder pVIII, codiert, inseriert werden (Barbas, C.F. et al., 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978–7982; Kang, A.S. et al., 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4363–4366).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bestehen die einzelnen Abschnitte von verknüpften Nucleotidsequenzen von Interesse aus einer Immunglobulinvariable-Schwerkettenregion-codierenden Sequenz, assoziiert mit einer variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenz. Vorzugsweise werden diese verknüpften Sequenzen in einem Vektor inseriert, der Sequenzen enthält, die für eine oder mehrere konstante Immunglobulin-Domänen codieren. Die Insertion wird so organisiert ("engineered"), dass die verknüpften variable-Schwerkettenregion- und/oder variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen im Leseraster zu den konstante-Region-codierenden Sequenzen inseriert werden. Eine derartige Insertion kann z. B. einen Fab-Expressionsvektor, einen Volllängen-Antikörper-Expressionsvektor oder einen Expressionsvektor, der für ein Fragment eines Volllängen-Antikörpers codiert, erzeugen. Vorzugsweise ist ein derartiger Vektor ein Expressionsvektor, der zum Screening geeignet ist (z. B. E. coli-, Phagemid- oder Säugervektoren), und die konstante-Schwerkettenregion-codierenden Sequenzen werden aus den humanen Immunglobulinklassen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD oder IgE ausgewählt, wodurch die Expression eines rekombinanten Fab- oder Volllängen-Antikörpers ermöglicht wird. Zusätzlich zu den konstante-Schwerkette-codierenden Sequenzen kann der Vektor auch eine konstante-Leichtkette-codierende Sequenz, ausgewählt aus den humanen lambda- oder kappa-Ketten, enthalten. Dies ist zweckdienlich, wenn die verknüpften Nucleotidsequenzen nur für die Immunglobulinvariable-Region-codierenden Sequenzen (Fvs) codieren.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bestehen die individuellen Abschnitte der verknüpften Nucleotidsequenzen aus einer variable-TcR-α-Kettenregion-codierenden Sequenz, assoziiert mit einer variable-β-Kettenregion-codierenden Sequenz oder einer variablen-γ-Kettenregion-codierenden Sequenz, assoziiert mit einer variable-δ-Kettenregion-codierenden Sequenz. Vorzugsweise werden diese verknüpften Sequenzen in einen Vektor inseriert, der Sequenzen enthält, die für eine oder mehrere konstante TcR-Domänen codieren. Die Insertion ist so organisiert, dass die inserierten verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen im Leseraster zu den korrespondierenden konstante-TcR-Region-codierenden Sequenzen sind. In einer weiteren Ausführungsform ist ein derartiger Vektor ein chimärer Expressionsvektor, umfassend Sequenzen, die für einen Leucin-Zipper im Leseraster zu den konstanten TcR-Regionen codieren. Es ist gezeigt worden, dass derartige Konstrukte die Stabilität von löslichen TcRs erhöhen (Willcox, B.E. et al., 1999. Protein Sci 8, 2418–2423).
Bibliotheken von kognaten Paaren, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, können mittels zweier unterschiedlicher Herangehensweisen in Vektoren eingeführt werden. Bei der ersten Herangehensweise werden einzelne kognate Paare individuell in einen geeigneten Vektor inseriert. Diese Bibliothek von Vektoren kann anschließend entweder separat gehalten oder vereinigt bzw. gepoolt werden. Bei der zweiten Herangehensweise werden alle kognaten Paare vor der Insertion in den Vektor vereinigt, gefolgt von einer massenhaften Insertion ("in-mass insertion") in geeignete Vektoren, wodurch eine vereinigte bzw. gepoolte Bibliothek von Vektoren erzeugt wird (erläutert in 12). Eine derartige Bibliothek von Vektoren umfasst eine große Diversität von Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine Bibliothek von kognaten Paaren von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen. Vorzugsweise umfassen die individuellen kognaten Paare der Bibliothek eine Immunglobulin-variable-Leichtkettenregion-codierende Sequenz, assoziiert mit einer variable-Schwerkettenregion-codierenden Sequenz.
Eine weitere derartige Bibliothek von kognaten Paaren umfasst verknüpfte TcR-Region-codierende Sequenzen, wobei jede der individuellen TcR-Region-codierenden Sequenzen eine variable-alpha-Kettenregion-codierende Sequenz, assoziiert mit einer variable-beta-Kettenregion-codierenden Sequenz, und/oder eine TcR-variable-gamma-Kettenregion-codierende Sequenz, assoziiert mit einer variable-delta-Kettenregion-codierenden Sequenz umfasst.
Ermöglicht wird auch eine Unterbibliothek von kognaten Paaren von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen, die für gewünschte Bindungsspezifitäten, gerichtet gegen ein spezielles Ziel bzw. Target, codieren. Vorzugsweise umfassen diese kognaten Paare verknüpfte Immunglobulin-variable-Leichtkettenregion- und -variable- Schwerkettenregion-codierende Sequenzen, TcR-variable-alpha-Kettenregion- und -variable-beta-Kettenregion-codierende Sequenzen und/oder TcR-variable-gamma-Kettenregion- und -variable-delta-Kettenregion-codierende Sequenzen.
Diese Unterbibliothek kann eine Unterbibliothek sein, ausgewählt aus einer Elternbibliothek von kognaten Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen, wie über die Erfindung hinweg beschrieben.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch eine Bibliothek oder Unterbibliothek, codierend für kognate Paare von Volllängen-Immunglobulinen, ausgewählt aus den humanen Immunglobulinklassen IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 oder IgM, und ermöglicht auch eine Bibliothek oder Unterbibliothek, codierend für lösliche und stabile kognate Paare von TcRs.
Ein durch die vorliegende Erfindung erhaltenes Merkmal ist die Diversität der Bibliotheken, die aus wenigstens 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 10⁴, 10⁵ oder 10⁶ verschiedenen kognaten Paaren bestehen.
Die Bibliotheken von kognaten Paaren von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen werden mittels eines Verfahrens, das die hierin beschriebenen Stufen umfasst, erhalten. Diese Bibliothek wird auch als die Elternbibliothek bezeichnet.
Screening bzw. Durchmusterung und Auswahl
Es wird erwartet, dass die Elternbibliothek von Paaren von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen, isoliert aus einem Spender unter Einsatz von einem der Verfahren der vorliegenden Erfindung, eine Diversität von Bindungsproteinen, von denen einige irrelevant, d. h., an ein gewünschtes Ziel nicht bindend, sein werden, wiedergibt. Daher umfasst die vorliegende Erfindung die Anreicherung und das Screening bzw. die Durchmusterung für eine Unterbibliothek, die für eine Teilmenge von Diversitäten von Bindungsspezifitäten, gerichtet gegen ein bestimmtes Ziel, codiert.
Für Bibliotheken von kognaten Paaren wird erwartet, dass die Diversität der Bibliothek die Diversität, die im Spender- bzw. Donormaterial vorhanden ist, wiedergibt, und zwar nur mit einer geringen Anzahl zufällig verknüpfter variabler Regionen. Somit kann eine Anreicherungsstufe vor dem Screening auf zielspezifische Bindungsaffinitäten in einer Bibliothek, bestehend aus kognaten Puren, nicht notwendig sein.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren zur Erzeugung einer Bibliothek von Paaren von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen, ferner die Erzeugung einer Unterbibliothek durch Auswahl einer Teilmenge von Paaren von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen, die für Bindungsproteine mit einer gewünschten Zielspezifität codieren. Eine derartige Auswahl von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen wird auch als eine Bibliothek von Ziel-spezifischen kognaten Paaren bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Bibliothek von Ziel-spezifischen kognaten Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen in einen Säuger-Expressionsvektor transferiert.
Immunologische Assays sind allgemein für die Auswahl von Zielspezifischen Immunglobulin-variable-Region-codierenden Sequenzen geeignet. Derartige Assays sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und sind z. B. ELISPOTS, ELISA, Membran-Assays (z. B. Western-Blots), Arrays bzw. Anordnungen auf Filtern oder FACS. Die Assays können jeweils auf eine direkte Weise durchgeführt werden, wobei die Polypeptide, die ausgehend von den Immunglobulin-variable-Region-codierenden Sequenzen produziert wurden, eingesetzt werden. Alternativ können die Immunassays in Kombination mit oder nach Anreicherungsverfahren, wie Phagendisplay, Ribosomendisplay, Bakterienoberflächendisplay, Hefedisplay, Display auf eukaryotischen Viren, RNA-Display oder kovalentem Display (in der Übersicht dargestellt in FitzGerald, K., 2000. Drug Discov. Today 5, 253–258) durchgeführt werden. Wie in 10 erläutert, können sowohl kognate Fab-Expressionsbibliotheken als auch kognate Volllängen-Antikörper-Expressionsbibliotheken einem Screening unterworfen werden, wodurch eine Unterbibliothek von positiven Klonen erzeugt wird. Derartige Screening-Assays und Anreicherungsverfahrensweisen sind auch für Fv- oder scFv-Fragmente oder kombinatorische Bibliotheken von verknüpften variablen Regionen geeignet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Auswahl einer Unterbibliothek von Ziel-spezifischen kognaten Paaren von variable-Regioncodierenden Sequenzen unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Screeningassays durchgeführt. Hochdurchsatz-Screeningassays könnten, jedoch ohne Beschränkung darauf, ELISA-Assays sein, die mit einer teilautomatisierten ("semi-automated") oder vollständig automatisierten Ausrüstung durchgeführt werden. Sie könnten auch ein Membranassay sein, bei dem Bakterien mit Roboterunterstützung abgenommen und auf eine geeignete Membran, aufgelegt auf Agarplatten, rasterförmig aufgetragen werden, wodurch Arrays von Kolonien, die Antigen-bindende Moleküle exprimieren, erzeugt werden. Die Moleküle werden durch die Membran auf eine zweite darunter liegende Antigen-beschichtete Membran sekretiert, die separat entwickelt und verwendet werden kann, um Klone zu identifizieren, die Antigen-bindende Moleküle gegen das gewünschte Ziel sekretieren (de Wildt, R.M. et al., 2000. Nat. Biotechnol. 18, 989–994).
Wenn eine Unterbibliothek von kognaten Paaren oder kombinatorischen Paaren von Antigen-bindenden Klonen mittels einer geeigneten Technologie ausgewählt worden ist, ist es möglich, eine zusätzliche Analyse mittels DNA-Sequenzierung der verknüpften Immunglobulin-Leichtkette-variable-Region- und -Schwerkette-variable-Region-codierenden Sequenzen durchzuführen. Erstens wird eine derartige DNA-Sequenzierung Information über die Diversität der Bibliothek, wie z. B. die Keimbahnabstammung ("germline origin"), die Familien-verteilung und die Reifung innerhalb der CDR-Regionen bereitstellen. Eine derartige Analyse wird die Auswahl von Klonen ermöglichen, die eine breite Diversität darstellen, und wiederholte Klone aussparen. Zweitens wird eine DNA-Sequenzierung Mutationen, die während des Isolationsverfahrens eingeführt wurden, aufdecken.
Beim Analysieren von variable-Region-codierenden Sequenzen gibt es drei Typen von Mutationen, die zu berücksichtigen sind, wenn bewertet wird, ob eine Mutation annehmbar ist: i) Der häufigste Typ von Mutationen resultiert aus einem Intra-Familien-Überkreuz-Priming ("intra-family cross-priming"), wobei V-Gen-Primer zu einem Priming der falschen Teilmenge innerhalb einer speziellen V-Genfamilie führen. Die eingeführten Änderungen sind hauptsächlich Substitutionen von natürlich vorkommenden Kodons an einer speziellen Position. Aufgrund des hohen Grades der Sequenzhomologie innerhalb einer V-Genfamilie können diese Veränderungen üblicherweise als konservative und annehmbare Änderungen angesehen werden; ii) weniger häufige Mutationen werden durch Inter-Familien-Überkreuz-Priming eingeführt (z. B. ein VH3-Familien-Primer führt zu einem Priming einer VH1-Familie-codierenden Sequenz) und induzieren bedeutendere strukturelle Veränderungen, manchmal ohne natürliche Entsprechung. Derartige Veränderungen könnten die Immunogenität der variablen Region potentiell beeinträchtigen, indem neue Epitope erzeugt werden. Derartige Veränderungen können leicht identifiziert und nachfolgend unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken repariert werden oder die Klone können aus der Bibliothek ausgeschlossen werden; iii) Fehler, die durch die Taq-DNA-Polymerase erzeugt werden, werden am leichtesten in den konstante-Region-codierenden Sequenzen identifiziert und können leicht eliminiert werden. Jedoch werden Taq-induzierte Mutationen auch in den variable-Region-codierenden Sequenzen vorhanden sein, wo sie von den natürlich auftretenden somatischen Mutationen, die ebenso das Ergebnis von Zufallsmutationen in den variable-Region-codierenden Sequenzen sind, ununterscheidbar sind. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Mutationen nicht-systematisch sind und lediglich bestimmte Paare in unterscheidbaren Weisen beeinträchtigen, erscheint es vernünftig, derartige Veränderungen außer Acht zu lassen.
Ferner kann die Sequenzanalyse verwendet werden, um den Grad der Verwürfelung in einer Bibliothek von kognaten Paaren zu identifizieren, wie in Tabelle 20 für die VH-Gruppe H4 erläutert.
Wie in Beispiel 9 beschrieben, kann das Vorhandensein der in i) und ii) beschriebenen Mutationen in der Expressionsbibliothek umgangen werden, wenn Primer verwendet werden, die sich in der Leadersequenz der variable-Region-codierenden Sequenzen anlagern, und zwar anstelle von Primern, die sich in der 5'-Region der variablen Regionen anlagern.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Unterbibliothek von Ziel-spezifischen und möglicherweise Sequenz-analysierten Paaren von verknüpften Immunglobulin-variable-Leichtkettenregion- und -variable-Schwerkettenregion-codierenden Sequenzen in einen Säuger-Expressionsvektor transferiert. Ein derartiger Transfer kann in einen beliebigen der Vektoren, die im vorherigen Abschnitt beschrieben wurden, erfol gen, was die Expression eines rekombinanten Volllängen-Antikörpers ermöglicht. Falls das Screening mit einer kognaten Volllängen-Antikörper-Säuger-Expressionsbibliothek durchgeführt wird, kann ein derartiger Transfer nicht erforderlich sein.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Elternbibliothek ausgehend von einer Lymphozyten-enthaltenden Zellfraktion, die bezüglich T-Lymphozyten angereichert ist, erzeugt. Die Page von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen, die die Elternbibliothek darstellen, können hinsichtlich der Codierung einer Teilmenge von Paaren von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen, bestehend aus alpha- und beta- und/oder gamma- und delta-Ketten, die für Bindungsproteine mit einer gewünschten Zielspezifität codieren, ausgewählt werden, wodurch eine Unterbibliothek von kognaten Paaren oder kombinatorischen Paaren erzeugt wird. Antigen-spezifische T-Zellrezeptoren können nachfolgend ausgehend von einem Pool von transfizierten Zellen identifiziert werden, wobei eine Standardmethodologie, wie z. B. die Färbung mit tetrameren MHC-Peptid-Komplexen, verwendet wird (z. B. Callan, M.F. et al., 1998. J. Exp. med. 187, 1395–1402; Novak, E.J., et al., 1999. J. Clin. Invest 104, R63–R67), durch Messung von Zellreaktionen in der Form der IL-2-Freisetzung oder durch ausgefeiltere Mittel, wie z. B. Hefe- oder retrovirale Displaytechniken.
Wirtszellen und Expression
Die Bibliotheken können in bzw. auf Vektoren transferiert werden, die zur Expression und Produktion von Proteinen, die von den verknüpften Nucleinsäuresequenzen von Interesse codiert werden, insbesondere variable-Region-enthaltende Bindungsproteine oder Fragmente davon, geeignet sind. Derartige Vektoren sind im Abschnitt Vektoren und Bibliotheken beschrieben und sorgen für die Expression von beispielsweise Volllängen-Antikörpern, Fab-Fragmenten, Fv-Fragmenten, scFv, Membran-gebundenen oder löslichen TcRs oder TcR-Fragmenten einer gewählten Spezies.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Einführung in eine Wirtszelle einer Bibliothek oder Unterbibliothek von Vektoren von kognaten Paaren von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen oder ein einzelner Klon, codierend für ein kognates Paar von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen, und zwar zur Amplifikation und/oder Expression. Die Wirtszellen können aus Bakterien, Hefe, anderen Pilzen, Insektenzellen, Pflanzenzellen oder Säugerzellen ausgewählt sein. Für Expressionszwecke sind Säugerzellen bevorzugt, wie z. B. Ovarialzellen aus dem Chinesischen Hamster (CHO), COS-Zellen, BHK-Zellen, Myelomzellen (z. B. Sp2/0-Zellen, NS0), NIH 3T3, Fibroblasten- oder immortalisierte humane Zellen, wie z. B. HeLa-Zellen, HEK 293-Zellen oder PER.C6.
Die Einführung von Vektoren in Wirtszellen kann mittels einer Anzahl von Transformations- oder Transfektionsverfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, bewerkstelligt werden, und zwar einschließlich Calciumphosphat-Präzipitation, Elektroporation, Mikroinjektion, Liposomenfusion, RBC-Ghost-Fusion, Protoplastenfusion, Virusinfekti an und dergleichen. Die Produktion von monoklonalen Volllängen-Antikörpern, Fab-Fragmenten, Fv-Fragmenten und scFv-Fragmenten ist gut bekannt.
Die Produktion von rekombinanten polyklonalen Antikörpern, die für Behandlung(szwecke) verwendet werden sollen, ist ein recht neues Gebiet. Eine rekombinante polyklonale Herstellungstechnologie ist in der PCR-Anmeldung WO 2004/061104 beschrieben worden. Kurz gesagt, involviert diese Technologie die Erzeugung einer Sammlung von Zellen, geeignet als eine Herstellungszelllinie. Die folgende Beschreibung der Technik ist für eine Bibliothek von kognaten Paaren erstellt, ist jedoch genauso anwendbar für eine kombinatorische Bibliothek. Die individuellen Zellen in der Sammlung von Zellen sind befähigt zur Expression eines unterscheidbaren Mitglieds des rekombinanten polyklonalen Bindungsproteins, z. B. aus einer Bibliothek von kognaten Paaren. Um sicherzustellen, dass die individuellen Zellen ein einzelnes kognates Paar und nicht mehrere kognate Paare des polyklonalen Bindungsproteins exprimieren, werden die Nucleinsäuresequenzen, die für die kognaten Paare codieren, in eine einzelne bzw. singuläre ortsspezifische Position des Genoms jeder individuellen Zelle eingeführt. Dies ist ein wichtiges Merkmal der Sammlung von Zellen, da dies eine Verwürfelung der Schwer- und Leichtketten, die von jeder Zelle exprimiert werden, verhindert, jedoch auch, da es Zellen erzeugt, die, abgesehen von den kleinen Unterschieden hinsichtlich der variablen Regionen des individuellen kognaten Paares, zueinander praktisch identisch sind. Dieses Merkmal ("trait") wird ein unbeeinflusstes Wachstum der Sammlung von Zellen über den Zeitraum, der für die Produktion nötig ist, ermöglichen. Um eine einzelne bzw. singuläre ortsspezifische Integration sicherzustellen, sollte eine Wirtszelllinie mit lediglich einer Integrationsstelle verwendet werden, diese sind im Handel erhältlich, z. B. von Invitrogen als CHO-Zellen vom Typ Flp-In, die eine einzelne FRT-Stelle enthalten. Geeignete Vektoren für diese Zelllinie enthalten eine entsprechende FRT-Stelle und werden in das Genom unter Verwendung der Flp-Rekombinase eingeführt. Es gibt mehrere weitere bekannte Rekombinasen, z. B. Cre, die beta-Rekombinase, Gin, Pin, PinB, PinD, R/RS, die lambda-Integrase oder die Phage ΦC31-Integrase, die in Kombination mit ihren entsprechenden Rekombinationsstellen verwendet werden können. Weiterhin enthalten geeignete Vektoren einen Selektionsmarker, der die Auswahl von Orts- bzw. positionsspezifischen Integranten ermöglicht.
Die Erzeugung einer polyklonalen Herstellungszelllinie und die Produktion eines rekombinanten polyklonalen Proteins, ausgehend von einer derartigen Zelllinie, können mittels mehrerer unterschiedlicher Transfektions- und Herstellungsstrategien erhalten werden.
Ein Weg ist es, eine Bibliothek von Vektoren, miteinander zu einer einzigen Zusammensetzung gemischt, für die Transfektion einer Wirtszelllinie mit einer einzelnen Integrationsstelle pro Zelle zu verwenden. Dieses Verfahren wird als Bulk-Transfektion oder "transfection in bulk" bezeichnet. Im Allgemeinen werden das Vektor- und Wirtszell-Design, wie zuvor beschrieben, sicherstellen, dass eine polyklonale Zelllinie, die zum unbeeinflussten Wachstum befähigt ist, bei einer geeigneten Selektion erhalten wird. Ein gefrorener Bestand bzw. eine gefrorene Stammkultur („frozen stock") der polyklonalen Zelllinie wird vor dem Beginn der Herstellung des rekombinanten polyklonalen Proteins erzeugt.
Ein weiterer Weg ist es, eine Bibliothek von Vektoren, aufgeteilt zu Fraktionen, die näherungsweise 5 bis 50 individuelle Vektoren der Bibliothek in einer Zusammensetzung enthalten, für die Transfektion zu verwenden. Vorzugsweise stellt eine Fraktion der Bibliothek 10 bis 20 individuelle Vektoren dar. Ein Aliquot von Wirtszellen wird anschließend mit jeder Zusammensetzung transfiziert. Dieses Verfahren wird als Semi-Bulk-Transfektion bezeichnet. Die Anzahl transfizierter Aliquote wird von der Größe der Bibliothek und der Anzahl individueller Vektoren in jeder Fraktion abhängen. Falls die Bibliothek z. B. 100 unterscheidbare kognate Paare darstellt, die zu Fraktionen, die 20 unterscheidbare Mitglieder in einer Zusammensetzung enthalten, aufgespalten sind, müssten 5 Aliquote von Wirtszellen mit einer Bibliothekszusammensetzung, die eine unterscheidbare Fraktion der ursprünglichen Bibliothek darstellt, transfiziert werden. Die Aliquote von Wirtszellen werden hinsichtlich einer ortsspezifischen Integration selektiert. Vorzugsweise werden die unterscheidbaren Aliquote separat selektiert. Jedoch können sie vor einer Selektion auch gepoolt bzw. vereinigt werden. Die Aliquote können hinsichtlich ihrer klonalen Diversität analysiert werden, und nur die mit einer hinreichenden Diversität werden verwendet werden, um einen Bestand für eine polyklonale kognates-Paar-Bibliothek zu erzeugen. Um die gewünschte polyklonale Zelllinie für die Herstellung zu erhalten, können die Aliquote vor der Erzeugung des gefrorenen Bestandes, unmittelbar, nachdem sie aus dem Bestand entnommen wurden oder nach einer kurzen Proliferations- und Adaptationszeit gemischt werden. Optional werden die Aliquote von Zellen über die Produktion hinweg separat gehalten, und die polyklonale Proteinzusammensetzung wird aufgebaut bzw. hergestellt, indem die Produkte von jedem Aliquot anstelle der Aliquote von Zellen vor der Produktion kombiniert werden.
Ein dritter Weg ist ein Hochdurchsatzverfahren, bei dem Wirtszellen separat unter Verwendung der individuellen Vektoren, die Bibliotheken von kognaten Paaren darstellen, transfiziert werden. Dieses Verfahren wird als individuelle Transfektion bezeichnet. Die individuell transfizierten Wirtszellen werden vorzugsweise getrennt hinsichtlich einer ortsspezifischen Integration selektiert. Die individuellen Zellklone, die bei der Selektion erzeugt werden, können bezüglich der Proliferationszeit analysiert werden, und es werden vorzugsweise die mit ähnlichen Wachstumsraten verwendet, um einen Bestand für eine Bibliothek polyklonaler kognater Paare zu erzeugen. Die individuellen Zellklone können gemischt werden, um die gewünschte polyklonale Zelllinie vor der Erzeugung des Bestandes zu erhalten, sofort nachdem sie aus dem Bestand entnommen wurden oder nach einer kurzen Proliferations- und Adaptationszeit. Diese Herangehensweise kann jede mögliche verbleibende Sequenzabweichung während Transfektion, Integration und Selektion eliminieren. Alternativ werden die individuell transfizierten Wirtszellen vor der Durchführung der Selektion gemischt. Dies wird eine Kontrolle der Sequenzabweichung aufgrund der Transfektion ermöglichen.
Ein gemeinsames Merkmal in den oben dargelegten Herstellungsstrategien ist, dass alle der individuellen kognaten Paare, die das rekombinante polyklonale Protein darstellen, in einer oder einer begrenzten Zahl von Bioreaktoren hergestellt werden können. Der einzige Unterschied ist die Stufe, bei der man die Wahl trifft, die Sammlung von Zellen, die die polyklonale Herstellungszelllinie darstellen, zu erzeugen.
Die Erfindung ermöglicht auch eine Population von Wirtszellen, die eine kognate Bibliothek oder Unterbibliothek von verknüpften Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen umfassen, und auch eine Population von Wirtszellen, die eine Bibliothek umfassen, erhalten aus einer Population von isolierten Einzelzellen, die Lymphozyten darstellen, wobei die Multiplex-RT-PCR-Amplifikation, gefolgt von Verknüpfung mittels Ligation oder Rekombination, oder die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Technologie der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, um die kognaten Paare zu verknüpfen.
Ermöglicht wird auch eine Population von Wirtszellen, die eine kombinatorische Bibliothek oder Unterbibliothek von verknüpften Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen umfassen.
Eine Population von Wirtszellen, die durch die vorliegende Erfindung ermöglicht wird, wird eine diverse Population von Zellen umfassen, die der Diversität der Bibliothek, mit der die Zellen transformiert/transfiziert worden sind, entspricht. Vorzugsweise stellt jede Zelle der Population von Zellen nur ein kognates Paar der gesamten Bibliothek von kognaten Paaren dar, und kein individuelles Mitglied der Bibliothek von kognaten Paaren überschreitet mehr als 50%, stärker bevorzugt 25% oder am stärksten bevorzugt 10% der Gesamtzahl individueller Mitglieder, exprimiert von der Population von Wirtszellen.
Die Population von Wirtszellen steht typischerweise für Säugerzellen.
Eine Population von Wirtszellen, wie obenstehend beschrieben, kann zur Expression eines rekombinanten polyklonalen Bindungsproteins eingesetzt werden, da individuelle Zellen der Population variable-Region-codierende Sequenzen von unterschiedlicher Diversität darstellen.
Die Erfindung ermöglicht auch ein rekombinantes polyklonales Protein, exprimiert von einer Population von Wirtszellen, die eine Bibliothek von Vektoren, codierend für diverse kognate Paare von verknüpften variable-Region-codierenden Sequenzen, umfassen, wobei eine derartige Bibliothek mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhältlich ist. Typischerweise besteht ein derartiges rekombinantes polyklonales Protein aus wenigstens 2, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 10⁴, 10⁵ oder 10⁶ Proteinen, bestehend aus unterschiedlichen kognaten Paaren.
Die Erfindung ermöglicht ferner ein rekombinantes polyklonales Immunglobulin, exprimiert von einer Population von Wirtszellen, die eine Bibliothek von Vektoren, codierend für diverse kognate Paare von Schwerkette-variable-Region- und Leichtkette-variable-Region-codierenden Sequenzen, umfasst, und auch einen rekombinanten polyklonalen TcR, exprimiert von einer Population von Wirtszellen, die eine Bibliothek von Vektoren, codierend für diverse kognate Paare von TcR-variable-alpha-Kettenregion-, verknüpft mit variablebeta-Kettenregion-codierenden Sequenzen, und/oder TcR-variable-gamma-Kettenregion-, verknüpft mit variable-delta-Kettenregion-codierenden Sequenzen, umfasst.
Die Erfindung ermöglicht auch eine Wirtszelle, die für die Produktion eines monoklonalen Proteins geeignet ist. Insbesondere ein monoklonaler Antikörper, bestehend aus einem kognaten Paar einer variablen Leichtkettenregion mit einer variablen Schwerkettenregion, oder ein monoklonaler TcR, bestehend aus einem kognaten Paar einer variablen-alpha-Region mit einer variablen beta-Region oder einer variablen delta-Region mit einer variablen-gamma-Region. Vorzugsweise ist eine derartige monoklonale Produktionszelllinie keine Hybridomzelllinie.
Ein derartiger monoklonaler Antikörper oder TcR kann erzeugt werden durch Hinzufügen der folgenden Stufen zum Verfahren der Verknüpfung einer Mehrzahl von nicht-zusammenhängenden Nucleotidsequenzen von Interesse: a) Inserieren der verknüpften Nucleinsäuresequenzen in einen Vektor; b) Einführen des Vektors in eine Wirtszelle; c) Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen, die für eine Expression geeignet sind; und d) Erhalten des Proteinprodukts, das ausgehend vom Vektor, der in die Wirtszelle inseriert wurde, exprimiert wird. Vorzugsweise codiert der in die Wirtszelle eingeführte Vektor für ein individuelles kognates Paar von variable-Region-codierenden Sequenzen.
Anwendungen der Erfindung
Eine der Hauptanwendungen der vorliegenden Erfindung ist die Verknüpfung von kognaten Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen, insbesondere Immunglobulin-variable-Schwer- und -variable-Leichtkettenregion-codierende Sequenzen oder TcR-variable-alpha- und -variable-beta-Ketten- oder -variable-gamma- und -variable-delta-Kettenregion-codierende Sequenzen, durch ein Hochdurchsatzverfahren zur Erzeugung von Bibliotheken von kognaten Paaren. Zusätzlich zur Erzeugung von Bibliotheken von kognaten Paaren können die Multiplex-RT-PCR, gefolgt von Verknüpfung mittels Ligation oder Rekombination, oder die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Techniken der vorliegenden Erfindung bei der Erzeugung von kombinatorischen Bibliotheken eingesetzt werden, indem die Technik an einer Population von genetisch diversen Zellen, Zelllysaten aus einer derartigen Population von Zellen oder an RNA, gereinigt aus einer derartigen Population von Zellen, durchgeführt wird. Die Bibliotheken, Unterbibliotheken oder einzelnen Klone aus einer dieser Bibliotheken erleichtern die Expression von polyklonalen oder monoklonalen Proteinen. Insbesondere können monoklonale oder polyklonale Antikörper aus den Bibliotheken der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Die Verwendung von rekombinanten monoklonalen Antikörpern in Diagnostika, in der Behandlung und in der Prophylaxe ist gut bekannt. Rekombinante monoklonale und polyklonale Antikörper, die mittels der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, werden die gleichen Anwendungen besitzen, wie Antikörperprodukte, die mittels bestehender Technologien erzeugt werden. Insbesondere kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein polyklonales rekombinantes Immunglobulin als aktiven Inhaltsstoff, kombiniert mit wenigstens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipiens, mittels der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Stärker bevorzugt sind pharmazeutische Zusammensetzungen, bei denen das polyklonale rekombinante Immunglobulin aus kognaten Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen besteht. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen von polyklonalen rekombinanten Immunglobulinen können als Medikamente verwendet werden. Das polyklonale rekombinante Immunglobulin der Zusammensetzung kann spezifisch für oder reaktiv gegen ein vorherbestimmtes Krankheitsziel ("disease target") sein, und die Zusammensetzung kann somit zur Behandlung, Linderung bzw. Verbesserung oder Verhütung von Erkrankungen, wie z. B. Krebs, Infektionen, inflammatorische Erkrankungen, Allergie, Asthma und andere Atemwegserkrankungen, Autoimmunerkrankungen, immunologische Fehlfunktionen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Erkrankungen im Zentralnervensystem, metabolische und endokrine Erkrankungen, Transplantatabstoßung, oder unerwünschter Schwangerschaft verwendet werden, und zwar bei einem Säuger, wie z. B. einem Menschen, einem domestizierten Tier oder einem Haustier.
Die vorliegende Erfindung besitzt eine weitere Anwendung, die mit herkömmlichen kombinatorischen Techniken monoklonaler Antikörper nicht erreicht werden kann. In Situationen, in denen schützende Antigene entweder schlecht charakterisiert oder völlig unbekannt sind, wie z. B. bei sich ausbreitenden Infektionskrankheiten, ist es unmöglich bezüglich eines monoklonalen Antikörpers zu durchmustern, der einen Schutz gegen die Krankheit bereitstellen wird.
Mit der vorliegenden Erfindung wird es jedoch möglich sein, Antikörperexprimierende Zellen direkt aus Donoren bzw. Spender mit einer etablierten schützenden Antikörperreaktion, z. B. rekonvaleszente Patienten, zu erhalten und das Ausgangsmaterial aus diesen Individuen zu nutzen, um eine Bibliothek von kognaten Paaren von Immunglobulin-variable-Schwer- und -variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen zu erzeugen.
In Situationen, in denen z. B. das Virus bekannt ist, jedoch die schützenden Antigene unbekannt sind, wird es möglich sein, eine Unterbibliothek von kognaten Antikörper-Genpaaren mit breiter Reaktivität gegenüber antigenen Strukturen auf dem Virus zu erzeugen. Falls ein rekombinanter polyklonaler Antikörper ausgehend von einer derartigen Unterbibliothek erzeugt wird, wird er wahrscheinlich schützende Antikörper enthalten.
In Situationen, in denen Antigene völlig unbekannt sind, kann ein rekombinanter polyklonaler Antikörper, erzeugt ausgehend von einer Bibliothek kognater Paare aus z. B. rekonvaleszenten Patienten, auf die gleiche Weise verwendet werden, wie hyperimmune Immunglobuline heute verwendet werden. Der Grund dafür liegt in der kognaten Paarung, die sicherstellt, dass der produzierte rekombinante polyklonale Antikörper der Antikörperimmunreaktion des rekonvaleszenten Patienten stark ähnelt.
Eine weitere Anwendung der Techniken zur Verknüpfung von kognaten Paaren von variablen Regionen, beschrieben in der vorliegenden Erfindung, ist für diagnostische und analytische Zwecke. Wenn ein Medikament an einen Patienten verabreicht wird, besteht stets die Möglichkeit einer Immunreaktion, die gegen das Medikament gerichtet ist. Diese Immunogenität kann mittels herkömmlicher Techniken untersucht werden, wie z. B. Medikamenten-spezifischen Bindungsassays mit Serum oder Plasma, das aus dem mit dem Medikament behandelten Individuum stammt. Alternativ können die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Immunreaktion des Patienten kurz nach Verabreichung des Medikaments widerzuspiegeln, indem kognate Paare von variable-Schwerkette- und -Leichtkettecodierenden Sequenzen isoliert werden. Antikörper, die ausgehend von einer derartigen Bibliothek exprimiert werden, können anschließend hinsichtlich einer Reaktivität gegenüber dem Medikament oder gegenüber Komponenten des Medikaments durchmustert werden. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, falls das Vorhandensein des Medikaments in Plasma oder Serum zu einer Störung des herkömmlichen Verfahrens führen würde. Derartige Medikamente sind z. B. Antikörper. Bei herkömmlichen Verfahren kann eine Identifizierung einer Anti-Medikament-Immunreaktion (z. B. eine anti-idiotypische, Anti-framework- bzw. Anti-Gerüstregion- oder Anti-Fc-Immunreaktion) in Verbindung mit einer Behandlung mit dem Antikörper nicht durchgeführt werden, bis der für die Behandlung verwendete Antikörper vollständig aus dem Blut ausgeschieden wurde. Mit der vorliegenden Erfindung können Sequenzen, die für derartige Anti-Medikament-Antikörper codieren, aus dem mit dem Medikament behandelten Individuum innerhalb einiger Wochen isoliert und analysiert werden. Dies wäre ein alternatives Verfahren zur Untersuchung, ob Wirkstoffe im Allgemeinen, und insbesondere Antikörper-basierte Wirkstoffe bzw. Medikamente immunogen sind.
Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung liegt in der Validierung und im Vergleich von Vakzinen und Immunisierungsprogrammen. Dies ist besonders nützlich während der Vakzinentwicklung, da es möglich sein wird, die Sequenzdiversität von Antikörperreaktionen, erzeugt in Reaktion auf neue Kandidatenvakzine, zu bewerten und zu vergleichen, und zwar zusätzlich zu den gängigen Vergleichen von Antikörper-Bindungsaffinitäten und Serumtiter. Ferner kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um Antikörperreaktionen bei der Überwachung der Vakzinwirksamkeit bei Populationen zu analysieren, aufzuzeichnen und zu vergleichen.
Die vorliegende Erfindung findet auch Anwendungen außerhalb des Gebiets von variable-Region-enthaltenden Bindungsproteinen. Für einen Fachmann auf dem Gebiet ist es lediglich eine Sache der Optimierung, die in der vorliegenden Erfindung offenbarte Technik anzupassen, um zwei oder mehr transkribierte Nucleotidsequenzen, die für ein anderes heteromeres Protein als ein Bindungsprotein codieren, zu verknüpfen. Eine derartige Verknüpfung von Sequenzen, die für Domänen oder Untereinheiten aus einem heteromeren Protein codieren, kann einen Vorteil bei Isolation dieser Protein-codierenden Sequenzen darstellen, da sie die An zahl der Stufen beträchtlich verringern würde. Ferner wäre es möglich, z. B. Spleißvarianten, Mutationen oder neue Familienmitglieder derartiger Proteine zu isolieren, indem nur ein Multiplex-Primer-Gemisch/Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch verwendet wird.
Die Verknüpfung von Sequenzen, die für entfernte Domänen eines einzelnen Proteins codieren, ist auch eine Möglichkeit. Eine derartige Technik würde die Forschung in Bezug auf die Bedeutung von bestimmten Domänen in einem Multidomänenprotein erleichtern, da sie die Deletion von dazwischen liegenden Domänen erleichtern würde.
Die Erzeugung von chimären oder gekoppelten Proteinen ist auch ein Gebiet, auf dem die vorliegende Erfindung angewendet werden kann. Sogar wenn die zu verknüpfenden Proteine unterschiedlichen Ursprungs sind, z. B. eine Chimäre zwischen einem humanen und einem Mäuse-Protein, kann die vorliegende Erfindung eingesetzt werden, indem die Zellen vor der reversen Transkription gemischt werden. Ein derartiges Zellgemisch kann entweder eine Population aus Zellen jeder Spezies oder eine Einzelzelle aus jeder Spezies darstellen.
Beispiele
Beispiel 1: Zweistufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR
In diesem Beispiel wurde eine reverse Transkription (RT) unter Verwendung einer Matrize, die aus einer isolierten Einzelzelle stammte, durchgeführt, und die produzierte cDNA wurde als Matrize für mehr als eine Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR verwendet.
a. Zellen
Eine IgG1-kappa-exprimierende Chinesischer-Hamster-Ovar(CHO)-Zelllinie wurde unter Verwendung der Flp-In-Technologie (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) erzeugt.
Ein IgG-kappa-exprimierender Sauger-Plasmidvektor pLL113 (4) wurde auf der Basis des Flp-In-Expressionsvektors pcDNA5/FRT konstruiert. CHO-Flp-In-Zellen wurden mit pLL113, enthaltend die Antikörper-codierenden Gene, und p0G44, der die transiente Expression der Flp-Rekombinase vermittelt, unter Verwendung von Lipofectamin2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers cotransfiziert. Transformanten wurden hinsichtlich der Produktion von IgG-kappa mittels Immunassays selektiert bzw. ausgewählt und verifiziert. Die selektierte Zelllinie wurde als CHO-Flp-In-pLL113 bezeichnet und in Ham-F-12-Medium, supplementiert mit 2 mM L-Glutamin, 10% FCS und 900 Hygromycin B, aufrecht erhalten (Erhaltungsmedium).
CHO-Flp-In-pLL113-Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin geerntet und dreimal in Erhaltungsmedium gewaschen. Nach dem abschließenden Waschschritt wurden die Zellen im ursprünglichen Volumen an Erhaltungsmedium resuspendiert. Die Zellkonzentration wurde unter Verwendung eines Systems mit der Bezeichnung Casy-1 (Schärfe System GmbH, Reutlingen, Deutschland) bestimmt, und es erfolgte eine Verdünnung in Erhaltungsmedium auf eine Konzentration von 1 Zelle/5 μl.
b. Reverse Transkription
Die CHO-Flp-In-pLL113-Zellsuspension, die im Durchschnitt eine Zelle enthielt, wurde in einzelne Wells einer 96-Well-PCR-Platte (Thermo-Fast 96, "skirted AB-0800", Abgene, Epsom, Surrey, UK) dispensiert.
Die cDNA wurde ausgehend von den verteilten Zellen synthetisiert, wobei die Stufe der reversen Transkriptase (RT) im einstufigen RT-PCR-Protokoll von Qiagen (Qiagen One-Step RT-PCR-Kit, Kat.# 210210, Hilden, Deutschland) eingesetzt wurde.
Jedes Well enthielt die folgenden Reagentien in einem Gesamtvolumen von 20 μl:
1 × Ein-Stufen-RT-PCR-Puffer ("One Step RT-PCR buffer"),
dNTPs in einer Endkonzentration von jeweils 1 mM,
5 pmol Oligo poly-dT (18),
26 U RNase-Inhibitor (RNasin, Promega, Madison, USA, Kat.-Nr. N2111),
2 μl Ein-Stufen-RT-PCR-Enzymgemisch, und
5 μl CHO-Flp-In-pLL113-Zellsuspension.
Die RT-Reaktion wurde durchgeführt, indem die Reaktionsgemische bei 55°C für 30 min inkubiert wurden. Nachfolgend wurde die reverse Transkriptase inaktiviert, indem das Reaktionsgemisch für 10 min bei 94°C inkubiert wurde.
c. Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR
Eine Fraktion der in Stufe b) erzeugten cDNA-Produkte wurde als Matrize für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR verwendet. Die Reaktionen wurden in 96-Well-Platten durchgeführt.
Jedes Well enthielt in einem Gesamtvolumen von 40 μl die folgenden Reagentien:
1 × Ein-Stufen-RT-PCR-Puffer,
dNTPs in einer Endkonzentration von jeweils 500 μM,
Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch in den Konzentrationen, wie sie in Tabelle 1 angegeben sind,
26 U RNase-Inhibitor (RNasin, Promega, Madison, USA, Kat.-Nr. N2111),
2 μl Ein-Stufen-RT-PCR-Enzymgemisch, und
1 μl cDNA-Matrize (stammend aus einer Einzelzelle (Stufe b)).
Das verwendete Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch umfasste die in Tabelle 1 gezeigten Primer. Tabelle 1

W = A/T, S = G/C, R = A/G. In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der genspezifischen Region.

Die Reaktionen wurden mit einem 96-Well-Thermocycler vom Typ MWG Primus HT (MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland) mit den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
d. Geschachtelte bzw. Nested-PCR
Eine geschachtelte bzw. Nested-PCR wurde unter Verwendung der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Produkte als Matrize durchgeführt. Die Reaktionen wurden in 96-Well-Platten durchgeführt.
Jedes Well enthielt in einem Gesamtvolumen von 50 μl die folgenden Reagentien:
1 × BioTaq-Puffer,
dNTPs in einer Endkonzentration von jeweils 400 μM,
2 mM MgCl₂,
Nested-PCR-Primer-Gemisch,
1,25 U BIOTAQ DNA-Polymerase (Kat.-Nr. BIO-21040, Bioline, UK) und
1 μl Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR-Produkt (Stufe c).
Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der genspezifischen Region.
Die Reaktionen wurden mit einem 96-Well-Thermocycler vom Typ MWG Primus HT (MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland) mit den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
Die Nested-PCR-Produkte wurden mittels Elektrophorese und 1%igem Agarosegel analysiert, wobei Ethidiumbromid zur Detektion verwendet wurde (5). Die erwartete Größe des Überlappungsverlängerungs-Produkts betrug 1076 bp. Ein derartiges Produkt kann in den Bahnen 1, 5, 6, 7, 8 und 12 beobachtet werden und ist durch die Pfeile angezeigt (5A). Im gezeigten Experiment ist die Negativkontrolle kontaminiert, und eine ähnliche Kontamination ist auch in den Proben vorhanden. 5B stellt die Fragmente von 5A dar, die für das vorliegende Experiment relevant sind.
Das vorliegende Experiment erläutert einen Weg zur Durchführung einer zweistufigen Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR, wobei eine Matrize, die aus einer Einzelzelle stammt, eingesetzt wird. Es wurde ferner gezeigt, dass es möglich ist, näherungsweise 20 Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCRs unter Verwendung von cDNA, die aus einer isolierten Einzelzelle isoliert wurde, durchzuführen.
Beispiel 2: Einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR
In diesem Beispiel wurden reverse Transkription und Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR in einer einzelnen Stufe durchgeführt, wobei Matrize aus lysierten Zellen in Konzentrationen, die 100, 10 oder einer Zelle(n) entsprechen, verwendet wurde.
a. Zellen
Die humane Hybridomzelllinie HB-8501, die einen Anti-Tetanus-IgG1-kappa-Antikörper produziert, wurde von der American Type Culture Collection erworben und in modifiziertem Dulbecco-Medium nach Iscove (Vitacell, Kiev, Ukraine, Kat.-Nr. 30-2005), enthaltend 10% fötales Rinderserum, kultiviert. Bevor die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR durchgeführt wurde, wurden die Zellen geerntet, gezählt und bei –80°C in Kulturmedium in einer Konzentration von 200 Zellen/μl eingefroren.
b. Einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR
Der Qiagen-Ein-Stufen-RT-PCR-Kit (Qiagen-Kat.-Nr. 210212, Hilden, Deutschland) wurde für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR im Wesentlichen gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Vor der Zugabe zu den PCR-Röhrchen wurden die Zelllysate aufgetaut und in H₂O verdünnt, um eine Lysatkonzentration, die 100, 10 und 1 Zelle(n) pro 5 μl entspricht, zu erhalten.
Jedes PCR-Röhrchen enthielt die folgenden Reagentien in einem Gesamtvolumen von 50 μl:
1 × Ein-Stufen-RT-PCR-Puffer,
dNTPs in einer Endkonzentration von jeweils 400 μM,
Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch in den Konzentrationen, wie sie in Tabelle 3 angegeben sind,
2 μl Ein-Stufen-RT-PCR-Enzymgemisch,
50 U RNase-Inhibitor (RNasin, Promega, Madison, USA, Kat.-Nr. N2515), und
5 μl verdünntes Zelllysat.
Das verwendete Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch umfasste die in Tabelle 3 angegebenen Primer. Tabelle 3

Die Reaktionen wurden unter Verwendung der folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:

Reverse Transkription: 30 min 55°C

Polymerase-Aktivierung: 15 min 95°C, Inaktivierung der reversen Transkriptase und Aktivierung der Taq-Polymerase.
PCR-Reaktion:
Zehn Mikroliter der Reaktionsprodukte wurden mittels Elektrophorese an 1,5%igem Agarosegel analysiert, wobei Ethidiumbromid zur Detektion verwendet wurde (6A).
Erwartete Größe der Fragmente (die exakte Größe hängt von den Längen der variablen Regionen ab):
V_H: 410 bp
LC: 680 bp
Überlappungsverlängerungs-Fragment: 1070 bp
Diskrete DNA-Fragmente mit Mobilitäten, die den Längen der variablen Schwerkettenregion (V_H) und der variablen Leichtketten- und konstanten Leichtkettenregion (LC) entsprechen, werden bei allen Zelllysatverdünnungen festgestellt. Ein weniger intensives Fragment mit einer Mobilität, die dem mutmaßlichen Überlappungsverlängerungs-Fragment entspricht, wird in den Lysaten von 100 und 10 Zellen festgestellt. Das Überlappungsverlänge rungs-Fragment der Probe mit dem Lysat einer Zelle ist schwer zu erkennen, obgleich es im ursprünglichen Gel festgestellt werden kann (siehe Pfeil in der Photographie, die in 6A gezeigt ist, und in der Skizze, die in 6B gezeigt ist).
c. Identifizierung des Überlappungsverlängerungs-Fragments
Ausgehend von einem Experiment, das wie das oben Beschriebene reproduziert wurde, wurde das Vorhandensein der Überlappungsverlängerungs-Bande verifiziert. Regionen im Agarosegel um 1070 bp aus einer Bahn, die 1 Zelle entspricht, und aus einer Bahn, die 100 Zellen entspricht, wurden ausgeschnitten, und die DNA wurde unter Verwendung von Qiaex II (Qiagen-Kat.-Nr. 20051, Hilden, Deutschland) gereinigt und in 20 μl Wasser eluiert.
Ein Mikroliter des Eluats wurde einer PCR (Biotaq-Kit, Bioline, UK, Kat.-Nr. BIO-21040) gemäß den Anweisungen des Herstellers unterworfen, mit Primern, die das mutmaßliche Überlappungsverlängerungs-Fragment flankieren (J_H-Primer, entsprechend SEQ ID NO: 32 bis 35, und C_Lκ-Primer, entsprechend SEQ ID NO: 17, jeder Primer in einer Konzentration von 0,5 μM). Die Zyklusparameter waren:
Zehn Mikroliter von jedem Reaktionsprodukt wurden mittels Elektrophorese an 1%igem Agarosegel analysiert, wobei Ethidiumbromid zur Detektion verwendet wurde. Mehrere Fragmente können festgestellt werden, einschließlich, sowohl aus 1 Zelle als auch 100 Zellen, eines Fragments mit einer Mobilität des erwarteten Überlappungsverlängerungs-Fragments (Pfeil in 6C). Das 1 kb-Fragment aus der Gelbahn, die einer Zelle entsprach, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung von Qiaex II wie oben beschrieben gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen NheI und NcoI (separat) verdaut, und die Reaktionsprodukte wurden mittels Elektrophorese an 1%igem Agarosegel analysiert, wobei Ethidiumbromid zur Detektion verwendet wurde (6D). Diese Restriktionsschnittstellen sind in der Überlappung zwischen VH und LC vorhanden, und die erwarteten Größen nach dem Verdau liegen in einer Länge von 410 bzw. 680 bp (2). Der NheI-Verdau war partiell, da eine große Fraktion noch mit der ursprünglichen Größe vorliegt.
Beispiel 3: Kombinierte einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR und geschachtelte PCR
In diesem Beispiel wurden eine reverse Transkription und Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR-Reaktionen in einer einzigen Stufe durchgeführt, gefolgt von einer Semi-Nested-PCR-Amplifikation, wobei eine Matrize aus lysierten Zellen in Konzentrationen, die 100, 10 oder 1 Zelle(n) entsprachen, verwendet wurde.
a. Einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR
Eine Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR unter Verwendung von HB-8501-Zelllysat wurde durchgeführt, wie in Beispiel 2 beschrieben, wobei ein Multiplex- Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch, umfassend die in Tabelle 4 angegebenen Primer, eingesetzt wurde. Tabelle 4

Es sollte jedoch angemerkt werden, dass für jedes Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch nur einer der C_H1-5-Primer verwendet wurde, was in fünf unterschiedlichen Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemischen resultierte.
Die verbleibenden Parameter waren, wie es für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktion in Beispiel 2 beschrieben ist, lediglich mit einer Änderung der Anlagerungs- bzw. Annealingtemperatur auf 50°C. Eine Reaktion wurde für jeden konstante Schwerkettenregion-Rückwärtsprimer (C_H1, C_H2, C_H3, C_H4, C_H5, entsprechend den SEQ ID NOs: 49 bis 53) durchgeführt, wobei Lysate, die 100, 10, 1 und 0 Zelle(n) entsprechen, eingesetzt wurden.
b. Semi-Nested-PCR
Ein Mikroliter des Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktionsprodukts wurde einer Semi-Nested-PCR (Biotaq-Kit, Bioline, UK, Kat.-Nr. BIO-21040), im Wesentlichen wie es vom Hersteller vorgeschlagen wird, unterworfen. Das Gesamtvolumen der Reaktionen betrug 50 μl. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5
In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der genspezifischen Region.
Die Zyklusbedingungen waren wie folgt:
Zehn Mikroliter jeder Reaktion wurden mittels Elektrophorese an 1,5%igem Agarosegel analysiert, wobei Ethidiumbromid zur Detektion verwendet wurde ( 7).
Das mutmaßliche Überlappungsverlängerungs-Fragment aus der Semi-Nested-PCR, das dem Lysat aus einer Zelle entsprach und bei dem der C_H4-Primer in der ersten Reaktion verwendet wurde (siehe Pfeil in 7), wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten, unter Verwendung eines Qiaex II-Kits (Qiagen, Kat.-Nr. 20051, Hilden, Deutschland) gereinigt und in pCR2.1-TOPO unter Verwendung eines Klonierungskits mit der Bezeichnung Invitrogen TOPO TA (Invitrogen Kat.-Nr. 45-0641, Carlsbad, CA, USA) inseriert. Inserts von acht Klonen wurden sequenziert, und sieben von diesen schienen aus einer variablen Schwerkettenregion, verknüpft mit einer variablen und konstanten Leichtkettenregion, zu bestehen, wie gemäß der erwarteten Überlappungsregion.
In Zusammenfassung war die Empfindlichkeit der kombinierten Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR- und der Semi-Nested-PCR-Reaktion in hohem Maße zufrieden stellend, wobei 4 von 5 Konstante-Region-Primer zum Amplifizieren signifikanter Mengen an Überlappungsverlängerungs-Produkten aus Lysat, das einer Einzelzelle entsprach, befähigt waren.
Beispiel 4: Kombinierte einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR und geschachtelte PCR unter Verwendung von angereicherten humanen B-Lymphozyten als Matrizenquelle
In diesem Beispiel wurden eine reverse Transkription und Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR-Reaktionen in einer einzigen Stufe durchgeführt, gefolgt von einer Semi-Nested-PCR-Amplifikation, wobei isolierte einzelne humane B-Lymphozyten als Matrizenquelle verwendet wurden.
a. B-Zell-Isolation
Ein menschlicher, männlicher Spender wurde mit Tetanustoxoid immunisiert. Eine Blutprobe von 120 ml wurde dem Spender 6 Tage nach der Immunisierung abgenommen, und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden unter Verwendung von Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norwegen, Produkt Nr. 1001967) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die CD19-positive Zellpopulation wurde unter Einsatz einer auf magnetischen Kügelchen basierenden Zellsortierung angereichert. Die PBMCs wurden mit FITC-konjugiertem Anti-CD19-Antikörper (Becton Dickinson, NJ, USA, Kat.-Nr. 345776) gefärbt. Eine auf magnetischen Kügelchen basierende Zellsortierung unter Verwendung von Anti-FITC-konjugierten magnetischen Mikrokügelchen und Säulenreinigung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (Miltenyi Biotec, Gladbach, Deutschland, Kat.-Nr. 130-042-401). Die Zellen wurden auf eine Konzentration von 200 Zellen pro ml in PBS, enthaltend 2 nM EDTA und 0,5% BSA, verdünnt. Fünf Mikroliter der verdünnten Zellen wurden auf PCR-Röhrchen verteilt, wodurch näherungsweise eine Zelle pro Röhrchen erhalten wurde. Die Röhrchen wurden bei –80°C bis zur Verwendung gelagert.
b. Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR und Semi-Nested-PCR
Die Bedingungen für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR und die Semi-Nested-PCR waren wie in Beispiel 3 beschrieben. Jedoch wurden die Reaktionen nur mit dem Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch, das den Primer C_H3, entsprechend SEQ ID NO: 51, darstellte, durchgeführt. Sechzehn Proben aus den kombinierten Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR- und Semi-Nested-PCR-Reaktionen wurden analysiert, indem 10 μl aus jeder Semi-Nested-PCR-Reaktion einer Elektrophorese an 1%igem Agarosegel unterworfen wurden, wobei Ethidiumbromid zur Detektion verwendet wurde (8).
Wie in 8 ersichtlich ist, enthielten 2 von 16 Bahnen (Bahnen 5 und 6) Fragmente der erwarteten Mobilität (etwa 1 kb). Weiterhin enthielt Bahn 2 ein weniger intensives Fragment mit der erwarteten Mobilität. Die 1 kb-Fragmente von Bahn 5 und 6 wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten, unter Verwendung eines Qiaex II-Kits (Qiagen, Kat.-Nr. 20051) gereinigt und unter Verwendung eines Klonierungskits mit der Bezeichnung Invitrogen TOPO TA (Invitrogen Kat.-Nr. 45-0641, Carlsbad, CA, USA) in pCR2.1-TOPO eingefügt. Zwei Klone von jedem isolierten Fragment wiesen Inserts mit der korrekten Größe auf. Ein Restriktionsen zymverdau (NcoI und NheI, einzeln) zeigte Fragmente der erwarteten Größen (410 und 680 bp), was auf eine korrekte Verknüpfung zwischen den codierenden Sequenzen der variablen Schwerkettenregion und der variablen und konstanten Region der Leichtkette hinwies.
Die zwei Klone, die von dem Fragment in Bahn 5 herrührten, wurden sequenziert, und es wurde gezeigt, dass sie identisch sind, was darauf hinwies, dass die verknüpfte V_H und LC kognate Paare waren.
Beispiel 5: Kombinierte einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR und geschachtelte PCR unter Verwendung von V_λ-spezifischen Primern
In diesem Beispiel wurden reverse-Transkription- und Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktionen in einer einzigen Stufe unter Verwendung von V_λ-spezifischen Primern durchgeführt, gefolgt von einer Semi-Nested-PCR-Reaktion. Gesamt-RNA, gereinigt aus zwei unterschiedlichen Zelllinien, die die lambda-Genfamlien 1b und 1e in Kombination mit der gleichen variablen Schwerkettenregion exprimieren, wurden als Matrizen verwendet.
a. Zellen
Zwei IgG1-lambda-exprimierende Chinesischer-Hamster-Ovar (CHO)-Zelllinien wurden unter Verwendung der Flp-In-Technologie (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) erzeugt.
Die IgG1-lambda-exprimierenden Säugervektoren pEm465/01P581 und pEm465/01P582 (9A), die für zwei lambda-Genfamilien stehen, wurden auf der Basis des Flp-In-Expressionsvektors pcDNA5/FRT konstruiert. CHO-Flp-In-Zellen wurde mit den oben erwähnten Plasmiden, die die Antikörper-codierenden Gene enthalten, und p0G44, das eine transiente Expression der Flp-Rekombinase vermittelt, unter Verwendung von Fugene 6 (Roche, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers cotransfiziert. Transformanten wurden auf Insertionen selektiert. Die selektierten Zelllinien wurden mit CHO-Flp-In/Em464/01P581 & CHO-Flp-In/Em464/01P582 bezeichnet und in F-12-Medium nach Ham, supplementiert mit 2 mM L-Glutamin, 10% FCS und 900 μg/ml Hygromycin B, aufrechterhalten (Erhaltungsmedium).
Die Zelllinien wurden unter Verwendung von Trypsin geerntet und dreimal im Erhaltungsmedium gewaschen. Näherungsweise 10⁷ Zellen wurden für die Reinigung von Gesamt-RNA verwendet, wobei der Kit mit der Bezeichnung Nucleo Spin L (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) gemäß der Beschreibung des Herstellers verwendet wurde. Die RNA-Endkonzentrationen wurden mittels OD₂₆₀-Messungen bestimmt.
b. Einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR
Eine Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR unter Verwendung von 50 pg, 5 pg oder 0,5 pg Gesamt-RNA als Matrize wurde im Wesentlichen durchgeführt, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, wobei ein Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer- Gemisch, das die in Tabelle 6 dargestellten Primer umfasste, und die unten spezifizierten Zyklusbedingungen eingesetzt wurden.

Reverse Transkription: 30 min 55°C

Polymerase-Aktivierung: 15 min 95°C, Inaktivierung der reversen Transkriptase und Aktivierung der Taq-Polymerase.

PCR-Reaktion:
Tabelle 6

Y = C/T, W = A/T, S = G/C, R = A/G. In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der genspezifischen Region.

c. Semi-Nested-PCR
Ein Mikroliter des Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktionsprodukts wurde einer Semi-Nested-PCR (Biotaq-Kit, Bioline, UK, Kat.-Nr. BIO-21040) unterworfen, im Wesentlichen, wie es vom Hersteller vorgeschlagen wird. Die Gesamtvolumina der Reaktionen betrugen 20 μl. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7
In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der genspezifischen Region.
Die Zyklusbedingungen waren wie folgt:
Zehn Mikroliter der Nested-Produkte wurden mittels Elektrophorese an 1,5%igem Agarosegel analysiert, wobei Ethidiumbromid zur Detektion verwendet wurde (9B und 9C). Die Pfeile weisen auf Überlappungsverlängerungs-Produkte mit den erwarteten Wanderungseigenschaften von näherungsweise 1 kb hin.
Das vorliegende Experiment erläutert, dass das in Tabelle 6 dargestellte lambda-Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch in der einstufigen Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR unabhängig von der verwendeten Matrize anwendbar ist. Ferner wurden spezifische Überlappungsverlängerungs-PCR-Produkte bei 0,5 pg Gesamt-RNA produziert. Diese Empfindlichkeit legt nahe, dass kognate verknüpfte codierende Sequenzen für die variable Schwerkettenregion und die variable Leichtkettenregion, ausgehend von einer Einzelzelle, amplifiziert werden können.
Beispiel 6: Erzeugung einer Unterbibliothek von Tetanus-spezifischen kognaten Paaren von Antikörper-codierenden Sequenzen
Im vorliegenden Beispiel werden die Stufen, die in dem in 10 dargestellten Fließbild dargelegt sind, unter Verwendung von Tetanustoxoid (TT) als Zielantigen beispielhaft dargestellt.
a. Spender
Spender bzw. Donoren, die zuvor mit dem Tetanusvakzin immunisiert worden sind, erhalten eine Auffrischung ("are boosted") mit Tetanusvakzin (Statens Serum Institut, Dänemark). Sechs Tage nach der Tetanusvakzinauffrischung wird den Spender eine Blutprobe von näherungsweise 200 ml in ein Röhrchen, das ein Antikoagulans enthält, abgenommen.
Es ist erforderlich, dass die Spender allgemein gesund sind, ohne stumme oder chronische Infektionen. Sie sollten nicht an Autoimmunkrankheiten leiden oder eine immunsuppressive Medikation erhalten, und sie sollten innerhalb der letzten drei Monate keine Vakzinierungen erfahren haben. Die Spender dürfen auch zum Zeitpunkt der TT-Vakzinauffrischung keine schweren Infektionen innerhalb des letzten Monats gehabt haben.
b. Präparation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC)
PBMC werden unter Verwendung von Lymphoprep (Axis-Shield PoC AS, Norwegen, Produkt Nr. 1001967) gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert. Kurz gesagt, wird Blut 1:1 in PBS verdünnt, und diese Suspension wird auf Lymphoprep in einem Verhältnis von 2:1 aufgeschichtet. Die Gläschen bzw. Phiolen werden für 20 min bei 25°C und 800 g zentrifugiert, und die weiße Interphasenbande wird gesammelt. Die Zellen werden in PBS, die 2 mM EDTA enthält, gewaschen.
c. Anreicherung von B-Zellen
Die B-Zelllinie (Zellen vom Typ CD19+) der PBMCs wird mittels Zellsortierung unter Einsatz magnetischer Kügelchen angereichert, wobei die folgende Verfahrensweise angewendet wird.
Die isolierten PBMCs werden mit Anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, USA, Kat.-Nr. 345776) gefärbt. Alle Schritte werden bei 4°C im Dunklen durchgeführt. Die Färbung wird mit 10 μl Anti-CD19-FITC pro 1 × 10⁶ Zellen in einem Volumen von 100 μl/1 × 10⁶ Zellen unter Verwendung von M-Puffer (PBS, pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) durchgeführt. Dies wird zu einer Färbung der B-Zelllinie der PBMCs führen. Die Zellen werden für 20 min inkubiert, gefolgt von zwei Waschschritten mit M-Puffer. Die Anti-CD 19-FITC-gefärbten Zellen werden mit Anti-FITC-konjugierten Mikrokügelchen magnetisch markiert, wobei 10 μl Anti-FITC-Magnetkügelchen (Miltenyi Biotec, Gladbach, Deutschland, Kat.-Nr. 130-042-401) pro 1 × 10⁶ Zellen in einem Volumen von 100 μl M-Puffer pro 1 × 10⁶ Zellen verwendet werden. Eine Inkubation erfolgt für 15 min, gefolgt von einem einzelnen Waschschritt mit M-Puffer. Die Zellen werden in entgastem M-Puffer resuspendiert.
Eine Säule vom Typ MACS LS (Miltenyi Biotec, Gladbach, Deutschland, Kat.-Nr. 130-042-401) wird mit entgastem M-Puffer gemäß den Vorschriften des Herstellers vorbehandelt bzw. vorbereitet. Die Suspension von Zellen, die mit Anti-CD 19-FITC gefärbt und mit Anti-FITC-Magnetkügelchen markiert sind, wird auf die Säule aufgebracht und durchfließen gelassen. Gefärbte und markierte Zellen (CD19+) werden im Magnetfeld, das die Säule umgibt, zurückgehalten werden, wohingegen ungefärbte Zellen (CD19–) die Säule passieren werden. Die Säule wird mit entgastem M-Puffer gewaschen. Das Magnetfeld wird entfernt, und die CD19+-Zellen werden gesammelt.
d. Sortierung von Plasmazellen
Das Eluat aus der MACS-Säule wird zentrifugiert und in FACS-Puffer (PBS, pH 7,2, 2% BSA) in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/60 μl FACS-Puffer resuspendiert. Anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, USA, Kat.-Nr. 345776) (10 μl/10⁶ Zellen), Anti-CD38-PE (Becton Dickenson, NJ, USA, Kat.-Nr. 555460) (10 μl/10⁶ Zellen) und Anti-CD45-PerCP (Becton Dickenson, NJ, USA, Kat.-Nr. 345809) (20 μl/10⁶ Zellen) werden zugegeben. Eine Inkubation bei 4°C für 20 min im Dunkeln wird durchgeführt, gefolgt von zweimaligem Waschen und Resuspension in FACS-Puffer.
Die Zellen werden mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) unter Verwendung der folgenden Gating-Parameter sortiert:

1. Vorwärts-Streulicht und Seitwärts-Streulicht, um Lymphozyten und Monozyten, einschließlich Plasmablasten ("plasma blasters") und Plasmazellen, zurückzuhalten und um tote Zellen und Zellen mit einem sehr hohen Seitwärts-Streulicht, die Aggregate oder Granulozyten sein können, zu vermeiden.
2. Zellen, die CD19-positiv sind und erhöhte Level an CD38 exprimieren (CD38^hi). Dies ist grundsätzlich ein "gate" hinsichtlich CD38, da die PBMCs an einer MACS-Säule bezüglich CD19-Expression angereichert worden sind, jedoch wird dies jegliche Kontaminanten offenbaren.
3. CD45-positive Zellen. Alle Lymphozyten exprimieren CD45. Jedoch regulieren Plasmazellen ihre CD45-Expression herab, verglichen mit früheren Stadien der Lymphozytendifferenzierung. Daher kann eine diskrete Population von Zellen, die Plasmazellen entsprechen, erhalten werden, wenn ein Gating hinsichtlich CD45 erfolgt.

FACS-sortierte Zellen werden als Einzelzellen direkt in einzelne Wells von 96-Well-Platten, enthaltend 5 μl PBS-Puffer, supplementiert mit 5 U RNase-Inhibitor (RNasin, Promega, Madison, USA, Kat.-Nr. N2515) pro Well, gesammelt. Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen für eine spätere RT-PCR eingefroren werden oder die Zellen können sofort für eine RT-PCR verwendet werden.
e. Verknüpfung von kognaten Paaren von variable-Region-codierenden Immunglobulin-Sequenzen
Die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Technologie wird auf die Einzelzellen angewendet, um dadurch eine kognate Verknüpfung von transkribierten variable Schwerkettenregion- und variable Leichtkettenregion-codierenden Anti-Tetanustoxoid-Sequenzen zu erzielen.
e-1. Einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR
Der Qiagen-Ein-Stufen-RT-PCR-Kit (Qiagen Kat.-Nr. 210212, Hilden, Deutschland) wird für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR im Wesentlichen gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Gefrorene 96-Well-Platten, die eine Einzelzelle pro Well enthalten, werden aus dem Tiefkühlgerät entnommen, und 15 μl RT-PCR-Reaktionsgemisch werden zu jeder Probe (Einzelzelle) gegeben, wenn die Wells frei von Eiskristallen sind.
Das RT-PCR-Reaktionsgemisch enthält in einem Gesamtvolumen von 20 μl die folgenden Reagentien:
1 × Ein-Stufen-RT-PCR-Puffer,
dNTPs in einer Endkonzentration von jeweils 400 μM,
Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch in den Konzentrationen, wie sie in Tabelle 8 angegeben sind,
0,8 μl Ein-Stufen-RT-PCR-Enzymgemisch, und
20 U RNase-Inhibitor (RNasin, Promega, Madison, USA, Kat.-Nr. N2515).
Die Zusammensetzung des Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisches ist in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8

Die Zyklusbedingungen sind wie folgt:

Reverse Transkription: 30 min 55°C

Polymerase-Aktivierung: 15 min 95°C, Inaktivierung der reversen Transkriptase und Aktivierung der Taq-Polymerase.
PCR-Reaktion:
e-2. Zusätzliche Amplifikation
Ein Mikroliter des Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktionsprodukts aus jeder Probe wird einer Semi-Nested-PCR (Biotaq-Kit, Bioline, UK, Kat.-Nr. BIO-21040) unterworfen, wie es im Wesentlichen vom Hersteller vorgeschlagen wird, wobei 96-Well-Platten eingesetzt werden. Das Gesamtvolumen jeder Reaktion beträgt 50 μl, enthaltend eine Endkonzentration von 1 × Biotaq-Puffer, 200 μM dNTPs (von jedem), 2 mM MgCl₂, 1,25 U Bio-Taq-Polymerase und die in Tabelle 9 dargestellten Primer.
Die Zyklusbedingungen sind wie folgt:
Tabelle 9
In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der genspezifischen Region.
Zehn Mikroliter einer limitierten Gruppe von Proben werden mittels Elektrophorese an 1,5%igem Agarosegel analysiert, wobei Ethidiumbromid zur Sichtbarmachung eingesetzt wird, um zu verifizieren, dass die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR erfolgreich war.
Erwartete Größe der Fragmente (die exakte Größe hängt von den Längen der variablen Regionen ab):
V_H: ~410 bp
LC: ~680 bp
Überlappungsverlängerungs-Fragment: 1070 bp
Zwei Mikroliter aus allen Proben, deren Bearbeitung in den 96-Well-Platten erfolgte und die vom gleichen Spender stammten, werden in einem Röhrchen kombiniert. Die gepoolten bzw. vereinigten Proben werden mit XhoI und NotI verdaut. Die verdauten Überlappungsverlängerungs-Fragmente werden mittels präparativer Elektrophorese an 1%igem Agarosegel gereinigt; die Überlappungsverlängerungs-Fragmente werden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und unter Verwendung eines Qiaex II-Kits (Qiagen Kat.-Nr. 20051, Hilden, Deutschland) gereinigt. Es ist nicht nötig, die kognaten Paare in dieser Stufe zu vereinigen, sofern dies nicht gewünscht wird. In diesem Fall wird jede individuelle Reaktion einer Restriktionsspaltung unterworfen werden, und die Produkte werden individuell in den unten beschriebenen Vektor kloniert.
f. Kognate Fab-Expressionsbibliothek
Eine Bibliothek von Fab-Vektoren wird erzeugt, indem der Pool von XhoI/NotI-verdauten Überlappungsverlängerungs-Fragmenten in den E. coli-Vektor JSK301 (11) mittels Ligation inseriert wird. E. coli (TOP10) wird mittels Elektroporation mit der Bibliothek von Fab-Vektoren transformiert, und die Transformanten werden auf 2 × YT-Agar, enthaltend 100 μg/ml Carbenicillin, selektiert. Plasmid-DNA wird aus Kolonien, direkt von den Agarplatten weg präpariert. Die Plasmidpräparation stammt von einer Minimalzahl von Kolonien pro Spender, entsprechend 3 × der Gesamtzahl an einzelnen Plasmazellen, die ursprünglich sortiert wurden, um die Diversität aufrecht zu erhalten. Eine Fab-Expressionsbibliothek wird erzeugt, indem eine prokaryotische Promotor- und Leaderkassette, stammend aus phh3 (Den, W. et al., 1999. J. Immunol. Methods 222, 45–57), in die resultierende Plasmidpräparation inseriert wird, und zwar durch Verdau der Plasmidpräparation mit AscI und NheI und nachfolgende Ligation. Das Bibliothekserzeugungsverfahren ist in 12 dargelegt. E. coli (TG1) wird mittels Elektroporation mit der resultierenden Fab-Expressionsbibliothek transformiert, und die Transformanten werden auf 2 × YT-Agar, enthaltend 100 μg/ml Carbenicillin, selektiert. Die individuellen Spender werden während der Verfahrensweise, die in Den et al., J Immunol Methods, 1999, Jan 1; 222(1–2): 45–47, beschrieben ist, getrennt gehalten. Sie können jedoch bei jeder beliebigen Stufe, in der dies gewünscht sein könnte, kombiniert werden.
g. Screening von Klonen
Fab-exprimierende Klone werden mittels Antigen-spezifischer ELISA-Assays auf eine TT-Antigen-Bindung durchmustert.
g-1. Master-Platten-Erzeugung und Fab-Expression
Individuelle, ausgewählte Kolonien der TG1-Zellen, die jeweils einen kognaten Fab-Expressionsvektor aus der in Stufe (f) erzeugten Bibliothek beherbergen, werden in einzelne Wells von 96-Well-Platten, enthaltend 2 × YT/100 μg/ml Amp/1% Glucose, abge impft. Die Kolonien werden über Nacht bei 37°C unter sanftem Schütteln wachsen gelassen. Diese Platten werden als Master-Platten bezeichnet, die nach Zugabe von Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 15% bei –80°C gelagert werden.
Bevor die Master-Platten gelagert werden, werden sie zur Inokulation von einer oder mehreren 384-Well-Platten, enthaltend 2 × YT/100 μg/ml Amp/0,1% Glucose, verwendet, wobei ein 96-Pin-Replikator verwendet wird. Die Platten werden verschlossen und für 2–3 h bei 37°C geschüttelt.
Die Fab-Expression wird induziert, indem ein gleiches Volumen an 2 × YT/100 μg/ml Amp/0,2 mM IPTG zugegeben wird, wodurch eine IPTG-Endkonzentration von 0,1 mM erhalten wird. Die Platten werden verschlossen und über Nacht bei 30°C geschüttelt. Am folgenden Tag werden die Fab-enthaltenden Überstände auf eine TT-Antigen-Bindungsspezifität mittels ELISA analysiert.
g-2. ELISA-Analyse
ELISA-Platten mit dreihundertvierundachzig (384) Wells (Nunc, Roskilde, Dänemark, Kat.-Nr. 265196) werden über Nacht bei 4°C mittels Tetanustoxoid (TT)-Antigen, verdünnt auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml in PBS in einem Volumen von 25 μl pro Well, beschichtet. Überschüssige Bindungsstellen der Wells werden für 1 h bei RT blockiert, indem 2% M-PBS-T (2% Magermilchpulver in PBS, 0,05% Tween 20) zugegeben werden. Die Wells werden 2 Mal mit PBS-T (PBS, 0,05% Tween 20) gewaschen.
Die Fab-enthaltenden Bakterienüberstände aus g-1. werden 1:2 in 2% M-PBS-T verdünnt und in doppelter Wiederholung auf die ELISA-Wells transferiert. Eine Inkubation wird für 1 h bei RT durchgeführt. Die Wells werden 4 Mal mit PBS-T gewaschen. Ziegeanti-Human Fab/HRP (Sigma, St. Louis, MO, USA, Kat.-Nr. A0293) als 1:10.000-Verdünnung in 2% M-PBS-T wird zu den Wells gegeben. Eine Inkubation wird für 1 h bei RT durchgeführt. Die Wells werden 4 Mal mit PBS-T gewaschen. Substrat vom Typ TMB Plus (KemEnTec, Kopenhagen, Dänemark, Kat.-Nr. 4390L) wird zugegeben, und eine Inkubation wird für 5–15 Minuten durchgeführt. Die Reaktionen werden gestoppt, indem ein gleiches Volumen 1 M H₂SO₄ zugegeben wird. Die Ausmaße der Reaktionen werden bei 450 nm in einem ELISA-Lesegerät (Multiscan Ascent, Labsystems, Franklin, USA) ausgelesen.
Die ursprünglichen Bakterienklone, die den TT-Antigen-bindenden Klonen entsprechen, werden nachfolgend aus den ursprünglichen Master-Platten geborgen bzw. entnommen. Aus den isolierten Antigen-positiven Fab-Klonen wird Plasmid-DNA präpariert, wodurch eine kognate Fab-Expressions-Unterbibliothek von TT-Antigen-bindenden Klonen erzeugt wird.
Die Klone können auch mittels eines Anti-Leichtketten-ELISA-Assays analysiert werden, um eine Korrelation zwischen der Anzahl an Antigen-bindenden Klonen und der Anzahl an Fab-exprimierenden Klonen zu erhalten. Ferner liefert eine derartige Analyse Informationen hinsichtlich der Repräsentation von kappa- und lambda-Leichtketten in den Klonen.
h. Kognate Antikörper-Expressionsbibliothek
Um die Expression von humanen Volllängen-Antikörpern zu erleichtern, müssen die kognaten variablen Regionen aus dem bakteriellen Fab-Expressionsvektor auf einen Säuger-Expressionsvektor transferiert werden, der die konstanten Domänen von einem der humanen Immunglobulin-Isotypen enthält. Ein derartiger Transfer kann entweder Klon um Klon oder massenhaft durchgeführt werden. Untenstehend ist beschrieben, wie der massenhafte Transfer durchzuführen ist.
Der massenhafte Transfer wird in zwei Stufen durchgeführt. Als Erstes werden die Plasmidpräparationen der individuell isolierten Antigen-bindenden Fab-Klone gepoolt. Die den prokaryotischen Promotor und Leader enthaltende Kassette wird mit einer Säuger-Promotor- und -Leaderkassette ersetzt, die aus der Leadersequenz der humanen alkalischen Phosphatase (AP-Leader), dem humanen Elongationsfaktor 1-alpha-Promotor (EFP), dem späten Adenovirus-Hauptpromotor (AdMLP) und der IgK-Leadersequenz besteht, indem die gepoolte Fab-Expressions-Unterbibliothek mit AscI und NheI verdaut wird, gefolgt von der Insertion einer Sauger-Promotor- und -Leaderkassette mittels einer nachfolgenden Ligation. E. coli (TOP 10) wird mittels Elektroporation mit der resultierenden Fab-Expressionsbibliothek mit ausgetauschtem Promotor transformiert, und die Transformanten werden auf 2 × YT-Agar, enthaltend 100 μg/ml Carbenicillin, selektiert. Plasmid-DNA wird aus Kolonien, direkt von den Agarplatten weg, präpariert. Die Plasmidpräparation stammt von einer Minimalzahl von Kolonien pro Spender, entsprechend etwa 3 × der Gesamtzahl an Klonen in der ursprünglichen Bibliothek, um Diversität aufrecht zu erhalten.
Als Zweites werden die kognaten variablen Regionen aus dem Fab-Expressionsvektor mit ausgetauschtem Promotor isoliert, indem die Plasmidpräparation mit XhoI und NotI verdaut wird. Das isolierte Fragment wird mittels Ligation in einen Sauger-Expressionsvektor inseriert, was in einer kognaten Antikörper-Expressionsbibliothek resultiert. Der verwendete Vektor ist im Wesentlichen der gleiche wie in 9A, abgesehen davon, dass IgL in diesem Fall der kappa-Leichtkette-codierenden Sequenz entspricht. Der oben verwendete Sauger-Expressionsvektor basiert auf dem ortsspezifischen Flp-In-System (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA, Kat.-Nr. K6010-01). E. coli (TOP10) wird mittels Elektroporation mit der resultierenden kognaten Antikörper-Expressionsbibliothek transformiert, und die Transformanten werden auf 2 × YT-Agar, enthaltend 100 μg/ml Carbenicillin, selektiert. Plasmid-DNA wird aus Kolonien, direkt von den Agarplatten weg, präpariert. Die Plasmidpräparation stammt wiederum von einer Minimalzahl von Kolonien pro Spender, entsprechend etwa 3 × der Gesamtzahl an Klonen der ursprünglichen Bibliothek, um Diversität aufrecht zu erhalten. Die resultierende Plasmidzubereitung der kognaten Antikörper-Expressionsbibliothek kann verwendet werden, um eine Säugerwirtszelle, z. B. die CHO-Zellen aus dem Flp-In-System von Invitrogen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA, Kat.-Nr. K6010-01), zu transfizieren, um stabile Sauger-Expressionszelllinien mittels Flp-Rekombinase-vermittelter Integration zu erzeugen.
Eine derartige Zelllinie kann bei der Produktion von rekombinanten polyklonalen Antikörpern verwendet werden.
Beispiel 7: Screening mittels High-Density-Membran-Assay
Die Fab-exprimierenden Klone aus Beispiel 6f werden mittels eines High-Density-Membran-Assays durchmustert.
a. Master-Platten-Erzeugung
Master-Platten werden erzeugt, wie es in Stufe g-1 von Beispiel 6 beschrieben ist.
b. Vorbereitung von PVDF-Membranen
PVDF-Membranen (Amersham, Uppsala, Schweden, Kat.-Nr. RPN2020F) werden gemäß den Anweisungen des Herstellers über Nacht bei 4°C mit TT-Antigen, verdünnt auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml in PBS, beschichtet. Überschüssige Bindungsstellen auf den Membranen werden für 1 h in 2% M-PBS (2% Magermilchpulver in PBS) blockiert. Die Membranen werden 3 Mal in PBS gewaschen. Die Membranen werden für einige Minuten in 2 × YT eingegeben bzw. damit getränkt.
c. Klonkonsolidierung
Eine Konsolidierung von Klonen in 384-Well-Platten wird durchgeführt, indem Klone aus den Master-Platten in eine oder mehrere 384-Well-Platten, enthaltend 20 μl 2 × YT/Well, unter Verwendung eines 96-Pin-Replikators transferiert werden.
Unter Verwendung eines 384-Pin-Replikators werden die Bakterien in doppelter Wiederholung auf eine oder mehrere Nylonmembranen (Amersham, Uppsala, Schweden, Kat.-Nr. RPN2020B), platziert auf 2 × YT/Carb/1% Glucose-Agarplatten, transferiert. Die Platten werden 4–6 h bei 37°C inkubiert.
d. Fab-Induktion
Die in Stufe b vorbereiteten PVDF-Membranen werden auf 2 × YT/Carb/0,1 mM IPTG-Agarplatten platziert. Die Nylonmembranen mit den wachsenden Bakterienkolonien werden über den PVDF-Membranen (eine Nylonmembran pro PVDF-Membran) auf der IPTG-enthaltenden Agarplatte platziert. Die IPTG-enthaltende Agarplatte wird bei 30°C über Nacht inkubiert, um die IPTG-induzierte Fab-Expression in den Kolonien zu begünstigen. Die Fab-Moleküle diffundieren durch die Nylonmembran auf die PVDF-Membran, wo TT-Antigen-bindende Fabs auf der Membran zurückgehalten werden.
e. Detektion
Die Nylonmembranen werden entfernt, und die PVDF-Membranen werden 2 × 5 Minuten mit PBS-T (PBS, 0,05% Tween 20) gewaschen. Die Membranen werden für 30 Minuten mit 2% M-PBS inkubiert. Die PVDF-Membranen werden 2 × 5 Minuten mit PBS-T gewaschen, gefolgt von einer Inkubation für 1 h mit Ziege-anti-Human IgG/HRP (Sigma, St. Louis, MO, USA, Kat.-Nr. A0293), 1:10.000 verdünnt in 2% M-PBS. Die PVDF-Membranen werden 3 × 5 Minuten mit PBS-T gewaschen. Schließlich werden die PVDF-Membranen für 5 Minuten mit einem chemilumineszierenden Substrat mit der Bezeichnung SuperSignal West Femto (Pierce, Rockford, Il, USA, Kat.-Nr. 34095) gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Überschüssiges Substrat wird entfernt, und die PVDF-Membranen werden unter einer CCD-Kamera zur Detektion des Chemilumineszenzsignals, das an Positionen auf der PVDF-Membran, an denen ein Fab-Fragment das TT-Antigen bindet, erzeugt werden, platziert.
Positive TT-Antigen-bindende Klone werden als Punkte auf der Darstellung bzw. dem Bild erscheinen. Der ursprüngliche Bakterienklon wird nachfolgend aus den ursprünglichen Master-Platten entnommen. Plasmid-DNA wird aus den isolierten Antigenpositiven Fab-Klonen präpariert, wodurch eine kognate Fab-Expressions-Unterbibliothek von TT-Antigen-bindenden Klonen erzeugt wird.
f. Korrelation zwischen Antigen-bindenden Klonen und Fab-exprimierenden Klonen
Die in Stufe e. entfernten Nylonmembranen werden auf eine zweite Reihe von PVDF-Membranen, beschichtet mit Anti-Leichtkette-Antikörper oder Anti-Fab-Antikörper gemäß der Verfahrensweise in Stufe b., platziert. Die Stufen d. und e. werden anschließend wiederholt.
Fab-positive Klone werden anschließend als Punkte auf der Darstellung erscheinen und eine Korrelation zwischen der Anzahl an TT-Antigen-bindenden Klonen und der Anzahl an Fab-exprimierenden Klonen kann erstellt werden.
Beispiel 8: Erläuterndes Beispiel, das die Isolation von Sequenzen, die für ein heteromeres Protein codieren, beschreibt
Das vorliegende Beispiel erläutert, wie ein trimeres Guanin-Nucleotidbindendes Protein (G-Protein) in einer einzigen Stufe unter Einsatz der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Technik der vorliegenden Erfindung isoliert werden kann. Die Familie der G-Protein-Untereinheiten ist groß, alleine bei Menschen gibt es näherungsweise 16 verschiedene alpha-Untereinheiten, 5 beta-Untereinheiten und 12 gamma-Untereinheiten. Für das vorliegende Beispiel wurden die Untereinheit GαS (GenBank-Eingangs-Nr. X04408), die Untereinheit Gβ1 (GenBank-Eingangs-Nr. AF501822) und die Untereinheit Gγ1 (GenBank-Eingangs-Nr. BCO29367) gewählt. Die Verknüpfungsverfahrensweise ist in 13 erläutert, wobei Stufe 1 die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Stufe ist und Stufe 2 die zusätzliche Amplifikation des verknüpften Produkts ist.
a. Zellen
Eine Population von humanen Leberzellen wird aus Proben chirurgischen Abfalls ("surgical discharge samples") erhalten. Die Leberzellen werden desintegriert und lysiert, Gesamt-RNA wird aus dem Lysat unter Verwendung des RNA L-Kits (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland, Kat.-Nr. 740 962.20) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert.
b. Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR
Der Qiagen-Ein-Stufen-RT-PCR-Kit (Qiagen Kat.-Nr. 210212, Hilden, Deutschland) wird für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR im Wesentlichen gemäß der Empfehlung des Herstellers verwendet.
Jedes PCR-Röhrchen enthält in einem Gesamtvolumen von 50 μl die folgenden Reagentien:
1 × Ein-Stufen-RT-PCR-Puffer,
dNTPs in einer Endkonzentration von jeweils 400 μM,
Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch in den Konzentrationen, wie sie in Tabelle 10 angegeben sind,
2 μl Ein-Stufen-RT-PCR-Enzymgemisch,
1 U/ml RNase-Inhibitor (RNasin, Promega, Madison, USA, Kat.-Nr. N2515), und
50 ng Gesamt-RNA.
Das verwendete Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch umfasst die in Tabelle 10 dargestellten Primer.
Tabelle 10
In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der genspezifischen Region.
Die verwendeten Zyklusbedingungen sind:

Reverse Transkription: 30 min 42°C

Polymerase-Aktivierung: 15 min 95°C Inaktivierung der reversen Transkriptase und Aktivierung der Taq-Polymerase.
PCR-Reaktion:
c. Amplifikations-PCR
Ein Mikroliter des Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktionsprodukts wird einer zusätzlichen PCR-Amplifikationsstufe (Biotaq-Kit, Bioline, UK, Kat.- Nr. BIO-21040), im Wesentlichen wie vom Hersteller vorgeschlagen, unterworfen. Die verwendeten Primer sind α1 und γ2, wie in Tabelle 10 dargestellt, entsprechend SEQ ID NO: 80 und 85. Das Gesamtvolumen der Reaktion beträgt 50 μl.
Die Zyklusbedingungen sind wie folgt:
Fünf Mikroliter des Reaktionsprodukts werden mittels Elektrophorese an 1%igem Agarosegel analysiert, wobei Ethidiumbromid zur Detektion verwendet wird. Es wird erwartet, dass die Größe des Produkts 2215 bp beträgt. Jedoch könnten zusätzliche unverknüpfte Fragmente der Untereinheiten vorhanden sein. Die erwarteten Größen dieser Fragmente sind Gα: 1228 bp, Gβ: 1064 bp und Gγ: 262 bp.
d. Klonierung
Das verbleibende Reaktionsprodukt wird einer Elektrophorese an 1%igem Agarosegel unterworfen, wobei Ethidiumbromid zur Detektion verwendet wird und das Überlappungsverlängerungs-Fragment von 2215 bp wird aus dem Agarosegel ausgeschnitten, unter Verwendung eines Qiaex II-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland, Kat.-Nr. 20051) gereinigt und unter Verwendung eines Klonierungs-Kits mit der Bezeichnung TOPO TA von Invitrogen (Invitrogen Kat.-Nr. 45-0641, Carlsbad, CA, USA) in pCR2.1-TOPO inseriert.
Darüber hinaus könnten Promotorsequenzen oder Ribosomenbindungsstellen stromaufwärts jeder Untereinheit-codierenden Sequenz inseriert werden, um ihre Expression ausgehend vom Vektor zu erleichtern. Die in den Überlappungsverlängerungs-Sequenzen vorhandenen Restriktionsschnittstellen sind für eine derartige Insertion anwendbar.
e. Allgemeine Erwägungen
Die Verknüpfung von Sequenzen, die für Untereinheiten, die ein heteromeres Protein darstellen, codieren, wie es oben beschrieben ist, kann bei den meisten heteromeren Proteinen, bei denen die Sequenz von individuellen Untereinheiten bekannt ist, durchgeführt werden. Darüber hinaus ist es, wenn ein Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch, das zum Amplifizieren mehrerer Mitglieder einer bestimmten Familie, z. B. aller G-Protein-α-, -β- und -γ-Untereinheiten, befähigt ist, möglich, eine beliebige Kombination von Untereinheiten ausgehend von einem Zelltyp zu identifizieren und zu verknüpfen, ohne dass zuerst analysiert werden muss, welche Familienmitglieder von welchem Zelltyp exprimiert werden. Z. B. kann das obige Beispiel unter Einsatz einer Matrize, die aus isolierten Einzelleberzellen stammt, durchgeführt werden, wobei ein Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch, das zum Amplifizieren und Verknüpfen aller 16 Gα-Untereinheiten mit den 5 Gβ-Untereinheiten und den 12 Gγ-Untereinheiten befähigt ist, eingesetzt wird. Dadurch wird identi fiziert, welche Kombination von Untereinheiten in jeder Zelle exprimiert wird und die codierenden Sequenzen, die für diese Kombination von Untereinheiten verantwortlich sind, werden gleichzeitig isoliert. Zusätzlich könnte die Verwendung von degenerierten Primern sogar dazu dienen, neue Mitglieder einer bestimmten Familie zu identifizieren.
Wenn Untereinheiten eines heteromeren Proteins unter Verwendung der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Technik der vorliegenden Erfindung verknüpft werden, sollte die insgesamte Größe des verknüpften Produkts in Betracht gezogen werden, da Beschränkungen hinsichtlich der Anzahl von Basenpaaren bestehen, die eine DNA-Polymerase amplifizieren kann. Die Deep-Vent-Polymerase von New England Biolabs, MA, USA, ist eine DNA-Polymerase, die zur Erzeugung von sehr langen Primerverlängerungen von bis zu 14.000 bp Länge befähigt ist. Theoretisch können 14.000 bp für ein Protein mit einem durchschnittlichen Gewicht von 510 kDa codieren. Es sollte somit möglich sein, codierende Sequenzen für sehr große heteromere Proteine unter Einsatz des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zu isolieren. Die Verlängerungsfähigkeit könnte möglicherweise durch Einsatz von Gemischen von DNA-Polymerasen weiter erhöht werden.
Beispiel 9: Design von Leader-Primern:
In diesem Beispiel wurde ein Multiplex-Satz von Primern, bei denen die Priming-Stelle in der Sequenz gehalten wird, die für die Leaderregion der humanen Antikörper-Schwerkette- und -kappa-Leichtkette-Familien codiert, konzipiert.
Bei Verwendung von Primern, die sich an die N-Terminus-codierenden Sequenzen der variable Region-Familien anlagern, kann ein gewisser Grad an Kreuzhybridisierung beobachtet werden. Primer einer bestimmten Genfamiliensequenz können mit der cDNA einer weiteren Familie hybridisieren, was in vielen Fällen zur Schaffung neuer Sequenzen führt. Proteine, die ausgehend von derartigen Sequenzen produziert werden, sind potentiell immunogen, wenn sie in der Behandlung verwendet werden. Allgemein können diese neuen Sequenzen mittels PCR korrigiert oder aus der Bibliothek eliminiert werden.
Eine alternative Lösung ist es, die Priming-Stelle in der Sequenz, die für die Leader-Peptidregion der variablen Antikörperregion codiert, zu positionieren. Hybridsequenzen, die als Ergebnis eines Überkreuz-Primings erzeugt werden, werden während der intrazellulären Prozessierung des Antikörpers, bei der der Peptid-Leader, der die potentiell immunogenen Sequenzen enthält, abgespalten wird, eliminiert werden, und sie werden folglich im sekretierten bzw. sezernierten Antikörperprodukt nicht vorhanden sein. Frühere Sätze von Leader-Primern zur Antikörperklonierung waren im 5'-Ende der Leader-codierenden Sequenz lokalisiert, was eine direkte eukaryotische Expression erlaubt (Campbell M.J. et al., 1992, Mol Immunol. 29, 193–203). Ungünstigerweise sind eukaryotische Leader-Peptide schlecht für eine prokaryotische Prozessierung geeignet.
Die Einfachheit, mit der Nucleinsäuresequenzen in Bakterien manipuliert bzw. gehandhabt werden, macht es attraktiv, Klonierungssysteme zu entwickeln, bei denen ein Sequenztransport bzw. Sequenz-Shuttling zwischen bakteriellen Vektoren und Vektoren für andere Wirtsorganismen möglich ist. Daher wurde im vorliegenden Beispiel ein Multiplex-Primersatz konzipiert, bei dem die Priming-Stelle an einer Position in der Leaderregion-codierenden Sequenz gehalten wird, die eine funktionelle Expression von Antikörpern oder Antikörperfragmenten sowohl in eukaryotischen als auch prokaryotischen Expressionssystemen erlaubt.
Die Sequenzerfordernisse für die Spaltung durch Signalpeptidase an der C-terminalen Region eines beliebigen Leader-Peptids scheinen für prokaryotische und eukaryotische Systeme sehr ähnlich zu sein (Nielsen H. et al., 1997, Protein Eng. 10, 1–6). Es folgt ferner, dass Mutationen in der C-terminalen Region des Leader-Peptids wahrscheinlich (nur) eine geringe Auswirkung auf die Konformation der N-terminalen Region haben und umgekehrt. Es wird somit erwartet, dass C-terminale Sequenzen zwischen Spezies ohne Funktionsverlust transferierbar sein könnten.
Das grundlegende Konzept des Primer-Designs im vorliegenden Beispiel war es, die Priming-Stelle bei den letzten sechs Kodons in der C-terminalen Region des Leader-Peptids zu platzieren. Der verbleibende Teil der Leader-codierenden Sequenz, stromaufwärts der Priming-Stelle (näherungsweise 50 Nucleotide), sollte durch den geeigneten Expressionsvektor, der zur Wirtsspezies passt, bereitgestellt werden. Beispielsweise können Vektoren, die für eine Expression in Gram-negativen Bakterien geeignet sind, mit einer partiellen oder Volllängen-PelB-Leadersequenz konzipiert werden. Für die Expression von Antikörpern in Eukaryoten wird ein Vektor mit einer partiell nativen Schwerkettenleader-codierenden Antikörper-Sequenz und einer partiell variablen kappa-Kettenleader-codierenden Sequenz geeignet sein. Ungeachtet des Expressionssystems werden die letzten sechs Aminosäuren des Leaders aus der endogenen Antikörper-Leader-codierenden Sequenz stammen, die in den Nucleinsäureabschnitt, der in den Vektor inseriert wird, enthalten sind.
Die folgenden Primersequenzen wurden zur Verwendung in der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR konzipiert (Tabelle 11). Jedoch können die Überlappungsenden (Kleinbuchstaben) leicht umkonzipiert werden, um in der Verknüpfung mittels Ligations- oder Rekombinationsverfahrensweisen zu funktionieren. Tabelle 11

M = A/T, R = A/G, Y = C/T, S = G/C. In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der genspezifischen Region.

Es sollte angemerkt werden, dass die Restriktionsschnittstellen in diesem Primer-Design verglichen mit den in den vorigen Beispielen beschriebenen Primern geringfügig modifiziert waren. Somit umfasste die Überlappungssequenz zwischen den variable-Schwerketten- und Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen eine NotI- und eine NheI-Restriktionsschnittstelle, und die vorherige NotI-Schnittstelle in konstantem kappa-Primer (C_Lκ) ist durch eine AscI-Schnittstelle ersetzt worden. Die letztere Modifikation sollte natürlich beachtet werden, wenn Primer für die zusätzliche PCR-Amplifikation konzipiert werden. Ferner sollte die NotI-Schnittstelle im Klonierungsvektor, gezeigt in 11, zu einer AscI-Schnittstelle geändert werden, und die AscI-Schnittstelle in der Promotoreinheit sollte zu einer NotI-Schnittstelle geändert werden.
Die Funktionalität hinsichtlich der Leaderspaltung ist in silico unter Verwendung von Signale, bereitgestellt von CBS an der Dänischen Technischen Universität, getestet worden.
Die chimären Leader-Peptide, die bezüglich der variablen Schwerkette getestet wurden, wurden von Nucleinsäuresequenzen codiert, bestehend aus einer trunkierten Pe1B-Sequenz, einer C-terminalen NotI-Schnittstelle (SEQ ID NO: 100: ATG AAA TAT CTT CTA CCA ACA GCG GCA GCT GGA TTA TTG GCG GCC GCC) und in Assoziation mit der NotI-Schnittstelle des genspezifischen Teil von einer von SEQ ID NO: 86 bis 92, codierend für die sechs C-terminalen Aminosäuren aus nativen V_HL-Familienmitgliedern. Alle sieben Sequenzen zeigten eine Signalpeptidspaltung in Gram-negativen Bakterien unter Verwendung des Signale-Programms.
Die chimären Leader-Peptide, die bezüglich der variablen Leichtkette getestet wurden, wurden von Nucleinsäuresequenzen codiert, bestehend aus einer trunkierten PelB-Sequenz, einer C-terminalen NheI-Schnittstelle (SEQ ID NO: 101: ATG AAA TAT TTG CTA CCA ACA GCG GCA GCT GGA TTA TTG TTA CTA GCG), und in Assoziation mit der NheI-Schnittstelle des genspezifischen Teils von einer von SEQ ID NO: 93 bis 98, codierend für die sechs C-terminalen Aminosäuren aus nativen V_LκL-Familienmitgliedern. Alle sechs Sequenzen zeigten eine Signalpeptidspaltung in Gram-negativen Bakterien unter Verwendung des Signale-Programms.
Die Sequenzen von SEQ ID NO: 100 und 101 sind für die Konstruktion eines bakteriellen Expressionsvektors, der zu dem in 11 Erläuterten sehr ähnlich ist, geeignet dahingehend, dass die AscI-Schnittstelle, die in 11 erläutert ist, durch SEQ ID NO: 100 ersetzt ist und die NheI-Schnittstelle durch SEQ ID NO: 101 ersetzt ist. Ferner besteht der Bedarf, die NotI-Schnittstelle, die in 11 erläutert ist, durch eine AscI-Schnittstelle zu ersetzen.
Der Säuger-Expressionsvektor (9) kann gleichermaßen rekonzipiert werden, um eine Expression in Säugerzellen nach dem Transfer der variable Regioncodierenden Abschnitte aus dem gerade beschriebenen bakteriellen Vektor zu ermöglichen.
Beispiel 10: In einem Röhrchen erfolgende Multiplex-RT-PCR und Verknüpfung mittels Ligation
Das vorliegende Beispiel erläutert, wie ein kognates Paar, das verknüpfte codierende Sequenzen für die variable Schwerkettenregion und die variable Leichtkettenregion umfasst, in einer in einem Röhrchen stattfindenden Reaktion erzeugt werden kann, wobei eine Ligation anstelle von Überlappungsverlängerungs-PCR verwendet wird, um eine Verknüpfung zu erhalten.
a. Multiplex-RT-PCR
Eine in unserem Labor erzeugte Zelllinie, die Fab-Moleküle mit Spezifität gegenüber Tetanustoxoid exprimiert, wird mittels Grenzwertverdünnung verteilt, um eine Einzelzelle in einem einzelnen PCR-Röhrchen zu erhalten.
Zusätzlich zu der Einzelzelle enthält jedes PCR-Röhrchen die folgenden Reagentien in einem Gesamtvolumen von 20 μl:
1 × Phusion-HF-Puffer
dNTPs in einer Endkonzentration von jeweils 200 μM
Multiplex-Primer-Gemisch in den Konzentrationen, wie sie in Tabelle 12 angegeben sind
0,8 U Phusion-Polymerase (FinnZymes, Kat.-Nr. F-530-L)
1 μl Reverse Transkriptase "Sensiscript" (Qiagen Kat.-Nr. 205213)
20 U RNase-Inhibitor Tabelle 12

W = A/T, R = A/G, S = G/C. In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der genspezifischen Region.

Die Zyklusbedingungen sind:
b. Verknüpfung mittels Ligation
Um die Verknüpfung mittels Ligation durchzuführen, werden Restriktionsenzyme und Ligase direkt zu den Multiplex-RT-PCR-Reaktionsprodukten gegeben. Alterna tiv kann die Multiplex-RT-PCR vor dieser Zugabe gereinigt werden, um das Gemisch von der Polymerase zu befreien.
Die folgenden Reagentien werden zu jedem Röhrchen in einem Gesamtvolumen von 40 μl gegeben:
1 × NEBII-Puffer
1 mM ATP
50 U XbaI (New England Biolabs, Kat.-Nr. R0145L)
25 U SpeI (New England Biolabs, Kat.-Nr. R0133S)
100 μg/ml BSA
400 U T4 DNA-Ligase (New England Biolabs, Kat.-Nr. MO202S)
Die Reaktion wird bei 16°C über Nacht inkubiert.
Die verknüpften codierenden Sequenzen der variablen Region von Schwerkette und Leichtkette werden aus dem Reaktionsgel mittels Elektrophorese und Ausschneiden der Bande von näherungsweise 1000 bp gereinigt.
In einer alternativen Version dieses Verfahrens wird die Multiplex-RT-PCR-Reaktion mit einem C_H-Primer anstelle der J_H-Primer im Multiplex-Primersatz durchgeführt. Dieser Primer kann entweder mit einem Klonierungsende ausgestattet sein, das eine im Leseraster erfolgende Insertion der variablen Schwerkettenregion in einen Expressionsvektor erlaubt, oder es kann eine Semi-Nested-PCR mit den Primern von Tabelle 5 durchgeführt werden.
Beispiel 11: Erzeugung eines rekombinanten polyklonalen Immunglobulins mit Spezifität gegenüber Tetanustoxoid
Im vorliegenden Beispiel werden Ergebnisse von einem einzelnen Spender bzw. Donor (TT03), der mit Tetanustoxoid (TT) immunisiert wurde, verwendet, um die im Fließbild von 10 dargelegten Schritte zu erläutern.
a. Spender
Acht Spender, die zuvor mit dem Tetanusvakzin immunisiert worden sind, erhielten eine Auffrischung mit Tetanusvakzin (Statens Serum Institut, Dänemark). Die Spender wurden mit den Ziffern TT01 bis TT08 bezeichnet. Sechs Tage nach der Tetanusvakzin-Auffrischung wurde den Spender eine Blutprobe von näherungsweise 200 ml in ein Röhrchen, das ein Antikoagulans enthielt, abgenommen.
Die Spender waren gesund, ohne chronische Infektionen, Autoimmunkrankheiten oder immunsuppressive Medikation, und sie hatten innerhalb der letzten 3 Monate keine Vakzinierungen.
a-1. Aufzeichnung der Spenderqualität
Zum Zeitpunkt der Immunisierung wurden den Spender Vorab-Blutproben abgenommen. Vierzehn Tage später wurden zusätzliche Blutproben genommen, um den Serumtiter zu bestimmen. Alle Spender reagierten mit einer Erhöhung des TT-Titers. Ein ELISPOT-Assay wurde ebenso aufgebaut, um die Häufigkeit von TT-spezifischen Plasmazellen zu messen. Für den ELISPOT-Assay können unterschiedliche Zellfraktionen verwendet werden, z. B. das Hauptblut von bzw. ab Tag 6, die PBMC-Fraktion, die magnetisch sortierte Fraktion oder die FACS-sortierte Fraktion. Der ELISPOT-Assay kann verwendet werden, um das Spendermaterial zu bewerten und um die Probanden mit der besten Reaktion ("best responders") zu identifizieren, bei denen dann die Sortierungsstufe und die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR weiter vorangetrieben werden können. Für den Spender TT03 wurde ein ELISPOT-Assay unter Verwendung der CD19+-Zellfraktion (siehe Abschnitt c) durchgeführt. Der ELISPOT-Assay wurde durchgeführt, wie von Lakew (Lakew, M. et al., 1997, J. Immunol. Methods 203, 193–198) beschrieben, mit geringen Modifikationen. Die Häufigkeit von TT-spezifischen Plasmazellen in der PBNC-Fraktion wurde zu 0,021% berechnet.
b. Präparation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC)
PBMCs wurden aus dem Blut unter Verwendung von Lymphoprep (Axis-Shield, Norwegen, Prod. Nr. 1001967) gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert. Kurz gesagt, wurde das Blut 1:1 in PBS verdünnt, und Lymphoprep wurde mit dieser Suspension in einem Verhältnis von 2:1 überschichtet. Die Fläschchen bzw. Phiolen wurden für 20 min, 25°C, bei 800 g zentrifugiert, und die weiße Interphasenbande wurde gesammelt. Die Zellen wurden in PBS, enthaltend 2 mM EDTA, gewaschen.
Aus den dem Spender TT03 abgenommenen 200 ml Vollblut wurden näherungsweise 2 × 10⁸ PBMCs erhalten.
c. Anreicherung von B-Zellen
Die B-Zelllinie (CD19+-Zellen) der PBMCs wurde mittels Zellsortierung unter Verwendung magnetischer Kügelchen gemäß der folgenden Verfahrensweise angereichert.
Die isolierten PBMCs wurden mit Anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, USA, Kat.-Nr. 345776) gefärbt. Alle Schritte wurden bei 4°C im Dunklen durchgeführt. Die Färbung wurde mit 10 μl Anti-CD19-FITC pro 1 × 10⁶ Zellen in einem Volumen von 100 μl pro 1 × 10⁶ Zellen unter Verwendung von M-Puffer (PBS, pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) durchgeführt. Dies resultiert in einer Färbung der B-Zelllinie der PBMCs. Die Zellen wurden für 20 min inkubiert, gefolgt von zwei Waschschritten mit M-Puffer. Die Anti-CD19-FITC-gefärbten Zellen wurden magnetisch markiert mit anti-FITC-konjugierten Mikrokügelchen, wobei 10 μl magnetische Anti-FITC-Kügelchen (Miltenyi Biotec, Gladbach, Deutschland, Katalog Nr. 130-042-401) pro 1 × 10⁶ Zellen in einem Volumen von 100 μl M-Puffer pro 1 × 10⁶ Zellen verwendet wurden. Eine Inkubation wurde für 15 min durchgeführt, gefolgt von einem einzelnen Waschschritt mit M-Puffer. Die Zellen wurden in entgastem N-Puffer resuspendiert.
Eine Säule vom Typ MACS LS (Miltenyi Biotec, Gladbach, Deutschland, Kat.-Nr. 130-042-401) wurde gemäß den Beschreibungen des Herstellers mit entgastem M-Puffer vorbehandelt bzw. vorbereitet. Die Suspension von Zellen, gefärbt mit Anti-19-FITC und markiert mit Anti-FITC-Magnetkügelchen, wurde auf die Säule aufgebracht und durchfließen gelassen. Gefärbte und markierte Zellen (CD19+) wurden in dem die Säule umgebenden Magnetfeld zurückgehalten, während ungefärbte Zellen (CD19–) die Säule passierten. Die Säule wurde mit entgastem M-Puffer gewaschen. Das Magnetfeld wurde entfernt, und die Zellen vom Typ CD 19+ wurden gesammelt.
Eine analytische Färbung des Ausgangsmaterials (PBMC), der unmarkierten Fraktion und der CD19-markierten Fraktion aus TT03 unter Verwendung von Anti-19-FITC, Anti-CD38-PE und Anti-CD35-PerCP wurde durchgeführt (14). Diese zeigt, dass die magnetische Zellsortierung in zwei unterscheidbaren Fraktionen, verglichen mit der PBMC-Fraktion, resultiert. Die CD19-negativen Zellen, gezeigt in Feld B, und die CD19-positiven Zellen, gezeigt in Feld C. Von der PBMC-Fraktion waren 11% der Zellen CD19+, das Ausmaß der Reinigung von CD19-positiven Zellen war 99,5% von R1 (das Scatter- bzw. Streulicht-Gate in 14C) für TT03.
Wie in 14C ersichtlich, zeigte die Anti-CD38/Anti-CD45-Auftragung eine unterscheidbare Population von Zellen vom Typ CD38hi, CD45in (R2), entsprechend 1,1% von R1. Diese Population enthielt die Plasmazellen und wurde während der späteren Sortierungsstufe gesammelt. Dies wies darauf hin, dass 0,12% der Zellen in der PBMC-Fraktion Plasmazellen entsprachen.
Die CD19-positive Zellfraktion wurde in FCS (Invitrogen, Kat.-Nr. 16000-044) +10% DMSO (Sigma, Kat.-Nr. D2650) für die spätere Sortierung eingefroren. Eine Analyse, wie die, die in 14 ersichtlich ist, wurde anhand der MACS-gereinigten Zellen, die eingefroren worden waren, durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Zellen intakt waren (15). Die Färbungsmuster, die in 15 ersichtlich sind, waren die gleichen, wie die, die in 14C ersichtlich sind, obgleich eine geringfügig breitere Färbungsintensität beobachtet wurde. Die Zellen, die mittels Sortierung gesammelt wurden, sind die Teilmenge bzw. Untergruppe von R1 und R2. Dies entspricht näherungsweise 1,1% der MACS-gereinigten Zellen.
d. Sortierung von Plasmazellen
Das gefrorene Eluat aus der MACS-Säule wurde aufgetaut, zentrifugiert und in FACS-Puffer (PBS, pH 7,2, 2% BSA) in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/60 μl FACS-Puffer resuspendiert. Anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, USA, Kat.-Nr. 345776) (10 μl/10⁶ Zellen), Anti-CD38-PE (Becton Dickenson, NJ, USA, Kat.-Nr. 555460) (10 μl/10⁶ Zellen) und Anti-CD45-PerCP (Becton Dickenson, NJ, USA, Kat.-Nr. 345809) (20 μl/10⁶ Zellen) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei 4°C für 20 min im Dunklen inkubiert, gefolgt von zweimaligem Waschen und Resuspension im FACS-Puffer.
Die Zellen wurden mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) unter Verwendung der folgenden Gating-Parameter sortiert:

1. Vorwärts-Streulicht und Seitwärts-Streulicht, um Lymphozyten und Monozyten, einschließlich Plasmablasten ("plasma blasters") und Plasmazellen, zurückzuhal ten und um tote Zellen mit einem sehr hohen Seitwärts-Streulicht, die Aggregate oder Granulozyten sein können, zu vermeiden.
2. Zellen, die CD19-positiv sind und erhöhte Level an CD38 exprimieren (CD38_hi). Dies ist grundsätzlich ein "gate" hinsichtlich CD38, da die PBMCs an einer MACS-Säule bezüglich CD19-Expression angereichert worden sind, jedoch wird dies jegliche Kontaminanten offenbaren.
3. CD45-intermediär positive Zellen. Alle Lymphozyten exprimieren CD45. Jedoch regulieren Plasmazellen ihre CD45-Expression herab, verglichen mit früheren Stadien der Lymphozytendifferenzierung. Daher kann eine diskrete Population von Zellen, die Plasmazellen entsprechen, erhalten werden, wenn ein Gating hinsichtlich CD45 erfolgt.

FACS-sortierte Zellen vom Spender TT03 wurden als die Teilmenge der zwei "Gates" P2 und P1 (16A bzw. 16B) gesammelt. Die Zellen waren CD38hi (FL2-A), CD45in (FL3-A) und CD19+, Letzteres aufgrund der MACS-Reinigung. Kurz gesagt, wurden die Zellen in Menge gesammelt, gezählt und in RPMI (Invitrogen, Kat.-Nr. 21875-034), enthaltend 10% FCS (Invitrogen, Kat.-Nr. 16000-044), 100 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Kat.-Nr. 15140-122), 2 mM L-Glutamin (Kat.-Nr. 25030-024), verdünnt. Die Zellen wurden anschließend in fünfzig 96-Well-PCR-Platten (ABgene, Kat.-Nr. AB-0800) zu einer Zelle pro Well in 5 μl Medium dispensiert. Die Platten wurden verschlossen und sofort eingefroren und für die spätere RT-PCR-Analyse gelagert.
e. Verknüpfung von kognaten Paaren von Sequenzen, codierend für die variable Immunglobulinregion
Die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Technologie wurde auf die vom Spender TT03 erhaltenen Einzelzellen angewendet, wodurch eine kognate Verknüpfung von transkribierten variable-Schwerkettenregion- und variable-Leichtkettenregion-codierenden Anti-Tetanustoxoid-Sequenzen erzielt wurde.
e-1. Einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR
Der Qiagen-Ein-Stufen-RT-PCR-Kit (Qiagen, Kat.-Nr. 210212, Hilden, Deutschland) wurde für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR im Wesentlichen gemäß der Empfehlung des Herstellers verwendet. Fünfzig gefrorene 96-Well-PCR-Platten, enthaltend näherungsweise eine Einzelzelle pro Well, wurden aus dem Tiefkühlgerät entnommen und sofort, wenn die Wells frei von Eiskristallen waren, wurden 15 μl RT-PCR-Reaktionsgemisch zu jedem Well gegeben.
Das RT-PCR-Reaktionsgemisch enthielt in einem Gesamtvolumen von 20 μl die folgenden Reagentien:
1 × Ein-Stufen-RT-PCR-Puffer
dNTPs in einer Endkonzentration von jeweils 400 μM
Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch in den Konzentrationen, wie sie in Tabelle 13 angegeben sind
0,8 μl Ein-Stufen-RT-PCR-Enzym-Gemisch
20 U RNase-Inhibitor (RNasin, Promega, Madison, USA, Kat.-Nr. N2515)
Die Zusammensetzung des Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisches ist in Tabelle 13 dargestellt. Tabelle 13

W = A/T, S = G/C, R = A/G. In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der Gen-spezifischen Region.

Die Zyklusbedingungen waren wie folgt:

Reverse Transkription: 30 min 55°C

Polymerase-Aktivierung: 15 min 95°C Inaktivierung der reversen Transkriptase und Aktivierung der Taq-Polymerase.
PCR-Reaktion:
e-2. Zusätzliche Amplifikation
Ein Mikroliter des Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Reaktionsprodukts aus jeder Probe wurde einer Semi-Nested-PCR (Biotaq-Kit, Bioline, UK, Kat. Nr. BIO-21040) unterworfen, im Wesentlichen wie es vom Hersteller vorgeschlagen wird, wobei 96-Well-PCR-Platten (ABgene, Kat. Nr. AB-0800) eingesetzt wurden. Das Gesamtvolumen jeder Reaktion betrug 50 μl, enthaltend eine Endkonzentration von 1 × Biotaq-Puffer, 200 μM dNTPs (von jedem), 2 mM MgCl₂, 1,25 U BioTaq-Polymerase und die in Tabelle 14 angegebenen Primer.
Tabelle 14
In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der Gen-spezifischen Region.
Die Zyklusbedingungen waren wie folgt:
Zehn Mikroliter jeder Probe aus Reihe A, Well 1–12 aus jeder Platte, wurden mittels Elektrophorese an 1,5%igem Agarosegel analysiert, wobei Ethidiumbromid zur Sichtbarmachung verwendet wurde, um zu verifizieren, dass die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR erfolgreich war. Die erwartete Größe des Überlappungsverlängerungs-Fragments betrug näherungsweise 1070 bp (die exakte Größe hängt von den Längen der variablen Regionen ab). 17 zeigt Proben aus acht 96-Well-Platten. Die durchschnittliche Anzahl erfolgreicher Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Fragmente aus 50 96-Well-Platten wurde auf acht pro Platte geschätzt. Somit wurde die Gesamtzahl erfolgreicher Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Fragmente zu näherungsweise 400 geschätzt.
Zehn Mikroliter aus allen durchgeführten Reaktionen, die in den 96-Well-Platten abliefen, stammend vom gleichen Spender, wurden in einem einzelnen Röhrchen konsolidiert. Ein Aliquot, bestehend aus 200 μl der gepoolten PCR-Produkte, wurde nachfolgend unter Verwendung eines PCR-Reinigungs-Kits mit der Bezeichnung QIAquick gemäß der Verfahrensweise des Herstellers gereinigt (Qiagen Kat. Nr. 28106, Hilden, Deutschland), wobei 60 Mikroliter vom Puffer EB zur Flution verwendet wurden. Der gereinigte Pool von Überlappungs-PCR-Produkten wurden mit XhoI und NotI verdaut und nachfolgend mittels präparativer Elektrophorese an 1%igem Agarosegel gereinigt; die Überlappungsverlängerungs-Fragmente wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und unter Verwendung eines Qiaex II-Kits (Qiagen Kat. Nr. 20051, Hilden, Deutschland) gereinigt.
f. Kognate Fab-Expressionsbibliothek
Eine Fab-Expressionsbibliothek wurde mittels einer zweistufigen Ligationsverfahrensweise erzeugt. Anfänglich wurde der Pool von verdauten Überlappungsverlängerungs-Fragmenten, oben beschrieben, in den XhoI/NotI-verdauten E. coli-Vektor JSK301 (11) ligiert. Elektrokompetente E. coli-Zellen (XL1-Blue, Elektroporations-kompetent, Stratagen, Kat. Nr. 200228, La Jolla, USA) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Ligationsprodukt nachfolgend transformiert. Die transformierten E. coli-Zellen wurden auf 2 × YT-Agar, enthaltend 100 μg/ml Carbenicillin, ausplattiert bzw. ausgestrichen. Biomasse, die näherungsweise 10¹⁰–10¹¹ Zellen, stammend aus einer Anzahl von unabhängigen Kolonien, die die Gesamtzahl an Überlappungs-PCR-Produkten wenigstens 5-fach übertraf, entsprach, wurde als Ausgangsmaterial für die Plasmidpraparation unter Verwendung des Kits mit der Bezeichnung Qiagen Plasmid preparation Maxi (Qiagen Kat. Nr. 12163, Hilden, Deutschland) verwendet. Um die Fab-Expression der klonierten kognaten verknüpften VH- und VL-codierenden Sequenzen zu ermöglichen, wurde eine prokaryotische Promotor- und Leaderkassette in einer zweiten Ligationsstufe inseriert. Das verwendete bidirektionale Promotorfragment (SEQ ID NO 321) wurde aus dem Elternvektor ("parental") JSK301 mittels AscI/NheI-Verdau extrahiert. Der gereinigte Pool von Plasmiden wurde gleichermaßen mit den Restriktionsendonucleasen AscI/NheI verdaut und wie zuvor beschrieben an Gel gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden nachfolgend ligiert und elektrokompetente E. coli-Zellen (TG1, Stratagene, Kat. Nr. 200123, La Jolla, USA) wurden damit transformiert und nachfolgend auf 2 × YT-Agar, enthaltend 100 μg/ml Carbenicillin und 1% Glucose ("glycose"), ausplattiert. Das Fab-Expressionsbibliothek-Erzeugungsverfahren ist in 12 dargelegt.
g. Screening von Klonen
Fab-exprimierende Klone wurden mittels Antigen-spezifischer ELISA-Assays auf TT-Antigen-Bindung durchmustert.
g-1. Master-Platten-Erzeugung und Fab-Expression
Individuell ausgewählte Kolonien der TG1-Zellen, die jeweils einen kognaten Expressionsvektor aus der Bibliothek, die wie im Abschnitt (f) erzeugt wurde, beherbergen, wurden in einzelne Wells von 96-Well-Platten, enthaltend 2 × YT/100 μg/ml Carb/1% Glucose, abgeimpft. Die Platten wurden unter sanftem Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert. Vier 96-Well-Platten wurden in den Wells einer 384-Well-Platte, enthaltend 2 × YT/100 μg/ml Carb/1% Glucose, konsolidiert, wobei 96-Pin-Replikatoren verwendet wurden. Die 384-Well-Platten wurden tagsüber bei 37°C inkubiert. Diese Platten werden als Master-Platten bezeichnet, und sie wurden nach Zugabe von Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 15% bei –80°C gelagert.
Die Master-Platten wurden zur Inokulation von Platten mit 384 tiefen Wells ("384 Deep Well plates"), enthaltend 2 × YT/100 μg/ml Carb 0,1% Glucose, verwendet, wobei ein 96-Pin-Replikator verwendet wurde. Die Platten wurden verschlossen und unter Schütteln für 2–3 h bei 37°C inkubiert.
Die Fab-Expression wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens von 2 × YT/100 μg/ml Carb/0,2 mM IPTG, wodurch eine IPTG-Endkonzentration von 0,1 mM erhalten wurde, induziert. Die Platten wurden verschlossen und unter Schütteln über Nacht bei 30°C inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Fab-enthaltenden Überstande mittels ELISA bezüglich TT-Antigen-Bindungsspezifität analysiert.
g-2. ELISA-Analyse
ELISA-Platten mit dreihundertvierundachzig (384) Wells (Corning Inc., Corning, NY, USA, Kat. Nr. 3700) wurden über Nacht bei 4°C mit Tetanustoxoid (TT)-Antigen, verdünnt auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml in PBS, in einem Volumen von 25 μl pro Well, beschichtet. Überschüssige Bindungsstellen der Wells wurden für 1 h bei Raumtemperatur (RT) blockiert, indem 2% M-PBS-T (2% Magermilchpulver in PBS, 0,05% Tween 20) zugegeben wurde. Die Wells wurden 2 Mal mit PBS-T (PBS, 0,05% Tween 20) gewaschen.
Die Fab-enthaltenden bakteriellen Überstände aus Abschnitt (g-1) wurden 1:2 in 2% M-PBS-T verdünnt und in doppelter Wiederholung auf die ELISA-Wells transferiert. Die Inkubation erfolgte für 1 h bei RT. Die Wells wurden 4 Mal mit PBS-T gewaschen. Ziegeanti-Human Fab/HRP (Sigma, St. Louis, MO, USA, Kat. Nr. A0293), 1:10.000 Verdünnung in 2% M-PBS-T, wurde zu den Wells gegeben. Eine Inkubation erfolgte für 1 h bei RT. Die Wells wurden 4 Mal mit PBS-T gewaschen. Ein Substrat mit der Bezeichnung TMB Plus (KemEnTec, Kopenhagen, Dänemark, Kat. Nr. 4390L) wurde zugegeben, und eine Inkubation wurde für 5–15 Minuten durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe eines gleichen Volumens 1 M H₂SO₄ gestoppt und unter Verwendung eines Spektralphotometers bei 450 nm analysiert (Multiscan Ascent, Labsystems, Franklin, USA).
Die ursprünglichen Bakterienklone, die TT-Antigen-bindenden Klonen entsprechen, können nachfolgend aus den ursprünglichen Master-Platten entnommen werden. Plasmid-DNA kann aus den isolierten Antigen-positiven Fab-Klonen präpariert werden, wodurch eine kognate Fab-Expressionsbibliothek von TT-Antigen-bindenden Klonen erzeugt wird.
Eine Teilmenge der Klone wurde mittels eines Anti-kappa-ELISA-Assays weiter analysiert, um eine Korrelation zwischen der Anzahl Antigen-bindender Klone und der Anzahl Fab-exprimierender Klone zu erhalten. Der Anti-kappa-Assay wurde allgemein durchgeführt, wie der TT-Assay, abgesehen davon, dass die Wells mit einer 1:1000-Verdünnung von Ziege-anti-Human-kappa-Antikörper (Caltag, Californien, USA, Kat. Nr. H16000) unter Verwendung eines Carbonatpuffers, pH 9,6, beschichtet wurden.
g-3. Screening-Ergebnisse
Klone aus vier 384-Well-Platten wurden hinsichtlich der Reaktivität mit Anti-kappa-AB und TT unter Verwendung von ELISA-Assays gemäß der Verfahrensweise, die in g-2 beschrieben ist, durchmustert. Die Ergebnisse, die erhalten wurden, sind in den Tabellen 15 bis 19 zusammengefasst. Die Anti-kappa-ELISA-Ergebnisse informieren über die Expression von Fab-Fragmenten in einem gegebenen Klon, die TT-ELISA-Ergebnisse informieren über die Funktionalität der Fab-Fragmente. Tabelle 15 ELISA-Screening, Anti-kappa-Beschichtung (insgesamt 1440 Klone)

Platte # 2 × Hintergrund 3 × Hintergrund 4 × Hintergrund

G050 105 79 73

G051 93 79 68

G052 120 96 73

G053 164 141 125

Summe 482 395 339

% Fab-positive Klone 34% 27% 24%
Von 1440 analysierten Einzelklonen zeigten 482 Klone oder 34% Antikappa-Reaktivität bei einem Level, der 2 × Hintergrundreaktivität übertraf. 395 Klone oder 27% der Klone zeigten Reaktivität über 3 × Hintergrund, usw.
Die gleichen Klone wurden auf TT-Antigen-Reaktivität mittels ELISA analysiert, und die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 16 angegeben: Tabelle 16 ELISA-Screening, TT-Beschichtung (insgesamt 1440 Klone)

Platte # 2 × Hintergrund 3 × Hintergrund 4 × Hintergrund

G050 26 19 17

G051 24 18 15

G052 34 31 24

G053 46 36 30

Summe 130 104 86

% TT-positive Klone 9,0% 7,2% 6,1%
Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, dass 9,0% der Klone Reaktivität mit TT mit 2 × Hintergrund (definiert als das Signal, das durch die Reaktivität eines Fab-Fragments mit einer irrelevanten Spezifität erhalten wird) zeigten. 104 Klone reagierten mit 3 × Hintergrund (7,2%) usw.
Von den Fab-positiven Klonen (insgesamt 482 Klone) zeigten näherungsweise 27% der Klone (130/482) Reaktivität mit TT mit dem 2 × Hintergrundlevel. Dieser Level ändert sich nicht signifikant bei den anderen Hintergrund-Leveln.

Sechs 384-Well-Platten wurden auf Klone mit TT-Reaktivität durchmustert. Die Anzahl von Klonen, die zu Reaktivität mit dem Antigen führen, ist in der Tabelle 17 gezeigt. Mit diesen Platten wurde kein Anti-kappa-ELISA durchgeführt. Tabelle 17 ELISA-Screening, TT-Beschichtung (insgesamt 2160 Klone)

Platte #	2 × Hintergrund	3 × Hintergrund	4 × Hintergrund
G054	82	65	52
G055	30	24	21
G056	25	23	21
G057	30	28	26
G058	24	21	19
G059	18	14	13
Summe	209	175	151
% TT-positive Klone	9,7%	8,1%	7,0%

Der prozentuale Anteil von TT-positiven Klonen in den Platten G054-G059 war mit dem vergleichbar, der in den Platten G050–G053 festgestellt wurde (Tabelle 16).
Die Ergebnisse von allen Klonen, die gegen TT durchmustert wurden (Tabelle 16 und 17), sind in Tabelle 18 zusammengefasst. Tabelle 18 Alle durchmusterten Klone, TT-reaktive Klone

Platten 2 × Hintergrund 3 × Hintergrund 4 × Hintergrund

G050–G053 130 104 86

G054–G059 209 175 151

Summe 339 279 237

% der Gesamtzahl (3600) 9,4% 7,8% 6,6%
Zusammenfassend zeigte eine Gesamtzahl von 339 Klonen Reaktivität mit TT mit wenigstens 2 × Hintergrund-Level (Tabelle 18). Dies entspricht 9,4% aller durchmusterten Klone.
Alle positiven Klone, die Reaktivität mit TT mit 2 × Hintergrund zeigten, wurden in 96-Well-Platten inokuliert, wie zuvor beschrieben, und zwar ausgehend von der Master-Platte. Am nächsten Tag wurden die Bakterien mittels Zentrifugation bei 4000 Upm für 15 Minuten gesammelt, und das Pellet wurde in 0,8 mM EDTA, 0,4 × PBS, 0,8 M NaCl resuspendiert und für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Der Periplasmaextrakt wurde mittels Zentrifugation gesammelt, und die Reaktivität der Klone wurde weiter analysiert. Hier werden Ergebnisse aus einer derartigen Platte (G060) bezüglich Reaktivität mit Anti-kappa (18), Ovalbumin (nicht-verwandtes Antigen) (19), TT (20) und aus einem einstufigen kompetitiven Assay unter Verwendung einer Konzentration von 10^–7 M TT-Antigen in Lösung (21) ge zeigt. Diese ELISA-Assays wurden mit dem gleichen Periplasmaextrakt bei der gleichen Verdünnung durchgeführt.
Die meisten der Klone exprimierten Fab-Fragmente (90/96) (13), und keine Klone reagierten mit Ovalbumin (19). Die Reaktivität mit immobilisiertem TT wurde durch TT in Lösung verringert oder vollständig inhibiert (21), was darauf hinweist, dass die Klone spezifisch mit TT reagieren. Die Reaktivität der Klone in Platte G060 ist in Tabelle 19 zusammengefasst. Tabelle 19 Zusammenfassung bezüglich der G060-Platte (Gesamtzahl von 96 Klonen)

Hintergrund-Level Anti-kappa-positiv TT-positiv

2 × 94% (90/96) 74% (71/96)

3 × 91% (87/96) 72% (69/96)

4 × 84% (81/96) 69% (66/96)
h. Diversitätsanalyse und Bestätigung bzw. Freigabe von Klonen
Plasmide, isoliert aus 47 Klonen (aus der Platte G060) aus der kognaten TT-Antigen-bindenden Fab-Expressions-Unterbibliothek, wurden einer Sequenzanalyse unterworfen. Die für die variable Schwerkette codierenden Sequenzen wurden unter Verwendung des Primers LSN-HCP:
AGGAAACAGGAGATATACAT (SEQ ID NO: 131), der sich an den P tac-Promotor anlagert, sequenziert, und die für die Leichtkette codierenden Sequenzen wurden unter Verwendung des Primers LSN-LCP:
TCGCCAAGGAGACAGTCATA (SEQ ID NO: 132), der sich an den P lac-Promotor anlagert, sequenziert. Die Sequenzdaten wurden unter Verwendung einer Software mit der Bezeichnung Vektor NTI (Informax, Frederick, MD, USA) analysiert. Die Sequenzdaten der Schwerkette wurden auf ein Basenpaar 5' der stromaufwärtigen AscI-Restriktionsschnittstelle und direkt 3' der stromabwärtigen XhoI-Restriktionsschnittstelle beschnitten. Die Leichtketten-Sequenzdaten wurden auf das zweite 5'-Basenpaar der stromaufwärtigen NheI-Restriktionsschnittstelle und 3' des letzten Kodons "AAA", codierend für das C-terminale Lysin der variablen Kette, beschnitten. Die Beschneidung ("trimming") wurde durchgeführt, um die weitere Analyse, wie z. B. die Translation jeder DNA-Sequenz, zu erleichtern.
Die für die variable Schwer- und Leichtkette codierenden Sequenzen wurden hinsichtlich der Keimbahn-Genverwendung ("germline gene usage") analysiert, indem die Sequenzen mit der "V-base germline variable region sequence"-Datenbank (MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) verglichen wurden. Das am engsten verwandte Keimbahnallel wurde somit für jede Sequenz bestimmt, die ein V-Genrepertoire, stammend aus 12 unterschiedlichen Keimbahnallelen für die Schwerkette, die zur VH-Familie VH1 bis VH5 gehören, und 8 unterschiedlichen Keimbahnallelen für die variable kappa-Kette, die zu VKI, VKIII und VKIV gehören, zeigt (Tabelle 20).
Darüber hinaus wurden die variablen Gensequenzen in Proteinsequenzen translatiert, die unter Verwendung der AlignX-Software (Informax, Frederick, MD, USA) angeordnet wurden, wie in 22 und 23 dargestellt. Auf der Basis der Proteinsequenz-Alignments bzw. -Anordnungen konnten die Sequenzen der variablen Ketten in Gruppen gemäß V(D)J-Umordnungsereignissen kategorisiert werden, bezeichnet mit H für die variable Schwerkettensequenz und mit L für die variable kappa-Kettensequenz, gefolgt von einer einzigartigen Zahl. In jeder Umordnungsgruppe wurden die Sequenzen gemäß dem Reifungsgenotyp (M-Typ in Tabelle 20) innerhalb der CDR1-, -2- und -3-Regionen kategorisiert, wiedergegeben durch einen Kleinbuchstaben in alphabetischer Folge. Sieben der Klone wiesen vorzeitige Stoppkodons auf, wovon 6 Klone eine "amber"-Mutation (TAG) (Klon-IDs g060:b12, d08, f06, c12, f03, c04) waren, und 1 Klon war eine "opal"-Mutation (TAG) (Klon-ID g060:h12). Diese Kodons wurden durch E. coli höchstwahrscheinlich unterdrückt, was in funktionellen Fab-Fragmenten resultiert. Vier dieser Klone waren Mitglieder von Gruppen, die ähnliche Klone enthalten, was sie redundant macht. Zusätzliche Klone müssten analysiert werden, um die drei verbleibenden Klone mit vorzeitigen Stoppkodons zu ersetzen, da sie einzelne Mitglieder ihrer Gruppen waren. Alternativ könnten die Sequenzen mit molekularbiologischen Standardtechniken, wie z. B. PCR, korrigiert werden, indem das Stoppkodon durch ein geeignetes Kodon ersetzt wird.
Die 47 analysierten V-Region-Sequenzen könnten in 20 einzigartigen V(D)J-Umordnungsgruppen (in Tabelle 20 als "Gruppen" bezeichnet) für sowohl das variable Schwer(ketten)- als auch das variable kappa(-Ketten)-Gen unterteilt werden. Vier Umordnungsgruppen könnten ferner in 1 bis 4 Reifungstypen (a bis d) unterteilt werden, was in 27 einzigartigen Antikörper-codierenden Sequenzen resultiert (Tabelle 12). Allgemein kombinieren spezifische Schwerketten-Umordnungsgruppen mit spezifischen Leichtketten-Umordnungsgruppen (H1 mit L1, H12 mit L24, und so weiter). Ferner passt der Reifungstyp zwischen Paaren von variable-Schwerkette- und den variable-Leichtkette-codierenden Sequenzen (z. B. H4c passt zu L13c). Eine derartige Stringenz bei der Paarung zwischen Umordnungsgruppen und Reifungstypen weist auf eine kognate Paarung der variable-Region-codierenden Sequenzen hin.
Jedoch ist die Schwerketten-Umordnungsgruppe H4 eine Ausnahme. H4 paart mit zwei unterschiedlichen Leichtketten, L28 und L13. L13 war für H4 einzigartig, umfassend die Reifungstypen a, b und c, die zu den L13-Reifungstypen passen. Andererseits wurde auch festgestellt, dass L28 mit dem einzigen Mitglied in der Schwerkettengruppe H2 paarte. Zwei von sieben H4a-Schwerkettensequenzen paaren mit der Schwerkette L13a, und fünf von sieben H4a-Schwerkettensequenzen paaren mit L28a. Zusammengefasst legen diese Beobachtungen ein Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR-Ereignis nahe, bei dem zwei TT-spezifische Antikörper-produzierende Plasmazellen mit den Genotyp-Kombinationen H2-L28 und H4a-L13a in einem einzelnen Well vorhanden waren. Seltene Verwürfelungsereignisse der Leichtketten- und Schwerketten-Genpaarung, wie z. B. bei H2 und H4a mit L28, wurden erwartet, da das Experiment auf der Grenzwertverdünnung von Plasmazellen basierte.
Die Sequenzidentität zwischen individuellen kognaten Paaren der variable-Schwerkette- und variable-Leichtkette-codierenden Sequenzen aus der gleichen Gruppe und dem gleichen Reifungstyp beträgt wenigstens 90%, und vorzugsweise wenigstens 95%. Am Beispiel g060g03 und g060a01 aus der Gruppe H1, Reifungstyp a: der Klon g060g03 entspricht dem Nucleinsäure-("nucl.") SEQ ID-Paar 168:215, wobei die für die variable Schwerkette codierende Sequenz SEQ ID NO: 168 entspricht und die für die variable Leichtkette codierende Sequenz SEQ ID NO: 215 entspricht. Der Klon g060a01 entspricht dem Nucleinsäure-SEQ ID-Paar 133:180. Wenn SEQ ID NO: 168 mit SEQ ID NO: 133 (die variablen Schwerketten) angeglichen wird, sind 4/369 Basen nicht identisch, und für die variablen Leichtketten (SEQ ID NO: 215 und 180) sind 8/327 Basen nicht identisch. Dies entspricht einer Sequenzidentität von 98,3% zwischen diesen kognaten Paaren (g060g03 und g060a01). Wenn jedoch die Sequenzidentität zwischen unterschiedlichen Gruppen betrachtet wird, wird nicht erwartet, dass die Sequenzidentität hoch sein wird, da es sich um eine polyklonale Unterbibliothek handelt und Diversität erwünscht ist. In diesem speziellen Beispiel beträgt die geringste Identität zwischen den kognaten Paaren näherungsweise 40% (z. B. g060b11 und g060h11 besitzen eine Sequenzidentität von 39,5%).
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Unterbibliothek von kognaten Paaren von Immunglobulin-variable-Schwerkettenregion- und -variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen, wobei die Immunglobuline, die ausgehend von der Bibliothek erhältlich sind, zur Reaktion mit oder Bindung an Tetanustoxin befähigt sind.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine derartige Unterbibliothek von kognaten Paaren von Immunglobulin-variable-Schwerkettenregion und -variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenzen, umfassend individuelle kognate Paare mit wenigstens 90% Sequenzidentität mit einem individuellen SEQ ID-Paar, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID-Paaren 135:182, 168:215, 146:193, 151:198, 173:220, 152:199, 164:211, 148:195, 137:184, 169:216, 138:185, 143:190, 161:208, 166:213, 157:204, 139:186, 134:181, 150:197, 156:203, 158:205, 170:217, 178:225, 141:188 oder 144:191.
i. Apparente Affinitäten
Ein kompetitiver bzw. Verdrängungsassay wurde aufgebaut, um die apparente Affinität oder den IC₅₀-Wert von ausgewählten Klonen aus der Platte g060 zu bestimmen.
Kurz gesagt, wurden Fab-Fragmente wie folgt in 50 ml-Kulturen exprimiert: 50 ml 2 × YT/100 μg/ml Carb/0,1% Glucose wurden zu 0,5 ml Übemachtkultur gegeben, und es wurde für näherungsweise 2 h bei 37°C geschüttelt. IPTG wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben, und das Schütteln wurde über Nacht bei 30°C fortgesetzt. Am nächsten Tag wurden die Bakterien mittels Zentrifugation bei 4000 Upm für 15 Minuten gesammelt, und das Pellet wurde in 1 ml 0,8 mM EDTA, 0,4 × PBS, 0,8 M NaCl resuspendiert und für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Der Periplasmaextrakt wurde mittels Zentrifugation gesammelt und bei –20°C gelagert.
Der kompetitive Assay wurde wie folgt durchgeführt: Die Periplasmaextrakte in geeigneten Verdünnungen, abgeschätzt mittels Titration, wurden in eine Reihe von Röhrchen gegeben. Als Positivkontrolle wurde das aus dem Phagendisplay stammende Fab-Fragment mp584, abgeleitet von der humanen Hybridomzelllinie HB8501, die einen Anti-TT-Antikörper exprimiert, verwendet. Lösliches TT wurde zum ersten Röhrchen in einer Konzentration von 100 nM gegeben und nachfolgend in 4-fachen Stufen in den folgenden Röhrchen verdünnt, was eine Gesamtzahl von sieben Verdünnungen von TT (von 100 nM bis 25 pM) ergibt.
Die Reaktionen wurden für näherungsweise 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden auf ELISA-Platten, beschichtet mit TT mit 1 μg/ml, transferiert und wie zuvor beschrieben blockiert. Die Platten wurden für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von 4 × Waschen mit PBS-T. Ziege-anti-Human Fab/HRP wurde in einer Verdünnung von 1:10.000 zugegeben, und es erfolgte eine Inkubation für 1 h. Ein Substrat mit der Bezeichnung TMB Plus (KemEnTech, Dänemark, Kat. Nr. 4390A) wurde zugegeben, und eine Inkubation wurde für näherungsweise 10 Minuten durchgeführt, und die Reaktionen wurden mit 1 M H₂SO₄ gestoppt. Die Platten wurden bei 450 nm ausgelesen. Die Daten sind in 24 aufgetragen.

Die apparenten Affinitäten der analysierten Klone sind in Tabelle 21 wiedergegeben: Tabelle 21

Klon	Apparente Affinität
g060a10	0,50 nM
g060b06	0,60 nM
g060b12	1,2 nM
g060c04	0,55 nM
g060d04	1,1 nM
g060f01	1,2 nM
g060g04	0,9 nM
g060g07	0,35 nM
g060h11	3,0 nM
mp584 (positive Kontrolle)	6,0 nM

Wie in Tabelle 21 ersichtlich, weisen die Fab-Fragmente apparente Affinitäten im unteren nanomolaren oder oberen picomolaren Bereich auf. Darüber hinaus weisen alle kognaten gepaarten Fab-Fragmente eine höhere apparente Affinität auf als die des aus dem Phagendisplay stammenden Fab-Fragments.
j. Zusammenfassung
Beim Spender TT03 wurde die Häufigkeit von TT-spezifischen Plasmazellen in der Fraktion der peripheren Blutmonozyten zu 0,022% berechnet. Ausgehend von TT03 wurden näherungsweise 400 kognate Paare erzeugt. 3600 Klone aus den Zellen, die mit der Bibliothek kognater Paare transformiert wurden, wurden unter Verwendung von ELISA durchmustert, von diesen zeigten 339 Klone TT-Reaktivität im ELISA-Screening. 47 dieser Klone wurden bezüglich ihrer klonalen Diversität analysiert. Von diesen 47 Klonen erwiesen sich 27 als ähnlich zu einzigartigen nicht-verwürfelten variable-Region-codierenden Sequenzen. Drei von diesen Klonen enthielten ein vorzeitiges Stopp-Kodon, das vor einem Transfer in einen Säuger-Expressionsvektor korrigiert werden muss. Der Transfer in Säuger-Expressionsvektoren wurde in Beispiel 1, Abschnitt h, beschrieben. Die apparenten Affinitäten wurden an ausgewählten Klonen gemessen und reichten vom unteren nanomolaren bis zum oberen picomolaren Bereich.
k. Perspektiven
Das Tetanustoxin ist mit einer Letaldosis von einigen Nanogramm eine der stärksten bekannten toxischen Substanzen. Das Toxin wird von Clostridium tetani produziert, einem Bodenbakterium, das auch im Verdauungstrakt von bis zu 25% der Menschen vorhanden ist. Das Tetanus-Immunisierungsprogramm hat die Erkrankung in der westlichen Hemisphäre praktisch ausgelöscht, obgleich jährlich noch 100–200 Fälle in den größeren westlichen Ländern beobachtet werden, wobei die fallbezogene Sterblichkeitsrate 50% beträgt. In den Entwicklungsländern ist die Anzahl von Fällen beträchtlich höher. Das Bakterienwachstum in kontaminierten, durchdringenden Wunden kann zu einer Toxinfreisetzung, die schlussendlich zu Rigor bzw. Starre, Spasmen, Atemlähmung und Tod führt, führen.
Hyperimmune Immunglobulinprodukte, isoliert aus menschlichen Blutspendern mit einem hohen Titer an Antikörperreaktion gegen Tetanustoxoid, können verwendet werden, um Tetanus zu verhindern oder, falls (die Behandlung) früh eingeleitet wird, um etablierten Tetanus zu behandeln, auch in Zusammenhang mit einer aktiven Immunisierung. In den Entwicklungsländern wird jedoch aufgrund der Knappheit des humanen Produkts von Pferden stammendes hyperimmunes Anti-Tetanustoxoid verwendet. Rekombinante monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen Tetanustoxoid besitzen das Potential hyperimmune Globulinprodukte für die therapeutische und/oder prophylaktische Verwendung zu ersetzen. Rekombinante monoklonale Antikörper, die aus der herkömmlichen Hybridomtechnologie herrühren, sind als gegen TT wirksam beschrieben worden (Chin, J. et al., 2003. Biologicals 31, 45–53). Interessanterweise wurde eine synergistische Wirkung beobachtet, wenn zwei monoklonale Antikörper gemischt wurden. Folglich könnte ein rekombinanter polyklonaler Anti-Tetanustoxoid-Antikörper, der zur Reaktion mit oder Bindung an Tetanustoxin befähigt ist, potentiell sehr wirksam sein bei der Behandlung oder beim prophylaktischen Schutz von Patienten, die mit dem Risiko der Entwicklung von Tetanus behaftet sind.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes polyklonales Immunglobulin oder Fragmente davon, befähigt zur Reaktion mit oder Bindung an Tetanustoxin.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes polyklonales Immunglobulin, befähigt zur Reaktion mit oder Bindung an Tetanustoxin, das aus kognaten Paaren der variablen Schwerkettenregion und variablen Leichtkettenregion von Immunglobulin besteht.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes polyklonales Immunglobulin, befähigt zur Reaktion mit oder Bindung an Tetanustoxin, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes polyklonales Immunglobulin, befähigt zur Reaktion mit oder Bindung an Tetanustoxin, das individuelle Paare von kognaten Paaren von variabler Schwerkettenregion und variabler Leichtkettenregion von Immunglobulin mit wenigstens 90% Sequenzidentität mit bzw. bei einem individuellen SEQ ID-Paar, ausgewählt aus den SEQ ID-Paaren 229:276, 262:309, 240:287, 245:292, 267:314, 246:293, 258:305, 242:289, 231:278, 263:310, 232:279, 237:284, 255:302, 260:307, 251:298, 233:280, 228:275, 244:291, 250:297, 252:299, 264:311, 272:319, 235:282 oder 238:285, umfasst.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen rekombinanten polyklonalen Antikörper, der zur Reaktion mit oder Bindung an Tetanustoxin befähigt ist, als aktiven Inhaltsstoff, die für die Behandlung oder Prävention eines Tetanus gedacht ist. Vorzugsweise wird der rekombinante polyklonale Antikörper mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipiens kombiniert.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines rekombinanten polyklonalen Immunglobulins, das zur Reaktion mit oder Bindung an Tetanustoxin befähigt ist, als Medikament zur Behandlung oder zum prophylaktischen Schutz eines Patienten, der mit dem Risiko der Entwicklung von Tetanus behaftet ist.
Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Prävention bei einem Patienten oder zur Behandlung eines Patienten, der mit dem Risiko der Entwicklung von Tetanus behaftet ist, wobei einem Patienten, der dessen bedarf, eine Zusammensetzung verabreicht wird, die einen rekombinanten polyklonalen Antikörper, der zur Reaktion mit oder Bindung an Tetanustoxin befähigt ist, umfasst.
Beispiel 12: Vergleich von Ergebnissen, die von zwei Spendern erhalten wurden

Im folgenden Beispiel werden Ergebnisse, die vom Spender TT08 erhalten wurden, mit den Ergebnissen verglichen, die vom Spender TT03 in Beispiel 11 erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 zusammengefasst. Tabelle 22

	TT03	TT08
TT-spezifische Plasmazellen in der PBMC-Fraktion (ELISPOT)	0,021%	0,011%
CD19+-Zellen in der PBMC-Fraktion (FACS)	11%	5%
Plasmazellen in der PBMC-Fraktion (FACS, CD38hi, CD45in)	0,12%	0,08%
Geschätzte Anzahl verknüpfter V_H- und V_L-Sequenzen	400	400
Anzahl von Klonen, die auf Fab-Expression durchmustert wurden	1400	2000
Anzahl von Fab-positiven Klonen (2 × Hintergrund)	482	558
Anzahl an Klonen, die auf TT-Spezifität durchmustert wurden	3600	3400
Anzahl von TT-spezifischen Klonen (2 × Hintergrund)	339	188
Anzahl an Sequenzen, die ausgehend von TT-spezifischen Klonen analysiert wurden	47	102
VH-Keimbahnallele	12 (VH1–5)	NA
VL-Keimbahnallele	8 (VKI, III, IV)	NA
Anzahl einzigartiger kognater Paare	27	40
Bereich der apparenten Affinität	0,35–3,0 nM	NA

NA = nicht analysiert

Dies zeigt deutlich, dass Bibliotheken ähnlicher Qualität aus zwei unterschiedlichen Spender, die mit TT immunisiert wurden, isoliert werden könnten.
Der Grund für die hohe Anzahl einzigartiger kognater Paare in der Bibliothek, die vom Spender TT08 erhalten wurde, liegt wahrscheinlich an der höheren Zahl analysierter Sequenzen.
Beispiel 13: Vergleich der Bibliothek von kognaten Paaren aus Beispiel 11 mit einer kombinatorischen Phagendisplay-Bibliothek, erzeugt ausgehend vom gleichen Spender
Im vorliegenden Beispiel wurde eine kombinatorische Phagendisplay-Bibliothek, ausgehend vom gleichen Spender, der zuvor zur Herstellung der Bibliothek von kognaten Paaren verwendet wurde, hergestellt, um die Bibliotheksdiversität, -affinität und -spezifität zwischen Bibliotheken von kognaten Paaren und kombinatorischen Bibliotheken zu vergleichen.
a. Konstruktion der kombinatorischen Phagenbibliothek
Eine Phagendisplay-Bibliothek wurde aus der CD 19⁺-Fraktion von Zellen aus dem Spender TT03 (identisch zu der Zellfraktion, die in Beispiel 11 c erhalten wurde) erzeugt.
Gesamt-RNA wurde aus näherungsweise 5 × 10⁶ CD19⁺-Zellen präpariert, wobei der Kit mit der Bezeichnung NucleoSpin RNA L (Machery-Nagel, Kat. Nr. 740 962.20) verwendet wurde. Die cDNA wurde nachfolgend in einer Reaktion mit Oligo(dT)-Priming unter Verwendung von reverser Transkriptase vom Typ ThermoScript (Invitrogen, Kat. Nr. 11146-016) synthetisiert.
Die VH- und kappa-Ketten wurden mittels PCR amplifiziert, wobei DNA-Polymerase vom Typ HotMasterTaq (Eppendorf, Kat. Nr. 0032 002.692) und Primer, im Wesentlichen wie von de Haard et al. (J. Biol. Chem. 274, 18218–18230, 1999) hinsichtlich Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen im 5'-Ende modifiziert, verwendet wurden.
Die kombinatorische Phagendisplay-Bibliothek wurde mittels schrittweiser Insertion von kappa- und V_H-PCR-Produkten in den Phagendisplay-Vektor Em351 (modifiziert ausgehend von phh3, beschrieben in Den, W. et al., 1999, J. Immunol. Methods 222, 45–57) erzeugt.
Die endgültige Bibliothek wurde mittels Elektroporation in den E. coli-Stamm TG1 (Stratagene) eingeführt. Die Größe der kombinatorischen Bibliothek enthielt 3 × 10⁶ unabhängige Klone mit einer hohen Insert-Frequenz.
b. Panning der kombinatorischen Bibliothek
Fab-präsentierende Phagenpartikel wurden gemäß Standardverfahrensweisen (z. B. Antibody Engineering, A Practical Approach, 1996, Herausgeber McCafferty, Hoogenboom und Chiswell) präpariert.
Ein "Panning" wurde anhand von Tetanustoxoid (TT, SSI-Charge Nr. 89-2), verdünnt auf 1 μg/ml in PBS und immobilisiert in MaxiSorp-Immunröhrchen (Nunc, Kat. Nr. 444202), durchgeführt. Nach einer einstündigen Inkubationszeitdauer und mehreren Waschschritten wurden gebundene Phagenpartikel unter Verwendung von 100 mM TEA (Triethylamin) eluiert.
Das Phagenpartikeleluat wurde neutralisiert und zum Infizieren exponentiell wachsender TG1-Zellen verwendet, aus denen Fab-präsentierende Phagenpartikel, angereichert bezüglich der TT-Spezifität, erhalten wurden. Ein zweiter Panning-Durchgang unter Verwendung der eluierten Phagen wurde nach der oben dargelegten allgemeinen Verfahrensweise durchgeführt.
In parallelen Ansätzen wurden drei Panning-Durchgänge anhand des C-Fragments des Tetanustoxinmoleküls (Sigma, Kat. Nr. T3694) nach der oben dargelegten Verfahrensweise durchgeführt.
Einzelne Kolonien wurden bezüglich Bindung an Tetanustoxoid und das C-Fragment aus der unselektierten Bibliothek durchmustert und, nach jedem Panning-Durchgang, aus beiden Panning-Gruppen bzw. -Sätzen, wie oben beschrieben.
c. Vergleich der Spezifität und Affinität von kombinatorischen Phagenpartikelldonen und Kognates-Paar-Klonen
Einzelkolonien wurden aus der unselektierten Bibliothek und nach jedem Panning-Durchgang (anhand von intaktem Tetanustoxoid (TT) bzw. Tetanustoxoid-C-Fragment) abgeimpft. Fab-präsentierende Phagenpartikel wurden bezüglich Reaktivität mittels ELISA-Assays analysiert. Die Anzahl Fab-positiver Klone, die TT- und/oder C-Fragment-Reaktivität von wenigstens 2 × Hintergrundreaktivität und wenigstens 4 × Hintergrundreaktivität zeigen, sind in den untenstehenden Tabellen 23 bis 25 angegeben. Alle Ergebnisse sind als Anzahl spezifischer Klone/Anzahl Fab-positiver Klone angegeben. Tabelle 23: Klone, selektiert anhand von TT und analysiert mittels TT-spezifischem ELISA

Anreicherung 2 × Hintergrund 4 × Hintergrund

Unselektierte Klone - 13/etwa 5000

Nach 1 Panning-Durchgang 61/99 59/93

Nach 2 Panning-Durchgängen 165/169 163/166

Tabelle 24: Klone, selektiert anhand von TT und analysiert mittels C-Fragmentspezifischem ELISA

Anreicherung 2 × Hintergrund 4 × Hintergrund

Unselektierte Klone 0/13 0/13

Nach 1 Panning-Durchgang 0/85 0/85

Nach 2 Panning-Durchgängen 0/85 0/85

Tabelle 25: Klone, selektiert anhand des C-Fragments, analysiert mittels C-Fragment-spezifischem ELISA

Anreicherung 2 × Hintergrund 4 × Hintergrund

Nach 1 Panning-Durchgang 1/35 0/35

Nach 2 Panning-Durchgängen 12/47 9/47

Nach 3 Panning-Durchgängen 64/126 26/126
Das Panning der Phagendisplay-Bibliothek gegen TT deckte eine steigende Anzahl an TT-spezifischen Klonen, wenn die Anzahl der Panning-Durchgänge erhöht wurde, auf, und lediglich einige Klone wurden in der unselektierten Bibliothek identifiziert. Ausgehend von der unselektierten Bibliothek oder nach zwei Panning-Durchgängen der Bibliothek gegen TT wurden keine Klone, die mit dem Tetanustoxoid/C-Fragment reagieren, festgestellt. Um Fab-Fragmente mit C-Fragment-Spezifität aus der kombinatorischen Phagendisplay-Bibliothek zu erhalten, musste diese Bibliothek einem spezifischen Panning gegen das C-Fragment unterworfen werden.
Zum Vergleich wurden 13 TT-spezifische Klone aus Beispiel 11 einem C-Fragment-spezifischen ELISA unterworfen, von denen sieben eine Reaktivität über 2 × Hintergrund zeigten. Folglich könnten Fab-Fragmente mit Spezifität gegenüber dem Tetanustoxin-C-Fragment, ausgehend von einer Bibliothek von kognaten Paaren, die ausgehend von einem TT-immunisierten Individuum erhalten wird, exprimiert werden.
Dies zeigt deutlich den Nachteil der Verwendung von "Panning" zum Identifizieren von Klonen mit Spezifität gegenüber einem bestimmten Antigen. Falls wichtige Antigenfragmente oder -epitope unbekannt sind, können sie während des Pannings ausgesondert werden bzw. verloren gehen ("discharged"), was am Ende in einem weniger wirksamen Produkt resultiert.
Weiterhin wurden die apparenten Affinitäten der kombinatorischen Klone gemessen, wie es im Assay von Beispiel 11i beschrieben ist. Zehn der kombinatorischen Klone, die nach zwei Panning-Durchgängen anhand von TT erhalten wurden, wurden analysiert, wobei apparente Bindungsaffinitäten zwischen 1 und 15 nM aufgedeckt wurden.
Zum Vergleich zeigten vier von neun Klonen, die aus der Bibliothek kognater Paare (Tabelle 21) analysiert wurden, Affinitäten im picomolaren Bereich. Dies weist darauf hin, dass die Paarung von variablen Regionen, wie ursprünglich durch das Spender-Immunsystem selektiert bzw. ausgewählt, in Kombination mit den somatischen Hypermutationen, denen die Paare als ein Paar unterworfen wurden, potentiell in höheren apparenten Bindungsaffinitäten resultieren als Zufallskombinationen von derartigen variablen Regionen.
d. Vergleich von Sequenzen von TT-spezifischen kombinatorischen Phasenpartikel-Klonen und Kognates-Paar-Klonen
Die große Menge an Sequenzdaten, die ausgehend von den zwei Bibliotheken erzeugt wurde, schließt direkte Vergleiche von Rohsequenzen aus. Um den Unterschied zwischen V_H- und V_L-Sequenzpaaren in der Phagendisplay-Bibliothek und in der Bibliothek von kognaten Paaren sichtbar zu machen, wurden phylogenetische Stammbäume für die V_H- und V_L-Sequenzen generiert, und Paare wurden in einer Dot-Matrix bzw. Punkt-Matrix dargestellt. Die Paarung von phylogenetischer Information in einer Dot-Matrix (25) deckte stark unterschiedliche Verteilungsprofile von V_H- und V_L-Sequenzpaaren in den zwei Bibliotheken auf. Das gestreute bzw. verwürfelte Auftreten der V_H- und V_L-Sequenzpaare in der Phagendisplay-Bibliothek (25A) wies auf eine geringe phylogenetische Verwandtschaft zwischen V_H- und V_L-Genen hin, in Übereinstimmung mit der Zufallspaarung der V-Gene in dieser Bibliothek. Im Gegensatz dazu zeigen V_H- und V_L-Sequenzpaare aus der Bibliothek von kognaten Paaren (25B) ein geclustertes bzw. gehäuftes Auftreten, was auf eine Co-Evolution von V-Genen hinweist, wie sie für kognate Paare erwartet wird. Auch ist die genetische Diversität für die V-Gene in der Bibliothek von kognaten Paaren, verglichen mit den V-Genen aus der kombinatorischen Bibliothek, viel größer, was darauf hinweist, dass das Verfahren des Isolierens von kognaten gepaarten V-Genen weniger verzerrend ("less biased") ist.
Beispiel 14: Kombinierte einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR und Nested-PCR unter Verwendung von T-Zellen als Matrizenquelle
In diesem Beispiel wird beschrieben, wie eine einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR an T-Lymphozyten, die von einem menschlichen Spender stammen, durchgeführt werden kann.
a. Erhalten einer Lymphozyten-enthaltenden Zellfraktion
Eine Blutprobe wird von menschlichen Spender erhalten, die dem gewünschten Antigen, z. B. mittels Immunisierung, natürliche Infektion, Malignität, durch eine Autoimmunreaktion oder andere Erkrankungen, ausgesetzt wurden, erhalten. Die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) werden unter Verwendung von Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norwegen, Prod. Nr. 1001967) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert.
Im vorliegenden Beispiel werden Antigen-spezifische T-Zellen durch weitere Stimulation der PBMC-Fraktion erzeugt. Die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR kann jedoch auch direkt an Einzelzellen aus der PBMC-Fraktion oder an einer Zellfraktion, die bezüglich T-Zellen (z. B. mittels FACS-Sortierung auf CD3-positive Zellen) angereichert ist, durchgeführt werden.
b. Erzeugung Antigen-spezifischer T-Zellen
Die PBMC-Zellfraktion wird in einem geeigneten Kulturmedium, das relevante Cytokine, wie z. B. IL2, enthält, resuspendiert. Ferner wird das gewünschte Antigen zu der Kultur gegeben, wo es den T-Lymphozyten mittels Antigen-präsentierender Zellen (APC), die in der PBMC-Fraktion vorhanden sind, präsentiert werden wird. Alternativ können der PBMC-Fraktion APC-Feederzellen, die zuvor so behandelt wurden, dass sie das gewünschte Antigen präsentieren. Derartige APC-Feederzellen können APC sein, die dem gewünschten Antigen in der Form z. B. des Peptids, des Proteins oder einer anderen Molekülform exponiert wurden, oder mikrobiell infizierte APC oder Zellen, die so transfiziert wurden, dass sie das Antigen exprimieren und präsentieren, oder APC, die mit anderen antigenen Zellen co-kultiviert werden, wie z. B. Krebszellen in der Form von primärem Gewebe oder primären Zelllinien. Aus der Literatur sind viele verschiedene Typen von APC-Feederzellen bekannt, einschließlich transformierter Zelllinien, B-Zelllinien, dendritscher Zellen, usw.
Die PBMC-Fraktion wird für näherungsweise 3 bis 5 Wochen kultiviert, während der frische Antigen-präsentierende Zellen zusammen mit anderen Cytokinen zugegeben werden, z. B. auf einer wöchentlichen Basis. Dies resultiert in der Proliferation, Aktivierung und Reifung von T-Lymphozyten. Am Ende der Kultivierungszeitdauer wird die Zellkultur von Antigen-spezifischen T-Zellen dominiert werden. Ob diese Zellen CD4+ oder CD8+ sind, hängt von der Erkrankung, dem Antigen, den APC-Zellen und den Cytokin-Gemischen, verwendet während der Stimulationszeitdauer, ab.
Die Antigenspezifität kann z. B. mit einem CTL-Assay, mit Proliferationsassays und mit MHC-Tetrameren, beladen mit dem gewünschten Antigen (Altmau, J.D., et al., 1996. Science 274, 94–96) getestet werden.
Die Antigen-spezifischen Zellen werden auf PCR-Röhrchen verteilt, entweder mittels Grenzwertverdünnung oder unter Verwendung von FACS, um eine Einzelzelle pro Gefäß zu erhalten. Das Gefäß kann bis zur Verwendung bei –80°C gelagert werden.
b. Einstufige Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR
Der Qiagen-Ein-Stufen-RT-PCR-Kit (Qiagen, Kat. Nr. 210212, Hilden, Deutschland) wird für die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR im Wesentlichen gemäß der Empfehlung des Herstellers verwendet. Vor der Zugabe des PCR-Reaktionsgemischs zu dem PCR-Röhrchen werden die Zellen aufgetaut.
PCR-Reaktionsgemische und Zyklusbedingungen werden anfänglich hergestellt, wie im Beispiel 11e-1, beschrieben. Jedoch kann ein gewisser Optimierungsaufwand für einen neuen Primersatz erwartet werden.
Das verwendete Multiplex-Überlappungsverlängerungs-Primer-Gemisch umfasst die in Tabelle 26 dargestellten Primer.
Tabelle 26
c. Semi-Nested-PCR
Eine Durchführung von Semi-Nested-PCR, wie in Beispiel 11e-2, beschrieben, wird gleichermaßen durchgeführt, und eine gewisse Optimierung kann erwartet werden.
Die verwendeten Primer sind in Tabelle 27 dargestellt.
Tabelle 27
In Großbuchstaben geschriebene Sequenzen entsprechen der Gen-spezifischen Region.
Um zu verifizieren, dass die Multiplex-Überlappungsverlängerungs-RT-PCR erfolgreich ist, wird ein Anteil der Proben aus den Semi-Nested-PCR-Reaktionen analysiert, indem 10 μl jeder Semi-Nested-PCR-Reaktion einer Elektrophorese an 1%igem Agarosegel unterworfen wird, wobei Ethidiumbromid zur Detektion verwendet wird. Die erwartete Größe des Überlappungsverlängerungs-Fragments beträgt näherungsweise 58 bp (die exakte Größe hängt von den Längen der variablen Regionen ab).
Näherungsweise zehn Mikroliter aus allen durchgeführten Reaktionen, die vom gleichen Spender stammen, werden in einem einzelnen Röhrchen konsolidiert. Ein Aliquot der gepoolten PCR-Produkte wird nachfolgend gereinigt, wobei der QIAquick-PCR-Reinigungs-Kit gemäß der Verfahrensweise des Herstellers verwendet wird (Qiagen, Kat. Nr. 28106, Hilden, Deutschland). Der gereinigte Pool von Überlappungs-PCR-Produkten kann mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und nachfolgend gereinigt und in einen geeigneten Vektor inseriert werden.
Im vorliegenden Experiment sind Primer für die konstante Region (SEQ ID NO: 376 und 377), die bei der Semi-Nested-PCR verwendet werden, für eine Subklonierung von Semi-Nested-PCR-Produkt in einem geeigneten Vektor konzipiert. Das Design der Cβ-Primer beruht auf der Veränderung eines SER-Restes zu Met an Position 21 im Peptid der konstanten Region der β-Kette, wodurch eine NsiI-Schnittstelle in die Nucleinsäuresequenz eingeführt werden kann:
Diese Transition sollte relativ sicher sein, da SER 21 auf der β-Ketten-Konstantregion in einer Schleifenstruktur am membranseitigen bzw. membrannahen Ende ("membrane proximal end") der Domäne exponiert ist. Diese relativ konservative Änderung wird daher die insgesamte Domänenstruktur wahrscheinlich nicht stören.
Das Design der Cα-Primer beruht auf der Veränderung von Nucleotiden, die den Positionen 15–17 im Peptid der konstanten Region der α-Kette entsprechen, wodurch eine SacI-Schnittstelle in die Nucleinsäuresequenz eingeführt werden kann:
Geeignete Vektoren werden daher die verbleibenden Teile der konstanten Regionen der TcR-α- und -β-Ketten enthalten und werden eine geeignete Modifikation im Hinblick auf Restriktionsschnittstellen enthalten. Diese Veränderungen können unter Verwendung von Standardtechniken der PCR-Subklonierung durchgeführt werden.
e. Weitere Erwägungen
Die große Zahl an Primern für die variable Region kann während der Multiplex-Überlappungsverlängerungs-PCR-Amplifikation potentiell auf eine inhibitorische Weise Wechselwirken. Um dies zu vermeiden, können Primer für die variable Region in Teilmengen bzw. Untergruppen unterteilt und in geeigneten Kombinationen verwendet werden.
Andere Ausführungsformen
Obgleich die vorstehende Erfindung auf dem Wege von Erläuterung und Beispielen zu Zwecken der Klarheit des Verständnisses in gewissem Umfang detailliert beschrieben wurde, wird für Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet im Licht der Lehren dieser Erfindung offensichtlich sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen daran durchgeführt werden können, ohne vom Geist oder Rahmen der angehängten Ansprüche abzuweichen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Verknüpfen einer Mehrzahl von nicht-zusammenhängenden Nukleotidsequenzen von Interesse, wobei das Verfahren umfasst: a) Amplifizieren von Nukleotidsequenzen von Interesse in einer Multiplex-Molekülamplifikationsverfahrensweise unter Verwendung einer Matrize, die aus einer isolierten Einzelzelle stammt; und b) Bewirken einer Verknüpfung der in Stufe a) amplifizierten Nukleotidsequenzen von Interesse, wobei die Nukleotidsequenzen von Interesse variable-Regioncodierende Sequenzen umfassen und die Verknüpfung ein kognates Paar von variable-Region-codierenden Sequenzen erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenzen von Interesse Immunglobulin-variable-Region-codierende Sequenzen umfassen, und die Verknüpfung ein kognates Paar aus einer variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenz, assoziiert mit einer variable-Schwerkettenregion-codierenden Sequenz, erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenzen von Interesse variable-T-Zell-Rezeptor-Region-codierende Sequenzen umfassen und die Verknüpfung ein kognates Paar, bestehend aus einer variable-alpha-Kettenregion-codierenden Sequenz, assoziiert mit einer variable-beta-Kettenregion-codierenden Sequenz, oder einer variable-gamma-Kettenregion-codierenden Sequenz, assoziiert mit einer variable-delta-Kettenregion-codierenden Sequenz, erzeugt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Multiplex-Molekülamplifikationsverfahrensweise eine Multiplex-RT-PCR-Amplifikation ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Multiplex-RT-PCR-Amplifikation ein zweistufiges Verfahren ist, umfassend eine separate Stufe der reversen Transkription (RT) vor der Multiplex-PCR-Amplifikation.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Multiplex-RT-PCR-Amplifikation in einer einzelnen Stufe durchgeführt wird, umfassend anfängliches Eingeben aller Komponenten, die zum Durchführen von sowohl reverser Transkription (RT) als auch Multiplex-PCR-Amplifikation nötig sind, in ein einzelnes Gefäß.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Einzelzelle aus einer Lymphozyten enthaltenden Zellfraktion erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 7, worin die Einzelzelle expandiert wird, um eine Population von isogenen Zellen vor der Stufe der reversen Transkription der Multiplex-Molekülamplifikationsverfahrensweise zu erhalten.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Verknüpfung der Nukleotidsequenzen von Interesse im gleichen Gefäß durchgeführt wird, wie die Multiplex-Molekülamplifikation.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, worin die Verknüpfung der Nukleotidsequenzen von Interesse in Verbindung mit der Multiplex-PCR-Amplifikation bewirkt wird, wobei ein Multiplex-Überlappungsverlängerungsprimer-Gemisch eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, worin die Verknüpfung der Nukleotidsequenzen von Interesse durch Ligation bewirkt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin eine zusätzliche Molekülamplifikation durchgeführt wird, wobei ein Primergemisch eingesetzt wird, das zum Amplifizieren der verknüpften Nukleinsäuresequenzen von Interesse angepasst ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin das Multiplex-Überlappungsverlängerungsprimer-Gemisch Primersätze umfasst, worin wenigstens ein Primersatz-Mitglied von jedem Primersatz ein Überlappungsverlängerungsende umfasst, das zur Hybridisierung mit dem Überlappungsverlängerungsende eines Primersatzmitglieds eines zweiten Primersatzes fähig ist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 13, worin das Multiplex-Überlappungsverlängerungsprimer-Gemisch umfasst: a) wenigstens einen C_L- oder J_L-Primer, komplementär zum Sinn-Strang einer Immunglobulin-Leichtkettenregioncodierenden Sequenz; b) wenigstens einen V_L-5'-Primer oder V_LL-Primer, komplementär zum Gegensinn-Strang einer variable-Leichtkettenregion-codierenden Immunglobulin-Sequenz oder variable-Leichtkettenregion-Leadersequenz, und fähig zur Bildung eines Primersatzes mit dem/den Primer(n) in Stufe a); c) wenigstens einen C_H- oder J_H-Primer, komplementär zum Sinn-Strang einer konstante-Schwerkettendomänecodierenden Immunglobulin-Sequenz oder einer Schwerkette-Bindungsregion-codierenden Sequenz; und d) wenigstens einen V_H-5'-Primer oder V_HL-Primer, komplementär zum Gegensinn-Strang einer variable-Schwerkettenregion-codierenden Immunglobulin-Sequenz oder variable-Schwerkettenregion-Leadersequenz, und fähig zur Bildung eines Primersatzes mit dem/den Primer(n) in Stufe c).
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Primer von Stufe b) V_LL-Primer mit wenigstens 90% Sequenzidentität mit der genspezifischen Region von SEQ ID NO: 93 bis 98 sind und die Primer von Stufe d) V_HL-Primer mit wenigstens 90% Sequenzidentität mit der genspezifischen Region von SEQ ID NO: 86 bis 92 sind.
Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von kognaten Paaren, umfassend verknüpfte variable-Region-codierende Sequenzen, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer Lymphozyten enthaltenden Zellfraktion von einem Donor; b) gegebenenfalls Anreichern bezüglich einer bestimmten Lymphozyten-Population aus der Zellfraktion; c) Erhalten einer Population von isolierten Einzelzellen, umfassend das Verteilen von Zellen aus der Zellfraktion individuell in eine Mehrzahl von Gefäßen; und d) Amplifizieren und Bewirken einer Verknüpfung der variable-Region-codierenden Sequenzen, die in der Population von isolierten Einzelzellen enthalten sind, gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die individuelle isolierte Einzelzelle in der Population von Einzelzellen vor der Durchführung von Amplifikation und Verknüpfung (Stufe d)) zu einer Population isogener Zellen expandiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7, 16 oder 17, worin die Lymphozyten enthaltende Fraktion Blut, Knochenmark, mononukleäre Zellen oder weiße Blutzellen-darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 16 bis 18, worin die Lymphozyten enthaltende Zellfraktion bezüglich Zellen der B-Lymphozyten-Linie angereichert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 16 bis 19, worin die Lymphozyten enthaltende Zellfraktion oder B-Lymphozyten-Linie bezüglich Plasmazellen angereichert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 16 bis 20, worin die Zellen aus der Lymphozyten enthaltenden Zellfraktion, B-Lymphozyten-Linie oder Plasmazellen bezüglich Antigenspezifität angereichert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 16 bis 18, worin die Lymphozyten enthaltende Zellfraktion bezüglich Zellen der T-Lymphozyten-Linie angereichert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 16 bis 18, worin antigenspezifische T-Zellen durch Stimulation der Lymphozyten enthaltenden Zellfraktion erzeugt werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend das Inserieren der verknüpften Nukleotidsequenzen oder einer Bibliothek von kognaten Paaren in einem Vektor.
Verfahren nach Anspruch 24, worin der Vektor aus Klonierungsvektoren, Shuttlevektoren, Display-Vektoren oder Expressionsvektoren ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, worin die verknüpften Nukleotidsequenzen oder die individuellen Mitglieder der Bibliothek von kognaten Paaren eine variable-Schwerkettenregion-codierende Immunglobulin-Sequenz, assoziiert mit einer variable-Leichtkettenregion-codierenden Sequenz, umfassen und die Sequenzen im Leseraster in einen Vektor inseriert sind, der bereits Sequenzen, codierend für eine oder mehrere konstante Immunglobulindomänen oder Fragmente davon, enthält.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, worin die verknüpften Nukleotidsequenzen oder die individuellen Mitglieder der Bibliothek von kognaten Paaren eine variable-T-Zell-Rezeptor-α-Kettenregion-codierende Sequenz, assoziiert mit einer variable-β-Kettenregion-codierenden Sequenz, umfassen und die Sequenzen im Leseraster in einen Vektor inseriert sind, der bereits Sequenzen, codierend für eine oder mehrere konstante T-Zell-Rezeptor-Domänen oder Fragmente davon, enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 27, ferner umfassend das Erzeugen einer Unterbibliothek durch Auswählen einer Teilmenge von kognaten Paaren von verknüpften variable-Region-Sequenzen, die für Bindungsproteine mit einer gewünschten Target-Spezifität codieren, wobei eine Bibliothek von Target-spezifischen kognaten Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, ferner umfassend das Transferieren des kognaten Paars oder der Bibliothek von Target-spezifischen kognaten Paaren von variable-Region-codierenden Sequenzen in einen Säugerexpressionsvektor.
Verfahren nach Anspruch 29, worin der Säugerexpressionsvektor für eine oder mehrere konstante-Region-Domänen codiert, ausgewählt aus humanem Immunglobulin der Klassen IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, der kappa-Leichtkette oder lambda-Leichtkette oder aus humanen T-Zell-Rezeptor-alpha-, -beta-, -delta- und/oder -gamma-Ketten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 30, ferner umfassend die Stufen: a) Einführen eines Vektors, der für einen Abschnitt von verknüpften Nukleotidsequenzen codiert, in eine Wirtszelle; b) Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen, die für eine Expression angepasst sind; und c) Erhalten des Proteinprodukts, das ausgehend von dem in die Wirtszelle eingefügten Vektor exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 31, worin das Proteinprodukt ein monoklonaler Antikörper ist, umfassend ein kognates Paar aus einer variablen Leichtkettenregion, assoziiert mit einer variablen Schwerkettenregion.
Verfahren nach Anspruch 31, worin das Polypeptidprodukt ein monoklonaler T-Zellrezeptor ist, umfassend ein kognates Paar aus einer variablen alpha-Kette-Region, assoziiert mit einer variablen beta-Kette-Region.