JP2007505611A - 目的とする配列を連結するための方法 - Google Patents

目的とする配列を連結するための方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2007505611A
JP2007505611A JP2006526523A JP2006526523A JP2007505611A JP 2007505611 A JP2007505611 A JP 2007505611A JP 2006526523 A JP2006526523 A JP 2006526523A JP 2006526523 A JP2006526523 A JP 2006526523A JP 2007505611 A JP2007505611 A JP 2007505611A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
variable region
cells
primer
region coding
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2006526523A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2007505611A5 (ja
JP4651619B2 (ja
Inventor
マルティン・ベー・オレクシウィッツ
ラース・エス・ニールセン
ペーター・エス・アナセン
マルギット・ホ・ハンセン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Symphogen AS
Original Assignee
Symphogen AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44209637&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2007505611(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Symphogen AS filed Critical Symphogen AS
Publication of JP2007505611A publication Critical patent/JP2007505611A/ja
Publication of JP2007505611A5 publication Critical patent/JP2007505611A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4651619B2 publication Critical patent/JP4651619B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲは、単一反応でヘテロメリックタンパク質のドメインまたはサブユニットをコードする２つもしくはそれ以上のヌクレオチド配列を連結する効率的な方法を提供する。特に、例えば、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、またはＢ細胞受容体からの可変領域コード配列の連関は、本発明の方法で容易にされる。これは可変領域コード配列のライブラリーを生成するより効率的な方法を可能にする。単離単一細胞由来のテンプレートを使用する多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲを実行する機能は、ハイスループットフォーマットで同族対合ライブラリーの生成を可能にする。

Description

本発明は、増幅、特にポリメラーゼ鎖反応（多重ＰＣＲ）といっしょに目的とするヌクレオチド配列を連結することが可能な多重分子増幅法に関する。この方法は、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、またはＢ細胞受容体からの可変領域コード配列の同族対合（ｃｏｇｎａｔｅ ｐａｉｒ）ライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリーの生成に特に有利である。
免疫反応に関与する抗原結合タンパク質は、きわめて多様性の結合特異性を示す大きなポリクローナルレパートリーとして哺乳類に存在する。この多様性は、これら結合タンパク質の可変領域をコードする遺伝子配列の再配列によって生成される。かかる可変領域結合タンパク質としては、Ｂ細胞受容体の可溶性および膜結合形態（免疫グロブリンまたは抗体としても周知）および膜結合Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）が挙げられる。免疫グロブリンに関して、その親和性は、これら可変遺伝子の体超変異のサイクルに関与する親和性成熟と呼ばれる方法を通じて、Ｂ細胞抗原受容体によって抗原の認識後に増強される。
特に、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、および単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子など免疫グロブリンまたはその断片は、クローン化および組換え発現の影響を受けやすい。しかし、他の可変領域結合タンパク質もすべて原則として、抗体について同じコンセプトを使用してクローン化され、かつ発現されうる。
所望の結合特異性を有する抗体を単離するための既知の方法は、ほとんどの場合、免疫宿主からのハイブリドーマの生成後、特異的クローンのスクリーニングを含み、または、例えばファージディスプレイなどの方法を使用して後で強化される免疫グロブリン可変ドメインから成る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるコンビナトリアル発現ライブラリーの生成を含む。
治療抗体を製造するためのハイブリドーマ技術の使用における主な制限は、ヒトＢリンパ球の融合パートナーとして適切なヒトリンパ腫の欠如である。ヘテロハイブリドーマ（すなわち、マウスリンパ腫とのヒトＢ細胞の融合）は周知のように不安定であり、したがって製造目的の適切な細胞系をもたらすことは稀である。エプスタイン・バーウイルスの感染を通じて不死化されたヒトＢ細胞は、同様の不安定性の課題を示す。治療用のヒト抗体を製造するための確固たる細胞法の欠如は、分子生物学における最近の利点で補償されうる。
コンビナトリアルライブラリーおよびファージディスプレイの使用は、１０１０を上回る潜在的な多様性を有する抗体クローンの大きなレパートリーの生成を可能にする。このレパートリーのために特異的標的との結合の選択が実行され、それによってサブライブラリーを生成することができる。このサブライブラリーを使用してポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを生成することができる。ライブラリーを構成する可変領域コード配列（例えば免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列）は、細胞の集団を発現するリンパ球、形質細胞、ハイブリドーマ、または他の免疫グロブリンから増幅されうる。コンビナトリアルライブラリーを生成するための現行の技術は、細胞の集団からの可変領域コード配列の別個の単離を含む。したがって、例えば免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の最初の対合が失われる。もっと正確に言えば、コンビナトリアルライブラリーにおいては、該配列はランダムに対合され、これら可変配列の最初の組合せは偶然にのみ起こる。したがって、所望の結合特異性の原因となる可変領域コード配列を単離するために、相当な量のスクリーニングが必要である。これは一般に、リボソームディスプレイまたはファージディスプレイなど所望の特異性を示すクローンの強化のための方法と組合せて実行される。その場合にも、達成される多様性は、最初の細胞に見られるように同様の高い親和性の結合タンパク質を生じさせる可変領域コード配列を単離するには十分に大きくはありえない。さらに、さらにコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするために通常使用される強化手順は、例えば、ライブラリーの多様性をさらに削減する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における特に低い毒性にポリペプチド、効率的な折畳み、ゆっくりのオフレート、または他の系依存パラメータの強いバイアスを導入する。さらに、かかるコンビナトリアルライブラリー由来のクローンは、対合として、最初の対合（以下、同族対合を呼ぶ）とは対照的に、その進展の特定の段階中にＢおよびＴリンパ球受容体の場合のように、自己抗原に対するインビボ陰性選択を通じて決して行われないため、自己抗原に対する交差反応性を有する結合タンパク質を産生する傾向が高くなる。したがって、可変領域コード配列の最初の対合のクローン化は所望の方法である。さらに、所望の結合特異性を示すクローンの頻度は、同族対合のライブラリー内で、特に出発原料細胞が特異的結合対合をコードする細胞の頻度が高いドナー、例えば、免疫または免疫化ドナー由来である場合には、従来のコンビナトリアルライブラリーにおけるよりも相当に高いことが予想される。当然、同族対合ライブラリーのサイズはコンビナトリアルライブラリーほど大きい必要はなく、関連性の継続的な免疫反応を有するドナー由来の１０４〜１０５クローンもしくは１０２〜１０３クローンほどのサイズの同族対合ライブラリーできわめて多様性の所望の結合特異性を示す結合タンパク質を得るために確実に十分である。
同族対合ライブラリーを生成するために、同じ細胞由来の可変領域コード配列の連関が必要である。現在のところ、可変領域コード配列の同族対合を達成しうる２つの異なる方法が記載されている。
細胞内（Ｉｎ−ｃｅｌｌ）ＰＣＲは、細胞の集団が固定され、透過化された後、免疫グロブリンからの重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の細胞内連関が行われる方法である。この連関は、オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ（特許文献１）または組換え（非特許文献１）のいずれかによって実行されうる。これらの刊行物に記載された増幅方法は、ｉ）免疫グロブリンｃＤＮＡを生成する定常領域プライマーを利用する逆転写、ｉｉ）オーバーラップ・エクステンション設計または組換え部位のいずれかを含有するプライマーセットを利用する重鎖および軽鎖可変領域コード配列のＰＣＲ増幅、ｉｉｉ）この方法が選択される場合は、組換えによる連関、ｉｖ）クローン化のための制限部位を生成する産物のネステッドＰＣＲから成る３つもしくは４つのステップ方法である。細胞は透過化されるため、増幅産物が細胞から漏れ出し、それによって重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列のスクランブルを導入し、結果として同族対合の損失をもたらす相当なリスクがある。したがって、この手順は、各反応後に洗浄するステップを含み、これは方法を面倒にし、かつ反応の効率を低下させる。
より一般的には、細胞内ＰＣＲは周知のように非効率的であり、結果として感度が低くなる。したがって、細胞内ＰＣＲ連関法は決して広範囲に使用されておらず、最初の研究では実際に、連関が実際に細胞内で起こることを検証するために使用されうるように確実に反復されることはない。しかし、これは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列のスクランブルを回避し、それによって同族対合を妨げるのに絶対的に重要である。
異なる細胞内法が特許文献２に記載されている。この方法は、ＲＮＡトランススプライシングに基づき、かつ細胞内のｍＲＮＡをコードするＶＨおよびＶＬの接合を達成する。この方法は、細胞内のトランススプライシングを推進するＤＮＡ構成物の存在を必要とする。
単一細胞ＰＣＲは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の同族対合を達成する異なる方法である（例えば、非特許文献２、非特許文献３を参照）。これらの刊行物においては、細胞を発現する免疫グロブリンの集団は、反応につき１つの細胞の密度に希釈することによって分布され、それによってクローン化方法中の重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列のスクランブルを除去する。基本的には、記載されている方法は、ｉ）ｃＤＮＡを生成するオリゴｄｔ−、ランダム六量体、または定常領域プライマーを利用する逆転写、ｉｉ）ｃＤＮＡ産物をいくつかのチューブへ分画し、かつクローン化の制限部位を含有するプライマーセットにより（別個のチューブで）個々の可変鎖コード配列でＰＣＲ増幅を実行するステップ、ｉｉｉ）（場合により）クローン化の制限部位を生成する産物のネステッドＰＣＲ、およびｉｖ）それ自体、多重ステップ方法である、適切なベクターへそれらをクローン化することによりこれら別個のチューブから重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列を連結するステップから成る３つから４つのステップの手順である。
ヒトにおいては、２種類の軽鎖、すなわちラムダ（λ）およびカッパ（κ）がある。これは、すべての単一細胞から生成されたｃＤＮＡにより、少なくとも３つの別個のＰＣＲ反応が実行され、その後に分析し、かつ適切な断片を単一ベクターへクローン化し、同族対合を達成することを意味する。したがって、記載された単一細胞ＰＣＲ法は、同族対合のライブラリーを生成する多数の操作を必要とする。とはいえ、同族対合ライブラリーは、きわめて多様性の結合特異性を示す結合タンパク質を得るためにそれほど大きなコンビナトリアルライブラリーを必要とすることはないが、記載された単一細胞ＰＣＲ法によって、例えば１０４〜１０５クローンのライブラリーを生成する面倒な作業となる。さらに、多数の操作は汚染および人的エラーのリスクを大いに増大させる。
免疫反応中に通常観察される親和性に対応する高い親和性結合タンパク質を得るために、その増幅に伴って可変領域配列の同族対合がきわめて有利である。大いに多様性のライブラリーを生成するには、ハイスループットフォーマットに適合され、汚染およびスクランブルのリスクが最小限であるクローン化法を有することが必要である。
ハイスループットフォーマットに適合されるコンビナトリアルライブラリーの生成を可能にするクローン化ステップの数の削減が同様に望ましい。
国際公開第９３／０３１５１号パンフレット 国際公開第０１／９２２９１号パンフレット Ｃｈａｐａｌ，Ｎ．ら、１９９７年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３、５１８−５２４頁 コルネラ（Ｃｏｒｏｎｅｌｌａ）、Ｊ．Ａ．ら、２０００年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８、Ｅ８５ ワング（Ｗａｎｇ）、Ｘ．ら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０、２１７−２２５頁
本発明は、多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲまたは多重ＲＴ−ＰＣＲなど多重分子増幅手順の後、ライゲーションまたは組換えによる連関を利用する、目的とする２つもしくはそれ以上のヌクレオチド配列、例えば、可変領域コード配列を連結する効率的な方法を提供する。この方法は単一細胞に適用可能であり、それによって、ハイスループットフォーマットで同族対合のクローン化を可能にする。
本発明は、目的とする２つもしくはそれ以上の非隣接ヌクレオチド配列の増幅および連結方法を提供し、かかる配列のクローン化がハイスルーフォーマットに適合されることを可能にすることをめざす。これは基本的にクローン化される配列を増幅および連結に必要なステップの数を削減することによって達成される。
本発明の一態様は、多重分子増幅手順で、単離単一細胞、同質細胞の集団、または遺伝学的に多様な細胞の集団由来のテンプレートを使用する目的とするヌクレオチド配列を増幅させ、増幅された配列のその後の連関を生じさせる複数の非隣接ヌクレオチド配列を連結する方法である。テンプレートが単離単一細胞または同質細胞の集団である場合は、連関は結果として、同族の方法で各々他を伴う目的とするヌクレオチド配列を含んで成る核酸部分をもたらす。テンプレートが遺伝学的に多様な細胞の集団である場合は、連関は結果として、各部分がランダム方法で伴う目的とする核酸配列を含んで成る部分のライブラリーをもたらし、これはコンビナトリアルライブラリーとも呼ばれる。
本発明の一実施形態においては、この多重分子増幅手順は多重ＰＣＲ増幅であり、好ましくは、逆転写ステップによって進められる。好ましい実施形態においては、逆転写、増幅、および連関は、多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲを使用する単一ステップ、または多重ＲＴ−ＰＣＲの後、ライゲーションまたは組換えによるライゲーションによる連関を使用する２ステップで実行される。
本発明の別の実施形態は、連結された可変領域コード配列、特に重鎖可変領域および軽鎖コード配列またはＴ細胞受容体（ＴｃＲ）α鎖コード配列およびβ鎖コード配列を含んで成る同族対合のライブラリーの生成に関する。この方法は、少なくとも１つの適切なドナーからリンパ球含有細胞分画を得て、かつ場合によりこの分画から特定のリンパ球集団、例えば、Ｂリンパ球またＴリンパ球を、可変領域コード配列が免疫グロブリン由来であるか、またはＴｃＲが望ましいかどうかによって強化するステップを含む。リンパ球含有細分画または強化細胞分画は容器のアレイへ分布され、各容器で１つの細胞を得る。単一細胞のアレイは逆転写（ＲＴ）ステップ、またはテンプレートとして単一細胞の集団由来の核酸を使用する他のｃＤＮＡ生成手順にかけられる。ＲＴステップ後には多重分子増幅手順および本発明の方法の１つによる各細胞から生成された可変領域コード配列の対合の連関が行われる。
本発明において開示されているクローン化法は、面倒で非効率的なクローン化法を除外し、さらに多重クローン化ステップ中の汚染および多様性の損失のリスクを削減する。
本発明の他の態様は、多重分子増幅および連関方法によって製造される同族対合のライブラリーに関する。本発明の方法によって生成される同族対合の最初のライブラリー（親ライブラリー）はスクリーニングにかけられ、それによって同族対合コード標的特異的結合タンパク質可変ドメインまたは完全長結合タンパク質のサブライブラリーを生成することができる。
本発明の別の実施形態においては、本発明のライブラリーおよびサブライブラリーを組換えモノクローナルまたはポリクローナルタンパク質の発現において使用されうるが、ここでドナーに存在する最初の結合親和性および特異性は保存される。
定義
「同族対合」という語は、単一細胞内に含まれ、またはこれに由来する目的とする非隣接核酸の最初の対合を表す。好ましい実施形態においては、同族対合は、ともに結合タンパク質可変ドメインをコードし、遺伝子配列が同じ細胞由来である、２つの可変領域コード配列を含んで成る。したがって、完全な結合タンパク質または安定したその断片のいずれかとして発現されると、それらは最初にこの細胞から発現される結合タンパク質の結合親和性および特異性を保存する。同族対合は、例えば、同じ細胞からの可変軽鎖コード配列を伴う抗体可変重鎖コード配列、または同じ細胞からのβ鎖コード配列を伴うＴ細胞受容体α鎖コード配列を含んで成りうる。同族対合のライブラリーはかかる同族対合の収集物である。
「ホットスタートポリメラーゼ」という語は、逆転写に使用される温度では不活性であり、またはきわめて低い活性を有するポリメラーゼを表す。かかるポリメラーゼは、機能的になるには高温（９０〜９５℃）によって活性化される必要がある。これは、例えば、逆転写酵素反応とのポリメラーゼの干渉を妨げるため、単一ステップＲＴ−ＰＣＲ手順における利点である。
「細胞の同質集団」という語は、遺伝学的に同一の細胞の集団を表す。特に、単離単一細胞のクローン性増殖によって誘導される同質集団が本発明において目的とされている。
「単離単一細胞」という語は、「単一容器における単一細胞」に対応する細胞の集団から物理的に分離されている細胞を表す。細胞の集団が個別に複数の容器に分配すると、単離単一細胞の集団が得られる。「テンプレート源」と題するセクションで規定されているように、単一細胞を有する容器の集団は、それを単一細胞の集団とみなすために必ずしも１００％ではない。
増幅に関して「連結」または「連関」由来の語は、目的とする核酸配列を単一部分中にコードする増幅された核酸配列の結合を表す。同族対合に関して、部分は可変ドメイン、例えば、同じ細胞由来の抗体軽鎖可変領域コード配列を伴う抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列含んで成る。連関は、増幅と同時に、または増幅直後のステップとして達成されうる。これらの部分の形態または機能性には要件はなく、直鎖、環状、一本鎖、または二本鎖でありうる。連関は必ずしも永久的でもなく、目的とする核酸配列の１つは、必要に応じてこれらの部分から単離され、可変領域コード配列の１つは、例えば、同族対合部分から単離されうる。しかし、同族対合を構成する最初の可変領域が他の可変領域とスクランブルしない限り、それらは依然として同族対合とみなされるが、単一部分へともに連結されない。連関は、好ましくは、ヌクレオチドリン酸ジエステル連関である。しかし、連関は異なる化学的架橋手順によっても得られうる。
「多重分子増幅」という語は、同じ反応における２つもしくはそれ以上の標的配列の同時の増幅を表す。適切な増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ウー（Ｗｕ）とウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）、１９８９年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４、５６０−９頁）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）法（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、１９９２年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０、１６９１−６頁）、自立塩基性配列複製（グアテリ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７、１８７４−８頁）、および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）（コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）Ｊ．、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ ３５０、９１−２頁）が挙げられる。最後の２つの増幅方法は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両方を産生する等温転写に基づく等温反応を含む。
「多重ＰＣＲ」という語は、同じ反応における２セット以上のプライマー、例えば、重鎖可変領域の増幅に適合される１つのプライマーセット、および同じＰＣＲ反応におけるκ鎖可変領域の増幅に適合される１つのプライマーセットを含むことによって、２つもしくはそれ以上の標的配列が同時に増幅されるＰＣＲの変形を表す。また、λ鎖可変領域の増幅に適合されるプライマーセットが、これらのプライマーセットと組合せられうる。
「多重ＲＴ−ＰＣＲ」という語は、逆転写（ＲＴ）ステップによって先行される多重ＰＣＲ反応を表す。多重ＲＴ−ＰＣＲは、多重ＰＣＲの前に別個のＲＴステップによる２ステップ方法として、またはＲＴと多重ＰＣＲの両方の全成分が単一のチューブで組み合わされる単一ステップ方法として実行されうる。
「多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ」および「多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ）」という語は、多重ＰＣＲまたは多重ＲＴ−ＰＣＲが多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを利用して実行され、標的配列を増幅し、それによって標的配列の同時の増幅および連関を可能にすることを意味する。
「複数の容器」は、細胞の集団から単一細胞の物理的分離を可能にする物体（または物体の収集物）を表す。これは、チューブ、多重ウェルプレート（例えば、９６ウェル、３８４ウェル、マイクロタイタープレート、または他の多重ウェルプレート）、アレイ、マイクロアレイ、マイクロチップ、ゲル、またはゲルマトリクスでありうる。好ましくは、この物体はＰＣＲ増幅に適用可能である。
本明細書で使用される「ポリクローナルタンパク質」または「多クローン性」という語は、異なるが、好ましくは、免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される相同タンパク質分子を含んで成るタンパク質組成物を指す。したがって、各タンパク質分子は、組成物の他の分子と相同であるが、１つもしくはそれ以上の可変ポリペプチド配列の伸長をも含有し、これ／これらはポリクローナルタンパク質の個々のメンバー間のアミノ酸配列の差によって特徴づけられる。かかるポリクローナルタンパク質の既知の例としては、抗体または免疫グロブリン分子、Ｔ細胞受容体、およびＢ細胞受容体が挙げられる。ポリクローナルタンパク質は、所望の標的、例えば、所望の標的抗原に向けた結合特異性を示すポリクローナル抗体に向けた共有結合活性など共通の特長によって規定されているタンパク質分子の明確なサブセットから成りうる。
本明細書で使用される「遺伝学的に多様な細胞の集団」という語は、集団における個々の細胞がゲノムレベルで互いに異なる細胞集団を指す。遺伝学的に多様な細胞のかかる集団は、例えば、ドナー由来の細胞、またはかかる細胞の分画、例えば、細胞分画を含有するＢリンパ球またはＴリンパ球の集団である。
「プライマーセット」という語は、「プライマー対合」という語と同義で使用され、ともに目的とするヌクレオチド配列（すなわち、同族対合の１つのメンバー）の増幅をプライムすることが可能である２つもしくはそれ以上のプライマーを表す。本発明のプライマーセットは、可変領域コード配列を含有するヌクレオチド配列のファミリーをプライムするように設計されうる。異なるファミリーの例は、抗体κ軽鎖、λ軽鎖、重鎖可変領域、およびα、β、γ、またはδＴ細胞受容体可変領域である。可変領域コード配列を含有するヌクレオチド配列のファミリーの増幅のためのプライマーセットはしばしば、いくつかのプライマーが変性プライマーでありうる複数のプライマーを構成する。
「配列同一性」という語は、２つの配列の最短の長さにわたる核酸配列間の同一性の程度を示すパーセンテージで表現される。これは（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）×１００／Ｎｒｅｆで計算でき、式中Ｎｒｅｆは配列の最短における残基の数であり、かつ式中Ｎｄｉｆは２つの配列間のＮｒｅｆ長の最適に配置マッチした非同一の残基の総数である。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＴＡＡＴＣＡＡＴＣＧＧ（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）と７５％の配列同一性を有する（下線は最適な配置を示し、太字は８つの中で２つの非同一の残基を示す）。
連関に関して「ランダムに」または「ランダム」という語は、同じ細胞由来ではないが、遺伝学的に多様な細胞の集団の中で横に連結するヌクレオチド配列の連関を指す。目的とするヌクレオチド配列が可変領域コード配列である場合は、これは結果として連結配列のコンビナトリアルライブラリーをもたらす。他方、目的とするヌクレオチド配列が非多様なヘテロメリックタンパク質をコードする場合は、ランダム連結配列は同様に単一細胞から連結された配列であるように見える。
逆転写に関して「単離単一細胞由来テンプレート」という語は、かかる単離細胞内の核酸を指す。核酸は、例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡの形でありうる。核酸は、細胞から単離され、または細胞の残りの内容物を有したままでありうるが、ここで細胞は無傷の形または溶解された形である。
増幅および連関方法
本発明の一特徴は、２セット以上のプライマー、例えば、同じ反応において可変領域コード配列を増幅するために必要なプライマーすべてを含めることによって、２つもしくはそれ以上の標的配列が同じチューブで同時に増幅されるＰＣＲの変形を利用する、目的とするヌクレオチド配列を増幅するために必要なチューブの数を削減する。一般に、この方法は多重ポリメラーゼ鎖反応（多重ＰＣＲ）として周知である。
逆転写によって先行される多重ＰＣＲ増幅および多重ＰＣＲ（多重ＲＴ−ＰＣＲ）は、診断分野内、例えば、ＤＮＡの変異、欠失、および多型の分析において、ｍＲＮＡレベルの定量的アッセイ、およびウイルス、細菌、および寄生虫の同定のために公知である（マルコウレイトス（Ｍａｒｋｏｕｌａｔｏｓ）、Ｐ．ら、２００２年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１６、４７−５１頁）。しかし、免疫グロブリン軽鎖可変領域コード配列が、ＶＨプライマーセットとともにＶκおよび／またはＶλプライマーセットを構成する５つ以上のプライマーから成る多重プライマーミックスを使用する免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列と同じ容器で増幅されている例はきわめて少ない（チヤパル（Ｃｈａｐａｌ）、Ｎ．ら、１９９７年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３、５１８−５２４頁、リュー（Ｌｉｕ）、Ａ．Ｈ．ら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９、７６１０−７６１４頁、エンブレトン（Ｅｍｂｌｅｔｏｎ）、Ｍ．Ｊ．ら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０、３８３１−３８３７年）。この理由は、抗原結合タンパク質の可変ドメインをコードする配列の増幅に適合されるプライマーセットが、これらの可変領域コード配列の多様性を捕捉するために、一般に複数の変性プライマーで構成されていることが考えられる。したがって、ＰＣＲ反応の複雑性は、可変領域コード配列で多重ＰＣＲ増幅を実行する場合にきわめて増大する。
本発明の別の特徴は、多重ＰＣＲによって増幅された２つもしくはそれ以上の標的配列が増幅方法に近接近して連結されていることである。特に可変領域コード配列の同族対合がこの方法によって連結されている。
本発明の一実施形態は、多重プライマーミックスがオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ手順において機能し、結果として目的とするヌクレオチド配列の同時の増幅および連関をもたらすように設計されうることを十分に引出す。この多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法は、目的とするヌクレオチド配列、特に連結可変領域の同族対合を単離し、かつ連結するのに必要な反応の数を削減するのに役立つ。
本発明の他の実施形態は、多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲによる連関の代わりとしてライゲーションまたは組換えによる連関を使用する。これらの手順においては、連関は多重ＰＣＲ増幅と同時に実行されないが、増幅直後のステップとして実行される。しかし、連関は、多重ＰＣＲが実行されるのと同じチューブで依然として実行されうる。
多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲを実行するために、各セットの少なくとも１つのプライマーがオーバーラップ・エクステンションテールを備えている２つもしくはそれ以上のプライマーセット（多重プライマーミックス）の存在が必要である。オーバーラップ・エクステンションテールは、増幅中のプライマーセットの各々によって生成される産物の連関を可能にする。かかるプライマーミックスは、多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスと呼ばれる。多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲは、連結される配列が同じチューブで同時に生成され、それによって、中間の精製なしに増幅中に標的配列の即時連関を提供するという点で従来のオーバーラップ・エクステンションＰＣＲと異なる。さらに、従来のオーバーラップ・エクステンションＰＣＲは、連結産物を生成するためにアウタープライマーセットまたはネステッドプライマーセットのいずれかとの別個の連結ＰＣＲ反応を必要とする（ホルトン（Ｈｏｒｔｏｎ）、Ｒ．Ｍ．ら、１９８９年、Ｇｅｎｅ ７７、６１−６８頁）。かかる追加の増幅ステップは本発明の多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲにおいて任意である。
本発明のさらに別の特徴は、単離単一細胞または同質細胞の集団由来のテンプレートを利用する、多重ＰＣＲまたは多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ増幅に先行する逆転写（ＲＴ）ステップである。
本発明の別の特徴は、多重ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして単離単一細胞または同質細胞の集団由来のヌクレオチド配列の使用である。好ましくは、単一細胞からのＲＮＡは、多重ＰＣＲの前にｃＤＮＡへ逆転写される。目的とする一部の核酸配列の増幅のために、ゲノムＤＮＡがｍＲＮＡの代わりとして使用されうる。単離単一細胞、またはテンプレート源として単離単一細胞のクローン性増殖によって得られる同質細胞の集団を使用することによって、細胞の集団内で異なる細胞由来のヌクレオチド配列との、目的とするへテロメリックタンパク質をコードするヌクレオチド配列のスクランブルを回避することが可能である。これは、目的とする配列の最初の組成物を得るのが望まれる場合には重要である。特に、可変領域コード配列の同族対合の生成には、テンプレート源として単離単一細胞または同質細胞の集団の使用が重要な特徴である。
多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲは稀に使用される方法である。国際公開第９９／１６９０４号パンフレットは、第１反応におけるゲノム配列からのエクソンの連関を開示しており、それによって逆転写を利用することなくｃＤＮＡを生成する。記載された方法では、連結されるエクソンにつき１つの（２つのプライマーで構成された）プライマーセットが利用され、それによって多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを構成した。各々個々のプライマーは、相補的なオーバーラップ・エクステンションテールによって隣接プライマーセットとのオーバーラッピングが可能である。ｃＤＮＡは、多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを利用した後、必要なステップとして記載されたネステッドＰＣＲによってオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ反応を実行することによってゲノムＤＮＡのテンプレートから生成された。
国際公開第９９／１６９０４号パンフレットに記載されたゲノムＤＮＡのエクソンからのｃＤＮＡの生成は、ヘテロメリックタンパク質をコードする配列のクローン化とは異なる分野である。まず第一に、ヘテロメリックタンパク質は一般に異なる遺伝子から発現されるが、国際公開第９９／１６９０４号パンフレットに記載されたエクソン連関は単一遺伝子からのエクソンの連関に関する。また、本発明は、目的とする連結核酸配列のライブラリー、特にコンビナトリアルライブラリー、および可変領域の同族対合のライブラリーの生成を促進し、単一遺伝子からの一連のエクソンの連結とは完全に異なる状況であり、結果として単一の非可変ｃＤＮＡをもたらす。さらに、本発明は、単一細胞由来の核酸を、好ましくは、それがテンプレートとして利用されうる前に残りの細胞内容物から単離される必要がないＲＮＡの形でこれを利用する。
多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲは可変領域コード配列の連関に関して記載されている刊行物はほとんどない。
多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲの最も単純な形態は、ハイブリドーマ細胞系からのｓｃＦｖコード配列の単離について記載された（チリオン（Ｔｈｉｒｉｏｎ）、Ｓ．ら、１９９６年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．５、５０７−５１１年、およびムリナックス（Ｍｕｌｌｉｎａｘ）Ｒ．Ｌ ら、１９９２年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２、８６４−８６９頁）。チリオン（Ｔｈｉｒｉｏｎ）およびムリナックス（Ｍｕｌｌｉｎａｘ）によって記載された方法では、ハイブリドーマ細胞系から抽出された全ＲＮＡでのオリゴ−ｄＴプライマーによるｍＲＮＡの逆転写の後、別個の連関ステップが利用された。連関ステップは、それぞれ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の増幅に対する２つのプライマーペアを構成する合計４つのプライマーで実行された。ＶＬ順方向プライマーおよびＶＨまたはＣＨ逆方向プライマーには相補的なオーバーラップ・エクステンションテールが含まれ、それによって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の同時の増幅および連関を可能にした。これらの方法ではこれらの連関方法の感度を増大させるネステッドＰＣＲが使用されなかった。
可変領域コード配列の連関に関して多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲの他の例が、前に言及された国際公開第９３／０３１５１号パンフレットに記載されたが、これによりクローン化の前に単一細胞を単離する必要なしに同じ細胞に由来するクローン化重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の方法が提供されている。国際公開第９３／０３１５１号パンフレットに記載された方法では、ＲＴステップと多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲステップとの間で洗浄を必要とした。さらに、国際公開第９３／０３１５１号パンフレットによってもたらされた特定の目的の１つは、可変領域コード配列の同族対合を得るために単一細胞を単離しなければならない問題を解決することであった。
これら既知の多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ法のいずれも単離単一細胞由来のテンプレートで機能するように開発されなかった。いずれの方法も単一ステップＲＴ−ＰＣＲ反応として実行することができなかった。
本発明の一実施形態は、目的とする複数の非隣接ヌクレオチド配列の連関を包含する。この方法は、多重ＰＣＲまたは多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅手順で、単離単一細胞または同質細胞の集団由来のテンプレートを使用する目的とするヌクレオチド配列を増幅するステップと、目的とする増幅されたヌクレオチド配列の連関を生じさせるステップとを含んで成る。さらに、この方法は、連結産物の追加の増幅を実行する任意のステップを含んで成る。
本発明の別の実施形態は、連結可変領域コード配列を含んで成る同族対合のライブラリーを製造するための方法を包含する。この方法は、ドナーからのリンパ球を含有する細胞分画を提供し、場合により該細胞分画からの特定のリンパ球集団が強化されたステップを含んで成る。さらに、単離単一細胞の集団は、個別に複数の容器の中で、リンパ球を含有する細胞分画、または強化された細胞分画からの細胞を分配することによって得られる。単離単一細胞の集団に含まれた可変領域コード配列の多重分子増幅（多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅）が実行され、かつ可変領域コード配列の対合の連関が、ここでは個々の対合は単一細胞由来あり、単離単一細胞の集団内で達成される。さらに、この方法は、２つの任意のステップを含んで成り、第１のステップでは、単一細胞の集団における個々の単離単一細胞が多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅を実行する前に同質細胞の集団に拡大される。それによって、多様な集団の同質細胞を有する複数の容器を得る（１つの容器における同一細胞の１つの集団）。第２の任意のステップは、連結可変領域コード配列の追加の増幅を実行するステップを包含する。
本発明の好ましい実施形態においては、免疫グロブリン軽鎖可変領域コード配列から成る同族対合の該ライブラリーの個々のメンバーが、免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列を伴い、同じ細胞に由来し、またはＴ細胞受容体結合ドメインをコードする配列を含んで成り、β鎖可変領域を伴うα鎖可変領域またはδ鎖可変領域を伴うγ鎖可変領域で構成されており、ここで付随した可変領域は同じ細胞に由来する。
本発明の多重ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写（ＲＴ）が多重ＰＣＲ増幅（または他の多重分子増幅）から別個にあらかじめ生成される２ステップ方法、またはＲＴおよび多重ＰＣＲ増幅ステップが１つのチューブで同じプライマーにより実行される単一ステップ方法のいずれかとして実行されうる。
逆転写（ＲＴ）は逆転写酵素活性を含有する酵素で実行され、結果として全ＲＮＡ、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、または単離単一細胞からの標的特異的ＲＮＡの生成がもたらされる。逆転写のために利用されうるプライマーは、例えば、オリゴ−ｄＴプライマー、ランダム六量体、ランダム十量体、他のランダムプライマー、または目的とするヌクレオチド配列に対して特異的であるプライマーである。
２ステップ多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅手順は、ＲＴステップで生成されたｃＤＮＡが、２つ以上の容器に分布されることを可能にし、増幅を継続する前にテンプレート分画の貯蔵が可能である。また、２つ以上のチューブへのｃＤＮＡの分布は、同じテンプレート由来の核酸の２つ以上の多重ＰＣＲ増幅の実行を可能にする。とはいえ、これは結果として別個の反応の数を増大させるが、これが所望である場合には、多重プライマーミックスの複雑性を低下させる可能性がある。この２ステップ法は、例えば、１つのチューブで重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域コード配列、および同じテンプレートを利用する異なるチューブで重鎖可変領域およびλ軽鎖可変領域コード配列を増幅し、連結するために適用されうる。単一細胞は通常、軽鎖の１つのみを発現する。しかし、これはしばしば、その他を実行する前に反応の１つの結果を待つ代わりに同時に反応を実行することが容易となる。さらに、κとλの両方の増幅は、κまたはλのみが単一細胞から増幅することが予想されるため、内部陰性対照として役立つ。
単一ステップ多重ＲＴ−ＰＣＲ手順においては、逆転写および多重ＰＣＲ増幅が同じ容器で行われる。単一ステップで逆転写および多重ＰＣＲの両方を実行するために必要な成分すべてが最初に容器へ添加され、反応が実行される。一般に、反応が開始されていると追加の成分を追加する必要がない。単一ステップ多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅の利点は、さらに本発明の連結ヌクレオチド配列を生成するために必要なステップの数を削減することである。これは特に、同じ反応が複数の容器で行われる必要がある単一細胞のアレイで多重ＲＴ−ＰＣＲを実行する場合に有用である。単一ステップ多重ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写のためのプライマーとしても多重ＰＣＲ増幅に必要な多重プライマーミックスに存在する逆プライマーを利用することによって実行される。一般に、単一ステップ多重ＲＴ−ＰＣＲに必要な組成物は、核酸テンプレート、逆転写酵素活性を有する酵素、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを含んで成るｄＮＴＰ混合物）、および多重プライマーミックスを含んで成る。核酸テンプレートは、好ましくは、細胞の溶解物として精製形態、または依然として無傷細胞内のいずれかで単離単一細胞由来の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡである。一般に、反応混合物の正確な組成物は、本発明で使用される各多重プライマーミックスのために若干の最適化を必要とする。これは２ステップ手順および単一ステップ多重ＲＴ−ＰＣＲ手順の両方に適用される。
本発明の他の実施形態においては、テンプレートとしてＲＮＡの代わりにゲノムＤＮＡを使用することが適切でありうる。かかる場合には、逆転写ステップは省略され、本発明の残りのステップは本出願の全体を通じて記載されているように実行される。
一部の単一ステップ多重ＲＴ−ＰＣＲのために、反応中に追加の成分を追加することが有利でありうる。例えば、ＲＴステップ後のポリメラーゼの添加。他の成分は、例えば、ｄＮＴＰ混合物またはおそらく異なるプライマー組成物による多重プライマーミックスでありうる。次いで、これは、所望の連結産物を得るために必要なチューブの数も制限するため、単一ステップ多重ＲＴ−ＰＣＲと同じ利点を一般に有する１つのチューブ多重ＲＴ−ＰＣＲとしてみなしうる。
多重ＲＴ−ＰＣＲによって増幅された目的とするヌクレオチド配列は、異なる多重プライマーミックスを使用する、多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ、ライゲーション、または組換えなどいくつかの方法によって互いに結合されうる。好ましくは、多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅および連関方法は、単一ステップまたは２ステップ方法である。しかし、連関方法は、例えば、ＰＣＲ、ライゲーション、または組換えのいずれかによる、目的とする核酸配列を連結するスタッファー断片を使用する多重ステップ方法としても実行されうる。かかるスタッファー断片は、ｃｉｓエレメント、プロモーターエレメント、もしくは関連コーディング配列または認識配列を含有しうる。好ましい実施形態においては、連関方法は多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅と同じ容器で実行される。
本発明の一実施形態においては、目的とする複数の非隣接ヌクレオチド配列の連関が、多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを利用する多重ＰＣＲ増幅に伴って実行される。これにより、標的配列の増幅および連関の結合が生じる。一般に、多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲに必要な組成物は、核酸テンプレート、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを含んで成るｄＮＴＰ混合物）、および多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを含んで成る。
本発明の特定の実施形態においては、目的とする複数の非隣接ヌクレオチド配列の連関は、単離単一細胞または同質細胞の集団由来のテンプレートを使用する多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲによって実行される。さらに、この方法は、連結産物の追加の分子増幅を実行する任意のステップを含んで成る。好ましくは、多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲは、単一ステップ／１つのチューブ反応として実行される。
本発明の多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスは、少なくとも２つの可変領域コード配列の増幅および連関、例えば、κまたはλ軽鎖可変領域ファミリーを有する免疫グロブリン重鎖可変領域ファミリーからの配列の増幅および連関、またはＴ細胞受容体ファミリーα、β、γ、またはδからの配列の増幅および連関をプライムすることが可能な少なくとも２つのプライマーセットを含んで成る。
本発明の他の実施形態においては、多重ＲＴ−ＰＣＲによって増幅される目的とする複数のヌクレオチド配列は、ライゲーションによって連結される。これを達成するために、多重ＲＴ−ＰＣＲに使用される多重プライマーミックスは、増幅された標的配列が適切な制限酵素で開裂され、かつＤＮＡライゲーションによる共有連関が実行されうるように設計されている（このプライマー設計は「プライマーの混合と設計」のセクションに記載されている。かかる多重プライマーミックスとのＲＴ−ＰＣＲ増幅の後、標的配列の適合性末端を形成するために必要な制限酵素が、リガーゼとともに混合物に添加される。このステップ前にＰＣＲ産物の精製は必要ではないが、精製は実行されうる。結合制限開裂およびライゲーションの反応温度は約０〜４０℃である。しかし、多重ＰＣＲ反応からのポリメラーゼが依然として混合物に存在する場合は、室温よりも低いインキュベーション温度が好ましく、最も好ましくは、４〜１６℃の温度である。
本発明のさらに他の実施形態においては、多重ＲＴ−ＰＣＲによって増幅された目的とする複数のヌクレオチド配列は、組換えによって連結される。この方法においては、増幅された標的配列は、同一の組換え部位を使用して結合されうる。次いで、連関は組換えを促進するリコンビナーゼを添加することによって実行される。一部の適切なリコンビナーゼ系は、さまざまなＦＲＴ部位を有するＦｌｐリコンビナーゼ、さまざまなｌｏｘ部位を有するＣｒｅリコンビナーゼ、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間で組換えを実施するインテグラーゼＦＣ３１、β−リコンビナーゼ−６系のほか、Ｇｉｎ−ｇｉｘ系である。組換えによる連関は、２つのヌクレオチド配列で例示されている（ＶＬで連結されたＶＨ）（本明細書で参照により援用される（チヤパル（Ｃｈａｐａｌ）、Ｎ．ら、１９９７年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３、５１８−５２４頁））。
本発明の好ましい実施形態においては、目的とするヌクレオチド配列は、可変領域コード配列を含んで成り、かつ連関は可変領域コード配列の同族対合を生成する。かかる同族対合は、可変領域に加えて１つもしくはそれ以上の定常領域コード配列を含んで成る。
本発明のさらにより好ましい実施形態においては、目的とするヌクレオチド配列は、免疫グロブリン可変領域コード配列を含んで成り、かつ連関は軽鎖可変領域および重鎖可変領域コード配列の同族対合を生成する。かかる同族対合は、可変領域に加えて１つもしくはそれ以上の定常領域コード配列を含んで成りうる。さらに、かかる同族対合は、全血、単核細胞、または白血球などリンパ球を含有する細胞分画から強化されたＢリンパ球系列の細胞由来のテンプレートから単離されうる。
本発明の同じ程度に好ましい実施形態においては、目的とするヌクレオチド配列はＴｃＲ可変領域コード配列を含んで成り、かつ連関はα鎖可変領域およびβ鎖可変領域コード配列、またはγ鎖可変領域およびδ鎖可変領域コード配列の同族対合を生成する。かかる同族対合は、可変領域に加えて１つもしくはそれ以上の定常領域コード配列を含んで成りうる。さらに、かかる同族対合は、全血、単核細胞、または白血球などリンパ球を含有する細胞分画から強化されたＴリンパ球系列の細胞由来のテンプレートから単離されうる。
本発明の他の態様は、テンプレート源として遺伝学的に多様な細胞の集団による多重ＲＴ−ＰＣＲを利用することである。配列をコードするヘテロメリックタンパク質の大半は、結合タンパク質からの可変領域コード配列における場合のように細胞と細胞の間で変動することはない。したがって、かかる非可変へテロメリックタンパク質コード配列のクローン化のために本発明を利用すると、単一細胞の初期単離を実行する必要はない。
本発明のこの実施形態においては、目的とする複数の非隣接ヌクレオチド配列は、遺伝学的に多様な細胞由来のテンプレートを使用する目的とするヌクレオチド配列の多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅を実行し、増幅された目的とするヌクレオチド配列の連関を生じさせるステップを含んで成る方法によってランダムに連結される。さらに、この方法は、連結産物の追加の増幅を実行する任意のステップを含んで成る。単一細胞方法でのように、連関は、増幅のための多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを利用し、あるいはライゲーションまたは組換えによって実行されうる。好ましくは、細胞集団由来のテンプレートは厳密に細胞内に含まれていない。細胞の集団は例えば溶解されうる。
変形結合タンパク質を発現する細胞の集団でのランダム連関の方法の適用は、可変領域コード配列のコンビナトリアルライブラリーの簡単な生成を可能にする。好ましくは、細胞の集団は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ハイブリドーマ細胞、形質細胞、またはこれらの細胞の混合物など可変領域結合タンパク質を発現する細胞を構成する。
上記の実施形態における細胞の集団は、例えば、追加の精製なしに透過され、または溶解され、またはテンプレート核酸は標準の手順によって細胞から単離されうる。単一ステップ多重ＲＴ−ＰＣＲ手順が好ましい。しかし、２ステップ手順も実施形態において使用されうる。
本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域および重鎖可変領域コード配列の連結対合から成るコンビナトリアルライブラリーをも提供する。
多重ＲＴ−ＰＣＲ連関方法の特異性、感度、および収量を増大させる効率的な方法は、多重ＲＴ−ＰＣＲ後のライゲーションもしくは組換えによる連関または多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲを使用する連関から得られる連結ヌクレオチド配列の追加の分子増幅を実行することによる。この追加の増幅は、好ましくは、目的とする連結核酸配列を増幅するために適合したプライマーミックスを利用するＰＣＲ増幅で実行される。利用されるプライマーミックスは、多重プライマーミックスまたは多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスのアウタープライマーであり、連結可変領域コード配列のセンス鎖の最も外側の５’末端および３’末端にアニールし、それによって、連結産物全体の増幅を可能にするプライマーを意味しうる。アウタープライマーは、オーバーラップ・エクステンションテールを含有することがない多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスのプライマーとしても記載されうる。あるいは、ネステッドまたは半ネステッドプライマーセットが、連結ヌクレオチド配列の追加の増幅のために使用されうる。かかるネステッドＰＣＲは特に、方法の特異性を増大させ、ならびに連結産物の量を増大させるために役立つ。本発明のために、半ネステッドＰＣＲ（プライマーの混合と設計と題するセクションに記載されているように）は機能およびネステッドＰＣＲとみなされる。したがって、本発明には必要ではないが、多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲからの連結産物、または、好ましくは、ネステッドＰＣＲもしくは半ネステッドＰＣＲを使用するライゲーションもしくは組換えによる連結産物の追加のＰＣＲ増幅を実行することが望ましい。
追加の増幅は、多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応産物またはライゲーション産物もしくは組換え産物の分画または全体を、またはこれらの産物のいずれかの分画を直接使用することにより、またはこれらの反応のいずれか１つからの精製連結産物を部分的に使用することにより、例えば、連結産物のアガロースゲル電気泳動を実行し、かつ連結可変領域コード配列の予想サイズに対応する断片を切除することによって実行されうる。多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲによって連結された産物については、追加の増幅は、好ましくは、第１の反応において連結されなかった個々の標的配列の連関を補助することになるため、多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応からの分画で直接実行される。
目的とする配列
本発明の目的とするヌクレオチド配列は、発現されると、タンパク質またはタンパク質の一部を形成する異なるサブユニットまたはドメインをコードする配列から選択されうる。少なくとも２つの非同一サブユニットから成るかかるタンパク質は、ヘテロメリックタンパク質として周知である。ヘテロメリックタンパク質は全種類の種において一般的である。かかるタンパク質が属するクラスの一部は、例えば、酵素、阻害物質、構造的タンパク質、毒素、チャンネルタンパク質、Ｇタンパク質、受容体タンパク質、免疫グロブリンスパーファミリータンパク質、輸送タンパク質等である。かかるヘテロメリックタンパク質をコードするヌクレオチド配列は非隣接であり、例えば、それらが異なる遺伝子、または異なるｍＲＮＡ分子由来であることを意味する。しかし本発明で使用される非隣接は、ドメインが目的とされないヌクレオチド配列によって分離される同じタンパク質のドメインをコードするヌクレオチド配列をも意味する。
本発明の一実施形態においては、目的とするヌクレオチド配列は、免疫グロブリン（抗体）、Ｂ細胞受容体、およびＴ細胞受容体（ＴｃＲ）など免疫グロブリンスーパーファミリーからの可変領域コード配列を含有する。特に免疫グロブリンからの可変領域コード配列が目的とされる。かかる可変領域コード配列は、完全長抗体、ならびにＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、および可変領域コード配列の断片の組合せ、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）、接合遺伝子もしくはＶ遺伝子、またはこれらの組合せである。一般に、本発明は、可変領域コード配列およびその断片の組合せで適用されうる。本出願は、重鎖の可変ドメインを有する軽鎖全体の連関を例示する。しかし、本発明は、ＦｖまたはｓｃＦｖコード配列を生成する重鎖および軽鎖の可変ドメインのみの連関、またはＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）２を生成する重鎖可変領域＋定常領域ドメインＣＨ１＋ヒンジ領域の一部を有する軽鎖全体の連関をも可能にする。さらに、重鎖定常領域ドメインの領域を可変重鎖に添加し、それによって切断抗体コード配列または完全長抗体コード配列を生成する。
本発明の別の実施形態においては、可変領域コード配列は、免疫グロブリン軽鎖（κまたはλ）コード配列の１種類、および１つの免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列を含んで成る。
Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）由来の可変領域コード配列も目的とされる。かかるＴｃＲコード配列は、完全長αおよびβ鎖またはγおよびδ鎖ならびに可溶性ＴｃＲまたはこれら鎖の可変ドメインまたはその単一融合タンパク質（例えば、単一鎖αβ、または単一鎖γδ）のコード配列を含んで成る。
テンプレート源
本発明の一特徴は、単離単一細胞、同質細胞の集団、または単一容器へ分離されていない細胞の遺伝学的に多様な集団由来のヌクレオチド配列を連結する能力である。本発明で利用される細胞は、例えば、細菌、酵母、真菌、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳類細胞、またはかかる細胞の分画でありうる。哺乳類由来の血液細胞が本発明で利用されうる細胞の分画の一例である。
本発明の好ましい特徴は、目的とする核酸配列、特に可変領域コード配列のスクランブルが回避されるため、テンプレート源として単離単一細胞または同質細胞の集団の使用である。これは、例えば可変領域コード配列の最初の対合を得ることが望まれる場合には重要である。
本発明の他の好ましくは実施形態は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、形質細胞および／またはこれら細胞系列の種々の発展段階などリンパ球を含んで成る細胞分画から単一細胞または単一細胞の集団を得ることである。免疫グロブリンスーパーファミリーから結合タンパク質を発現する細胞の他の集団も単一細胞を得るために使用されうる。ハイブリドーマ細胞系、Ｂリンパ球またはＴリンパ球系列の細胞系、ウイルス不死化細胞系、または免疫反応に関与するドナー由来細胞などの細胞系も本発明で適用可能である。ドナー由来リンパ球を含有する細胞分画は、かかる細胞、例えば、血液、骨髄、リンパ節、脾組織、扁桃腺組織で豊富であり、または腫瘍もしくは炎症組織浸潤において、およびその周囲の浸潤からである天然の組織または流体から得られうる。本発明のための適切な細胞ドナーは、すべてが後天的免疫系を含有する脊椎動物から選択されうる。ドナーは所望の標的に関して無傷または高度免疫のいずれかでありうる。所望の標的に向けた結合特異性を有する抗原結合タンパク質の単離には、高度免疫ドナーが好ましい。かかる高度免疫ドナーは、標的、または標的の断片で免疫されたドナーであり、または回復期患者、または標的に向けて天然の免疫反応を実行中の非健康個人、例えば、自己免疫患者、癌患者、感染症患者、例えば、ＨＩＶ患者、Ａ、Ｂ、またはＣ型肝炎患者、ＳＡＲＳ患者等、または慢性疾患を有する患者でありうる。
治療のために組換えタンパク質を利用すると、それらは治療される個人との種同一性を有する配列由来であることが好ましい（例えば、ヒトの治療のためのヒト配列）。最初に、外来配列（すなわち、非ヒト）由来の組換えタンパク質は免疫系によって認識されるため、ポリクローナル抗タンパク質に関わる免疫反応をもたらす。これらの抗タンパク質抗体は活性部位を占有することによって薬物作用を遮断する場合があり、薬物クリアランスを促進させ、反復曝露に対して過敏性反応など有害反応を潜在的に誘発しうる。
しかし、免疫原性は、組換えタンパク質が種同一性を有する配列由来である場合にも確認されうる。かかる免疫原性は、例えば、インビボで確認されるものと異なる翻訳後修飾によって誘発されうる。可変領域コード配列のコンビナトリアルライブラリーは、インビトロで生成される可変領域コード配列のランダム対合から成るため、これらも免疫原性を生じさせうる。インビボで抗体重および軽鎖コード配列対合（またはＴ細胞受容体）の形成を支配する規則は完全には理解されていない。したがって、当然、インビトロで形成された対合の一部は、対合を構成する両方の配列が完全にヒトであっても、免疫系によって外来と認識されることになる。同族ライブラリーから得られる結合タンパク質は、他方では、該の異常な組合せを生成することはなく、したがって、コンビナトリアルライブラリーからの結合タンパク質よりも免疫原生の可能性が低い。これは、コンビナトリアルライブラリーからの産物が治療に不適切であることを意味せず、上記の副作用に関して大規模なモニタリングを必要とするだけである。
本発明において使用するために、細胞ドナーは、本発明の連結ヌクレオチド配列から得られる産物で治療される種と同じ種であることが好ましい。好ましくは、細胞ドナーは、家畜、ペット、ヒト、またはトランスジェニック動物である。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニック動物は、米国特許第６，１１１，１６６号明細書、およびクロイワ（Ｋｕｒｏｉｗａ）、Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００２年、２０：８８９−８９３頁に記載されている。かかるトランスジェニック動物は、ヒト免疫グロブリンを産生することが可能である。したがって、特異的標的に対する完全ヒト抗体は、かかるトランスジェニック動物の通常の免疫法によって増加されうる。これは、天然ヒト抗体反応が存在せず、または限定的に存在するヒト抗原のなどより困難な標的に対する特異性を有する結合タンパク質をコードするライブラリーの生成を可能にする。かかるトランスジェニック動物は同様にヒトＴ細胞受容体を産生するように開発されうる。
本発明の別の実施形態においては、リンパ球を含有する細胞分画は、ドナーから得られる全血、骨髄、単核細胞、または白血球で構成されている。単核細胞は、血液、骨髄、リンパ節、脾、癌細胞および炎症の浸潤の周りの浸潤から単離されうる。単核細胞は、密度遠心分離法、例えば、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）勾配によって単離されうる。単核細胞が組織から成るサンプルから単離される場合は、組織は勾配遠視分離が実行される前に分解される。分解は、例えば、粉砕、エレクトロポレーションなど機械的方法および／または酵素処理など化学的方法によって実行されうる。白血球の単離は、白血球分離法を使用してドナーから直接実行されうる。例えば、リンパ球を含有する骨髄または組織の生の組織標本も本発明において使用されうる。かかる組織標本は、単一細胞分布を促進するために、上記のように分解される必要がある。
本発明の別の特徴は、リンパ球を含有する細胞分画、例えば、Ｂリンパ球またはＴリンパ球系列からの細胞など特定のリンパ球集団に関して、例えば、全血、単球細胞、白血球、または骨髄の強化である。Ｂリンパ球の強化は、例えば、ＣＤ１９または他のＢ細胞系列特異的マーカーなど系列特異的細胞表面マーカータンパク質を駆使する、磁気ビーズ細胞選別または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して実行されうる。Ｔリンパ球の強化は、例えば、ＣＤ３または他のＴ細胞系列特異的マーカーなど細胞表面マーカーを利用して実行されうる。
本発明の好ましい特徴は、さらに、細胞を個別に複数の容器の中へ分配する前に形質細胞を得るために強化されたＢリンパ球を選別することである。形質細胞の単離は一般に、おそらくＣＤ４５と組合せたＣＤ３８などの表面マーカーを利用するＦＳＣＳ選別によって実行される。他の形質細胞特異的表面マーカーまたはその組合せ、例えば、ＣＤ１３８、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ４０、ＣＤ９、ＨＬＡ−ＤＲ、またはＣＤ６２Ｌも利用することができ、マーカーの正確な選択は、形質細胞供給源、例えば、扁桃腺、血液、または骨髄に依存する。形質細胞も、これらの供給源のいずれかにより得られる非強化リンパ球含有細胞集団から得られうる。血液から単離される形質細胞は前駆形質細胞または形質芽球とも呼ばれる場合がある。本発明においては、これらの細胞は形質細胞とも呼ばれるが、それらは骨髄に存在する形質細胞とは対照的にＣＤ１９陽性である。形質細胞は、高頻度のこれら細胞が、所望の抗原に対する後天的免疫を反映する抗原特異的抗体を産生するため免疫グロブリンコード配列の同族対合の単離に望ましく、細胞の大部分は体細胞超変異を受けており、したがって高い親和性抗体をコードする。さらに、形質細胞におけるｍＲＮＡレベルは残りのＢリンパ球集団と比べ上昇し、したがって逆転写手順は単一形質細胞を使用するとより効率的である。形質細胞単離の代わりとして、記憶Ｂ細胞が、ＣＤ２２などの細胞表面マーカーを利用して細胞分画を含有するリンパ球から単離されうる。
本発明の他の特徴は、細胞を複数の容器の中に分配する前に抗原特異性のための強化Ｂリンパ球を選択することである。抗原特異的Ｂリンパ球の単離は、表面露出免疫グロブリンに対する抗原の結合を可能にする所望の抗原または複数の抗原と強化Ｂリンパ球を接触させた後、結合剤を単離することによって実行される。これは、例えば、磁気ビーズを所望の抗原または複数の抗原でコーティングした後、磁気ビーズ細胞選別によって、ＦＳＣＳによって、カラムを抗原でコーティングした後、親和性クロマトグラフィーによって、フィルタスクリーニングアッセイまたは技術的に周知の他の方法によって行われうる。形質細胞ならびにＢリンパ球、非強化単核細胞、白血球、全血、骨髄、または組織標本を、必要に応じて抗原特性に関して単離にかけられうる。
本発明の他の特徴は、記憶Ｔ細胞の分画を得る表面マーカーＣＤ４５Ｒ０および／またはＣＤ２７を使用することにより強化Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ３陽性細胞）を選別することである。Ｔリンパ球はＭＨＣペプチド複合体を使用することによりＭＨＣ抗原特異性についても選択されうる（例えば、カラン（Ｃａｌｌａｎ）、Ｍ．Ｆ．ら、１９９８年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７、１３９５−１４０２頁、ノバック（Ｎｏｖａｋ）、Ｅ．Ｊ．ら、１９９９年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １０４、Ｒ６３−Ｒ６７頁）。
本発明の別の特徴は、上記の単離細胞分画のいずれか（例えば、Ｂリンパ球、形質細胞、記憶細胞、またはＴリンパ球）の不死化である。不死化は、例えば、細胞分布の前にエプスタイン・バーウイルスで実行されうる（トラジアーニ（Ｔｒａｇｇｉａｉ）、Ｅ．ら、２００４年、Ｎａｔ Ｍｅｄ １０、８７１−８７５頁）。あるいは、単離単一細胞は、逆転写の前に不死化され、拡大されうる。トラジアーニ（Ｔｒａｇｇｉａｉ）ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．、２００４年８月、１０（８）：８７１−５頁。
本発明の別の特徴は、所望の細胞の集団（例えば、ハイブリドーマ細胞、Ｂリンパ球またはＴリンパ球系列の細胞系、全血細胞、骨髄細胞、単核細胞、白血球、Ｂリンパ球、形質細胞、抗原−特異的Ｂリンパ球、記憶Ｂ細胞、Ｔリンパ球、抗原／ＭＨＣ特異的Ｔリンパ球、または記憶Ｔ細胞）を個別に、単離単一細胞の集団を得るために複数の容器へ分布させることである。この単一細胞の単離は、単一容器が単一細胞を含有し、またはマイクロアレイ、チップ、もしくはゲルマトリクスが単一細胞を産生するようにして装填される方法で細胞の集団からの細胞の物理的分離を指す。細胞は、限界希釈によって単一容器のアレイなど多数の容器へ直接分布されうる。本発明で使用される単一容器は、好ましくは、ＰＣＲに適用可能なものである（例えば、ＰＣＲチューブ、および９６ウェルもしくは３８４ウェルＰＣＲプレート、またはより大きなアレイの容器）。しかし他の容器も使用されうる。単一細胞を多数の単一容器（例えば、３８４ウェルプレート）へ分配すると、単一細胞の集団が得られる。かかる分布は、例えば、平均して１、０．５、または０．３細胞の細胞濃度を含む大きな塊を単一容器へ分配しすることによって実行され、それよって平均して単一細胞もしくはそれ以下を平均して含有する容器を得ることができる。限界希釈による細胞の分布が統計的事象であるため、容器の分画は空となり、主な分画は単一細胞を含有することになり、より小さな分画は２つもしくはそれ以上の細胞を含有することになる。２つもしくはそれ以上の細胞が容器に存在する場合、可変領域コード配列の一部のスクランブルが容器に存在する細胞の中で起こりうる。しかし、これは小さな事象であるため、本発明の全体的な有用性に影響を及ぼすことはない。また、所望の結合親和性および特異性を有することがない可変領域コード配列の組合せは、スクリーニング方法中に選択されず、したがって除去されない可能性がきわめて高くなる。したがって、スクランブルの小さな事象は、本発明の最終ライブラリーに大きく影響を及ぼすことはない。
例えば、単一細胞を単一容器へ正確に分配するようにプログラムされうるＦＡＣＳマシンまたはロボットなど細胞選別装置を使用する限界希釈による細胞分布の代替がある。これらの代替は、面倒ではなく単一容器への単一細胞の分布を均一に得る上でより効率的であるため好ましい。
上記の強化、選別、および単離手順は、細胞の大半が無傷の状態を保つように実行される。強化および選別中の細胞の破壊は結果として可変領域コード配列のスクランブルをもたらしうる。しかし、これは、破壊頻度が低く予想されるため問題であると思われない。分布の前の細胞の洗浄および単一容器への可能なＲＮＡｓｅ処理により、方法中に漏れたＲＮＡが除去される。
さらに、単一容器の集団で単一細胞の集団を得るために細胞をいかに分配するかについての上記の説明を考えると、すべての容器が単一細胞を含有しなければならないということを絶対的に必要な特徴と解釈すべきではない。もっと正確に言えば、容器の大半は単一細胞を含有し、例えば、２つもしくはそれ以上の細胞を有する容器の数は分配された細胞の総量の２５％未満であり、または１０％未満であることがより好ましい。
本発明の別の特徴は、複数の容器の中に個別に分配された細胞由来のテンプレートを使用する逆転写の実行である。
逆転写（ＲＴ）のために、本発明によれば、ＲＴのテンプレート源として役立つべき単一細胞内の核酸は単一細胞由来とみなされるが、それらは必ずしもその単一細胞の残りの内容物から分離されているわけではない。
単一容器への単一細胞の最終分布が実行されていると、単一細胞は逆転写の前に同質細胞の集団を得るために拡大されうる。この方法はテンプレートとして使用されるより多くのｍＲＮＡをもたらすが、これは稀な標的が増幅され、連結される場合には重要でありうる。しかし、細胞は、拡大中に標的遺伝子に関して遺伝学的に同一でなくてはならない。単離細胞または同質細胞の集団は、無傷の状態を保ち、または逆転写のテンプレートが変性されていない限り溶解されているかのいずれかでありうる。好ましくは、細胞は、以下の逆転写およびＰＣＲ増幅を容易にするために溶解されている。
本発明の異なる実施形態においては、開示されている多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ法または多重ＲＴ−ＰＣＲの後の、ライゲーションまたは組換えによる連関も、単一容器へ分離されていないが、すべていっしょに細胞のプールとして残存している遺伝学的に多様な細胞の集団由来のテンプレートで利用されうる。この方法は、コンビナトリアルライブラリーの生成のために使用されうる。かかる方法は単一細胞の分布を必要としない。しかし、この方法において使用されうる細胞は、単一細胞法、例えば、選別されたＢリンパ球またはＴリンパ球の集団（プール）について記載されたものと同じである。単一ステップの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ法または単一ステップの多重ＲＴ−ＰＣＲの後、かかる細胞集団でライゲーションまたは組換えにより連関を実行する場合、反応前に細胞を溶解し、必要に応じて、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡが溶解物から単離されうることが好ましい。
本発明の単一ステップの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲの感度は、きわめて低い量のテンプレートの使用を可能にする。実施例２および３に示されているように、単一ステップの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲは、単一細胞の溶解物に対応する量のテンプレートで実施されうる。
プライマーの混合と設計
本発明のプライマーの混合は、目的とする少なくとも２つの異なる標的配列を増幅することが可能である、プライマーセットを２つずつ形成する少なくとも４つのプライマーを含んで成る。２つもしくはそれ以上のかかるプライマーセットの混合物は、多重プライマーミックスを構成する。好ましくは、多重ミックスは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０（、）１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０のプライマーセット（プライマー対合）を含んで成る。特に可変領域コード配列の増幅のためには、多重プライマーミックス内の個々のプライマーセットが３つ以上の数個のプライマーを構成しうる。好ましくは、個々のプライマーセットは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、もしくは３００プライマーを含んで成る。好ましくは、多重プライマーミックスにおけるプライマーの総数は少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、もしくは２００であり、多くとも２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、もしくは４００のプライマーである。
本発明のすべてのプライマーは遺伝子特異的領域を含んで成り、かつ好ましくは、すべてのプライマーはさらにプライマーの５’末端でプライマーテール、すなわち、遺伝子特異的プライマー部の３’に融合される５’非コーディング配列を備えている。かかるプライマーテールは、約６〜５０個のヌクレオチドの長さであるが、必要に応じて、より長くもなりうる。増幅に際してプライマーテールは標的配列に追加される。
本発明のプライマーテールは、例えば、クローン化テール、ライゲーションによる連関に適合されたテール、組換えによる連関に適合されたテール、またはオーバーラップ・エクステンションテールなど連関テールである。
クローン化テールは、６〜２０個のヌクレオチドの長さもしくはそれ以上であり、かつ適切なベクターへの連結産物の挿入に有用である制限部位および／または組換え部位を含んで成る。
ライゲーションによる連関を可能にするために、多重プライマーミックスのプライマーセットは、第１のプライマーセットの一部（順方向または逆方向プライマー）が、開裂に際して第２のプライマーセットの一部の連関テールに位置した制限部位と適合性である制限部位を含有する連関テールを備えるように設計されている。３つ以上の標的配列の連関のために、第２のプライマーセットの第２の部は、開裂に際して第３のプライマーセットの一部に位置した制限部位と適合性である制限部位を備えている。第２のプライマーセットに位置したこの第２の制限部位は、第１のプライマーセットの制限部位と非適合性でなければならない。相当数の標的配列が、このようにしてプライマーセットを設計することによって連結されうる。標的配列において低頻度または発生しない制限部位が、標的配列において選択されるべきである。さらに、適合性の制限部位は、ライゲーションの部位が使用される特定の制限酵素に対して開裂抵抗性となるように同一ではないのが好ましい。これは同一の標的配列間の連関が制限酵素によって開裂可能であるため、標的配列１の標的配列２との連関に対する反応を推進する。制限部位の適切な対合は、例えば、ＸｂａＩを有するＳｐｅＩ（あるいは、ＮｈｅＩまたはＡｖｒＩＩがこれらの一方または両方を置換しうる）、ＢｓｐＨＩを有するＮｃｏＩ、ＭｆｅＩを有するＥｃｏＲＩ、またはＮｓｉＩを有するＰｓｔＩである。連関については、ＳｐｅＩは、例えば、標的配列１に位置し、ＸｂａＩは標的配列２に位置し、ＮｃｏＩは標的配列２の他の末端で位置し、ＢｓｐＨＩは標的配列３などに位置しうる。方法をさらに単純化するために、制限酵素が同じバッファーで機能すれば有利である。
組換えによる連関を可能にするために、多重プライマーミックスのプライマーセットは、例えば、本明細書で参照により援用される、チャパル（Ｃｈａｐａｌ）（１９９７年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３、５１８−５２４頁）による論文で例示されているように設計されうる。
多重ＰＣＲ増幅と同じステップで目的とするヌクレオチド配列の連関を可能にするために、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲに適合されたテールが多重プライマーミックスの各プライマーセットの少なくとも１つに追加され、それによって多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを生成する。
オーバーラップ・エクステンションテールは一般的に長く、長さが８〜７５個のヌクレオチドであり、プロモーター、リボソーム結合部位、末端配列、またはｓｃＦｖにおけるようなリンカー配列など調節エレメントのその後の挿入を可能にする制限部位または組換え部位を含有しうる。オーバーラップ・エクステンションテールは、必要に応じて、終止コドンをも含有しうる。一般に、図１に示されているように、３タイプのオーバーラップ・エクステンションテールがある。タイプＩにおいては、２つのプライマーセットのオーバーラップ・エクステンションテールは単に互いにオーバーラップしている。２つのオーバーラップ・エクステンションテールのヌクレオチドのすべてが必ずしも互いを相補するわけではない。本発明の一態様において、相補的ヌクレオチドはオーバーラップ・エクステンションテールの６０〜８５％を示す。タイプＩＩのオーバーラップ・エクステンションテールにおいては、５’ヌクレオチドの４〜６個が隣接標的配列の遺伝子特異的領域に相補的である。タイプＩＩＩのオーバーラップ・エクステンションテールにおいては、オーバーラップ全体が隣接標的配列に相補的である。タイプＩおよびＩＩのオーバーラップ・エクステンションテールは、調節エレメントなどがその後に連結標的配列間に挿入されると好ましい。タイプＩＩのオーバーラップ・エクステンションテールは、標的配列がｓｃＦｖで見られるように明確なリンカーによって連結されるならば好ましい。タイプＩＩＩのオーバーラップ・エクステンションテールは、標的配列が互いにインフレーム連結されるならば好ましい。
オーバーラップ・エクステンションテールの設計は、長さ、相対ＧＣ含量（ＧＣ％）、制限部位の存在、パリンドローム、融解温度、それらが結合る遺伝子特異的部分等など配列特徴に依存している。オーバーラップ・エクステンションテールの長さは、８〜７５個のヌクレオチド長、好ましくは、１５〜４０個のヌクレオチド長である。さらに好ましくは、それらは２２〜２８個のヌクレオチド長である。きわめて長いオーバーラップ・エクステンションテール（５０〜７５個のヌクレオチド）は、各プライマーセットによって生じる産物の連関に有利でありうる。しかし、オーバーラップ・エクステンションテールの長さと遺伝子特異的領域との間の比率は、きわめて長いオーバーラップ・エクステンションを使用する場合にはおそらく調節される必要がある。ＧＣ％選好はオーバーラップ・エクステンションテールの長さに依存する。より短いテールは、それらが相補的である短い領域を有するため、長いテールよりも相互作用を強化する高いＧＣ％が必要である。プライマー設計の他の原則は同様に確認され、例えば、プライマーの二量化およびヘアピン形成が最小限にされる。それらはいずれも誤ったプライミングに関与することはない。さらに、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはしばしば、新たに合成されたＤＮＡ鎖の３’末端でアデノシン（Ａ）を追加することが周知であり、これはオーバーラップ・エクステンションテールにおいてオーバーラップ・エクステンションテールが３’非テンプレートＡ追加の適応を可能にすることによって適応されうる。
連関テール、例えば、オーバーラップ・エクステンションテール、ライゲーションによる連関に適合されたテール、または組換えによる連関に適合されたテールを持っているプライマーの選択は、標的配列の連関の順序および方向を規定する。本発明にはそれがプライマーセットの順方向プライマーまたは逆方向のプライマーであるか、あるいは連関テールを備えている順方向と逆方向の両方のプライマーであるかどうかは重要ではない。しかし、最終産物における標的配列の順序および方向は、例えば、プロモーターおよび末端配列など調節エレメントの挿入のため、または個々の標的配列のインフレーム連関のために関連性であるため、いずれにしてもこの点を少なからず考慮すべきである。
目的とする２つのヌクレオチド配列の連関のために、連関テールは各標的配列のＰＣＲ増幅に使用される各プライマーセットの逆方向プライマーまたは順方向プライマーのいずれかに追加されうる。本発明は、オーバーラップ・エクステンションテールおよびライゲーションによる連関に適合されたテールの各セットのＶＨおよびＶＬ順方向プライマーへの追加を例示している（例えば、それぞれ、図２および実施例９）。これは結果として、５’〜５’（ヘッド−ヘッドおよび双方向）である産物の連結方向がもたらされる。しかし、連関テールは各セットの逆方向プライマーにも追加されうる（例えば、第１のセットにおけるＣκおよび／またはＣλおよび第２のセットにおけるＣＨまたはＪＨ）。これは結果として３’〜３’（テール−テールおよび双方向）である産物の連結方向がもたらされる。第３のオプションは、連関テールを第１のプライマーセットの逆方向プライマー（例えば、Ｃκおよび／またはＣλプライマー）および第２のセットの順方向のプライマー（例えば、ＶＨプライマー）またはその逆に追加することである。これは結果として３’〜５’の方向（ヘッド−テールおよび一方向）をもたらす。図３は、連関テールを備える各プライマーセットのプライマーに依存して生成されうる可能な方向を示す。
目的とする３つ以上のヌクレオチド配列を連結する場合、プライマーセットの一部は、１つのテールが先のプライマーセットのテールに相補的であり、もう一方のテールが後のプライマーセットのプライマーの１つに相補的であるように順方向と逆方向のプライマー上に連関テールを有する必要がある。この原理は、２つの他の標的配列間で連結される標的配列を増幅するすべてのプライマーセットに適用できる。
遺伝子特異的プライマー部の設計は一般に、プライマーの二量化、ヘアピン形成、および非特異的アニーリングを最小限に抑えるなど既知のプライマー設計を観察すべきである。さらに、３’塩基としての複数のＧまたはＣヌクレオチドが可能であれば回避されるべきである。プライマーセットにおける遺伝子特異的領域の融解温度（Ｔｍ）は、好ましくは、互いにプラス／マイナス５℃に相当する。本発明において、４５℃〜７５℃のＴｍ値が望ましく、約６０℃のＴｍ値が大部分の用途に最適である。有利には、初期プライマー設計はこの作業のために開発されたコンピュータプログラムによって支援されうる。しかし、プライマー設計は一般に実験室試験および定期的な最適化が必要である。これは、例えば、プライマーセットを使用して得られる増幅産物のサイズ、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびシークエンシングを分析することによって行われうる。プライマー内の変性位置の使用は、可変領域を有する配列を増幅する場合、またはタンパク質の特定のクラスに属する新しいファミリーメンバーを検索する場合に有用な方法である。変性位置の数も最適化を必要としうる。
本発明は、高度多重フォーマットでいっしょに使用されうる改善されたプライマーセットを含む。ハールト（Ｈａａｒｄ）（デ・ハールト（ｄｅ Ｈａａｒｄ）、Ｈ．Ｊ．ら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、１８２１８−１８２３０頁）によって記載されたプライマーセットは起点として使用され、プライマーの３’末端をトリミングし、非特異的相互作用を削減し、かつオーバーラップ・エクステンションテールまたはライゲーションによる連関のために適合されたテールを追加することによって修飾した。
本発明の一特徴は、増幅をプライムし、かつ目的とする少なくとも２つのヌクレオチド配列の連関を促進する少なくとも２つのプライマーセットから成るプライマーミックスである。本発明のプライマーミックスは、例えば、酵素、阻害物質、構造的タンパク質、毒素、チャンネルタンパク質、Ｇタンパク質、受容体タンパク質、免疫グロブリンスパーファミリータンパク質、輸送タンパク質等のクラスに属する、ヘテロメリックタンパク質からの少なくとも２つのサブユニットまたはドメインの増幅をプライムすることが可能である。
本発明の別の特徴は、プライマーセットを含んで成る多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスであり、ここで各プライマーセットの少なくとも１つのプライマーセットメンバーは、第２のプライマーセットのプライマーセットメンバーのオーバーラップ・エクステンションテールとハイブリダイズすることが可能なオーバーラップ・エクステンションテールを含んで成る。
オーバーラップ・エクステンションテールは、プライマーセットから生じる各個別産物に隣接する産物に相補的であるテールを備えることによって多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ増幅中に目的とするヌクレオチドの即時連関を可能にする。しかし、これは連関がこの第１のＰＣＲ増幅中に必ず起こることを意味しない。反応設定によって、実際の連関の大半は、第１のＰＣＲ増幅のアウタープライマーによる追加の増幅（多重ＰＣＲ増幅）中に実行されうる。
本発明の別の特徴は、可変領域コード配列を含有するヌクレオチド配列のファミリーを増幅するように設計されたプライマーセットである。かかるファミリーの例は、免疫グロブリンからのκ軽鎖（例えば、ヒトにおけるＶＫＩ−ＶＩ）、λ軽鎖（例えば、ヒトにおけるＶＬ１−１０）、および可変重鎖（例えば、ヒトにおけるＶＨ１−７およびマウスにおけるＶＨ１−１５）、およびα、β、γ、またはδ ＴｃＲ可変領域である。可変領域コード配列を含有するヌクレオチド配列のファミリーの増幅のためのプライマーセットはしばしば、いくつかのプライマーが変性プライマーでありうる複数のプライマーを含んで成る。免疫グロブリン軽鎖可変領域コード配列のファミリーの増幅は、例えば、定常領域κ（Ｃκプライマー）および／またはλプライマー（Ｃλプライマー）（逆方向プライマー）または複数のかかるプライマーとともに、κ鎖（ＶＬκプライマー）またはκリーダー配列（ＶＬκＬプライマー）および／またはλ鎖（ＶＬλプライマー）またはλリーダー配列（ＶＬλＬプライマー）（順方向プライマー）の可変領域の５’末端に相補的である複数のプライマーから成るプライマーセットを使用することにより実行される。あるいは、軽鎖接合領域プライマー（ＪＬκおよび／またはＪＬλプライマー）が、定常領域プライマーの代わりに逆方向プライマーとして使用されうる。あるいは、順方向プライマーが可変軽鎖のリーダー配列に先行するＵＴＲ領域においてアニールする。同様に、免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列のファミリーは、さまざまなプライマー組合せを利用する１つのプライマーセットで増幅されうる。例えば、複数の重鎖接合領域プライマー（ＪＨプライマー）または重鎖定常領域プライマー（逆方向プライマー）とともに重鎖可変領域（ＶＨプライマー）またはこの領域のリーダー配列（ＶＨＬプライマー）（順方向プライマー）の５’末端に相補的である複数のプライマー。ＣＨプライマーは、アイソタイプ特異的ありうるとともに、原理上はすべてのＣＨプライマー（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）、結果として完全長重鎖をもたらすものも利用されうる。あるいは、順方向プライマーは可変重鎖のリーダー配列に先行するＵＴＲ領域においてアニールする。
可変領域の５’末端の代わりにリーダー配列においてアニールする順方向プライマーの使用は、交差ハイブリダイゼーションが可変領域プライマーについて観察される場合には特に有用である。その後、交差ハイブリダイゼーションによる変異は、リーダー配列が細胞内でのタンパク質処理中に開裂されるため最終タンパク質から除去される。実施例９は、抗体可変重鎖およびκ軽鎖リーダープライマーの設計を記載する。プライミングの部位がリーダーコード配列の３’末端（Ｃ末端）に位置している態様は従来の抗体リーダープライマーに対して有利であるが、これは両方の系において機能的リーダー配列を可能にするやり方で細菌と真核性発現ベクターとの間で増幅された配列の輸送を可能にするためである。実施例９に記載された設計系は、抗体λ軽鎖、ＴｃＲα、β、γ、またはδ鎖にも容易に適用されうる。
本発明の一特徴は、可変領域コード配列に先行するリーダーコード配列の３’末端においてアニールするプライマーであり、可変領域コード配列の増幅のためのその使用である。
本発明の好ましい特徴は、重鎖リーダーコード配列（ＶＨＬプライマー）のＣ末端においてアニールするプライマーに対応する配列番号８６〜９２の遺伝子特異的領域と少なくとも９０％の配列同一性（好ましくは、少なくとも９５％の同一性）を有するプライマーの使用である。これらの配列番号の遺伝子特異的配列は、配列の３’末端の塩基番号１８に対応する（表１１も参照）。
本発明の他の好ましい特徴は、κ軽鎖リーダーコード配列（ＶＬκＬプライマー）のＣ末端においてアニールするプライマーに対応する配列番号９３〜９８の遺伝子特異的領域と少なくとも９０％の配列同一性（好ましくは、少なくとも９５％の同一性）を有するプライマーの使用である。これらの配列番号の遺伝子特異的配列は、配列の３’末端の塩基番号２５に対応する（表１１も参照）。
本発明の一実施形態においては、多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲおよびおそらく逆転写ステップにも利用される多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスは、ａ）免疫グロブリン軽鎖領域コード配列のセンス鎖に相補的である少なくとも１つのＣＬまたはＪＬプライマー、ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域コード配列のアンチセンス鎖に相補的であり、かつａ）におけるプライマーでプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのＶＬ５’プライマーまたはＶＬリーダープライマー、ｃ）免疫グロブリン定常重鎖ドメインコード配列または重鎖接合領域のセンス鎖に相補的である少なくとも１つのＣＨまたはＪＨプライマー、およびｄ）免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列のアンチセンス鎖に相補的であり、かつｃ）におけるプライマーでプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのＶＨ５’プライマーまたはＶＨリーダープライマーを含んで成る。
本発明のプライマーセットは、例えば、可変領域コード配列を増幅することが可能な、ＶＬκ＋Ｃκ、ＶＬλ＋Ｃλ、ＶＬκ＋ＪＬκ、ＶＬλ＋ＪＬλ、ＶＬκＬ＋Ｃκ、ＶＬλＬ＋Ｃλ、ＶＬκＬ＋ＪＬκ、ＶＬλＬ＋ＪＬλ、ＶＨ＋ＪＨ、ＶＨ＋ＣＨ、ＶＨＬ＋ＪＨ、またはＶＨＬ＋ＣＨ、またはこれらの組合せでありうる。
別の実施形態においては、ＣＬ（ＪＬ）プライマーおよびＶＬ（ＶＬＬ）プライマーが、κ軽鎖可変領域またはλ軽鎖可変領域を含んで成る配列を増幅するために適合されている。
本発明の好ましい実施形態においては、ＣＬ（ＪＬ）プライマーおよびＶＬ（ＶＬＬ）プライマーが、κおよびλ軽鎖可変領域コード配列を増幅するために適合されている。
本発明のさらにより好ましい実施形態においては、配列番号９３〜９８の遺伝子特異的領域と少なくとも９０％の配列同一性（好ましくは、少なくとも９５％同一性）を有する軽鎖増幅ＶＬＬプライマーの順方向プライマーおよび配列番号８６〜９２の遺伝子特異的領域と少なくとも９０％の配列同一性（好ましくは、少なくとも９５％同一性）を有する重鎖増幅ＶＨＬプライマーの順方向プライマーである。
本発明の別の実施形態においては、免疫グロブリンＶＬ／ＶＬＬおよびＶＨ／ＶＨＬは、好ましくは、相補的オーバーラップ・エクステンションテールの形でプライマー連関テールを持っている。これは、ヘッド−ヘッドの方法で連結されている可変領域コード配列を生成する。ヘッド−テールの方法での可変領域コード配列の連関については、ＣＬ／ＪＬおよびＶＨ／ＶＨＬプライマーの各々が、好ましくは、相補的オーバーラップ・エクステンションテールの形で連関テールを含有する。テール−テールの方法での可変領域コード配列の連関については、ＣＬ／ＪＬおよびＣＨ／ＪＨプライマーが、好ましくは、相補的オーバーラップ・エクステンションテールの形で連関テールを含有する（図３）。
好ましくは、多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを含む、本発明の多重プライマーミックスは、２つのプライマーセットを含んで成る。したがって、多重プライマーミックスは、少なくとも４つの異なるプライマーを含んで成る。本発明の別の態様においては、多重プライマーミックスは、４つ以上の異なるプライマーを含んで成る。本発明の多重プライマーミックスは、単一容器における標的配列の増幅に使用される。例えば、κ、λ、および重鎖可変領域がすべて同じ容器で増幅される。本発明の１つの多重プライマーミックスは、以下のように分布された１６種類の変性プライマーで構成された。すなわち、８個のＶＨプライマー、１個のＣＨ１プライマー、６個のＶＬκプライマー、および１個のＣκプライマー（図２）。他のセットは、以下のように分配された１９個の変性プライマーで構成された。すなわち、８個のＶＨプライマー、４個のＪＨプライマー、６個のＶＬκプライマー、および１個のＣκプライマー。第３のセットは、以下のように分配された２２個の変性プライマーで構成された。すなわち、８個のＶＨプライマー、１個のＣＨ１プライマー、１１個のＶＬ１プライマー、および２個のＣλプライマー。第４のセットは以下のように分配さされた２７個の変性プライマーで構成された。すなわち、８個のＶＨプライマー、１個のＣＨ１プライマー、６個のＶＬＫプライマー、１個のＣκプライマー、１１個のＶＬλプライマー、および２個のＣλプライマー。
本発明は、多重ＲＴ−ＰＣＲの後、ライゲーションまたは組換え、または多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲによる連関に
よって得られる連結産物の追加のＰＣＲ増幅のためのプライマーをも含む。この追加のＰＣＲ増幅は、連結標的配列を増幅するために適合されたプライマーミックスを使用ことにより実行されうる。かかるプライマーミックスは、多重プライマーミックス、または多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスのアウタープライマーを含んで成りうるが、これは連結ヌクレオチド配列のセンス鎖の最も外側の５’末端および３’末端にアニールし、それによって連結産物全体の増幅を可能にするプライマーを意味する。本発明におけるアウターとして利用されうるプライマーの一例は、ＪＨまたはＣＨプライマーでプライマーセットを形成するＣκ／Ｊκおよび／またはＣλ／Ｊλプライマーである。この方法は一般に多重ＲＴ−ＰＣＲの後、ライゲーションまたは組換えによる連関、または多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲによって得られる連結産物の量を増大させるために役立つ。
あるいは、一次多重ＲＴ−ＰＣＲまたは多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応で使用されるアウタープライマーと比べネステッドされているプライマーセットが、連結ヌクレオチド配列の追加の増幅に使用されうる。本発明において、かかるプライマーセットはネステッドプライマーセットと呼ばれる。ネステッドプライマーの設計は一般に、それらが多重ＲＴ−ＰＣＲまたは多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲにおいて使用されるアウタープライマーのアニーリング位置に３’をプライムすることを除き、既述の遺伝子特異的プライマーに対するものと同じ設計規則を守る。したがって、ネステッドＰＣＲに由来する産物は、多重ＲＴ−ＰＣＲの後、ライゲーションまたは組換えに、または多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲによる連関によって得られる連結産物よりも短い。連結産物の量を増大させることに加えて、ネステッドＰＣＲはさらに、特に多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ法の全体的な特異性を増大させるのに役立つ。しかし注目すべきは、既述されている多重プライマーミックス／多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスのすべてが、追加の増幅を実行する際にネステッドプライマーセットとの組合せに適切であるわけではないことである。かかる場合には、多重プライマーミックス／多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスのアウタープライマーが追加の増幅のために使用され、または半ネステッドＰＣＲが以下に記載されているように適用されうる。
本発明の一実施形態においては、ＪＬおよびＪＨプライマーの混合物が連結免疫グロブリン可変領域コード配列の追加の増幅のためのネステッドプライマーとして使用される。
本発明のネステッドプライマーセットは、第１の多重プライマーミックス／多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスからの逆方向（または順方向）アウタープライマー、および第１の多重プライマーミックス／多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスの順方向（または逆方向）アウタープライマーのアニーリング位置に３’をプライムする第２のネステッドプライマーでも構成されうる。追加のＰＣＲ増幅のためのかかるプライマーセットの使用は一般に半ネステッドＰＣＲとして周知である。半ネステッドＰＣＲは、例えば、かかるプライマーは相補性決定領域（ＣＤＲ）においてアニールする必要があるため、例えば、可変領域配列（ＶおよびＪプライマー）のための特異的領域におけるネステッドプライマーを設計することが困難である場合には適用されうる。さらに、半ネステッドＰＣＲは、連結配列の１つの末端が、例えばクローン化のために無傷の状態を保つことが望まれる場合に使用されうる。
本発明の一特徴は、追加の増幅反応中に無傷で保たれた定常軽鎖コード配列を維持する。追加の増幅に使用されるＣＬ（逆方向）プライマーは、一次反応（多重ＲＴ−ＰＣＲまたは多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応）に使用されるアウタープライマーと比べわずかしか修飾されていない。この修飾は、一次増幅に使用されるＣＬプライマーの３’末端に数個の塩基を追加することを含んで成る。さらに、異なるクローン化テールがネステッドＣＬプライマーに追加されうる。追加の増幅において使用される順方向プライマーは、一次反応で使用される定常重鎖特異的アウタープライマーと比べ完全にネステッドされている。一次反応におけるアウタープライマーと追加の増幅における完全にネステッドされた順方向プライマーとともにわずかに修飾されたネステッドＣＬプライマーの併用は結果として、完全にネステッドされたプライマーセットを使用するネステッドＰＣＲで達成されるものと同等である特異性の増大をもたらす。
本発明の好ましい実施形態においては、ネステッドＰＣＲは、ＪＨプライマー、および２〜１０個の遺伝子特異的塩基対が多重プライマーミックス／多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスの第１のＣＬプライマーと比べ３’末端で追加されている修飾ＣＬプライマーで実行される。
多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲの最適化
２ステップおよび単一ステップ手順の多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲステップのパラメータは、いくつかのパラメータで最適化されうる（例えば、ヘネガリウ（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ）、Ｏ．ら、１９９７年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３、５０４−５１１頁、マルコウレイトス（Ｍａｒｋｏｕｌａｔｏｓ）、Ｐ．ら、２００２年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１６、４７−５１頁を参照）。一般に同じ最適化パラメータが多重ＲＴ−ＰＣＲに適用されるが、アウタープライマーとインナープライマーとの比はかかる反応には重要ではない。
ａ．プライマー濃度
オーバーラップ・エクステンションテールを持っているプライマー（例えば、ＶＨおよびＶＬプライマー）の濃度は、好ましくは、オーバーラップ・エクステンションテールなしのアウタープライマー（例えば、ＪＨおよびκプライマー）の濃度よりも低い。
標的配列の１つがその他よりも低い効率で、例えば、高いＧＣ％の結果として増幅する場合は、増幅効率を均一にする可能性がありうる。これは低い効率で増幅を仲介するプライマーセットの高い濃度を使用し、または他のプライマーセットの濃度を低下させることによって行われうる。例えば、重鎖可変領域をコードする配列は高いＧＣ％を有し、したがって軽鎖可変領域よりも低い増幅効率を有する傾向がある。これはＶＨプライマーよりも低い濃度でＶＬプライマーを使用する方向を示す。
さらに、多数のプライマーを使用する場合、総プライマー濃度は問題となりうる。上限は実験的に滴定実験によって決定される。アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の「ＡｍｐｌｉＴａｑ」ＰＣＲシステムについては、上限は１．１μＭ総オリゴヌクレオチド濃度であることがわかったが、他のシステムについては、２．４μＭという高さでありうる。総オリゴヌクレオチドのかかる上限は、個々のプライマーの最大濃度に影響を及ぼす。個々のプライマー濃度が低すぎる場合は、不十分なＰＣＲ感度の原因となる可能性が高い。
オリゴヌクレオチドプライマーの品質は、多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲにとって重要であることもわかっている。ＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドは、最良の結果をもたらした。
ｂ．ＰＣＲ循環条件
好ましくは、循環条件は以下のとおりである：
変性： １０−３０ｓ ９４℃
アニーリング： ３０−６０ｓ ５０−７０℃ プライマーのＴｍの
約５℃以下
エクステンション： １分×ＥＰＬ ６５−７２℃ ＥＰＬは予想産物の
ｋｂで表した長さ
循環数： ３０−８０
最終エクステンション： １０分 ６５−７２℃
単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲについては、以下のステップが上記に概要を示した増幅循環の前に循環プログラムへ組込まれた：
逆転写： ３０分 ４２−６０℃ これらの条件は
別々の逆転写が実行される
場合にも使用される。
ポリメラーゼ活性化： １０−１５分 ９５℃ ホットスタートポリメラーゼが
単一ステップＲＴ−ＰＣＲでは
好ましい。メーカーに従って
活性化。
これらのパラメータすべての最適化が可能である。特にアニーリング温度が重要である。したがって、最初に、最終プライマーミックスを構成することになる個々のプライマーセットすべてが、最適なアニーリング温度および時間、ならびに伸長および変性時間を個別に確認するために試験されるべきである。これにより、これらのパラメータは多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスに最適化されうる時間枠についての得策が得られる。
例えば、低いプライマー濃度またはテンプレート濃度による不十分なＰＣＲ感度の問題は、高い数の熱サイクルを使用することによって克服されうる。高い数の熱サイクルは、３５〜８０サイクル、好ましくは、約４０サイクルとなる。
さらに、長いエクステンション時間は、多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法を改善しうる。長いエクステンション時間は、通常の１分エクステンションと比べ１．５−４分×ＥＰＬとなる。
ｃ．補助剤の使用
多重ＰＣＲ反応は、ＤＮＡを緩和し、したがってテンプレート変性を容易にするＤＭＳＯ、グリセロール、またはベタインなどＰＣＲ添加剤を使用することにより大幅に改善されうる。
ｄ．ｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ２
デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の品質および濃度は多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲにとって重要である。最良のｄＮＴＰ濃度は各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の２００〜４００μＭであり、それ以上では増幅は急速に抑制される。低いｄＮＴＰ濃度（各ｄＮＴＰの１００ｍＭ）はＰＣＲ増幅を達成するのに十分である。ｄＮＴＰストックは融解／凍結サイクルに敏感である。３〜５のかかるサイクル後、多重ＰＣＲは十分に機能しない場合が多い。かかる問題を回避するには、小アリコートのｄＮＴＰを作り、−２０℃下で凍結保存することができる。
Ｍｇ２＋濃度の最適化は、大部分のＤＮＡポリメラーゼがマグネシウム依存酵素であるため重要である。ＤＮＡポリメラーゼに加えて、テンプレートＤＮＡプライマーおよびｄＮＴＰはＭｇ２＋に結合する。したがって、最適なＭｇ２＋濃度はｄＮＴＰ濃度、テンプレートＤＮＡ、およびサンプルバッファー組成に依存する。プライマーおよび／またはテンプレートＤＮＡバッファーが、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどキレート剤を含有する場合は、明らかなＭｇ２＋最適条件は変更される。過剰なＭｇ２＋濃度はＤＮＡ二重鎖を安定化し、収量を減少するＤＮＡの完全な変性を阻止する。過剰なＭｇ２＋は、不正確なテンプレート部位へのプライマーの疑似アニーリングも安定化し、それによって特異性を減少させうる。他方、不十分なＭｇ２＋濃度は産物の量を減少させる。
ｄＮＴＰとＭｇＣｌ２との間の適切なバランスは、約２００〜４００μＭ ｄＮＴＰ（各々）〜１．５〜３ｍＭ ＭｇＣｌ２である。
ｅ．ＰＣＲバッファー濃度
一般に、ＫＣｌベースのバッファーは多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲに十分であり、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、トリス−ＨＣｌ、またはその組合せなど他の成分に基づくバッファーも多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲによる機能に最適化されうる。長い産物の増幅に関与するプライマー対合は低い塩濃度（例えば、２０〜５０ｍＭ ＫＣｌ）で十分に機能するが、短い産物の増幅に関与するプライマー対合は高い塩濃度（例えば、８０〜１００ｍＭ ＫＣｌ）で十分に機能する。バッファー濃度を１×の代わりに２×に上昇させることにより多重反応の効率を改善しうる。
ｆ．ＤＮＡポリメラーゼ
本発明は、Ｔａｑポリメラーゼで実証されている。あるいは、例えば、Ｐｆｕ、Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｐｗｏ、Ｔｇｏ、Ｔｔｈ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ−ｖｅｎｔを含む他の種類の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが使用されうる。３’〜５’エクソヌクレアーゼ活性の有無によるポリメラーゼは単独または互いに組合せて使用されうる。
ベクターおよびライブラリー
本発明による目的とするヌクレオチド配列の連関は、目的とする連結ヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチドセグメントをもたらす。さらに、目的とするかかる連結核酸配列のライブラリー、特に可変領域コード配列のライブラリーが、本発明の方法によりもたらされる。
本発明の一特徴は、本発明の方法によって生成される、目的とする連結ヌクレオチド配列または目的とする連結ヌクレオチド配列のライブラリーを含むセグメントの挿入である。このライブラリーは、コンビナトリアルライブラリーまたは可変領域コード配列の同族対合のライブラリーでありうる。アウタープライマー、ネステッドプライマー、または半ネステッドプライマーによって生成される制限部位は、好ましくは、選択のベクターの適切な制限部位にマッチするように設計されている。目的とする連結核酸配列は、半ネステッド、ネステッドプライマー、またはアウタープライマーの１つが適切な組換え部位およびその１つも含有する選択のベクターを備えている場合は、組換えによってもベクターへ挿入されうる。
基本的に、本発明の多重ＲＴ−ＰＣＲ連関方法の１つによって生成される産物の担体として使用されうるベクターには制限はない。選択のベクターは、例えば、細菌、酵母、他の真菌、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳類細胞を含む細胞における増幅および発現に適切なものでありうる。かかるベクターを使用し、さらにクローン化ステップ、ベクター系間の輸送、ベクターへ挿入される産物のディスプレイ、挿入される産物の発現、および／または宿主細胞のゲノムへの組込みを促進することができる。
クローン化およびシャトルベクターは、好ましくは、細菌ベクターである。しかし、他の種類のベクターもクローン化およびシャトル手順に適用されうる。
ディスプレイベクターは、例えば、ファージベクター、もしくはｆｄ、Ｍ１３、またはｆ１糸状バクテリオファージのクラス由来のファージミドベクターでありうる。かかるベクターは、例えば、結合タンパク質またはその断片を含むタンパク質の糸状バクテリオファージの表面上のディスプレイを促進することが可能である。リボソーム、ＤＮＡ、酵母細菌、または哺乳類細胞でのディスプレイに適切なディスプレイベクターも当技術分野で周知である。これらは例えばウイルスベクター、またはキメラタンパク質をコードするベクターを含んで成る。
発現ベクターは、言及された種のすべてに存在し、完全に選択すべきベクターは発現されるタンパク質に依存する。一部の発現ベクターは、さらに、適切な組換え部位を利用する、ランダムインテグレーション、または部位特異的インテグレーションのいずれかによって宿主細胞のゲノムへ組込むことが可能である。発現ベクターは、連結産物がこれらの配列にインフレーム挿入される場合、大きなタンパク質、例えば、完全長モノクローナル抗体の発現を、適切な宿主細胞へ導入される場合に可能にする追加のコード配列を提供するように設計されうる。このインフレーム挿入は、糸状バクテリオファージまたは細胞の表面上でディスプレイを促進するキメラタンパク質の発現も促進しうる。バクテリオファージディスプレイ系においては、目的とする連結ヌクレオチド配列は、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩなどコートタンパク質をコードする配列にインフレーム挿入されうる（バルバス（Ｂａｒｂａｓ）、Ｃ．Ｆ．ら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８、７９７８−７９８２頁、カング（Ｋａｎｇ）、Ａ．Ｓ．ら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８、４３６３−４３６６頁）。
本発明の一実施形態においては、目的とする連結ヌクレオチド配列の個々のセグメントは、軽鎖可変領域コード配列を伴う免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列で構成されている。好ましくは、これらの連結配列は、１つもしくはそれ以上の免疫グロブリン定常ドメインをコードする配列を含有するベクターへ挿入される。挿入は、連結重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域コード配列が定常領域コード配列にインフレーム挿入されるように改変されている。かかる挿入は、例えば、Ｆａｂ発現ベクター、完全長抗体発現ベクター、または完全長抗体の断片をコードする発現ベクターを生成しうる。好ましくは、かかるベクターは、スクリーニングに適切な発現ベクターであり（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ファージミド、または哺乳類ベクター）、および定常領域重鎖コード配列はヒト免疫グロブリンクラスＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはＩｇＥから選択され、それによってＦａｂまたは完全長組換え抗体の発現を可能にする。定常重鎖コード配列に加えて、ベクターはヒトλまたはκ鎖から選択される定常軽鎖コード配列をも含有しうる。これは、連結ヌクレオチド配列が免疫グロブリン可変領域コード配列（Ｆｖ）のみをコードする場合に適切である。
本発明の他の実施形態においては、連結ヌクレオチド配列の個々のセグメントは、β鎖可変領域コード配列を伴うＴｃＲα鎖可変領域コード配列、またはδ鎖可変領域コード配列を伴うγ鎖可変領域コード配列で構成されている。好ましくは、これらの連結配列は、１つもしくはそれ以上のＴｃＲ定常ドメインをコードする配列を含有するベクターへ挿入される。挿入は、挿入される連結可変領域コード配列が対応するＴｃＲ定常領域コード配列にインフレームであるように改変されている。別の実施形態においては、かかるベクターは、ＴｃＲ定常領域にインフレームでロイシンジッパーをコードする配列を含むキメラ発現ベクターである。かかる構成物は可溶性ＴｃＲの安定化を増大させる（ウィルコックス（Ｗｉｌｌｃｏｘ）、Ｂ．Ｅ．ら、１９９９年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ８、２４１８−２４２３頁）。
本発明の同族対合のライブラリーは、２つの異なる方法によってベクターへ導入されうる。第１の方法においては、単一同族対合は個別に適切なベクターへ挿入される。次いで、このベクターのライブラリーは、別々に保存され、またはプールされうる。第２の方法においては、同族対合のすべてはベクター挿入の前にプールされた後、ベクターのプールライブラリーを生成する適切なベクターへインマス（ｉｎ−ｍａｓｓ）挿入される（図１２に図示）。かかるベクターのライブラリーは、大きな多様性の可変領域コード配列を含んで成る。
本発明の一態様は、連結可変領域コード配列の同族対合のライブラリーである。好ましくは、ライブラリーの個々の同族対合は、重鎖可変領域コード配列を伴う免疫グロブリン軽鎖可変領域コード配列を含んで成る。
同族対合の他の好ましいライブラリーは連結ＴｃＲ領域コード配列を含んで成るが、各個々のＴｃＲ領域コード配列は、β鎖可変領域コード配列を伴うα鎖可変領域コード配列、および／またはδ鎖可変領域コード配列を伴うＴｃＲγ鎖可変領域コード配列を含んで成る。
本発明の実施形態は、特定の標的に対する所望の結合特異性をコードする連結可変領域コード配列の同族対合のサブライブラリーである。好ましくは、これらの同族対合は、連結免疫グロブリン軽鎖可変領域および重鎖可変領域コード配列、ＴｃＲα鎖可変領域、およびβ鎖可変領域コード配列、および／またはＴｃＲγ鎖可変領域、およびδ鎖可変領域コード配列を含んで成る。
別の実施形態は、本発明の全体を通じて記載された可変領域コード配列の同族対合の親ライブラリーから選択されるサブライブラリーである。
本発明の好ましい実施形態は、ヒト免疫グロブリンクラスＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭから選択される完全長免疫グロブリンの同族対合をコードするライブラリーまたはサブライブラリーである。
本発明の他の好ましい特徴は、ＴｃＲの可溶性または安定な同族対合をコードするライブラリーまたはサブライブラリーである。
本発明の特徴は、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、または１０６の異なる同族対合で構成される多様性の該ライブラリーである。
本発明の別の実施形態においては、連結可変領域コード配列の同族対合の該ライブラリーは、本明細書に記載されたステップを含んで成る方法によって得ることが可能である。このライブラリーは親ライブラリーとも呼ばれる。
スクリーニングおよび選択
本発明の方法の１つを利用するドナーから単離された連結可変領域コード配列の対合の親ライブラリーは、一部が無関連である、すなわち、所望の標的、特にコンビナトリアルライブラリーに結合にしていない多様性の結合タンパク質を示すことが予想される。したがって、本発明は、特定の標的に対する多様性の結合特異性のサブセットをコードするサブライブラリーに対する強化およびスクリーニングを含む。
同族対合のライブラリーについては、ライブラリーの多様性は、わずかに少ない数のランダム連結可変領域を有するドナー物質に存在する多様性を示すことが予想される。したがって、強化ステップは、同族対合から成るライブラリーにおける標的特異的結合親和性のスクリーニング前に必要ではありえない。
本発明の別の実施形態においては、連結可変領域コード配列の対合のライブラリーを生成する方法は、さらに、所望の標的特異性を有する結合タンパク質をコードする連結可変領域配列の対合の一部を選択することによってサブライブラリーを作成するステップを含んで成る。連結可変領域コード配列のかかる選択は、標的特異的同族対合のライブラリーとも呼ばれる。
本発明の好ましい実施形態においては、哺乳類発現ベクターに移される可変領域コード配列の標的特異的同族対合のライブラリーである。
免疫学的アッセイは一般に標的特異的免疫グロブリン可変領域コード配列のこれらの選択に適切である。かかるアッセイは当技術分野で公知であり、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴＳ、ＥＬＩＳＡ、膜アッセイ（例えば、ウェスタンブロット）、フィルター上のアレイ、またはＦＡＣＳを構成する。これらのアッセイは、免疫グロブリン可変領域コード配列から製造されるポリペプチドを利用する直接的な方法でいずれも実行されうる。あるいは、免疫アッセイは、免疫アッセイは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌表面ディスプレイ、酵母ディスプレイ、真核生物ウイルスディスプレイ、ＲＮＡディスプレイ、または共有ディスプレイなど強化方法と組合せて、またはこれらの後に実行されうる（フィッツジェラルド（ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ）、Ｋ．、２０００年、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ５、２５３−２５８年において概説）。図１０に示されているように、同族Ｆａｂ発現ライブラリーと同族完全長抗体発現ライブラリーの両方はスクリーニングにかけられ、それによって陽性クローンのサブライブラリーを生成することができる。かかるスクリーニングアッセイおよび強化手順は、連結可変領域のＦｖもしくはｓｃＦｖ断片またはコンビナトリアルライブラリーにも適切である。
本発明の好ましい実施形態においては、可変領域コード配列の標的特異的同族対合またはコンビナトリアル対合のサブライブラリーの選択は、ハイスループットスクリーニングアッセイを使用することによって実行される。ハイスループットスクリーニングアッセイは、半自動または完全自動装置で実行されるＥＬＩＳＡアッセイでありうるが、これに限定されない。これは細菌が無人操縦で選別され、抗原結合分子を発現するコロニーのアレイ生成する寒天プレートの上部の適切な膜へ載せられる膜アッセイでもありうる。これらの分子は膜を通じて第２の基礎を成す抗原コート膜へ分泌され、これらは別々に進展され、所望の標的に向けて抗原結合分子を分泌するクローンを同定するために使用されうる（ド・ウィルト（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ）、Ｒ．Ｍ．ら、２０００年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８、９８９−９９４頁）。
抗原結合クローンの同族対合またはコンビナトリアル対合のサブライブラリーが適切な方法によって選択されている場合、連結免疫グロブリン軽鎖可変領域および重鎖可変領域コード配列のＤＮＡシークエンシングによって追加の分析を実行することが可能である。まず第一に、かかるＤＮＡシークエンシングは、ＣＤＲ領域内の生殖細胞系起源、ファミリー分布、および成熟などライブラリーの多様性に関する情報を提供する。かかる分析は、きわめて多様性を示すクローンの選択、および繰り返しクローンを取り除くことを可能にする。第二に、ＤＮＡシークエンシングは単離方法中に導入される変異を示す。
可変領域コード配列を分析する場合、変異が許容されるかどうか評価する際に考慮する３種類の変異がある。すなわち、ｉ）最も多い種類の変異は、Ｖ遺伝子プライマーが特定のＶ遺伝子ファミリー内の不適切なサブセットにプライムするファミリー内交差プライミングに由来する。導入される変更は主に特定の位置での天然起源コドンの置換である。Ｖ遺伝子ファミリー内の高度の配列相同性により、これらの変更は通常、保守的および許容可能な変更とみなされうる、ｉｉ）あまり多くない変異はファミリー間交差プライミングによって誘発され（例えば、ＶＨ３ファミリープライマーは、ＶＨ１ファミリーコード配列をプライムする）、より大きな構造的な変更を誘発し、天然の対応物を有さない場合がある。かかる変更は潜在的に新しいエピトープを作成することによって可変領域の免疫原性に影響を及ぼしうる。かかる変更は容易に確認され、その後に標準分子生物学的方法を使用して修復され、またはクローンはライブラリーから除外されうる、ｉｉｉ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによって生じるエラーは定常領域コード配列で最も容易に確認され、かつ容易に除去されうる。しかし、Ｔａｑ誘発変異はもちろん可変領域コード配列にも存在しうるが、ここでそれらは、可変領域コード配列におけるランダム変異の結果でもある、天然起源体変異と区別ができない。変異が非系統的であり、かつ明確な方法で特定の対合にのみ影響を及ぼすことを考慮すると、かかる変更を軽視することは妥当と思われる。
さらに、配列分析を用いて、ＶＨ群Ｈ４について表２０に示されているように同族対合におけるスクランブルの程度を確認することができる。
実施例９に記載されているように、ｉ）およびｉｉ）に記載された変異の存在は、可変領域の５’領域においてアニールするプライマーの代わりに可変領域コード配列のリーダー配列においてアニールするプライマーを利用する場合に、発現ライブラリーにおいて回避されうる。
本発明の別の実施形態においては、標的特異的かつおそらく配列分析された連結免疫グロブリン軽鎖可変領域および重鎖可変領域コード配列の対合のサブライブラリーは、哺乳類発現ベクターに移される。かかる移動は、前のセクションに記載されたベクターのいずれかへ実行され、完全長組換え抗体の発現を可能にする。スクリーニングが哺乳類の同族完全長抗体発現ライブラリーで実行される場合は、かかる移動は必要でない場合がある。
本発明の他の実施形態においては、親ライブラリーは、Ｔリンパ球で強化されているリンパ球を含有する細胞分画から生成される。親ライブラリーを構成する連結可変領域コード配列の対合が、同族対合またはコンビナトリアル対合のサブライブラリーを生成する所望の標的特異性を有する結合タンパク質をコードするαおよびβおよび／またはγおよびδ鎖から成る連結可変領域配列の一部をコードするために選択されうる。抗原特異的Ｔ細胞受容体はその後に、発現四量体ＭＨＣペプチド複合体による染色（例えば、カラン（Ｃａｌｌａｎ）、Ｍ．Ｆ．ら、１９９８年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７、１３９５−１４０２年、ノバック（Ｎｏｖａｋ）、Ｅ．Ｊ．ら、１９９９年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １０４、Ｒ６３−Ｒ６７頁）など標準の方法を使用するトランスフェクトされた細胞のプールから、ＩＬ−２放出の形で細胞反応を測定することによって、または酵母またはレトロウイルスディスプレイ法などの、より洗練された手段によって同定されうる。
宿主細胞および発現
本発明のライブラリーは、目的とする連結核酸配列、特に結合タンパク質またはその断片を含有する可変領域からコードされたタンパク質の発現および産生に適したベクターに移されうる。かかるベクターは、ベクターおよびライブラリーのセクションに記載されており、例えば、選択種の完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、膜結合、または可溶性ＴｃＲ、またはＴｃＲ断片の発現を提供する。
本発明の一特徴は、増幅および／または発現のための、連結可変領域コード配列の同族対合のベクターまたは連結可変領域コード配列の同族対合をコードする単一クローンのライブラリーまたはサブライブラリーの宿主細胞への導入である。宿主細胞は、細菌、酵母、他の真菌、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳類細胞から選択されうる。発現のために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０）、ＮＩＨ３Ｔ３、線維芽細胞などの哺乳類細胞、もしくはＨｅＬａ細胞、ＨＥＸ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６などの不死化されたヒト細胞が好ましい。
ベクターの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、ＲＢＣ宿主融合、プロトプラスト融合、ウイルス感染などを含む、当業者に周知の多くの形質転換またはトランスフェクション法によって達成されうる。モノクローナル完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、およびｓｃＦｖ断片の製造は公知である。
治療に使用される組換えポリクローナル抗体の製造はきわめて新しい分野である。組換えポリクローナル製造技術は、国際公開第２００４／０６１１０４号パンフレットに記載されている。手短に言えば、この技術は、細胞系の製造として適した細胞の収集物の生成を含む。この技術の以下の説明は、同族対合のライブラリーのために行われているが、当然、コンビナトリアルライブラリーに適用可能である。細胞も収集物における個々の細胞は、例えば同族対合のライブラリーから組換えポリクローナル結合タンパク質の明確なメンバーを発現することが可能である。個々の細胞が単一同族対合を発現し、ポリクローナル結合タンパク質のいくつかの同族対合を発現しないことを確実にするために、同族対合をコードする核酸配列は各個々の細胞のゲノムにおける単一部位特異的部位へ導入される。これは、各細胞から発現される重鎖および軽鎖のスクランブルを阻止するだけではなく、個々の同族対合の可変領域における小さな差を除き、互いに実質的に同一である細胞を生成するため、細胞の収集の重要な特徴である。この特性は、製造に必要な時間にわたって細胞の収集の不偏の成長を可能にする。単一部位特異的インテグレーションを確実にするために、１つのみインテグレーション部位を有する宿主細胞系が使用されるべきであり、これらは市販されており、例えば、単一ＦＲＴ部位を含有するインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞である。この細胞系のための適切なベクターは、対応するＦＲＴ部位を含有し、Ｆｌｐリコンビナーゼを使用してゲノムへ導入される。いくつかの他の周知のリコンビナーゼ、例えば、その対応する組換え部位と組合せて使用されうるＣｒｅ、βリコンビナーゼ、Ｇｉｎ、Ｐｉｎ、ＰｉｎＢ、ＰｉｎＤ、Ｒ／ＲＳ、λインテグラーゼ、またはファージＦＣ３１インテグラーゼがある。さらに適切なベクターは、部位特異的成分の選択を可能にする選択マーカーを含有する。
ポリクローナル製造細胞系の生成およびかかる細胞系からの組換えポリクローナルタンパク質の製造は、いくつかの異なるトランスフェクションおよび製造法によって得られうる。
１つの方法は、細胞ごとに単一のインテグレーション部位を有する宿主細胞系のトランスフェクションのために単一組成物へ混合されたベクターのライブラリーを使用することである。この方法は、バルクトランスフェクションまたは一括トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂｕｌｋ）と呼ばれる。一般に、既述のベクターおよび宿主細胞の設計は、不偏成長が可能なポリクローナル細胞系が適切な選択次第で得られることを確実にする。ポリクローナル細胞系の凍結ストックが、組換えポリクローナルタンパク質製造の開始前に生成される。
別の方法は、トランスフェクションのために組成物中ライブラリーの約５〜５０の個々のベクターを含有する分画に分割されたベクターのライブラリーを使用することである。好ましくは、ライブラリーの分画は、１０〜２０の個々のベクターを構成する。次いで、各組成物は宿主細胞のアリコートへトランスフェクトされる。この方法は半バルクトランスフェクションと呼ばれる。トランスフェクトされるアリコートの数は、ライブラリーのサイズおよび各分画中の個々のベクターの数に依存する。ライブラリーが、例えば、１００の異なった同族対合を構成し、これらが組成物中に２０の異なったメンバーを含有する分画へ分割される場合は、５個の宿主細胞もアリコートが最初のライブラリーの異なった分画を構成するライブラリー組成物でトランスフェクトされる必要がある。宿主細胞のアリコートは部位特異的インテグレーションのために選択される。好ましくは、異なったアリコートが別々に選択される。しかし、それらは選択前にプールもされうる。アリコートはそのクローン多様性について分析され、十分な多様性を有するもののみを使用してポリクローナル同族対合ライブラリーストックを生成する。製造のための所望のポリクローナル細胞系を得るために、アリコートは、凍結ストックを生成する前、それらがストックから回収された直後、または短い増殖および順応時間後に混合されうる。場合により、細胞のアリコートは製造の全体を通じて別々に保存され、ポリクローナルタンパク質組成物は、製造前の細胞のアリコートではなく各アリコートの産物を混合することによってアセンブルされる。
第３の方法は、同族対合のライブラリーを構成する個々のベクターを使用して宿主細胞が別々にトランスフェクトされるハイスループット法である。この方法は個別トランスフェクションと呼ばれる。個別にトランスフェクトされる宿主細胞は、好ましくは、部位特異的インテグレーションのために別々に選択される。選択と同時に生成される個別の細胞クローンが増殖時間に関して分析されうるが、好ましくは、同様の増殖速度を有するものが使用され、ポリクローナル同族対合ライブラリーストックを生成する。個別の細胞クローンを混合してストックを生成する前、それらがストックから回収された直後、または短い増殖および順応時間後に所望のポリクローナル細胞系を得ることができる。この方法は、トランスフェクション、インテグレーション、および選択中の可能な残留性配列の偏りを除去しうる。あるいは、個別にトランスフェクトされた宿主細胞は選択が実行される前に混合され、これはトランスフェクションによる配列の偏りの制御を可能にする。
上記で概要が示された製造法における共通の特徴は、組換えポリクローナルタンパク質を構成する個別の同族対合のすべてが、１つの、または限定された数のバイオリアクターにおいて製造されうる点である。唯一の差は、ポリクローナル製造細胞系を構成する細胞の収集を生成するために選択される段階である。
本発明の一実施形態は、可変領域コード配列の連結対合の同族ライブラリーまたはサブライブラリーを含んで成る宿主細胞の集団である。
別の実施形態においては、宿主細胞の集団が、多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅の後、ライゲーションまたは組換えによる、または本発明の多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ法による連関によって同族対合を連結するステップを利用するリンパ球を構成する単離単一細胞の集団から得られるライブラリーを含んで成る。
本発明の他の実施形態は、可変領域コード配列の連結対合のコンビナトリアルライブラリーまたはサブライブラリーを含んで成る宿主細胞の集団である。
本発明に記載された宿主細胞の集団は、細胞が形質転換／トランスフェクトされているライブラリーの多様性に対応する多様な細胞集団を含む。好ましくは、細胞の集団の各細胞は、同族対合の全ライブラリーの１つの同族対合のみを構成し、同族対合のライブラリーの個々のメンバーが宿主細胞の集団から発現される個々のメンバーの総数の５０％、より好ましくは２５％、または最も好ましくは１０％を越えることはない。
本発明の好ましい実施形態においては、宿主細胞の集団は哺乳類細胞である。
上記の宿主細胞の集団は、集団の個々の細胞が異なる多様性の可変領域コード配列を構成するため、組換えポリクローナル結合タンパク質の発現に利用されうる。
本発明の一実施形態は、連結可変領域コード配列に多様な同族対合をコードするベクターのライブラリーを含んで成る宿主細胞の集団から発現される組換えポリクローナルタンパク質であり、ここでかかるライブラリーは本発明の方法によって得ることが可能である。一般的に、本発明の組換えポリクローナルタンパク質は、少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、または１０６の異なる同族対合で構成されたタンパク質で構成されている。
本発明の好ましい実施形態は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の多様な同族対合をコードするベクターのライブラリーを含んで成る宿主細胞の集団から発現される組換えポリクローナル免疫グロブリンである。
本発明の他の好ましい実施形態は、β鎖可変領域コード配列と連結されたＴｃＲα鎖可変領域および／またはδ鎖可変領域コード配列と連結されたＴｃＲγ鎖可変領域の多様な同族対合をコードするベクターのライブラリーを含んで成る宿主細胞の集団から発現される組換えポリクローナルＴｃＲである。
本発明の他の実施形態は、モノクローナルタンパク質の製造に適した宿主細胞である。特に、重鎖可変領域を有する軽鎖可変領域の同族対合で構成されたモノクローナル抗体、もしくはβ可変領域を有するα可変領域またはγ可変領域を有するδ可変領域の同族対合で構成されたモノクローナルＴｃＲである。好ましくは、かかるモノクローナル産生細胞系はハイブリドーマ細胞系ではない。
かかるモノクローナル抗体またはＴｃＲは、目的とする複数の非隣接ヌクレオチド配列を連結する方法に以下のステップ、すなわちａ）該連結核酸配列をベクターへ挿入するステップ、ｂ）該ベクターを宿主細胞へ導入するステップ、ｃ）該宿主細胞を発現に適切な条件下で培養するステップ、およびｄ）前期宿主細胞へ挿入されるベクターから発現されるタンパク質産物を得るステップを追加することによって生成されうる。好ましくは、宿主細胞へ導入されるベクターは、可変領域コード配列の個別の同族対合をコードする。
発明の用途
本発明の主な用途の１つは、同族対合のライブラリーを生成するためのハイスループット法による、可変領域コード配列、特に免疫グロブリン重および軽鎖可変領域コード配列またはＴｃＲαおよびβ鎖またはγおよびδ鎖可変領域コード配列の同族対合の連関である。同族対合ライブラリーの生成に加えて、多重ＲＴ−ＰＣＲの後、ライゲーションまたは組換え、または本発明の多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ法による連関が、遺伝学的に多様な細胞の集団、かかる細胞の集団からの細胞溶解物、またはかかる細胞の集団から精製されたＲＮＡでこの方法を実行することによって、コンビナトリアルライブラリーの生成において利用されうる。ライブラリー、サブライブラリー、またはこれらのライブラリーの１つからの単一クローンは、ポリクローナルまたはモノクローナルタンパク質の発現を促進する。特にモノクローナルまたはポリクローナル抗体が本発明のライブラリーから得られうる。
診断、治療、および予防における組換えモノクローナル抗体の使用が公知である。本発明によって生成される組換えモノクローナルおよびポリクローナル抗体は、既存の方法によって生成される抗体産物と同じ用途を有する。特に、有効成分としてポリクローナル組換え免疫グロブリンを含んで成る医薬組成物が、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と組合せて、本発明の手段によって製造されうる。より好ましくは、ポリクローナル組換え免疫グロブリンが可変領域コード配列の同族対合で構成されている医薬組成物である。ポリクローナル組換え免疫グロブリンのかかる医薬組成物は薬剤として使用されうる。組成物のポリクローナル組換え免疫グロブリンは、所定の疾患標的に対して特異的またはこれに対して反応性であり、したがって、組成物は、ヒト、家畜、またはペットなど哺乳類における癌、感染、炎症疾患、アレルギー、喘息または他の呼吸疾患、自己免疫疾患、免疫異常、心血管疾患、中枢神経系の疾患、代謝および内分泌疾患、移植による拒絶反応、または望ましくない妊娠などの疾患の治療、改善、または予防に使用されうる。
本発明はさらに、従来のモノクローナルコンビナトリアル抗体法では得ることができない用途を有する。新興感染症など、保護抗原が不十分に特徴付けられ、または完全に未知である状況においては、疾患に対する保護を提供するモノクローナル抗体のスクリーニングが不可能である。
しかし、本発明により、確立された保護抗体反応を有するドナー、例えば、回復期患者から直接、抗体発現細胞を得るとともに、これらの個体からの出発原料を使用し、免疫グロブリン重および軽鎖可変領域コード配列の同族対合のライブラリーを生成することが可能である。
例えばウイルスが既知であるが、保護抗原が未知である状況においては、ウイルス上の抗原構造物に対して広い反応性を有する同族抗体遺伝子対合のサブライブラリーを生成することが可能である。組換えポリクローナル抗体がかかるサブライブラリーから製造される場合は、保護抗体を含有する可能性が高くなる。
抗原が完全に未知である状況では、例えば、回復期患者からの同族対合ライブラリーから生成される組換えポリクローナル抗体は、高力価免疫グロブリンが今日使用されているのと同じ方法で使用されうる。この理由は同族対合であり、これは産生される組換えポリクローナル抗体が、回復期患者の抗体免疫反応に酷似することを確実にする。
本発明に記載された可変領域の同族対合を連結するための方法の他の用途は、診断および分析的目的である。薬剤を患者に投与すると、薬剤に対する免疫反応の可能性はつねに存在する。この免疫原性は、薬剤で治療された個体由来の血清または形質による薬剤特異的結合アッセイなど従来の方法によって評価されうる。あるいは、本発明の方法を使用し、可変重鎖および軽鎖コード配列の同族対合を単離することによって、薬剤の投与直後の患者の免疫反応を正確に描写することができる。次いで、かかるライブラリーから発現される抗体を薬剤または薬剤の成分に対する反応性についてスクリーニングすることができる。この方法は、形質または血清における薬剤の存在が従来の方法を妨げる場合には特に有用である。かかる薬剤は例えば抗体である。従来の方法により、抗体による治療に関して抗薬剤免疫反応（例えば、抗イディオタイプ、抗フレームワーク、または抗Ｆｃ免疫反応）の確認は、治療に使用される抗体が血液から完全に除去されていない間は実行することができない。本発明によりかかる抗薬剤抗体をコードする配列は、２週間以内に薬剤で治療された個体から単離および分析することができる。したがって、これは、薬剤一般および特に抗体ベースの薬剤は免疫原性であるかどうか評価するための代替の方法となる。
本発明の別の用途は、ワクチンおよび免疫化プログラムの検証および比較における用途である。これはワクチン開発中に特に有用であるが、それは抗体結合親和性および血清滴定の現行の比較に加えて、新規の候補ワクチンに対する反応において生成される抗体反応の配列多様性を評価し、比較することが可能であるためである。さらに、本発明を使用し、集団におけるワクチン効果の調査における抗体反応を分析、モニタリング、および比較することができる。
本発明には結合タンパク質を含有する可変領域の分野以外にも用途があることもわかる。当業者が本発明に開示された方法を、結合タンパク質以外のヘテロメリックタンパク質をコードする２つもしくはそれ以上の転写ヌクレオチド配列を連結することに適合させるのは最適化の問題にすぎない。ヘテロメリックタンパク質からのドメインまたはサブユニットをコードする配列のかかる連関は、ステップの数を相当に削減するため、これらのタンパク質コード配列の単離において有利でありうる。さらに、唯一の多重プライマーミックス／多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを使用することによって、かかるタンパク質の例えばスプライス変形、変異、または新しいファミリーメンバーを単離することが可能である。
単一タンパク質の遠位ドメインをコードする配列の連関も可能性がある。かかる方法は、中間ドメインの削除を容易にするため、マルチドメインタンパク質における特定ドメインの重要性に関して研究を容易にする。
キメラまたは結合タンパク質の生成も本発明が適用されうる分野である。連結されるタンパク質が異なる起源、例えば、ヒトとマウスのタンパク質間のキメラであっても、本発明は逆転写の前に細胞を混合することによって利用されうる。かかる細胞混合物は、各種からの細胞の集団または各種からの単一細胞のいずれかを構成しうる。
実施例１：２ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ
本実施例においては、逆転写（ＲＴ）を単離単一細胞由来のテンプレートを使用して実行し、製造されたｃＤＮＡを１つ以上のオーバーラップ・エクステンションＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。
ａ．細胞
ＩｇＧ１κ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系をＦｌｐ−Ｉｎ法（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国）を使用して生成した。
ＩｇＧκ哺乳類発現プラスミドベクターｐＬＬ１１３（図４）をＦｌｐ−Ｉｎ発現ベクター、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴに基づき構成した。ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を、メーカーの指示に従ってリポフェクタミン２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国）を使用し、抗体コード遺伝子を含有するｐＬＬ１１３、およびＦｌｐリコンビナーゼの一時的発現を提供するｐＯＧ４４と共トランスフェクトした。形質転換体を選択し、免疫アッセイによってＩｇＧκの産生について検証した。選択細胞系をＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ ｐＬＬ１１３と命名し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ、および９００ハイグロマイシンＢを補充したハム（Ｈａｍ）のＦ−１２培地（維持培地）で維持した。
ＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ ｐＬＬ１１３細胞をトリプシンを使用して回収し、維持培地で３回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を最初の量の維持培地に再懸濁した。細胞濃度をＣａｓｙ−１システム（シェルフェ・ジステム・ゲーエムベーハー（Ｓｃｈａｅｒｆｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＧｍｂＨ）、ロイトリンゲン（Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ）、ドイツ）使用して測定し、維持培地で１細胞／５μｌの濃度に希釈した。
ｂ．逆転写
平均して１つの細胞を含有するＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ ｐＬＬ１１３細胞を、９６ウェルＰＣＲプレート（サーモ・ファスト（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆａｓｔ）９６、スカート（ｓｋｉｒｔｅｄ）ＡＢ−０８００、ＡＢジーン（ＡＢｇｅｎｅ），エプソム（Ｅｐｓｏｍ）、Ｓｕｒｒｅｙ、英国）の単一ウェルへ分注した。
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）単一ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコル（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）単一ステップ（ＯｎｅＳｔｅｐ）ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｋｉｔ）、カタログ番号（Ｃａｔ＃）２１０２１０、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）で逆転写酵素（ＲＴ）ステップを利用することによって分布細胞からｃＤＮＡを合成した。
各ウェルには以下の試薬が２０μｌの総量で含まれた：
１×単一ステップＲＴ−ＰＣＲバッファー、
各々１ｍＭの最終濃度でのｄＮＴＰ、
５ｐｍｏｌオリゴポリ−ｄＴ（１８）、
２６Ｕ ＲＮａｓｅ阻害物質（ＲＮａｓｉｎ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、米国、カタログ番号Ｎ２１１１）、
２μｌの単一ステップＲＴ−ＰＣＲ酵素混合物、および
５μｌＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ ｐＬＬ１１３細胞懸濁液。
反応混合物を５５℃下で３０分間インキュベートすることによりＲＴ反応を実行した。その後、反応混合物を９４℃下で１０分間インキュベートすることにより逆転写酵素を不活性化した。
ｃ．多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ
ステップｂ）で生成されたｃＤＮＡ産物分画を多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲのテンプレートとして使用した。反応を９６ウェルプレートで実行した。
各ウェルには、４０μｌの総量で、以下の試薬が含まれた：
１×単一ステップＲＴ−ＰＣＲバッファー、
各々５００μＭの最終濃度でｄＮＴＰ、
表１に示した濃度で多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックス、
２６Ｕ ＲＮａｓｅ阻害物質（ＲＮａｓｉｎ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、米国、カタログ番号Ｎ２１１１）、
２μｌの単一ステップＲＴ−ＰＣＲ酵素混合物、および
１μｌｃＤＮＡテンプレート（単一細胞由来（ステップｂ））。
使用された多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスは、表１に示したプライマーを構成した。
Figure 2007505611
９６ウェルＭＷＧプリムス（Ｐｒｉｍｕｓ）ＨＴサーモサイクラー（ＭＷＧバイオテク（Ｂｉｏｔｅｃｈ）ＡＧ、エーバースベルク（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）、ドイツ）により以下の循環条件で反応を行った：
変性 ３０秒 ９５℃
アニール ３０秒 ５０℃ ５０サイクル
伸長 ５分 ７２℃
最終伸長 １０分 ７２℃
ｄ．ネステッドＰＣＲ
多重オーバーラップ・エクステンション産物をテンプレートとして用いてネステッドＰＣＲを実行した。反応を９６ウェルプレートで実行した。
各ウェルには、５０μｌの総量で、以下の試薬が含まれた：
１×Ｂｉｏ Ｔａｑバッファー、
各々４００μＭの最終濃度でｄＮＴＰ、
２ｍＭ ＭｇＣｌ２、
ネステッドＰＣＲプライマーミックス、
１．２５Ｕ ＢＩＯＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号ＢＩＯ−２１０４０、Ｂｉｏｌｉｎｅ、英国）、および
１μｌ多重オーバーラップ・エクステンション産物（ステップｃ）。
使用されたプライマーは表２に示されている。
Figure 2007505611
９６ウェルＭＷＧプリムス（Ｐｒｉｍｕｓ）ＨＴサーモサイクラー（ＭＷＧバイオテク（Ｂｉｏｔｅｃｈ）ＡＧ、エーバースベルク（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）、ドイツ）により以下の循環条件で反応を行った：
変性 ３０秒 ９５℃
アニール ３０秒 ５０℃ ２５サイクル
伸長 ９０秒 ７２℃
最終伸長 １０分 ７２℃
検出のためにエチジウムブロミドを使用する１％アガロースゲル電気泳動によってネステッドＰＣＲ産物を分析した（図５）。オーバーラップ・エクステンション産物の予想サイズは１０７６ｂｐであった。かかる産物は矢印で示されたレーン１、５、６、７、８、および１２で確認されうる（図５Ａ）。示された実験においては、陰性対照が混入され、同様の混入はサンプルにも存在する。図５Ｂは、本実験に関連性である図５Ａの断片を示す。
本実験は、単一細胞由来のテンプレートを利用する２ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲを実行する１つの方法を示す。さらに、単離単一細胞から生成されたｃＤＮＡを使用する約２０回の多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲを実行することが可能であることが示された。
実施例２：単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ
本実施例においては、１００、１０、または１細胞に対応する濃度で溶解細胞からのテンプレートを使用する単一ステップで逆転写および多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲを実行した。
ａ．細胞
抗破傷風ＩｇＧ１κ抗体を産生するヒトハイブリドーマ細胞系ＨＢ−８５０１をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手し、１０％ウシ胎仔血清を含有するＩｓｃｏｖｅの変法ダルベッコ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）培地（ビタセル（Ｖｉｔａｃｅｌｌ）、キエフ（Ｋｉｅｖ）、ウクライナ、カタログ番号３０−２００５）中で培養した。多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲを実行する前、細胞を回収し、計算し、濃度２００細胞／μｌで培養培地中−８０℃下で凍結した。
ｂ．単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）単一ステップＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２１０２１２、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を、実質的にメーカーの推奨に従って多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲのために使用した。ＰＣＲチューブへの添加前に細胞溶解物を解凍し、Ｈ２Ｏで希釈し、１００、１０、および１細胞／５μｌに対応する溶解物濃度を得た。
各ＰＣＲチューブには、５０μｌの総量で、以下の試薬が含まれた：
１×単一ステップＲＴ−ＰＣＲバッファー、
各々４００μＭの最終濃度でｄＮＴＰ、
表３に示した濃度で多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックス、
２μｌの単一ステップＲＴ−ＰＣＲ酵素混合物、
５０Ｕ ＲＮａｓｅ阻害物質（ＲＮａｓｉｎ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、米国、カタログ番号Ｎ２５１５）、および
５μｌ希釈細胞溶解物
使用された多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスは表３に示されたプライマーを構成した。
Figure 2007505611
反応を以下の循環条件を使用して実行した：
逆転写： ３０分 ５５℃
ポリメラーゼ活性化： １５分 ９５℃ 逆転写酵素の不活性化
およびＴａｑポリメラーゼの活性化
ＰＣＲ反応：
変性 ３０秒 ９４℃
アニール ３０秒 ４４℃ ５０サイクル
伸長 ３分 ７２℃
最終伸長 １０分 ７２℃
検出のためにエチジウムブロミドを使用する１．５％アガロースゲル電気泳動によって１０マイクロリットルの反応産物を分析した（図６Ａ）。
断片の予想サイズ（正確なサイズは可変領域の長さに依存する）：
ＶＨ：４１０ｂｐ
ＬＣ：６８０ｂｐ
オーバーラップ・エクステンション断片：１０７０ｂｐ
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変および定常領域（ＬＣ）長さに対応する可動性を有する別々のＤＮＡ断片が細胞溶解物のすべての希釈溶液に確認される。推定オーバーラップ・エクステンション断片に対応する可動性を有する強くない断片が１００および１０細胞からの溶解物に確認される。１細胞溶解物サンプルのオーバーラップ・エクステンション断片は認識するのが困難であるが、最初のゲル上に確認されうる（図６Ａに示した写真および図６Ｂに示した略図の矢印を参照）。
ｃ．オーバーラップ・エクステンション断片の確認
上記の１つとして再現された実験から、オーバーラップ・エクステンションバンドの存在を検証した。１細胞に対応するレーンから、および１００細胞に対応すレーンから約１０７０ｂｐのアガロースゲルにおける領域を切除し、ＱｉａｅｘＩＩ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２００５１、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を使用してＤＮＡを精製し、２０μｌの水中に溶出した。
１マイクロリットルの溶出物を、推定オーバーラップ・エクステンション断片をフランキングするプライマー（配列番号３２〜３５に対応するＪＨプライマーおよび配列番号１７に対応するＣＬκプライマー、各プライマーの濃度０．５μＭ）とともにメーカーの指示に従ってＰＣＲ（Ｂｉｏｔａｑキット、Ｂｉｏｌｉｎｅ、英国、カタログ番号ＢＩＯ−２１０４０）にかけた。循環パラメータは以下のとおりであった：
変性 ３０秒 ９５℃
アニール ３０秒 ５５℃ ３０サイクル
伸長 １分 ７２℃
検出のためにエチジウムブロミドを使用する１％アガロースゲル電気泳動によって１０マイクロリットルの各反応産物を分析した。いくつかの断片が、１および１００細胞から、予想オーバーラップ・エクステンション断片の可動性を有する断片を含めて確認されうる（図６Ｃの矢印）。１細胞に対応するゲルレーンからの１ｋｂ断片をゲルから切り離し、上記のようにＱｉａｅｘＩＩを使用して精製した。精製断片を制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｃｏＩ（別々に）で消化し、検出のためにエチジウムブロミドを使用する１％アガロースゲル電気泳動によって反応産物を分析した（図６Ｄ）。これらの制限部位は、ＶＨとＬＣと間のオーバーラップに存在し、消化後の予想サイズはそれぞれ、長さ約４１０ｂｐおよび６８０ｂｐである（図２）。ＮｈｅＩ消化は、長い分画が最初のサイズで依然として存在するため部分的であった。
実施例３：単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲとネステッドＰＣＲの組合せ
本実施例においては、逆転写および多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ反応を、単一ステップの後、１００、１０、または１細胞に対応する濃度で溶解された細胞からテンプレートを使用する半ネステッドＰＣＲ増幅で実行した。
ａ．単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ
ＨＢ−８５０１細胞溶解物を使用する多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲを、表４に示したプライマーを含んで成る多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを利用して実施例２に記載されていように実行した。
Figure 2007505611
しかし、注目すべきは、各多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスにはＣＨ１−５プライマーの１つのみを使用し、結果として５種類の多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスが生じたことである。
残りのパラメータは、アニーリング温度を５０℃に変更した以外は、実施例２における多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応について記載されたとおりであった。各重鎖定常領域逆プライマー（それぞれ、配列番号４９〜５３に対応するＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、ＣＨ５）について、１００、１０、１、および０細胞に対応する溶解物を利用して反応を実行した。
ｂ．半ネステッドＰＣＲ
１マイクロリットルの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応産物を、実質的にメーカーによって提案されているように、半ネステッドＰＣＲ（Ｂｉｏｔａｑキット、Ｂｉｏｌｉｎｅ、英国、カタログ番号ＢＩＯ−２１０４０）にかけた。反応物の総量は５０μｌであった。使用されたプライマーは表５に示されている。
Figure 2007505611
循環条件は以下のとおりであった：
変性 ３０秒 ９５℃
アニール ３０秒 ５０℃ ２５サイクル
伸長 １．５分 ７２℃
最終伸長 ５分 ７２℃
検出のためにエチジウムブロミドを使用する１．５％アガロースゲル電気泳動によって１０マイクロリットルの各反応物を分析した（図７）。
１つの細胞から溶解物に対応する半ネステッドＰＣＲからの推定オーバーラップ・エクステンション断片、およびＣＨ４プライマーを第１の反応で使用し（図７の矢印を参照）、アガロースゲルから切除し、ＱｉａｅｘＩＩキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２００５１、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を使用して精製し、かつインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＯＰＯ ＴＡクローン化キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ番号４５−０６４１、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国）を使用してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへ挿入した。８個のクローンの挿入をシークエンシングし、これらのうちの７個は、予想オーバーラップ領域によって、軽鎖可変および定常領域へ連結された重鎖可変領域で構成されるように思われた。
要約すれば、多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲと半ヘテロメリックＰＣＲ反応の組合せの感度はきわめて十分であり、５つのうち４つの定常領域プライマーが単一細胞に対応する溶解物からのオーバーラップ・エクステンション産物の相当な量を増幅することが可能であった。
実施例４：テンプレート源として強化ヒトＢリンパ球を使用する単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲとネステッドＰＣＲの組合せ
本実施例においては、単一ステップの後、テンプレート源として単離単一ヒトＢリンパ球を使用する半ネステッド増幅ＰＣＲで逆転写および多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ反応を実行した。
ａ．Ｂ細胞単離
ヒト男性ドナーを破傷風トキソイドで免疫化した。１２０ｍｌの血液サンプルを免疫化後６日にドナーから収集し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をメーカーの指示に従ってリンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（アクシス・シールド（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）、オスロ（Ｏｓｌｏ）、ノルウェー、製品番号１００１９６７）を使用して単離した。ＣＤ１９陽性細胞集団を磁気ビーズ細胞選別を利用して強化した。ＰＢＭＣをＦＩＴＣ共役抗ＣＤ１９抗体（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国、カタログ番号３４５７７６）で染色した。抗ＦＩＴＣ共役磁気マイクロビーズおよびカラム精製を使用する磁気ビーズ細胞選別をメーカーの指示（ミルティニー・バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、グラードバッハ（Ｇｌａｄｂａｃｈ）、ドイツ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）に従って実行した。２ｎＭ ＥＤＴＡおよび０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中１ｍｌ当たり２００細胞の濃度に細胞を希釈した。５マイクロリットルの希釈細胞をＰＣＲチューブに分配し、チューブ当たり約単一細胞を得た。チューブを使用するまで−８０℃下で保存した。
ｂ．多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲと半ネステッドＰＣＲ
多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲと半ネステッドＰＣＲの条件は、実施例３に記載されているとおりであった。しかし、反応は、配列番号５１に対応するプライマーを構成する多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスでのみ実行された。多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲと半ネステッドＰＣＲの反応の組合せからの１６個のサンプルを、検出のためにエチジウムブロミドを使用する１％アガロースゲル電気泳動に各半ネステッドＰＣＲ反応から１０μｌをかけることによって分析した（図８）。
図８において確認できるように、１６のうち２つのレーン（レーン５および６）には予想可動性（約１ｋｂ）の断片が含まれた。さらに、レーン２には予想可能性で強くない断片が含まれた。レーン５および６の１ｋｂ断片をアガロースゲルから切除し、ＱｉａｅｘＩＩキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２００５１）を使用して精製し、かつインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＯＰＯ ＴＡクローン化キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ番号４５−０６４１、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国）を使用してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへ挿入した。各単離断片からの２つのクローンが正確なサイズの挿入を有した。制限酵素消化（別々に、ＮｃｏＩおよびＮｈｅｌ）は予想サイズ（４１０および６８０ｂｐ）の断片を示し、重鎖可変領域と軽鎖可変および定常領域コード配列との正確な連関を示した。
レーン５の断片に由来する２つのクローンをシークエンスし、同一であることがわかり、連結ＶＨおよびＬＣが同族対合であることを示した。
実施例５：Ｖλ特異的プライマーを使用する単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲとネステッドＰＣＲの組合せ
本実施例においては、逆転写および多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ反応を、Ｖλ特異的プライマーを使用する単一ステップの後、半ネステッドＰＣＲ反応によって実行した。同じ重鎖可変領域と組合せてλ遺伝子ファミリー１ｂおよび１ｅを発現する２つの異なる細胞系から精製された総ＲＮＡをテンプレートとして使用した。
ａ．細胞
２つのＩｇＧ１λ発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系をＦｌｐ−Ｉｎ法（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国）を使用して生成した。
２つのλ遺伝子ファミリーを示すＩｇＧ１−λ哺乳類発現ベクターｐＥｍ４６５／０１Ｐ５８１およびｐＥｍ４６５／０１Ｐ５８２（図９Ａ）をＦｌｐ−Ｉｎ発現ベクター、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴに基づき構成した。メーカーの指示に従ってフージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）６（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）を使用し、Ｆｌｐリコンビナーゼの一時的発現を提供する遺伝子およびｐＯＧ４４をコードする抗体を含有する上記のプラスミドとＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を共トランスフェクトした。形質転換体を挿入のために選択した。選択細胞系をＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ／Ｅｍ４６４／０１Ｐ５８１およびＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ／Ｅｍ４６４／０１Ｐ５８２と命名し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ、および９００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを補充したハム（Ｈａｍ）のＦ−１２培地（維持培地）で維持した。
細胞系をトリプシンを使用して回収し、維持培地で３回洗浄した。メーカーの説明書に従い、Ｎｕｃｌｅｏ Ｓｐｉｎ Ｌキット（マチェレイ・ナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）、デューレン（Ｄｕｅｒｅｎ）、ドイツ）を使用して約１０７細胞を総ＲＮＡ精製のために使用した。最終ＲＮＡ濃度はＯＤ２６０測定によって判定された。
単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ
５０ｐｇ、５ｐｇ、または０．５ｐｇ総ＲＮＡをテンプレートとして使用する多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲを、表６に示したプライマーを含んで成る多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックス、および以下に示した循環条件を利用する実質的に実施例３に記載されているように実行した。
逆転写： ３０分 ５５℃
ポリメラーゼ活性化： １５分 ９５℃ 逆転写酵素の不活性化
およびＴａｑポリメラーゼの活性化
ＰＣＲ反応：
変性 ３０秒 ９５℃
アニール ３０秒 ５０℃ ３５サイクル
伸長 ５分 ７２℃
最終伸長 １０分 ７２℃
Figure 2007505611
ｃ．半ネステッドＰＣＲ
１マイクロリットルの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応産物を、実質的にメーカーによって提案されているように、半ネステッドＰＣＲ（Ｂｉｏｔａｑキット、Ｂｉｏｌｉｎｅ、英国、カタログ番号ＢＩＯ−２１０４０）にかけた。反応物の総量は２０μｌであった。使用されたプライマーは表７に示されている。
Figure 2007505611
循環条件は以下のとおりであった：
変性 ３０秒 ９５℃
アニール ３０秒 ５０℃ ２５サイクル
伸長 １．５分 ７２℃
最終伸長 ５分 ７２℃
検出のためにエチジウムブロミドを使用する１．５％アガロースゲル電気泳動によって１０マイクロリットルのネステッド産物を分析した（図９Ｂおよび９Ｃ）。矢印は、約１ｋｂの予想移動特性を有するオーバーラップ・エクステンション産物を示す。
本実験は、表６に示されたλ多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスが、使用されるテンプレートとは無関係に単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲに適用可能であることを示す。さらに、特異的オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ産物を０．５ｐｇ総ＲＮＡで製造した。感度は、同族連結重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列が単一細胞から増幅されうることを示す。
実施例６：抗体コード配列の破傷風同族対合のサブライブラリーの生成
本実施例においては、図１０に示されたフローチャートに概要が示されたステップが、破傷風トキソイド（ＴＴ）を標的抗原として使用して例示されている。
ａ．ドナー
破傷風ワクチンであらかじめ免疫化されているドナーを破傷風ワクチン（ステテンス・セラム・インスティトゥート（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）、デンマーク）で追加免疫した。破傷風ワクチン追加免疫後６日に約２００ｍｌの血液サンプルをドナーから採取し、抗凝固剤を含有するチューブへ入れた。
ドナーは一般に静止または慢性感染がない健康であることが必要である。ドナーは自己免疫疾患に罹患していなこと、または免疫抑制薬が投与されていないこととし、かつ過去３か月以内にワクチン接種を受けていないこととした。また、ＴＴワクチン追加免疫の時点で、ドナーは先月中に重篤な感染を有していてはならなかった。
ｂ．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製
ＰＢＭＣをメーカーの指示に従ってリンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（アクシス・シールド（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）ＰｏＣ ＡＳ、ノルウェー、製品番号１００１９６７）を使用して血液サンプルから単離した。手短に言えば、血液はＰＢＳ中で１：１に希釈し、この懸濁液は２：１の比でリンホプレップ上で層状にする。バイアルを２０分間、２５℃、８００ｇで遠心分離し、白色の相間バンドを収集する。細胞を２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中に洗浄する。
ｃ．Ｂ細胞の強化
以下の手順を使用してＰＢＭＣのＢ細胞系列（ＣＤ１９＋細胞）を磁気ビーズ細胞選別によって強化する。
単離ＰＢＭＣを抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国、カタログ番号３４５７７６）で染色する。全ステップを暗所で４℃下で実行する。Ｍバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡ，２ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用する１×１０６細胞当たり１００μｌの量で１×１０６細胞当たり１０μｌの抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣで染色を実行する。これによりＰＢＭＣのＢ細胞系列が染色される。細胞を２０分間インキュベートした後、Ｍバッファーで２回の洗浄ステップを行う。１×１０６細胞当たり１００μｌの量で１×１０６細胞当たり抗ＦＩＴＣ磁気ビーズ（ミルティニー・バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、グラードバッハ（Ｇｌａｄｂａｃｈ）、ドイツ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）１０μｌを使用することにより、抗ＦＩＴＣ共役マイクロビーズで抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ染色細胞を磁気的に標識する。インキュベーションを１５分間実行した後、Ｍバッファーで１回の洗浄ステップを行う。細胞を脱気したＭバッファー中に再懸濁する。
ＭＡＣＳ ＬＳカラム（ミルティニー・バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、グラードバッハ（Ｇｌａｄｂａｃｈ）、ドイツ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）をメーカーの指示に従い脱気したＭバッファーで前処理する。抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣで染色し、抗ＦＩＴＣ磁気ビーズで標識した細胞の懸濁液をカラムに入れ、通過させる。染色および標識細胞（ＣＤ１９＋）をカラム周囲の磁場に保持すると同時に、染色されていない細胞（ＣＤ１９−）はカラムを通過する。カラムを脱気Ｍバッファーで洗浄する。磁場を除去し、ＣＤ１９＋細胞を収集する。
ｄ．形質細胞の選別
ＭＡＣＳカラムからの溶出液を遠心分離し、１×１０６細胞／６０μｌ ＦＡＣＳバッファーの濃度でＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、２％ＢＳＡ）中に再懸濁する。抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国、カタログ番号３４５７７６）（１０μｌ／１０６細胞）、抗ＣＤ３８−ＰＥ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国、カタログ番号５５５４６０）（１０μｌ／１０６細胞）、および抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国、カタログ番号３４５８０９）（２０μｌ／１０６細胞）を添加する。インキュベーションを４℃で２０分間、暗所で実行した後、２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁する。
以下のゲートパラメータを使用する蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）によって細胞を選別する：
１．形質ブラスター（ｐｌａｓｍａ ｂｌａｓｔｅｒ）および形質細胞を含むリンパ球および単球を保持し、死細胞を回避するための前方散乱光および側方散乱光、および凝集体または顆粒球でありうるきわめて高い側方散乱抗の細胞。
２．ＣＤ１９陽性であり、高レベルのＣＤ３８（ＣＤ３８ｈｉ）を発現する細胞。これは基本的に、ＰＢＭＣはＣＤ１９発現のためのＭＡＣＳカラムで強化されているため単にＣＤ３８におけるゲートであるが、これは混入物を見せる。
３．ＣＤ４５陽性細胞。全リンパ球はＣＤ４５を発現する。しかし、形質細胞は初期のリンパ球分化期と比べそのＣＤ４５発現をダウンレギュレートする。したがって、ＣＤ４５でゲーティングすると形質細胞に対応する別個の細胞集団を得ることができる。
ＦＡＣＳ選別細胞を単一細胞として直接、ウェル当たり５ＵＲＮａｓｅ阻害物質（ＲＮａｓｉｎ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、米国、カタログ番号Ｎ２５１５）を補充したＰＢＳバッファー５μｌを含有する９６ウェルプレートの単一ウェルへ収集する。この時点で細胞はその後のＲＴ−ＰＣＲのために凍結され、または細胞は直ちにＲＴ−ＰＣＲのために処理されうる。
ｅ．免疫グロブリン可変領域コード配列の同族対合の連関
多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ法を単一細胞に適用し、それによって、転写抗破傷風トキソイド重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の同族連関を達成する。
ｅ−１．単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）単一ステップＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２１０２１２、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を、実質的にメーカーの推奨に従って多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲのために使用した。ウェル当たり単一細胞を含有する凍結９６ウェルプレートを冷凍庫から除去し、ウェルが氷を含まない場合、ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物１５μｌを直ちに各サンプル（単一細胞）に添加する。
ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物は、２０μｌの総量で、以下の試薬を含有する：
１×単一ステップＲＴ−ＰＣＲバッファー
各々４００μＭの最終濃度でｄＮＴＰ、
表８に示した濃度で多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックス、
０．８μｌ単一ステップＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックス、および
２０Ｕ ＲＮａｓｅ阻害物質（ＲＮａｓｉｎ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、米国、カタログ番号Ｎ２５１５）。
多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスの組成物は表８に示されている。
Figure 2007505611
循環条件は以下のとおりである：
逆転写： ３０分 ５５℃
ポリメラーゼ活性化： １５分 ９５℃ 逆転写酵素を不活性化し
Ｔａｑポリメラーゼを活性化する。
ＰＣＲ反応：
変性 ３０秒 ９４℃
アニール ３０秒 ５２℃ ３５サイクル
伸長 ５分 ７２℃
最終伸長 １０分 ７２℃
ｅ−２．追加の増幅
各サンプルからの１マイクロリットルの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応産物を、実質的にメーカーによって提案されているように、９６ウェルプレートを利用して半ネステッドＰＣＲ（Ｂｉｏｔａｑキット、Ｂｉｏｌｉｎｅ、英国、カタログ番号ＢＩＯ−２１０４０）にかける。各反応物の総量は５０μｌであり、１×Ｂｉｏｔａｑバッファー、２００μＭ ｄＮＴＰ（各々）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２５Ｕ Ｂｉｏ Ｔａｑポリメラーゼの最終濃度を含有し、プライマーは表９に示されている。
循環条件は以下のとおりであった：
変性 ３０秒 ９５℃
アニール ３０秒 ５５℃ ３０サイクル
伸長 １．５分 ７２℃
最終伸長 ５分 ７２℃
Figure 2007505611
多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲが成功しているかを検証するために、視覚化用にエチジウムブロミドを使用する１．５％アガロースゲル電気泳動によって１０マイクロリットルの限定セットのサンプルを分析する
断片の予想サイズ（正確なサイズは可変領域の長さに依存する）：
ＶＨ：約４１０ｂｐ
ＬＣ：約６８０ｂｐ
オーバーラップ・エクステンション断片：約１０７０ｂｐ
同じドナー由来の、９６ウェルプレートで実行した全サンプルから２マイクロリットルを単一チューブで混合する。プールしたサンプルをＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化する。消化オーバーラップ・エクステンション断片を予備１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、オーバーラップ・エクステンション断片をアガロースゲルから除去し、ＱｉａｅｘＩＩキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２００５１、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を使用して精製する。この段階で同族対合をプールすることは、望ましくない場合は、必要ではない。その場合、各個の反応物は制限開裂にかけられ、産物は別々にクローン化され以下に記載されたベクターへ入れられる。
ｆ．同族Ｆａｂ発現ライブラリー
ライゲーションによって、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ消化されたオーバーラップ・エクステンション断片のプールを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターＪＳＫ３０１（図１１）へ挿入することによってＦａｂベクターのライブラリーを生成する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＴＯＰ１０）をＦａｂベクターのライブラリーでエレクトロポレーションによって形質転換し、形質転換体を１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する２×ＹＴ寒天上に選択した。プラスミドＤＮＡは寒天プレートから直接取られたコロニーから調製される。プラスミド調製物は、多様性を維持するために、最初に選別した単一形質細胞の総数の３倍に対応する、ドナーにつき最小数のコロニー由来である。Ｆａｂ発現ライブラリーは原核生物プロモーターおよびｐｈｈ３由来のリーダーカセット（デン（Ｄｅｎ）、Ｗ．ら、１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２２、４５−５７頁）を、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩでプラスミド調製物を消化し、その後のライゲーションによる結果として生じるプラスミド調製物へ挿入することによって生成される。ライブラリー生成法は図１２に概要が示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＴＧ１）を結果として生じるＦａｂ発現ライゲーションでエレクトロポレーションによって形質転換し、形質転換体を１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する２×ＹＴ寒天上に選択した。個々のドナーは、デン（Ｄｅｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９９年、１月、１；２２２（１−２）、４５−５７頁に記載された手順の間、別々に状態にしておく。しかし、いかなる段階でも、必要に応じて混合することができる。
ｇ．クローンのスクリーニング
Ｆａｂ発現クローンを抗原特異的ＥＬＩＳＡアッセイによってＴＴ抗原結合についてスクリーニングする。
ｇ−１．マスタープレート生成およびＦａｂ発現
ステップ（ｆ）で生成されたライブラリーから同族Ｆａｂ発現ベクターを各々有するＴＧ１細胞の個々の選択コロニーを、２×ＹＴ／１００μｇ／ｍＬ Ａｍｐ／１％グルコースを含有する９６ウェルプレートの単一ウェルへ採取する。コロニーを静かに攪拌しながら３７℃下で一夜増殖させる。これらのプレートはマスタープレートと呼ばれ、これらをグリセロールを添加して１５％の最終濃度にして−８０℃下で保存する。
マスタープレートを保存する前に、９６ピンリプリケーターを使用して、２×ＹＴ／１００μｇ／ｍＬ Ａｍｐ／１％グルコースを含有する１つもしくはそれ以上の３８４ウェルプレートの接種用に使用する。プレートを密閉し、２−３時間、３７℃下で攪拌する。
同等量の２×ＹＴ／１００μｇ／ｍＬ Ａｍｐ／０．２ｍＭ ＩＰＴＧを添加することによってＦａｂ発現を誘導し、０．１ｍＭの最終ＩＰＴＧ濃度を得る。プレートを密閉し、一夜、３０℃下で攪拌する。翌日、上清を含有するＦａｂをＥＬＩＳＡによってＴＴ抗原結合特異性について分析する。
ｇ−２．ＥＬＩＳＡ分析
３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ）、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク、カタログ番号２６５１９６）を一夜、４℃下で破傷風トキソイド（ＴＴ）抗原でコートし、ウェル当たり２５μｌの量でＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈する。ウェルの過剰な結合部位を２％Ｍ−ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中２％脱脂粉乳、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を添加することによって室温（ＲＴ）下で１時間遮断する。ウェルをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄する。
ｇ−１．からの細菌上清を含有するＦａｂを２％Ｍ−ＰＢＳ−Ｔ中に１：２で希釈し、ＥＬＩＳＡウェルに２部移す。インキュベーションを１時間ＲＴ下で実行する。ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄する。２％Ｍ−ＰＢＳ−Ｔ中ヤギ抗ヒトＦａｂ／ＨＲＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州（ＭＯ）、米国、カタログ番号Ａ０２９３）１：１０，０００希釈をウェルに添加する。インキュベーションを１時間ＲＴ下で実行する。ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄する。ＴＭＢプラス（ＫｅｍＥｎＴｅｃ、コペンハーゲン、デンマーク、カタログ番号４３９０Ｌ）基質を添加し、インキュベーションを５−１５分間実行する。同等量の１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止する。反応の
程度をＥＬＩＳＡリーダー（マルチスキャン・アセント（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ）、ラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、米国）において４５０ｎｍで読取る。
ＴＴ抗原−結合クローンに対応する最初の細菌クローンをその後に最初のマスタープレートから回収する。プラスミドＤＮＡを単離抗原陽性Ｆａｂクローンから調製し、ＴＴ抗原−結合クローンの同族Ｆａｂ発現サブライブラリーを生成する。
クローンは、抗原−結合クローンの数とＦａｂ発現クローンの数との相関を得るために、抗軽鎖ＥＬＩＳＡアッセイによっても分析されうる。さらにかかる分析は、クローンにおけるκおよびλ軽鎖表示の情報を提供する。
ｈ．同族抗体発現ライブラリー
完全長ヒト抗体の発現を促進するために、細菌Ｆａｂ発現ベクターからの同族可変領域は、ヒト免疫グロブリンアイソタイプの１つからの定常ドメインを含有する哺乳類発現ベクターに移す必要がある。かかる移動はクローンごとに、または物質で実行されうる。以下で物質移動の実行の仕方を記載する。
物質移動は２ステップで実行される。最初に、別々に単離された抗原−結合Ｆａｂクローンのプラスミド調製物をプールする。カセットを含有する原核生物プロモーターおよびリーダーを、ヒトアルカリホスファターゼリーダー配列（ＡＰリーダー）、ヒト延長因子１−αプロモーター（ＥＦＰ）、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩでプールＦａｂ発現サブライブラリーを消化した後、哺乳類プロモーターの挿入によるＩｇＫリーダー配列、およびその後のライゲーションによるリーダーカセットから成る哺乳類プロモーターおよびリーダーカセットと交換する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＴＯＰ１０）を結果として生じるプロモーター交換Ｆａｂ発現ライブラリーでエレクトロポレーションによって形質転換し、形質転換体を１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する２×ＹＴ寒天上に選択する。プラスミドＤＮＡは寒天プレートから直接取られたコロニーから調製される。プラスミド調製物は、多様性を維持するために、最初のライブラリーにおけるクローンの総数の約３倍に対応する、ドナーにつき最小数のコロニー由来である。
第二に、プロモーター交換Ｆａｂ発現ベクターからの同族対合領域をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩでプラスミド調製物を消化することによって単離する。単離断片をライゲーションによって哺乳類発現ベクターへ挿入し、結果として同族抗体発現ライブラリーを得る。使用されるベクターは、この場合のＩｇＬがκ軽鎖コード配列に対応することを除き、図９Ａにおけるのと実質的に同じである。上記で使用される哺乳類発現ベクターは、部位特異的Ｆｌｐ−Ｉｎ系（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州、米国、カタログ番号Ｋ６０１０−０１）に基づく。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＴＯＰ１０）を結果として生じる同族抗体発現ライブラリーによるエレクトロポレーションによって形質転換し、形質転換体を１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する２×ＹＴ寒天上に選択する。プラスミドＤＮＡは寒天プレートから直接コロニーから調製される。プラスミド調製物は、多様性を維持するために、最初のライブラリーにおけるクローンの総数の約３倍に対応する、ドナーにつき最小数のコロニー由来である。同族抗体発現ライブラリーの結果として生じるプラスミド調製物を使用して哺乳類宿主細胞、例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＦｌｐ−Ｉｎ系（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州、米国、カタログ番号Ｋ６０１０−０１）からのＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、Ｆｌｐリコンビナーゼ仲介インテグレーションによって安定した哺乳類発現細胞系を生成することができる。かかる細胞系は、組換えポリクローナル抗体も製造において使用されうる。
実施例７：高密度膜アッセイによるスクリーニング
実施例６ｆ．からのＦａｂ発現クローンを高密度膜アッセイによってスクリーニングする。
ａ．マスタープレート生成
実施例６のステップ（ｇ−１）に記載されているようにマスタープレートを生成する。
ｂ．ＰＶＤＦ膜調製
ＰＶＤＦ膜（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン、カタログ番号ＲＰＮ２０２０Ｆ）をメーカーの指示に従い、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈したＴＴ抗原で一夜、４℃下でコーティングする。膜上の過剰な結合部位を１時間、２％Ｍ−ＰＢＳ（ＰＢＳ中２％脱脂粉乳）中で遮断する。膜をＰＢＳ中で３回リンスする。膜を数分間、２×ＹＴ中に浸漬する。
ｃ．クローン固定
９６ピンリプリケーターを使用して、２０μｌ ２×ＹＴ／ウェルを含有する１つもしくはそれ以上の３８４ウェルプレートへクローンをマスタープレートから移動させることによってクローンの３８４ウェルプレートへの固定を実行する。
３８４ピンリプリケーターを使用することにより、２×ＹＴ／Ｃａｒｂ／１％グルコース寒天プレート上に配置した１つもしくはそれ以上のナイロン膜（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン、カタログ番号ＲＰＮ２０２０Ｂ）へ２部で細菌を移す。プレートを４−６時間、３７℃下でインキュベートする。
ｄ．Ｆａｂ誘導
ステップｂで調製したＰＶＤＦ膜を２×ＹＴ／Ｃａｒｂ／０．１ｍＭ ＩＰＴＧ寒天プレート上に配置する。増殖細菌コロニーを有するナイロン膜を、ＩＰＴＧを含有する寒天プレート上のＰＶＤＦ膜（ＰＶＤＦ膜当たり１つのナイロン膜）の上部に配置する。ＩＰＴＧを含有する寒天プレートを３０℃下で一夜インキュベートし、コロニーからのＩＰＴＧ誘発Ｆａｂ発現を促進する。Ｆａｂ分子はナイロン膜を通じてＰＶＤＦ膜へ拡散し、ここでＴＴ抗原結合Ｆａｂが膜上に保持される。
ｅ．検出
ナイロン膜を除去し、ＰＶＤＦ膜を、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間２回洗浄する。膜を３０分間２％Ｍ−ＰＢＳでインキュベートする。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで５分間２回洗浄した後、２％Ｍ−ＰＢＳ中１：１０，０００で希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州（ＭＯ）、米国、カタログ番号Ａ０２９３）で１時間インキュベーションを行う。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで５分間３回洗浄する。最後に、ＰＶＤＦ膜を５分間、スーパーシグナル・ウェスト・フェムト（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ）化学発光基質で（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州（Ｉｌ）、米国、カタログ番号３４０９５）メーカーの指示に従いインキュベートする。過剰な基質を除去し、Ｆａｂ断片がＴＴ抗原に結合するＰＶＤＦ膜上の位置で生成される化学発光シグナルの検出のためにＣＣＤカメラ下でＰＶＤＦ膜を配置する。
陽性ＴＴ抗原結合クローンが画像上のドットとして現れる。最初の細菌クローンをその後に最初のマスタープレートから回収する。プラスミドＤＮＡを単離抗原陽性Ｆａｂクローンから調製し、ＴＴ抗原結合クローンの同族Ｆａｂ発現サブライブラリーを生成する。
ｆ．抗原結合クローンとＦａｂ発現クローンとの相関
ステップｅ．で除去されたナイロン膜を、ステップｂ．における手順に従い抗軽鎖抗体または抗Ｆａｂ抗体でコーティングされた第２の一連のＰＶＤＦ膜上に配置する。次いで、ステップｄ．およびｅ．を繰返す。
次いで、Ｆａｂ陽性クローンが画像上のドットとして現れ、ＴＴ抗原結合クローンの数とＦａｂ発現クローンの数との相関を行うことができる。
実施例８：ヘテロメリックタンパク質をコードする配列の単離を説明する例示的実施例
本実施例は、三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）がいかにして本発明の多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ法を利用する単一ステップで単離されうるかを示す。Ｇタンパク質サブユニットのファミリーは大きく、ヒトにおけるだけでも約１６の異なるαサブユニット、５個のβサブユニット、および１２個のγサブユニットがある。本実施例では、サブユニットＧαＳ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｘ０４４０８）、サブユニットＧβ１（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＡＦ５０１８２２）、およびサブユニットＧγ１（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＢＣ０２９３６７）を選択した。連関手順は図１３に示されているが、ここでステップ１は多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲであり、ステップ２は連結産物の追加の増幅である。
ａ．細胞
ヒト肝細胞の集団を外科的排出サンプルから得る。肝細胞を分解および溶解し、ＲＮＡ Ｌキット（マチェレイ・ナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）、デューレン（Ｄｕｅｒｅｎ）、ドイツ、カタログ番号７４０ ９６２．２０）をメーカーの指示に従い使用して溶解物から総ＲＮＡを単離する。
ｂ．多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）単一ステップＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２１０２１２、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を、メーカーの推奨に実質的に従い多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ用に使用する。
各ＰＣＲチューブは、５０μｌの総量で、以下の試薬を含有する：
１×単一ステップＲＴ−ＰＣＲバッファー、
各々４００μＭの最終濃度でｄＮＴＰ、
表１０に示した濃度で多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックス、
２μｌの単一ステップＲＴ−ＰＣＲ酵素混合物、
１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害物質（ＲＮａｓｉｎ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、米国、カタログ番号Ｎ２５１５）、および
５０ｎｇ総ＲＮＡ。
使用された多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスは、表１０に示されているプライマーを含んで成る。
Figure 2007505611
使用された循環条件は以下のとおりである：
逆転写： ３０分 ４２℃
ポリメラーゼ活性化： １５分 ９５℃ 逆転写酵素を不活性化し
Ｔａｑポリメラーゼを活性化する。
ＰＣＲ反応：
変性 ３０秒 ９４℃
アニール ３０秒 ４９℃ ４５サイクル
伸長 ３分 ７２℃
最終伸長 １０分 ７２℃
ｃ．増幅ＰＣＲ
１マイクロリットルの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応産物を、実質的にメーカーによって提案されているように、追加のＰＣＲ増幅ステップ（Ｂｉｏｔａｑキット、バイオライン（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、英国、カタログ番号ＢＩＯ−２１０４０）にかける。使用されたプライマーは、配列番号８０および８５に対応する表１０に示されているα１およびγ２である。反応物の総量は５０μｌである。
循環条件は以下のとおりであった：
変性 ３０秒 ９５℃
アニール ３０秒 ５３℃ ２５サイクル
伸長 ３分 ７２℃
最終伸長 １０分 ７２℃
検出のためにエチジウムブロミドを使用する１％アガロースゲル電気泳動によって５マイクロリットルの反応産物を分析した。産物のサイズは２２１５ｂｐであると予想される。しかし、追加の連結されていないサブユニットの断片が存在しうる。これらの断片の予想サイズは、Ｇα：１２２８ｂｐ、Ｇβ：１０６４ｂｐ、およびＧγ：２６２ｂｐである。
ｄ．クローン化
検出のためにエチジウムブロミドを使用する１％アガロースゲル電気泳動に残りの反応産物をかけ、２２１５ｂｐのオーバーラップ・エクステンション断片をアガロースゲルから切除し、Ｑｉａｅｘ ＩＩキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ、カタログ番号２００５１）を使用して精製し、かつインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）ＴＯＰＯ ＴＡクローン化キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ番号４５−０６４１、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国）を使用してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへ挿入した。
さらに、プロモーター配列またはリボソーム結合部位は、ベクターからのその発現を促進するために各サブユニットコード配列の上流に挿入されうる。オーバーラップ・エクステンション配列に存在する制限部位は、かかる挿入に適用可能である。
ｅ．一般的検討
上記のようにヘテロメリックタンパク質を構成する配列コードサブユニットの連関は、個々のサブユニットの配列が既知であるほとんどのヘテロメリックタンパク質について実行されうる。さらに、一部の特定ファミリーのメンバー、例えば、すべてのＧタンパク質α、β、およびγサブユニットを増幅することが可能な多重オーバーラップ・エクステンションプロトコルミックスを使用する際には、そのファミリーメンバーがどんな細胞系によって発現されるか最初に分析する必要なく、細胞型からのサブユニットの組合せを確認し、連結することが可能である。例えば、上記の実施例は、５個のＧβサブユニットおよび１２個のＧγサブユニットとともに１６個のＧαサブユニットすべてを増幅および連結することが可能な多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを使用する単離単一肝細胞由来のテンプレートを利用して実行され、それによって、サブユニットのどの組合せが各細胞において発現され、同時にそのサブユニットの組合せの原因となるコード配列を単離することを確認する。また、変性プライマーの使用は、特定のファミリーの新しいメンバーを確認するためにも役立ちうる。
本発明の多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ法を使用してヘテロメリックタンパク質のサブユニットを連結する際には、ＤＮＡポリメラーゼが増幅しうる塩基対の数には制限があるため、連結産物の全体的なサイズを考慮すべきである。ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州（ＭＡ）、米国）製のディープ・ベント（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）ポリメラーゼは、長さが１４，０００ｂｐまでのきわめて長いプライマー伸長を生成することが可能な１つのＤＮＡポリメラーゼである。理論上、１４，０００ｂｐは、平均量５１０ｋＤａのタンパク質をコードしうる。したがって、本発明の方法を利用してきわめて長いヘテロメリックタンパク質のコード配列を単離することが可能である。伸長能力は、さらにＤＮＡポリメラーゼの混合物を利用することによって、おそらく増大されうる。
実施例９：リーダープライマーのデザイン：
本実施例においては、プライミングの部位が、ヒト抗体重鎖およびκ軽鎖ファミリーのリーダー領域をコードする配列で保存されている多重セットのプライマーがデザインされた。
可変領域ファミリーのＮ末端コード配列にアニールするプライマーを使用すると、ある程度の交差ハイブリダイゼーションが確認されうる。特定の遺伝子ファミリー配列のプライマーは、多くの場合に新規の配列の生成を引き起こす別の遺伝子ファミリーのｃＤＮＡとハイブリダイズしうる。かかる配列から生じるタンパク質は、治療において使用されると潜在的に免疫原性である。一般に、これら新規の配列はＰＣＲによって修正され、またはライブラリーから除去されうる。
他の解決法は、プライミングの部位を抗体可変領域のリーダーペプチド領域をコードする配列に配置することである。交差プライミングの結果として生成されるハイブリッド配列は、抗体の細胞間処理中に除去されるが、ここで潜在的な免疫原性配列を含有するペプチドリーダーは開裂され、したがって分泌抗体産物に存在することはない。抗体クローン化のためのリーダープライマーの以前のセットはリーダーコード配列の５’末端に位置しており、直接の真核生物の発現を可能にする（キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）Ｍ．Ｊ．ら、１９９２年、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９年、１９３−２０３頁）。残念ながら、真核生物リーダーペプチドは原核生物処理には十分に適していない。
核酸配列が細菌において容易に操作されることにより、細菌ベクターと他の宿主生物に対するベクターとの間の配列輸送が可能であるクローン化システムの開発への魅力が生じる。したがって、真核生物と原核生物の発現系において抗体または抗体断片の機能的発現を可能にするプライミングの部位がリーダー領域コード配列における位置で保存される多重プライマーセットが、本実施例でデザインされた。
いかなるリーダーペプチドのＣ末端領域でのシグナルペプチダーゼ開裂の配列要件は、原核生物系および真核生物系でほとんど同じであるように思われる（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）Ｈ．ら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０、１−６頁）。さらに、リーダーペプチドのＣ末端領域における変異はＮ末端領域の構造に対する影響はほとんどなく、その逆もまた同じであるという結果になる。したがって、Ｃ末端配列は機能の損失なしに種間で移転可能でありうる。
本実施例におけるプライマーデザインの基本コンセプトは、リーダーペプチドのＣ末端領域の最後の６つのコドンにプライミングの部位を配置することであった。プライミングの部位の上流（約５０個のヌクレオチド）のリーダーコード配列の残りの部分は、宿主種にマッチする適切な発現ベクターによって供給されなければならない。例えば、グラム陰性細菌における発現に適切なベクターは、部分または完全長Ｐｅ１Ｂリーダー配列でデザインされうる。真核生物における抗体の発現には、部分的陰性抗体重鎖リーダーコード配列および部分的可変κ鎖リーダーコード配列を有するベクターが適切となる。発現系に関係なく、リーダーの最後の６つのアミノ酸は、ベクターへ挿入される核酸部分に含まれる内因性抗体リーダーコード配列由来となる。
以下のプライマー配列は、多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲにおける使用にデザインされた（表１１）。しかし、オーバーラッピングテール（小文字）は、ライゲーションまたは組換え手順による連関において機能するように容易に再デザインされうる。
Figure 2007505611
注目すべきは、このプライマーデザインにおける制限部位が、以前の実施例に記載されたプライマーと比べわずかに変更されたことである。したがって、重鎖と軽鎖の可変領域コード配列間のオーバーラップ配列はＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ制限部位を構成したが、定常κプライマー（ＣＬκ）においては、以前のＮｏｔＩ部位がＡｓｃＩ部位と交換されている。後者の変更は、もちろん、追加のＰＣＲ増幅のプライマーをデザインする際に確認されるはずである。さらに、図１１に示されているクローン化ベクターにおけるＮｏｔＩ部位は、ＡｓｃＩ部位に変更され、プロモーター単位におけるＡｓｃＩ部位は、ＮｏｔＩ部位に変更されるはずである。
リーダー開裂に関する機能性は、デンマーク工科大学におけるＣＢＳによって提供されるＳｉｇｎａｌＰを使用してコンピュータ内で試験されている。
可変重鎖について試験されたキメラリーダーペプチドは、切断Ｐｅ１Ｂ配列、Ｃ末端ＮｏｔＩ部位（配列番号１００：ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＴＴ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＣＧ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ）、およびＮｏｔＩ部位に伴って、天然ＶＨＬファミリーメンバーからの６つのＣ末端アミノ酸をコードする配列番号８６〜９２のひとつの遺伝子特異的部から成る核酸配列によってコードされた。７つの配列すべては、ＳｉｇｎａｌＰプログラムを使用することによりグラム陰性細菌におけるシグナルペプチド開裂を示した。
可変軽鎖について試験されたキメラリーダーペプチドは、切断Ｐｅ１Ｂ配列、Ｃ末端ＮｈｅＩ部位（配列番号１０１：ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＣＧ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＣＴＡ ＧＣＧ）、およびＮｈｅＩ部位に伴って、天然ＶＬκＬファミリーメンバーからの６つのＣ末端アミノ酸をコードする配列番号９３〜９８のひとつの遺伝子特異的部から成る核酸配列によってコードされた。６つの配列すべては、ＳｉｇｎａｌＰプログラムを使用することによりグラム陰性細菌におけるシグナルペプチド開裂を示した。
配列番号１００および１０１の配列は、図１１に示されているＡｓｃＩ部位が配列番号１００で置換され、ＮｈｅＩ部位が配列番号１０１で置換されているという点で、図１１に示されているものと同様の細菌発現ベクターの構成に適切である。さらに、図１１に示されているＮｏｔＩ部位は、ＡｓｃＩ部位に対して置換される必要がある。
哺乳類発現ベクター（図９）は同様に、今述べた細菌ベクターからの可変領域コード部分の移動後の哺乳類細胞における発現を可能にするように再デザインされうる。
実施例１０：ライゲーションによる単一チューブ多重ＲＴ−ＰＣＲおよび連関
本実施例は、連結重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列を含んで成る同族対合がいかにして、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲの代わりにライゲーションを使用して単一チューブ反応で生成され、連関を得るかについて示す。
ａ．多重ＲＴ−ＰＣＲ
破傷風トキソイドに対する特異性を有するＦａｂ分子を発現する組織内産生細胞系が、単一ＰＣＲチューブで単一細胞を得る限界希釈によって分配されている。
単一細胞に加えて、各ＰＣＲチューブが以下の試薬を２０μｌの総量で含有する：
１×フュージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）ＨＦバッファー
各々２００μＭの最終濃度でｄＮＴＰ、
表１２に示した濃度で多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックス、
０．８Ｕフュージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）ポリメラーゼ（フィンザイムス（ＦｉｎｎＺｙｍｅｓ）カタログ番号Ｆ−５３０−Ｌ）
１μｌセンシスクリプト（Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２０５２１３）
２０Ｕ ＲＮａｓｅ阻害物質
Figure 2007505611
循環条件：
逆転写 ３０分 ３７℃
変性 ３０秒 ９８℃
変性 １０秒 ９８℃
アニール ３０秒 ５５℃ ４０サイクル
伸長 ３０秒 ７２℃
最終伸長 ５分 ７２℃
ｂ．ライゲーションによる連関
ライゲーションによる連関を実行するには、制限酵素およびリガーゼを多重ＲＴ−ＰＣＲ反応産物に直接添加する。あるいは、多重ＲＴ−ＰＣＲは、ポリメラーゼから混合物を含まないようにするために、この添加の前に精製されうる。
以下の試薬が各チューブに４０μｌの総量で添加される：
１×ＮＥＢＩＩバッファー
１ｍＭ ＡＴＰ
５０Ｕ ＸｂａＩ（ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）カタログ番号Ｒ０１４５Ｌ）
２５Ｕ ＳｐｅＩ（ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）カタログ番号Ｒ０１３３Ｓ）
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
４００Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）カタログ番号Ｍ０２０２Ｓ）
反応は、一夜、１６℃下でインキュベートする。
連結重鎖および軽鎖可変領域コード配列をゲル電気泳動および約１０００ｂｐのバンドの切除による反応物から精製する。
この方法の別の変法においては、多重ＲＴ−ＰＣＲ反応は、多重プライマーセットでＪＨプライマーの代わりにＣＨプライマーで実行される。このプライマーは、重鎖可変領域の発現ベクターへのインフレーム挿入を可能にするクローン化テールを備えうるか、または半ネステッドＰＣＲが表５のプライマーで実行されうる。
実施例１１：破傷風トキソイドに対する特異性を有する組換えポリクローナル免疫グロブリンの生成
本実施例では、破傷風トキソイド（ＴＴ）で免疫化した単一ドナー（ＴＴ０３）の結果を使用し、図１０のフローチャートに概要を示したステップを示す。
ａ．ドナー
以前に破傷風ワクチンで免疫化されているドナー８人を破傷風ワクチン（ステテンス・セラム・インスティトゥート（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）、デンマーク）で追加免疫した。ドナーにはＴＴ０１〜ＴＴ０８の番号を割り当てた。破傷風ワクチン追加免疫後６日に約２００ｍｌの血液サンプルをドナーから採取し、抗凝固剤を含有するチューブへ入れた。
ドナーは慢性感染せず、自己免疫疾患に罹患せず、または免疫抑制薬を投与されておらず、健康であることが必要であり、かつドナーは過去３か月以内にワクチン接種を受けていないこととした。
ａ−１．ドナーの品質モニター
免疫化の時点でドナー前出血を採取した。１４日後、追加の採血により血清力価を測定した。ドナーはすべてＴＴ力価の増大に反応した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイも構成し、ＴＴ特異的形質細胞の頻度を測定した。異なる細胞分画、例えば、６日目の主な出血、ＰＢＭＣ分画、磁気選別分画、またはＦＡＣＳ選別分画をＥＬＩＳＰＯＴ用に使用することができた。ＥＬＩＳＰＯＴを使用してドナー材料を評価し、最良の反応者を確認することができ、次いで選別ステップおよび多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲにより進行しうる。ドナーＴＴ０３のためにＣＤ１９＋細胞分画（セクションｃを参照）を使用してＥＬＩＳＰＯＴを実行した。ＥＬＩＳＰＯＴは、小さな変更を加えて、レイキフ（Ｌａｋｅｗ）（レイキフ（Ｌａｋｅｗ）、Ｍ．ら、１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０３、１９３−１９８頁）によって記載されているように実行した。ＰＢＭＣ分画におけるＴＴ特異的形質細胞の頻度は、０．０２１％と計算された。
ｂ．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製
ＰＢＭＣをメーカーの推奨に従ってリンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（アクシス・シールド（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ ＰｏＣ ＡＳ）、オスロ（Ｏｓｌｏ）、ノルウェー、製品番号１００１９６７）を使用して血液サンプルから単離した。手短に言えば、血液はＰＢＳ中で１：１に希釈し、この懸濁液は２：１の比でリンホプレップ上で層状にした。バイアルを２０分間、２５℃、８００ｇで遠心分離し、白色の相間バンドを収集した。細胞を２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中で洗浄した。
ドナーＴＴ０３から採取した全血２００ｍｌから約２×１０８ＰＢＭＣを得た。
ｃ．Ｂ細胞の強化
以下の手順を使用してＰＢＭＣのＢ細胞系列（ＣＤ１９＋細胞）を磁気ビーズ細胞選別によって強化した。
単離ＰＢＭＣを抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国、カタログ番号３４５７７６）で染色した。全ステップを暗所で４℃下で実行した。Ｍバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用する１×１０６細胞当たり１００μｌの量で１×１０６細胞当たり１０μｌの抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣで染色を実行した。これによりＰＢＭＣのＢ細胞系列が染色される。細胞を２０分間インキュベートした後、Ｍバッファーで２回の洗浄ステップを行った。１×１０６細胞当たり１００μｌの量で１×１０６細胞当たり抗ＦＩＴＣ磁気ビーズ（ミルティニー・バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、グラードバッハ（Ｇｌａｄｂａｃｈ）、ドイツ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）１０μｌを使用することにより、抗ＦＩＴＣ共役マイクロビーズで抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ染色細胞を磁気的に標識する。インキュベーションを１５分間実行した後、Ｍバッファーで１回の洗浄ステップを行った。細胞を脱気したＭバッファー中に再懸濁した。
ＭＡＣＳ ＬＳカラム（ミルティニー・バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、グラードバッハ（Ｇｌａｄｂａｃｈ）、ドイツ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）をメーカーの指示に従い脱気したＭバッファーで前処理した。抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣで染色し、抗ＦＩＴＣ磁気ビーズで標識した細胞の懸濁液をカラムに入れ、通過させた。染色および標識細胞（ＣＤ１９＋）をカラム周囲の磁場に保持すると同時に、染色されていない細胞（ＣＤ１９÷）はカラムを通過した。カラムを脱気Ｍバッファーで洗浄した。磁場を除去し、ＣＤ１９＋細胞を収集した。
抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３８−ＰＥ、および抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰを使用するＴＴ０３からの出発原料（ＰＢＭＣ）、非標識分画、およびＣＤ１９標識分画の分析的染色を実行した（図１４）。これは、磁気細胞選別によりＰＢＭＣ分画と比較して２つの異なる分画が生じることを示す。パネルＢに示されたＣＤ１９陰性細胞およびパネルＣに示されたＣＤ１９陽性細胞。ＰＢＭＣ分画のうち１１％の細胞がＣＤ＋１９であり、ＣＤ１９陽性細胞精製の程度はＴＴ０３ではＲ１の９９．５％であった（図１４ｃの散乱光ゲート）。
図１４Ｃに示されているように、抗ＣＤ３８／抗ＣＤ４５は、Ｒ１の１．１％に対応するＣＤ３８ｈｉ、ＣＤ４５ｉｎ細胞（Ｒ２）の異なる集団を示した。この集団には形質細胞が含まれ、その後の選別ステップ中に収集された。これはＰＢＭＣ分画において細胞の０．１２％が形質細胞に対応することを示した。
ＣＤ１９陽性細胞分画をＦＣＳ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１６０００−０４４）＋１０％ＤＭＳＯ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｄ２６５０）中にその後の選別のために凍結した。図１４に示されているような分析を、細胞が無傷であることを確実にするように凍結されていたＭＡＣＳ精製細胞で行った（図１５）。図１５に見られる染色パターンは図１４Ｃに見られるのと同じであったが、わずかに広い染色強度が確認された。選別によって収集された細胞は、Ｒ１およびＲ２のサブセットである。これはＭＡＣＳ精製細胞の約１．１％に対応する。
ｄ．形質細胞の選別
ＭＡＣＳカラムからの溶出液を遠心分離し、１×１０６細胞／６０μｌ ＦＡＣＳバッファーの濃度でＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、２％ＢＳＡ）中に再懸濁した。抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国、カタログ番号３４５７７６）（１０μｌ／１０６細胞）、抗ＣＤ３８−ＰＥ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国、カタログ番号５５５４６０）（１０μｌ／１０６細胞）、および
抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国、カタログ番号３４５８０９）（２０μｌ／１０６細胞）を添加し、混合物を４℃で２０分間、暗所でインキュベートした後、２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁した。
以下のゲートパラメータを使用する蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）によって細胞を選別した：
１．形質ブラスター（ｐｌａｓｍａ ｂｌａｓｔｅｒ）および形質細胞を含むリンパ球および単球を保持し、死細胞を回避するための前方散乱光および側方散乱光、および凝集体または顆粒球でありうるきわめて高い側方散乱光の細胞。
２．ＣＤ１９陽性であり、高レベルのＣＤ３８（ＣＤ３８ｈｉ）を発現する細胞。これは基本的に、ＰＢＭＣはＣＤ１９発現のためのＭＡＣＳカラムで強化されているため単にＣＤ３８におけるゲートであるが、これにより混入物が明らかになる。
３．ＣＤ４５中間陽性細胞。全リンパ球はＣＤ４５を発現する。しかし、形質細胞は初期のリンパ球分化期と比べそのＣＤ４５発現をダウンレギュレートする。したがって、ＣＤ４５でゲーティングすると形質細胞に対応する別個の細胞集団を得ることができる。
ドナーＴＴ０３からのＦＡＣＳ選別細胞を２つのゲートＰ２およびＰ１のサブセットとして収集した（それぞれ、図１６Ａおよび１６Ｂ）。細胞は、ＣＤ３８ｈｉ（ＦＬ２−Ａ）、ＣＤ４５ｉｎ（ＦＬ３−Ａ）、およびＣＤ１９＋であり、後者はＭＡＣＳ精製によるものであった。手短に言えば、細胞をまとめて収集し、計算し、１０％ＦＣＳ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）、カタログ番号１６０００−０４４）、１００単位／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）、カタログ番号１５１４０−１２２）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（カタログ番号２５０３０−０２４）を含有するＲＰＭＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）、カタログ番号２１８７５−０３４）中に希釈した。次いで、培地５μｌ中ウェル当たり細胞１個で５０個の９６ウェルＰＣＲプレート（ＡＢｇｅｎｅ、カタログ番号ＡＢ−０８００）へ分注した。プレートを密閉し、直ちに凍結し、その後のＲＴ−ＰＣＲ分析用に保存した。
ｅ．免疫グロブリン可変領域コード配列の同族対合の連関
多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ法をドナーＴＴ０３から得た単一細胞に適用し、それによって、転写抗破傷風トキソイド重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の同族連関を達成した。
ｅ−１．単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）単一ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコル（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２１０２１２、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を、実質的にメーカーの推奨に従って多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲのために使用した。ウェル当たり単一細胞を含有する５０個の凍結９６ウェルプレートを冷凍庫から除去し、ウェルが氷を含まない場合、ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物１５μｌを直ちに各ウェルに添加した。
ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物は、２０μｌの総量で、以下の試薬を含有する：
１×単一ステップＲＴ−ＰＣＲバッファ
各々４００μＭの最終濃度でｄＮＴＰ、
表１３に示した濃度で多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックス、
０．８μｌ単一ステップＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックス、
２０Ｕ ＲＮａｓｅ阻害物質（ＲＮａｓｉｎ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、米国、カタログ番号Ｎ２５１５）。
多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスの組成物は表１３に示されている。
Figure 2007505611
循環条件は以下のとおりである：
逆転写： ３０分 ５５℃
ポリメラーゼ活性化： １５分 ９５℃ 逆転写酵素を不活性化し
Ｔａｑポリメラーゼを
活性化する。
ＰＣＲ反応：
変性 ３０秒 ９４℃
アニール ３０秒 ５２℃ ３５サイクル
伸長 ５分 ７２℃
最終伸長 １０分 ７２℃
ｅ−２．追加の増幅
各サンプルからの１マイクロリットルの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応産物を、実質的にメーカーによって提案されているように、９６ウェルＰＣＲプレートを利用して半ネステッドＰＣＲ（Ｂｉｏｔａｑキット、バイオライン（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、英国、カタログ番号ＢＩＯ−２１０４０）にかけた。各反応物の総量は５０μｌであり、１×Ｂｉｏｔａｑバッファー、２００μＭ ｄＮＴＰ（各々）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２５Ｕ Ｂｉｏ Ｔａｑポリメラーゼの最終濃度を含有し、プライマーを表１４に示した。
Figure 2007505611
循環条件は以下のとおりであった：
変性 ３０秒 ９５℃
アニール ３０秒 ５５℃ ３０サイクル
伸長 １．５分 ７２℃
最終伸長 ５分 ７２℃
多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲが成功しているかを検証するために、視覚化用にエチジウムブロミドを使用する１．５％アガロースゲル電気泳動によって各プレートの列Ａ、ウェル１−１２からのサンプル１０マイクロリットルを分析した。オーバーラップ・エクステンション断片の予想サイズは約１０７０ｂｐであった（正確なサイズは可変領域の長さに依存する）。図１７は、８個の９６ウェルプレートからのサンプルを示す。５０個の９６ウェルプレートからの有効なオーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ断片の平均数は、プレート当たり８個と推定された。したがって、有効なオーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ断片の総数は約４００と推定された。
同じドナー由来の、９６ウェルプレートにおける実行で行われた反応物すべてから１０マイクロリットルを単一チューブに固定した。プールしたＰＣＲ産物２００μｌから成るアリコートをその後、溶出のために６０マイクロリットルのバッファーＥＢを使用し、メーカーの手順（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２８１０６、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。オーバーラップＰＣＲ産物の精製プールをＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、その後に予備的１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。オーバーラップ・エクステンション断片をアガロースゲルから切除し、ＱｉａｅｘＩＩキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２００５１、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を使用して精製した。
ｆ．同族Ｆａｂ発現ライブラリー
Ｆａｂ発現ライブラリーを２ステップライゲーション法によって生成した。最初、上記の消化オーバーラップ・エクステンション断片のプールを、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ消化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターＪＳＫ３１０１（図１１）へライゲートした。その後、ライゲーション反応物をエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ＸＬ１−ブルーエレクトロポレーションコンペテント、ストラタゲン（Ｓｔｒａｔｇｅｎ）、カタログ番号２００２２８、ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、米国）ヘメーカーの指示に従い変換した。変換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を１００μｇ／ｍｌカルベニシリン含有２×ＹＴ寒天上にプレーティングした。オーバーラップＰＣＲ産物の総数の少なくとも５倍を越える多くの独立コロニー由来の約１０１０−１０１１細胞に対応するバイオマスを、キアゲン・プラスミド調製Ｍａｘｉキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号１２１６３、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を使用するプラスミド調製用の出発原料として使用した。クローン化同族連結ＶＨおよびＶＬコード配列のＦａｂ発現を可能にするため、原核生物プロモーターおよびリーダーカセットを第２のライゲーションステップへ挿入した。使用した双方向プロモーター断片（配列番号３２１）をＡｓｃＩ／ＮｈｅＩ消化によって親ＪＳＫ３０１から抽出した。プラスミドの精製プールを同様にＡｓｃＩ／ＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、既述のようにゲル精製した。精製断片をその後にライゲートし、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へ変換し（ＴＧ１、ストラタゲン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）、カタログ番号２００１２３、ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、米国）、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン、および１％グリコース含有２×ＹＴ寒天上にプレーティングした。Ｆａｂ発現ライブラリー精製法は図１２に概要が示されている。
ｇ．クローンのスクリーニング
Ｆａｂ発現クローンを抗原特異的ＥＬＩＳＡアッセイによってＴＴ抗原結合についてスクリーニングした。
ｇ−１．マスタープレート生成およびＦａｂ発現
セクション（ｆ）に記載されたように生成されたライブラリーから同族Ｆａｂ発現ベクターを各々有するＴＧ１細胞の個々の選択コロニーを、２×ＹＴ／１００μｇ／ｍＬ Ｃａｒｂ／１％グルコースを含有する９６ウェルプレート単一ウェルへ採取する。プレートを静かに攪拌しながら３７℃下で一夜インキュベートした。９６ピンリプリケーターを使用して、２×ＹＴ／１００μｇ／ｍＬ Ｃａｒｂ／１％グルコースを含有する１個の３８４ウェルプレートのウェルへ４個の９６ウェルプレートを固定した。３８４ウェルプレートを３７℃下で一夜インキュベートした。これらのプレートはマスタープレートと呼ばれ、これらをグリセロールを添加して１５％の最終濃度にして−８０℃下で保存した。
９６ピンリプリケーターを使用して２×ＹＴ／１００μｇ／ｍＬ Ｃａｒｂ／１％グルコースを含有する３８４ディープ・ウェル（Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ）プレートの接種用に使用した。プレートを密閉し、２−３時間、３７℃下で攪拌しながらインキュベートした。
同等量の２×ＹＴ／１００μｇ／ｍＬ Ｃａｒｂ／０．２ｍＭ ＩＰＴＧを添加することによってＦａｂ発現を誘導し、０．１ｍＭの最終ＩＰＴＧ濃度を得る。プレートを密閉し、一夜、３０℃下で攪拌しながらインキュベートした。翌日、上清を含有するＦａｂをＥＬＩＳＡによってＴＴ抗原結合特異性について分析した。
ｇ−２．ＥＬＩＳＡ分析
３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州（ＮＹ）、米国、カタログ番号３７００）を一夜、４℃下で破傷風トキソイド（ＴＴ）抗原でコートし、ウェル当たり２５μｌの量でＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈する。ウェルの過剰な結合部位を２％Ｍ−ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中２％脱脂粉乳、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）を添加することによって室温（ＲＴ）下で１時間遮断する。ウェルをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）で２回洗浄した。
セクション（ｇ−１）からの細菌上清を含有するＦａｂを２％Ｍ−ＰＢＳ−Ｔ中に１：２で希釈し、ＥＬＩＳＡウェルに２部移す。インキュベーションを１時間ＲＴ下で実行した。ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。２％Ｍ−ＰＢＳ−Ｔ中ヤギ抗ヒトＦａｂ／ＨＲＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州（ＭＯ）、米国、カタログ番号Ａ０２９３）１：１０，０００希釈をウェルに添加した。インキュベーションを１時間ＲＴ下で実行した。ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。ＴＭＢプラス（ＫｅｍＥｎＴｅｃ、コペンハーゲン、デンマーク、カタログ番号４３９０Ｌ）基質を添加し、インキュベーションを５〜１５分間実行した。同等量の１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止し、４５０ｎｍで分光光度計（マルチスキャン・アセント（（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ）、ラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、フランクリン（Ｆｒａｎｋｌｉｎ）、米国）を使用して分析した。
ＴＴ抗原結合クローンに対応する最初の細菌クローンをその後に最初のマスタープレートから回収することができる。プラスミドＤＮＡを単離抗原陽性Ｆａｂクローンから調製し、ＴＴ抗原結合クローンの同族Ｆａｂ発現サブライブラリーを生成することができる。
クローンのサブセットをさらに抗κＥＬＩＳＡアッセイによって分析し、抗原結合クローンの数とＦａｂ発現クローンの数との相関を得た。抗κアッセイは、炭酸バッファー、ｐＨ９．６を使用してヤギ抗ヒトκ抗体（カルタグ（Ｃａｌｔａｇ）、カリフォルニア、米国、カタログ番号Ｈ１６０００）の１：１０００希釈でウェルをコートしたことを除き、一般にＴＴアッセイとして実行された。
ｇ−３．スクリーニング結果
ｇ−２に記載された手順に従うＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗κＡｂおよびＴＴとの反応性について４個の３８４ウェルプレートからのクローンをスクリーニングした。得られた結果は表１５〜１９に示されている。抗κＥＬＩＳＡの結果は、所定のクローンにおけるＦａｂ断片の発現に関する情報を示し、ＴＴ ＥＬＩＳＡの結果はＦａｂ断片の機能性に関する情報を示す。
Figure 2007505611
分析された１４４０の単一のクローンのうち、４８２のクローンすなわち３４％が２×バックグラウンドを越える反応性のレベルで抗κ反応性を示した。３９５のクローンすなわちクローンの２７％は３×バックグラウンド等を上回る反応性を示した。
同じクローンをＥＬＩＳＡによってＴＴ抗原反応性について分析し、結果は以下の表１６に示されている。
Figure 2007505611
この表から９．０％のクローンが２×バックグラウンド（無関連特異性のＦａｂ断片の反応性によって得られる信号と定義）でＴＴとの反応性を示したことがわかる。１０４のクローンは３×バックグラウンド（７．２％）等で反応した。
Ｆａｂ陽性クローン（合計４８２クローン）のうち、約２７％のクローン（１３０／４８２）は２×バックグラウンドレベルでＴＴとの反応性を示した。このレベルは他のバックグラウンドレベルで大きく変化することはない。
６個の３８４ウェルプレートをＴＴ反応性を有するクローンについてスクリーニングした。抗原との反応性をもたらすクローンの数は表１７に示されている。抗κＥＬＩＳＡはこれらのプレートでは行われなかった。
Figure 2007505611
プレートＧ０５４−Ｇ０５９におけるＴＴ陽性クローンの比率はプレートＧ０５０−Ｇ０５３で見られるものと同等であった（表１６）。
ＴＴに対してスクリーニングされたクローンすべての結果（表１６および１７）が表１８に示されている。
Figure 2007505611
要約すれば、合計３３９のクローンが少なくとも２×バックグラウンドレベルでＴＴとの反応性を示した（表１８）。これはスクリーニングした全クローンの９．４％に対応する。
２×バックグラウンドでＴＴとの反応性を示す陽性クローンすべてを、マスタープレートから既述のように９６ウェルプレートへ接種した。翌日、４０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを０．８ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４×ＰＢＳ、０．８Ｍ ＮａＣｌ中に再懸濁し、１５分間、氷上でインキュベートした。ペリプラスム抽出物を遠心分離によって収集し、クローンの反応性をさらに分析した。ここでわれわれは、抗κ（図１８）、オボアルブミン（無関係抗原）（図１９）、ＴＴ（図２０）、および溶液中でＴＴ抗原の１０−７Ｍ濃度を使用する単一ステップ競合アッセイ（図２１）との反応性についてかかるプレート（Ｇ０６０）からの結果を示す。これらのＥＬＩＳＡアッセイは、同じペリプラスム抽出物、同じ希釈で実行された。
クローンの大部分はＦａｂ断片を発現し（９０／９６）（図１３）、オボアルブミンと反応したクローンはなかった（図１９）。固定化ＴＴとの反応性は、溶液中のＴＴによって減少または完全に抑制され（図２１）、クローンがＴＴと特異的に反応することを示した。プレートＧ０６０におけるクローンの反応性は表１９に示されている。
Figure 2007505611
ｈ．多様性分析およびクローン認定
同族ＴＴ抗原結合Ｆａｂ発現サブライブラリーからの４７のクローンから（プレートＧ０６０から）単離されたプラスミドを配列分析にかけた。可変重鎖コード配列をプライマーＬＳＮ−ＨＣＰを使用して配列決定した：ＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ（配列番号１３１）、Ｐｔａｃプロモーターにアニールし、軽鎖コード配列をプライマーＬＳＮ−ＬＣＰを使用して配列決定した：ＴＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＡ（配列番号１３２）、Ｐｌａｃプロモーターにアニールした。配列データをベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）ＮＴＩソフトウェア（インフォマックス（Ｉｎｆｏｒｍａｘ）、フレデリック（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）、メリーランド州（ＭＤ）、米国）を使用して分析した。結果として得られる重鎖の配列データを上流ＡｓｃＩ制限部位の塩基対５’および下流ＸｈｏＩ制限部位の直接３７にトリミングした。軽鎖配列データを上流ＮｈｅＩ制限部位の第２の５’塩基対、および可変鎖Ｃ末端リシンをコードする最後のコドン「ＡＡＡ」の３’にトリミングした。トリミングは、各ＤＮＡ配列の翻訳など別の分析を容易にするために実行された。
Ｖ塩基生殖細胞系可変領域配列データベースと配列を比較することによって生殖細胞系遺伝子用法について可変重および軽鎖コード配列を分析した（ＭＲＣタンパク質工学センター（ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ Ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、英国）。したがって、最も近い関係の生殖細胞系対立遺伝子は、ＶＨファミリーＶＨ１〜ＶＨ５に属する１２種類の可変重鎖生殖細胞系対立遺伝子およびＶＫＩ、ＶＫＩＩＩ、およびＶＫＩＶに属する８種類の可変κ軽鎖生殖細胞系対立遺伝子に由来するＶ遺伝子レパートリーを示す各配列に対して決定された（表２０）。
さらに、図２２および図２３に示されているように、ＡｌｉｇｎＸソフトウェア（インフォマックス（Ｉｎｆｏｒｍａｘ）、フレデリック（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）、メリーランド州（ＭＤ）、米国）を使用して調整されたタンパク質配列へ可変遺伝子配列を翻訳した。タンパク質配列アラインメントに基づき、可変鎖配列はＶ（Ｄ）Ｊ再配置事象に従う群へ分類され、可変重鎖配列にはＨおよび可変κ鎖配列にはＬで指定して独自の番号を付けた。各再配列群において、配列をＣＤＲ１、２、および３の領域内で成熟遺伝子型（表２０のＭ型）に従い分類し、アルファベット順に小文字で示した。クローンの７個が未成熟終止コドンであり、そのうち６個がアンバー変異（ＴＡＧ）（クローンＩＤｇ０６０：ｂ１２、ｄ０８、ｆ０６、ｃ１２、ｆ０３、ｃ０４）であり、１個のクローンはオパール突然変（ＴＡＧ）（クローンＩＤｇ０６０：ｈ１２）であった。これらのコドンは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって抑制される可能性がきわめて高く、結果として機能的Ｆａｂ断片をもたらした。これらのクローンの４個は、同様のクローンを含有する群のメンバーであり、それらを過剰にした。追加のクローンは、残りの３個のクローンをそれらがその群の単一メンバーであるように早期終止コドンで置換するために分析されなければならないであろう。あるいは、配列は、ＰＣＲなどの標準の分子生物学的方法によって修正され、終止コドンを適切なコドンで置換しうる。
４７の分析されたＶ領域配列は、可変重および可変κ遺伝子の両方について２０の独自のＶ（Ｄ）Ｊ再配置群（表では「群」と指定）に分けられる。再配列群の４つがさらに１〜４の成熟型（ａ〜ｄ）に分けられ、結果として２７の独自の抗体コード配列が生じる（表１２）。一般に、特異的重鎖再配列群は、特異的軽鎖再配列群（例えば、Ｌ１によるＨ１、Ｌ２４によるＨ１２など）と結合する。さらに、成熟型は可変重および可変軽コード配列の対合とマッチする（例えば、Ｈ４ｃはＬ１３ｃとマッチする）。再配置間および成熟型の対合におけるかかるストリンジェンシーは、可変領域コード配列の同族対合を示す。
しかし、重鎖再配列群Ｈ４は例外である。Ｈ４は２つの異なる軽鎖Ｌ２８およびＬ１３と対合する。Ｌ１３は、Ｌ１３成熟型とマッチする成熟型ａ、ｂ、およびｃを含んで成るＨ４に特有である。他方、２８は、重鎖群Ｈ２における単一メンバーと対合することもわかった。７つのＨ４ａ重鎖配列のうち２つが重鎖Ｌ１３ａと対合し、７つのＨ４ａ重鎖配列のうち５つはＬ２８ａと対合する。要約すれば、これらの所見は、遺伝子型の組合せＨ２−Ｌ２８およびＨ４ａ−Ｌ１３ａの形質細胞を産生する２つのＴＴ特異的抗体が単一ウェルに存在する多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ事象を示した。Ｌ２８によるＨ２およびＨ４ａなど、軽鎖および重鎖遺伝子対合の稀なスクランブル事象が、形質細胞の限界希釈に基づき実験として予想された。
同じ群および成熟型からの可変重鎖および可変軽鎖コード配列の個々の同族対合間の配列同一性は、少なくとも９０％、かつ好ましくは、少なくとも９５％である。例えば、群Ｈ１成熟型ａからｇ０６０ｇ０３およびｇ０６０ａ０１を取る。クローンｇ０６０ｇ０３は核酸配列番号対合１６８：２１５に対応し、ここで可変重鎖コード配列は、配列番号１６８に対応し、可変軽鎖コード配列は配列番号２１５に対応する。クローンｇ０６０ａ０１は核酸配列番号対合１３３：１８０に対応する。配列番号１６８が配列番号１３３（可変重鎖）と整列すると、４／３６９塩基は同一ではなく、可変軽鎖（配列番号２１５および１８０）については、８／３２７塩基は同一ではなく、これはこれら２つの同族対合（ｇ０６０ｇ０３およびｇ０６０ａ０１）間の９８．３％の配列同一性に対応する。しかし、異なる群間の配列同一性を見ると、これはポリクローナルサブライブラリーであり、多様性が望ましいため、配列同一性が高くなることは予想されない。特定の実施例においては、同族対合間の最も低い同一性は約４０％である（例えば、ｇ０６０ｂ１１およびｇ０６０ｈ１１は３９．５％の配列同一性を有する）。
本発明の一実施形態は、免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の同族対合のサブライブラリーであり、ここで前記ライブラリーから得ることが可能な免疫グロブリンは破傷風毒素と反応し、またはこれに結合することが可能である。
本発明の別の実施形態は、配列番号対合１３５：１８２、１６８：２１５、１４６：１９３、１５１：１９８、１７３：２２０、１５２：１９９、１６４：２１１、１４８：１９５、１３７：１８４、１６９：２１６、１３８：１８５、１４３：１９０、１６１：２０８、１６６：２１３、１５７：２０４、１３９：１８６、１３４：１８１、１５０：１９７、１５６：２０３、１５８：２０５、１７０：２１７、１７８：２２５、１４１：１８８、または１４４：１９１より成る群から選択される個々の配列番号対合との少なくとも９０％の配列同一性を有する個々の同族対合を含んで成る、免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の同族対合のかかるサブライブラリーである。
Figure 2007505611
Figure 2007505611
ｉ．明白な親和性
プレートＧ０６０からの選択クローンの明白な親和性またはＩＣ５０を判定するために競合アッセイを設定した。
手短に言えば、Ｆａｂ断片を以下のように５０ｍｌ培養中で発現させた。すなわち、５０ｍｌ２×ＹＴ／１００μｇ／ｍｌＣａｒｂ／０．１％グルコースを０．５ｍｌ一夜培養に添加し、約２時間３７℃下で攪拌した。ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭまで添加し、攪拌を一夜３０℃下で継続した。翌日、４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって細菌を収集し、ペレットを１ｍｌ ０．８ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４×ＰＢＳ、０．８Ｍ ＮａＣｌ中に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。ペリプラスム抽出物を遠心分離によって収集し、−２０℃下で保存した。
競合アッセイを以下のように実行した。すなわち、滴定によって推定された適切な希釈でぺリプラスム抽出物を一連のチューブに添加した。陽性対照として、抗ＴＴ抗体を発現するヒトハイブリドーマ細胞系ＨＢ８５０１由来のファージディスプレイ由来Ｆａｂ断片を使用した。可溶性ＴＴを１００ｎＭの濃度で第１のチューブに添加し、その後に次のチューブにおける４倍ステップで希釈し、合計７つのＴＴ希釈液を作った（１００ｎＭ〜２５ｐＭ）。反応物を約４５分間室温でインキュベートした。１μｇ／ｍｌのＴＴでコートしたＥＬＩＳＡプレートにサンプルを移し、既述のように遮断した。プレートを１時間室温下でインキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ヤギ抗ヒトＦａｂ／ＨＲＰを１：１０，０００の希釈で添加し、１時間インキュベートした。ＴＭＢプラス基質（ＫｅｍＥｎＴｅｃ、デンマーク、カタログ番号４３９０Ａ）を添加し、インキュベーションを約１０分間実行し、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。プレートを４５０ｎｍで読取った。データは図２４にプロットされている。
分析されたクローンの明白な親和性は表２１に示されている。
Figure 2007505611
表２１に示されているように、Ｆａｂ断片は、低ナノモルまたは上ピコモル範囲で明白な親和性を有する。さらに、すべての同族対合Ｆａｂ断片は、ファージディスプレイ由来Ｆａｂ断片のものよりも高い明白な親和性を示す。
ｊ．要約
ドナーＴＴ０３においては、末梢血単球細胞分画におけるＴＴ特異的形質細胞は、０．０２２％と計算された。約４００同族対合がＴＴ０３から生成された。同族対合ライブラリーで転換された細胞からの３６００個のクローンについて、ＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングし、これらのうち３３９個のクローンがＥＬＩＳＡスクリーニングにおけるＴＴ反応性を示した。これらのクローンのうち４７個がそのクローン多様性に関して分析されている。これら４７個のクローンのうち、２７個が独自の非スクランブル可変領域コード配列に似ていることが判明した。これらのクローンのち３個が、哺乳類発現ベクターへ移す前に修正を必要とする早期終止コドンを含有した。哺乳類発現ベクターへの移動は、実施例１、セクションｈに記載された。明白な親和性を、低ナノモル〜上ピコモル範囲で、選択されたクローンで測定された。
ｋ．考察
破傷風毒素は、致死量が数ナノグラムとして知られる最毒性物質の１つである。この毒素は、ヒトの２５％までの消化管中にも存在する土壌菌である破傷風菌によって産生される。破傷風免疫化プログラムは西欧諸国において疾患を有効に根絶してきたが、１００−２００例は依然として主な西欧諸国で毎年観察されており、致死率は５０％である。発展途上国における症例数は大幅に増大する。汚染穿通創における細菌増殖が毒素の放出をもたらし、最終的に硬直、痙攣、呼吸停止、および死亡に至る。
破傷風トキソイドに対する高力価の抗体反応を有するヒト血液ドナーから単離された高力価免疫グロブリンを使用し、破傷風を予防し、または早期に開始すれば、活性免疫化とも併用して、確立された破傷風を治療することができる。しかし、人的生産の不足により、ウマ高免疫抗破傷風トキソイドが発展途上国では使用されている。破傷風トキソイドに対する組換えモノクロナールまたはポリクローナル抗体は、治療および／または予防用途の高力価免疫グロブリン産物の代わりとなる可能性を有する。従来のハイブリドーマ技術に由来する組換えモノクロナール抗体は、ＴＴに対して有効であることが記載されている（チン（Ｃｈｉｎ）、Ｊ．ら、２００３年、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３１、４５−５３頁）。興味深いことに、２つのモノクロナール抗体を混合すると相乗効果が確認された。したがって、破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル抗破傷風トキソイド抗体は、破傷風を発症する危険のある患者の治療または予防保護において潜在的にきわめて有効でありうる。
本発明の一実施形態は、破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル免疫グロブリンまたはその断片である。
本発明の好ましい実施形態は、免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の同族対合から成る破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル免疫グロブリンである。
本発明の別の実施形態は、本発明による方法によって得られる破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル免疫グロブリンである。
本発明の別の実施形態は、配列番号の対合２２９：２７６、２６２：３０９、２４０：２８７、２４５：２９２、２６７：３１４、２４６：２９３、２５８：３０５、２４２：２８９、２３１：２７８、２６３：３１０、２３２：２７９、２３７：２８４、２５５：３０２、２６０：３０７、２５１：２９８、２３３：２８０、２２８：２７５、２４４：２９１、２５０：２９７、２５２：２９９、２６４：３１１、２７２：３１９、２３５：２８２、または２３８：２８５から選択される個々の配列番号の対合と少なくとも９０％の同一性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の同族対合を含む、破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル免疫グロブリンである。
本発明の他の実施形態は、破傷風の治療または予防を目的とした有効成分として破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル抗体を含んで成る医薬組成物である。好ましくは、組換えポリクローナル抗体は、薬剤として許容される賦形剤と組合わされる。
本発明の別の実施形態は、破傷風を発症する危険のある患者の治療または予防保護のための薬剤として、破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル免疫グロブリンの使用である。
さらなる実施形態は、破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル抗体を含んで成る組成物をそれを必要とする患者に投与することによって、破傷風を発症する危険のある患者を予防または治療する方法である。
実施例１２：２人のドナーから得た結果の比較
以下の実施例においては、ドナーＴＴ０８から得られた結果を実施例１１におけるドナーＴＴ０３から得られた結果と比較する。結果は表２２にまとめられている。
Figure 2007505611
これは明らかに、同様の品質のライブラリーがＴＴで免疫された２人の異なるドナーから単離されることを示した。
ドナーＴＴ０８から得られたライブラリーにおける独自の同族対合の数が多い理由として、分析された配列の数が多いことが最も可能性が高い。
実施例１３：実施例１１からの同族対合のライブラリーと同じドナーから生成されたコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーとの比較
本実施例においては、同族対合のライブラリーとコンビナトリアルライブラリーとの間のライブラリーの多様性、親和性、および特異性を比較するために、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを以前に使用された同じドナーから調製し、同族対合のライブラリーを調製した。
ａ．コンビナトリアルファージライブラリーの構成
ドナーＴＴ０３（実施例１１ｃにおいて得られた細胞分画と同一）からの細胞のＣＤ１９＋分画からファージディスプレイライブラリーを生成した。
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｌキット（マッハライ・ナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）、カタログ番号７４０９６２．２０）を使用して約５×１０６ＣＤ１９＋細胞から総ＲＮＡを調製した。その後にｃＤＮＡをＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１１１４６−０１６）を使用してオリゴ（ｄＴ）プライム反応で合成した。
ＨｏｔＭａｓｔｅｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、カタログ番号００３２００２．６９２）およびプライマーを使用し、５’末端における制限酵素認識配列に関してのみ変更し、実質的にデ・ハールト（ｄｅ Ｈａａｒｄ）ら、（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、１８２１８−１８２３０頁、１９９９年）によって記載されたように、ＶＨおよびκ鎖をＰＣＲ増幅した。
コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを、κおよびＶＨＰＣＲ産物のＥｍ３５１ファージディスプレイベクター（デン（Ｄｅｎ）、Ｗ．ら、１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２２、４５−５７頁に記載されたｐｈｈ３からの変更）への連続的挿入によって生成した。
最終ライブラリーをＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））へ電気穿孔した。コンビナトリアルライブラリーのサイズは、高い挿入頻度で３×１０６の独立クローンを含有した。
（Ｉ）
ｂ．コンビナトリアルライブラリーのパニング
Ｆａｂディスプレイファージ粒子を標準の手順（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ １９９６年、マクカフェルティ（ＭａｃＣａｆｆｅｒｔｙ）編、フーゲンブーム・アンド・チスウェル（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ））に従って調製した。
ＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬに希釈した破傷風トキソイド（ＴＴ、ＳＳＩバッチ番号８９−２）上でパニングを実行し、ＭａｘｉＳｏｒｐイムノチューブ（ヌンク（Ｎｕｎｃ）カタログ番号４４２０２）に固定した。１時間のインキュベーションおよび数回の洗浄ステップ後、結合ファージ粒子を１００ｍＭ ＴＥＡ（トリエチルアミン）を使用して溶出した。
ファージ粒子溶出物を中和し、これを使用して指数増殖期ＴＧ１細胞を感染させ、ＴＴ特異性で強化したＦａｂディスプレイファージ粒子を得た。溶出ファージを使用する第２回のパニングを上記に概要を示した一般的な手順に従い実行した。
平行して、３回のパニングを、上記に概要を示した手順に従い、破傷風毒素分子（シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号Ｔ３６９４）のＣ断片上で実行した。
単一コロニーを破傷風トキソイドおよび非選択のライブラリーからのＣ断片との結合について、上記の両方のセットのパニングから各回のパニング後、スクリーニングした。
ｃ．コンビナトリアルファージ粒子クローンおよび同族対合クローンの特異性および親和性の比較
単一コロニーを非選択のライブラリーから、および各回のパニング後に選択した（それぞれ、無傷破傷風トキソイド（ＴＴ）および破傷風トキソイドＣ断片）。Ｆａｂディスプレイファージ粒子を反応性についてＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。ＴＴおよび／またはＣ断片の少なくとも２×バックグラウンド反応性および少なくとも４×バックグラウンド反応性を示すＦａｂ陽性クローンの数が以下の表２３〜２５に示されている。結果はすべて特異的クローンの数／Ｆａｂ陽性クローンの数で示されている。
Figure 2007505611
Figure 2007505611
Figure 2007505611
ＴＴに対するファージディスプレイライブラリーのパニングは、パニング回数を増大させるとＴＴ特異的クローンの数の増大を示し、ほんのわずかなクローンのみが非選択ライブラリーで確認された。非選択ライブラリーから、またはＴＴに対するライブラリーの２回のパニング後の破傷風トキソイドＣ断片と反応性であるクローンは確認されなかった。コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーからＣ断片特異性を有するＦａｂ断片を得るために、このライブラリーはＣ断片に対して特異的にパニングされる必要があった。
比較のために、実施例１１から１３個のＴＴ特異的クローンをＣ断片特異的ＥＬＩＳＡにかけたが、これらのうち７個が２×バックグラウンドを越える反応性を示した。したがって、破傷風毒素Ｃ断片に対する特異性を有するＦａｂ断片は、ＴＴ免疫個体から得られる同族対合のライブラリーから発現されうる。
これは明らかに、特定の抗原に対する特異性を有するクローンを確認するためにパニングを使用することの欠点を示す。重要な抗原断片またはエピトープが未知である場合は、それらはパニング中に排出され、それによって最後に無効な産物が生じる。
さらに、コンビナトリアルクローンの明白な親和性を実施例１１ｉのアッセイにおいて記載されているように判定した。ＴＴでの２回のパニング後に得られたコンビナトリアルクローンの１０個を分析し、１〜１５ｎＭの明らかな結合親和性を示した。
比較のために、同族対合のライブラリー（表２１）から分析された９個のクローンのうち４個がピコモル範囲での親和性を示した。
これは、可変領域の対合がドナー免疫系によって最初に選択されたものであり、体超変異との組合せで、対合が一対にかけられており、潜在的にかかる可変領域のランダムな組合せよりも高い明白な結合親和性が生じることを示す。
ＴＴ特異的コンビナトリアルファージ粒子クローンおよび同族対合クローンの配列比較
２つのライブラリーから生成された大量の配列データは、遺伝子配列の直接比較を妨げる。ファージディスプレイライブラリーにおけるＶＨとＶＬの配列対合間の差を視覚化するために、同族対合のライブラリーにおいて、系統発生的な３個がＶＨおよびＶＬ配列のために生成され、対合はドットマトリクスで示された。ドットマトリクスでの系統発生的情報の対合（図２５）は、２つのライブラリーにおけるＶＨとＶＬの配列対合のきわめて異なる分布プロフィールを示した。ファージディスプレイライブラリーにおけるＶＨとＶＬの配列対合の散在性出現（図２５Ａ）は、このライブラリーにおけるＶ遺伝子のランダム対合と一致してＶＨとＶＬ遺伝子間にほとんど系統発生的関係がないことを示した。これとは対照的に、同族対合のライブラリーからのＶＨとＶＬの配列対合（図２５Ｂ）は集合出現を示し、同族対合に予想されるＶ遺伝子の共進化を示した。また、遺伝子多様性は、コンビナトリアルライブラリーからのＶ遺伝子と比べ同族対合のライブラリーにおけるＶ遺伝子ではるかに大きく、同族対合Ｖ遺伝子を単離する方法がバイアスを受けていないことを示した。
実施例１４：テンプレート源としてＴ細胞を使用する単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲとネステッドＰＣＲの組合せ
本実施例においては、ヒトドナー由来のＴリンパ球で単一ステップの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲがいかにして実行されるかが記載されている。
ａ．細胞分画を含有するリンパ球の獲得
血液サンプルを、例えば、免疫化、自然感染、悪性腫瘍によって、自己免疫反応により、または他の疾患によって、所望の抗原に曝露されているヒトドナーから得る。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をメーカーの指示に従ってリンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（アクシス・シールド（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）、オスロ（Ｏｓｌｏ）、ノルウェー、製品番号１００１９６７）を使用して単離する。
本実施例においては、抗原特異的Ｔ細胞がＰＢＭＣ分画の別の刺激によって生成される。しかし、多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲは、ＰＢＭＣ分画から単一細胞またはＴ細胞で強化した細胞分画で直接実行される（例えば、ＣＤ３陽性細胞のＦＡＣＳ選別によって）。
ｂ．抗原特異的Ｔ細胞の生成
ＰＢＭＣ細胞分画を、ＩＬ２など関連性サイトカインを含有する適切な培養培地に再懸濁する。さらに、所望の抗原を培養に添加し、ここでＰＢＭＣ分画に存在する細胞（ＡＰＣ）に存在する抗原によってＴリンパ球に提示される。あるいは、あらかじめ所望の抗原を提示するように処理されたＡＰＣ供給細胞をＰＢＭＣ分画に添加することができる。かかるＡＰＣ供給細胞は、例えば、ペプチド、タンパク質の形、または他の分子形態で所望の抗原に曝露され、または抗原を発現および提示するようにトランスフェクトされた細菌感染ＡＰＣまたは細胞、または他の抗原細胞、例えば、一次組織または細胞系の形での癌細胞などと共培養されたＡＰＣでありうる。多くの異なる種類のＡＰＣ供給細胞が、変換細胞系、Ｂ細胞系、樹状細胞等を含めて、文献により周知である。
ＰＢＭＣ分画は約３〜５週間培養され、その間に新鮮抗原提示細胞がサイトカインとともに、例えば、週１回の頻度で添加される。この結果として、Ｔリンパ球の増殖、活性化、および成熟が生じる。培養期間の終了時には、細胞は抗原特異的Ｔ細胞によって支配される。これらの細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるかどうかは、疾患、抗原、ＡＰＣ細胞、および刺激期間中に使用されるサイトカイン混合物によって決まる。
抗原特異性は、例えば、ＣＴＬアッセイ、増殖アッセイ、および所望の抗原を添加したＭＨＣ四量体によって試験されうる（アルトマン（Ａｌｔｍａｎ）、Ｊ．Ｄ．ら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、９４−９６頁）。
抗原特異的Ｔ細胞は、単一細胞優先容器を得るために、限界希釈またはＦＡＣＳの使用のいずれかによってＰＣＲチューブに分配される。容器は使用するまで−８０℃下で保存されうる。
ｂ．単一ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）単一ステップＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２１０２１２、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を、実質的にメーカーの推奨に従って多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲのために使用しる。ＰＣＲ反応混合物のＰＣＲチューブへの添加前に細胞を解凍する。
ＰＣＲ反応混合物および循環条件を最初に実施例１１ｅ−１に記載されているように設定する。しかし、一定量の最適化が新しいプライマーセットのために期待されうる。
使用された多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスは、表２６に示されているプライマーを含んで成る。
Figure 2007505611
Figure 2007505611
ｃ．半ネステッドＰＣＲ
半ネステッドＰＣＲが同様に実施例１１ｅ-２に記載されているように実行されることが提案されており、かつ一部の最適化が期待される。
使用されたプロフィールは、表２７に示されている。
Figure 2007505611
多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲが成功しているかを検証するために、各半ネステッドＰＣＲ反応から１０μｌを検出のためにエチジウムブロミドを使用する１％アガロースゲル電気泳動にかけることによって分析する。オーバーラップ・エクステンション断片の予想サイズは約８５０ｂｐである（正確なサイズは可変領域の長さに依存する）。
同じドナー由来の実行された反応物すべてから１０マイクロリットルを単一チューブに固定した。プールしたＰＣＲ産物のアリコートをその後、メーカーの手順（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号２８１０６、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。オーバーラップＰＣＲ産物の精製プールを適切な制限酵素で消化し、その後に精製し、適切なベクターに挿入した。
本実験においては、半ネステッドＰＣＲにおいて使用された定常領域プライマー（配列番号３７６および３７７）を、半ネステッドＰＣＲ産物の適切なベクターへのサブクローン化のためにデザインされている。Ｃβプライマーのデザインは、β鎖定常領域ペプチドにおける２１位でのＳＥＲのＭｅｔへの変更に依拠し、それによってＮｓｉＩ部位は核酸配列へ導入されうる：
NsiI
tcc cac -> atg cat
SER HIS MET HIS
この遷移は、ＳＥＲ２１がドメインの膜近位端でのループ構造におけるβ鎖定常領域で露出されるため比較的安全である。したがって、この比較的保存的な変化はドメイン構造全体を破壊するおそれはない。
Ｃαプライマーのデザインは、α鎖定常領域ペプチドにおける１５−１７位に対応するヌクレオチドの変化に依拠し、それによってＳａｃＩ部位は核酸配列へ導入されうる。
SacI
aaa tcc agt -> aag agc tct
LYS SER SER LYS SER SER
したがって、適切なベクターは、ＴｃＲαおよびβの定常領域の残りの部分を含み、制限部位の点で適切な修飾を含むことになる。これらの変化は、標準ＰＣＲおよびサブクローン化法を使用して実行されうる。
ｅ．追加の検討
大量の可変領域プライマーは、多重オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ増幅中に抑制的な方法で潜在的に相互作用しうる。これを回避するには、可変領域プライマーはサブセットに分割され、適切な組合せて別々に使用されうる。
他の実施形態
本明細書に引用されたすべての刊行物および特許出願は、それぞれの刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により援用されることが示されている場合には、本明細書で参照により援用される。前記発明は、明確な理解のために図面および実施例によって相当に詳しく説明されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神および範囲を逸脱することなく、いくらか変更および修正がなされうることは当業者には容易に理解されるであろう。
オーバーラップ・エクステンションテールの異なる種類を示す図である。太い線はプライマーの遺伝子特異的部に対応し、通常の線はオーバーラッピングテールに対応する。縦棒は相補的領域を示す。プライマーは目的とする２つのヌクレオチド配列の連関を促進する。図１（Ｉ）は、唯一のエクステンションテールが、完全または部分的にオーバーラップするタイプＩのオーバーラップ・エクステンションテールの２つの種類であり、図１（ＩＩ）は、第１のプライマーエクステンションテールの５’ヌクレオチドの一部が隣接するプライマーの遺伝子特異的部を相補するタイプＩＩのオーバーラップ・エクステンションテールを示し、図１（ＩＩＩ）は、オーバーラップ・エクステンションテール全体が隣接するプライマーの遺伝子特異的領域を相補するタイプＩＩＩのオーバーラップ・エクステンションテールを示す。 免疫グロブリン可変領域コード配列の連関において適用可能な多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスの図式的概観を示す図である。連結される軽鎖（ＬＣ）および重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするｃＤＮＡは、そのセンス鎖５’および３’末端ならびに予想サイズの増幅産物を示すチューブとして示されている。コード配列を増幅するために使用される多重オーバーラップ・エクステンションプライマーセットは矢印によって示されている。破線の５’オーバーハングを有する曲がった矢印のテールはクローン化テールを示す。オーバーラップ・エクステンションテールは太字である。テールに存在する制限部位はテールといっしょに指定されている。多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスにおけるプライマーの総数は１６であり、１つのＣＫおよび１つのＣＨ１プライマーを含んで成る外側プライマー、および６つのＶＬおよび８つのＶＨプライマーを含んで成るオーバーラップ・エクステンションプライマー上に分布している。ＣＨ１プライマーは、重鎖定常ドメイン１の５’末端でアニールする。多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲに由来する産物は、遺伝子および可変遺伝子（Ｃκ＋ＪＬ＋ＶＬ）を接合する定常領域、および可変遺伝子、多様性部分および接合遺伝子（ＶＨ＋Ｄ＋ＪＨ）から成る重鎖可変領域から成るκ軽鎖全体を構成する約１０７０ｂｐであると予想される。５’および３’は、オープンリーディングフレームの方向を示す。ほんの一部のＣＨ１領域コード配列は、ＣＨ１のアニーリング位置が重鎖Ｊ領域に近接しているため、この多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスによって増幅される。 プライマーが連関テールを備えテールに依存して得られうる産物の異なる連結方向を示す一連の図である。中実の黒はオーバーラップ領域を示す。５’および３’は、オープンリーディングフレームの方向を示す。図３Ａは、産物のヘッド−ヘッドの方向付けを示す図である。図３Ｂは、テール−テール方向付けを示す図である。図３Ｃは、最初に軽鎖コード配列によるヘッド−テール方向付けを示す図である。図３Ｄは、最初に重鎖コード配列によるヘッド−テール方向付けを示す図である。 コード配列がヘッド−テール方向付けである免疫グロブリン発現ベクターｐＬＬ１１３を示す概略図である。ベクターは、以下の要素を含んで成る。すなわち、ｂｌａ＝アンピシリン耐性遺伝子の発現を可能にするプロモーター。Ａｍｐ＝アンピシリン耐性をコードする遺伝子。ｐＵＣｏｒｉ＝複製のｐＵＣ起源。ＡｄＭＬＰ＝アデノウイルス主要後期プロモーター。ヒトＩｇＧ１＝免疫グロブリンアイソタイプＧ１重鎖をコードする配列。ｈＧＨｐＡ＝ヒト成長ホルモンポリＡシグナル配列。ｂＧＨポリＡ＝ウシ成長ホルモンポリＡ配列。ヒトκＬＣ＝免疫グロブリンκ軽鎖をコードする配列。ＦＲＴ＝Ｆｌｐ認識標的部位。ハイグロマイシン＝ハイグロマイシン耐性をコードする遺伝子。ＳＶ４０ポリＡ＝サルウイルス４０ポリＡシグナル配列。 ２ステップ多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ後の半ネステッドＰＣＲの結果を示す電気泳動ゲルである。増幅産物は、単一ＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ ｐＬＬ１１３細胞から単離されたｃＤＮＡ由来である。レーン１−１２は、サンプルレーンであり、矢印は１０７６ｂｐの正確なネステッド多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ産物を示し、Ｍ１は１００ｂｐラダーを示す。Ｗは陰性対照テンプレートとして使用される水である。Ｃは細胞系ＨＢ−８５０１由来の陽性ｃＤＮＡ対照テンプレートである。別々のパネルにおいて、同じレーンＷ、Ｃ、および１００ｂｐラダーが、個別のＤＮＡ断片を分解するために低いコントラストで示されている。 ゲルからの関連断片を示す図５Ａに示されているゲルの略図である。 追加のＰＣＲ増幅なしの単一ステップの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応の結果を示す電気泳動ゲルの一連の写真およびグラフである。各パネルにおいて、Ｍ１は１００ｂｐラダーであり、Ｍ２は５００ｂｐラダーである。 １００、１０、１、または０細胞に対応する溶解物由来の増幅産物を示す電気泳動ゲルである。矢印はオーバーラップ・エクステンション産物を示す。 図６Ａにおけるゲルを示す略図である。 図６Ａにおける１００および１細胞レーンにおけるオーバーラップ・エクステンション産物の存在を証明する電気泳動ゲルである。 図６Ｃにおける１細胞レーンからのオーバーラップ・エクステンション産物の、それぞれ、ＮｈｅＩおよびＮｃｏｌによる制限酵素開裂を示す電気泳動ゲルである。 単一ステップの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ後の半ネステッドＰＣＲ増幅の結果を示す電気泳動ゲルである。Ｍ１は１００ｂｐラダーであり、Ｍ２は５００ｂｐラダーである。多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応における外側プライマーとしてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、またはＣＨ５のいずれかを含んで成る多重オーバーラップ・エクステンションプライマー混合物からの結果。反応は、１００、１０、１、または０細胞に対応する細胞溶解物で実行される。オーバーラップ・エクステンション産物のサイズは矢印で示されている。 単一ステップのオーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ後、テンプレートして豊富なヒトＢリンパ球を使用する半ネステッドＰＣＲ増幅の結果を示す電気泳動ゲルである。Ｍ１は１００ｂｐラダーである。レーン５および６は、オーバーラップ・エクステンション産物に対して予想されるサイズのバンドを示す図である。 コード配列がヘッド−ヘッド方向付けである細胞系を発現するＩｇＧ１λの生成に使用される哺乳類発現ベクター（Ｅｍ４６５／０１Ｐ５８２／Ｅｍ４６５／０１Ｐ５８１）を示す概略図である。ベクターは、以下の要素を含んで成る。Ａｍｐ＝アンピシリン耐性をコードする遺伝子。ｐＵＣｏｒｉ＝複製のｐＵＣ起源。ＡｄＭＬＰ＝アデノウイルス主要後期プロモーター。ＥＦＰ＝延長因子プロモーター。ＡＰリーダー＝アルカリホスファターゼリーダー配列。ＶＨ＝重鎖可変領域コード配列。ＩｇＧ１ ＨＣ＝配列（をコードする）免疫グロブリンアイソタイプＧ１重鎖定常領域。ｒＢＧポリＡ＝ウサギβグロブリンポリＡシグナル配列。ｂＧＨポリＡ＝ウシ成長ホルモンポリＡ配列。ＩｇＫリーダー＝マウスκリーダーをコードする配列。ＩｇＬ（１ｂまたは１ｃ）＝免疫グロブリンλ軽鎖ファミリー１ｂまたは１ｃをコードする配列。ＦＲＴ＝Ｆｌｐ認識標的部位。ハイグロマイシン＝ハイグロマイシン耐性をコードする遺伝子。ＳＶ４０ポリＡ＝サルウイルス４０ポリＡシグナル配列。 それぞれ、細胞系ＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ／Ｅｍ４６４／０１Ｐ５８１およびＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ／Ｅｍ４６４／０１Ｐ５８２（から）単離されたＰＣＲ産物を装填したエチジウムブロミド染色アガロースゲルを示す図である。レーン１〜４は、多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応で使用される５０ｐｇ、５ｐｇ、０．５ｐｇ、または０ｐｇの総ＲＮＡテンプレート濃度に対応する。Ｍは１００ｂｐラダーである（ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ、米国）。矢印はオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ産物を示す。 ポリクローナルまたはモノクローナル抗体が発現されうる同族抗体発現ライブラリーを生成するために使用されるステップを示すフローチャートである。 同族可変領域コード配列を含んで成るオーバーラップ・エクステンション断片を指示ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ制限部位でのベクターへ挿入することによってＦａｂベクターのライブラリーを生成するために使用されるＪＳＫ３０１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターを示す概略図である。ベクターは以下の要素を含んで成る。すなわち、ＡｍｐおよびＡｍｐ ｐｒｏ＝アンピシリン耐性遺伝子およびそのプロモーター。ｐＵＣ１９Ｏｒｉ＝複製の起源。ヒトＣＨ１＝ヒト免疫グロブリンγ１重鎖ドメイン１をコードする配列。スタッファー＝オーバーラップ・エクステンション断片の挿入時に切離される無関連配列挿入。ｔａｃＰおよびｌａｃＺ＝ＮｈｅＩおよびＡｓｃＩ制限部位で切除されうる細菌プロモーター。 同族Ｆａｂ発現ベクターのライブラリーの生成を示す概略図である。ステップＩは、可変領域コード配列の同族対合（ＶＨ１−ＶＬ１〜ＶＨＸ−ＶＬＸ）のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ消化による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターＪＳＫ３０１への挿入を示す。ステップＩＩは、細菌プロモーターおよびリーダーカセット（ＶＨＸの発現を推進するｐｅｌＢリーダー−Ｐｔａｃ−プロモーターおよびＶＬＸの発現を推進するＰｌａｃプロモーター−ｐｅｌＢリーダー）のＡｓｃＩ−ＮｈｅＩ消化による挿入を示す。 単一ステップの多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲを利用した後にＰＣＲ増幅を追加する、Ｇタンパク質を構成するα−、β−、およびγ−サブユニットの連関を示す図である。個々のコード領域のサイズおよび連結産物のサイズが示される。増幅中のプライマーテールによって導入される制限部位は最終産物について示されている。 （Ａ）ドナー血液から精製されたＰＢＭＣ、（Ｂ）磁気的に区別された非標識ＣＤ１９陰性細胞分画、および（Ｃ）磁気的に区別されたＣＤ１９＋細胞分画の分析的ＦＡＣＳ染色のドットプロットを示す図である。分散プロット、ＣＤ１９／ＣＤ３８プロット、およびＣＤ３８／ＣＤ４５プロットが各分画について示されている。 液体窒素中に保存され、融解され、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３８、および抗ＣＤ４５で染色されていた図９ＣからのＣＤ１９＋分画を示す図である。図９Ｃに対応するドットプロットが示されている。 ＣＤ１９＋細胞分画で区別するため使用されるゲートを示す図である。ＣＤ３８およびＣＤ４５に基づく分散ゲートおよび蛍光ゲートがＣＤ３８高（ＣＤ３８ｈｉ）、ＣＤ４５中間（ＣＤ４５ｉｎ）細胞を単離するために使用された。 ドナーＴＴ０３に対する有効な多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ反応を示す電気泳動ゲルである（Ａ列、８つの９６ウェルプレートからウェル１−１２）。サンプルは、各々４８サンプルの２つの列（ＡおよびＢ）におけるアガロースゲルに適用されている。オーバーラップ・エクステンション断片の予想サイズは約１０７０ｂｐであった。推定オーバーラップ・エクステンション断片は矢印で示されている。 プレートＧ０６０からのペリプラスム抽出物のＥＬＩＳＡ分析を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートはヤギ（ｇｔ）抗ヒトκでコーティングされ、捕捉Ｆａｂ断片はＨＲＰ共役ｇｔ抗ヒトＦａｂ特異的抗体で検出された。 プレートＧ０６０からのペリプラスム抽出物のＥＬＩＳＡ分析を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートは１０μｇ／ｍｌオボアルブミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ａ−５５０３）でコーティングされ、捕捉Ｆａｂ断片はＨＲＰ共役ｇｔ抗ヒトＦａｂ特異的抗体で検出された。 プレートＧ０６０からのペリプラスム抽出物のＥＬＩＳＡ分析を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートは破傷風トキソイドでコーティングされ、捕捉Ｆａｂ断片はＨＲＰ共役ｇｔ抗ヒトＦａｂ特異的抗体で検出された。 プレートＧ０６０からのペリプラスム抽出物のワンステップ競合ＥＬＩＳＡ分析を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートは破傷風トキソイド（ＴＴ）でコーティングされ、可溶性ＴＴを１０−７Ｍで各ウェルに添加し、細菌上清からのＦａｂ断片の結合を、固定化ＴＴに対して競合した。捕捉Ｆａｂ断片はＨＲＰ共役ｇｔ抗ヒトＦａｂ特異的抗体で検出された。 プレートＧ０６０からのＴＴ抗原結合クローンからの可変重鎖タンパク質配列のアラインメントを示す図である。配列相同性の程度は、異なる陰影によって示され、１００％、８０％、および６０％がそれぞれ、黒色、灰色、薄い灰色で示された。ＣＤＲ１はアラインメント位置３４〜４１に配置されている。ＣＤＲ２はアラインメント位置５５〜７３に配置されている。ＣＤＲ３はアラインメント位置１０７〜１２７に配置されている。早期終止コドンはアスタリスクで示された。アラインメントは、上列の図２２ａ〜ｄおよび下列の図２２ｅ〜ｈによる左〜右の２つの列に分布した８つの別々の図（ａ−ｈ）に分けられている。 プレートＧ０６０からのＴＴ抗原結合クローンの可変軽鎖タンパク質配列のアラインメントを示す図である。配列相同性の程度は、異なる陰影によって示され、１００％、８０％、および６０％がそれぞれ、黒色、灰色、薄い灰色で示された。ＣＤＲ１はアラインメント位置２６〜４２に配置されている。ＣＤＲ２はアラインメント位置５８〜６４に配置されている。ＣＤＲ３はアラインメント位置９７〜１０６に配置されている。早期終止コドンはアスタリスクで示された。アラインメントは、上列の図２３ａ〜ｄおよび下列の図２３ｅ〜ｈによる左〜右の２つの列に分布した８つの別々の図（ａ−ｈ）に分けられている。 プレートＧ０６０からの選択クローンの明らかな親和性を判定するための競合ＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。濃度１００ｎＭ〜２５ｐＭの可溶性ＴＴ希釈（４倍希釈）をＦａｂ断片に添加し、それによって、Ｆａｂ断片の結合を、固定化ＴＴに対して競合した。反応の程度は、可溶性ＴＴが反応物に添加された場合に確認された結合に対する所定の可溶性ＴＴ濃度で観察された結合の比で示されている。 抗体重鎖と軽鎖可変ドメイン配列間の遺伝子内および遺伝子間の関係を示す二重系統発生的ドットマトリクスプロットを示す図である。ＶＨおよびＶＬ配列の系統発生的な３つは、特定のＶ遺伝子の実際の対合を示すためにドットマトリクスで対合されている。Ａ）ファージディスプレイを使用するコンビナトリアルライブラリーから得られるＴＴ結合クローン。Ｂ）本発明を使用する同族対合のライブラリーから得られるＴＴ結合クローン。

Claims (58)

  1. 目的とする複数の非隣接ヌクレオチド配列を連結する方法であって、前記方法が、
    ａ）多重分子増幅手順で、単離単一細胞または同質細胞の集団由来のテンプレートを使用して目的とするヌクレオチド配列を増幅するステップと、
    ｂ）ステップａ）で増幅された目的とするヌクレオチド配列の連関を生じさせるステップと
    を含む方法。
  2. 前記目的とするヌクレオチド配列が、可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が可変領域コード配列の同族対合を生成する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記目的とするヌクレオチド配列が、免疫グロブリン可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が重鎖可変領域コード配列を伴う軽鎖可変領域コード配列の同族対合を生成する請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記目的とするヌクレオチド配列がＴ細胞受容体可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が、β鎖可変領域コード配列を伴うα鎖可変領域コード配列、またはδ鎖可変領域コード配列を伴うγ鎖可変領域コード配列で構成された同族対合を生成する、請求項１または２に記載の方法。
  5. ランダムに目的とする複数の非隣接ヌクレオチド配列を連結する方法であって、前記方法が、
    ａ）多重分子増幅手順で、遺伝学的に多様な細胞の集団由来のテンプレートを使用して目的とするヌクレオチド配列を増幅するステップと、
    ｂ）ステップａ）で増幅された目的とするヌクレオチド配列の連関を生じさせるステップと
    を含む方法。
  6. 前記細胞の集団が溶解される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記目的とするヌクレオチド配列が可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が可変領域コード配列の対合のコンビナトリアルライブラリーを生成する、請求項５または６に記載の方法。
  8. 前記目的とするヌクレオチド配列が免疫グロブリン可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が軽鎖可変領域と重鎖可変領域コード配列の対合のコンビナトリアルライブラリーを生成する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記目的とするヌクレオチド配列がＴ細胞受容体可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関がα鎖可変領域とβ鎖可変領域コード配列の対合のコンビナトリアルライブラリーを生成する、請求項７に記載の方法。
  10. 前記多重分子増幅手順が多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、多重ＰＣＲ増幅の前に別個の逆転写（ＲＴ）ステップを含んで成る２ステップ方法である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、逆転写（ＲＴ）および多重ＰＣＲ増幅を実行するのに必要な成分すべてを単一の容器へ最初に添加するステップを含んで成る単一ステップで実行される、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記目的とするヌクレオチド配列の連関が、前記多重分子増幅と同じ容器で実行される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記目的とするヌクレオチド配列の連関が、多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを利用する多重ＰＣＲ増幅に伴って達成される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記目的とするヌクレオチド配列の連関がライゲーションによって達成される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記目的とする連結核酸配列を増幅するために適合されるプライマーミックスを利用する追加の分子増幅が実行される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスがプライマーセットを含んで成り、ここで各プライマーセットの少なくとも１つのプライマーセットメンバーが、第２のプライマーセットのプライマーセットメンバーのオーバーラップ・エクステンションテールとハイブリダイズすることが可能なオーバーラップ・エクステンションテールを含んで成る、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスが、
    ａ）免疫グロブリン軽鎖領域コード配列のセンス鎖を相補する少なくとも１つのＣＬまたはＪＬプライマーと、
    ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域コード配列または軽鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖を相補し、かつステップａ）におけるプライマーでプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのＶＬ５’プライマーまたはＶＬＬプライマーと、
    ｃ）免疫グロブリン定常重鎖ドメインコード配列または重鎖接合領域コード配列のセンス鎖を相補する少なくとも１つのＣＨまたはＪＨプライマーと、
    ｄ）免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列または重鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖を相補し、かつステップｃ）におけるプライマーでプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのＶＨ５’プライマーまたはＶＨＬプライマーと
    を含んで成る、請求項１４または１７に記載の方法。
  19. ステップｂ）のプライマーが配列番号９３〜９８の遺伝子特異的領域との少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬＬプライマーであり、かつステップｄ）のプライマーが配列番号８６〜９２の遺伝子特異的領域との少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨＬプライマーである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記単一細胞、前記同質細胞の集団または前記遺伝学的に異なる細胞の集団が、細胞分画を含有するリンパ球から得られる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 連結可変領域コード配列を含んで成る同族対合のライブラリーを製造する方法であって、前記方法が、
    ａ）ドナーからのリンパ球含有細胞分画を提供するステップと、
    ｂ）場合により前記細胞分画から特定のリンパ球集団を強化するステップと、
    ｃ）細胞を前記細胞分画から個別に複数の容器へ分配するステップを含んで成る、単離単一細胞の集団を得るステップと、
    ｄ）請求項１〜４のいずれか１項に依存する限り、請求項１〜４または１０〜２０のいずれか１項に記載の方法による、単離単一細胞の前記集団に含まれる可変領域コード配列の連関を増幅し、これを生じさせるステップと
    を含んで成る方法。
  22. 単一細胞の集団における個々の単離単一細胞が、増幅および連関を実行する（ステップｄ）前に、同質細胞の集団に拡大される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記リンパ球を含有する細胞分画が、全血、骨髄、単核細胞、または白血球を構成する、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記リンパ球を含有する細胞分画がＢリンパ球系列の細胞で強化されている、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記リンパ球を含有する細胞分画またはＢリンパ球系列が形質細胞で強化されている、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記リンパ球を含有する細胞分画、Ｂリンパ球系列、または形質細胞からの細胞が抗原特異性で強化されている、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記リンパ球を含有する細胞分画が、前記Ｔリンパ球系列の細胞で強化されている、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  28. 抗原特異的Ｔ細胞がリンパ球を含有する細胞分画の刺激によって生成される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記連結ヌクレオチド配列または同族対合のライブラリーをベクターへ挿入するステップをさらに含んで成る、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記ベクターがクローン化ベクター、シャトルベクター、ディスプレイベクター、または発現ベクターの中から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記連結ヌクレオチド配列または前記同族対合のライブラリーの個々のメンバーが、軽鎖可変領域コード化配列を伴う免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記配列が、１つもしくはそれ以上の免疫グロブリン定常ドメインまたはその断片をコードする配列をすでに含有するベクターへインフレーム挿入される、請求項２９または３０に記載の方法。
  32. 前記連結ヌクレオチド配列または前記同族対合のライブラリーの個々のメンバーが、β鎖可変領域コード配列を伴うＴ細胞受容体α鎖可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記配列が、１つもしくはそれ以上のＴ細胞受容体定常ドメインまたはその断片をコードする配列をすでに含有するベクターへインフレーム挿入される、請求項２９または３０に記載の方法。
  33. 所望の標的特異性を有する結合タンパク質をコードする連結可変領域配列の同族対合の一部を選択することによってサブライブラリーを作成し、可変領域コード配列の標的特異的同族対合のライブラリーを生成するステップをさらに含んで成る、請求項２１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記同族対合または可変領域コード配列の標的特異的同族対合のライブラリーを哺乳類発現ベクターへ移動させるステップをさらに含んで成る、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記哺乳類発現ベクターが、ヒト免疫グロブリンクラスのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、κ軽鎖、またはλ軽鎖、もしくはヒトＴ細胞受容体α、β、δ、および／またはγ鎖から選択される１つもしくはそれ以上の定常領域ドメインをコードする、請求項３４に記載の方法。
  36. ａ）連結ヌクレオチド配列の部分をコードするベクターを宿主細胞へ導入するステップと、
    ｂ）発現に適合した条件下で前記宿主細胞を培養するステップと、
    ｃ）前記宿主細胞へ挿入される前記ベクターから発現されるタンパク質産物を得るステップと
    をさらに含んで成る、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記タンパク質産物が、重鎖可変領域を伴う軽鎖可変領域の同族対合を含んで成るモノクローナル抗体である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ポリペプチド産物が、β鎖可変領域を伴うα鎖可変領域の同族対合を含んで成るモノクローナルＴ細胞受容体である、請求項３６に記載の方法。
  39. 連結可変領域コード配列から成る同族対合のライブラリー。
  40. 前記可変領域コード配列の同族対合が、請求項２１またはそれに従属するいずれかの請求項に記載の方法によって得られる、請求項３９に記載のライブラリー。
  41. 前記同族対合の個々のメンバーが、重鎖可変領域コード配列を伴う免疫グロブリン軽鎖可変領域コード配列を含んで成る、請求項３９または４０に記載のライブラリー。
  42. 前記個々のメンバーが、ヒト免疫グロブリンクラスのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭから選択される完全長抗体をコードする、請求項４１に記載のライブラリー。
  43. 前記同族対合の個々のメンバーが、β鎖可変領域コード配列を伴うＴｃＲα鎖可変領域コード配列またはδ鎖可変領域コード配列を伴うγ鎖可変領域コード配列を含んで成る、請求項３９または４０に記載のライブラリー。
  44. 前記個々のメンバーが完全長ＴｃＲをコードする、請求項４０に記載のライブラリー。
  45. 特定の標的に対して所望の結合特異性を示すタンパク質をコードする可変領域コード配列の同族対合のサブライブラリー。
  46. 請求項３９〜４４の１つに記載のライブラリーから選択される特定の標的に対する所望の結合特異性を示すタンパク質をコードするサブライブラリー。
  47. 前記ライブラリーから発現可能な前記免疫グロブリンが、破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な連結免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の同族対合のサブライブラリー。
  48. 請求項３９〜４７のいずれか一項に記載のライブラリーまたはサブライブラリーを含んで成る宿主細胞の集団。
  49. 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項４８に記載の宿主細胞の集団。
  50. 請求項４８または４９に記載の宿主細胞から発現される組換えポリクローナルタンパク質。
  51. 破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル免疫グロブリンまたはその断片。
  52. 前記個々のメンバーが同族対合である、請求項５１に記載の組換えポリクローナル免疫グロブリン。
  53. 配列番号の対合２２９：２７６、２６２：３０９、２４０：２８７、２４５：２９２、２６７：３１４、２４６：２９３、２５８：３０５、２４２：２８９、２３１：２７８、２６３：３１０、２３２：２７９、２３７：２８４、２５５：３０２、２６０：３０７、２５１：２９８、２３３：２８０、２２８：２７５、２４４：２９１、２５０：２９７、２５２：２９９、２６４：３１１、２７２：３１９、２３５：２８２、または２３８：２８５より成る群から選択される個々の配列番号の対合と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域コード配列を伴う免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列を含んで成る少なくとも２つの個々の同族対合を含んで成る、請求項５１または５２に記載の組換えポリクローナル免疫グロブリン。
  54. 領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を決定する相補性が、請求項５３に記載の１つもしくはそれ以上の配列番号対合由来である、破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換え免疫グロブリンまたはその断片。
  55. 少なくとも１つの薬剤として許容される賦形剤と組合せた有効成分として請求項５０に記載の組換えポリクローナル免疫グロブリンを含んで成る医薬組成物。
  56. 場合により薬剤として許容される賦形剤と組合せた有効成分として破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル抗体を含んで成る医薬組成物。
  57. 薬剤として使用するための請求項５５または５６に記載の医薬組成物。
  58. 破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル抗体を含んで成る組成物をそれを必要とする患者に投与することによって破傷風を発症するリスクがある患者を予防または治療する方法。
JP2006526523A 2003-09-18 2004-09-17 目的とする配列を連結するための方法 Active JP4651619B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US50458903P 2003-09-18 2003-09-18
US50445503P 2003-09-18 2003-09-18
DKPA200301867 2003-12-17
DKPA200400782 2004-05-15
PCT/DK2004/000633 WO2005042774A2 (en) 2003-09-18 2004-09-17 Method for linking sequences of interest

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2007505611A true JP2007505611A (ja) 2007-03-15
JP2007505611A5 JP2007505611A5 (ja) 2007-10-25
JP4651619B2 JP4651619B2 (ja) 2011-03-16

Family

ID=44209637

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006526523A Active JP4651619B2 (ja) 2003-09-18 2004-09-17 目的とする配列を連結するための方法

Country Status (18)

Country Link
US (2) US7749697B2 (ja)
EP (3) EP1516929A3 (ja)
JP (1) JP4651619B2 (ja)
CN (2) CN102199593A (ja)
AT (2) ATE388228T1 (ja)
AU (1) AU2004286019B2 (ja)
BR (1) BRPI0414282A (ja)
CA (1) CA2539576A1 (ja)
DE (1) DE602004012299T2 (ja)
DK (2) DK1921144T3 (ja)
ES (2) ES2375529T3 (ja)
MY (1) MY148907A (ja)
NZ (1) NZ545936A (ja)
PL (2) PL1921144T3 (ja)
PT (2) PT1670912E (ja)
SI (2) SI1921144T1 (ja)
TW (1) TWI333977B (ja)
WO (1) WO2005042774A2 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012500634A (ja) * 2008-08-29 2012-01-12 シムフォゲン・アクティーゼルスカブ 鳥類から得られた抗体のクローニング方法
JP2014521316A (ja) * 2011-07-12 2014-08-28 エックスバイオテク，インコーポレイテッド 親和性成熟化ヒト抗体の同定
JP2015519911A (ja) * 2012-06-15 2015-07-16 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 複数転写産物のハイスループットシークエンシング
JP2017510292A (ja) * 2014-02-14 2017-04-13 メモ テラポイティクス アクチェンゲゼルシャフト 免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を回収する方法
JP2019531091A (ja) * 2016-09-15 2019-10-31 オーグメンタ・バイオワークス・インコーポレーテッド 免疫レパートリー配列増幅法および適用
US10513733B2 (en) 2015-03-23 2019-12-24 Board Of Regents, The University Of Texas System High throughout sequencing of paired VH and VL transcripts from B cells secreting antigen-specific antibodies
JP7251985B2 (ja) 2011-04-28 2023-04-04 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 試料に関連するポリヌクレオチドの同定
US11866785B2 (en) 2017-10-27 2024-01-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor specific antibodies and T-cell receptors and methods of identifying the same

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2512647C (en) 2003-01-07 2013-10-08 Symphogen A/S Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins
US7993919B2 (en) * 2003-11-19 2011-08-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of inducing memory B cell development and terminal differentiation
ATE548657T1 (de) 2004-07-20 2012-03-15 Symphogen As Prozedur zur strukturellen charakterisierung rekombinanter polyclonaler proteine oder einer polyclonalen zelllinie
EP1771483A1 (en) 2004-07-20 2007-04-11 Symphogen A/S Anti-rhesus d recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture
EP2322623A3 (en) 2005-03-25 2011-10-19 National Research Council of Canada Method for isolation of soluble polypeptides
EP1707628B1 (en) * 2005-03-30 2009-11-11 Sekisui Chemical Co., Ltd. Methods for producing recombinant polyclonal immunoglobulins
WO2007003041A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-11 John Schrader Methods of isolating cells and generating monoclonal antibodies
JP2009518320A (ja) * 2005-12-05 2009-05-07 シュムフォウエン アクティーゼルスカブ 抗オルトポックスウイルス組換えポリクローナル抗体
KR20080113223A (ko) * 2006-03-06 2008-12-29 심포젠 에이/에스 호흡기세포 융합 바이러스 감염 치료용 재조합 폴리클로날 항체
US7504106B2 (en) 2006-03-14 2009-03-17 Boris Skurkovich Method and composition for treatment of renal failure with antibodies and their equivalents as partial or complete replacement for dialysis
ES2369946T3 (es) 2007-03-01 2011-12-09 Symphogen A/S Procedimiento para clonación de anticuerpos análogos.
DK2132229T3 (en) * 2007-03-01 2016-06-20 Symphogen As Recombinant anti-epidermal growth factor receptor-ANTIBODY COMPOSITIONS
CA2678628A1 (en) 2007-03-06 2008-09-12 Symphogen A/S Recombinant antibodies for treatment of respiratory syncytial virus infections
JP2008289483A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Symphogen As 真核生物系において発現可能な形質転換体のスクリーニング
BRPI0812091A2 (pt) 2007-05-25 2014-10-14 Symphogen As Método para fabricar uma proteína policlonal recombinante
WO2009030237A2 (en) * 2007-09-07 2009-03-12 Symphogen A/S Methods for recombinant manufacturing of anti-rsv antibodies
US8268564B2 (en) * 2007-09-26 2012-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods and applications for stitched DNA barcodes
US7792057B2 (en) * 2007-12-21 2010-09-07 At&T Labs, Inc. Method and system for computing multicast traffic matrices
WO2010000864A1 (en) * 2008-07-04 2010-01-07 Novo Nordisk A/S Method for producing monoclonal antibodies
KR101706255B1 (ko) * 2008-08-29 2017-02-14 심포젠 에이/에스 재조합 항-표피 성장 인자 수용체 항체 조성물
US20110224094A1 (en) * 2008-10-06 2011-09-15 Symphogen A/S Method for identifying and selecting drug candidates for combinatorial drug products
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
US8691510B2 (en) 2008-11-07 2014-04-08 Sequenta, Inc. Sequence analysis of complex amplicons
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
GB2477439B (en) 2008-11-07 2012-02-15 Sequenta Inc Methods for correlating clonotypes with a disease in a patient
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
ES2568509T3 (es) 2009-01-15 2016-04-29 Adaptive Biotechnologies Corporation Perfilado de la inmunidad adaptativa y métodos para la generación de anticuerpos monoclonales
GB0903207D0 (en) 2009-02-25 2009-04-08 Ucb Pharma Sa Method for expressing multimeric proteins
WO2010097435A1 (en) * 2009-02-25 2010-09-02 Ucb Pharma, S.A. Method for producing antibodies
US8563305B2 (en) 2009-04-30 2013-10-22 Oklahoma Medical Research Foundation Rapid generation of antibodies
JP5804521B2 (ja) 2009-05-29 2015-11-04 モルフォシス・アー・ゲー コレクション及びその使用方法
RU2014144463A (ru) 2009-06-25 2015-06-20 Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер Способ измерения адаптивного иммунитета
US9043160B1 (en) 2009-11-09 2015-05-26 Sequenta, Inc. Method of determining clonotypes and clonotype profiles
CA2790289A1 (en) * 2010-02-18 2011-08-25 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Antibody against serotype b lipopolysaccharide of pseudomonas aeruginosa
ES2730951T3 (es) 2010-10-08 2019-11-13 Harvard College Secuenciación inmune de alto rendimiento
CN105399831A (zh) 2010-10-29 2016-03-16 伊缪诺金公司 非拮抗性egfr结合分子及其免疫偶联物
MX2013004761A (es) 2010-10-29 2013-08-27 Immunogen Inc Nuevas moleculas de union al receptor del factor de crecimiento epidermico (egfr) e inmunoconjugados de estas.
EP2635604B1 (en) 2010-11-01 2016-11-30 Symphogen A/S Pan-her antibody composition
US9155802B2 (en) 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition
WO2012068317A2 (en) 2010-11-16 2012-05-24 Excelimmune, Inc. Methods for producing recombinant proteins
CA2816558C (en) 2010-11-19 2020-12-29 Morphosys Ag A collection and methods for its use
KR20140027915A (ko) * 2010-12-01 2014-03-07 모르포시스 아게 단일 세포 내 생체 분자의 동시 검출
WO2012083225A2 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Gigagen, Inc. System and methods for massively parallel analysis of nycleic acids in single cells
WO2012092376A2 (en) * 2010-12-31 2012-07-05 Short Jay M Comprehensive monoclonal antibody generation
WO2012104851A1 (en) * 2011-01-31 2012-08-09 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of diagnosing disease using overlap extension pcr
US20230287392A1 (en) * 2011-04-28 2023-09-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identification of Polynucleotides Associated with a Sample
WO2012174214A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 The Regents Of The University Of California High resolution analysis of mammalian transcriptome using gene pool specific primers
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
US9279159B2 (en) 2011-10-21 2016-03-08 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
EP2794010A4 (en) 2011-11-21 2015-10-21 Immunogen Inc METHOD OF TREATING TUMORS RESISTANT TO EGFR THERAPIES BY A CYTOTOXIC EGFR-AGENT ANTIBODY CONJUGATE
ES2683037T3 (es) 2011-12-09 2018-09-24 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnóstico de tumores malignos linfoides y detección de enfermedad residual mínima
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
EP2626433B1 (en) 2012-02-09 2017-04-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for linking nucleic acids in a microsome from endoplasmatic reticuli
DK2823060T3 (en) 2012-03-05 2018-05-28 Adaptive Biotechnologies Corp Determination of associated immune receptor chains from frequency-matched subunits
AU2013255537B2 (en) 2012-05-02 2018-02-15 Symphogen A/S Humanized pan-her antibody compositions
US9150905B2 (en) 2012-05-08 2015-10-06 Adaptive Biotechnologies Corporation Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed PCR reactions
WO2013188772A1 (en) * 2012-06-14 2013-12-19 Gigagen, Inc. Methods for antibody and cell therapeutic discovery
CN105189779B (zh) 2012-10-01 2018-05-11 适应生物技术公司 通过适应性免疫受体多样性和克隆性表征进行的免疫能力评估
WO2015160439A2 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
JP6368322B2 (ja) * 2013-01-24 2018-08-01 アブトラス カンパニー リミテッドＡｂＴＬＡＳ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． タンパク質組合せ基盤のｆｖライブラリー及びこれの製造方法
JP2016514091A (ja) 2013-02-08 2016-05-19 ミスフォールディング ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド トランスサイレチン抗体およびその使用
BR112015023398A8 (pt) 2013-03-15 2022-08-23 Theranos Inc Métodos para amplificar ácidos nucléicos
GB2525568B (en) 2013-03-15 2020-10-14 Abvitro Llc Single cell barcoding for antibody discovery
US10450595B2 (en) 2013-03-15 2019-10-22 Theranos Ip Company, Llc Nucleic acid amplification
WO2014145291A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Theranos, Inc. Nucleic acid amplification
EP2970960B1 (en) 2013-03-15 2019-03-13 Theranos IP Company, LLC Nucleic acid amplification
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
MX2018005873A (es) 2013-09-06 2022-11-17 Labrador Diagnostics Llc Sistemas y metodos para detectar enfermedades infecciosas.
GB201316644D0 (en) 2013-09-19 2013-11-06 Kymab Ltd Expression vector production & High-Throughput cell screening
CN103820430A (zh) * 2013-12-19 2014-05-28 河南科技大学 高gc含量或以复杂结构dna为模板的dna片段的重叠延伸pcr法
CA2935122C (en) 2013-12-30 2023-09-19 Atreca, Inc. Analysis of nucleic acids associated with single cells using nucleic acid barcodes
WO2015120403A1 (en) * 2014-02-08 2015-08-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Multiplexed linking pcr
AU2015227054A1 (en) 2014-03-05 2016-09-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
EP3165605B1 (en) * 2014-05-30 2019-11-06 National University Corporation University Of Toyama TCR cDNA AMPLIFICATION METHOD
MX2017003382A (es) 2014-09-15 2017-11-20 Abvitro Llc Secuenciacion de bibliotecas de nucleotidos de alto rendimiento.
CA2961323C (en) 2014-09-16 2021-11-30 Symphogen A/S Anti-met antibodies and compositions
AU2015339191A1 (en) * 2014-10-29 2017-05-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
WO2016086029A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Adaptive Biotechnologies Corporation Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing
CN104560980B (zh) * 2015-01-20 2017-04-05 中国人民解放军第三军医大学 基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物和方法
AU2016222788B2 (en) 2015-02-24 2022-03-31 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing
EP3277294B1 (en) 2015-04-01 2024-05-15 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target
US9422547B1 (en) 2015-06-09 2016-08-23 Gigagen, Inc. Recombinant fusion proteins and libraries from immune cell repertoires
DK3307905T3 (da) 2015-06-09 2022-02-14 Gigagen Inc Rekombinante fusionsproteiner og biblioteker fra immuncellerepertoirer
US10793851B2 (en) 2015-08-04 2020-10-06 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Multiplexed binary assembly and quantitative tracking of bacterial populations
CN105087560B (zh) * 2015-08-07 2016-06-01 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 一种基于高通量测序构建猪bcr重链文库的多重pcr引物和方法
KR20180053752A (ko) 2015-10-02 2018-05-23 심포젠 에이/에스 항-pd-1 항체 및 조성물
WO2017096239A1 (en) * 2015-12-04 2017-06-08 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Cloning and expression system for t-cell receptors
US20190256840A1 (en) * 2016-01-08 2019-08-22 Iontas Ltd Binding members with altered diversity scaffold domains
WO2017180738A1 (en) * 2016-04-12 2017-10-19 Medimmune, Llc Immune repertoire mining
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
EA201991214A1 (ru) 2016-11-18 2019-10-31 Антитела против pd-1 и их композиции
WO2018102473A2 (en) 2016-11-29 2018-06-07 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods and materials for cloning functional t cell receptors from single t cells
CN110366557B (zh) * 2016-12-23 2024-04-09 威特拉公司 结合多肽及其制备方法
WO2018170013A1 (en) 2017-03-13 2018-09-20 Gigagen, Inc. Systems and methods for massively parallel combinatorial analysis of single cells
CN111164210A (zh) * 2017-09-28 2020-05-15 深圳华大生命科学研究院 一种扩增tcr全长序列的pcr引物及其应用
CN111344418A (zh) * 2017-09-28 2020-06-26 深圳华大生命科学研究院 一种扩增tcr全长序列的试剂盒及其应用
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
CN116144706A (zh) 2018-08-13 2023-05-23 根路径基因组学公司 成对的二分免疫受体多核苷酸的高通量克隆及其应用
US11662341B2 (en) 2018-10-10 2023-05-30 Augmenta Bioworks, Inc. Methods for isolating immune binding proteins
CN109972209B (zh) * 2019-01-18 2022-05-03 南开大学 基于乳液pcr的一步法将单链抗体库重排为全长抗体库的方法
WO2020191365A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Gigamune, Inc. Engineered cells expressing anti-viral t cell receptors and methods of use thereof
SG11202110956RA (en) 2019-04-05 2021-10-28 Rootpath Genomics Inc Compositions and methods for t-cell receptor gene assembly
JP2022531113A (ja) * 2019-04-30 2022-07-06 ギガジェン，インコーポレイティッド 組換えポリクローナルタンパク質およびその使用方法
CN111139286B (zh) * 2019-11-07 2023-11-21 南方医科大学南方医院 一种bcr高通量测序文库的构建方法
WO2021253002A1 (en) 2020-06-12 2021-12-16 Gigagen, Inc. Recombinant polyclonal proteins targeting covid-19 and methods of use thereof
WO2022031834A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Gigagen, Inc. Recombinant polyclonal proteins targeting zika and methods of use thereof
CN114774405A (zh) * 2022-04-19 2022-07-22 上海赛唐生物技术有限公司 一种单链抗体扩展库的制备方法及其应用
WO2023213787A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Aarhus Universitet Antibodies for prophylaxis or treatment of sars- cov-2 infections
WO2024050450A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Gigamune, Inc. Engineered enveloped vectors and methods of use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06509473A (ja) * 1991-08-10 1994-10-27 メディカル・リサーチ・カウンシル 細胞個体群の処理
WO2001089563A1 (en) * 2000-05-26 2001-11-29 Symphogen A/S Recombinant or purified polyclonal antibodies for treating allergy

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5906936A (en) 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
DE4010839A1 (de) * 1990-04-04 1991-10-10 Bosch Gmbh Robert Vorrichtung zur erzeugung eines triggersignals aus zuendimpulsen einer zuendanlage
AU1457992A (en) * 1991-03-01 1992-10-06 Stratagene Pcr generated dicistronic dna molecules for producing antibodies
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
WO1993020227A1 (en) 1992-03-31 1993-10-14 Abbott Laboratories Method of multiplex ligase chain reaction
GB9220808D0 (en) * 1992-10-02 1992-11-18 Medical Res Council Antibody genes
US6096878A (en) 1993-05-10 2000-08-01 Japan Tobacco Inc. Human immunoglobulin VH gene segments and DNA fragments containing the same
WO1995020401A1 (en) 1994-01-31 1995-08-03 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
FR2724393A1 (fr) 1994-09-12 1996-03-15 Inst Nat Sante Rech Med Obtention d'un anticorps monoclonal recombinant humanise a partir d'un anticorps monoclonal murin, sa production en cellules d'insecte, et ses utilisations
US6111166A (en) 1994-09-19 2000-08-29 Medarex, Incorporated Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors
US6258529B1 (en) 1994-12-01 2001-07-10 Oravax, Inc. PCR amplification of rearranged genomic variable regions of immunoglobulin genes
US5882856A (en) 1995-06-07 1999-03-16 Genzyme Corporation Universal primer sequence for multiplex DNA amplification
WO1997010505A1 (en) * 1995-09-14 1997-03-20 The Regents Of The University Of California ANTIBODIES SPECIFIC FOR NATIVE PrP?Sc¿
JP2002514919A (ja) * 1997-04-04 2002-05-21 バイオサイト ダイアグノスティックス，インコーポレイテッド 多価ライブラリーおよびポリクローナルライブラリー
US6610293B1 (en) 1997-06-16 2003-08-26 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Opsonic and protective monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of gram positive bacteria
JP2001518310A (ja) * 1997-09-29 2001-10-16 シティ・オブ・ホープ 核酸断片の効率的連結
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP2003516150A (ja) 1999-12-08 2003-05-13 ジェンセット 潜在性分泌タンパク質をコードする全長ヒトｃＤＮＡ
IL136459A0 (en) 2000-05-30 2001-06-14 Galim Galil Immunology Ltd Antibody library
US6849259B2 (en) 2000-06-16 2005-02-01 Symphogen A/S Polyclonal antibody composition for treating allergy
US6994963B1 (en) 2000-07-10 2006-02-07 Ambion, Inc. Methods for recombinatorial nucleic acid synthesis
US6867021B2 (en) 2001-02-20 2005-03-15 Board Of Trustees Of Michigan State University Multiplex RT-PCR/PCR for simultaneous detection of bovine coronavirus, bovine rotavirus, Cryptosporidium parvum, and Escherichia coli
US20040067532A1 (en) 2002-08-12 2004-04-08 Genetastix Corporation High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody
CA2512647C (en) 2003-01-07 2013-10-08 Symphogen A/S Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins
US20060275766A1 (en) 2003-01-07 2006-12-07 Haurum John S Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins
US20060228350A1 (en) * 2003-08-18 2006-10-12 Medimmune, Inc. Framework-shuffling of antibodies
US7993919B2 (en) 2003-11-19 2011-08-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of inducing memory B cell development and terminal differentiation
EP1771483A1 (en) 2004-07-20 2007-04-11 Symphogen A/S Anti-rhesus d recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture
ATE548657T1 (de) 2004-07-20 2012-03-15 Symphogen As Prozedur zur strukturellen charakterisierung rekombinanter polyclonaler proteine oder einer polyclonalen zelllinie
JP2008289483A (ja) * 2007-05-25 2008-12-04 Symphogen As 真核生物系において発現可能な形質転換体のスクリーニング

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06509473A (ja) * 1991-08-10 1994-10-27 メディカル・リサーチ・カウンシル 細胞個体群の処理
WO2001089563A1 (en) * 2000-05-26 2001-11-29 Symphogen A/S Recombinant or purified polyclonal antibodies for treating allergy

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012500634A (ja) * 2008-08-29 2012-01-12 シムフォゲン・アクティーゼルスカブ 鳥類から得られた抗体のクローニング方法
JP7251985B2 (ja) 2011-04-28 2023-04-04 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 試料に関連するポリヌクレオチドの同定
US9670483B2 (en) 2011-07-12 2017-06-06 Xbiotech, Inc. Immunoglobulin variable region libraries
JP2014521316A (ja) * 2011-07-12 2014-08-28 エックスバイオテク，インコーポレイテッド 親和性成熟化ヒト抗体の同定
JP2015519911A (ja) * 2012-06-15 2015-07-16 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 複数転写産物のハイスループットシークエンシング
US9708654B2 (en) 2012-06-15 2017-07-18 Board Of Regents, The University Of Texas System High throughput sequencing of multiple transcripts
JP7048562B2 (ja) 2014-02-14 2022-04-05 メモ テラポイティクス アクチェンゲゼルシャフト 免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を回収する方法
JP2020054355A (ja) * 2014-02-14 2020-04-09 メモ テラポイティクス アクチェンゲゼルシャフト 免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を回収する方法
JP2017510292A (ja) * 2014-02-14 2017-04-13 メモ テラポイティクス アクチェンゲゼルシャフト 免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を回収する方法
JP2022084830A (ja) * 2014-02-14 2022-06-07 メモ テラポイティクス アクチェンゲゼルシャフト 免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を回収する方法
JP7342181B2 (ja) 2014-02-14 2023-09-11 メモ テラポイティクス アクチェンゲゼルシャフト 免疫受容体をコードする２以上の遺伝子又は遺伝子産物を回収する方法
US10513733B2 (en) 2015-03-23 2019-12-24 Board Of Regents, The University Of Texas System High throughout sequencing of paired VH and VL transcripts from B cells secreting antigen-specific antibodies
JP2022105176A (ja) * 2016-09-15 2022-07-12 オーグメンタ・バイオワークス・インコーポレーテッド 免疫レパートリー配列増幅法および適用
JP2019531091A (ja) * 2016-09-15 2019-10-31 オーグメンタ・バイオワークス・インコーポレーテッド 免疫レパートリー配列増幅法および適用
JP7372387B2 (ja) 2016-09-15 2023-10-31 オーグメンタ・バイオワークス・インコーポレーテッド 免疫レパートリー配列増幅法および適用
US11866785B2 (en) 2017-10-27 2024-01-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor specific antibodies and T-cell receptors and methods of identifying the same

Also Published As

Publication number Publication date
TW200519201A (en) 2005-06-16
ES2375529T3 (es) 2012-03-01
ATE388228T1 (de) 2008-03-15
MY148907A (en) 2013-06-14
US7749697B2 (en) 2010-07-06
EP1921144A2 (en) 2008-05-14
CA2539576A1 (en) 2005-05-12
EP1921144B1 (en) 2011-12-14
AU2004286019A1 (en) 2005-05-12
PT1670912E (pt) 2008-04-30
EP1516929A3 (en) 2006-06-07
PL1921144T3 (pl) 2012-05-31
WO2005042774A2 (en) 2005-05-12
SI1670912T1 (sl) 2008-08-31
PL1670912T3 (pl) 2008-08-29
EP1921144A3 (en) 2009-12-30
EP1516929A2 (en) 2005-03-23
CN102199593A (zh) 2011-09-28
CN1856571B (zh) 2011-05-11
JP4651619B2 (ja) 2011-03-16
US20070141048A1 (en) 2007-06-21
DE602004012299T2 (de) 2009-08-13
DK1670912T3 (da) 2008-06-23
TWI333977B (en) 2010-12-01
WO2005042774A3 (en) 2005-06-09
CN1856571A (zh) 2006-11-01
US20100310558A1 (en) 2010-12-09
SI1921144T1 (sl) 2012-03-30
AU2004286019B2 (en) 2011-04-14
ATE537256T1 (de) 2011-12-15
EP1670912A2 (en) 2006-06-21
PT1921144E (pt) 2012-01-11
DE602004012299D1 (de) 2008-04-17
ES2302542T3 (es) 2008-07-16
NZ545936A (en) 2009-04-30
AU2004286019A2 (en) 2005-05-12
DK1921144T3 (da) 2012-03-19
BRPI0414282A (pt) 2006-11-21
EP1670912B1 (en) 2008-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4651619B2 (ja) 目的とする配列を連結するための方法
JP5669397B2 (ja) 同族抗体をクローニングするための方法
JP2012527881A (ja) コレクション及びその使用方法
US20100069262A1 (en) Method for Cloning Avian-Derived Antibodies
RU2392324C2 (ru) Способ связывания интересующих последовательностей
KR101135134B1 (ko) 관심있는 서열을 결합시키는 방법
MXPA06002894A (en) Method for linking sequences of interest

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070904

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070904

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100622

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100922

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101019

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101102

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20101130

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20101214

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 4651619

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131224

Year of fee payment: 3

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250