TWI333977B - Method for linking sequences of interest - Google Patents

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TWI333977B
TWI333977B TW093126165A TW93126165A TWI333977B TW I333977 B TWI333977 B TW I333977B TW 093126165 A TW093126165 A TW 093126165A TW 93126165 A TW93126165 A TW 93126165A TW I333977 B TWI333977 B TW I333977B
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Description

「1333977 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發，關於-種與増幅侧有關，特別係與 有關之可連結有興趣之核細序列之多重分子增幅重pc 【先前技術】 涉及免疫反應之抗原結合蛋白質係以具有廣泛多樣性之結合專一性之大量* ^株^原結合蛋白質存在於哺乳動物體内。此多樣性係由重組可編碼此等結合 蛋^質之可變區之基因序列而產生。此可變區結合蛋白f包含⑽胞受體（亦已_ 知為免疫球蛋白或抗體）之可溶與膜_結合形式以及膜_結合之τ細胞受體 (TcR)。_免疫球蛋白’魏和力麵由Β細胞抗較體對抗原進行識別作用， 經由稱為親和力突變之程序後而增強’該親和力突變涉及此等可變基因之體細 胞過度突變之循環。 尤其’已對免疫球蛋白或其片段，例如Fab片段、Fv片段以及單鏈Fv(scFv) 分子進行選殖及重組表現。然而’原則上亦可利用如抗體之相同觀念對所有其 他可變區結合蛋白質進行選殖及表現。 —已知之單離出具有所欲結合專一性之抗體之方法大多經常涉及自經免疫之 倍主產生融合瘤接著篩選出特定選殖株或者涉及於由免疫球蛋白可變域組成之· 大腸桿菌中產生組合表現基因庫，其接著大量使用例如，噬菌體呈現(phage display)等技術。 在利用融合瘤技術製造治療性抗體上之主要限制係缺少適合作為人類B淋《 巴細胞之融合搭檔之人類淋巴瘤。雜融合瘤（亦即，人類B細胞與小鼠淋巴瘤之 融合物）非常不穩定因此鮮少產生以生產為目的之穩定的細胞株。人類B細胞經 艾普斯坦-巴亞（Epstein-Barr)病毒感染而永生化後會展現類似之不穩定的問 題。在製造治療用之人類抗體上所缺乏之健全的細胞方法可以近來分子生物上 之優點予以彌補。 利用組合基因庫以及噬菌體呈現可產生具有超過之潛在多樣性之大量. 抗體選殖株。由此大量之抗體選殖株中選出可結合特定標的者因而產生次-基因』 6048*6508-PF;Chiumeow 5 1333977 f (SUb-library)。此次-基因庫可用於產生多株抗體或單株抗體。構成該基因 庫之可變區編碼序列(例如免疫球蛋白重鏈可變區及輕鍵可變區編碼序列）可自 淋^細胞、漿細胞、融合瘤或任何其他可表現細胞族群之免疫球蛋白予以增幅。 目刚用於產生組合基因庫之技術包含自細胞族群個別單離該可變區編碼序列。， 因此’原本作為示範之免疫球蛋白重鍵可變區及輕鏈可變區編碼序列對將會遺、 ^。而於組合基因庫中該序列係隨機配對且此等可變序列之原本的組合僅偶然 is此m離出具有所欲之結合專—性之可變區編碼序列需進行· 大量篩選。典型地係與用於擴增可展現所欲專—性之選殖株之方法組合使用， 例如核醣體呈現或錢體呈現。儘管如此，所達到之多樣性可能不足以大到單· 離出可引起具有與原本細麟發現者她之高親和力之結合蛋白質之可變區編 =序列對。再者’ -般用於篩選組合基因庫之擴增程序會導入強烈的偏差例如鲁 大腸桿菌中相當低毒性之多肽、有效摺疊、慢離率(sl〇w 〇ff_rate)、或其他系 統依賴性參數，其甚至進-步會降低該基因庫之多樣性。此外，衍生自此等組 合基因庫之選殖株將更易於產生對自體抗原具有交互反應性之結合蛋白質，因 為才目較於縣之序列對(後文稱為同源對），其為未經過體内自體抗原反向筛選 之序列對，例如其係B及T淋巴細胞受體於其發展之特定階段之例。因此，可 變=碼序狀縣序列狀選殖係所欲之目^再者，所麵可展現出所欲 ^結合專-性之·株的鮮，師對之基因庫較f知之組合基因庫高，尤其 右起始材料細祕衍生自具有高鮮之細胞編碼專—結合對之捐贈者，例如免 疫或經免疫化之捐贈者。接著同源對基因庫之大小不需像組合基因庫—樣大： 同源對基因庫之大小為⑽至1〇5選殖株或甚至小至1〇2至1〇3選殖株，為了得到參 具有廣泛多樣性之所欲結合專一性之結合蛋白質，該衍生自具有有意義進行免 疫反應之捐贈者之同源對基因庫已非常足夠。 為了產生同源對基因庫需要連接衍生自相同細胞之可變區編碼序列。目 前，已有兩種方法可達成可變區編碼序列之同源對。 * ★細胞内PCR(in-cell P〇〇係-種方法，其，將細胞族群@定以及通透化， 接著在細射自免絲蛋自連接线可籠及輕鏈可變區闕序列。此連接可 藉由重疊-延伸RT-PC_ 93/03151)或重組作用（Chapal，N.等人膽生物技 術23, 518-524)進行。此等公開文獻中所述之增幅過程係—種三或四步驟之方 法包括0逆轉錄作用’利用固定部位之引子產生免疫球蛋自cDNA，⑴重鍵及 6048-6508-PF;Chiumeow 6 輕鏈可變區編碼序列之PCR增幅作用，利用含有重叠_延伸設計或重組位置之引 =對，111)藉由重組進行連接，若選擇此方法，iv)產物之巢式pcR(此skd 幻， 生供選殖用之限制位置。由於細胞係經通透化的，故具有增幅產物可能會有 田胞為漏之風險’由此而導入雜亂之重鏈可變區及輕鏈可變區編碼序列更’ =成同源對之損失。因此，該程序需包含於各反應後進行之洗滌步驟但使過考 程變得麻煩且使反應效率降低。 一般而S ’此等細胞内PCR之效能極差，造成低敏感度。因此，此等細胞， 内PCR連接技術從未廣泛制，且實際上從未4實地重複該原本之研究以證實 ^胞中的確發生連接。然而，應極力避免雜亂之重鏈可變區及輕鏈可變區編碼 序列以及由此而來之同源對之混亂。 W0 01/92291揭不另一種細胞内方法。此方法係根據騰反式剪接 ans splicing) ’而於細胞中完成yH及巩編碼之接合。此方法需要於細 胞中具有可驅動反式剪接之DNA構築體。 單、《«胞PCR(single-cell PCR)係達成重鏈可變區及輕鏈可變區編碼序列 =源，的另-種方法(參見’例如，c⑽neUa，； A.等人麵⑹ ，85，Wang’ Χ·等人 2000 J. Immunol. Methods 20，217-225)。於這些公 開^帽由轉仙將免疫球蛋自表餘胞之鱗分配成每似應—個細胞 2又因此可排除於選殖過程中雜亂之重鍵可變區及輕鍵可變區編碼序列。 《s斤述之過程係一種=或四步驟之程序包括1)逆轉錄作用，利用寡_dT_、 二土I5機引子序列_、或固定區引子產生cDNA，⑴將c腿產物分裝至數個試 二广，，用包含用於選殖之限制位置之引子對於個別之可變鏈編碼序列(於 夕中）進订PCR增幅作用，1⑴產物之巢式PCR，產生供選殖用（視需要） 故^位置以及1V)連結該重鏈可變區及輕鏈可變區編碼序列，自侧的試管中 將，、選殖至適當的載體以進行連結，其本身係__種多步驟之過程。 ^'、有„型之輕鏈：入及斤。此表示當自每個單-細胞中產生cDNA 一 而要進彳了二種侧的PGR反應’接著進行分析以及將適當片段選殖至單 ㈣其^成同源對。因此，上述之單一細胞PCR方法需要許多操作以產生同 基，庫。軸，同輯基因料f要像組合基因庫-樣大，但射得到具 一目^夕樣吐^。。專一性之結合蛋白質，藉由所述之單—細胞PCR方法產生 八例如10至105選殖株之基因庫仍為一項費力之任務。再者，操作越多就 7 6048-6508-PF；Chiumeow 增加污染及人為失誤之風險。 為了得到高親和性結合蛋白質，其親和力相當於正常免疫反應所得者，與 1區序列之增幅作用有關之同源對係非常有用的。為了產生具有大量多樣性 ，土因庫ϋ具有可適合1產形式之選殖技術且將污染及祕之風險減至* 低0 同樣亦希望減少選殖之步驟使組合基因庫之產生可適合量產形式。 ’ * 【發明内容】 本發明提供_種連結二衫個有興趣之膽酸序列（例如可麵編碼序列）· 之有效方法’其係利用多重分子增幅作用程序，例如多重重疊延伸rt pcr或 多重RT-PCR接著藉由接合作用或重組作用進行連接。該方法可應用於單一細_ 胞’因此可以量產形式選殖同源對。 【實施方式】 本發明係提供-種將二或多個有興趣之非—連續性核普酸序列增幅及連接 之程序其可使此等序列之選殖符合高—量形式。基本上係經由減少欲進行選殖之 序列所需之增幅及連結之步驟數而予以達成。 本發明之-觀點侧於連結數個非-連續性核：g：酸糊之^法，包括增幅， 利用何生自經單離之單-細胞、同基因型細胞群(i琴也卿也恤㈣⑺⑴） 或基因多樣性細胞(genetically diverse cell)群之模板進行多重分子增幅程 序，以及接著將經增幅之序列連接。若該模板係單離之單一細胞或同基因型細鲁 胞群’該連接會產生-種具有有興趣之核替酸序列之核酸斷片，該序列彼此係 以同源方式連接。若該模板係基因多樣性細胞群，該連接會產生一種斷片基因* 庫’其中各斷片包括有興趣之核酸序列，該序列彼此係以隨機方式連接，亦稱 為级合基因庫β * 本發明之具體實施例中，此多重分子增幅作用程序係一種多重pcR增幅作 用，較佳係由逆轉錄步驟開始進行。較佳之具體實施例中，利用多重重疊-延伸 RT-^CR使逆轉錄、增幅作用以及連接係於單一步驟中進行，或者利用多重RT_pcR 接著由接合作用或重組作用使逆轉錄、增幅作用以及連接係於二步驟中進行。 本發明之另一具體實施例係關於同源對基因庫之產生，包括經連結之可變
Q 6048-6508-PF；Chiumeow 區編碼序列，尤其健鏈可魏以及輕鍵編碼序列或τ_ m眞巧祕涉及自至少-觸#_财獲得含淋^ 之細胞刀液toll fractlQn)以及視需要自此分液中擴增特定淋巴細鱗，例如 B淋巴細胞或T淋巴細胞，端視得自免疫球蛋白或Μ中所欲之可變區編碼序 列。將含淋巴細胞之細胞分液或經擴增之細胞分液分配至容轉财，得到各 容器中含有-個細胞。·魅自單_細胞群之核酸作為難，使單一細胞陣 列進灯逆轉錄(RT)步驟或者c脆生產程序。RT步驟後接$進行彡重分子辦幅程 序以及連接由各_娜本發明之—财法所產生之可_編碼序列對。 本發明所揭7TT之選殖技射將費力及無效能之選殖方酬除且同時降低污 染之風險以及於多重選殖步驟中多樣性之損失。 本發明之另-齡侧於㈣乡重分？職制及連接過賴產生之同源 對之基因庫。可射本發明之方法所產生之同麟初始基因庫（母基因庫）進行 篩選’而產生可編碼標的-專—性結合蛋㈣之可變域或全長之結合蛋白質之同 源對子-基因庫。 抑本發明之另-频實細中，本發明之基因庫及子基因庫可驗表現重組 单株或^株蛋白質’其中保留了該蛋白質於捐贈者體内原本具有之結合親和力 以及專'性。 定義 ，源對」係指有興趣之非-連續性核酸之原本的配對其包含於單一細胞 中。於較佳之具體實施财，同源對包細條可變區編碼序列其—起編碼結合 蛋白質可變域且其基因序列係衍生自相同之細胞H當表現完整的結合蛋 白質或其穩&之#段時，其儲該結合蛋自質原本於此細胞巾所表現出之結合 親和力以及專一性。同源對可包括例如來自相同細胞之抗體可變重鏈編碼序列 與可變輕鏈編碼序列，或來自相同細胞之了細胞受體α鏈編碼序列以及0鏈編 碼序列。同源對基因庫係此等同源對之收集。 熱啟動聚合酶(hot-start polymerase)」係指一種於逆轉錄之溫度下不 具活，或具有非常低潍之聚合酶。此等聚合酶需由高溫(90 至95°C)予以活化 而變得具有作用。由於此特性阻斷聚合酶與逆轉錄酶反應間之干擾，故為單一 RT-PCR程序中之優點的實例。 同基因型細胞群」係指基因方面相同之細胞群。尤其，本發明有興趣的 6048-6508-PF；Chiumeow 9 ^得自左單離之單—細胞之細胞擴統lQnal ex卿而來的同基因型細胞 Φ入「ί單離之單一細胞」係指自細胞群經物理分離之細胞相當於「單一容器 含有單—細胞」。當逐個地於數個容器間分配細胞群時，可得經單離之二 ^胞。如標題為「模板來源」__節巾所指明，為了稱其為單—細胞 早一細胞之容器並非100%具有單一細胞。 、
、：增te作用相關之「連結」或「連接」係指將可編碼有興趣之核酸序列之 經增幅的核酸序列連接成[斷片。與同源對有關之斷片包括可編碼可變域(例 如抗體重鏈可變區以及衍生自相同細胞之抗體輕鏈可親編碼序列）之核酸序 列。該連接可與增幅個晴完錢為緊接著侧後之步驟。對該^片之 形式，功縫無要求，其可為線形、獅、單股或雙股。該連接不需為永久性 =，若需要，可自該斷片中單離出有興趣之核酸序列，例如自該同源對斷片中 單離出可變區編碼序列之一者，而，只要構成期麟之原本的可變區並未 ^其他可變區混雜，仍視為同源對，雖然未連結成單一斷片。該連接較佳為核 ;酸磷二酯連接。然而，亦可藉由不同之化學交聯程序產生連接。 ， 多重分子增幅作用」係指於相同反應中同時增幅二或多個標的序列。適 當的增幅方法包含聚合酶連鎖反應（PCR)(u.s. 4, 683, 202)、接合酶連鎖反應 (LCR)(Wu 及 Wallace，1989, Genomics 4, 560-9)、核酸股置換取代增幅（strand displacement amplification)(SDA)技術(Walker 等人 ’ 1992，Nucl. Acids Res. 20’ 1691-6)、自主序列複製系統（self-sustained sequence replication)(Guatelli 等人，1990,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S· A.，87, 1874-8) 以及依賴核酸序列之增幅作用（nucleic acid based sequence amplification)(NASBA)(Compton J·，1991，Nature 350，91-2)。最後兩種增 * 幅方法涉及根據等溫轉錄作用之等溫反應（isothermal reaction)，其可產生單 股RNA(ssRNA)以及雙股DNA(dsDNA)兩者。 「多重PCR」係指一種經變化之PCR，藉由於相同反應中含有一組以上之引 子（例如於相同之PCR反應中含有一組適用於增幅該重鏈可變區之引子以及一組 適用於增幅該/c鏈可變區之引子)使其可同時增幅二或多個標的序列。此外適用 於增幅該λ鏈可變區之引子對亦可與這些引子對組合。 「多重RT-PCR」係指一種多重PCR反應，其先進行逆轉錄(RT)步驟。該多 6048-6508-PF;Chiumeow 10 [1333977 重rt-pcr可以二步驟過程進行(於進行多重PCR前先進行RT)，或以單—步驟母 程進行，其中RT及多重pcr所需之所有成分係組合於單一試管中。 ° 「多重重疊-延伸PCR」以及「多重重疊-延伸RT_PCR」係指利用多重 延伸引子混合物進行該多i PCR或多重RT_PCR以增幅該標的序列，因 = 進行增幅以及連接該標的序列。 〜吟 本文所使用之「多株蛋白質」或「多株性」一詞係指包括不同、但為 (homologous)蛋白質分子之蛋白質組成物，較佳係選自免疫球蛋白家族者。因、 此，各蛋白質分子與該組成物巾之其他分子係同源的，但亦包含—或多種可 多肽序列之延展物(stretch)，其特徵為多株蛋白質之各成員間具有胺基 之差異。此等多株蛋白質之已知之實例包含抗體或免疫球蛋白分子、τ細 以及B細胞受體。多株蛋白質可由經定義之蛋白質分子之子集組成其已= -般之特徵抑界定’例如騎欲之獅享有結合活性，例如多株抗斜 欲之標的抗原展現結合專一性。 7 n 本文使用之「基因多樣性細胞群」—詞係指—群細胞其中各細胞之基因體 層次彼此不同。此基因多樣性細胞群係來自例如捐贈者、或此等細胞之^液 如含有B淋巴細胞或τ淋巴細胞之細胞分液）之細胞群。 「引子組」係與「引子對」一詞交互使用，係指二或多個引子其可一起引 導有興趣之核序列（亦即同源對中之—者）的增幅作[本發^引子 經過設計以將含有可變區編碼序列之贿酸序列家族。不同家族 為 體/c輕鍵、；I輕鏈、重鏈可變區、以及α、万、r、或川田胞可變區。用ς增 幅含有可《編碼序狀贿酸相家叙5丨子_常係由數则 ^ 中數個引子可為退化性引子(degenerate prjmer)。 i令最“者長度其十异為()X 1〇〇/Nref，其中Nref係較短序列之驗基 數’以及Ndif係兩序列間於Nref長度中理想配對下之非一相同之驗基的總數。因此， 腿=AGTCAGTC與序列TMEMI£GG間具有75%之相似性(^2以及 Nref=8)(標底線者為最佳比對，以及粗體者為8個驗基中兩個非相同之驗基）。 與連接有關之「隨機地」或「隨機」一詞係指核苔酸序列之連接^序列 ，但經由基因多樣性細胞群予以交互連結。若有興趣之核符酸 序列係可變區編碼賴，則可_經連結之序_齡基因庫 6048-6508-pp；chiumeow 11 1333977 有興趣之核微序列係編碼非-多樣性雜聚蛋白質，該隨機連結的 一細胞連結之序列相似。 、早 與逆轉錄有關之「衍生自單-細胞群之模板」係指此等經單離之 核酸。該核酸可呈例如RNA、mRNA、DNA、或基因體DNA之形式。該核酸可自細《 胞單離出來或仍為細胞中之内容物，其t該細胞為完整的形式或經溶^ ，田 增幅作用及連接過程 式。ν 本發明之一特徵係減少於增幅有興趣之核苷酸序列時所需之試管數， . 利用經變化之PCR，藉由包含-組以上之引子，例如於同一反應中包含增幅可變 區編碼序列所需之所有引子，該PCR可於同一試管中同時增幅二或多個標 ·
列《—般此方法係稱為多重聚合酶連鎖反應多重PCR)。 T 先進行逆轉錄之多重PCR增幅作用以及多重PCR(多重RT-PCR)為診斷領域籲 中已知之技術’例如用於突變分析、DNA缺失及多態性、_Α層級之定量分析 以及病毒、細菌及寄生蟲之鑑定（評論KMark〇ulat〇s，P等人2〇〇2J ciin⑽
Anal. 16, 47-51)。然而，僅非常少數之實例中已將免疫球蛋白輕鏈可變區 碼序列於同-容器中增幅，如同免疫球蛋白重鏈可變區編碼序列利用多重引子 合物（由構成V /c及/或Vλ引子組與vH引子組之四個以上之引子組成）(chapai N.等人 1997· Bio Techniques 23, 518-524 ;Liu，A. Η.等人 1992. Pr〇c· Nat/
Acad· Sci. U.S. A. 89，7610-7614 ;Embleton，M. J.等人 1992. Nucleic Acids
Res. 20，3831-3837)。基於此原因，為了捕捉此等可變區編碼序列之多樣性， 適用於增幅該可編碼抗原結合蛋白質之可變域序列之引子組—般係由數個退化 性引子所構成。因此，當進行可變區編碼序列之多重pCR增幅作用時高度增_ 加了 PCR反應之複雜性。 本發明之另-特徵係由多重PCR增幅之二或多個標的序列係於極接近該增. 幅過程下連結。尤其係可變區編碼序列之同源對係藉由此過程連結。 本發明之-具體實例中，發現可設計將多重引子混合物·重疊_延伸pcR ‘ 程序，造成同時增幅以及連接有興趣之核普酸序列。此多重重疊_延伸pCR技術 可用以減少單離與連結有興趣之核脊酸序列時所需之反應次數，尤其係經連結 之可變區的同源對。 本發明之其他具體實施例中係藉由接合作用或重組作用進行連接，此為除 了藉由多重重疊-延伸PCR外之另一種連接。此等程序中，並非係與多重pCR增 6048-6508-PF;Chiumeow 12 1333977 幅作用同時進行連接，但為增幅作用後立即進行之步驟。然而仍可於進行多重 PCR之相同試管中進行連接。 為了進行多重重疊-延伸PCR，需要二或多個引子組（多重引子混合物）存 在’且各組中之至少一個引子具有重疊_延伸尾部。該重疊_延伸尾部可連接由 各引子組於增幅作用中產生之產物。此引子混合物稱為多重重疊_延伸引子混合 物。該多重重疊-延伸PCR ’與習知之重疊-延伸PCR之不同處在於欲連結之序列 係同時產生於相同之試管中，因此於增幅作用期間可立即連接該標的序列，無 須任何中間的純化作用。再者，為了產生該經連結之產物，習知之重疊-延伸PCR 需要以外側引子組或巢式引子組進行另一個連接用pCR反應(Η。—，R M等人 1989. Gene 77, 6卜68)。於本發明之多重重疊—延伸pcR中，此額外之增幅步 驟係選擇性的。 本發明之另-特徵係於多重PCR或多重重疊—延伸pcR增幅作用前進行逆轉 錄⑽步驟，其係利用衍生自經單離之單一細胞或同基因型細胞群作為模板。 #本發明之衍生自經單離之單—細胞或同基因翻胞群之核 =酸序列作為多重PCR增幅作用之模板。較佳地，於進行多重ρ㈣，將來自 :-細胞之腿逆轉錄成cDNA。為了增幅某些有興趣之核酸序列，可使用基因 。。腿替代_A。藉由使用經單離之單一細胞或同基因型細胞群消自經單離之 之細胞擴充)作顧㈣，可避免雜亂之可編碼有興趣之縣蛋白質之 核彼序列，無生自細胞群中不同細胞之序列。此點對希望獲得有興趣之序 具重要性。尤其為了產生可寵編碼序狀同源對， 使用轉離之早-細胞或同基_細鱗作為模板縣—重要特徵。 ° W0 99/169〇4 ^ ί 因而無須利用逆轉錄作用來產生_。所述之過 :伸=利==：^連結，_成多重重疊- 該纖以細腿為模板藉= ㈣反應，接著進行巢式PCR而產生，其為二=子心物細重疊-延 聚蛋===ΠΓ眶之外子產生cDNA之技術與選殖可編碼雜 A貪白貝之技術係不同的。首先，雜聚蛋
99/16904所述之外子連接係關於自單 7由不同之基因表現，而WO 基因連接外子。此外，本發明有助於產 6048-6508-PF；Chiumeow 13 1333977 生經連結之有興趣之核酸序列之基因庫，尤其係組合基因庫以及可變區同源對 基因庫；與自單一基因連結一系列外子產生單一非可變cDNA係完全不同的情 況。再者，本發明利用衍生自單—細胞之核酸，較佳係RNA形式，於利用作為 模板前其不需自殘餘之細胞内容物中進行單離。 · 已有少數公開文獻提出與連接可變區編碼序列相關之多重重疊-延伸、 RT-PCR 〇 多重重疊-延伸RT-PCR之最簡單的形式係說明用於自融合瘤細胞株中單離· scFv 編碼序列（Thirion，S.等人 1996. Eur_ J· Cancer Prev. 5, 507-511 以. 及Mullinax，R.L 等人 1992. BioTechniquesl2, 864-869>Thirion及Mullinax 所述之方法侧肖mKM之逆觸反獻㈣τ剌子卩及自融合齡絲萃取 之總RNA為模板接著進行獨立的連接步驟。該連接步驟係以共四個引子進行，隹 包括分別用於增幅重鏈可變區以及輕鏈可變區編碼序列之兩對引子。Vl之前置引 子（forward primer)以及V«或CH之反置引子(reverse primer)含有互補重疊_ 延伸尾部’因而可同時進行增幅以及連接該重鏈可變區及輕鏈可變區編碼序 列。此等方法並未使用巢式PCR以增加連接方法之敏感度。 〜與連接可變區编碼序列有關之多重重疊_延伸RT_pcR之其他實例係說明於 則述W0 93/03151中，其提供-種自相同細胞選殖重鏈可變區及輕鏈可變區編 碼序列而於選殖前不需單離單一細胞之方法。w〇 9湖151所述之方法需要於 ^步驟及多重重疊-延伸PCR步驟間進行洗蘇。再者，w〇 93/〇3151所提出之特 1 目的中之-者係欲解決為了得到可變區編碼序朋麟必鮮離單-細胞之 2已知之多重重疊-延伸RT_PCR技術中皆未揭露街生自經單離之單一細 胞之模板之_。絲有任何—财法可進料—步狀RTPCR反應。 法勺月之〗f實施例包括連接數個有興趣之非-連續性核普酸序列。該方 二fCR或多重RT—PCR增幅程序$，利用衍生自經單離之單一 :或巧關_群作域板明财興趣之核瓶序取及使鮮幅 /、趣之核醫酸序列產生連接。再者，該方法包 、·曰 幅作用之選擇性步驟。 法匕括將絰連結之產物進行額外的增 本發明之另-具體實關包括產生具有經連結之可變 基因庫之方法。财法包料捐贈者提供含麵巴細胞之城分液，視需要'自 14 6048-6508-PF;Chiumeow 1333977 分液中擴增特定之淋巴細胞群。再*，將得自含有淋巴細胞之細胞分液、 或、坐擴增之細胞分液之細胞逐個地順著數個容器分配而得到經 ^進行多重分子增幅作用（多重RT-PCR增幅作用）以增幅經單離之^ 中所含之可麵編碼序列以及使可魏編碼相對產生連接，其巾 =生自經單離之單—細胞群中之單—細胞。再者，該技術包括兩個選擇性步驟.、 第-步於進行多重rT-PC：r增幅侧翁單—細鱗巾之_經單離之單一 f張成同基因型細胞群》因此得到數個具有多樣性之同基因型細胞群之容器 容器中具有-同基因型細胞群）。第二選擇性步驟包括將經連結之可變區編 列進行額外的增幅作用。 、、序 本發明之較佳具體實施例中，由免疫球蛋白輕鏈可變區編碼序列組成之同 源對基因庫之各個成員係與源自相同細胞之免疫球蛋白重^ 之α鏈可變區或與5鏈可變區聯繫在—起鍵可魏構成，其中經聯繫之可 變區來自相同的細胞。 本發明之多f RT-PCR增幅作用可為二步驟過程，其中逆轉錄係與多重pcR 增幅作用（或者為多重分子增幅_)分騎行，或者為[步驟過程，其中rt 與多重PCR增幅步驟係於一根試管中以相同之引子進行。 逆轉錄作用（RT)係以含有逆轉錄酶活性之酵素進行，由經單離之單一細胞 2之總RNA、mRNA或標的專-性RNA產生cMA。適用於逆轉錄作用之引子例如 寡-dT引子、六鹼基隨機引子序列、十鹼基隨機引子序列、其他隨機引子 '或對 有興趣之核苷酸序列具有專一性之引子。 二步驟多重RT-PCR增幅程序，於進行增幅作用前可考慮將由RT步驟產生 之cDNA，刀配至一個以上之容器以儲存模板分液。此外，將分配至一個以 上之試管中，可使衍生自相同模板之核酸進行一次以上之多重pCR增幅作用。 雖然，此會使獨立的反應數增加，但其顯現出可減少多重引子混合物之複雜性 之可能性，若其為所欲者。此二步驟方法可應用於，例如在一試管中增幅及連 結重鏈可變區以及zc輕鏈可變區編碼序列以及於不同試管中利用相同的模板增 幅及連結重鏈可變區以及;(輕鏈可變區編碼序列。單一細胞通常只表現一種輕 鏈。然而，將可輕易的同時進行反應以代替進行另一個反應前需等待反應結果。 再者，由於認為單一細胞只增幅凡或又，因此可將該扣及；1兩者之增幅作用作 6048'6508-PF;Chiumeow 15 1333977 為固有的陰性對照。 於單一步驟多重RT-PCR程序中，逆轉錄作用及多重PCR增幅作用係於相同 容器中進行。所有為進行單一步驟之該逆轉錄作用及該多重RT_pCR兩者所需之 成分係一開始時即加至容器中然後進行反應。一般，當反應開始後不需添加額· 外的成分。單一步驟多重RT-PCR增幅作用之優點係其可進一步減少為了產生本、 發明之經連結之核苔酸序列所需之步驟。當於單一細胞之陣列中進行多重 RT-PCR時特別有用，此處係指相同反應需於數個容器中進行。單一步驟多重. RT-PCR係藉由利用存在於多重引子混合物（為多重pcR增幅作用所需）中之反置 引子以及逆轉錄作用之引子進行。一般，單一步驟多重RT_pcR所需之組成包括· 核酸模板、具有逆轉錄酶活性之酵素、具有DNA聚合酶活性之酵素、去氧三磷 酸核苷混合物(dNTP混合物包括dATP、dCTP、dGTP、及dTTP)、以及多重引子混籲 合物。該核酸模板較佳為衍生自經單離之單一細胞之總謹或mRNA，其可呈經 純化之开>式，如細胞之溶胞產物，或仍存在於完整之細胞中。一般，該反應混 合物之精確的組成需要對用於本發明之各多重引子混合物進行某些適當的調 整。此可應用於二步驟及單一步驟多重RT_pCR程序。 本發明之另一具體實施例中可適當的使用基因體DNA取代RNA作為模板。 此例中省略的逆轉錄步驟，本發明之剩餘之其他步驟係如說明書中所述進行。 某些單一步驟多重RT_pCR&應可有利於反應中添加額外的成分。例如，於 RT步驟後添加聚合酶。其他成分例如dNTp混合物或可能具有不同引子組成之多 重引子混合物。由於其亦限制為得到所欲之經連結之產物所需之試管數，各可 視為單試管多重RT-PCR，通常與該單—步驟多重RT_pcR具有侧的優點。 經多重RT-PCR增幅之有興趣之核苷酸序列彼此間可藉由數種方法加以連 結，例如利用不同多重引子混合物進行多重重疊_延伸RT_pCR、接合或重組。較_ 佳地該多重RT-PCR增幅作用及連接過程係單一步驟或二步驟過程。然而，該連 接過程亦可以多步驟過程進行，例如於pcR、接合作用或重組作用中使用填塞片 段(stuffer fragment)連結有興趣之核酸。此填塞片段可包含順式_元件、啟動 子兀件或有意義之編碼序列或識別序列。於較佳之具體實施例中該連接過程係 於與多重RT-PCR增幅作用相同之容器中進行。 本發明之具體實酬巾，數轉_連無之有興趣域^:祕狀連接係由 利用多重重疊-延伸引子混合物之多重卩⑶增幅作騎完成。此造成標的序列之 6048-6508-PF;Chiumeow 16 1333977 增幅作用以及連接組合在-起…般，够重延伸pGR所需之域包括核 祕板、具有DNA聚合酶活性之酵素 '去氧三磷酸核脊混合物㈣p混合物包括 dATP、dOT、dGTP、及OTP)、以衫重重疊_延伸引子混合物。 本發明之特定具體實施例中，數個非-連續性之有興趣之補酸序列之連接. 係由利用衍生自經單離之單-細胞或同基因型細麟之模板之多重重疊_延伸· RT-PCR所完成。再者’該方法包括一選擇性之步驟，該步驟係將經連結之產物 進行額外的好增幅作用。健地，該乡重重疊—延伸RT_PGR#m驟 . -試管反應之方式進行。 本發明之多重重疊-延伸引子混合物包括至少兩組引子對，該引子可引導至 少兩個可變區編碼序列之增幅侧及連接，例如將免絲蛋白重鏈可變區家族 之序列與/C或λ輕鏈可變區家族之相進行增幅及連接，或將τ細胞受體家族_ 之α、β、r、或(5序列進行增幅及連接。 、 本發明之另-具H實施例巾，係藉由接合個連結該經過乡重rt_pcr增幅 之數個有興趣之核微序列。為了達成此侧，多重所使用之多重引子 混合物係經過設計，俾使該經增幅之標的序列可經由適當的限制酵素進行切 割^及可藉由腿接合作用進行共價連接(該引子之設計詳述於「引子混合物 及設計」-節）。以此等多重引子混合物進行多重RT pCR增幅作用後，將為了 使標的序列形成可相容之末端所需之限制酵素與接合酶一起加入至該混三物 中。雖然可進行純化’但此步驟前不需純化pcR產物。經組合之限制切割作用 以及接合作用之反應溫度約為〇及批間。然而，若多重pcR反應之聚合酶仍 存在於該混合物巾，翁養溫度較佳低於室溫，更佳為該溫度約在4及耽間。鲁 本發明之又另-具體實施例中，係藉由重組作用連結該經過多重-⑽辨 幅之數個有興趣之核普酸序列。此方法中，經增幅之標的序列可彻相同之^ · 制位置予以會合。然後藉由添加有助於重組作用之重組酶進行連接。某些適人 的重組酶系統為具有FRT位置變化之Flp重組酶、具有1〇χ位置變狀^ ^ ‘ 組酶、整合酶（integrase)(DC31其可於attP位置及attB位置間進行重組作用、 冷重組酶-六系統（々-recombi nase-s i X system)以及Gi n-giX系統。 藉由重組作用進行之連接已由兩核苷酸序列（Vh與Vl之連結）為作為例示 (Chapal，N·等人 1997 BioTechniques 23, 518-524)，以參考資料合併於本文。 本發明之較佳具體實施例中，有興趣之核脊酸序列包括可變區編碼序列以 6048-6508-PF;Chiumeow 17 1333977 及該連接產生之可變區編碼序列同源對。除了可變區外，此同源對可包括一戋 多個固定區編碼序列。 本發明之更佳的具體實施例中，有興趣之核苷酸序列包括免疫球蛋白可變 區編碼序列以及該連接產生之輕鍵可魏及重鏈可變區編碼序列同源對。除了 可變區外’此同源對可包括一或多個固定區編碼序列。再者，此同源對可單離 自衍生自B-淋巴細胞系之細胞（該細胞係經由含有淋巴細胞之細胞分液擴增，例 如全血、單核細胞或白血球細胞）之模板。 0 本發明之又更佳的具體實施例中，有興趣之核脊酸序列包括Μ可變區編 碼序列以及該連接產生之α鏈可變區及續可麵闕序列或Τ鏈可變區及占 鏈可變區編碼序列同源對。除了可變區外，此同麟可包括—或多個固定區編 碼序列。再者’此同源對可單離自衍生自τ_淋巴細胞系之細胞(該細胞係經由含 有淋巴細胞之細齡賴增，例如全血、單油胞或自血球細胞)之模板。 本發明之另-觀點，係湘以基因上具有多樣性之細麟作為模板來源之 多重RT-PCR。乡數之雜聚蛋白質編碼相不會隨細胞之*同而改變如同結合蛋 白質之可變區編碼序列之例。因此，當利用本發明選殖此等非_可變的雜ϋ白 質編碼序列時，無需進行單細胞之起始單離作用。 本發明此频倾财，可細下财法賴猶絲财姨之非_ 性核舰序列，該方法包括使驗生自基因上具有多樣性之細胞群作為模板， 使有興趣之贿酸序舰行乡重射GR增财㈣及使輯幅之有興趣之 酸序列產生連接。再者，該方法包括使經連結之產驗行額外 擇性步驟。如單-細胞之方法可卿_多重重4_延利子混合物之增幅2 或者接合或纽作騎行連接。健地贿生自細麟之難鮮完全地 於細胞内。例如該細胞群可經溶解。 機連接之過程應用至表現可變區結合蛋白質之細 混合
Γ·Γ基因庫。較佳地，該細胞群構成之細胞可表現可變= ? 巴細胞'τ淋巴細胞、融合瘤細胞、漿細胞、或此等細胞之 實Γ中之細胞群例如可經通透化或溶解、不需其他純化作用、 ^該，板敝可藉由胞標準程序單離自細胞。以該單—轉多重RTPCR程序較 佳j而，一步驟程序亦可用於該具體實施例中。 6048*6508-PF；Chiumeow 18 1333977 本發明亦提供由經連結之免疫球蛋白輕鏈可變區及重鏈可變區編碼序列對 組成之組合基因庫。 增加該多重RT-PCR-連接過程之專一性、敏感性以及產量之有效方法，係使 經連結之核苷酸序列（該經連結之核苷酸序列係得自多重RT_pCR接著由接合作 用或重組作用連接或者採用多重重疊-延伸RT_pcR連接)進行額外的分子增幅作 用。此額外的增幅作用較佳係以PCR增幅作用進行，利用適用於增幅該經連結 之有興趣之核酸序列之引子混合物。所利用之引子混合物可為該多重引子混合 物或多重重疊-延伸引子混合物之外则子，意、彳旨剌子可煉合至該經連結之可 變區編碼序列之有意義股之最遠的5’ 4及3，端，因此可增幅該整個經連結之 產物。該外则子亦可形容為該多重重疊—延伸引子混合物之引子料含重^延 伸尾部。此外’經連結之核脊酸序列之額外的增幅作用可使用巢式或半巢式引 子組。此巢式PCR特別適用於增加該方法之專一性以及增加經連結之產物的產 量。本發财，半-巢式PCR(詳述於標題糾子混合物及設計—節）之作用如同 巢式PCR。因此’本發明欲(但非必須)將得自該多重重疊延伸rt pcr之經連灶 之產物或由藉由接合作贼重組作麟得之產物進行額外的pc：R增幅作用^ 佳係使用巢式PCR或半-巢式PCR。 直接使时液或該完整之多重重疊-延伸RT_peR反應產物或接合作用產 物或重組侧餘，或者任—此等錄之分絲使 狀錄㈤域錢行初旨轉錄，幼下赠㈣ 預^大小之片段而純化該經連結之絲）進行簡外的增幅作 RT PCR ^ ^、重疊延伸RT_PC：R連結之產物，較佳係直接以多重重疊-延伸 未連行該妍的增幅_，因為此有祕連接於P反應中尚 有興趣之序列 一 有興趣的贿酸序列可選自編碼不同次單元或域 ，或域之序列表現時可形成蛋白践蛋白質之部分。由二二 皁元所組狀此等蛋白質係已知為雜聚蛋白f。 ''相同之认 中。此等蛋白質之某些種類係狀例如酵素 '抑制劑於^物f 二蛋白質、G-蛋白質、受體蛋白質、免疫球蛋白 :=白： 等。編碼此等雜聚蛋白質之贿酸序列係非—連續性的，』2其==不白二 6048-6508.PF；chiumeow 19 1333977 基因、或不同mRNA分子。然而，本發明所使用之非_連續性亦指編碼該相同蛋 白質域之序列，其中該域係由非有興趣之核昔酸序列分開。 本發明之-具體實施例巾’有興趣之核;g：酸序列包含來自免疫球蛋白超級 家族之可變區編碼序列，例如免疫球蛋白（抗體）、B細胞受體以及τ細胞受體· (TcR)。尤其有興趣者係來自免疫球蛋白之可變區編碼序列。此可變區編碼序列· 包括完整之抗體以及Fab、Fv、scFv與可變區編碼序列片段之組合，列如互補 決定區(CDR)、會合基因或V-基因或此等組合。通常本發明可應用至可變區編碼· 序列及其片段之任何組合。本說明書示範該整個輕鏈與重鏈之可變域之連接。· 然而，本發明亦可只連接重鏈及輕鏈之可變域產生Fv或scFv編碼序列，或連 接該整個輕鏈與重鏈可變區+固定區域Chi+部分之鉸鏈區（hinge regi〇n)，產生 Fab、Fab或F(ab)2。再者，可於可變重鏈中加入重鏈固定區域之任何區，因鲁 而產生經截斷之抗體編碼序列或完整之抗體編碼序列。 本發明之另-具體實施例巾可魏編碼序列包括免疫球蛋白輕鏈（κ或λ ) 編碼序列之一型以及一個免疫球蛋白重鏈可變區編碼序列。 衍生自Τ細胞受體(TcR)之可變區編碼序列亦為有興趣之者。此等TcR編碼 序列包括完整之α與召鏈或γ與5鏈序列以及可溶性TcR或僅此等鏈或其單鏈 融合蛋白質之可變域(例如單鏈α召或單鏈r 序列。 模板來源 本發明之一特徵係連結衍生自經單離之單一細胞、同基因型細胞群、或基 因上具有多樣性之細胞群（其尚未分離至單一容器）之核苷酸序列之能力。本發 明所利用之細胞例如細菌、酵母菌、真菌、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細· 胞或此等細胞之分液。衍生自哺乳動物之血液細胞係可用於本發明之細胞分液 之實例。 本發明之較佳的特徵係使用經單離之單一細胞或同基因型細胞群作為模板 來源，因此可避免擾亂有興趣之核酸序列，尤其係可變區編碼序列。此點對希· 望得到例如可變區編碼序列之原始配對者係重要的。 本發明之另一較佳特徵，係由細胞分液（包括淋巴細胞，例如B淋巴細胞、 T淋巴細胞、漿細胞及/或此等細胞系之各種發展階段)得到單一細胞或單一細胞 群。其他可表現來自免疫球蛋白超級家族之結合蛋白質之細胞群亦可用於得到 單一細胞。細胞株例如融合瘤細胞、B淋巴細胞或τ淋巴細胞系之細胞株或病毒 6048-6508-PF；Chiumeow 20 1333977 永生=之細絲絲自於者之參與免疫反狀細胞亦可應祕本 自於扣贈者之含有此細胞之峨分液可得自富含此等細胞 體’例如血液、骨髓、淋巴結、脾臟組織、扁桃腺組織或得自腫 滲透液或發纽織料液。本發明之適當的細胞觸者可選自 疫系統之雜祕。捐贈者騎欲之標的可天生有免疫或高度免疫’。、彳 出對=欲之標的具有結合專—性之抗原結合蛋白f，以高妓疫捐贈者 此等尚度免疫捐贈者可為經標的或該標的之片段免疫化之捐贈者 令之病患’或非-歸之個體其對標的正進行免疫反應，例如自觀疫性病串、 癌症病患、HIV病患或具有慢性疾病之病患。 病心 當利用重組蛋自質進行治療時，其較健魅自無治叙蝴 似性之序列（例如以人類序列治療人類）。首先，因為衍生自外來序列(’亦 丨 人類)之纽蛋白質會經由免疫系統辨識導致與免疫反應有關之多株抗 抗體之產生。此等抗—蛋白#抗體可藉由佔據該活性位置而 ^加速齡之清除収其可糾域㈣反細如於再絲料;^狀 然而，於纽蛋白質係触自具有_她之序狀_亦可能產生致免 =二此致免疫性可例如由後—轉譯作用之修飾所引起，該修飾可能與體内所見 。可麵編碼相之組合基因庫亦可能引域免紐， =^變區編碼序列隨機配對所組成。尚未完全了解體内體 之配對視為外來物，即使構成該配對之兩序列皆為人類之序列。另—方面 =基=之結合蛋白質不會產生該異常之組合因此其致免疫性比得自組合 結合蛋白質少。此並不表示來自組合基因庫之產物不適用於治療，其 僅而要較大程度地監測關於上述之副作用。 ’、 為了用於本發明’細胞·者難應與欲轉自本剌之經連結之核普酸 ^列產物雜者_，佳地，細胞制者侧養的雜、寵物、人類或基因 轉殖動物。帶有人類免疫球蛋白位置之基因轉殖動物係詳述於美國專利第 20 8 KUr〇iWa，Υ·#Λ^ ^ Biotechnology； 2002; 0=9-893。此等基因動物可產生人類免疫球蛋白。因此藉由一般免疫 技術可使此等基因轉殖動物針對特定標的產生完全人類抗體^此可產生編碼結 6〇48-6508-PF；chiumeow 21 1333977 合蛋白質（該蛋白質對多種困難的標的例如人類抗原具有專—性）之基因庫對其 無自然人類抗體反應存在或限制自然人類抗體反應存在。此等基因二物亦 可發展為製造人類τ細胞受體。 本發明之又一具體實施例中，含有淋巴細胞之細胞分液係由得自捐贈者之. 全血、骨髓、單核細胞、或白血球細胞所構成。單核細胞可單離自血液、骨髓、 淋巴結、脾臟、癌症細胞周圍之滲透液或發炎的滲透液。單核細胞可藉由密度. 離心技術，例如聚蔗糖梯度離心，進行單離。若單核細胞係單離自由^織組=. 之樣本，該組織於梯度離心前進行破碎處理。破碎處理可藉由，例如，機械方 法=如碾磨 '電穿孔以及/或藉由化學方法例如酵素處理，而進行。白血球細胞· 之單離可使用白血球濾析（leuk〇pheresis)直接自捐贈者進行。例如骨髓或組織 之粗製備物’其含有淋巴細胞’亦可用於本發明。為了有助於單細胞分配，此_ 等製備物需要經過如上述之破碎處理。 本發明之又一特徵係擴增該含有淋巴細胞之細胞分液，例如，全血、單核 細胞、白血球細胞或骨髓，該細胞分液與特定淋巴細胞群有關，例如來自B淋 巴細胞或T淋巴細胞系之細胞。B淋巴細胞之擴增可使用，例如磁珠細胞分類 (magnetic bead cell sorting)或螢光活化之細胞分類（FACS)利用系—專一性之 細胞表面標記蛋白質例如CD19或其他B細胞系_專一性之標記進行。τ淋巴細胞 之擴增可使用’例如利用細胞表面標記例如CD3或其他τ細胞系一專一性之標纪 進行。 —士發明之較佳特徵係為了進一步取得漿細胞，於個別地將細胞分配至數個 容器前將經擴增之Β淋巴細胞分類。漿細胞之單離一般係藉由FACS分類進行， 利用表面標記例如可能與GD45組合之CD38。亦可其他的漿細胞專一性表 面標記或其組合，例如CD138、CD2()、圓、c勵、⑽、HLADR或CD62L，標 ，之正確的選擇係根據漿細胞之來源，例如扁桃腺、血液或魏。漿細胞亦可 得自未-經擴增之含有淋巴細胞之細胞群，該細胞群可由任何來源取得。單離自 血液之漿細胞有時稱為早期漿細胞（early plasma cell)或成漿細胞 (plasmablast)。本發明中此等細胞亦稱為漿細胞雖然與屬於骨髓之漿細胞相比 其係CD19陽性。較佳係使用漿細胞進行免疫球蛋白編碼序列之同源對之單離作 用’因為此等細胞較常產生抗原-專一性抗體反映出對所欲之抗原之後天免疫且 多數之此等細胞已經過體細胞過度突變因此可編碼出高親和性之抗體。再者， 22 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977 襞細胞中之舰狀較殘餘之B淋巴細胞， 單離自含有淋巴細胞之細胞分液 錄程序較有效。另-種漿細胞之單離，記情B知始,二早贼用襞細胞時逆轉 κ ^ ^ A ________、 隐8、逆胞可利用細胞表面標記例如CD22 驗==::=個：π挑選具有抗原專-性之 觸接著早離該結合物而進仃。此可藉由，例如，藉由於磁珠 原或磁珠細齡類狀録、藉由FAes、藉由歸柱 =2 層析、藉由過祕齡析或其他此技藝巾.之綠而
:=:原白血球細胞、全血、‘組= 本發明之另-特徵係使用表面標記及/或CD27將經擴增之τ淋巴細 胞(例如CD3陽性之細胞）進行分類俾得到記憶τ細胞之分液。τ淋巴細胞亦可使 用MHC-胜肽複合物挑選MHC-抗原專-性(例如Callan，M. F.等人聰】
Med. 187, 1395-1402 ； Novak, E.J.fA 1999. J. Clin. Invest 104, R63-R67) 〇 本發明之又-碰係上述任何經單離之細齡液之永生化_ (例如b淋巴 細胞、毁細胞、記憶細胞、或T淋巴細胞）。永生化作用可於進行細胞分配前以 例如艾普斯坦-巴亞病毒進行(Traggiai，Ε·，等人2〇〇4. Nat _ 1〇 871_875)。 或者，經單離之細胞於進行逆觸前予以永生化及擴充々鄉⑹等人 _ 2004 Aug;10(8):871-5 。 ·
本發明之又-特則^了得到經單離之單―細麟，將所欲之細麟(例如 融合瘤細胞、B淋巴細胞或T淋巴細胞系之細胞株、全血細胞、骨髓細胞、單核 細胞、白血球細胞、B淋巴細胞、漿細胞、抗原_專一性B淋巴細胞、記憶B細 胞、T淋巴細胞、抗原/MHC-專一性T淋巴細胞、或記憶τ細胞)個別地分配至數 個容器中》單一細胞群之單離作用係指以物理方式分離該細胞群之細胞，此方 法中單一容器含有單一細胞》可藉由限制性之稀釋直接將該細胞群分配至多個 谷器例如單一容器之陣列。本發明所使用之單一容器較佳係可用於PCR者（例如 PCR試管以及96孔或384孔之PCR盤或較大之容器陣列）。然而亦可使用其他容 器。當單一細胞群分配至具有多個空間之單一容器（例如384孔盤）時，得到單 一細胞群。此分配可藉由，例如，將體積分配至單一容器其平均包括細胞濃度 6048-6508 -PF;Chiurneow 23 1333977 為- '0.5、0.3細胞，因此得到平均含有單一細胞之容器。因為藉由限制性之 稀釋的分配作用係統計上之事件，故容器中之分液可能不含細胞、大部分之分 液中含有單-細胞、以及少數分液中含有二或多個細胞。當容器中含有二或多 個細胞時，於存在有多個細胞之容器中可能發生某些雜^之可變區編碼序列。 然而，由於其係少數事件將不影響本發明之整體效用。此外，不太可能選擇該 不具有所欲之結合親和性以及專—性之可變區編碼序狀組合因此其於筛選過 程中予以排除。因此’少數雜亂之事件不會影響本發明最終之基因庫。 除了藉由限制性之稀釋來分配細胞外，亦可使用，例如，細胞分選儀例如 FACS機器或可照規定精確地將單—細胞分配至單—容器之控織置之替代方 法。其中以此㈣代方法為佳，因為其較不f力且可更有效—致 分配至單一容器。 平、肥 進行上述之擴增、分類以及單_序後，A部分之細胞健躲完整的狀 態。於擴增及分類細胞期間中若使細胞破裂則可能造成雜亂之可變區編碼序 列。然，，由於預測細胞破裂的機會較低故簡此情形不會構成問題。於細胞 分配至早-容器前細胞之洗務及可能的RNAse處理將會移除任何脆，該· 於過程中遺漏。 兩再，，為了於單-容器群巾得解—細胞群而考慮上述如何分配細胞時， 不而將每個容器中必須含有單一細胞理解為絕對所需之特徵。反而， 大含有單—細胞，例如具有二或多個細胞之容11的數量舰經分配 之、，，田胞〜數的25% ’或者更佳為低於1〇%。 板進概雜職生自簡舰分岐數舞11 _之細胞作為模 倾明搭，為了逆轉錄(rt)之目的’該逆轉錄係將單一細胞中之核酸作 ^中^離視為触自單-細胞儘管料需自單-細胞之殘餘 當已完成將單-細胞最終分配至其單一容器時，為了於 擴充該單-細胞。此過程產生更多的_A以作為模=== 時擴充該單一細胞顯得重要。然而，於擴充期間該細胞與 有基因上之相滕。該經單離之細胞或因型細胞群 可維持元整之細胞狀態或經溶解之狀態，只要用於逆轉錄之模板未降解即可。 24 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977 為了使後續之逆轉錄及PCR增幅作用較易進行，該細胞較佳係經溶解。 本發明之不同的具體實施例中，所揭示之多重重疊-延伸RT_pcR方法或多 重RT-PCR接著藉由接合作用或重組作用進行連接其亦可利用衍生自具有基因上 多樣性之細胞群（其尚未分離至單一容器）作為模板，但是其仍呈現為雜聚之細· 胞群。此方法可用於產生組合基因庫。此等方法不需單一細胞之分配。然而，· 可用於此方法之細胞與用於單一細胞法所述之細胞係相同的，例如經分類之B 淋巴細胞或T淋巴細胞群(細胞集合）。當以此等細胞群進行單一步驟多重重疊—· 延伸RT-PCR或單一步驟多重rt-PCR接著藉由接合作用或重組作用進行連接. 時，較佳於反應前將細胞溶解以及若需要可自該溶胞產物中單離出總RNA或 mRNA ° 本發明之單一步驟多重重疊-延伸RT-PCR之敏感性足可利用非常少量之模· 板。如實施例2及3所示，可使用相當於單一細胞之溶胞產物用量之模板進行 單一步驟多重重疊-延伸RT-PCR。 引子混合物及設計 本發明之引子混合物包括至少四個引子其兩兩形成引子組，該引子混合物 可增幅至少兩個不同之有興趣之標的序列。此等引子之二或多種混合物構成多 重引子混合物。較佳地，多重混合物包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、或 20、30、40、50、60、70、80、90、100、 110、120、130、140或150個引子組（引子對）。尤其為了增幅可變區編碼序列， 多重引子混合物中之各個引子組可由兩個以上之數個引子所構成。較佳地，各 個引子組包括至少 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、2G、25、 30、35、45、50、60、70、80、90、1〇〇、no、120、130、140、150、160、170、 180、190、200、220、240、260、280或300個引子。較佳地，多重引子混合物-中引子之總數至少為 5、6、7、8、9、1〇、11、12、13、14、15、20、25、30、 35、45、50、60、70、80、90、1〇〇、125、150 或 200 個引子以及最多為 225、 250、275、300、325、350、375 或 400 個引子。 本發明之所有引子具有基因-特定區，且較佳為所有引子配有額外的引子尾 部於該引子之5’端，亦即5’非-編碼序列其係與該基因特定之引子部分的3， 端融合。此等引子尾部之長度約自6至5〇個核:g：酸，但若需要可以更長。增幅 作用時該引子尾部係附加於該標的序列。 6048-6508-PF;Chiumeow 合作例如’ __及_物物，義於經接 、異it 適重組作用連接之尾部或重疊-延伸尾部。 位置:=====__及/或重組 為了可藉由接合作用進行連接，多重5丨子齡物之引子 (前置/_反置引子）配有包含限制位置之連接尾部其_時可 «上之標:序列用：，限制位置相容。為了連接兩個 位於第，組之第!二=二配二限制; 再去，如=應擇序列中具有低次數或未出現過之限制位置。 特定肥之料恤置健非為綱者，因此雜合位置可抵抗所使用之 二因為相同標的序列間之連接會受到限制酵素之切割^ bsphi* rr/〇r^r 'Nc〇1 ^ 。為了進-_ 過==:= 連子組例如可參照 考資料合併於本文。 ⑷之文章所不例者進行設計，其以參 重引之贿酸序列，於該多 蓋生多延伸好混合物。 適用於终延伸pcr之尾部，因而 引子，且之重疊延伸尾雊射此重疊。“疊，尾部之财贿酸彼此不 6048-6508-PF；Chiumeow 26 1333977 需完全互補。本發明之-觀點’該互補核苔酸代表重疊_延伸尾部之6〇至咖 間II型重疊-延伸尾部中，5核g酸令之4至6健:g：酸係與鄰近之標的序 =之基因特定區互補。ΙΠ型重疊-延伸尾部巾，整個重疊延伸尾部係與鄰近之 “的序列互補。當調節元件等係之後才插入該經連結之標的序列中時較佳係使· 用I及II 重疊-延伸尾部。若標的序列欲藉由界定之連接子(如scFv中所示 者）予以連結時較佳係使用Π型重疊-延伸尾部。若標的序列欲於結構上彼此連 結時較佳係使用III型重疊-延伸尾部。 . 重疊-延伸尾部之設計係根據序列之特徵例如長度、相對GC比((;(:％)、所具 有之限制位置、回文序列、炫化溫度(melting temperature) '結合在一起之基 因特定部分等。重疊-延伸尾部之長度應為8至75個核^:酸間，較佳為自15至 40個核苷酸長。更佳為自22至28個核苷酸長。非常長之重疊_延伸尾部（5〇至魯 75個核苷酸)之使用有利於連接經由各引子組所產生之產物。然而，當使用非常 長之重疊-延伸尾部時該重疊-延伸尾部與基因特定區間之比例可能需要調整。 GC%偏好係根據該重疊-延伸尾部之長度。因為較短之尾部在互補時具有較短之 面積故需要比較長之尾部還高之GC%以加強交互作用。亦應注意其他關於引子設 計之原則，例如應盡量減少引子之二聚合作用以及髮夾狀之形成。亦應防止其 產生錯誤之配對。再者，已知TaqDNA聚合酶經常會於新合成之DNA股的3，端 加上腺苷酸(A)，因此藉由使重疊-延伸尾部產生3,非_模板儿添加作用而作為 重疊-延伸尾部設計。 帶有連接用尾部（例如該重疊-延伸尾部、適用於經由接合作用進行連接之 尾部或適膀經由纽侧進行連接之尾部）之引子之選擇可決定標的序列之# 連接順序及方向。對本發明來說不論是引子組之前置引子或反置引子配有該連 接用尾部或可能前置及反置引子兩者皆配有該連接用尾部皆非必要。然而，因. 為最終產物中標的序列之順序及方向可能具有實用性，例如為了插入調節元件 例如啟動子及終止序列或於結構上連接各個標的序列，而仍需有所考量。 . 為了連接兩個有興趣之核苷酸序列，可對各標的序列之PCR增幅作用所使 用之各引子組中之反置引子或前置引子加上連接用尾部。本發明係示範對％及 Vl之各引子組中之前置引子加上重疊-延伸尾部以及適用於經由接合作用進行連 接之尾部（分別如第2圖以及實施例9)。此造成產物之連接方向為5，對5，（頭 -對-頭或雙向）。然而，重疊·延伸尾部亦可加在各引子組中之反置引子上(例如 27 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977 第一組之C/c及/或Cx及第二組之Ch及或Jh)。此造成產物之連接方向為3，對3， (尾-對-尾或雙向）。第三種選擇係將該連接用尾部加在第一引子組之反置引子 上(例如及/或α引子）以及第二引子組之前置引子上（例如Vh引子）戈反之亦 可。此造成3,對5,之方向（頭-對-尾或單向）。第3圖係根據各引子組中配 該連接用尾部之引子說明可能產生之方向。
當連接兩個以上之有興趣之核苷酸序列時，某些引子組需於前置及反置引 子兩者上具有連接用尾部，因此一尾部可與前面引子組之尾部互補且其他尾部 可與接下來之引子組之其中一個引子互補。此原則適用於所有引子組，、其中^ 引子可增幅兩其他標的序列間欲連結之標的序列β X 基因-特定引子部分之設計-錢錢已知之引子設戟關如應盡量減 少引子之二聚合侧、敎狀之形成以及非_專—性煉合。再者，應盡可能避免 多個G或C核普酸為3’祕。引子組中基因-特定區之溶化溫度(Tm)較佳應彼 此相等約正/負叱。本發明中Tm值為饥及饥間以及&值為約6『C時係 適合多數之_。有繼，-開始之引子設計可藉由為此發展之電腦程式的輔 助。然而，引子之設計一般需要實驗測試以及規則性的達最佳化。此可藉由， 例如，分析大小、限制酵素片段長度多型性(restricti〇n f卿邮二抑 Polymorphism，RFLP)以及將使職引子組得到之增幅作用產物定序而予以完 成。當增幅該具有可變區之序列或當尋找屬於特定種類蛋白質之新的家族成員 時’於引子中使用退化性位置(degenerate p〇siti〇n)係一種有用之方法。該退 化性位置之數目亦需要最適化。 ，發：包括經改善之引子組，其可以高度多樣化之形式 _肩，·8-18230)所述之引子組作為起始點，以及^=子；； 減少非-專一性之交互作用以及加上重疊—延伸尾部或適用於 、、生由接合作用進行連接之尾部。 本發明之-特徵係由至少兩組引子組所組成之引子混合物立可引導增幅 少Γ有興趣之核序列之連接。本發明之引子混合物可引 ^至夕兩個:人早兀或雜聚蛋白f(例如屬於酵素、抑制劑、結構蛋白質、毒素、 質之^;/體蛋㈣、紐絲白雜家祕自質、轉運蛋白 28 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977 本發明之另一特徵係包括多個引子組之多重重疊_延伸引子混合物，其中各 引子組之至少一個引子組成員具有重曼_延伸尾部，該重疊-延伸尾部可與第二 引子組之引子組成員之重疊-延伸尾部雜合。 該重疊-延伸尾部可於多重重疊-延伸PCR增幅作用中使由該引子組產生之. 各個產物配有可與鄰接之產物互補之尾部而立即連接該有興趣之核苷酸。然而· 並不表示該連接必然地發生於第一個PCR增幅作用期間。根據反應之設定，大 部分之實際上的連接係於額外的增幅作用中進行，該增幅作用使用第一個pCR . 增幅作用（多重PCR增幅作用）之外側引子。 本發明之另一特徵係經設計用於增幅包含可變區編碼序列之核苷酸家族之· 引子組。此等家族之實例為zc輕鏈（例如人類之VKI_VI)、λ輕鏈(例如人類之 VL1-10)以及免疫球蛋白之可變重鏈(例如人類之以及小鼠之vli-15)、以· 及α、冷、r、或5 TcR可變區。用於增幅包含可變區編碼序列之核苷酸家族 之引子組通常包括多個引子其中數個引子可為退化性引子。免疫球蛋白輕鏈可 變區編碼序列之家族係使用由多個引子組成之引子組進行增幅作用之實例，其 中該引子互補於/c鏈可變區之5，端(Vu引子）或λ:領導序列（VLKL引子)及/或λ 鏈(Vu引子）或λ領導序列（Vlu引子）（前置引子)與固定區K (CK引子)及/或又引 子(Cx引子）（反置引子）或多個此等引子。或者，將輕鏈會合區引子(Ju及/或災 λ引子）作為反置引子以取代該固定區引子。或者，前置引子可煉合至位於可變 輕鏈之領導序列前面的UTR區。同樣地，免疫球蛋白重鏈可變區編碼序列之家 族可採用利用各種引子組合之一引子組進行增幅。例如多個引子其互補於重鏈 可變區之5’端(Vh引子）或此區之領導序列(Vhl引子)（前置引子)與多個重鏈會· 合區引子(Jh引子）或重鏈固定區引子(反置引子、該仏引子可為同型（is〇type)_ 專性且原則上可利用任何Ch引子(例如Cm、、Ch3、或Ch4)，可產生全長之重-鏈者亦可。或者’前置引子可煉合至位於可變重鏈之領導序列前面的UTR區。 若觀察到可變區引子有交又-雜合作用時，使用煉合至領導序列以取代煉合 至可變區5端之前置引子係特別有用的。因為由交叉-雜合作用產生之突變將 自最終蛋白質内排除此係因為於領導序列會細胞内之蛋白質加工期間予以切 除。實施例9說明抗體可變重鏈及κ輕鏈領導引子之設計。引導位置位於領導 編碼序列之3’端(C-端）之觀點相較於先前抗體領導引子係較有利的，因為其可 穿梭於細菌及真核細胞表現載體間經增幅之序列而使領導序列在此兩系統中皆 29 6048-6508-PF;Chiumeow 1333977 本發明之-特徵係-種可煉合至可變區編碼序列前面之領導編碼序列之 3端之引子，以及其用於增幅可變區編碼序列。 本發明之難特徵係顧與序顺聰：86至92之基因儀區且有至小 90%序列相似性(較佳為至少95%相似性)之引子，其相當於煉合至重鍵領導編= 序列之C-端之引子(Vhl引子）。此等序列識別號序列之基因—特定區相當於驗基 號18至該序列之3’端（亦參見表U)。 本發明之另一較佳具體實施例係應用與序列識別號：93至卯之基因-特定 區具有至少_序列相似性(較佳為至少95%相似性)之引子，其相纽練合至κ 輕鏈領導編碼相之C—端之引子d引子）。此科賴職相之基因°特定 區相當於驗基編號25至該序列之3’端（亦參見表11)。 本發明之一具體實施例中，用於多重重疊_延伸PCR以及也可能用於逆轉錄 步驟重重疊-延伸引子混合物包括a)至少__與免疫球蛋自輕鏈區編瑪序列 之有意義股互補之Cl或Jl引子；b)至少一與免疫球蛋白輕鏈可變區編碼序列之 反義股互補之VL 5’引子或VL領導引子且可與a)中之引子形成引子組；c)至少 一與免疫球蛋白固定重鏈域編碼序列之有意義股或重鏈會合區互補之Ch或Jh引 子；d)至少一與免疫球蛋白重鏈可變區編碼序列之反義股互補之％ 5，引子或 Vh領導引子’且可與c)中之引子形成引子組。 本發明之引子組例如vu+m、vu+ju、vu+jLx、vL«L+m、A Vul+JTu、ViaL+Ju、VH+JH ' Vh+Ch、Vhl+Jh、或 Vhl+Ch、或此等組合，可增幅可變區 I 編碼標的序列。 另一具體實施例係適用於增幅包括/C輕鏈可變區或;(輕鏈可變區之序列之 ·
Cl(Jl)引子及vL(yu)引子。 本發明較佳具體實施例中該Q(Jl)引子及Vl(Vll)引子可適用於增幅/C及λ ' 輕鏈可變區編碼序列。 本發明之更佳具體實施例中，輕鏈增幅作用之前置引子係Vi±引子其與序列 識別號：93至98之基因-特定區具有至少90%序列相似性(較佳為至少95%相似 性），以及重鏈增幅作用之前置引子係Vhl引子其與序列識別號86至92之基因-特定區具有至少90%序列相似性(較佳為至少95%相似性）。 6048 *6508-PF;Chiumeow 30 1333977 本發明之另-具體實_巾，包含免疫球蛋自研d Vh/、引子連 較佳呈互補重疊:延伸尾部之形式。此產生之可變區編碼序列係以頭-對-頭之方 式連結。至於以頭-對-尾之方式連接之可變區編碼序列，為該应研此 引子含有連接用尾部或VL/Vu與Ch/Jh引子含有連接用尾部，較佳呈互補重叠_延· 伸尾部之形式。至於以尾-對-尾之方式連接之可變區編碼序列，為該cl/(l與， Ch/J«引子含有連接用尾部，較佳呈互補重叠_延伸尾部之形式（第3圖）。 優先地，本發日月之多重引子混合物（包含多重重疊_延伸引子混合物）包括兩. 組引子組。因此’多重引子混合物包括至少四個不同的引子。本發明之又一觀. 點甲，^重！丨子混合物包括四個以上不_引子。本發明之多重引子混合物係 用於在單-容器中增幅標的序列。例如Λ、又及重鏈可變區皆於同一容器中進 斤增幅作用。本發明之-多重引子混合物係由16個不同的退化性引子所組成其· 分配如下：8個V„引子、1個Chi引子、6個Vu引子、以及i個以丨子（第2圖卜 另-組包括19個退化性引子其分配如下：8個Vh引子、4個L引子、6個^引 子、以及1個C«引子。第三組包括22個退化性引子其分配如下·· 8個％引子、 1個Ch,引子、8個V“ 5丨子、以及2個L引子。第四組包括27個退化性引子豆 分配如下個VH引子、丨個^引子、6個^引子、Hg)C/c引子、7個^引子、、 以及2個Cx引子。 本發明亦包括用於使經連結之產物進行額外的pCR增幅作用之引子，該經 連結之產物係得自多重RT-PCR接賴由接合作用或重組作職行連接或得自多 重重疊-延伸RT-PCR。此額外的PCR增幅作用可使用適用於增幅該經連結之標的籲 序歹j之多重引子進行。此引子混合物包括該多重引子混合物或多重重疊-延伸引 子混合物之外側引子，意即該引子係煉合至經連結之核普酸序列之有意義股之 最外侧的5端及3’端，因而可增幅完整之經連結之產物。可作為本發明之外. 侧引子之實例者為⑺Λ及/或W丨子其與或G引子形成引子組。—般此_ 過程係用於增加經連結之產物的數量，該經連結之產物係得自多重RT pcR接著 藉由接合作用或重組作用進行連接或得自多重重疊_延伸rt_pcr。 或者，相較於原本於多重RT-PCR或多重重疊-延伸rt-PCR反應中所使用之 外側引子，亦可於經連結之核苷酸序列之額外的增幅作用中使用巢式引子。本 發明中此等引子組稱為巢式引子組。巢式引子之設計一般遵守與前述基因特定 性引子相同之設計規則，除了其係將3’引導至外側引子之煉合位置，該外側引 31 6048-6508-pp；chiume〇w 1333977 子係用於多重RT-PCR或多重重疊-延伸RT-PCR之引子。因此巢式PCR所得之產 物的長度短於藉由多重RT-PCR接著藉由接合作用或重組作用所得之經連結之產 物或藉由多重重疊-延伸RT-PCR所得之經連結之產物。除了增加經連結之產物 的數量外，該巢式PCR可進一步增加整體的專一性，尤其係該多重重疊-延伸 RT-PCR技術。然而，應注意當進行額外的增幅作用時，並非所有前述之多重引 * 子混合物/多重重疊-延伸引子混合物皆適合與巢式引子組組合，此等例子中多 重引子混合物/多重重疊-延伸引子混合物之外側引子可應用於額外的增幅作用 . 或如下述應用半-巢式PCR。 本發明之一具體實施例中，Jh及JL引子之混合物係作為經連結之免疫球蛋 白可變區編碼序列之額外的增幅作用之巢式引子。 本發明之巢式引子組亦可由來自第一多重引子混合物/多重重疊—延伸引子φ 混合物之反置（或前置）外側引子以及第二巢式引子組成，該巢式引子將3，引導 至第一多重引子混合物/多重重疊-延伸引子混合物之前置（或反置）外側引子之 煉合位置。於額外的PCR增幅作用中此引子之使用一般係已知為半_巢式PCR。 例如若難以設計一特定區域(例如可變區序列(V及j引子））之巢式引子則可應用 半-巢式PCR，因為此引子會煉合至互補決定區（complementarity region，CDR)。再者當欲保留該經連結之序列之一端完整時(例如為了選殖之目 的）可使用半-巢式PCR。 本發明之一特徵係於額外的增幅反應中保持固定輕鏈編碼序列之完整。相 較於原本的反應（多重RT-PCR或多重重疊-延伸RT_pCR反應)所使用之外側引 子，該額外的增幅作用所使用之Cl(反置）引子僅務微地修飾過。該修飾包括於· 原本增幅侧所使肖之α引子之3’端加JL幾働基。另外可於巢式G引子加 上不同的選殖用尾部。相較於原本的反應所使用之固定重鏈_特定外側引子，該 額外的增幅作賴賴之前置引子完全為巢式引子^ ^額外的增幅作用中組Z 使用該原本的反應中之外側引子與稍微修飾之巢式&引子以及 - 置引子時，與崎用完全巢式之引子組之巢式PCR所得之結果概 專一性。 4曰训 本發明之較體實施财，巢式ρα^使用Μ子及轉飾之^ 混ΐ物/多重重疊一延伸引子混合物之第一㈣引子相較下該經修 飾之CL引子係於其3端加上約2至10個基因_特定性鹼基對。 32 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977 多重重疊-延伸PCR之最佳化 不論二步驟或單一步驟之多重重疊-延伸PCR步驟之參數，可於數個參數上 予以最佳化（參見，例如，Henegariu, 0.等人 1997. BioTechnique23，504-511 ; Markoulatos，P.等人2002. J. Clin· Lab. Anal. 16，47-51)。一般相同最佳· 化之參數係用於多重RT-PCR，然而外側及内側引子間之比例於此反應中較不重 . 要。 a. 引子濃度 · 帶有重疊-延伸尾部之引子(例如Vh及Vl引子）的濃度較佳係低於不帶有重疊 . -延伸尾部之外側引子(例如心及^引子）的濃度。 若標的序列中之一者的增幅效率低於其他者，例如由高GC%所造成，則應使 該增幅效率均等。此可藉由使用較高濃度之引子組增幅該增幅效率較低之標的· 序列或降低其他引子組之濃度而予以達成。例如，編碼重鏈可變區之序列通常 具有較高之GC%因此其增幅效率低於輕鏈可變區之增幅效率。此需使Vl引子之濃 度低於Vh引子之濃度。 再者，當使用大量之引子時，總引子濃度可能成為爭議。濃度之上限係由 滴定實驗決定。由Applied Biosystems之“AmpliTaq Gold” PCR系統測得該 上限為1.1 總寡核苷酸濃度，然而至於其他系統可能高達2. 。此總寡核 苷酸濃度之上限影響各引子之最大濃度。若各引子之濃度太低可能造成pCR敏 感度不良。 發現於多重重疊-延伸PCR中寡核苷酸引子之品質亦為重要。經HpLC純化 之寡核脊酸可產生最佳之結果^ 零 b. PCR循環條件： 該循環條件較佳如下： 變性： 10至30秒 94〇C 煉合： 30至60秒 50 至 70°C 約比引子之Tm低 延伸： 1分鐘X EPL 65 至 72°C 5X：。 EPL係預期產物長 循環次數： 最終延伸： 30 至 80 10分鐘 65 至 721 度(kb)。 6048-6508-PF;Chiume〇w 33 插於多重.延伸rt—pcr’於上述增幅作用循環前將下列步驟安 逆轉錄：
42 至 60°C 聚合酶活化：
95〇C 當進行分離的逆轉錄時亦可使用此 等條件 於單一步驟RT-PCR中較佳使用熱-啟動聚合酶。根據製造商之指示進行 雍八2所有參數皆可付最佳化。尤其重要的係該煉合溫度。因此，一開始 刀=所有構銳最終引子混合物之各_引子組俾較最佳之煉合溫度
榀A批以及進行延長與變性之時間。此可為這些屬於多重重疊-延伸引子混合 物之參數的最佳化提供意見。 μ不良之PCR敏感度之問題，例如因為引子的濃度低或模板的濃度低， 4 ^題可藉由制高次數之織環抑克服。高次數之顯環約為35至80 次循環，較佳約40次循環。 再者，較長之延伸時間可改善該多重重疊—延伸pcR過程。相較於正常之i 分鐘延伸時間，較長之延伸時間約1. 5至4分鐘X EPL。 c.佐劑之使用 多重PCR反應可藉由使用pcr佐劑，例如DMS〇、甘油、甲醯胺、或甜菜鹼 (betaine)，予以顯著地改善，此等佐劑可使DNA變鬆散，因而使模板更容易變 性。 d. dNTP 及 MgCl2 魯 於多重重疊-延伸PCR中去氧三磷酸核苷之品質及濃度亦為重要。最佳之 dNTP 濃度係各 dNTP(dATP、dCTP、dGTP、及 dTTP)約為 200 至 400#M，若較高’ 則增幅作用快速受到抑制。低濃度之dNTP(各dNTP為100//M)足以達成PCR增 幅作用。dNTP備料對解束/冷凍之循環敏感。經三至五次此等循環後，多重pCR · 經常無法有效運作。為了避免此問題，可製作小等份之dNTP且保持於-2(TC。 最佳化之Mg2+濃度係一關鍵因子因為多數DNA聚合酶係鎂-相關性之酵素。 除了，DNA聚合酶外’模板DNA引子及dNTP會與Mg2*結合。因此，理想的Mg2+ 濃度係根據dNTP濃度、模板DNA、以及樣品緩衝液之組成。若引子及/或模板 DMA缓衝液含有螯合劑例如EDTA或EGTA，應改變所示之Mg2+最佳值》過量的Mg2. 6048-6508-PF;Chiumeow 34 1333977 濃度可穩定DNA雙股且防止DNA完全變性，而降低產量。當引子煉合至錯誤之 模板位置時過量的Mg2+亦可穩定該偽煉合，因而降低專一性。另一方面，不適當 之Mg2+濃度會降低產物之產量。 dNTP與Mg2t間之良好的平衡約為200至400 aM之dNTP(各dNTP)對1. 5至 3mM 之 MgCl2。 e. PCR緩衝液濃度 一般以KC1為主之緩衝液足以適用於多重重疊-延伸PCR ;然而，以其他成 分為主（例如（NHASO4、MgS〇4、Tris-ΗΠ、或其組合）之緩衝液亦可經最佳化後 應用於多重重疊-延伸PCR。欲產生較長之產物的增幅作用所使用之引子對較佳 係於低鹽濃度（例如20至50mMKCl)下運作，而欲產生較短之產物的增幅作用所 使用之引子對較佳係於高鹽濃度（例如80至l〇0raM KC1)下運作。將緩衝液濃度 提高至2X以取代IX可改善該多重反應之效率。 f. DNA聚合酶 本發明係以Taq聚合酶為例。或者，亦可使用其他類型之耐熱的DNA聚合 酶包含，例如 Pfu、Phusion、Pwo、Tgo、Tth ' Vent、De印-vent。可單獨使用 不具有或具有3’至5，外切酶活性之聚合酶或與其他酶組合使用。 載體及基因庫 根據本發明連接有興趣之核苷酸序列可產生具有經連結之有興趣之核苷酸 序列之核苷酸斷片。再者，此等經連結之有興趣之核酸序列之基因庫係藉由本 發明之方法而產生，尤其係可變區編碼序列之基因庫。 —本發明之一特徵係將經由本發明之方法所產生之含有經連結之有興趣之核 苷酸序列之斷片或經連結之有興趣之核苷酸序列之基因庫插入至適合的載體 中。該基因庫可餘合基轉或可魏編碼序狀同麟基因庫。較佳係將由 外側引子、巢式引子或半—巢式引子所產生之關位置設計為符合所選用之載體 適α的限制位置。若該半—巢式、巢式引子或外側引子配有適合的重組位置且所 選用之載體細，射藉由重組侧將經連結之有興趣之驢序藤至載體中。 基本上’對載體並無限制，只要其可作為藉由本發明之多重RT_PCR_連接方 么中之者所產生之產物的媒介。所選擇之載體可適用於細胞内增幅作用，包 幻如、細菌、酵母菌、#他真菌、見蟲細胞、植物細胞、或哺乳動物細胞。 此等载體可用於幫助後續選錄驟、載體系關之、顯示經插入載體中之 35 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977 產物、表現經插入之產物及/或整合至宿主細胞之基因體。 選殖及穿梭麵較佳為細g載體。然:而，其他麵之顏亦可用於選殖及 穿梭程序。 例如呈現載體(display vector)可為源自fd、Ml3或fl線狀體之嗟菌- 體載體或錄(phagemid)健。此等龍可幫助蛋白質，例如，結合蛋白或其 片段呈現於線狀嗟_體之表面。適合呈現於核糖體、眶、酵母菌細胞或哺乳動 物細胞之呈現載體亦為此技藝所知。這些包括例如病毒載體或編碼嵌合型蛋白· 質之載體。 表現載體(expression ¥沈1；01〇存在於所有上述物種中，且完全係根據所欲· 表現之蛋自質選擇所使狀表現紐。此外某些表現領可藉峨機整合作用 或位置-特定性整合作用，利用適當的重組位置而整合至宿主細胞之基因體中。售 可將表現載體設計為提供額外的編碼序列，亦即當經連結之產物插入此等序列 之結構中時，可表現較大之蛋白質，例如#引人至適#之宿主中時，可表現出 完整的單株抗體。此結構中之插入作用亦可幫助嵌合型蛋白質之表現，其有助 於呈現於線狀喔菌體或細胞之表面。於線狀嗤菌體呈現系統中，可將經連結之 有興趣之核苔酸序列插入至編碼鞘蛋白（coat piOtein)例如pIII vii 列結構中（Barbas, C.F.等人腿.Proc. Natl Acid % 88， 7978-7982 ; Kang，A. S.等人 l991. Proc. Natl. Acid.缸脱 88’ 4363-4366)。 ’ 本發明之-具體實施例巾，經連結之有興趣之膽酸序列的各個斷#係由 免疫球蛋白重鏈可變區編碼序列與輕鏈可變區編碼序列所組成。較佳地，此等攀 經連結之序列係插入至含有編瑪一或多個免疫球蛋白固定域之載體中。該插入 作用係屬於基因工程’使得經連結之重鏈可變區及輕鍵可變區編碼序列插入至 固定區編碼序狀結構巾。鱗插人侧可產蝴如Fab表現紐、完整之抗 體表現載體或編碼完整之抗體之狀之表現紐。此㈣體難為可適用於筛· 選之表現載體(例如’大腸桿菌、嗟粒、或哺乳動物載體)且該固定區重鏈編碼 序列係選自人類免疫球蛋白IgG卜IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA卜IgA2、IgD 或IgE類，因此可表現Fab或完整之重組抗體。除了該固定重鏈編碼序列外’ 該載體亦包含選自人類λ或/c鏈之固定輕鏈編碼序列。此適合當經連結之核苷 酸序列僅編碼該免疫球蛋白可變區編碼序列（FV)時。 6048-6508-PF；Chiumeow 36 本發明之另-具體實施例中，經連結之核^:酸序_各個斷片係由TCR α 鏈可變區編碼序列與/5鏈可變區編碼序列或r鏈可變區編碼序列與㈣可變區 編碼序列所組成。較佳地，此等經連結之序列係插人至含有編碼—或多個μ 固定域之載體中。該插人作祕屬於基因卫程，使得經連結之可變區編瑪序列 番^至相對應之TcR固定區編碼序列之結構中。又一具體實施例中，此等載體 ^合絲現_包括插人至TeR @定區結構化編舶賊拉鍊構型之序 。已顯示此等構築體可增加可溶性TcR之穩定性(觀咖，B E等人溯
Protein Sci 8， 2418-2423) 。 · 本發明之同麟基輯可藉由兩種不同的方法引人至載體巾。第一種方法 單-同源對個別地插人至猶的載體中可分別保存此載體基因庫 在—起。·第二種方法中，於插人至載體前所有同源對係匯集在一起，接 =由大規模(m-mass)插入至適當載體而產生匯集之載體基因庫(說明於第12 圖）。此載體基因庫具有多種可變區編碼序列對之多樣性。 本發明之-觀點侧於經連結之可變區編碼序觸源對之基因庫。較佳地 庫之侧朗源對包括免疫球蛋白輕鏈可變區編碼序顺重鏈可變區編 另-較佳之同源對基因庫包括經連結之Μ區編碼序列，其中個別的m 二=序^|包括_可魏編碼相與$鍵可籠編碼序列及
變區編碼序列與5鏈可變區編碼序列。 7趟J 且針ί ί 之可變__ _切-基因庫 的可編碼崎欲之結合專—I較佳地這些同源對包括經連結之 、殳，’蛋白輕鏈可變區與重鏈可變區編碼序列，Tc 編碼相及/或Μ 7鏈可變區⑽可變區編碼序列。U鏈舊 源對施例係'"子_基因庫其係選自本發明所述之可變區編碼序列同 ^發明讀佳具體實施_編碼完整之免魏蛋自 Ϊ〇2 IgG?f：f ^ ^ ^ igW IgG3、IgG4、或 igM 類 e 庫。本發明之另-較佳特徵係編碼可溶及穩定之M同源對之基因庫或子—基因 6048-6508-PF;Chiume〇w 37 104、to，、明^^徵係該基因庫之多樣性，其係由至少5、10、20、50、100、1咖、 、或10種不同的同源對所組成。 係获又—具體實施例中，該經連結之可變區編碼序列同源對之基因庫 筛^及^t文所述之步驟的方法而獲得。此基因庫亦稱為母基因庫。 係單法中之—者所得之經連結之可變區編碼序列(該序列 的，尤复伟二其⑽母土因庫可代表結合蛋白之多樣性，其中有些為無意義 了針對特定標的產生具有結合專一性之多樣性子集。 厍八 樣性者===少Γ機連結之可變區之基因庫之多 進行標㈣，由同源對組成之基因庫 之方ί發具體實施例巾，產生該經連結之可編碼序騎之基因庫 座，μ進純括藉由挑選該經連結之可變區序列對之子集建立一子-基因 編碼編碼出具有所欲之標的專—性之結合蛋白f。此經連結之可變區 柄序列之挑選，亦稱為標的_專—性同源對之基因庫。 變[ 庫轉ί===Γ將-專，源對基因 #八^=法普，用於挑選標的-專一性之免疫球蛋白可變區編碼序列。此 法已知於技藝中且包括例如ELIS顺、EUSA、 =直上接之:= 體呈現太枝糖體呈:/ίί ’該免疫分析法可結合下列擴增方法，例如嗟菌 ，核糖體呈現、細菌表面呈現、酵母菌呈現、真核細胞病毒呈現 K. 2000. DrugDiscov oday 5, 253-258)-起進行。如第1G圖所示，可將同源以 · 源完整之抗體表現基JHJ庫兩者進行_，因而產生雜選殖之子-基^ = #選分析法及擴增程序亦適用於經連結之可變區的組合基因庫。土 本發明之較佳具體實施例中，藉由使用高_量筛選 同源對之子-基因庫或可變區編碼序列之組合對之挑選^ 為，但非限於，以半自動或全自動設備進行之EUSA分析法。亦可為膜分析法。， 6048-6508-PF;Chiumeow 38 1333977 自動挑選且網格狀排列於環脂培養皿之頂端之適當的膜上而產生 -塗霜夕1結ΐ分子之選雜之陣列。該分子經由膜分泌至下面第二層經抗原 结扯。、.，〜射各卿影且驗朗可騎欲標的分泌抗縣合分子之選 者 eWUdt，R.M.等人 2000· Nat. Biotechnol. 18，989-994)。 二同雜之子基因庫或抗原_結合株之組合雜適當之麟挑選後， ^由經連結之免疫球蛋白輕鏈可變區及重鏈可變區編碼序列之腿定序進行 7 析。首先，此驗定序可提供關於基因庫多樣性之資訊例如種源 =nnline 〇rigin)、家族分布以及⑽區中之突變。此等分析有助於挑選出 爾除重複之選雜。第二，腿定序可揭露於單 當^可變區編碼序列時，評估—突變是否可接受時需考量三種突變形 t l㈣子之交互-引導所產生最常見之突變形式，其"基因之引子 代自疋：v基因家族中錯誤之子集。所引入之改變主要係於特定位置取 2、'發生之㈣子。由於v基因家射相之高度她性 =保留性且可接受找變；⑴由家族削仅交互— 财= 地史ί時^有，，"之對應部分。此等改變可能會藉由產生出新的表位而潛在 =響可魏之料雜。鱗改射㈣地顺从接著使 t 自基因庫排除；出）由τ叫眶聚合酶產生之錯誤 =最谷易於H編碼序财辨識出且可輕易地_LTaq所引起之突變 2出現於可_編碼序列，此處該突變無法由自然產生之細胞體突變中區分 ί可魏編碼序财賴錢接著綺魏挑選之結 此等ίΐ 性的僅崎定方式影響特定配對，顯科合理的忽視 再者’該序列分析可用於識別同源對基因庫中之雜亂程度。 如實施例9所述，當利用煉合至可變區編碼序列之領導序列之引子以取代 煉合至可變區之5區之引子時’可避免詳述於改⑴#之突變的存在。 物表赚中。此等轉移侧詳述於====== 6048-6508-PF;Chiumeow 39 1333977 =體。糾哺乳動物·之完麵抗體表現基因庫進行篩選就不需要此等轉 產生’該母基因麵射有淋巴細胞之細胞分液所 俘唾挑二二ηέΤ擴，°構成該母基因庫之經連結之可變區編碼序列對 械㈣，自咖職咖鍵組成其 =碼出具有所欲之標的專-性之結合蛋白質 因庫。抗原-專-性Τ細胞受體可葬*下別f 王⑽m、，且口對之子-基 Τ Γ ： ，Callan, M.F. f Λ 104 'r63 R6^ ^ ,18^1395~14〇2； N〇Vak> E.J.^A 1999. J. Clin. Invest 104, R63-R67)，藉由測罝呈IL-2形式釋出之細胞反 如酵母g或反轉路縣呈職術。 例 宿主細胞及表現作用 本發明之基轉可赫至顧巾，賴_合表現及生錢編碼自 之有興趣之核酸序狀蛋白質，尤其係含有結合蛋㈣或其片段之可變區。此 等載體係詳述於倾及顧名-節中，且可提供例如完整之抗體、触片段、& 片段、scFv片段、膜結合或可溶性TcR或選擇之種類的TcR片段之表現作用。 本發明之-特㈣將基因庫或經連結之可籠編碼序狀同源對之載體之 子-基因庫或編碼經連結之可變區編碼序列之同源對之單一選殖株引入至宿主 細胞，以進行增幅作用及/或表現作用。宿主細胞可選自細菌、酵母菌、其他真 菌、昆蟲細胞、植物細胞、或哺乳動物細胞。為了表現之目的較佳者為^乳動 物細胞，例如中國倉鼠卵（CH0)細胞、C0S細胞、BHK細胞、骨髓癌細胞(例如， Sp2/0細胞、NS0)、NHI 3T3、纖維母細胞或永生化之人類細胞例如細胞、 HEK 293 細胞、或 PER.C6。 " 可藉由為熟於此技藝者所知悉之許多轉形或轉染之方法將載體引入至宿主 細胞中，該方法包含磷酸釣沉澱法、電穿孔作用、微注射法、微脂粒融合、RBC 空骸細胞融合(RBC ghost fusion)、原生質體融合、病毒感染等。單株完整之 抗體、Fab片段、Fv片段以及scFv片段之產生亦為已知。 治療用重組多株抗體之生產係相當新穎之領域。重組多株製造技術已說明 於PCT申請案W0 2004/061104。簡言之，此技術涉及產生大量之細胞，適合如 製造細胞株。接著該技術係說明製造同源對基因庫，然而其僅應用組合基因庫。 40 6048-6508-PF;Chiumeow 1333977 該大:E：細胞中之個別的細胞可表現例如來自同源對基因庫之不同之重組多株結 合蛋白質之成員。為了確保該個別的細胞表現該多株結合蛋白質之單一同源對 而非數個同源對，將編碼該同源對之核酸序列引入至各個別的細胞之基因體中 的單一位置-特定位置。此為該大量細胞之重要特徵，因為此法可防止由各細胞· 表現之重及輕鏈混雜在一起，亦因為其產生之細胞實際上彼此相同，除了於個 別的同源對之可變區上微小的差異外。此特點可使該大量之細胞於生產所需之 時間中無偏差的生長。為了確保單一位置-特定整合，應使用只有一個整合位置. 之佰主細胞株，此等細胞可由商業上購得例如Invitr〇gen之CH〇 jqp_in細胞 其含有單一 FRT位置。適合此細胞株之載體含有相對應之FRT位置且係使用FRT 重組酶引入至基因體中。其他已知之數種重組酶例如Cre、々—重組酶、Gin、pin、
PinB、PinD、R/RS、又整合酶、或噬菌體φ(：31整合酶，可與其相對應之重組位，馨 置組合使用。再者，該適當的載體含有挑選標記以挑選該位置—特定性之整合物。 可藉由數種不同之轉染以及製造策略自此等細胞株得到多株製造細胞株之 產生以及重組多株蛋白質之生產。 其中一方法係使用混合成單一組成物之載體基因庫，對每個具有單一整合 位置之宿主細絲進行轉染。此方法稱為大量轉染(_ transfecti〇n)或大量 中之轉染（transfecti〇n in bulk)。一般，前述設計之載體及宿主細胞可確保 於適田的挑選下知到無偏差生長之多株細胞株。於開始製造重組多株蛋白質前 將產生多株細胞株之冷凍備料。 另方法係使用分成分液之載體基因庫進行轉染，該分液含有約5至5〇個 個別的載體組成基因體組成物^較佳地，該基因庫之分液包括lQ至2q個個別 的載體。織將各域物轉染錄等分之宿主細胞。此方法稱為半-大量轉染 (semi-bulk t_fectic)n)。經轉染之等分數目係根據基因庫之大小以及各分 液中個別的載體之數目。若該基因庫包含例如1〇〇個不同同源對，將其分成含 有20個不同成員之組成物之分液，故需要5等分之宿主細胞俾以由不同之原本-f因庫之^液構狀基因庫喊物進行。等分之宿主細胞細位置特定整 :作=進行挑選。較佳地’不同的等分係分開挑選。然而，其於挑選前亦可匯 ?在-起。分析各等分之選殖多紐且僅將具有足夠之多雜者齡生產多株 7源對基因庫備料。為得顺造狀所欲之多株細麟於生產冷;東之備料前 可將各等分混合’或於其自備料巾取得後或於短暫之增殖以及適應時間後立即 6048-6508-PF；Chiumeow 41 1333977 知到製造用之所欲之多株細胞株。視需要，於生產過程_分開保存該等分之細 胞’以及該乡株蛋白質减物係藉由組合各等分之產物而料在—倾非於生 產前組合該等分之細胞。 ' 第三種方法係高量之方法其中宿主細胞係分別使用構成該同源對基因庫之. 個別的載體進行轉^此方法麟侧的機。侧_染㈣主難係分別. 以位置特定性整合作用進行挑選。於挑選時產生之個別的細胞選雜可進行有 關增殖時間之分析以及較佳地，將具有相似之生長速率者用於產生多株同源對_ 基因庫備料。可將個別的細胞選殖株混合而於產生備料前得到所欲之多株細胞 株’或於其自備料中取得後立即得到所欲之多株細胞株，或於短暫之增殖以及’ 適應時間後立即得到得到所欲之多株細胞株。此方法可消除於轉染、整合及挑 選過程中任何可能之殘餘的序列偏差(sequence bias)。或者於進行挑選前將個_ 別經轉染的宿主細胞混合，此可控制於轉染過程中產生的序列偏差。 上述之製造策略中的制特徵係構成該重組錄蛋白#之_的同源對可 =於-個，或有限數量之生物反應器中。唯—的差異係用於產倾構成多株 製u細胞株之大量細胞之所選擇之階段。 對之宿主細胞群，其具有經連結之可變區編碼序列 心、又:具體實酬巾，雜主細麟具有得自料離之單—細麟(淋巴細胞
ί田庫，該基因庫係利❹重RT-PCR增幅作用接著藉由接合作用或重 =7進行触或者湘本發明之乡重重疊姻RT—PGR猶，_ 變區編碼序 本發明之另-具體實施例係-宿主細胞群，其具有經連結之可 列對之組合基因庫或子-基因庫。 ° —根據本發明，宿主細胞群包括多樣的細胞群相#於經以多樣性之基因庫 行轉形/轉染之細胞。較佳地，細胞群中之各細胞僅具有整個同源對基因庫 以及同源對基因庫之個別的成員不超過由宿主細胞群所表現之個 另J的成員總數之50%、更佳為不超過25%、或最佳為不超過1〇%。 本發明之雛具體實酬巾，該宿主峨聯哺乳動物細胞。 ⑽之宿主細麟可驗表現纽之錄結合蛋白f，輯族群中之個別 的、，田胞構成不同多樣性之可變區編碼序列。 42 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977 本發明之一具體實施例係由具有載體之基因庫之宿主細胞群所表現之重組 之夕株蛋白質，該載體可編碼多樣性之經連結之可變區編碼序列之同源對，其 中該基因庫係藉由本發明之方法而得。典型地，本發多: 質組成。 本發明之較佳具體實施例係一重組多株免疫球蛋白，該免疫球蛋白係由具 有載體之基S1庫之宿主細胞群所表現，該載體可編碼多樣性之重鏈可魏及ς 鏈可變區編碼序列之同源對。 1 本發明之另一較佳具體實施例係一重組多株TcR，該TcR係由具有載體之基 因庫之伯主細胞群所表現’該載體可編碼多樣性之與⑽可變區編碼序列連結 之TcR 〇：鏈及/或與5鏈可變區編碼序列連結之Μ γ鏈之同源對。 _ 本發明之另-具體實施例係適合生產單株蛋白質之宿主細胞。尤其係由輕 鏈可變區與重鏈可變區之同源對組成之單株抗體或由α可變可變區或占 可變區與r可魏之同源對組成之單射咖此等單株生產細麟較佳 人 瘤細胞枝。 此等單株抗體或TcR可藉由將下列步驟添加至連接數個有興趣之非-連續性 核脊酸序列之方法中而予以產生a)將該經連結之核酸序列插入至載體中；_ ，載體引人至宿主細胞；c)於適合表現之條件下培養該宿主細胞；以及幻自唾
=該宿主細财之讎得_表狀蛋Μ。較佳地，舰引入宿主細 中之載體可編碼該可變區編碼序列之個別的同源對。 本發明之應用 本，明之-主要的應祕連接可變區編碼序列之同源對，尤其係免疫球蛋 2重及輕鏈可變區編碼序列或TcR讀沒鏈以及鏈可變區編碼序列，藉 由问1法以產生同源對基因庫。除了產生同源對基因庫外，藉由對基因多樣性 =田胞群、得自此等細胞群之細胞溶胞產物、或自此等細胞群純化之腿實行 —發明之多重RT-PCR接著藉由接合作用或重組作用進行連接或者使用多重重疊 -延伸RT-PCR技術以產生組合基因庫。此等基因庫中之一基因庫、子基因庫、 或單-選殖株可幫助多株或單株蛋白質之表I尤其可 到單株或多株抗體。 w 轉甲仔 已知重組單株抗體可用於診斷、治療、以及獅^本發明產生之重組單 6048-6508-PF;Chiumeow 43 ΪΓ體其應用與由現存技術所產生之抗體產物相同。尤盆，包括以多枝 蛋白為活性成分，與至少—種醫藥可接受之 物，可藉由本發明之方法予以製造。較佳者為醫藥 醫樂.、·且成 蛋白係由可魏編解列之同源對所組成 =重』免疫球 物可作為藥劑。該組成物之多株重組免疫球t·组成 專一性或反應性’因此該組成物可用於治療、預‘二二有 1疾病、自體免疫疾病、免疫機能不全、心血f疾病'中樞神 謝及内分泌疾病、移植之排斥作用、或非所欲之懷孕。 ，、…、病代 本發明具有H知之單株組合式抗難術無法獲得之進—步顧 辨=或完全未知之保護性抗物她ctive antigen)，例如新興疾^， 之情形下’可篩選出對該赫提供倾作用之單株抗體。 傳杂疾病 ^而，本發明可直接自具有已建立之蔓性抗體反應之捐贈者(例如康復中 之Ί)取得抗體-表現細胞，以及此等個體之起始物質產生免疫球蛋 及輕鍵可變區編碼序列同源對之基因庫。 槿產已知之病毒但保護性抗原係未知之情形下，可對該病毒之抗原結 in應性的同源抗體基因對之子-基因庫。若重組多株抗體係由此 子-基因庫產生的，其可能含有保護性抗體。 π古ίΐΐ未知之抗原之情形下，可以與現今伽高度免疫之免疫球蛋白之相 2式使用付自例如康復中之病患之同源對基因庫所產生之重組多株抗體。此 該同源對可確保所產生之重組多株抗體與康復中之病患的抗體免疫反應< 非系相似β 本發明所述之連接可變區同源對之技術的另_顧係驗賴及分析之目 的曰對病患投予藥劑時’總是存在著對該藥劑產生免疫反應之可能性。此致 免疫性可藉由習知技術加崎估，例如__專—性結合分析，其血清或血毁係 取自經該藥劑處理過的個體。或者，本發明之方法可藉由單離可變重鍵及輕鍵 編碼序列之同源對而聽快速反映經投予該_後病患之免疫反應、然後由自 此基因庫表現之蛋白質"選出__或該藥劑之成分具有反應性者。若血 衆或血清巾該_之存在會干擾習知方法時制適合使用此方法。此等藥劑係 例如抗體。習知方法中，與抗體治療相關之抗_藥劑免疫反應之鑑奴例如抗-獨 6048-6508-PF；Chiumeow 44 用二.&1 j1G)typle)、t骨架(anti_framewQrk)或抗-Fe紐反應)要等到所 療之抗體完全自錢巾清除後才可進行。以本㈣之方法，編碼此尊尸- =另1可，個體以藥艇療後之數星_進行單離及分析。因此，1 ."、種汗估-般藥物且尤其係以抗體為主之藥物之致免疫性的方法。 別有i發係疫苗與免疫計晝之確認以及比較。此於發展疫苗時特 對新箱之抗體結錢和力及血清力價之啸外，其可評估及比較 — ' 、、史田生反應之抗體反應之序列多樣性。再者，在監督群體中疫 田功效上本發明可用於分析、監測及比較抗體反應。 蔹去ίΐΓί魏在包含結合蛋白質之可變區領域外之應用^其難熟於此技 «者〇改本發明觸示之技鶴其聽連結二❹經轉錄之贿酸序列之最佳 核巧序列編碼除結合蛋白質外之雜$蛋白質。連接此種編碼雜聚 ^白質之域或次早7〇之序列可有觀單離此等蛋自質編碼序姻為其可減少相 ¥之步驟數再者其可藉由僅使用多重引子混合物/多重重疊-延伸引子混合 物之-者單侧如此等蛋白f之拼接變異物(spli⑺如㈣、突變或新的家 族成員。 亦可連接編碼單-蛋白質之遠親域(distant dQmain)之序列^此技術可易 於研究關於具有多重域之蛋白f中特定域之重要性，因為其易於刪除中間域 (intermediate domain) ° 產生嵌合或偶合蛋白質亦為本發明可應用之領域。即使欲連結之蛋白質係 來自不同來源，例如人類與小鼠蛋白質之嵌合物，_本發明時於逆轉錄前將 該細胞混合。此等細胞混合物係由各種族之細胞群或各種族之單一細胞所構成。 [實施例]
實施例1 :二步驟多重重疊-延伸RT-PCR 此實施例中，使用衍生自經單離之單一細胞作為模板進行逆轉錄(RT)以及 將產生之cDNA作為多個多重重疊-延伸pcr之模板。 a.細胞 使用 Flp-In技術（Invitrogen，Carlsbad, CA，USA)產生可表現 lgGl-/c之 中國倉鼠卵(CH0)細胞株。 根據Flp-In表現載體(PCDNA5/FRT)構築IgG-/c哺乳動物表現質體載體 pLL113(第4圖）。依照製造商之說明手冊使用Lipofectamin2000(Invitrogen， 45 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977
Carlsbad，CA，USA)將CHO-Flp-In細胞以含有抗體編碼基因之pLul3與Flp 重組酶之瞬間表現載體p〇G44進行共轉染。挑選轉形株以及藉由免疫分析證< 可產生/c。將經挑選之細胞株命名為CHO Flp"~ln pLLl 13，以及保持於補 充有2mM L-麵酿胺、10% FCS以及900濕徽素B(保持於培養基中）之s · 培養基。 使用胰蛋白酶採收CHO Flp-In pLL113細胞且以保持培養基洗滌3次。細 胞經最後一次洗滌後將其再懸浮於原來體積之保持培養基中。使用以外—丨系統 (Scharfe System GmbH, Reutlingen，Germany)決定細胞濃度且以保持培養基 進行稀釋將濃度調整為1細胞/5 //1。 1 b.逆轉錄 將平均含有一個細胞之CHO Flp-In pLL113細胞懸浮液分配至96-孔PCR盤· (Thermo-Fast 96，具有裙邊之 AB-0800，ABgene，Epsom, Surrey, 111〇之單一 個孔中。 藉由根據 Qiagen One-Step RT-PCR 實驗規則（Qiagen 〇neSt印 RT-PCR Kit，
Cat# 210210，Hilden，Germany)利用逆轉錄酶(RT)由經分配之細胞合成cdna。 各孔中含有下列試劑，總體積為20# 1 : 1 X One Step RT-PCR 緩衝液， 各種dNTP，各最終濃度為imM， 5pmol 之 〇lig0 聚-dT (18)， 26U 之 RNase 抑制劑（RNasin，Promega，Madison USA, cat. No N2111)，鲁 2以1之One Step RT-PCR酵素混合物，以及 5以1之CHO Flp-In pLLl 13細胞懸浮液。 將反應混合物於55°C下培養30分鐘進行RT反應。接著將反應混合物於94 -
C下培養1〇分鐘使逆轉錄酶失去活性。 c.多重重疊-延伸PCR 將步驟b)產生之cDNA產物之分液作為多重重疊-延伸PCR之模板《反應係 於96-孔盤中進行。 各孔中含有下列試劑，總體積為4〇；fzl : 1 X One Step RT-PCR 緩衝液， 各種dNTP ’各最終濃度為5〇〇#m， 6048-6508-PF；Chiumeow 46 1333977 多重重疊-延伸引子混合物，其濃度如表1所示， 26U 之 RNase 抑制劑（RNasin，Promega，Madison USA, cat. No N2111)’ 2/z 1之One Step RT-PCR酵素混合物，以及 1/zl之cDNA模板(衍生自單一細胞（步驟b))。 所使用之多重重疊-延伸引子混合物包括表1所示之引子。 表1
引子 名稱 濃度 序列 識別號 5’至3’方向之引子序列 1 agcctatactattgattaggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCART 2 agcctatactattgattaggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT 3 agcctatactattgattaggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGT Vu At 〇ΠηΜ 4 agcctatactattgattaggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAG VH 5 agcc tatacta11ga11aggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGT 6 agcctatactattgattaggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT 7 agcctatactattgattaggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGT 8 agcctatactattgattaggcgcgccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC Ch ΙΟΟηΜ 9 GACSGATGGGCCCTTGGTGG 10 cgcctaatcaatagtataggctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCT 11 cgcctaatcaatagtataggctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT Vl JL 9finM 12 cgcctaatcaatagtataggctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT 13 cgcctaatcaatagtataggctagccGATATTGTGATGACCCACACT 14 cgcctaatcaatagtataggctagccGAAACGACACTCACGCAGT 15 cgcctaatcaatagtataggctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT Cl a； ΙΟΟηΜ 16 atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTG W=A/T，S=G/C，R=A/G。大寫之序列相當於基因-特定區。 採用 96-孔 MffG Primus HT 核酸增幅儀（thermocycler)(MWG Biotech AG， Ebersberg, Germany)以下列循環條件進行反應： I 50次循環
變性 煉合 延伸 最終延伸 d.巢式PCR
30 秒 95°C 30 秒 50°C 5分鐘 72°C 10分鐘72°C 以該多重重疊-延伸產物作為模板進行巢式PCR。反應係於96-孔盤中進行。 各孔中含有下列試劑，總體積為50以1 : 6048-6508-PF;Chiumeow 47 1333977 1 x BioTaq緩衝液， 各種dNTP，各最終濃度為400βΜ， 2mM 之 MgCh， 巢式PCR引子混合物， 1.25U BIOTAQ DNA 聚合酶(Cat· No BIO-21040, Bioline，UK)，以及 lAl之多重重疊-延伸PCR產物（步驟c)。 所使用之引子如表2所示。 表2
引子 名稱 濃度 序列 識別號 5至3方向之引子序列 17 atat tctcGAGACGGTGACCAGGGTG Jh 各ΙΟΟηΜ 18 atattctcGAGACGGTGACCATTGT 19 atattctcGAGACGGTGACCAGGGTTC 20 atattctcGAGACGGTGACCGTGGT Cl« ΙΟΟηΜ 21 accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT 大寫之序列相當於基因-特定區。 採用 96-孔MWGPrimus HT核酸增幅儀(MffG Biotech AG，Ebersberg, Germany) 以下列循環條件進行反應： 變性 30秒 95。(： Λ 煉合 30秒 5(TC , 25次循環 延伸 90秒 72。〇 最終延伸10分鐘721 將巢式PCR產物藉由1%環脂凝膠電泳分析並使用溴化乙疑（ethidi咖 bronide)進行檢測（第5圖）。該重疊_延伸產物之預期大小為薦如。此等產物 可於欄卜5、6、7、8、及12由箭頭所指處發現（第5A圖）。實中 對照受到污染且於樣本中亦出現類似之污染。第5B圖^/=不= 片段對本實驗係有意義的。 w 本實驗闡明-種進行二步驟多重重疊—延伸pcR 一細胞之模板。再者，盆顯示佶田士。她00 ，、你扪用何生自
個多重重疊-延伸PCR Γ 早離之早一細胞產生之趣可進行約‘ 實施例2 :單一步驟多重重疊—延伸RT_pcR 6048-6508-PF：Chiume〇w 48 ^333977 此實施例中逆轉錄與多重重疊-延伸PCR係於單一步驟中進行，其使用經溶 解之細胞作為模板，該經溶解之細胞相當於1〇〇、1〇、或1個細胞。 a, 細胞 自美國菌種中心取得可產生抗—破傷風jgQ—K抗體之人類融合瘤細胞株. HB-8501且培養於含有10%胎牛血清之依考易氏經調整之杜貝可培養基 (Iscove s Modified Dulbecco· s Medium) (Vitacell, Kiev, Ukraine, cat.
No 30-2005)。於進行多重重疊-延伸RT_PCR前，採收細胞，計算細胞且冷凍於 -80°C，培養基中其濃度為200個細胞/从1。
b. 單一步驟多重重疊-延伸RT-PCR 實際上依照製造商之建邊使用Qiagen RT-PCR套組(Qiagen cat.
No 210212，Hilden，Germany)進行多重重疊-延伸RT-PCR。在加入PCR管中之籲 前，將細胞溶胞產物解凍以及以ΗΛ稀釋製成相當於每5以1含100、l〇、1個細 胞之溶胞產物濃度。 各PCR管中含有下列試劑，總體積為5〇yl : 1 X One-Step RT-PCR 緩衝液， 各種dNTP，各最終濃度為400/zM， 多重重疊-延伸引子混合物，其濃度如表3所示， 2以1之One-Step RT-PCR酵素混合物， 50U 之 RNase 抑制劑（RNasin，Promega, Madison USA, cat. No N2515)， 以及 癱 5/z 1經稀釋之細胞溶胞產物。 所使用之多重重疊-延伸引子混合物包括表3所示之引子。 表3
引子 名稱 濃度 序列 識別號 5’至3’方向之引子序列 Vh 各 40nM 22 gctagcattattattaccatggccCAGRTGCAGCTGGTGCART 23 gctagcattattattaccatggccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT 24 gctagcattattattaccatggccCAGRTCACCTTGAAGGAGT 25 gctagcattattattaccatggccSAGGTGCAGCTGGTGGAG 26 tattggcgcgccatggccsaggtgCAGCTGGTGGAG 27 gctagcat ta11a11accatggccCAGGTGCAGCTACAGCAGT 28 gctagcat tat tat taccatggccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT 6048-6508-PF;Chiume〇w 49 1333977 29 gctagcattattattaccatggccGARGTGCAGCTGGTGCAGT 30 gctagcattattattaccatggccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC 31 atattctcGAGACGGTGACCAGGGTG Jh 各 200nM 32 atattctcGAGACGGTGACCATTGTCC 33 atattctcGAGACGGTGACCAGGGnC 34 atattctcGAGACGGTGACCGTGGTCC 35 ccatggtaataataatgctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCT 36 bcatggtaataataatgctagccGATGTTGTGATGACrcAGTCr Vl 各 40nM 37 ccatggtaataataatgctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT 38 ccatggtaataataatgctagccGATATTGTGATGACCCACACT 39 ccatggtaataataatgctagccGAAACGACACTCACGCAGT 40 ccatggtaataataatgctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT Cl/c 200nM 16 atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTG W=A/T ，S=G/C R=A/G 。大寫之序列相當於基因-特定區。
使用下列循環條件進行反應： 逆轉錄： 30分鐘 55〇C 聚合酶活化： 15分鐘 95〇C 使逆轉錄酶失去活性 PCR反應： 變性 30秒 94〇C ' 以及活化Taq聚合酶 煉合 30秒 44〇C >. 50次循環 延伸 3分鐘 72t 最終延伸 10分鐘 12°C 取10Vl之反應產物藉由1.5%瓊脂凝膠電泳分析並使用溴化乙錠進行檢測 (第6A圖）。 該片段之預期大小為（確實的大小係根據可變區之長度）：
Vh : 410bp LC : 680bp 重疊-延伸片段：1070bp 於所有細胞溶胞產物之稀釋物中可見到移動性相當於重鏈可變區（Vh)及輕 鏈可變與固定區（LC)長度之分離的DNA片段。於1〇〇及10個細胞之溶胞產物中 可見到移動性相當於推定之重疊-延伸片段而強度較弱的片段。雖然於原本之凝 膠上可見到一個細胞溶胞產物樣本之重疊—延伸片段，但難以確認（參見第6八圖 6048-6508-PF;Chiumeow 1333977 所示之照片及第6B圖之素描圖中箭頭處）。 c.鑑定該重疊-延伸片段 自如上述複製之實驗驗證該重疊-延伸寬帶之存在。從相當於1個細胞之樣 本欄中及相當於100個細胞之樣本棚中將約1070bp附近的瓊脂凝膠區割下來且 使用 Qiaex II(Qiagen cat. No 20051，Hilden，Germany)純化 DNA 以及以 20 “1之水洗提》 依照製造商之說明手冊取1#1之洗出液以推定之重疊-延伸片段兩側之引 子（Jh引子相當於序列識別號32至35以及0«引子相當於序列識別號：17,各引 子之濃度為0.5 μM)進行PCR。循環參數為：
變性 30秒 95°C 煉合 30秒 55°C > 30次循環 延伸 1分鐘 72°C , 取10^1之各反應產物藉由1%瓊脂凝膠電泳分析並使用溴化乙錠進行檢 測。可看見數個片段包含’於1及100個細胞之樣本欄中，可看見具有所預期 之重疊-延伸片段之移動性之片段（第6C圖中箭頭處）。將相當於1個細胞之樣 本攔中lkb位置之片段處之凝膠割下來且如上述使用Qiaex進行純化。將經純 化之片段以限制酵素Nhel及NcoI(分開地)切割以及將反應產物藉由1%瓊脂凝 膠電泳分析並使用溴化乙錠進行檢測（第6D圖）。這些限制位置係位於仰與LC 間之重疊處而切割後之預期大小分別約為410與680bp長（第2圖）。該Nhel切 割作用不完全因為較大之片段仍存在於其原本大小的位置。
實施例3 :組合單一步驟多重重疊-延伸RT-PCR以及巢式PCR 此實施例中，逆轉錄與多重重疊-延伸PCR係於單一步驟中進行，接著進行 半-巢式PCR增幅作用，其使用經溶解之細胞作為模板，濃度相當於⑽、1〇、 或1個細胞。
a·單一步驟多重重疊-延伸RT-PCR 如實施例2所述利用多重重疊-延伸引子混合物（包括表4所示之引子)使用 HB-8501細胞溶胞產物進行多重重疊-延伸rt-PCR。 表4
引子 名稱 濃度 序列 識別號 5 ‘至3’方向之引子序列 Vh 各 40nM 41 J 1 1 一 - - tatxggcgcgccatggccCAGRTGCAGCTGGTGCART 6048-6508-PF;Chiumeow 51 1333977 42 tattggcgcgccatggccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT 43 tattggcgcgccatggccCAGRTCACCTTGAAGGAGT 44 tattggcgcgccatggccSAGGTGCAGCTGGTGGAG 45 tattggcgcgccatggccCAGGTGCAGCTACAGCAG 46 tattggcgcgccatggccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT 47 tattggcgcgccatggccGARGTGCAGCTGGTGCAGT 48 tattggcgcgccatggccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC 49 AAGTAGTCCTTGACCAGGCAGCC 取引子 50 TGAGTTCCACGACACCGTCA ChI-5 之一各 51 AGAGGTGCTCTTGGAGGAGG 200nM 52 AGTTTTGTCACAAGATTTGGG 53 GTTGCAGATGTAGGTCTGGGTGC 54 gccatggcgcgccaatagctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCT 55 gccatggcgcgccaatagctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT Vl 各？ΠηΜ 56 gccatggcgcgccaatagctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT uV/lUVl 57 gccatggcgcgccaatagctagccGATATTGTGATGACCCACACT 58 gccatggcgcgccaatagctagccGAAACGACACTCACGCAGT 59 gccatggcgcgccaatagctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT Cl/c 200nM 60 atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAA W=A/T ’ S=G/C R=A/G 。大寫之序列相當於基因-特定區。 應注意各多重重疊-延伸引子混合物中只使用Cni-5引子中之一者，因此造成 五種不同的多重重疊-延伸引子混合物。
其餘參數如實施例2之多重重疊-延伸RT-PCR反應中所述，僅將煉合溫度 改為50°C。使用相當於100、10、1、及0個細胞之溶胞產物分別以各重鏈固定 區反置引子(Chi、Ch2、Cra、Cim、Ch5，分別相當於序列識別號·· 49至53)進行反應。 b.半-巢式PCR 取1 //1之多重重疊-延伸RT-PCR反應產物進行半-巢式PCR(Biotaq套組， . Bioline，UK cat. No BIO-21040)，實質上係依照製造商所提議之方式。反應 之總體積為50以1。所使用之引子如表5所示。 ' 表5
引子 名稱 濃度 序列 識別號 5 ‘至3’方向之序列 Jh 各 200nM 61 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCC 62 ggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCC 63 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCC 6048-6508-PF;Chiumeow 52 1333977
64 ggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC Cl/c 200nM 21 accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT 大寫之序列相當於基因-特定區。 循環條件如下：
變性 30秒 95〇C ' 煉合 30秒 50°C ^ 25次循環 延伸 1.5分鐘 72〇C J 最終延伸 5分鐘 72〇C 取10"1之各反應產物藉由1.5%瓊脂凝膠電泳分析並使用溴化乙錠進行檢 測（第7圖）》 自瓊脂凝膠上切下所推定的重疊-延伸片段，該片段得自相當於一個細胞溶 胞產物之半-巢式PCR且其於第一個反應中係使用CH4引子（參見第7圖之箭頭 處），使用 Qiaex II 套組(Qiagen cat. No. 20051，Hilden，Germany)進行純 化以及使用 Invitrogen TOPO ΤΑ 選殖套組（Invitrogen cat. No 45-0641, Carlsbad, CA，USA)將該片段插入pCR2.1-T0P0。將插入物之8個選殖株進行定 序且其中7個顯示出係由連結至輕鏈可變及固定區之重鏈可變區構成，該連結 係藉由預期之重疊區而達成。 總之’多重重疊-延伸RT-PCR與半-巢式PCR之組合的敏感度令人非常滿 意’5個固定區引子中有4個引子可自相當於單一細胞之溶胞產物中增幅出顯著 量之重疊-延伸產物。
實施例4.使用經擴增之人類B淋巴細胞作為模板來源且組合單一步驟多重重疊 -延伸RT-PCR以及巢式PCR 此實施例中，逆轉錄與多重重疊-延伸PCR反應係於單一步驟中進行，接著 進行半-巢式增幅PCR ’其係使用經單離單一人類b淋巴細胞作為模板來源。 a. B-細胞之單離 將人類男性捐贈者以破傷風類毒素進行免疫。於免疫化6天後自捐贈者採 集 120ml 之血液樣本且使用 Lymphoprep(Axis-Shield，Oslo Norway，prod. No. 1001967)根據該製造商之使用手冊單離出週邊血液單核細胞(ρ·)。利用磁珠 細胞分類將CD-19陽性之細胞群擴增。以FITC-共軛之抗CD-19抗體將PBMC染 色（Becton Dickinson, NJ，USA, cat. No 345776)。根據該製造商（Miltenyi 53 6048-6508-PF;Chiumeow 1333977
Biotec，Gladbach，Germany，cat. No 130-042-401)之使用手冊使用抗-FITC- 共軛之磁性微珠進行磁珠細胞分類以及進行管柱純化作用。將細胞以含有2nM EDTA及0. 5% BSA之PBS稀釋成每毫升含有2〇〇個細胞之濃度。將5/ζ 1之經稀 釋之細胞分配至PCR試管中可得到每管約有單一個細胞。將試管儲存於-8〇<t直 到欲使用時。
b.多重重疊-延伸RT-PCR及半-巢式PCR 進行多重重疊-延伸RT-PCR及半-巢式PCR之條件如實施例3所述。然而， 僅進行多重重疊-延伸引子混合物中G引子為相當於序列識別號：51之0«之反 應。自各個半-巢式PCR反應中取1〇"1進行1%壤脂凝膠電泳並使用漠化乙錠進 行檢測以分析多重重疊-延伸RT-PCR及半-巢式PCR反應之16個樣本（第8圖）。 如第8圖所示，16個樣本欄中有2個樣本欄（第5及6欄）包含具有所預期· 之移動性之片段（約lkb)。再者，第2欄於所預期之移動性處含有強度較弱之片 段。自瓊脂凝膠上切下第5及6欄中lkb之片段，且使用Qiaex 11套組(Qiagen cat. No. 20051)進行純化以及使用 invitrogeriT〇p〇TA 選殖套組（Invitrogen cat. No 45-0641，Carlsbad，CA，USA)將該片段插入 PCR2.1-T0P0。來自各經 單離之片段的兩個選殖株皆具有正確大小之插入物。限制酶切割作用（分別為 Ncol及Nhel)顯示出具有預期大小之片段(41〇及680bp)係重鏈可變區及輕鏈可 變區與固定區編碼序列之正確的連接。 將源自第5攔之片段之兩個選殖株進行定序且顯示完全相似，表示該經連 結之Vh及LC係同源對。
實施例5 .使用Vi-專一‘陡引子以及組合單一步驟多重重疊-延伸rt-pcr以及巢_ 式PCR 此實施例中，逆轉錄與多重重疊-延伸PCR反應係於單一步驟中進行且係使. 用V,-專一性引子，接著進行半-巢式PCR反應。將自表現λ基因家族比及le 之兩種不同的細胞中純化出總RNA且與相同之重鍵可變區組合作為模板。 a.細胞 使用 Flp-In 技術（Invitrogen，Carlsbad, CA，USA)產生兩種表現 IgGi- λ之中國倉鼠卵（CH0)細胞。 基於Flp-In表現載體(pcDNA5/FRT)構築代表兩種λ基因家族之Ig(J1_又哺 乳動物表現載體 pEm465/01P581 及 pEm465/01P582(第 9Α 圖）]使用 Fugene 54 6048-6508-PF;Chiumeow 1333977 6(Roche，Mannheim，Germany)依照該製造商之說明手冊將CHO-Flp-In細胞以 含有抗體編碼基因之上述質體與Flp重組酶之瞬間表現載體p〇G44進行共轉 染。經由插入物挑選轉形株。將經挑選之細胞株命名為CH〇Flp_In/Em464/〇lp58l
&CH0Flp-In/Em464/GlP582 ’以及將細胞維持於補充有2mML-麩酿胺、l〇%FCS 以及900#g/ml之濕黴素B(保持於培養基中）之Ham，s F-12培養基中。 .
使用胰蛋白酶採收該細胞株且以保持培養基洗滌3次。使用Nucleo Spin L 套組(Macherey-Nagel，Duren, Germany)依照該製造商之說明將約l〇7個細胞進 行總RNA純化作用。該最終RNA濃度係由0D26Q測量值決定。 b.單一步驟多重重疊-延伸rt-PCR 實質上如實施例3所述使用50pg、5pg、或0. 5pg之總RNA作為模板以及包 括表6所示之引子之多重重疊-延伸引子混合物與下示之循環條件進行單一步驟· 多重重疊-延伸RT-PCR。
逆轉錄： 30分鐘 55〇C 聚合酶活化： 15分鐘 95〇C 使逆轉錄酶失去活性 PCR反應： 變性 30秒 95〇C " 以及活化Taq聚合酶 煉合 30秒 50°C 35次循環 延伸 5分鐘 72〇C , 最終延伸 10分鐘 72〇C 表6
引子 名稱 濃度 序列 識別號 5’至3’方向之引子序列 Vh 各 40nM 1 2 3 4 5 6 7 8 agcctatactattgattaggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCART agcctatactattgattaggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT agcctatactattgattaggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGT agcctatactattgattaggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAG agcctatactattgattaggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGT agcctatactattgattaggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT agcctatactattgattaggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGT agcctatactattgattaggcgcgccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC Ch ΙΟΟηΜ 9 GACSGATGGGCCCTTGGTGG 6048-6508-PF;Chiume〇w 55 1333977
65 cgcctaatcaatagtataggctagccCAGTCTGTGCTGACTCAGCCA 66 cgcctaatcaatagtataggctagccCAGTCTGTGYTGACGCAGC 67 cgcctaatcaatagtataggctagccCAGTCTGTCGTGACGCAGC 68 cgcctaatcaatagtataggctagccCARTCTGCCCTGACTCAGCCT 69 cgcctaatcaatagtataggctagccTCCTATGWGCTGACTCAGCCA νλ 各ΙΟΟηΜ 70 cgcctaatcaatagtataggctagccTCTTCTGAGCTGACTCAGGAC 71 cgcctaatcaatagtataggctagccCACGTTATACTGACTCAACCG 72 cgcctaatcaatagtataggctagccCAGGCTGTGCTGACTCAGC 73 cgcctaatcaatagtataggctagccAATTTTATGCTGACTCAGCCCCA 74 cgcctaatcaatagtataggctagccCAGRCTGTGGTGACYCAGGA 75 cgcctaatcaatagtataggctagccCWGCCTGTGCTGACTCAGC ΙΟΟηΜ 76 gccgcttattaTGAACATTCTGTAGGGGCCA V/ 八 L Λ 1 77 gccgcttattaAGAGCATTCTGCAGGGGCCA Y=C/T，W=A/T，S=G/C，R=A/G。大寫之序列相當於基因-特定區。 c.半-巢式PCR 取1 μ 1之多重重疊-延伸RT-PCR反應產物進行半-巢式PCR(Biotaq套組， Bioline, UK cat. No BIO-21040)，實質上係依照製造商所提議之方式。反應 之總體積為20 β 1。所使用之引子如表7所示。 表7 引子 名稱 濃度 序列 識別號 5’至3’方向之引子序列 61 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCC Jh 各 200nM 62 ggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCC 63 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCC 64 ggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC Cu 200nM 78 79 atatatatgcggccgcttattaTGAACATTCTGTAGGGGCCACTG atatatatgcggccgcttattaAGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG 大寫之序列相當於基因-特定區。 循環條件如下： 變性 30秒 95〇C 〕 煉合 30秒 50°C ,25次循環 延伸 1.5分鐘 72〇C > I 最終延伸 5分鐘 72t： 取之巢式產物藉由1.5%瓊脂凝膠電泳分析並使用溴化乙錠進行檢測 6048-6508-PF;Chiumeow 56 1333977 (第9B及9C圖）。箭頭所指之重疊-延伸產物具有所預期之移動特性約為丨吐。 本實驗說明表6所示之該又多重重疊—延伸引子混合物可獨立於所使用之模 板而應用於單一步驟多重重疊-延伸RT_PCR。再者，特定之重疊_延伸pcR產物 可由〇· 5pg之總RNA產生。此強度顯示出同源之經連結之重鏈可變區及輕鏈可· 變區編碼序列可自單一細胞中進行增幅。 實施例6 :產生破傷風-專一性抗體編碼序列同源對之子_基因庫 本實施例中，流程圖第1〇圖中所提出之步驟係使用破傷風類毒素(ττ)作 標的抗原進行說明。 … a.捐贈者 將先前已經過破傷風疫苗免疫化之捐贈者再次以破傷風疫苗（5乜比阳 Semm Institut，Denmark)強化。注射破傷風疫苗6天後自捐贈者採集約2〇〇ml · 之血液樣本裝在含有抗凝血劑之試管中。 一般此捐贈者應為健康且無潛在或慢性感染者。其不應患有自體免疫疾病 或接受任何免疫抑制藥物，且於最近3個月内不應接受任何疫苗接種。再者， 於接種TT-疫苗之時間，該捐贈者於最近丨個月内不應患有任何嚴重的感染。 b·製備週邊血液單核細胞(p腿〇 使用 Lymphoprep(Axis-Shield PoC AS, Norway，prod. No. 1001967)根據 該製造商之建議方式自血液樣本中單離出PBMC。簡言之，將血液以丨：丨之比例 以PBS稀釋且將此懸浮液以2 : 1之比例以Lymph〇prep進行分層。將瓶子於25 C下以800g離心20分鐘以及收集白色中間層。將細胞以含有2mM EDTA之pBS 洗滌。 響 c · B細胞之擴增 將PBMC之B-細胞系（CD19+細胞)藉由磁珠細胞分類使用下列程序進行擴增。- 將經單離之 PBMC 以抗-CD19-FITC(BeCt〇n Dickenson，NJ，USA, cat. No 345776)染色。所有步驟皆於4〇c下黑暗中進行。染色係以每1χ1〇6細胞於1〇〇以 1 之體積中以 10 " 1 抗—CD19-FITC 使用 M-緩衝液(PBS，pH 7. 2，0. 5% BSA，2mM EDTA)進行。此將對pbmc之B-細胞系進行染色。將細胞培養2〇分鐘接著以M-緩衝液進行兩次洗滌之步驟。每100 V 1之^緩衝液中含有1χ1〇6個細胞每1χ1〇6 個、-田胞使用 10之抗_Fitc磁珠(Miltenyi Biotec, Gladbach，Germany, cat.
No 130-042-401)，使該經抗—CD19_FITC染色之細胞係磁性地標示著與微珠共軛 57 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977 之抗-FITC。培養15分鐘接著以Μ-緩衝液洗滌一次。將細胞再懸浮於經除氣之 Μ-緩衝液中。 依照製造商之說明將 MACS LS 管柱(Miltenyi Biotec，Gladbach, Germany, cat. No 130-042-401)以經除氣之M-緩衝液預處理。將經抗-CD19-FITC染色且 ’ 標示著抗-FITC-磁珠之細胞的懸浮液施用至管柱且使其通過管柱。經染色且經 . 標示之細胞(CD19+)會留在管柱周圍的磁場中而未經染色之細胞（CD19-)會通過 管柱。將管柱以除氣之Μ-緩衝液洗滌。移除磁場且收集CD19+細胞。 d. 漿細胞之分類 將MACS管柱之洗出液離心且再懸浮於FACS緩衝液中（PBS，pH7. 2，2% BSA) 濃度為 lxl〇6細胞/60//1 之FACS緩衝液。加入抗-CD19-FITC(BectonDickenson， NJ，USA, cat. No345776)(10"1/106細胞）、抗-CD38-PE(BectonDickenson, NJ，_ USA, cat. No 555460)(10 " 1/106細胞）、以及抗-CD45-PerCP(Becton Dickenson, NJ，USA, cat. No 345809)(20仁1/106細胞於4°C黑暗下培養20分鐘，接著 洗蘇兩次且再懸浮於FACS緩衝液中。 使用下列限制參數經由螢光活化之細胞分類法(FACS)將細胞分類： 1. 前散射光（forward scatter)及側散射光(side scatter)，此係為了保留 淋巴細胞與單核白血球（包含漿母細胞團（plasma blasters)以及漿細胞）以及避 免死亡之細胞與具有高度侧散射光之細胞，此等細胞可能聚集在一起或為顆粒 性細胞。 2. CD19陽性且CD38表現程度增強（CD38hi)之細胞。此為僅關於CD38之基本_ 限制由於PBMC已經針對CD19表現作用藉由MACS管柱擴增，但是此將會揭示任_ 何污染物。 3. CD45陽性之細胞。所有淋巴細胞皆表現CD45 »然而，相較於早期之淋巴 · 細胞分化階段’漿細胞會減少其CD45之表現。因此當限制CD45時可得到相當 於漿細胞之分立的細胞群。 將經FACS分類之細胞直接收集為單一細胞群且收集至各孔含有1 pBS 緩衝液(補充有 5U 之 RNase 抑制劑(RNasin，Promega，Madison USA, cat. No N2515))之96孔盤中。此時可將細胞冷凍以稍後進行RT-PCR或立即將細胞進行 RT-PCR 〇 e. 連接免疫球蛋白可變區編碼序列之同源對 6048-6508-PF；Chiumeow 58
將多重重疊-延伸RT-PCR技術應用至該單一細胞群，因而完成經轉錄之抗_ 破傷風類毒素重鏈可變區與輕鏈可變區編碼序列同源對之連接。 e-Ι.單一步驟多重重疊-延伸RT-PCR 使用 Qiagen One-Step RT-PCR 套組（Qiagen cat· No 210212，Hilden，
Germany)實際上根據製造商之建議進行多重重疊-延伸rt-PCR。自冷;東庫中取出 每孔含有單一細胞之冷冻·的96-孔盤以及當孔中不含冰晶時立即於各樣本（單一 細胞）中加入15以1之RT-PCR反應混合物。 該RT-PCR反應混合物包含下列試劑，總體積為20//1 : 1 X One-Step RT-PCR 緩衝液， 各種dNTP，各最終濃度為400//M， 多重重疊-延伸引子混合物，其濃度如表8所示， 0. 8仁1之One-Step RT-PCR酵素混合物，以及 20U 之 RNase 抑制劑（RNasin，Promega，MadisonUSA，cat. NoN2515)。 該多重重疊-延伸引子混合物之組成顯示於表8。 表8
引子 名稱 濃度 序列 識別號 5至3方向之引子序列 41 tattggcgcgccatggccCAGRTGCAGCTGGTGCART 42 tattggcgcgccatggccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT 43 tattggcgcgccatggccCAGRTCACCTTGAAGGAGT Vh 各 40ηΜ 44 45 tattggcgcgccatggccSAGGTGCAGCTGGTGGAG tattggcgcgccatggccCAGGTGCAGCTACAGCAG 46 tattggcgcgccatggccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT 47 tattggcgcgccatggccGARGTGCAGCTGGTGCAGT 48 tattggcgcgccatggccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC CH(IgG) 200ηΜ 9 GACSGATGGGCCCTTGGTGG 54 gccatggcgcgccaatagctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCT 55 gccatggcgcgccaatagctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT Vl 各 40ηΜ 56 gccatggcgcgccaatagctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT 57 gccatggcgcgccaatagctagccGATATTGTGATGACCCACACT 58 gccatggcgcgccaatagctagccGAAACGACACTCACGCAGT 59 gccatggcgcgccaatagctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT Cl λ 200ηΜ 60 atatatatgcggccgc 11aTTAACACTCTCCCCTGTTGAA W=A/T，S=G/C，R=A/G。大寫之序列相當於基因-特定區。 6048-6508-PF；Chiumeow 59 1333977
循環條件如下： 逆轉錄： 30分鐘 55〇C 聚合酶活化： 15分鐘 951 使逆轉錄酶失去活性 PCR反應： 變性 30秒 94〇C ' 以及活化Taq聚合酶 煉合 30秒 52〇C , 35次循環 延伸 5分鐘 72〇C 最終延伸 10分鐘 72〇C e~2.額外的增幅作用 自各樣本中取1//1之多重重疊-延伸RT-PCR反應產物進行半-巢式· pCR(Bi〇taq 套組，Bioline，UK cat. No BIO-21040)，其實質上係依照製造商 之建議利用96孔盤進行。各反應之總體積為50/H，含有最終濃度為1χ之Biotaq 緩衝液、200/zM之各dNTP、2mM MgCh、1· 25U之Bio Taq聚合酶以及表9所示 之引子。
循環條件如下： 變性 30秒 95〇C 煉合 30秒 551 延伸 1.5分鐘 72〇C 最終延伸 5分鐘 72〇C y 30次循環
表9
引子 名稱 濃度 序列 識別號 5’至3’方向之引子序列 61 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCC Ju 62 ggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCC ^uUIlIu 63 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCC 64 ggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC Cu 200nM 21 accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC TT 大寫之序列相當於基因-特定區。 為了確認該多重重疊-延伸RT-PCR已成功，取10/z 1之有限組樣本藉由L 5〇/〇 瓊脂凝膠電泳分析並使用溴化乙錠使其可為肉眼所見。 6048-6508-PF;Chiumeow 60 1333977 該片段之預期大小為（確實的大小係根據可變區之長度）：
Vh :〜410bp LC · ~680bp 重疊-延伸片段：〜1070bp 自源自相同捐贈者之所有樣本(於卯孔盤進行反應者）中取出2//1組合於 一個試管中。將集合之樣本以Xh〇I與Notl切割。藉由製備性1%瓊脂凝膠&泳 純化該經切割之重疊-延伸片段；自該瓊脂凝膠上切下該多重重疊延伸片段且 使用 Qiaex II 套組(Qiagen cat. N〇 20051，Hilden, Germany)進行純化。若 非所欲此階段不需將同源對集合在—起。該例中各獨立的反應將進行限制切割 以及個別將產物選殖至下述載體中。 f.同源Fab表現基因庫
Fab載體之基因庫係藉由接合作用將經過此“/恥衍切割之重疊一延伸片段 的集合插入至大腸桿菌載體JSK30K第11圖）而產生。經由電穿孔以Fab載體= 基因庫使大腸桿菌（TOPio)轉形以及將轉形物於含有1〇〇yg/ml羧青黴素 (carbenicillin)之2ΧΥΤ奶旨上進行減。直細_盤上之選麟製備質體 DNA。為了保持多樣性，質體製備物係來自每位捐贈者之最低選質株數，相當於 3χ原本經分類之單一漿細胞之總數。触表現基因庫係藉由以A%】與制切 割質體製備_及接著進行接合作祕馳_之啟動子及衍生自_之領導 卡H(Den，1 等人 1999. J. ImmUnQi. Methods 222, 45-57)插人至所得質體製 備物中而產生’基因庫產生之過程摘述於第12圖。經由電穿孔以所得之_ 表現基因庫使大腸桿g(TG1)卿錢將卿物於含有1QQ〃g/ml齡徵素之 2xYT璦脂上進行挑選。於Den等人，】.！_〇!· Με_δ.ι999. 222(1-2): 45-57所述之過程中將各個捐贈者的基因庫分開保存。然而，若需要 亦可於任何階段將其組合。 g.選殖株之篩選 藉由抗原-專-性ELISA分析法篩選具有π抗原-結合之Fab表現選殖株。 g-Ι.主盤(Master Plate)之產生及Fab表現作用 將各個經挑選之TG1細胞選殖株(各具有得自步驟⑴產生之基因庫之同源 M)表現載體)置人含有ZxYT/H^g/mL Amp/Ι%葡萄糖之96孔盤之各單孔中。 該選殖株於37°C溫和晃動ΤΉ-整夜。將這㈣_主飾3浙心⑻， 61 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977 於其中加入甘油達最終濃度為15%並儲存於-8(TC。 於健存該主盤前，使用96針複製器（96 pin replicator)將一或多個含有 ZxYT/lOO/zg/mL Amp/0.1%葡萄糖之384孔盤用於接種。將盤密封以及於37°C晃 動2-3小時。
Fab表現作用係藉由加入等體積之2xYT/100#g/mL Amp/0. 2mM IPTG，得最 · 終IPTG濃度為〇. 1禮，予以誘發。將盤密封以及於3〇°C晃動一整夜。隔天，以 ELISA分析該含有Fab之上清液的TT抗原-結合專一性。 g-2. ELISA 分析 將 384 孔之 ELISA 盤（Nunc, Roskilde，Denmark, cat No 265196)於 4。(：下 以破傷風類毒素(TT)抗原（以PBS稀釋為最終濃度1 yg/mL每孔之體積為25//1) 塗覆一整夜。將孔中過量的結合位置藉由添加2% M-PBS-T(2%脫脂奶粉於PBS · 中，0. 05% Tween 20)於 RT 下進行封阻 1 小時。將孔以 pbs-T(PBS，0. 05% Tween 20)洗滌2次。 將得自g-Ι.之含有Fab之細菌上清液使用2% M-PBS-T以1: 2之比例稀釋， 以及以一式雙份之方式轉移至ELISA孔。於RT下培養1小時。將孔以PBS-Τ洗 蘇4次。將使用2%M-PBS-T以1:10. 〇〇〇稀釋之山羊-抗-人frab/HRP(Sigma，St.
Louis，MO, USA, cat. No A0293)添加至孔中士 rt下培養1小時。將孔以PBS-T 洗滌 4 次。加入 TMB Plus(KemEnTec，Copenhagen, Denmark, cat. No 4390L) 受質以及培養5至15分鐘。加入等體積之iM的H2S〇4使反應終止。反應程度係 以 ELISA 讀取器（Multiscan Ascent, Labsystems，Franklin, USA)於 450nm下 之讀值。 接著自原本之主盤中取出原本之細菌選殖株（相當於ττ抗原_結合選殖 株）。自經單離之抗原陽性Fab選殖株製備質體DNA，產生ΤΤ抗原-結合選殖株 之同源Fab表現子-基因庫。 為了取得抗原-結合選殖株之數目與Fab表現選殖株之數目間的相關性，亦 可藉由抗-輕鏈ELISA分析法分析該選殖株。再者，此等分析可提供於選殖株中 表現之/c及λ輕鏈之資訊。 h.同源抗體表現基因庫 為了促進完整之人類抗體的表現作用必須將來自細菌触表現載體之同源 可變區轉移至含有人類免疫球蛋自關物之-者之时域的哺乳動物表現載 6048-6508-PF;Chiumeow 62 1333977 可-㈣雜接—觸雜妨或纽切行。下列制如何進行 之質=======經單離之抗原-結合陶殖株 =著藉由：用插入哺乳動物啟;子及? igK領導序列)調換。經由電穿孔以所得之啟動子經調換之免F=m)大 腸，議⑽轉形以及將轉形物於含有_g/ml 黴素之 直接以璦脂盤上之選殖株製備質體舰。為了保持多樣性，質體製備物 係來自母位制权最低馳，树㈣&林基目权選絲之總數。 第二，將質體製備物以Xhol與NotI切割而自啟動子經調換之Fab表現基 因庫單離出同源可變區。將經單離之片段藉由接合作用插入至哺乳動物表現載 體中得到同源抗體表現基因庫。所使用之載體實質上與第9A圓所示者相同，除 了此例中之IgL相當於/C輕鏈編碼序列外。上述所使用之哺乳動物表現載體係
根據位置特疋性 Flp-In 糸統（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA，USA 如恥1(6010-〇1)。經由電穿孔以所得之同源抗體表現基因庫使大腸桿菌（聰〇) 轉形以及將轉形物於含有l〇〇yg/ml羧青黴素之2xYT瓊脂上進行挑選。直接以 瓊脂盤上之選雜製備質體DNA。為了保持多樣性，質體製備物係來自每位捐贈 者之最低選質株數，相當於約3χ原本基因庫之選殖株之總數。為了產生穩定之 哺乳動物表現細胞株，藉由Flp重組酶-媒介之整合作用將所得之同源抗體表現 基因庫之質體製備物用於轉染哺乳動物宿主細胞，例如invitrogen Flp_In系 統（InvitrogenC〇n)〇ration，Carlsbad，CA，USACatNoK6010-01：^CH(H® 胞。此細胞株可用於生產重組之多株抗體。 實施例7 :藉由高密度膜分析法(high density membrane assay)進行篩選 a.主盤之產生 如實施例6之步驟(g-1)所述產生主盤。 b. PVDF膜之製備 根據製造商之說明手冊於4°C下將PVDF膜(Amersham，Uppsala，Sweden, cat. N〇RPN2020F)以使用PBS稀釋成最終濃度為lyg/ml之TT抗原塗覆一整 6048-6508-PF rChiumeow 63 1333977 夜。將膜上過量的結合位置以2%M-PBS(2%脫脂奶粉於PBS中）進行封阻1小時。 將膜以PBS潤洗3次。浸於2xYT中數分鐘。 c. 選殖株之強化（consolidation) 將選殖株強化至384孔盤係藉由使用96針複製器將選殖株自主盤轉移至一 或多個含有20 β 1 2xYT/孔之384孔盤中進行。 使用384針複製器以雙份之方式將細菌轉移至一或多個尼龍膜(Amersham, Uppsala, Sweden, cat. N〇RPN2020B)置於 2xYT/Carb/l%葡萄糖瓊脂盤上。將盤 於37°C培養4至6小時。 d. Fab之誘導 將步驟b製備之PVDF膜放置於2xYT/Carb/0. ImM IPTG瓊脂盤上。將具有 生長中之菌落的尼龍膜置於該PVDF膜之上方（每一PVDF膜一層尼龍膜），該PVDF % 膜係位於含有IPTG瓊脂盤之上方。將含有IPTG之瓊脂盤30°C下一整夜俾使IPTG 促進菌落表現Fab。該Fab分子通過尼龍膜擴散至PVDF膜，此處TT-抗原會結 合Fab而將其保留於膜上。 e. 檢測 將尼龍膜移除以及以PBS-T(PBS，0· 05% Tween 20)洗滌該PVDF膜2x5分鐘。 將膜與2% Μ-PBS培養30分鐘。以PBS-T洗滌該PVDF膜2x5分鐘，接著與使用 2% Μ-PBS 以 1 : 10. 〇〇〇 比例稀釋之山羊-抗人 IgG/HRp(Sigma，St. L〇uis，M〇， USA，cat. No A0293)培養卜j、時《將PVDF膜以PBS-T洗務3x5分鐘。最後， 根據製造商之說明手冊將PVDF膜與SuperSignal West Femto化學發光受質塵 (Pierce, Rockford, II，USA, cat. No 34095)培養 5 分鐘。移除過量之受質· 以及將PVDF膜置於CCD攝影機下檢測於PVDF膜上Fab片段結合π_抗原處產生 之化學發光訊號。 陽性之ΤΤ-抗原結合選殖株於影像上顯示出點狀。接著自原本的主盤中取出 原本的細菌選殖株。自該經單離之抗原陽性Fab選殖株製備質體DNA，產生^_ - 抗原結合選殖株之同源Fab表現子-基因庫。 f. 抗原結合選殖株與Fab表現選殖株間之相關性 將自步驟e移除之尼龍膜置於第二組經抗-輕鏈抗體或抗—灿抗體塗覆之 PVDF膜上，其係重複依照步驟b、步驟d及e之程序。
Fab陽性之選殖株於影像上顯示出點狀且可得到與π_抗原結合選殖株之數 6048*6508-PF；Chiumeow 64 1333977 目及Fab表現選殖株之數目間之相關性。 實施例8 :描述單離出編碼雜聚蛋白質之序列之示範例 本實施例示範如何利用本發明之多重重疊-延伸RT-PCR技術以單一步驟單 離出二聚之鳥嘌呤核苷酸結合蛋白質蛋白質）。6_蛋白質次單元之家族龐 大’僅人類中就具有約16種不同之〇^次單元、5種沒次單元以及種7次單元。. 本實施例中選用次單元G α S(GenBank編號X04408)、次單元G /31 (GenBank編號 AF501822)以及Gr l(GenBank編號BC029367)。該連接程序示範於第13圖，其 中步驟1係多重重疊-延伸RT-PCR步驟以及步驟2係該經連結之產物額外的增 幅作用。 a. 細胞 自手術切下之樣本中取得人類肝臟細胞群。使肝細胞瓦解且溶解，使用RNA % L 套組(Macherey-Nagel，Duren，Germany, cat. No 740 962. 20)根據製造商之 說明手冊自該溶胞產物中單離出總RNA β
b. 多重重疊-延伸RT-PCR 使用 Qiagen One-Step RT-PCR 套組（Qiagen cat. No 210212，Hilden， Germany)實際上根據製造商之建議進行多重重疊-延伸rt-PCR。 各PCR試管中包含下列試劑，總體積為50/z 1 : 1 X One Step RT-PCR 緩衝液， 各種dNTP，各最終濃度為400"M，
多重重疊-延伸引子混合物，其濃度如表10所示， 2# 1之One Step RT-PCR酵素混合物， 1U///1 之 RNase 抑制劑（RNasin, Promega，Madison USA，cat. No N2515)’ 以及 50ng 之總 RNA。 所使用之多重重疊-延伸引子混合物包括表10所示之引子。 表10
引子 名稱 濃度 序列 識別喊 5’至3’方向之引子序列 a 1 400ηΜ 80 atatatatgcggccgcttaATGGGCTGCCTCGGGAA al 80ηΜ 81 gccatggcgcgccaatagctagccTTAGAGCAGCTCGTACTGACGAA β\ 80ηΜ 82 tattggcgcgccatggccATGAGTGAGCTTGACCAGTTACG 6048-6508-PF;Chiumeow 65 1333977 _β2 80nM 83 ggtacctaataataatcgatcgcTTAGTTCCAGATCTTGAGGAAGCT jrl 80nM 84 cgatcgattattattaggtaccccATGCCAGTAATCAATATTGAGGAC r 2 --------- 400nM 85 ggaggcgctcgagTTATGAAATCACACAGCCTCCTTTG 大寫之序列相當於基因-特定區。 循環條件如下：
逆轉錄： 30分鐘 42〇C 聚合酶活化： PCR反應： 15分鐘 95〇C 使逆轉錄酶失去活性 以及活化Taq聚合酶 變性 30秒 94〇C " 煉合 30秒 49〇C ,45次循環 延伸 3分鐘 72〇C 最終延伸 c.增幅PCR 10分鐘 72〇C 取1 μ 1之多重重疊-延伸RT-PCR反應產物進行額外的PCR增幅步驟(Biotaq 套組，Bioline，UK cat. No BIO-21040)，其實質上係依照製造商之建議。所 使用之引子係如表10所示之α 1與72相當於序列識別號80及85。反應之總體 積為50/ζ 1。 循環條件如下： 變性 30秒 95〇C ' 煉合 30秒 53〇C >· 25次循環 延伸 3分鐘 72〇C J 最終延伸 10分鐘 72〇C 取5/zl之反應產物藉由1%瓊脂凝膠電泳分析並使用溴化乙錠予以檢測。產 物之大小預期為2215bp。然而，可能存在其他未連結之片段。這些片段的預期 大小為 Ga : 1228bp，G/S : 1064bp 以及 Gr : 262bp。 d.選殖 將其餘之反應產物進行1%瓊脂凝膠電泳並使用溴化乙錠予以檢測且自瓊脂 凝膠上切下2215bp之重疊-延伸片段，使用Qiaex II套組(Qiagen cat. No. 20051)進行純化以及使用 Invitrogen ΤΟΡΟ ΤΑ 選殖套組（invitrogen cat. No 6048-6508-PF;Chiumeow 66 1333977 &0641，Carlsbad，CA，USA)將該片段插入 pCR2.1-7OP〇。 p再者，為了促進其於健中表現可將啟動子序贼核糖體結合位置插入各 -人早7L編碼序狀上游H延伸序财存在之關位置亦可細此法插入。
如上述’編碼該構成雜聚蛋白質次單元之序狀連接，可細至多數 蛋白質，其中該各個次單元之序列係已知者。再者，t_該等可增幅特定 族(例如所有G-蛋白質α-、卜、及r-次單元)之數種成員之多重重叠_延伸 子混合物時，其可酬及連結來自—__之次單元之任恤合而不須先分 ^由何種細雌齡狀家軸M。例如，上述實關可彻触自經單離之 單一肝細胞作為模板進行並採用可增幅及連結所有16種Ga次單元與5種G
Ϊ單元以種以次單元之多重重#_延伸5丨子混合物，因而可識別各細胞中 表現之次單70之組合且同時單離該次單元之組合之編碣序列。此外，甚至 用退化性引子來識別特定家族之新成員。 當使用本發明之多重重疊-延伸RT_pCR技術連結雜聚蛋白質之次單元時， 應考慮經連結之產物的總體大小’因為臟聚合酶可增幅之驗基對的數目有限。 新英格蘭Biolabs，MA，USA之De印Vent聚合酶係一種可增幅非常長之引子延 伸物之DNA聚合酶，可長達14, _bp。理論上，14, 〇〇〇bp可編碼出平均分子量 為510kDa之蛋白質。因此，利用本發明之方法應可單離出非常大之雜聚蛋白質 的編碼序列。即使利用DNA聚合酶之混合物也可能增加該延伸能力。 實施例9:領導引子之設計：
此實施例中，係設計-種多重組之引子，該引子之引導位置係位於編碼人 類抗體重鏈及/c輕鏈家族之領導區的序列。 當使用煉合至可變區家族之N一端編碼序列之引子時，可能觀察到某種程度 之交互-雜合作用…特定基因家族序狀引何雜合至另—基因家族之cDNf 其於許多例子中創造出新穎之序十由此等序列產生之蛋白f於驗治療時潛 在地會產生免疫性。-般’這些新穎之序列可由pCR予以橋正或自基因庫中排 除。 另一解決方案係將引導之位置設在編碼跳體可變區之領導胜肽區之序列 卜此法可於細胞内對抗體進行加工時將由交互-引導產生之雜合序列排除，其 中含有可能產生免疫性之序列的胜肽領導序列將被切除，因此不會出現於經^ 6048-6508-PF;Chiumeow 67 1333977 泌之抗體產财。歧將祕抗體之領導奸蚊位於領導編碼序列之5, 端，可直接進行真核細胞表現(Campbell M j等人臓M〇1丨麵㈣丨29, 193-203)。不幸地’真核細胞之領導胜肽非常不適於原核細胞加工。 核酸序列於細菌中操作的容易性吸引生物學家為其發展選殖系統，該系統 中序列可於細g載體與其他宿主有機體之紐間穿梭^因此，本實施例係設計 -種多重引子組’其引導位置係保持於領導區編瑪序列位置巾，*使抗體或抗 體片段之功能性表現作用可於真核細胞及原核細胞表現系統中進行。 原核細胞及真核細胞系統中對於任何位於領導胜肽c_端區之訊號胜肽酶序 列之要求似乎非常相似（Nielsen H.等人1997 Protein Eng. 10, 1-6.)。再者，
該領導胜肽之C-端區產生之突變可能會影響N_端區之構形反之亦然。因此，期 望該C-端序列可隨物種轉移而不會喪失其功能。 本實施例中引子設計之基本觀念係將引導之位置設置在領導胜肽之c_端區 的最後六個密碼子。領導編碼序列之其餘部分，即引導位置之上游（約5〇個核 符酸)應由符合宿主物種之適當的表現載體所提供。例如，可將適合表現於格蘭 氏陰性菌之載體設計為具有部分或完整長度之pelB領導序列β為了於真核細胞 中表現抗體’適合採用具有部分天然的抗體重鍵領導編碼序列及部分可變κ鍵 領導編碼序列之載體。不論表現系統，該領導序列之最後六個胺基酸，係源自 於内生性抗體領導編碼序列，該序列係包含於經插入載體中之核酸斷片内。
下列引子序列係設計用於多重重疊-延伸RT-PCR(表11)。然而，該重疊尾 部（小寫字體）可容易地再次設計成具有可經由接合作用或重組作用程序達成連 接功能者。 表11
引子 名稱 序列 識別號 5’至3’方向之引子序列 86 tattcccagcggccgccGCCACAGGTGCCCACTC 87 tattcccagcggccgccCCTTCMTGGGTCTTGTC 88 tattcccagcggccgccTTARAAGGTGTCCAGTGT Vhl 89 tattcccagcggccgccCCCAGATGGGTCCTG 90 tattcccagcggccgccCTCCAAGGAGTCTGTTC 91 tattcccagcggccgccCCATGGGGTGTCCTGTCA 92 tattcccagcggccgccGCAACAGGTGCCCACT CH(lgG) 9 GACSGATGGGCCCTTGGTGG 6048-6508-PF;Chiumeow 68 1333977
93 ggcggccgctgggaatagctagcgYTCCCAGGTGCCAGATG 94 ggcggccgctgggaatagctagcgGTCCCTGGATCCAGTG VUL 95 ggcggccgctgggaatagctagcgCTCCCAGATACCACCGGA 96 ggcggccgctgggaatagctagcgATCTCTGGTGCCTAC 97 ggcggccgctgggaatagctagcgATCTCTGATACCAGGGCA 98 ggcggccgctgggaatagctagcgGTTCCAGCCTCCAGGGGT Cu 99 atatatatggcgcgccnAACACTCTCCCCTGTTGAA Μ=Α/Τ，R=A/G ’ Y=C/T，S=G/C。大寫之序列相當於基因-特定區。 應注意相較於先前實施例中所述之引子，此引子設計中之限制位置係經過 稱微修正。因此，重鏈及輕鏈可變區編碼序列間之重疊序列包括NotI及Nhei 限制位置，以及於固定zc引子(CLK)中，先前之ΝοΐΙ位置已換成AscI位置。當 設計該額外的PCR增幅作用所使用之引子時，應注意後者之修正。再者，第u 圖顯示之選殖載體中的Notl位置應換成AscI位置，以及啟動子單元中之AscI 位置應換成Notl位置。 關於領導序列切割之功能，已使用由位於Danish Technical University 之CBS所提供之SignalP於電腦中進行試驗》 為可變重鏈進行試驗之嵌合型領導胜肽，係由下列序列所組成之核酸序列 所編碼：經截斷之PelB序列、(；端Notl位置（序列識別號100 : ATGAAATATCTT CTA CCA ACA GCG GCA GCT GGA TTA TTG GCG GCC GCC)、以及與 Notl 位置結合 序列識別號：86至92中之一者之基因特定部份，自天然的Vhl家族成員編碼該 六個C-端胺基酸。使用該signalP程式，所有七種序列於格蘭氏陰性菌中顯示 訊號胜肽切割作用。 為可變輕鏈進行試驗之嵌合型領導胜肽，係由下列序列所組成之核酸序列 所編碼：經截斷之PelB序列、C端Nhel位置(序列識別號：1〇1: ATG AM TAT TTG CTA CCA ACA GCG GCA GCT GGA TTA TTG TTA CTA GCG)、以及與 Nhel 位置結合 序列識別號：93至98中之一者之基因特定部份，自天然的VuL家族成員編碼該 六個C-端胺基酸。使用該signalP程式’所有六種序列於格蘭氏陰性菌中顯示 訊號胜肽切割作用。 序列識別號：100及101之序列適用於構築與第U圖所示範者類似之細菌 表現載體’第11圖所示範之AscI位置係經序列識別號：1〇〇所取代以及該Nhei 位置係經序列識別號：1〇1所取代。再者，該第U圖所示範之N〇tI位置需經取 6048 - 6508-PF；Chiumeow 69 1333977 代為AscI位置。 同樣地，哺乳動物表現載體（第9圖）可經重新設計為自前述之細菌載體轉 移該可變區編碼斷片後於哺乳動物細胞中表現者。 實施例10 :單一試管之多重RT_PCR及藉由接合作用進行連接 本實施例示範如何於單一試管反應中使用接合作用取代重疊_延伸pcR以產
生包括經連結之重鏈可變區及輕鏈可變區編碼序列之同源對，而獲得連接。 a.多重 RT-PCR 將對破傷風類毒素可表現具有專一性之Fab分子之自行產生之細胞株藉由 有限之稀釋進行分配而使單一個PCR試管中具有單一細胞。 除了該單一細胞，各PCR試管中含有下列試劑，總體積為2〇“1 : 1 X Phusion HF 緩衝液 各種dNTP，各最終濃度為200//M 多重引子混合物，其濃度如表12所示 0· 8U 之 Phusion 聚合酶(FinnZymes Cat. No F-530-L) 1 # 1 之 Sensiscript 逆轉錄酶(Qiagen Cat. No 205213) 20U之RNase抑制劑 表12
引子 名稱 濃度 序列 識別號 5’至3’方向之引子序列 102 tgttgttctagatgaaggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCART 103 tgttgttctagatgaaggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT 104 tgttgttctagatgaaggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGT Vu 久？ΠΠπΜ 105 tgttgttctagatgaaggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAG ττ LiUUlllVl 106 tgttgttctagatgaaggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGT 107 tgttgttctagatgaaggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT 108 tgttgttctagatgaaggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGT 109 tgttgttctagatgaaggcgcgccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC 61 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCC T. Λτ ΟΑΛ If 62 ggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCC Jh 各 ΖϋϋηΜ 63 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCC 64 ggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC Vu 各 200ηΜ 110 aacaacactagtgataggctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCT 111 aacaacactagtgataggctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT 112 aacaacactagtgataggctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT 6048-6508-PF;Chiumeow 70 ^33977 113 aacaacactagtgataggctagccGATATTGTGATGACCCACACT 114 aacaacactagtgataggctagccGAAACGACACTCACGCAGT Cu — 115 aacaacactagtgataggctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT 200nM — 」 16 atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGnG ^' W=A/T ’ R=A/G，S=G/C。大寫之序列相當於基因-特定區。 循環條件如下： 逆轉錄 30分鐘 37〇C 變性 30秒 98〇C 變性 10秒 98〇C ^ 煉合 30秒 55〇C >-40次循環 延伸 30秒 72〇C 最終延伸 5分鐘 72〇C b.藉由接合作用進行連接 為了藉由接合作用進行連接，直接於該多重RT-PCR反應產物中添加限制酵 素及接合酶。或者，可於添加前純化該多重RT_PCR產物以自該混合物中去除聚 合酶。 於各試管中加入下列試劑，總體積為4〇"1 :
1 X NEBII緩衝液 lmM ATP 50U XbaKNew England Biolabs Cat. No R0145L) 25U SpeI(New England Biolabs Cat. No R0133S)
100^g/ml BSA 400U T4 DNA 接合酶(New England Biolabs Cat. No M0202S) 反應係於16°C培養一整夜。 藉由凝膠電泳自反應中純化出經連結之重鏈及輕鏈可變區編碼序列以及將 約lOOObp之寬帶切下。 此方法之另一版本中，該多重RT-PCR反應係以G引子取代JH引子之多重 子組進行。此引子可具有選殖尾部而可將重鏈可變區插入至表現載體之結構 中，或使用表5之引子進行半巢式PCR。 實施例11 :產生對破傷風類毒素具有專一性之重組多株免疫球蛋白 本實施例係以經破傷風類毒素免疫化之單一捐贈者(Π03)為例說明第1〇圖 6048-6508-PF;Chiumeow 71 1333977 之流程圖所述之步驟。 a.捐贈者 先=、讀傷風類毒素免疫化之8位捐贈者接種破傷風疫苗（如她 =。將捐贈者以至簡予以編號。接種破傷風 疫田6天後’自_者抽取約2_之錢樣本收集至含有抗凝血劑之試管令。 位^贈者紐康且紐性絲、自體免雜病、錢受免疫抑㈣物者， 且於最近3個月内不應接種任何疫苗。 a-Ι.監測捐贈者之品質 於免疫化之同_取捐贈者之血液…天後再次抽血以決定血清力價。所 有捐贈者之π-力價皆增加。亦設立EU歸分析法測量TTm細胞之頻 率。該ELISPOT可使用不同的細胞分液，例如，接種6天後所抽取之血液騰魯 分液、經磁株分類之分液、或經FACS分類之分液。可使用Eusp〇T評估捐贈者 之血液以及鑑別出反應最佳者，然後進行分類步驟以及多重重疊延伸RT_pcR。 至於TT03，使用CD19+細胞分液進行EUSPOT(參見c節）。如Lakew(Lakew，M_
等人 1997. J. Immunol. Methods 203，193-198)所述經小幅修正後進行 ELISPOT 分析。TT-專一性槳細胞於pbmc分液中之頻率經計算為〇. 021%。 b. 週邊血液單核細胞(pbmc)之製備 使用 Lymphoprep(Axis-Shield，Oslo Norway, prod. No. 1001967)根據該 製造商之建議自血液樣本中單離出PBMC。簡言之，將血液與pbs以1 : 1稀釋且 將此懸浮液以2 : 1之比例以Lymphoprep進行分層。將瓶子於25〇C下以800g離| 心20分鐘以及收集白色中間界面寬帶。將細胞以含有2mM EDTAiPBS洗滌。· 自捐贈者TT03所抽取之200ml全企中得到約2 X 1〇8個PBMC。 c. B細胞之擴增 將PBMC之B-細胞系（CD19+細胞）藉由磁珠細胞分類使用下列程序進行擴增。 將經单離之 PBMC 以抗-CD19-FITC(Becton Dickenson, NJ, USA, cat. No 345776)染色。所有步驟皆於4°C下黑暗中進行。染色係以每ixi〇6細胞於1 〇〇 v 1 之體積中以 10 //1 抗-CD19-FITC 使用 M-緩衝液(PBS，pH7. 2，0. 5% BSA，2mM EDTA) 進行。此將對PBMC之B-細胞系進行染色。將細胞培養20分鐘接著以Μ-緩衝液 進行兩次洗滌之步驟。每100# 1之Μ-緩衝液中含有ΐχΐ〇6個細胞每1x1 〇6個細 胞使用 10//1 之抗-FITC磁珠(Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany, cat. No 6048-6508-PF;Chiumeow 72 1333977 130-042-401)，使該經抗-CD19-FITC染色之細胞係磁性地標示著與微珠共軛之 抗-FITC。培養15分鐘接著以M-緩衝液洗滌一次。將細胞再懸浮於經除氣之. 緩衝液中。 依照製造商之說明將 MACS LS 官柱(Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany, cat. No 130-042-401)以經除氣之M-緩衝液預處理。將經抗-CD19-FITC染色且 標示著抗-FITC-磁珠之細胞的懸浮液施用至管柱且使其通過管柱。經染色且經 標示之細胞(CD19+)會留在管柱周圍的磁場中而未經染色之細胞(CD19-)會通過 . 管柱。將管柱以除氣之Μ-緩衝液洗滌。移除磁場且收集CD19+細胞。 使用抗-CD19-FITC、抗-CD38-PE、以及抗-CD45-PerCP對得自ΤΤ03之起始 材料(PBMC)、未經標示之分液以及經CD19標示之分液進行分析性染色（第14 圖）。相較於PBMC分液此顯示該磁性細胞分類可產生兩種不同之分液。b攔中顯| 示CD19陰性細胞以及C欄顯示CD19陽性細胞。PBMC分液中11%之細胞係CD19+， CD19陽性細胞純化之程度係TT03之R1之99. 5%(第14C圖中之散射限制）。 如第14C圖所示’抗-CD38/抗-CD45點圖顯示出不同族群之CD45hi、CD45in 細胞(R2)相當於1_ 1%之R1。此含有漿細胞之族群係於稍後之分類步驟中所收集 而得。此表示PBMC中0.12%之細胞相當於篥細胞。
將 CD19 陽性細胞分液冷凍於 FCS+10% DMSO(Sigma，Cat. No. D2650)中 (Invitrogen，Cat· No. 16000-044)以稍後進行分類。對經過MACS純化之細胞 (已冷凍）進行類似第14圖所示之分析俾確認細胞之完整性（第15圖）。第15圖 所示之染色圖樣與第14C圖所示者相同但染色強度較為寬廣。藉由分類所收集 之細胞係R1及R2之子集。此相當於約1.1%之經MACS純化之細胞。 d.漿細胞之分類 將冷凍之MACS管柱之洗出液解凍、離心且再懸浮於FACS緩衝液中（PBS， pH7. 2 ’ 2% BSA)濃度為ΙχΙΟ6細胞/60 y 1之FACS緩衝液。加入抗 -CD19-FITC(Becton Dickenson, NJ，USA, cat. No 345776)(10//1/108細胞）、 抗-CD38-PE(Becton Dickenson, NJ，USA, cat. No 555460)(10 jt/1/106 細胞）、 以及抗-CD45-PerCP(Becton Dickenson, NJ，USA, cat. No 345809)(20 el/106 細胞），以及於4°C黑暗下培養20分鐘，接著洗滌兩次且再懸浮於FACS緩衝液 中。 使用下列限制參數經由螢光活化之細胞分類法（FACS)將細胞分類： 6048-6508-PF；Chiumeow 73 1333977 1·前散射光及側散射光’此係為了保留淋巴細胞與單核白血球（包含漿母細 胞團（plasma blasters)以及漿細胞）以及避免死亡之細胞與具有高度侧散射光 之細胞’此等細胞可能聚集在一起或為顆粒性細胞。 2.CD19陽性且CD38表現程度增強（CD38hi)之細胞。此為僅關於CD38之基 本限制由於PBMC已經針對CD19表現作用藉由MACS管柱擴增，但是此將會揭示 任何污染物。 3-CD45中間型陽性之細胞。所有淋巴細胞皆表現c1)45。然而，相較於早期 之淋巴細胞分化階段，漿細胞會減少其CD45之表現。因此當限制CD45時可得 到相當於漿細胞之分立的細胞群。 將得自TT03，經FACS分類之細胞收集為兩個門道(gate)p2及P2(分別為第 16A 及 16B 圖）之子集。該細胞係 CD38hi(FL2-A)、CD45in(FL3-A)及 CD19+，後· 者源於該MACS純化作用。簡言之，將細胞收集在一起、計數以及稀釋於含有1〇% FCS(Invitrogen，Cat No. 16000-044)、1〇〇 單位/ml 之青黴素-鏈黴素 (Invitrogen，Cat No. 15140-122、2mM L-麵酿胺（cat No. 25030-024)之 RPMI(Invitrogen，Cat No. 21875-034)中。然後以每孔一個細胞之量將細胞分 配至50個96孔PCR盤(ABgene，cat. No· AB-0800)，各孔含有5/z 1培養基。 可立即將該盤密封及冷凍，以備稍後進行RT_pcR分析。 e_連接免疫球蛋白可變區編碼序列之同源對 將多重重疊-延伸RT-PCR技術應用至得自捐贈者TT03之單一細胞群，因而 完成經轉錄之抗-破傷風類毒素重鏈可變區與輕鏈可變區編碼序列同源對之 接。 鬱 e-Ι.單一步驟多重重疊-延伸rt-PCR ^ 使用 Qiagen One-Step RT-PCR 套組（Qiagen cat. No 21〇212,耵1(1如
Germany)實際上根據製造商之建議進行多重重疊_延伸RT_pcR。自冷凍庫中取出 每孔約含有單一細胞之50個冷凍的96-孔PCR盤以及當孔中不含冰晶時立即於. 各孔中加入15 // 1之RT-PCR反應混合物。 該RT-PCR反應混合物包含下列試劑，總體積為2〇 # 1 : 1 X One Step RT-PCR 缓衝液， 各種dNTP，各最终濃度為400/zM， 多重重疊-延伸引子混合物，其濃度如表13所示， 6048-6508-PF；Chiumeow 74 1333977 0. 8以1之One-step RT-PCR酵素混合物， 20U 之 RNase 抑制劑（RNasin，Promega, Madison USA, cat. No N2515)。 該多重重疊-延伸引子混合物之組成顯示於表13。 表13
引子 名稱 濃度 序列 識別號 5’至3’方向之引子序列 116 tattcccatggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCART 117 tattcccatggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT 118 tattcccatggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGT Vh ^40η^ 119 tattcccstggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAG 120 tattcccatggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGT 121 tattcccatggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT 122 tattcccatggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGT 123 tattcccatggcgcgccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC CH(IgG) 200ηΜ 9 GACSGATGGGCCCTTGGTGG 124 ggcgcgccatgggaatagctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCT 125 ggcgcgccatgggaatagctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT V， A. 4ΠηΜ 126 ggcgcgccatgggaatagctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT 127 ggcgcgccatgggaatagctagccGATATTGTGATGACCCACACT 128 ggcgcgccatgggaatagctagccGAAACGACACTCACGCAGT 129 ggcgcgccatgggaatagctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT Cl λ 200ηΜ 130 atatatatgcggccgcTTAACACTCTCCCCTGTTGAA W=A/T，S=G/C，R=A/G。大寫之序列相當於基因-特定區。
循環條件如下： 逆轉錄： 30分鐘 55〇C 聚合酶活化： 15分鐘 95〇C 使逆轉錄酶失去活性 PCR反應： 變性 30秒 94〇C ' 以及活化Taq聚合酶。 煉合 30秒 52〇C -35次循環 延伸 5分鐘 72〇C . 最終延伸 10分鐘 72〇C e-2.額外的增幅作用 自各樣本中取1//1之多重重疊-延伸RT-PCR反應產物進行半巢式 6048-6508-PF；Chiumeow 75 1333977 PCR(Biotaq 套組，Bioline，UK cat. No BIO-21040)，其實質上係依照製造商 之建議利用96孔盤(ABgene，cat. No.AB-0800)進行。各反應之總體積為50//1， 含有最終濃度為lx之Biotaq緩衝液、200//M之各dNTP、2mM MgCh、1. 25U之 Bio Taq聚合酶以及表14所示之引子。 表14
引子 名稱 濃度 序列 識別號 5’至3’方向之引子序列 61 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCC Jh 各 2Π0πΜ 62 ggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCC *ΧΓ^ uUUXllil 63 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCC 64 ggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC Cl λ 200ηΜ 21 accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT 大寫之序列相當於基因-特定區。 循環條件如下：
變性 30秒 95〇C ' 煉合 30秒 55〇C ► 30次循環 延伸 1.5分鐘 72〇C 最終延伸 5分鐘 72〇C
為了確認該多重重疊-延伸RT-PCR已成功，自各盤之列A，孔1至12取10 “1之樣本藉由1.5%瓊脂凝膠電泳分析並使用溴化乙錠使其可為肉眼所見。 該重疊-延伸片段之預期大小約為1 〇7〇bp(確實的大小係根據可變區之長 度）。第17圖顯示8個96孔盤之樣本。50個96孔盤中成功之多重重疊-延伸φ RT-PCR片段的平均數經估計為每盤8個。因此，估計成功之多重重疊_延伸 RT-PCR片段的總數約為400個》 將源自相同捐贈者，所有已進行反應，於96孔盤進行反應者中取出 組合於-個試管巾。接著絲合之pGR產物巾取2QQ ^丨之等分使⑽細地pCR 純化套組根據製造商提供之程序⑴iagen cat N〇 281〇6，Hilden，
Germany) 使用60 /z 1緩衝液EB洗提俾進行純化。將經純化之集合的重疊pcR產物以 與Notl切割以及接著藉由製備性1%壤脂凝膠電泳純化；自該境脂凝膠上切下該 多重重疊-延伸片段且使用Qiaex π套組⑴iagen cat N〇 2〇〇51，犯胞， Germany)進行純化。 6048-6 5 0 8-PF;Chiumeow 1333977 f.同源Fab表現基因庫 Fab載體之基因庫係由二步驟接合程序產生的。首先
樣地，將經純化之質體集合以Ascl/Nhel限制内切酶切割以及如前述純化凝膠。 接著將純化Μ段接合錢獅至電勝任大腸翻細胞⑽，stratagene，cat· No. 200123, La Jolla, USA)且置於含有looeg/w羧青黴素與1%葡萄糖22χγτ 瓊脂。該Fab表現基因庫之產生過程摘述於第丨2圖。 g.選殖株之篩選 藉由抗原-專一性ELISA分析法篩選具有TT抗原-結合之Fab表現選殖株。 g-Ι.主盤之產生及Fab表現作用 將各個經挑選之TG1細胞選殖株(各具有得自節（f)產生之基因庫之同源Fab 表現載體）置入含有2xYT/100/zg/ml Carb/1%葡萄糖之96孔盤之各單孔中。將 盤於37C溫和晃動下培養一整夜。使用96針複製器，將4個96孔盤組合成一 個384孔盤’含有2xYT/100/zg/ml Carb/Ι%葡萄糖。將該384孔盤於37。(：下培 養一天。將這些盤稱為主盤，於其中加入甘油達最終濃度為15%並儲存M_8(rc。 使用96針複製器將主盤用於接種含有2xYT/100/zg/mL Carb 0.1%葡萄糖之 384深孔盤。將盤密封以及於37°C晃動2-3小時。
Fab表現作用係藉由加入等體積之2xYT/100"g/ml Carb/0.2mM IPTG，得 最終IPTG濃度為〇. lmM，予以誘發。將盤密封以及於3(TC晃動一整夜。隔天， 以ELISA分析該含有Fab之上清液的TT抗原-結合專一性。 g-2. ELISA 分析 將 384 孔之 ELISA 盤(Corning Inc.，Corning, NY, USA, cat. No 3700) 6048-6508-PF；Chiumeow 77 1333977 於4°C下以破傷風類毒素(TT)抗原（以PBS稀釋為最終濃度1 "g/吡每孔之體積 為25//1)塗覆一整夜。將孔中過量的結合位置藉由添加2% M_pBS T(2%脫脂奶 粉於PBS中’0.05%Tween20)於室溫(RT)下進行封阻1小時。將孔以pbs-T(PBS， 〇· 05% Tween 20)洗滌 2 次。 將得自節（g-Ι)之含有Fab之細菌上清液使用2% M-PBS-T以1 : 2之比例稀-釋，以及以一式雙份之方式轉移至ELISA孔。於RT下培養i小時。將孔以pBS_T 洗條4次。將使用2% M-PBS-T以1 : 10. 〇〇〇稀釋之山羊-抗-人Fab/HRP(Sigma，
St. Louis，MO, USA, cat. N〇A0293)添加至孔中。於rt下培養1小時。將孔 乂 PBS T 洗蘇 4 -人。力〇入 TMB Plus(KemEnTec，Copenhagen, Denmark, cat. No 4390L)受質以及培養5至15分鐘。加入等體積之m的HzS〇4使反應終止，以及 使用分光光度計於 450nm(Multiscan Ascent，Labsystems，Franklin, USA)T % 予以分析。 接著自原本之主盤中取出原本之細菌選殖株（相當於π抗原一結合選殖 株）。自經單離之抗原陽性Fab選殖株製備質體眶，產生ττ抗原_結合選雜 之同源Fab表現子-基因庫。 為了取得抗原-結合選殖株之數目與Fab表現選殖株之數目間的相關性，復 可藉由抗-/c ELISA分析法分析該選殖株之子集。該抗1分析一般係以仏分 ，進行，除了該孔以1:1咖稀釋之山羊—抗_人遠體㈣吨，㈤版恤，脱 Ut. No H16000)，使用碳酸鹽緩衝液，pH9. 6。 g-3.篩選結果
根據g-2所述之程序使用ELISA分析法筛選四個384孔盤中之選殖株對抗_ 二他及ττ的反應性。所得之結果摘述於表15至19。該抗_ κ elisa結果顯示於 ^之選絲中Fab片段之表現個，該TT eusa之結果顯示該_片段之功
93 景值 4x背景值 ___79 73 ______79 68 _j6 73 141 125 〜J95 339 120 164 482~ 6〇48-65〇8-PF；Chiumeow 78 1333977 %Fab陽性選殖株 34% ~ 27% 24% 經分析之1440個單一選殖株中，482個選殖株或34%以超過2x背景值反應 性之程度展現抗-/c反應性。395或27%之選殖株顯示出3x背景值以上之反應 性，等。 將相同之選殖株以ELISA分析其TT-抗原反應性，以及結果顯示於下表16 : 表16 ELISA篩選，TT塗覆（共1440個選殖棟) 盤# 2x背景值 3x背景值 4χ背景值 G050 26 19 17 G051 24 Γ 18 15 G052 34 Γ 31 24 G053 46 36 30 總和 130 104 86 }〇TT 1¼'性選_殖^^_ 9.0% 7. 2% 6.1% 由此表可知有9. 0%之選殖株於2X背景值（界定為由Fab片段之反應性與不 恰當之專一性所得之訊號)下顯示出對ττ之反應性。有1〇4個選殖株於3χ背景 值(7. 2%)下反應等。
Fab陽性選殖株中（共482個選殖株），約27%之選殖株(130/482)於2χ背景 值程度展現it；對m應性。此程度不纽變於其他背景餘度之顯著性。對 =個384孔盤篩選具有ττ反應性之選殖株。由抗原引起反應性之選殖株數目顯 示於表17。未將這些盤進行抗—keusa。 表17 ELISA篩選，TT塗覆（共2160個選殖株) 盤# 2χ背景值 3χ背景值 4χ背景值 G054 82 65 52 G055 30 24 21 (j〇56 25 23 21 G057 30 28 26 ϋϋ58 24 21 19 G059 18 14 13 總和 209 175 151 %ττ陽性選殖株 9. 7% 8.1% 7.0% 盤G054至G059中之TT陽性選殖株的比例與盤G050至G〇53(表16)所得者 所有經17篩選之選殖株(表16及17)的結果摘述於表18 : 表18所有經篩選之選殖株，π反應性選殖株 6048-6508-PF；Chiumeow 79 1333977 盤# 2x背景值 3x背景值 4x背景值 G050-G053 130 104 86 G054-G059 209 175 151 總和 339 279 237 佔所有選殖株(3600)之％ 9.4% 7.8% 6. 6°/〇 總結’共339個選殖株於至少2χ背景值之程度顯示出TT反應性(表18) *> · 相當於所有經篩選之選殖株的9.4%。 將於2χ背景值展現出ΤΤ反應性之所有陽性選殖株如前述自主盤接種至96 孔盤。次日’以4000rpm離心15分鐘收集細菌，以及將沉澱物再懸浮於〇、8mM EDTA，0、4x PBS，0、8M NaCl，以及於冰上培養15分鐘。藉由離心收集細胞 間質萃取物(periplasmic extract)，以及進一步分析該選殖株之反應性。此處 顯示其中一盤(G060)對抗-/c(第18圖）、卵白蛋白（無關之抗原）（第19圖）、# TT(第20圖）、以及單-步驟競爭分析(於溶液中使用1〇-7M濃度之Jr—抗原X第 21圖）之反應性的結果。於相同稀釋下以相同之細胞間質萃取物進行EUSA分析。 大多數之選殖株可表現Fab片段(90/96)(第13圖），以及無選殖株與卵白 蛋白反應（第19圖）。對固定化π之反應性降低或完全由溶液中之TT所抑制（第 21圖）’表示該選殖株對π係專一性反應。盤G060中選殖株之反應性摘述於表 19。 表19 G060盤（共96個選瘦株)之摘述 背景值程度 抗-/C陽性 TT陽性 2x 94%(90/96) 74%(71/96) 3x 91%(87/96) 72%(69/96) 4x Γ 84%(81/96) 69%(66/96) h.多樣性分析及選殖株之認可
將來自同源Π抗原-結合Fab表現子-基因庫之47個選殖株(得自盤g〇60) 中單離之質體進行序列分析。該可變重鏈編碼序列係使用引子LSN_Hcp進行定 序： AGGAAACACGGAGATATACAT(序列識別號：131)，煉合至該P⑽啟動子，以及該 輕鏈編碼序列係使用引子LSN-LCP進行定序： TCGCCAAGGAGACAGTCATA(序列識別號：132) ’煉合至該P /ac啟動子。使用Vector NTI軟體（Informax，Frederick, MD, USA)分析該序列數據。將所得之重鏈的序 列數據修改為一種5個鹼基對之上游AscI限制位置以及緊接著3個鹼基對之下 6048-6508-PF；Chiumeow 80 2 Xhol限制位置。將輕鍵的序舰據修改為第二種5働基對之上游他ej限 制位置以及編碼財變鏈紐之最後3個密碼子為，，處”，修改係為 了有助於進一步之分析例如各DM序列之轉譯。 藉由與X V為主之種株可變區序列資料庫（^七％ germiine⑽咖他 region sequence databaseXMRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)進打tb對以分析該可變重鏈及輕鏈編碼序列。因而定出相關性最高之種株對 偶基因各序列顯示出源自屬於VH_家族VH1至VH5之12種不同之可變重鍵種株 對偶基因以及屬於VKI、VKIII以及聰之8種㈣之可變_鏈種株對偶基 因之V-基因之性質（表2〇)。 再者’將可變基因序列轉譯成蛋白質序列，如第22及23圖所示係使用 AlignX軟體（lnf0rmax，Frederick，仙，USA)進行比對。根據蛋白質序列之比 對’可變鏈序列可依照V(D)J重排情況進行分類將可變重鍵序列指定為Η以及 將可變/c鏈序州為l接著為其特定編號^各重排群組中，依照成熟之基因 型（表20中之型）其中該CDR卜2、及3區分類，由小寫字母順序代表。其中 7^·選殖株具冑過+的停止碼子stQp GQd〇n)，6個選殖株係破珀 型犬變(amber mutation)(TAG)(選殖株 ID g〇6〇 : bl2、d08、f06、cl2、f03、 c04)以^ 1個選殖株係乳白型突變(〇pal mutati〇n)(TGA)(選殖株id g晒： hl2) ° it些密碼子極有可能為大腸桿菌所抑制而產生功能性触片段。其中四 個選殖株係含有類似選殖株之群組的成員而將其排除。為了取代該剩餘^具有 過早的停止密碼子之3鑛殖株需分析其他選殖株確認其域群組巾之單二成 員。或者，將該序列以標準分子生物技術，例如pCR，予以矯正以適當之密碼子 取代該停止密碼子。 該47個經分析之V-區序列可分為20種唯一之V(D)J重排群組(指定為表 中之、群組」）其皆係就可變重鏈及可變/c基因而言。其中四個重排群組可進 一步分為1至4種突變型(a至d),產生27種唯一之抗體編碼序列（表12)。一 般，特定之重鏈重排群組係與特定之輕鏈重排群組組合(例如H1與u、H12與 L24等等）。再者，該突變型符合可變重鏈及可變輕鏈編碼序列之配對(例如h4c 配L13c)。此等對重排群組及突變型中配對之嚴格性表示可變區編碼序列之同源 配對。 、 然而，重鏈重排群組H4係一例外》H4可與兩種不同之輕鏈L28及L13配對。 81 6048-6508-PF;Chiumeow 1333977 L13僅與H4配對，包括突變型a、b及c其與L13突變型配對。另一方面’亦發 現L28可與重鏈群組H2中之單一成員配對。七種H4a重鏈序列中之兩種可與輕 鏈L13a配對以及七種H4a重鏈序列中之五種可與輕鏈L28a配對。總之，這些 發現揭示多重重疊-延伸RT-PCR事件（其中具有兩種TT-專一性抗體產生漿細 胞，為H2-L28與H4a-L13a之組合)存在於單一孔中。少數輕鏈與重鏈基因配對 之混雜事件，例如H2及H4a與L28配對，係如實驗所預測係根據漿細胞之限制 稀釋。
來自相同群組之可變重鏈及可變輕鏈編碼序列之同源對與突變型間的序列 相似性至少為90%及較佳為95%«例如，來自群組H1突變型a之g060g〇3與 g060a01。選殖株g〇60g03相當於核苷酸序列識別號配對168 : 215，其中可變重 鏈編碼序列相當於序列識別號：168以及該可變輕鏈編碼序列相當於序列識別 號：215。選殖株g060a01相當於核苷酸序列識別號配對133 : 180。當序列識別 號：168與序列識別號：133(可變重鏈）比對時，4/369個鹼基不完全相同以及 至於可變輕鏈(序列識別號215與180)中8/327個鹼基不完全相同，故此兩個同 源對(g060g03與g060a01)之序列相似性相當於98. 3%。然而，當檢視不同群組 間之序列相似性時，不會期望該序列相似性具有高百分比，因為其係多株選瘦 之子-基因庫而期望其具有多樣性。於此特定實施例中同源對間之最低相似性為 約40%(例如g〇6〇bll與g060hll間之序列相似性為39. 5%)。 本發明之一具體實施例係免疫球蛋白重鏈可變區及輕鏈可變區編碼序列同 源對之子-基因庫，其中得自該基因庫之免疫球蛋白可與破傷風類毒素反應或結 合
本發明之另一具體實施例係免疫球蛋白重鏈可變區及輕鏈可變區 同源對之此等子-基因庫，包括各同源對與另一個序列識別號配對^具有序， 90%之相似性，該序列識別號配對係選自序列識別號配對135 : 18 .至少 ^ X 0〇 · XI^ \ 146 : 193、151 : 198、173 : 220、152 : 199、164 : 21 卜 148 . lot： 奶.195 、 137 : 184、 169 : 216、138 : 185、143 : 190、161 : 208、166 : 213、157 . 、139 : 18fi、 134 : 18卜 150 : 197、156 : 203、158 : 205、170 : 217、Π8 . ,. ιηι 〇 .奶、141 : 188 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977 1
Seq prot. 183276 216309 1 181274 1 193286 194287 202295 210303 199292 223316 225318 | 221314 | 200293 212305 196289 203296 215308 185278 217310 224317 186279 227320 191284 | 213306 | 209302 Seq nucl. 89182 122215 87180 99192 100193 108201 116209 105198 129222 131224 127220 106199 118211 102195 -1 109202 | 121214 | 91184 123216 130223 92185 133226 97190 oa <NI 05 115208 Vkappa 種株 DPK9 DPK9 DPK9 DPK22 DPK22 DPK22 DPK22 DPK4 DPK4 | DPK4 | DPK4 | DPK4 | 1 DPK4 1 | DPK22 1 DPK22 | | DPK22 | DPK9 DPK9 DPK9 LI 2a LI 2a DPK8 DPK8 DPK24 家族 ΗΗ VKIII VKIII VKIII VKIII H-H 1—^ VKIII VKIII VKIII μ—4 1—H > VKIV M-型 CO CO CO CO cd cO cC cO 〇 CO CO CO 1 CO cC CO CO CO <Λ cd 群組 i 1 o <=> Z3 〇 o Z3 2 2 寸 03 Csl 2 寸 2 CO Z3 CO H3 CO r-H CO 2 CO Cvl CO 2 L28* Seq prot. 136229 169262 134227 146239 147240 155248 163256 152245 176269 178271 174267 153246 165258 149242 156249 168261 138231 170263 177270 139232 180273 144237 166259 132255 Seq nucl. 42135 75168 13340 52145 53146 61154 69162 58151 82175 84177 80173 59152 71164 l 55148 62155 74167 44137 76169 83176 45138 86179 50143 72165 68161 種株 DP-14 DP-14 DP-14 DP-77 DP-77 DP-77 DP-77 DP-10 DP-10 DP-10 DP-10 | DP-10 | | DP-10 | DP-73 DP-73 DP-73 DP-73 DP-66 DP-66 VII-5 VII-5 VII-5 VII-5 | DP-88 家族丄 s CO S CO w CO w CO K * > * s s L〇 lO S LO w 03 * CNI S > CO K M M-型 CO cd 03 CC cO CO CCS CO CO ϋ 〇3 ¢0 cO 1 cC CO CO CO ¢0 CO 1 群組 s »™ ^ 03 £ s CNI s * οα Μ CO as LO LO s LO CO £ C^-j 〇〇 £ 〇〇 K ¢3¾ ac & SC 選殖株編號 g060a03 g060g03 g060a01 g060bl2 g060c03 g060d08 g060f06 g060d04 g060h02 g060hl0 g060gll g060d05 g060f09 g060c07 g060dll g060g02 g060a09 g060g04 g060h04 g060al0 g060hl2 g060b09 g060fl0 g060f05 s ΜΟΘεη-ΗΙίο·· dd-000LnVD-8 寸Ο 9 1333977 214307 1 222315 205298 187280 197290 207300 182275 198291 211304 1 188281 190283 208301 220313 201294 204297 206299 219312 195288 218311 226319 189282 184277 192285 120213 128221 111204 93186 103196 113206 88181 104197 117210 941B7 1 96189 114207 126219 107200 110203 112205 125218 101194 124217 132225 95188 90183 98191 DPK9 DPK9 DPK8 DPK9 DPK9 DPK8 CD T—^ DPK22 DPK22 DPK24 | DPK24 DPK24 DPK24 DPK24 DPK22 DPK22 DPK22 DPK22 DPK9 LI 2a DPK1 DPK1 DPK1 t—1 h-H »—H 1—4 > 1—1 ►—« VKIII VKIII 丨 VKIV 1 VKIV VKIV VKIV VKIV VKIII VKIII VKIII VKIII cd CC 1 cd X5 1 1 cd cd cO CO CO cO CCS 〇 〇 1 cd 1 CO CO 1 CO CO LO in o 3 3 CO CO L28* I L28* | L28* ! L28* L28* CO CO CO Zj <N1 oo OO t— D— 73166 167260 81174 175268 64157 158251 46139 140233 56149 150243 66159 160253 41134 135228 57150 151244 70163 164257 47140 141234 49142 143236 | 67160 161254 79172 173266 60153 154247 63156 157250 65158 159252 78171 172265 54147 148241 77170 171264 85178 179272 142235 i 137230 145238 48141 43136 51144 DP-32 DP-32 COS-8 DP-77 DP-77 DP-38 DP-77 DP-88 DP-88 DP-88 DP-88 1-. DP-88 1 DP-88 DP-88 DP-88 DP-88 DP-88 DP-88 DP-71 ur> HH DP-46 DP-46 DP-14 CO M >* CO w CO CO w CO X CO s CO K T"H r"H M t—t β r-H W M w r—^ w M CO M CO s H -=c <st 1 CQ 1 <c -< •C < < o CQ o 1 1 1 c〇 CO 1 1-H C<l SE： o CO oa * CO 03 β <N1 CO sc % P3 Μ sc Μ s o <NI za Q〇 p〇 CD P=： g060fll g060gl2 g060f01 g060all g060cl2 g060f03 g060a02 g060d03 g060f08 g060b05 g060b07 g060f04 1 g060gl0 g060d07 g060e05 g060f02 g060g09 g060c04 g060g07 g060hll g060b06 g060a04 g060bl0 •&-<ft5s^^#N^<.pnub9s^yi^f«?Mft5s^^^^^w^^l,*OI^^.l.^l^^^.10J0.b9T^B5rg^*:^^^A^^^*f
1333977 i.表親和力（apparent affinity) 為了決定該表親和力或自盤G060挑選之選殖株的ICs()遂進行競爭分析。 簡言之，使Fab片段於50ml培養基申表現，該培養基如下·· 5〇ml 2 χ γτ/1〇〇 #g/ml Carb/0.1%葡萄糖加入0. 5ml培養一整夜之培養菌，且於37〇c搖動約2 小時》加入IPTG使其最終濃度為0. ImM，以及於3〇°c持續搖動一整夜，次日， 以4000rpm離心15分鐘以收集細菌，以及將沉澱物再懸浮於lml 〇 8inM Em、 0. 4 x PBS、0. 8M NaCl中，以及於/水上培養15分鐘。藉由離心收集細胞間質萃 取物，且儲存於-20°C。 如下述進行競爭分析：將由滴定估量經適當稀釋之細胞間質萃取物加入一 系列試管中。陽性對照組係使用噬菌體呈現衍生之Fab片段mp584，其係衍生自 表現抗-TT抗體之人類融合瘤細胞株HB8501。將可溶性π以ΙΟΟηΜ濃度加至第| 一5式管，以及接者以四倍稀釋之濃度加入下一個試管中，總共有七種稀釋濃度 之ΠΧίΟΟηΜ至25pM)。反應於室溫下培養45分鐘《將樣本轉移至如前述塗覆$ 1 /zg/ml之TT且經封阻之ELISA盤。將盤於室溫下培養1小時，接著以ρβ$_τ 洗滌四次，加入以1 : 10. 〇〇〇稀釋之山羊-抗-人Fab/冊p ,以及培養丨小時。加 入 TMB Plus 受質（KemEnTech，Denmark, cat. No. 4390A)，培養約 1〇 分鐘， 以及以1M ΗΑ〇4使反應停止。將盤於45〇nm下讀取讀值。數據標繪於第24圖。 該經分析之選殖株的表親和力列於表21 : 表21
選殖株 表親和力 g060al0 0. 50nM g060b06 0. 60nM g060bl2 ϊ.2ηΜ g060c04 0. 55nM g060d04 l.lnM g060f01 「l_2nM g060g04 0. 9nM g060g07 0. 35nM g060hll~~~ 3. OnM ' mp584(陽性對照組） 6. OnM 如表21所示，Fab片段之表親和力之範圍係低毫微-莫耳或高微微—莫耳。 再者，與噬菌體呈現衍生之Fab片段相比所有同源對之Fab片段展現出較高的 6048-6508-PF；Chiumeow 85 表親和力。 j.總結 =者而巾，於週邊血料核細齡财仏專—性漿細胞之頻率經計 Γ Γ源對係請3所產生。使用elisa對得自以該同源對 ^自^之選殖株進行篩選，其中339個選殖株於細篩選 271Γ 應性。47個選雜經分析其選殖株之多樣性。此47個選殖株中， 密=證f為唯一之非—混雜可變區編碼序列。其中三個選殖株含有過早的停止 體之方、於H哺錢物表現賴前需_正。該轉移至哺乳動物表現載 二:法J說明於實施例6之h 一節。測量所挑選之選殖株的表 圍係自低毫微-莫耳至高微微-莫耳。 k.展望 =風類毒素為最具毒性之物f中的―種已知其致命㈣僅需少量毫微 素係由破傷風㈣產生，其係广種土壤_亦存在於人類之消化管中 同達25/。。該破傷風免疫計畫已有效防止該疾病發生於西方世界，然而每年仍有 數二1〇3案例發生於主要之西方國家，個案死亡率為5〇%。第三世界之案例 _㈣夕。生長於受巧染之穿入性傷口的細菌可能會釋出毒素，最終造成 僵硬、痙攣、呼吸中止以及死亡。 :離自對破傷風類毒素具有高力價之抗體反應之人類血液捐贈者之高度免 疫球蛋自產物可祕驗破傷風或者若初_絲療已形权破傷風， 性免疫作用結合。然而，由於人類產物之不足，第三世界係使用馬科之 疫抗-補_#素。於治毅/或蕭之職上，減傷職毒素之重 二Γ株或多株抗體具有取代高度免疫之球蛋白產物的潛力。已揭示由習知融 π術所仔之重組單株抗體可有效對抗π(αιίη，j.等人2〇03·Bi〇i〇gicais ’ 53)。有趣地，當混合兩種單株抗體時可發現協同作用。因此，重組之 多^抗-破傷風類毒素抗體可與破傷風類毒素反應或結合而有效地治療或預防 保濩具有罹患破傷風風險之病患。 ^發明之-具體實施例係一種可與破傷風類毒素反應或結合之重組之多株 免疫球蛋白或其片段。 j發明之較佳具體實關係—種可與破傷聰毒素反應或結合之重組之多 株免疫球蛋自，麵由減妓自重鏈可變區及_可變區之哪對所構成。 86 6048-6508-PF；Chiumeow 1333977 本發明另一具體實施例係一種可與破傷風類毒素反應或結合之重組之多株 免疫球蛋白，其係根據本發明之方法而獲得。 本發明另一具體實施例係一種可與破傷風類毒素反應或結合之重組之多株 免疫球蛋白’其包括各個免疫球蛋白重鏈可變區及輕鏈可變區之同源對，各同 源對與另一個序列識別號配對間具有至少90%之相似性，該序列識別號配對係選 自序列識別號配對 229 : 276、262 : 309、240 : 287、245 : 292、267 : 314、246 : 293'258 : 305、242 : 289、231 : 278、263 : 310、232 : 279、237 : 284、255 : 302、260 : 307、251 : 298、233 : 280、228 : 275、244 : 29卜 25G : 297、252 : 299、264 : 3U、272 : 319、235 : 282 或 238 : 285。 本發明又一具體實施例係一種醫藥組成物，其包括以可與破傷風類毒素反 應或結合之重組之多株抗體作為活性成分俾用於治療或預防破傷風。較佳地， 該重組多株抗體係與醫藥可接受之賦形劑組合。 本發明另一具體實施例係將可與破傷風類毒素反應或結合之重組之多株免 疫球蛋白作為藥劑以治療或預防保護具有罹患破傷風風險病患之用途。 其他具體實施例係一種預防或治療具有罹患破傷風風險之病患的方法，該 方法係對有g要之病患投予_種包括可與破傷風類毒素反應或結合之重組之多 株抗體之組成物。 實施例12 :得自兩位捐贈者之比較結果 以下實施例係比較得自捐贈者TT03(實施例11)與捐贈者之結果。該 ΤΤ03 TT08 raviL分液中之π專一性级細跑（RusPirn 0-^021% ~ 〇 011¾ PBMC分液中之CD19+細胞(FACS) \\%~~ V/ · U i 丄 /0 PBMC 分液中之漿細胞（FACS CD38hi，CD45in) 0ΓΤ2%·~ ϋ/Ο 0. 08% 經運結之Vh及Vl序列之估計數 4〇Γ~·~~ 400 篩選Fab表現之選殖株數目 1400 2000 f*ab陽性選殖株之數目 482" 558 3400 篩選TT-專一性選殖株之數目 3600 TT-專一性選趸株之數目（2X背景值） 33Γ~~ 188 由篩選ΤΤ-專一性選殖株分析之序列數目 47~~ 102 VH種株對偶基$ 12(νΗΓίΤ~ X \j ΝΑ ΝΑ VL種株對偶基因 8(VKI、in、τν、 唯一同源對的數目 ΎΓ —----1 40 6048-6508-PF；Chiumeow 87 1333977 表親和力範圍
>· 35-3. OnM ΝΑ 者 ΝΑ=未分析 此清楚地閣明性質相似之基因庫可單離自·經Η免疫化之兩個不同的捐贈 於得自ΤΤ08基因庫中唯-同源對之數目較高的原因可能係因為其經分析之 序列數較多。 實施例13:比較實施命Π1之同源對基因料由相同捐贈者所產生之&合式嗤菌 體呈現基因庫 本實施例中，為了比較同源對基因庫與組合式基因庫之基因庫多樣性、親
和性以及專-性’遂使贱前躲製備同源對基因庫之相同捐贈者來製備组合 式噬菌體呈現基因庫。 a.組合式噬菌體基因庫之構築 嗤菌體呈現基因庫係由捐贈者TT03(與實施例lie所得之細胞分液相同）之 CD19+細胞分液所產生。 使用趾16〇^11尺^[套組咖(：1^丫-^61。&1:.1 740 962.20)自約 5xl06個CD19+細胞製備總RNA ^接著使用ThermoScript逆轉錄酶(Invitrogen cat· no. 11146-016)於募(dT)-引導之反應(〇iigo(dT)—primedreacti〇n)中合 成 cDNA 〇 使用 HotMasterTaq DNA 聚合酶(Eppendorf cat. no. 0032 002. 692)以及 實質上如 deHaard 等人(J. Biol. Chem. 274, 18218-18230; 1999)所述之引 子（僅於5’ -端關於限制酵素識別位置上進行修飾）將…及凡鏈以pcR增幅❶ φ 相繼將/c及V«PCR產物插入Em351噬菌體呈現載體（由Den, W.等人於1999 J. Immunol. Methods 222，45-57所述之Phh3加以修飾而得）而產生組合式噬 . 菌體呈現基因庫》 將最終之基因庫以電穿孔方式送入TG1大腸桿菌菌株(Stratagene)。組合 式基因庫之大小含有3xl06個具有高插入頻率(high insert frequency)之獨立 的選殖株。 b.組合式基因庫之淘選 根據抗體工程’實用法(Antibody Engineering, A Practical Approach 1996, ed. McCafferty，Hoogenboom及Chiswell)之標準程序製備呈現Fab之噬菌粒。 6048-6508-PF;Chiumeow 88 1333977 將破傷風類毒素(ΤΤ ; SSI批號89-2)以PBS稀釋至leg/inL，且固定於 MaxiSorp 免疫試管（imraunotubes，Nunc cat. no. 444202)以進行淘選。經過一 個小時之培養以及數次洗滌步驟後，使用100mMTEA(三乙基胺）洗提出結合之噬 菌粒。 中和噬菌粒洗出液，以及將其用於感染呈指數生長之TG1細胞，由此得到 呈現Fab之噬菌粒（其TT專一性經擴增）。依照上述一般程序使用經洗提之噬菌 體進行第二回合之淘選。 同樣地’依照上述程序對該破傷風類毒素分子之C-片段進行三次淘選。 自未挑選之基因庫中以及每次淘選回合後自上述淘選之各組中，篩選可與 破傷風類毒素及C-片段結合之單一選殖株。 c.比較組合式噬菌粒選殖株與同源對選殖株之專一性及親和性 單一選殖株係淘選自未挑選之基因庫以及每次淘選回合後（分別為針對完 整之破傷風類毒素(TT)以及該破傷風類毒素之C-片段）。藉由ELISA分析法分析 呈現Fab之嗟菌粒》展現π及/或C-片段反應性（至少2x背景值反應性以及4X 背景值反應性）之Fab-陽性選殖株之數目顯示於下列表23至25。所有結果係以 專一性選殖株之數目/Fab-陽性選殖株之數目表示 擴增 2χ背景值 4x背景值 ~ 未挑選之選殖株 - 13/約 5000 笫i回合淘選後 61/99 59/93 第2回合淘選後 165/169 163/166 ，表M : i十對ΊΤ挑選及以c-片段-糞一押PT TQA厶- ί 斤之選殖株 2χ背景值 4χ背景值 未挑選之選殖株 〇ΤΪ3 ms ~ 第1回合淘選後 0/85 5/85 弟ζ回合淘選後 0785 - mb ' 表25 :針對〇片段挑撰 1撼播 專一性ELISA分析之選殖株
以TT 對嗟菌體呈現基因庫進㈣選顯示當崎之回合次數增加時ττ 專一 6048-65〇8-pf；Chiumeow 89 1333977 性選麟之數目增加，以及僅少數選殖株於未㈣之基因庫中較出^於未挑 選之基因庫巾或騎ττ之基⑽進行兩Θ合之鱗後未魏可與破傷風類毒素 C-片段反應之選殖株。為了自組合式噬菌體呈現基因庫得到具有c片段專一性 之Fab片段，需將此基因庫以c_片段進行專一性的淘選。 為進行比較，將得自實施n之13個Π-專一性選殖株進行c_片段—專一性 ELISA分析’其中7個顯示出2χ背景值以上之反應性。因此，對破傷風類毒素 C-片段具有專-性之Fab片段可於得自經π免疫化之個體的同源對基因庫中表 現0 此清楚地闡明使用淘選來鑑定對特定抗原具有專一性之選殖株的缺點。若 重要的抗原片段或表位係未知的，其可能於淘選中排除，因而造成效力較弱之 最終產物。
再者，組合式選殖株之表親和力係如實施例Ui所述之分析法予以測定。I 對得自經兩回合TT淘選後之10個組合式選殖株進行分析，結果顯示士人 親和力為1至15nM間。 °σ 至於得自同源對基因庫（表21)分析之9個選殖株中之4個選殖株，顯示出 落於微微-莫耳範圍之親和力。 ’ 此表示可變區之配對(原本由捐贈者免疫系統所挑選者)與體細胞高頻率突 變（經進行崎之g&對)之組合可能造成比此等可魏賴組合較高之表結 和力。 、。〇 d.比較TT專一性組合式噬菌粒選殖株與同源對選殖株之序列 排除由兩基因庫所產生之大量的序列數據之原始序列的直接比較。為了觀φ 察體呈現基因庫與同源對基因庫"„料序列對之不同，製作M W序列 之系統樹’以及以點陣列說明該配對。於點陣列中（第25圖）系統資訊之配對顯 不出於兩基因庫中V«與Vl序列之分布曲線非常不同。嗤菌體呈現基因庫中％與 V*·序列對之散佈現象（第25A圖）指出Vh與基因間少有系統關聯此與此基因庫· 令:基因之隨機配對結果一致❶反之’同源對基因庫之％與仏序列對（第2兕圖） 顯不出聚集之現象表示V基因如峨望之朗轉共_演化。再者，相較於组人 式基因庫之V-基因，同源對基因庫之v_基因具有較大之基因多樣性，此表示^ 離同源對之V-基因的方法較無偏見。 實施例14 :使用T-細胞作為模板來源之組合之單一步驟多重重疊_延伸rt pcr 6048-6508-PF;Chiumeow 90 1333977
以及巢式PCR 淋巴細胞進行單一步驟多 此實施例中，說明如何以衍生自人類捐贈者之τ 重重疊-延伸RT-PCR。 a. 取得含有細胞分液之淋巴細胞 自具有所欲抗原（例如，經由免疫化作用、线的感染、惡性腫瘤、㈣自 體免疫反應 '或其他疾病）之人類捐贈者取得血液樣本。使用 L_ho卿(AxiS-Shield，〇sl。N。卿，㈣ N。⑽19 明手冊單離出週邊錢軸細胞㈣e)。 本實施例中抗原-專-性T細胞係進-步由PBMC分液之刺激而產生。缺而， 該多重重疊-延伸RT-PCR亦可直接於得自PBMC分液之單一細胞或經擴增τ細胞 之細胞分液(例如藉由FACS-分類取得CD3-陽性細胞）中進行。 b. 產生抗原-專一性τ細胞 將PBMC細胞分液再懸浮於適當的培#基中，該培養基含有重要之細胞介素 例如IL2。再者，將所欲之抗原加入至培養基中，其中該抗原會藉由存在於· 分液中之抗原呈現細胞(antigen presenting eeU，Apc)呈麟τ淋巴細胞。 或者’事先處SAPC料細胞(feeder cell)使其可呈現所欲之抗原再將該細胞 加入至PBMC分液中。此等APC餵養細胞可為暴露於所欲抗原之Apc，該抗原之 形式例如胜肽、蛋白質或其他分子形式，或為經微生物感染之Apc或經轉染而 可表現及呈現抗原之細胞，或與其他抗原細胞共培養之他[，例如呈現原生組織 或細胞株形式之癌細胞。自文獻中可知許多不同形式之Apc餵養細胞，包含經 轉形之細胞株、B細胞株、樹狀細胞等。 將PBMC分液培養約3至5星期’期間基本上每星期加入新鮮的抗原呈現細 胞與細胞介素。此造成T淋巴細胞之增殖、活化及成熟《於培養期間之末期該 細胞培養中將以抗原-專一性T細胞為主。根據疾病、抗原、APC細胞以及刺激 期間所使用之細胞介素混合物，這些細胞為CD4+或CD8+。 抗原專一性可藉由例如CTL分析、增殖分析以及具有所欲抗原之MHC四聚 物予以測試(Altman, J.D.等人 1996· Science 274, 94-96)。 將抗原-專一性T細胞分配至PCR試管中，為了使每個容器中具有單一細 胞’可藉由限制稀釋或使用FACS。該容器可儲存於-80直到欲使用時。
c.單一步驟多重重疊-延伸rt-PCR 6048-6508-PF;Chiumeow 91 1333977 使用 Qiagen One-Step RT-PCR 套組（Qiagen cat. No 210212，Hilden， Germany)，實質上根據製造商之建議進行多重重疊-延伸rt-PCR。於PCR試管中 添加PCR反應混合物前，將細胞解凍。 PCR反應混合物及循環條件最初係如實施例11 e-i所設定者。然而，因為 新的引子組而將特定用量最佳化。 所使用之多重重疊-延伸引子混合物包括表26所示之引子》 表26 引子 名稱 濃度 序列 識別號 5’至3’方向之引子序列 va 各 ΙΟηΜ 322 tattggcgcgccatggccGCCCAGTCTGTGACCCAGC 323 tattggcgcgccatggccGCCCAGAAGATAACTCAA 324 tattggcgcgccatggccGATGCTAAGACCACCCAG 325 tattggcgcgccatggccGCCCAGACAGTCACTCAG 326 tattggcgcgccatggccAAACAGGAGGTGACACAGA 327 tattggcgcgccatggccGGAGACTCGGTTACCCAGA 328 tattggcgcgccatggccGGAGATTCAGTGACCCAGA 329 tattggcgcgccatggccAGCAATTCAGTCAAGCAGA 330 tattggcgcgccatggccGGACAAAACATTGACCAG 331 tattggcgcgccatggccAAAAATGAAGTGGAGCAGA 332 tattggcgcgccatggccGAAGACCAGGTGACGCAGA 333 tattggcgcgccatggccGGAATACAAGTGGAGCAGA 334 tattggcgcgccatggccCTACATACACTGGAGCAGA 335 tattggcgcgccatggccGAAGACAAGGTGGTACAAA 336 tattggcgcgccatggccGAAAACCAGGTGGAGCACA 337 tattggcgcgccatggccCAGGAGAATGTGGAGCAG 338 tattggcgcgccatggccGGAGAGAGTGTGGGGCTG 339 tattggcgcgccatggccGGAGAGGATGTGGAGCAGA 340 tattggcgcgccatggccAGCCAAAAGATAGAACAGA 341 tattggcgcgccatggccAGTCAACAGGGAGAAGAG 342 tattggcgcgccatggccCAACAACCAGTGCAGAGT 343 tattggcgcgccatggccAGCCAAGAACTGGAGCAGA 344 tattggcgcgccatggccGGTCAACAGCTGAATCAGA 345 tattggcgcgccatggccACCCAGCTGCTGGAGCAGA 346 tattggcgcgccatggccCAGCAGCAGGTGAAACAA 347 tattggcgcgccatggccATACTGAACGTGGAACAA 348 tattggcgcgccatggccGACCAGCAAGTTAAGCAA 6048-6508-PF；Chiumeow
92 1333977
349 tattggcgcgccatggccGGACAACAGGTAATGCAA 350 tattggcgcgccatggccAAGGACCAAGTGTTTCAG Ca ----- 200nM 351 TAGGCAGACAGACTTGTCACT 352 gccatggcgcgccaatagctagccGGTGAAGAAGTCGCCCAGA 353 gccatggcgcgccaatagctagccGATGCCATGGTCATCCAGA 354 gccatggcgcgccaatagctagccGAAGCCCAAGTGACCCAGA 355 gccatggcgcgccaatagctagccCATGCCAAAGTCACACAGA 356 gccatggcgcgccaatagctagccGACACAGCCGTTTCCCAGA 357 gccatggcgcgccaatagctagccGAAACGGGAGTTACGCAGA 358 gccatggcgcgccaatagctagccGAACCTGAAGTCACCCAGA 359 gccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGACATCTACCAGA 360 gccatggcgcgccaatagctagccATATCTGGAGTCTCCCACA 361 gccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGGAATCACCCAGA 362 gccatggcgcgccaatagctagccAATGCTGGTGTCACTCAGA V, 各 ΙΟηΜ 363 gccatggcgcgccaatagctagccAGTGCTGTCGTCTCTCAA 364 gccatggcgcgccaatagctagccGACGCTGGAGTCACACAA 365 gccatggcgcgccaatagctagccGATGGTGGAATCACTCAGT 366 gccatggcgcgccaatagctagccACTGCTGGGATCACCCAG 367 gccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGGAGTTGCCCAGT 368 gccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGGAGTGGTTCAGT 369 gccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGGAGTTACTCAGT 370 gccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGTAGTTACACAA 371 gccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGGAGTTATCCAGT 372 gccatggcgcgccaatagctagccGGTGCTGGAGTCTCCCAG 373 gccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGATGTTACCCAGA 374 gccatggcgcgccaatagctagccTCTCAGACTATTCATCAAT ΚΓ w——. 200nM 375 CAGGCACACCAGTGTGGCCTT
d.半巢式-PCR 同樣地，如實施例11 e-2所述進行半巢式-PCR，且可對其進行最佳化之調 整。 所使用之引子顯示於表27。 表27
弓1子 名稱 濃度 序列 識別號 5’至3’方向之引子序列 Ca 200nM 376 caccttagagctcTTAGAGTCTCTCAGCTGGTACAC c, 200nM 377 gacattatgCAtGATCTCTGCnCTGATGGCTC 大寫之序列相當於基因-特定區。 6048-6508-PF;Chiumeow 93 1333977 為了證實多重重疊-延伸RT-PCR已成功，自半-巢式PCR反應取出部份樣本 進行分析，該分析係自半-巢式PCR反應取出10/z 1樣本於1%瓊脂凝膠上進行電 泳並使用溴化乙錠予以檢測。該重疊-延伸片段之預期大小係約85〇bp(確切的大 小係根據該可變區之長度）。 · 自源自相同捐贈者之所有已進行之反應中取約10# 1，合併於單一試管中。 接著使用QIAquickPCR純化套組根據製造商所述之程序(Qiagencat. No. 281〇6，
Hilden，Germany)將部份經集合之PCR產物純化《將經純化之重疊PCR產物集 合物以適當之限制酵素進行切割以及接著進行純化然後插入至適當的載體中。 本實驗中半-巢式PCR所使用之固定區引子(序列識別號376及377)係設計 用於將該半-巢式PCR產物次-選殖(sub-clone)至適當的載體中。引子之設 計係依照於冷鏈固定區胜肽中之位置21處將SER變更為Met之改變，因而可將鲁 Nsil位置引入至核酸序列中：
Nsil
tcc cac — atg cat SER HIS MET HIS 此轉變應相當安全因為SER 21係暴露於/3鏈固定區該域之膜近端的圈狀結 構中。其係相當保留性之改變因此不會擾亂整體域之結構。
Co:引子之設計係依照相當於α鏈固定區胜狀中之位置15至I?處之核普酸 改變，因而可將SacI位置引入至核酸序列中：
SacI
aaa tcc agt — LYS SER SER
aag age tet LYS SER SER 因此適合的載體將含有該TcRa及/5鏈之固定區的剩餘部份以及含有適當 修飾之限制位置。 此等改變可使用標準PCR及次-選殖技術進行。 e.其他考量 於多重重疊-延伸PCR增幅作用中，大量之可變區引子可能會以抑制之方式 相互影響m免響’可將可變㈣子分成次训秦set)且以適當组 合分開使用。 其他具體實施例 6048-6508-PF;Chiumeow 94 1333977 此說明書中引用之所有刊物及專利申請案皆以參考資料合併於本文如同各 個別的刊物或專利申請㈣具體且_地指示以參考諸合併於本文。為了清 楚理解之目的，前述本發明已以_及實施例之方式予赠細綱，然而熟於 此技藝者應《_白在料離隨附之巾請專利_之精神及範訂可依照本 發明進行某4b改#及修偷。 【圖式簡單說明】 第1圖侧解說明不同類型之重疊一延伸尾部。粗線相當於引子之基因_特 定部份以及普通之線相當於重疊之尾部。該直紋表示互觀i引子可幫助兩 個有興趣之核序列的連接1 i⑴圖說明丨型重疊_延伸尾部之兩種變化， 其中只有延伸之尾部重疊，該重疊為完全重疊或部分重疊；帛丨（⑴圖說明Η · 型重疊-延伸尾部，其巾第-引子延伸尾部之部分5___麟近之引子的基 因-特定部份互補；第1(111)圖說明ΠΙ型重疊_延伸尾部，其中整個重疊延伸 尾部係與鄰近之引子的基因-特定部份互補。 第2圖係概要式的圖解顯示多重重疊-延伸引子混合物可應用於免疫球蛋白 可變區編碼相之連接’可編碼出欲進行連結之輕鍵⑽及重鏈可變區㈤ 之cDNA以管狀物表示並標明其有意義股之5’及3, @以及經增幅後之產物的 預期大小。用於增幅該編碼序列之多重重叠一延伸引子對係以箭頭表示。具有虛 線5突出部分之彎曲的箭頭係代表進行選殖之尾部。重疊—延伸尾部係以粗線 表示。出現於尾部中之限制位置係以相關之尾部命名。該多重重疊_延伸引子混 合物中引子的總數為十六個’分布於外側引子（包括一個匕及一個^引子〉以及馨 重疊延伸引子（包括六個Vl及八個Vh引子）。該Chi引子於重鏈固定域丨之5，端 煉合。預期該得自多重重疊-延伸RT-PCR之產物約為1〇7〇bp包含整個凡輕鏈(由， 固定區、接合基因（joining gene)以及可變基因（C/c+Jl+Vl)構成）以及該重鏈可 變區（由可變基因、多樣性斷片（diversity segment)以及接合基因（…祁+^構 成）。5及3表示開放閱讀架（open reading frame)之方向。只有小部分之 (^區編碼序列係藉由此多重重疊_延伸引子混合物進行增幅，因為該u引子之 煉合位置接近該重鏈J-區。 第3圖係圖解說明一系列不同連結方位之產物，其可根據具有該連接用尾 部之引子而獲得。黑色區塊表示該重疊區。5’及3，表示開放閱讀架之方向。 6048-6508-PF；Chiumeow 95 1333977 第3A圖係圖解說明頭-對-頭方向之產物。第3β圖係圖解說明尾_對_尾之方向。 第3C圖係圖解說明頭-對-尾之方向以輕鏈編碼序列優先。第3D圖係圖解說明 頭-對-尾之方向以重鏈編碼序列優先β 第4圖係該免疫球蛋白表現載體pLLli3之圖解，其中該編瑪序列係頭-對_ 尾之方向。該載體包括下列元件：bla=表現安比西林(ampiciiiin)抗性基因之 啟動子。Amp=編碼安比西林抗性之基因。pUC〇ri=pUC之複製起點。AdMLp=腺病 毒主要晚期啟動子(adenovirus major late pr〇m〇ter)。人類Ig(J1=編碼免疫球 蛋白同種型G1重鏈之序列。hGH pA=人類生長激素聚A訊號序列》bGH polyA= 牛生長激素聚A序列。人類/cLC=編碼免疫球蛋白&輕鏈之序列。FRT=Flp識別 標的位置。濕黴素(Hygromycin)=編碼濕黴素抗性之基因。SV4()丨A= 4〇聚A訊號序列。 第5A圖係顯示由兩-步驟多重重疊-延伸RT_pcR接著進行半巢式pcR之結 ，的電泳凝膠。該增幅侧之產物係衍生自從單—⑽Flp_In pLU13細胞中 單離之cDNA。第1至12攔係樣本欄以及箭頭指出i〇76bp之正確的巢式多重一 重疊延伸RT-PCR產物，Ml係' l〇〇bp階段標記。W係作為陰性對照組模板之水。 C係衍生自細胞株HB-8501之陽性cDNA對照組模板。為了解析各個j)NA片段以 較低的反差於分離之顯示平Φ巾描射目同之w、G以及腿p職標記欄。第5β 圖係第5A圖所示之凝膠的素描圖，標明凝膠上有意義之片段。 〇〇第6圖係一系列之電泳凝膠照片及圖示，顯示無額外之PCR增幅作用下， 單；步驟多重重疊-延伸RT-PCR反應之結果。各顯示平面中，M1係1〇〇bp階段 標記以及M2係、5_p階段標記。第6A ffl係-電泳凝膠，顯示該增幅作用之產 物，其係得自相當於100、10、i或〇個細胞之溶胞產物。箭頭指出該重疊—延 伸產物° f⑽隱帛6A騎示之麟的素觸。帛6C圖係-電;後膠，證實 重疊-延伸產物存在於第6A圖之⑽及1個細胞樣本攔怜第6D圖係I電泳凝 膠’顯示出分別以Nhel及Ncol限麵切割該第6C s中i個細胞樣本攔之 -延伸產物。 ，第7圖係一電泳凝膠，顯示得自單一步驟多重重疊—延伸RT_pcR及接著進 行半-巢式PCR增幅作用之結果。M1係薦p階段標記以及M2係5_ρ階段標 記。產生多重重疊-延伸引子混合物，其包含Cbi、^&、或&作為多重 重疊-延伸RT-PCR反應之外侧引子。該反應係於相當於刚、1〇、丨或Q細胞之 96 6048-6508-PF；Chiume〇w 1333977 溶胞產物巾餘。魏該轉-延伸趋。_該重疊_延伸產物之大 小0 ，8圖係-電泳凝膠’顯示得自單—步驟多重重疊延伸㈣⑶及接著使 用大篁之人類B淋巴細胞作為模板進行半_巢式pcR增幅作用之結果。奶係腿p . 階段bsi。第5及請顯示該重叠-延伸產物預期大小之寬帶。 第9A圖係用於產生igG卜λ表現細胞株之哺乳動物表現載體 (Em465/01P582/Em465/GlP581)之贿，其巾該編碼序列係頭_對_頭之方向^該. 載體包括下列το件：Amp=編碼安比西林抗性之基因。pUC 〇ri=pUC之複製起點。 AdMLP=腺病毒主要晚期啟動子。EFp=延長因子啟動子（e1q喊i〇n factor promoter)〇AP leader-鹼性磷酸酶領導序列。VH=重鏈可變區編碼序列^丨甙丨hc= 編瑪免疫球蛋白同種型G1重鏈固定區之序列。rBG p〇lyA=兔卜球蛋白聚A訊鲁 號序列。bGHpolyA:牛生長激素聚A序列。IgK leader=編碼鼠類&之領導序列。
IgL(lb或le>編碼免疫球蛋白；^f鏈家族比或le之序列。FRT=Fip識別標的 位置。濕黴素=編碼濕黴素抗性之基因。SV4〇 p〇lyA=狼病毒4〇聚A訊號序列。 第9B及9C圖係裝載分別單離自細胞株⑽Flp一In/Em464/〇lp58i及⑽
Flp-In/Em464/01P582之PCR產物之經漠化乙錠染色之壤脂凝膠。第J至4搁中 用於進行多重重疊-延伸RT-PCR反應之總腿模板之濃度為5〇pg、枷、〇晌、 或 Opg。Ml 係 lGGbp P皆段標記(New England Bidlabs，New England，USA)。箭 頭指出該重疊-延伸PCR產物。 ’ 第10醜示為了產生同源抗體表現基因庫所應用之步驟之流程圖，由該基 因庫中可表現出多株或單株抗體。 ° 土 9 第11圖係JSK301之圖解，其係-種大腸桿菌載體，藉由將含有同源可變 區編碼序列之重疊-延伸牌插人至載體巾職示之_/χΜ聞位置俾騰 產生Fab之基因庫。該載體包括下列元件：及pr〇=安比西林抗性基因 及其啟動子。pUcl90ri=複製起點。人類cm=編碼人類免疫球蛋白7 !重鏈域1 . 之序列。填充序列=無意義之序列插入物其於插入該重疊_延伸片段時切除。tac P及lac Z=細菌之啟動子可於Nhel及AscI限制位置間切除。 第12圖圖解說明同源Fab表現載體之基因庫之產生。步驟丨說明經由 Xhol-NotI之切割將可變區編碼序列（vm-VL至vhx-vlx)之同源對插入至大腸桿 菌載體JSK301中。步驟II說明經由Asci-NheI之切割而插入細菌啟動子及^ 6048-6508-PF;Chiumeow 97 1333977 導序列卡匣(災7B領導序列-p tac-啟動子可驅動VHx之表現以及P lac啟動子 -pe/B領導序列可驅動VLx之表現）。 第13圖係說明利用單一步驟多重重疊-延伸RT_pcR接著進行另一次汽^增 幅作用以連接構成G-蛋白質之、召-、及厂次單元。各編碼區之大小以及經 連結之產物的大小皆已標示出來。於最終產物中標明由增幅作用之引子尾部所 引入之限制位置。 第14圖顯示下列各項之分析性FACS染色之點圖：（Α)自捐贈者之血液中純 化之PBMC ; (B)磁分類(magnetically sorted)之未經標示之CD19陰性細胞分液 以及(C)磁分類之CD19+細胞分液。亦顯示各分液之散佈圖、CD19/CD38點圖、 以及CD38/CD45點圖。 第15圖顯示第9C圖之CD19+分液，其係經儲存於液態氮中，經過解凍以及| 以抗-CD19、抗-CD38、以及抗-CD45染色。第15圖顯示相當於第9C圖之點圖。 第16A圖至第16B圖顯示用於分類CD19+細胞分液之途徑。使用根據CD38 以及CD45之散佈途徑以及螢光途徑單離CD38高量（CD38hi)、CD45中等量 (CD45in)之細胞。 第17圖係一電泳圖，顯示於捐贈者TT03所進行之成功的多重重疊-延伸 RT-PCR反應(A列’ 1至12孔來自八組96孔盤）。將樣本施加於瓊脂凝膠之A及 B兩列，各列含有48個樣本。該重疊-延伸片段之預期大小約為i〇7〇bp。以箭 頭標示出所推測之重疊-延伸片段。 第18圖顯示來自盤G060之細胞間質萃取物之ELISA分析。以羊如)-抗_ 人/c塗覆該ELISA盤，且經捕捉之Fab片段係以HRP-共輛gt-抗-人Fab-專一性 抗體進行檢測β 第19圖顯示來自盤G060之細胞間質萃取物之ELISA分析。以10微克/毫 升之卵白蛋白（Sigma A-5503)塗覆該ELISA盤，且經捕捉之Fab片段係以HRP-共軛gt-抗-人Fab-專一性抗體進行檢測。 第20圖顯示來自盤G060之細胞間質萃取物之ELISA分析。以破傷風類毒 素(Tetanus Toxoid)塗覆該ELISA盤，且經捕捉之Fab片段係以HRP-共軛gt-抗-人Fab-專一性抗體進行檢測。 第21圖顯示來自盤G060之細胞間質萃取物之單步驟競爭型ELISA分析。 以破傷風類毒素(TT)塗覆該ELISA盤，以及為了對Fab片段(得自細菌之上清液) 6048-6508-PF；Chiumeow 98 1333977 與固定化Π之結合進行競爭，遂於各孔中加入ι〇1之可溶性TT。經捕捉之Fab 片段係以HRP-共軛gt-抗-人Fab-專一性抗體進行檢測。 第22圖顯示來自盤G060之TT抗原-結合選殖株之可變重鍵蛋白質序列之 比對。序列之同源程度係以不同的明暗度表示；1 〇〇%、80%以及60%分別係以黑、 灰、以及淡灰色顯示。CDR1係位於比對位置34至41。CDR2係位於比對位置55 至73。CDR3係位於比對位置107至127。早熟之停止密碼係以星號標示。該比 對係劃分為8個圖（a至h)由左至右分成上列第22a至d圖以及下列第22e至h 圖兩列。 第23圖顯示來自盤G060之TT抗原-結合選殖株之可變輕鏈蛋白質序列之 比對。序列之同源程度係以不同的明暗度表示；1〇〇%、8〇%以及6〇%分別係以黑、 灰、以及淡灰色顯示。CDR1係位於比對位置26至42。CDR2係位於比對位置58 至64。CDR3係位於比對位置97至1〇6。早熟之停止密碼係以星號標示。該比對 係劃分為8個圖（a至h)由左至右分成上列第23a至d圖以及下列第2加至匕圖 兩列。 第24圖顯示競爭型ELISA分析以決定自盤刪選擇之選殖株的表親和力 (apparent affinities)。將濃度為100nM至25pM(四倍稀釋)之可溶性w 液添加至Fab片段，俾對Fab-片段與固定化ττ之結合進行解。反應程 所觀察到之_(於特技可雜ΤΤ濃度下之結合瓶射可^^ 之結合的比例）。 〇合注丨1時
第25圖係-雙親緣_點轉圖，其齡抗體重鏈及輕 因内及基因間之，為了指出特定v基因之實際配對，於變 序列之親緣·樹配對韻體呈現自組合基@ W 株^ B)利用本發明同源對基因庫得到π結合選殖株。 、，·〇合選殖 【主要元件符號說明】 無0 6048-6508-PF；Chiumeow 99 1333977 15S81YY00 序列表 <11C> Symphogen A/S <120> METHOD OF LINKING ENCODING SSQUSMCSS OF INTEREST <130> 15881YY00 <160> 377 <170> Patentln version 3.3 <210> i <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 1 agcctatact attgattagg cgcgcccagr tgcagctggt gcart 45
<210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 2 agcctatact attgattagg cgcgccsagg tccagctggt rcagt 45 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 3
agcctatact attgattagg cgcgcccagr tcaccttgaa ggagt 45 <210> 4 <211> 44 <2i2> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 4 agcctatact attgattagg cgcgccsagg tgcagctggt ggag 4 4 1333977
15881YYOO <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 5 agcctatact attgattagg cgcgcccagg tgcagctaca gcagt 45 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> 45
<223> Primer sequence <400> 6 agcctatact attgattagg cgcgcccags tgcagctgca ggagt <210〉 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220〉 <223> Primer sequence <400> 7 agcctatact attgattagg cgcgccgarg tgcagctggt gcagt 45 <210> 8 <211> 46 <212〉 DNA <213> Artificial
<220> <223> Primer sequence <400> 8 agcctatact attgattagg cgcgcccagg tacagctgca gcagtc <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 9 . gacsgatggg cccttggtgg 2 20 1333977
15881YYOO <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 10 cgcctaatca atagtatagg ctagccgaca tccagwtgac ccagtct 47 <210> 11 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 11 cgcctaatca atagtatagg ctagccgatg ttgtgatgac tcagtct
47 <210> 12 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 12 cgcctaatca atagtatagg ctagccgaaa ttgtgwtgac rcagtct 47 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 13
cgcctaatca atagtatagg ctagccgata ttgtgatgac ccacact 47 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220〉 <223> Primer sequence <400> 14 45 cgcctaatca atagtatagg ctagccgaaa cgacactcac gcagt 3 1333977
15881YYOO <210> <211> <212> <213> 15 47 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 15 cgcctaatca atagtatagg ctagccgaaa ttgtgctgac tcagtct <210> <211> <212> <213> 16 38 DNA Artificial <220> <223〉 Primer sequence <400> 16 atatatatgc ggccgcttat taacactctc ccctgttg <210> <211> <212> <213> 17 26 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 17 atattctcga gacggtgacc agggtg <210> <211〉 <212> <213> 18 25 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 18 atattctcga gacggtgacc attgt <210> <211> <212> <213> 19 27 DNA Artificial <220〉 <223> Primer sequence <400> 19 atattctcga gacggtgacc agggttc 1333977 15881YY00 <210> 20 <211> 25 <212> <213> DNA Artificial - - <220> <223> Primer sequence <400> 20 atattctcga gacggtgacc gtggt 25 <210> <211> <212> <213> 21 51 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 21 accgcctcca ccggcggccg cttattaaca ctctcccctg ttgaagctct t 51 Λ Λ Λ Λ Ο |Η CN 00 ιΗ «~1 ι-Η t-S CM CM CN CN V V V V 22 43 DNA Artificial <220> <223> primer sequence <400> 22 gctagcatta ttattaccat ggcccagrtg cagctggtgc art 43 <210> <211> <212> <213> 23 43 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 23 gctagcatta ttattaccat ggccsaggtc cagctggtrc agt 43 <210> <211> <212> <213> 24 43 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 24 gctagcatta ttattaccat ggcccagrtc accttgaagg agt 43 5 1333977
15881YYOO <210> 25 <211> 42 <212> <213> DNA Artificial - <220> <223> Primer sequence <400> 25 gctagcatta ttattaccat ggccsaggtg cagctggtgg ag 42 Λ Λ Λ Λ Ο rH CN ΓΟ rH rH rH 1-H CNJ CvJ CM CN V V V V 26 36 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 26 tattggcgcg ccatggccsa ggtgcagctg gtggag 36 <210> <211> <212> <213> 27 43 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 27 gctagcatta ttattaccat ggcccaggtg cagctacagc agt 43 <210> <211> <212〉 <213> 28 43 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 28 gctagcatta ttattaccat ggcccagstg cagctgcagg agt 43 Λ Λ Λ Λ Ο ιΗ CM ΓΟ rH I-i rH ι-Η 〇] CM CV) V V V V 29 43 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 29 gctagcatta ttattaccat ggccgargtg cagctggtgc agt 43 6 1333977
15881YYOO <210> <211> <212> <213> 30 44 DNA -Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 30 gctagcatta ttattaccat ggcccaggta cagctgcagc agtc 44 <210> <211> <212> <213> 31 26 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 31 atattctcga gacggtgacc agggtg 26 <210> <211> <212> <213> 32 27 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 32 atattctcga gacggtgacc attgtcc 27 <210> <211> <212> <213> 33 27 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 33 atattctcga gacggtgacc agggttc 27 <210> <211> <212> <213> 34 27 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 34 atattctcga gacggtgacc gtggtcc 27 7 1333977 15881YY00 <210> <211> <212> <213> 35 44 DNA -Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 35 ccatggtaat aataatgcta gccgacatcc agwtgaccca gtct 44 <210> <211> <212> <213> 36 44 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 36 ccatggtaat aataatgcta gccgatgttg tgatgactca gtct 44 <210> <211> <212> <213> 37 44 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 37 ccatggtaat aataatgcta gccgaaattg tgwtgacrca gtct 44 <210> <211> <212> <213> 38 44 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 38 ccatggtaat aataatgcta gccgatattg tgatgaccca cact 44 <210> <211> <212> <213〉 39 42 DNA Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 39 8 1333977 15881YY00 42 ccatggtaat aataatgcta gccgaaacga cactcacgca gt <210> 40 <211> 44 <212> DNA <213〉 Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 40 ccatggtaat aataatgcta gccgaaattg <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 41 tattggcgcg ccatggccca grtgcagctg <210> 42 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 42 tattggcgcg ccatggccsa ggtccagctg <210> 43 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 43 tattggcgcg ccatggccca grtcaccttg <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 44 tattggcgcg ccatggccsa ggtgcagctg <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 45 tattggcgcg ccatggccca ggtgcagcta 44 37 3Ί 37 36
36 9 1333977 15881YY00 <210> 46 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 46 tattggcgcg ccatggccca gstgcagctg caggagt 37 <210> 47 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 47 tattggcgcg ccatggccga rgtgcagctg gtgcagt 37 <210> 48 <211> 38 <212> DNA <213> Aritficial <400> 48 tattggcgcg ccatggccca ggtacagctg cagcagtc 38
<210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Aritficial <400> 49 aagtagtcct tgaccaggca gcc 23 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Aritficial <400> 50 tgagttccac gacaccgtca 20
<210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Aritficial <400> 51 agaggtgctc ttggaggagg <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Aritficial <400> 52 10 20 1333977
15881YYOO agttttgtca caagatttgg g 21 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Aritficial <400> 53 gttgcagatg taggtctggg tgc <210> 54 <211> 45 <212〉 DNA <213> Aritficial <400> 54 gccatggcgc gccaatagct agccgacatc cagwtgaccc agtct <210> 55 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 55 gccatggcgc gccaatagct agccgatgtt gtgatgactc agtct 23 45 45 <210> 56 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 56 45 gccatggcgc gccaatagct agccgaaatt gtgwtgacrc agtct <210> 57 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 57 45 gccatggcgc gccaatagct agccgatatt gtgatgaccc acact <210> 58 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 58 gccatggcgc gccaatagct agccgaaacg acactcacgc agt
<210〉 59 <211> 45 <212> DNA 11 43 1333977 15881YY00 <213> Aritficial <400> 59 gccatggcgc gccaatagct agccgaaatt gtgctgactc agtct <210> <211> <212> <213> 60 40 DNA Aritficial <4'00> 60 atatatatgc ggccgcttat taacactctc ccctgttgaa <210> <211> <212> <213> 61 30 DNA Aritficial <400> 61 ggaggcgctc gagacggtga ccagggtgcc <210> <211> <212> <213> 62 30 DNA Aritficial <400> 62 ggaggcgctc gagacggtga ccattgtccc <210> <211> <212> <213> 63 30 DNA Aritficial <400> 63. ggaggcgctc gagacggtga ccagggttcc Λ Λ A Λ O rH CM ro rH rH «Η i—i CN CN CM V V V V 64 30 DNA Aritficial <400> 64 ggaggcgctc gagacggtga ccgtggtccc Λ Λ Λ Λ Ni ho ro ro μα U) Ν) l·-1 Ο V V V V 65 47 DNA Aritficial <400> 65 cgcctaatca atagtatagg ctagcccagt ctgtgctgac tcagcca 1333977 15881YY00 <210> 66 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 66 cgcctaatca atagtatagg ctagcccagt ctgtgytgac gcagc 45 <210> <211> <212> <213> 6Ί 45 DNA Aritficial <400> 67 cgcctaatca atagtatagg ctagcccagt ctgtcgtgac gcagc 45 <210> <211> <212> <213> 68 47 DNA Aritficial <400> 68 cgcctaatca atagtatagg ctagcccart ctgccctgac tcagcct 47 <210> <211〉 <212> <213> 69 47 DNA Aritficial <400> 69 cgcctaatca atagtatagg ctagcctcct atgwgctgac tcagcca 47 <210> 70 <211> 47 <212> DNA <213> Aritficial <400> 70 cgcctaatca atagtatagg ctagcctctt ctgagctgac tcaggac 47 <210> 71 <211> 47 <212> DNA <213> Aritficial <400> 71 cgcctaatca atagtatagg ctagcccacg ttatactgac tcaaccg 47 <210> 72 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 72 13 1333977
15881YYOO 45 cgcctaatca atagtatagg ctagcccagg ctgtgctgac tcagc <210> Ί3 <211X 49 <212> DNA <213> Aritficial <400> 73 cgcctaatca atagtatagg ctagccaatt ttatgctgac tcagcccca 49 <210> 74 <211> 46 <212> DNA <213> Aritficial <400> 74 cgcctaatca atagtatagg ctagcccagr ctgtggtgac ycagga 46
<210> 75 <211> 45 <212> DNA <213〉 Aritficial <400> 75 cgcctaatca atagtatagg ctagcccwgc ctgtgctgac tcagc 45 <210> 76 <211> 31 <212> DNA <213> Aritficial <400> 76 gccgcttatt atgaacattc tgtaggggcc a 31 <210> 77 <211> 31 <212> DNA <213> Aritficial <400> 77 gccgcttatt aagagcattc tgcaggggcc a
31 <210> 78 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400〉 78 atatatatgc ggccgcttat tatgaacatt ctgtaggggc cactg 45
<210> 79 <211> 45 <212> DNA 14 1333977 15881YY00 <213> Aritficial <400> 79 atatatatgc ggccgcttat taagagcatt ctgcaggggc cactg 45 <210> 80 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 80 atatatatgc ggccgcttaa tgggctgcct cgggaa 36 <210> 81 <211> 47 <212> DNA <213> Aritficial <400> 81
47 gccatggcgc gccaatagct agccttagag cagctcgtac tgacgaa <210> 82 <211> 41 <212> DNA <213> Aritficial <400> 82 tattggcgcg ccatggccat gagtgagctt gaccagttac g 41 <210> 83 <211> 47 <212> DNA <213> Aritficial <400> 83 ggtacctaat aataatcgat cgcttagttc cagatcttga ggaagct 47 <210> 84 <211> 48 <212> DNA <213> Aritficial ~ <400> 84 cgatcgatta ttattaggta ccccatgcca gtaatcaata ttgaggac 48 <210> 85 <211> 38 <212> DNA <213> Aritficial <400> 85 ggaggcgctc gagttatgaa atcacacagc ctcctttg 38 15 1333977 34 35
15881YY00 <210> 86 <211> 34 <212> DNA <213> Aritficial <220> <221> misc—feature <222〉 (18)7.(34) <223> gene-specific region <400> 86 tattcccagc ggccgccgcc acaggtgccc actc 34 <210> 87 <211> 34 <212> DNA <213> Aritficial <220> <221> misc一feature <222> (18)7.(34) <223> gene-specific region <400> 87 tattcccagc ggccgcccct tcmtgggtct tgtc <210> 88 <211> 35 <212> DNA <213> Aritficial <220> <221> misc一feature <222> (18)7.(35) <223> gene-specific region <400> 88 tattcccagc ggccgcctta raaggtgtcc agtgt <210> 89 <2I1> 32 <212> DNA <213> Aritficial <220〉 <221> misc一feature <222> (18)7. (32) <223> gene-specific region <400> 89 tattcccagc ggccgccccc agatgggtcc tg 32 16 1333977 15881YY00 <210> <211> <212> <213> 90 34 DNA Aritficial <220> <221〉 <222> <223> misc feature (18)7. (34) gene-specific region <400> 90 tattcccagc ggccgccctc caaggagtct gttc 34 <210> <211> <212> <213> 91 35 DNA Aritficial <220> <221> <222> <223> misc feature ¢18)7.(35) gene-specific region <400> 91 tattcccagc ggccgcccca tggggtgtcc tgtca 35 <210> <211> <212> <213> 92 33 DNA Aritficial <220> <221> <222> <223> misc feature (18)7.(33) gene-specific region <4〇0> 92 tattcccagc ggccgccgca acaggtgccc act 33 <210> <211> <212> <213> 93 41 DNA Aritficial <220> <221> <222> <223> misc feature (25)7.(41) gene-specific region <400> 93 ggcggccgct gggaatagct agcgytccca ggtgccagat g 41 17 1333977
15881YYOO <210> <211> <212> <213> 94 40 DNA Aritficial <220> <221> <222> <223> misc feature (25):.(40) gene-specific region <400> 94 ggcggccgct gggaatagct agcggtccct ggatccagtg 40 <210> <211> <212> <213> 95 42 DNA Aritficial <220> <221> <222> <223> misc feature (25)7.(42) gene-specific region <400> 95 ggcggccgct gggaatagct agcgctccca gataccaccg ga 42 <210> <211> <212> <213> 96 39 DNA Aritficial <220> <221> <222> <223> misc feature (25):.(39) gene-specific region <400> 96 ggcggccgct gggaatagct agcgatctct ggtgcctac 39 <210> <21l> <212> <213> 97 42 DNA Aritficial <220> <221> <222> misc feature (25)7. (42) <400> 97 ggcggccgct gggaatagct agcgatctct gataccaggg ca 42 <210> 98 18 1333977 15881YY00 <211> <212> <213> 42 DNA Aritficial <220> <221> <222> <223> raise feature (25)7.(42) gene-specific region <400> 98 ggcggccgct gggaatagct agcggttcca gcctccaggg gt <210> <211> <212> <213> 99 37 DNA Aritficial <400> 99 atatatatgg cgcgccttaa cactctcccc tgttgaa <210> <211> <212> <213> 100 48 DNA Artificial <220> <223> Vector sequence <400> 100 atgaaatatc ttctaccaac agcggcagct ggattattgg cggccgcc <210> <211> <212> <213> 101 48 DNA Artificial <220> <223> Vector sequence <400> 101 atgaaatatt tgctaccaac agcggcagct ggattattgt tactagcg <210> <211> <212> <213> 102 43 DNA Aritficial <400> 102 tgttgttcta gatgaaggcg cgcccagrtg cagctggtgc art <210> <211> <212> <213> 103 43 DNA Aritficial 431333977 15881YY00 <400> 103 tgttgttcta gatgaaggcg cgccsaggtc cagctggtrc agt <210> 104 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 104 43 tgttgttcta gatgaaggcg cgcccagrtc accttgaagg agt <210> 105 <211> 42 <212> DNA <213> Aritficial <400> 105 42 tgttgttcta gatgaaggcg cgccsaggtg cagctggtgg ag <210> 106 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial ' <400> 106 tgttgttcta gatgaaggcg cgcccaggtg cagctacagc agt 43 <210> 107 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 107 tgttgttcta gatgaaggcg cgcccagstg cagctgcagg agt 43 <210> 108 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 108 43 tgttgttcta gatgaaggcg cgccgargtg cagctggtgc agt <210> 109 <211> 44 <212> DNA <213> Aritficial <400> 109 tgttgttcta gatgaaggcg cgcccaggta cagctgcagc agtc 44 <210> 110 20 1333977 15881YY00 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> -110 aacaacacta gtgataggct agccgacatc cagwtgaccc agtct 45 <210> 111 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 111 aacaacacta gtgataggct agccgatgtt gtgatgactc agtct 45 <210> 112 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 112
aacaacacta gtgataggct agccgaaatt gtgwtgacrc agtct 45 <210> 113 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 113 aacaacacta gtgataggct agccgatatt gtgatgaccc acact 45 <210> 114 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 114 aacaacacta gtgataggct agccgaaacg acactcacgc agt 43
<210> 115 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 115 aacaacacta gtgataggct agccgaaatt gtgctgactc agtct 45 <210> 116 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 116 36 tattcccatg gcgcgcccag rtgcagctgg tgcart 21 1333977 15881YY00 <210> <211〉 <212> <213> 117 36 DNA Aritficial <400> 117 tattcccatg gcgcgccsag gtccagctgg trcagt <210> <211> <212> <213> 118 36 DNA Aritficial <400> 118 tattcccatg gcgcgcccag rtcaccttga aggagt <210> <211> <212> <213> 119 35 DNA Aritficial <400> 119 tattcccatg gcgcgccsag gtgcagctgg tggag <210> <211> <212> <213> 120 36 DNA Aritficial <400> 120 tattcccatg gcgcgcccag gtgcagctac agcagt <210> <211> <212> <213> 121 36 DNA Aritficial <400> 121 tattcccatg gcgcgcccag stgcagctgc aggagt Λ Λ Λ Λ Ο rH CN CO rH rH r-< rH CN CM OJ V V V V 122 36 DNA Aritficial <400> 122 tattcccatg gcgcgccgar gtgcagctgg tgcagt <210> <211> <212> <2X3> 123 37 DNA Aritficial 371333977 15881YY00 <400> 123 tattcccatg gcgcgcccag gtacagctgc agcagtc <210> 124 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 124 ggcgcgccat gggaatagct agccgacatc cagwtgaccc agtct 45 <210> 125 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 125 ggcgcgccat gggaatagct agccgatgtt gtgatgactc agtct 45 <210> 126 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 126 ggcgcgccat gggaatagct agccgaaatt gtgwtgacrc agtct 45 <210> 127 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 127 ggcgcgccat gggaatagct agccgatatt gtgatgaccc acact 45 <210> 128 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 128 ggcgcgccat gggaatagct agccgaaacg acactcacgc agt 43 <210> 129 <211> 45 <212> DNA <213> Aritficial <400> 129 ggcgcgccat gggaatagct agccgaaatt gtgctgactc agtct 45 <210> 130 23 1333977 15881YY00 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 130 atatatatgc ggccgcttaa cactctcccc tgttgaa 37 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Vector Sequence <400> 131 aggaaacagg agatatacat 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> Vector sequence <400> 132 tcgccaagga gacagtcata 20 <210> 133 <211> 369 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 133 gggcgcgccc aggtgcagct ggtgcaatct ggacctgaag tgaagaagcc tggggcctca 60 gtgagggtct cctgcaaggc ctctggttac tcctttaaga actatggtat ccactgggtg 120 cgacaggccc ctggacaggg gcttgagtgg atggggtgga tcagcgctga caatggtgac 180 acaaccactg cactgaacct ccggggcaga gtctccatga ccacagacac atccacaaac 240 acagtctaca tggaggtgaa gagcctaaga tctgacgaca cggccatata tttctgtgcg 300 cgagattttt atagtgggag ttaccggtcc tttgactgct ggggccaggg caccctggtc 360 accgtctcg 369 <210> 134 <211> 378 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 134 gggcgcgccc aggtgcagct acagcagtct gggggaggcc tggtcaagcc tggggggtcc 60 24 1333977 15881YY00 ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagta gctatagcat gaactgggtc 120 cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcatcca ttagtagtag tagtagttac 180 atatactacg cagactcagt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaac 240 tcactgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta ttactgtgcg 300 agacgccctg gttgggctgc tactcgggcg gcgggtgctt ttgatatctg gggccaaggg 360 acaatggtca ccgtctcg 378 <210> 135 <211> 357 <212> DNA <213> Homo Sapiens
<400> 135 gggcgcgccc aggtgcagct ggtgcaatct ggacctgaac tgaagaagcc tggggcctca 60 gtgaggatct cctgcaaggc ctctgagaaa tgtgatatcc actgggtgcg acaggcccct 120 ggacaggggc ttgagtggat gggatggatc agcgctgacg atggtgggac aaccactgcg 180 ctgaacctcc ggggcagagt ctccatgacc acagacagag ccacaaacac agtatacatg 240 gaactgaaga gcctaagatc tgacgacacg gccatttatt tctgtgcgcg agatttttat 300 agtgggactt accggtcctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357 <210> 136 <211> 396 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 136
gggcgcgcca aggtgcagct ggtggagtct gggggaggcg tggtccagcc tgggacgtcc 60 ctcagactct cctgtgtagt ctctggattc accttcagaa cctatggtat gaactgggtc 120 cgccaggctc caggcaaggg gctggagtgg ctggcatttc tatcatctga tgggagcgat 180 gaattctacg cggactccgt gaagggccga ttcaccgtct ccagggacaa ttccaagagc 240 actctctttc tgaaaatgaa cagtctgaga cctgatgaca cggctgtcta ttactgtgcg 300 agggatcgtg gggcccaaat tacacttttt ggagcccctc ttataaggcc ttcgtccttt 360 gactcctggg gccagggcac cctggtcacc gtctcg 396 <210> 137 <211> 362 <212> DNA <213> Homo Sapiens 25 1333977 15881YY00 <400> 137 gggcgcgccc aggtgcagct gcaggagtct ggacctgagg tgaagaagcc tggggcctca 60 gtgaaggtgt cctgcaaggc ttctggctac acgtttaaca gttatggaat cgcctgggtg 120 cgacaggtcc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatgga tcagccctta cagtggtcac 180 acaaactatg cagagaaggt ccagggcaga gtcaccatga ccacagacac cgccacgagc 240 acagcctgca tggagctgac gagcctgaga tctgacgaca cggccgttta tttctgtgcg 300 agagactaca gtagtccgta ccactttgac tactggggcc agggcacctg gtcaccgtct 360 eg 362 <210> 138 <211> 366
<212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 138 gggcgcgccc agatcacctt gaaggagtet ggtcctacgc tggtgaaacc cacacagacc 60 ctcacgctga cctgcacctt gtctgggttc tcactctaca ctactggagt gggtgtgggc 120 tggatccgtc agcccccagg aaaggccctg gagtggctgg cacgcattta ttgggatgat 180 gatgageget acaacccgtc tetgaagage aggctcacca tcaccaagga cgcctccaaa 240 aaccaggtgg tccttaaaat gaccaacatg gaccctgtgg acacagccac atattactgt 300 gcccggacca tgggcgtcgt tcttccattt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gteteg 366 <210> 139 <211> 351
<212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 139 gggcgcgcca aggtgcagct ggtggagtct gggggaggcc tggtcaagcc gggggggtcc 60 ctgagactct cctgtgtagt ttctgggttc cccctcaata gatacaccat gaactgggtc 120 cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg ctctcgtcca ttagtagtac tagttcttac 180 atatactacg cagactcagt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaat 240 tctctgtttc tgcagatgaa cagcctgaga gccgacgaca cggctctcta tttctgtgcg 300 agtggcaata ctcatgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc g 351 <210〉 140 <211> 378 <212> DNA <213> Homo Sapiens 26 1333977 15881ΥΎ00 <400> 140 gggcgcgccc aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaaget tgggacgtca 60 gtgagggtct cctgcaagac tcctggaggc tatgttttca gctgggtgcg acaggcccct . 120 ggacaagggc ctgagtggat gggagggatc atcaccaact ttgggacaac aaactacgca 180 cggaagttcc agggcagaat cacggttacc gcggacaaat ccacgaacac agtgtacatg 240 gatttgagca acctggcatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agccccccga 300 ggcacgtcga etatageage tcgttttaat egatatttet ttgactcctg gggccagggc 360 accctggtca ccgtctcg 378 <210> 141 <211> 396 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 141 gggcgcgccc aggtgcagct teaggagtet gggggaggcg tggtccagcc tgggacgtcc 60 ctcagactct cctgtgtagt ctctggattc accttcagaa cctatggtat gaactgggtc 120 cgccaggctc caggcaaggt gctggagtgg ctggcatttg tatcatctga tgggagcgat 180 gaattctacg cggactccgt gaagggccga ttcaccgtct ccagggacaa ttccaagagc 240 actctctttc tgaaaatgaa cagtctgaga gctgatgaca cggctgtcta ttactgtgcg 300 agagatcgtg gggcccaaat tacacttttt ggagcccctc ttataaggee ttcgtccttt 360 gactcctggg gccagggaac cctggtcacc gteteg 396 <210> 142 <211> 378 <212> DNA <213> Home ► Sapiens <400> 142 gggcgcgccg aggtgcagct ggtggagtct ggggctgagg tgaagaagee tgggacctca 60 gtgagggtct cctgcaagac ttctggaggc tatgttttca gctgggtgcg acaggcccct 120 ggacaagggc ctgagtggat gggagggatc atcaccagct ttgggacaac aagetaegea 180 cagaagttcc agggcagagt cacgattacc gcggacaaag ccacgaacac agtgtacatg 240 gatttgagcg acctgacatc tgaggacacg gccatatatt actgtgcgaa agccccccga 300 ggcacgtcga etatageage tcgttttaat egetatttet ttgactcctg gggccagggc 360 accctggtca ccgtctcg 378
<210> 143 27 1333977 15881YY00 <211> 366 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 143 gggcgcgccc aggtgcagct gcaggagtct ggtcctacgc tggtgaaacc cacacagacc ctcacgctga cctgctcgtt ctctggtttc tcactcggca ctactggagt caatgtgggc tggatccgtc agcccccggg aaaggccctg gagtggcttg cactcatttc ttgggatggt ggtaagcact acagcccatc tctgaactcc aggatcaccc tcactaagga cgcctccaga gagcaggtgg tggtccctac aatgaccaac atggaccctg cggacacagg cagatattat tgtgcacgta tagtggggac tcacggcttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcg <210> 144 <211> 393 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 144 gggcgcgcca aggtgcagct ggtggagtct ggagctgagg tgaagaagcc tggggccaca gtcagggtct cctgtaaggc ttctggttac aggtttaacg actattgtat cagctgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atggggtgga tcaacggtaa caatgctgac acattctatg caccgaagct ccagggcaga gtcaccatga gcacagacac atccacgagc acagcctaca tggagctgag gaacttgaga tcggacgaca cggccgttta tttctgtgcg cgagatcgag gacgtattac tctttttggc gaagttattt taagggcggg atggttcgac tcctggggcc agggcaccct ggtcaccgtc teg <210> 145 <211> 372 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 145 gggcgcgccc aggtgcagct ggtgcagtct gggggaggcc tggtcaagcc gggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc tcctttagta ataataacat gaattgggtc cgccagactc caggaaaggg actggagtgg gtcgcatcta ttagttttgg aagtcattac atatcctacg cagactcagt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccaggaat gcagtttatc tgcagatgaa cagcctgaga gtcgaggaca cggctgtcta ttactgcacg agatgeaggg gcggaactcg tacctattat tacatggacg tctggggcaa aggcaccctg 60 120 180 240 300 360 366 60 120 180 240 300 360 393 60 120 180 240 300 360
gtcaccgtct eg 372 28 1333977 15881YY00 <210> 146 <211> 372 <212> DNA <213> Homo Sapiens <_> 146 gggcgcgcca aggtgcagct ggtggagtct gggggaggcc tggtcaagcc aggggggtcc 60 ctgagactct cctgtgcagc ctctggatcc tcctttagta ataataacat gaattgggtc 120 cgccagactc caggaaaggg actggagtgg gtcgcatcca ttagttttgg aagtcattac 180 atatcctacg cagactcagt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccaggaat 240 gcagtttatc tgcagatgaa cagcctgaga gtcgaggaca cggctgtcta ttactgcacg 300 agatgcaggg gcggaactcg tacctattat tacatggacg tctggggcaa aggcaccctg 360 gtcaccgtct eg 372 <210> 147 <211> 390 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 147 gggcgcgccc agatgeaget ggtgcaatct ggggctgagg tgaagaagee tgggtcctcg 60 gtgaaggtct cctgccagtc ttctggaggc ccccccaaaa gttatactct cagctgggtg 120 cggcaggccc ctggacaagg ccctgagtgg atgggcggaa teattetaat ctttggccca 180 ccaaactacg cccagaagtt ccaggacaga ctcacgatca ccgcggacaa gtccaccaac 240 acagtctaca tggagttaag tagcctgaga tctgatgaca cggccatgta ctactgtgtg 300 acagcccccg acgacactgg cactatatta gctcgtcaca accgttacta ctttgactcc 360 tggggccagg gcaccctggt caccgtctcg 390 <210> 148 <211> 390 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 148 gggcgcgcca aggtgcagct ggtgcagtct ggageagagg tgaagaagee cggggagtct 60 ctgaaaatct cctgtcaggc ttctggatac ggctttaccg tctactggat cggctgggtg 120 cgccagccgc ccgggaaagg cctggagtgg ctgggtatca tctatcctgg tgactctgat 180 accagataca atccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccgtcagc 240 accacctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccattta ctactgtgcg 300
29 1333977 15881YY00 agacatctgg actcatacga tgttttcact ggttataatt tggggggcta catggacgtc 360 tggggcaagg gaaccctggt caccgtctcg 390 <210> 149 <211> 351 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 149 gggcgcgcca aagtgtagct ggtgcagtct gggggaggcc tggtcaagcc tggggggtcc 60 ctgagactct cctgtgtagt ctctggattc cccctcaata gatacatcat gaactgggtc 120 cgccagactc cagggaaggg gctggagtgg ctctcgtcca ttagtagtac cagttcttac 180 atatactacg cagactcagc gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaat 240 tctctgtttc tgcagatgaa cagcctgaga gccgaggaca caggtctcta ttactgtgcg 300 agtggcaata ctcatgacta ttggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc 9 351
<210> 150 <211> 378 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 150 gggcgcgccc agatgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaagcc tgggacctca 60 gtgagggtct cctgcaagac ttctggaggc tatgttttca gctgggtgcg acaggcccct 120 ggacaagggc ctgagtggat gggagggatc atcaccaact ttgggacaac aaactacgca 180 cagaagttcc agggcagagt cacgattacc gcggacaaat ccacgaacac agtgtatatg 240 gatttgagca acctgacatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agccccccga 300
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31 1333977 15881YY00 atatcctacg cagactcagt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccaggaat 240 gcagtttatc tgcagatgaa cagcctgaga gtcgaggaca cggctgtcta ttactgcacg 300 agatgcaggg gcggaactcg tacctattat tacatggacg tctggggcaa agggacaatg 360 gtcaccgtct eg 372 <210> 155 <211> 390 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 155 gggcgcgcca aggtgcagct ggtgcagtct ggageagagg tgaagaagee cggggagtct 60 ctgaaaatct cctgtcaggc ttctggatac ggctttaccg tctactggat cggctgggtg 120 cgccagccgc ccgggaaagg cctggagtgg ctgggtatca tctatcctgg tgactctgat 180 accagataca atccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccgtcagc 240 accacctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccattta ctactgtgcg 300 agacatctgg actcatacga tgttttcact ggttataatt tggggggcta catggacgtc 360 tggggcaagg gaaccctggt caccgtctcg 390 <210〉 156 <211> 378 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 156 gggcgcgccc aggtgcagct ggtggagtct ggggctgaag tgaagaagee tgggtcctca 60 gtgaaggtct cctgcaagtc ttctggaggc tatgttttca gctgggtgcg acaggcccct 120 gggcaaggac tagagtggat gggagggatc atctccaact ttcgcacggc agagtaegea 180 cggaagttcc agggtagagt caccatgacc gcggacacat ccacgaacac aatctacatg 240 gagctgacca gcctgacatc tgaagacacg geegtatatt tctgtgtgag cgccccccga 300 gacacgtcga etatageage tcgttttaat egataettet ttgacacctg gggccagggc 360 accctggtca ccgtctcg 378 <210> 157 <211> 378 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 157 gggcgcgccc aggtgcagct acagcagtcg gggggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc 60
1333977 15881YY00 ctgagactct cctgtgctgc ctctggattc gccttcagag actatgccat gcactgggtc 120 cgccaggccc caggcaaggg gctggagtgg atgggagtta tctcatttaa tggagatcag 180 atattttacg cagactccat gaagggccgc ttcaccatct ccagagagaa ctccaagaac 240 acgctgcatc tgcgcatgaa cagcctgaga cctgaggaca cggctgtcta ttactgtgcg 300 agagcccgac ttcttttttg tagcggtggt aggtgcgaca tggactcttg gggccaggga 360 accctggtca ccgtctcg 378 <210> 158 <211> 378 <212> DNA <213> Homo Sapiens
<400> 158 gggcgcgcca aagtgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaagcc tgggacctca 60 gtgagggtct cctgcaagac ttctggaggc tatgttttca gttgggtgcg acaggcccct 120 ggacacgggc ctgaatggat gggagggatc atcaccaact ttgggacagc aacctacgca 180 cagaagttcc agggcagagt ctcgattacc gcggacacat ccacgaacac attttacatg 240 gatttgaaca atctgaaatc tgacgacacg gccgtttatt actgtgcgag cgccccccga 300 gacacgtcga ctatagcggc tcggtttaat cggtacttct ttgacttctg gggcccgggc 360 accctggtca ccgtctcg 378 <210> 159 <211> 348 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 159
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<212> DNA 34 1333977 15881YY00 <213> Homo Sapiens <400> 163 gggcgcgcca aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaagcc tgggacctca 60 gtgagggtct cctgcaagac ttctggaggc tatgttttca gctgggtgcg acaggcccct 120 ggacaagggc ctgagtggat gggagggatc atcaccaact ttgggacaac aaactacgca 180 cagaagttcc agggcagagt cacgattacc gcggacaaat ccacgaacac agtgtacatg 240 gatttgagca acctgacatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agccccccga 300 ggcacgtcga ctatagcagc tcgttttaat cggtatttct ttgactcctg gggccagggc 360 accctggtca ccgtctcg 378
<210> 164 <211> 372 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 164 gggcgcgccg aagtgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaagcc tgggtcctcg 60 gtgaaggtct cctgcaagac tgaaggaggc accttcagca cctatgttat cagttggatg 120 cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggaggga tcgtccccat ctttaacaca 180 ccaaactacg ctcagaaatt ccagggcaga gtcacaatta ccgcggacag atccacgagc 240 acagcctaca tggagctgag gagcctggga tctgaggaca cggccgtcta ttactgtgcg 300 agggtagtgg gaggtacaag gtcctactac gctttgggct tctggggcca ggggaccacg 360 gtcaccgtct eg 372 <210> 165 <211> 366
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15881YYOO <210> 166 <211> 3*72 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 166 gggcgcgccg aggtccagct ggtgcagtct gggggaggtg tggtgcggcc tggggggtcc 60 ctgagactct cgtgtgcagg ctctggattc acctttgatg aataegetat gagctgggtc 120 cgccaagctc cagggaaggg gctggagtgg gtcgctttta ttaattggaa tggtgatagc 180 acatattatg cagactctgt gaagggccga ttcaccgtct ccagaaccaa cgccaagaac 240 tccctgtatc tgcaaatgaa cagtctgaga gccgaggaca cggccttcta ttactgtgcg 300 agagaccccc gcactaaact ggggatgtcc tattttgact attggggcca gggcaccctg 360 gtcaccgtct eg 372 <210> 167 <211> 390 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 167 gggcgcgccg aagtgcagct ggtgcagtct ggageagagg tgaagaagee cggggagtct 60 ctgaaaatct cctgtcaggc ttctggatac ggctttaccg tctactggat cggctgggtg 120 cgccagctgc ccgggaaagg cctggagtgg ctgggtatca tctatcctgg tgactctgat 180 accagataca atccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccgtcagc 240 accacctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccattta ctactgtgcg 300 agacatctgg actcatacga tgttttcact ggttataatt tggggggcta catggacgtc 360 tggggcaagg ggacaatggt caccgtctcg 390 <210> 168 <211> 369 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 168 gggcgcgccg aggtgcagct ggtgcagtct ggacctgaag tgaagaagee tggggcctca 60 gtgagggtct cctgcaaggc ctctggttac tcccttaaga actatggtat ccactgggtg 120 cgacaggccc ctggacaggg gcttgagtgg atggggtgga tcagcgctga caatggtgac 180 acaaccactg cactgaacct ccggggcaga gtctccatga ccacagacac atccacaaac 240 acagtctaca tggaggtgaa gagcctaaga tctgacgaca cggccatata tttctgtgcg 300 cgagattttt atagtgggag ttaccggtcc tttgactact ggggccaggg caccctggtc 360
36 1333977 15881YY00 accgtctcg 369 <210> 169 <211> 378 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 169
gggcgcgccg aagtgcagct ggtgcagtcg ggcccaggac tggtgaagcc ttcggagacc 60 ctgtccctca catgcgctgt ctctggtgcc tccgtcagcg gtggtgatta ctactggagc 120 tggatccggc agcccccagg gaaggcactg gagtggattg ggtatatcta ttacataggg 180 agcaccaact acaatccctc tctcaagagt cgactctccc tatcagtaga cacggccaag 240 agccagttct ccctgaagtt gagctctgtg accgctgcgg acacggccat ttatttctgt 300 gcgagagcac gtcggacgta tagtggctac gactccgcct ttgactactg gggccaggga 360 accctggtca ccgtctcg 378 <210> 170 <211> 372 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 170 gggcgcgccc aggtgcagct gcagcagtcg ggcccaggac tggtgaagcc ctcggagacc 60 ctgcccctca cctgcactgt ctctggtggc tccttcagta cctactactg gagctggatc 120 cggcagtccc cagagaaggg actggagtgg attggatata tccaaaacag tgtgaacacc 180 aactacaacc cctccctcaa gagtcgtgtc atcatttcag tggacacgtc caacaaccag 240 ttctccctga agctgaggtc tgtgaccgct gcggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaga 300 gtaagcggct ggggcccaag gggaggeate tactttgact actggggcca gggaaccctg 360 gtcaccgtct eg 372
<210> 171 <211> 378 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 171 gggcgcgcca aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgaag tgaagaagee tgggtcctca 60 gtgaaggtct cctgcaagtc ttctggaggc tatgttttca gctgggtgcg acaggcccct 120 gggcaaggac tagagtggat gggagggatc atctccaact ttcacacggc agagtaegea 180 cagaagttcc agggtagagt caccatgacc gcggacacat ccacgaacac aatctacatg 240 37 1333977
15881YYOO gagctgacca gcctgacatc tgaagacacg gccgtatatt tctgcgtgag cgccccccga 300 gacacgtcga ctatagcagc tcgttttaat cgatacttct ttgacacctg gggccagggc 360 accctggtca ccgtctcg 378 <210> 172 <211> 378 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 172 gggcgcgccg aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaagcc tgggacgtca 60 gtgagggtct cccgcaagac tcctggaggc tatgttttca gctgggtgcg acaggcccca 120 ggacaagggc ctgagtggat gggagggatc atcaccaact ttgggacaac aaactacgca 180 cggaagttcc agggcagaat cacggttacc gcggacaaat ccacgaacac agtgtacatg 240 gatttgagca acctggcatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agccccccga 300 ggcacgtcga ctatagcagc tcgttttaat cgatatttct ttgactcctg gagccagggc 360 accctggtca ccgtctcg 378
<210> 173 <211> 372 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 173 gggcgcgccg aggtgcagct ggtggagtct ggggctgagg tgaagaagcc tgggtcctcg 60 gtgaaggtct cctgcaaggc ctctggaggc agcttcagca cctatatttt cacctgggtg 120 cgccaggccc ctggacaggg gcttgagtgg atgggaggga tcaatcctat ctttgctaca 180 agagactacc caaagaagtt ccagggcaga gteaegatea ccgcggacga atccacgagg 240 actgtctata tggagttgag cagcctcaca tctgaggaca cggccgtcta ttactgtgca 300 agagtgttgg gaggtacaag gctctactac gctctgaacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct eg 372
<210> 174 <211> 372 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 174 gggcgcgccg aagtgcagct ggtgcagtct gggggaggtg tggtgcggcc tggggggtcc 60 ctgagactct cgtgtgcagg ctctggattc acctttgatg aatacgccat gagctgggtc 120 38 1333977 15881YY00 cgccaagctc cagggaaggg gctgaagtgg gtcgctttta ttaattggaa tggtgatagc 180 acatattatg cagactctgt gaagggccga ttcaccgtct ccagatccaa cgccaagaac 240 tccctgtatc tgcaaatgaa cagtctgaga gccgaggaca cggccttcta ttgctgtgcg 300 agagaccccc gcactaaact ggggatgtcc tattttgact attggggcca gggcaccctg 360 gtcaccgtct eg 372 <210> 175 <211> 372 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 175 gggcgcgccg aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaagee tgggtcctcg 60 gtgaaggtct cctgcaaggc ctctggaggc agcttcagca cctatgctat cacctgggtg 120 cgccaggccc ctggacaggg gettgaatgg atgggaggga tcatccctat etttgettea 180 agagactacg cacagaagtt teagggeaga gtcacaatca ccgcggacga atccacgagg 240 acagtgtsca tggageegag gagcctgaga tctgaagaca cggccgtgta ttactgtgca 300 agagtgctgg gaggtacaag gctctactac gctctgaacg tctggggcca aggcaccctg 360 gtcaccgtct eg 372
<210> 176 <211> 378 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 176 gggcgcgccg aggtgcagct ggtgcagtcg ggcccaggac tggtgaagcc ttcggagacc 60 ctgtccctca catgcgctgt ctctggtgcc tccgtcagcg gtggtgatta ctactggagc 120 tggatccggc agcccccagg gaaggcactg gagtggattg ggtatateta ttacataggg 180 agcaccaact acaatccctc tctcaagagt cgactctccc tatcagtaga cacggccaag 240 agccagttct ccctgaagtt gagctctgtg accgctgcgg acacggccac ttatttctgt 300 gegagageae gtcggacgta tagtggctac gactccgcct ttgactactg gggccaggga 360 accctggtca ccgtctcg 378
<210> 177 <211> 372 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 177 gggcgcgccg aggtgcagct ggtggagtct ggggctgagg tgaagaagee tgggtcctcg 60 39 1333977
15881YYOO gtgaaggtct cctgcaaggc ctctggaggc agcttcagca cctatgctat cacctgggtg 120 cgccaggccc ctggacaggg gcttgaatgg atgggaggga tcatccctat ctttgcttca 180 agagactacg cacagaagtt tcagggcaga gtcacaatca ccgcggacga atccacgagg 240 acagtgtaca tggagctgag cagcctgaga tctgacgaca cggccgtgta ttactgtgca 300 agagtgctgg gaggtacaag gctctactac gctctgaacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct eg 372 <210> 178 <211> 369 <212> DNA <213> Homo Sapiens
<400> 178 gggcgcgccc aggtcacctt gaaggagtet ggtcctacag tggtgaaacc cacacagacc 60 ctcacgctga cctgtagcct ctctgggttc gcactcggca ctaccggagt ggctgtgggc 120 tggatccgtc agcccccagg aaaggccctg gaatggcttg gactcatcga ttggaatgat 180 gataggeget acagaccctc tctgaagacc agactcacca tcacccagga catgtccagg 240 aaccaggtgg tccttagact gaccaacttg gacccactgg acacaggcac atatttttgt 300 gcacgttcag tagtgeegge gactagggcc tttgaettet ggggccaggg caccctggtc 360 accgtctcg 369 <210> 179 <211> 366 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 179
gggcgcgccc aggtcacctt gaaggagtet ggtcctacgc tggtgaaacc cacacagacc 60 ctcacgctga cctgcacctt gtctgggttc tcactctaca ctactggagt gggtgtgggc 120 tggatccgtc agcccccagg aaaggccctg gagtgactgg cacgcattta ttgggatgat 180 gatgageget acaacccgtc tetgaagage aggctcacca tcaccaagga cgcctccaaa 240 aaccaggtgg tccttaaaat gaccaacatg gaccctgtgg acacagccac atattactgt 300 gcccggacca tgggcgtcgt tcttccattt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gteteg 366 <210> 180 <211> 327 <212> DNA <213> Homo Sapiens 40 1333977 15881YY00 <400> 180 ctagccgaaa ttgtgctgac tcagtctcca tcctccctgt ctgcatctct aggagacaga 60 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagcac attagcaatt atttaaattg gtatcagcag -120 aaacctggga aagcccctaa actcctgatc tgtgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 180 ccatcaaggt tcactggcag tggatctggg gcagattaca ccctcaccat cagcagtctg 240 caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagtt acagtacctc gtggacgttc 300 ggccaaggga ccacggtgga aatcaaa 327 <210> 181 <211> 327
<212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 181 ctagccgaaa ttgtgttgac acagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60 gtcaccatca cttgccgggc gagtcagggc attagcaatt atttagcctg gtatcagcag 120 aaaccaggga aagttcctaa gctcctgatc tatgctgcat ccactttgca atcaggggtc 180 ccatctcggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 240 cagcctgaag atgttgcaac ttattactgt caaaagtata acagtgcccc gtacactttt 300 ggccagggga ccaagctgga gatcaaa 327 <210> 182 <211> 327 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 182 ctagccgatg ttgtgatgac tcagtctcca tcctccctgt ctgcatctct aggagacaga 60
gtcagcatca cttgccgggc aagtcaacat attagcaatt atataaattg gtatcagcag 120 aaacctggga aagcccctaa actcctgatc tatgctgctt ccactttgca aagtggggtc 180 ccatcaaggt tcactggcag tggatctggg gcagattaca ctctcaccat caccagtctg 240 caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagtt acggtacctc gtggacgttc 300 ggccaaggga ccacggtgga aatcaaa '327 <210> 183 <211> 327 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 183 ctagccgatg ttgtgatgac tcagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt gggagacaga 60 41 1333977 15881YY00 gtcaccatca cttgccaggc gagtcaagac attaccaact atttaaattg gtatcagcag 120 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tacgatgcat ccaatttgca accaggggtc 180 ccatcaaggt tcagtggaag tggatctgtg acagatttta ctttcaccat cagcagcctg 240 cggcctgaag atattgcaac atattactgt caacagtatg atggtccagt gcttactttc 300 ggcggaggga ccaaggtaga gatcaaa 327 <210> 184 <211> 327 <212> DMA <213> Homo Sapiens <400> 184 ctagccgatg ttgtgatgac tcagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60 gtcaccatct cttgccgggc aagtcagccc attagcacct atttaaattg gtatcagcag 120 aaaccaggga aagcccctaa gatcctgatc tttggtgcat ctcgtttgca aagtggtgtc 180 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca gtctcaccat caccagtctc 240 caacctgaag attttgcaac ttacatctgt caacaaagca agagtccccc gtacaatttt 300 ggccggggga ccaagctgga gatcaaa 327
<210〉 185 <211> 330 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400〉 185 ctagccgaaa ttgtgttgac acagtctcct tccaccctgt ctgcatctgt aggcgacaga 60 gtcaccatca cttgccgggc cagtcagagt attggtagct ggttggcctg gtatcaacag 120 aagcccctaa actcctgatc tataaggcgt ctactttaca aagtgagacc 180 ccttcaaggt tccgcggcag tggatctggg accgaattca ctctcaccat cagcagcctg 240 cagcctgatg attttgcaac ttactactgc caacagttta atagtttttc tccgtggacg 300 ttcggccaag ggaccaaggt ggaattcaaa 330
<210> 186 <211> 327 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 186 ctagccgatg ttgtgatgac tcagtctcca tcgtccctgt ctgcatctgt tggtgacaga 60 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attaacatta atttaaattg gtttcagcag 120 42 1333977
15881YYOO aaacccggga aagcccctaa cctactgatc tattctgcat ccactttgca aactggggtc 180 ccctcaaggt tcagtggaag tggatctggg acagagttca ctctcaccat cagcagtcta 240 caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagattt acagtcatgt taggacgttc 300 ggccaaggga ccaaggtgga gatcaaa 327 <210> 187 <211> 345 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 187 ctagccgatg ttgtgatgac tcagtctcca gactccctgg ctgtgtctct gggcgagagg 60 gccaccatca actgcaagtc cagccagagt cttttgtaca gctccaacaa taagaattac 120 ttagcttggt accagcagaa accaggacag cctcctaagt tgctcattta ctgggcatct 180 acccgggaat ccggggtccc tgaccgattc agtggcagcg ggtctgggac agatttcact 240 ctcaccatca gcagcctgca ggctgaagat gtggcagttt attactgtca gcaatattat 300 agtactcctc cgatgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaa 345
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<210> 189 <211> 345 <2X2> DNA <213> Homo Sapiens <400> 189 ctagccgaaa ttgtgttgac acagtctcca gactccctgg ctgtgtctct gggcgagagg 60 gccaccatca actgcaagtc cagccagagt cttttataca gctccaacaa taagaactac 120 ttagcttggt accagcagaa accaggacag cctcctaagt tgctcattta ctgggcatct 180 43 1333977 15881YY00 acccgggaat ccggggtccc tgaccgattc agtggcagcg ggtctgggac agatttcacc 240 ctcaccatca gcagcctgca ggctgaagat gtggcagttt attactgtca gcaatattat 300 agtactcctc cgatgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaa 345 <210> 190 <211> 330 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 190 ctagccgaaa ttgtgttgac acagtctcca tccttcctgt ctgcatctgt aggagacaga 60 gtcaccatca cttgccgggc cagtcagggc attgggaatt ttttagcctg gtatcagcaa 120 aaaccaggga aagcccctaa gctcctaatc tctggtgcat ccactttgca aagttgggtc 180 ccatcaaggt tcagcggccg tggatctggg accgaattca ccctcacaat cagcagcctg 240 cagcctgaag attttgcaac ttattactgt caacagctta atcgttaccc tccatacact 300 tttggccagg ggaccaagct ggagatcaaa 330
<210> 191 <211> 32*7 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 191
ctagccgaaa ttgtgatgac gcagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt gggagacaga 60 gtcaccatca cttgccaggc gagtcaggac attagcaaat atttaaattg gtatcagcag 120 aaaccaggga gagcccctaa actcctgatc tacgaagcat ccaatttgga gacaggggtc 180 ccaccaaggt tcagtggaag tggatctggg acacatttta ctttcaccat caccggcctg 240 cagcctgaag atattgcaac atattactgt caacagtgtg atagtctgcc tccggtcttt 300 ggccagggga ccaagctgga agtcaaa 327 <210> 192 <211> 330 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 192 ctagccgaaa ttgtgctgac tcagtctcca ggcaccctgg ctttgtctcc aggtgataga 60 gccaccctct cctgcggggc cagtcagagc gtgttcggcg acttcttagc ctggtaccaa 120 cacaagcctg gccaggctcc caggctcctc atctatggtg cttccaccag ggccactggc 180 atcccagaca ggttcagtgg cagtggagct gggacagact tcactctcac catcagcaga 240 44 1333977 15881YY00 ctggagcctg aggattttgc agtttatttc tgtcagtagt atggtgactc agtgttcacg 300 ttcggccaag ggaccaagtt gggaatcaaa 330 <210> 193 <211> 330 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 193 ctagccgaaa ttgtgatgac acagtctcca ggcaccctgg ctttgtctcc aggtgataga 60 gccaccctct cctgcggggc cagtcagagc gtgttcggcg acttcttagc ctggtaccaa 120 cacaagcctg gccaggctcc caggctcctc atctatggtg cttccaccag ggccactggc 180 atcccagaca ggttcagtgg cagtggagct gggacagact tcactctcac catcagcaga 240 ctggagcctg aggattttgc agtttatttc tgtcagcagt atggtgactc agtgttcacg 300 ttcggccaag ggaccaagtt ggaaatcaaa 330 <210> 194 <211> 330 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 194 ctagccgaaa ttgtgttgac acagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc agggcaaaga 60 gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt gttaacagag actacctagc ctggtaccag 120 cagaaacctg gctaggctcc caggctcctc atctatggtg catccagcag ggccactggc 180 atcccagaca ggttcagtgg cagtgggtct ggaacagact tcactctcac catcagcaga 240 ctggagcgag acgattttgc agtgtatttc tgtcaccagt atggtagctc acctaacact 300 tttggccagg ggaccaagct ggagatcaaa 330 <210> 195 <211> 330 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400〉 195 ctagccgaaa cgacactcac gcagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga 60 gccaccctct cctgcagggc cagtcagagc gttagcacca actacttagc ctggtaccga 120 cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atccatggtg catccagccg ggccactggc 180 atcccagaca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcactctcac catcagcaga 240 ctggagcctg aagattttgc agtgtatttc tgtcagcagt atggtagctc acctcagacg 300 330
ttcggccaag ggaccaggtt ggaaatcaaa 45 1333977 15881YY00 <210> 196 <211> 327 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 196 ctagccgaaa ttgtgctgac tcagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt tggtgacaga 60 gtcaccacca cttgccggac aagtcagagc attttcatta atttaaattg gtttcagcag 120 aaacccggga aagcccctaa actcctgatc tattctgcat ccactttgca aactggggtc 180 ccctcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagagttca ctctcaccat cagcagtcta 240 caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagattt acagtcaggt taggacgttc 300 ggccaaggga ccaaggtgga gatcaaa 327 <210> 197 <211> 330 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 197 ctagccgaca tccagatgac ccagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga 60 gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt gttaacagcg acaacttagc ctggtaccag 120 cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atgtctggtg caaccagtag ggccactgac 180 gtcccagaca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcactctcac catcagcaga 240 ctggagcctg aagattttgc agtgtattac tgtcaccagt atggtagctc agataacact 300 tttggccagg ggaccaagct ggagatcaaa 330 <210> 198 <211> 330 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 198 ctagccgatg ttgtgatgac tcagtttcct tcctctctgt ctgcatctgt gggagacaga 60 gtcaccatca cttgccgggc gagtcagggc attagcaatt ttttagcctg gtatcagcag 120 aaaccaggga aagttcctga gctccttatc tatggtgcat ccactttgca atcaggggtc 180 ccatctcggt tcagtggcag tggatctggg gcagagttca cactcaccat caacagcctg 240 cagcctgaag atgttgcgac ttattactgt caaaagtatg acagtggcct gagattcact 300 ttcggccctg ggaccaaagt ggatatcaaa 330
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15881YYOO
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Pro Gly Ala Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 20 25 30
Lys Asn Tyr Gly lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Trp lie Ser Ala Asp Asn Gly Asp Thr Thr Thr Ala 50 55 60
Leu Asn Leu Arg Gly Arg Val Ser Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn 65 70 75 80
Thr Val Tyr Met Glu Val Lys Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala lie 85 90 95
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Phe Tyr Ser Gly Ser Tyr Arg Ser Phe Asp 100 105 110
Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 228 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 228
Gly Arg Ala Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 15 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30
Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Ser Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr He Tyr Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Val Lys Giy Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 65 70 75 80 56 1333977
15881YYOO
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Pro Gly Trp Ala Ala Thr Arg Ala Ala Gly 100 105 110
Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 <210> 229 <211> 119 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 229 120 125
Gly Arg Ala Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 1 5 10 15
Pro Gly Ala Ser Val Arg He Ser Cys Lys Ala Ser Glu Lys Cys Asp 20 25 30 lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45
Trp lie Ser Ala Asp Asp Gly Gly Thr Thr Thr Ala Leu Asn Leu Arg 50 55 60
Gly Arg Val Ser Met Thr Thr Asp Arg Ala Thr Asn Thr Val Tyr Met 65 70 75 80
Glu Leu Lys Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala lie Tyr Phe Cys Ala 85 90 95
Arg Asp Phe Tyr Ser Gly Thr Tyr Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 230 <211> 132 - <212> PRT <213> homo sapiens <400> 230
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 15 10 15 57 1333977 15881YY00
Pro Gly Thr Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30
Arg Thr Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Leu Ala Phe Leu Ser Ser Asp Gly Ser Asp Glu Phe Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser 65 70 75 80
Thr Leu Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Ala Gin lie Thr Leu Phe Gly Ala 100 105 110
Pro Leu lie Arg Pro Ser Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 120 125
Val Thr Val Ser 130 <210> 231 <211> 121 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 231
Gly Arg Ala Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 20 25 30
Asn Ser Tyr Gly He Ala Trp Val Arg Gin Val Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Trp lie Ser Pro Tyr Ser Gly His Thr Asn Tyr Ala 50 55 60
Glu Lys Val Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ala Thr Ser 65 70 75 80 58 1333977
15881YYOO
Thr Ala Cys Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr His Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Trp Ser Pro Ser Arg 115 120 <210> 232 <211> 122 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 232
Gly Arg Ala Gin lie Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys 15 10 15
Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu 20 25 30
Tyr Thr Thr Gly Val Gly Val Gly Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Leu Glu Trp Leu Ala Arg lie Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr 50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Thr Lys Asp Ala Ser Lys 65 70 75 80
Asn Gin Val Val Leu Lys Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala 85 90 95
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Met Gly Val Val Leu Pro Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 233 <211> 117 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 233 59 1333977
15881YYOO
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 1 5 10 15 ' Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys V-al Val Ser Gly Phe Pro Leu 20 25 30 Asn Arg Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Leu Ser Ser lie Ser Ser Thr Ser Ser Tyr He Tyr Tyr Ala 50 55 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 65 70 75 80 Ser Leu Phe Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Leu 鲁 85 90 95 Tyr Phe Cys Ala Ser Gly Asn Thr His Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 234 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 234
Gly Arg Ala Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Leu Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Pro Gly Gly Tyr Val 20 25 30
Phe Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Pro Glu Trp Met Gly 35 40 45
Gly lie lie Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe Gin 50 55 60
Gly Arg lie Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met 65 70 75 80 60 1333977
15881YYOO
Asp Leu Ser Asn Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr lie Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr 100 105 110
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 235 <211> 132 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 235
Gly Arg Ala Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 15 10 15
Pro Gly Thr Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30
Arg Thr Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Val Leu 35 40 45
Glu Trp Leu Ala Phe Val Ser Ser Asp Gly Ser Asp Glu Phe Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser 65 70 75 80
Thr Leu Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Ala Gin lie Thr Leu Phe Gly Ala 100 105 110
Pro Leu 工le Arg Pro Ser Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 120 125
Val Thr Val Ser 130 <210> 236 <21X> 126 <212> PRT <213> homo sapiens 61 1333977 15881YY00 <400〉 236
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 5 10 15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Tyr Val 20 25 30
Phe Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Pro Glu Trp Met Gly 35 40 45
Gly lie lie Thr Ser Phe Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 50 55 60
Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ala Thr Asn Thr Val Tyr Met 65 70 75 80
Asp Leu Ser Asp Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Lys Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr lie Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr 100 105 110
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 237 <211> 122 <212〉 PRT <213> homo sapiens <400> 237
Gly Arg Ala Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys 15 10 15
Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu 20 25 30
Gly Thr Thr Gly Val Asn Val Gly Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Leu Glu Trp Leu Ala Leu lie Ser Trp Asp Gly Gly Lys His Tyr 50 55 60
Ser Pro Ser Leu Asn Ser Arg lie Thr Leu Thr Lys Asp Ala Ser Arg 65 70 75 80 62 1333977 8 1 T ro 3 3 R o 2 1 p h sapiens
15881YYOO
Glu Gin Val Val Val Pro Thr Met Thr Asn Met Asp Pro JUa Asp Thr 85 90 95
Gly Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg lie Val Gly Thr His Gly Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> <211> <212> <213〉 <400>
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Ala Thr Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe 20 25 30
Asn Asp Tyr Cys lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Trp 工le Asn Gly Asn Asn Ala Asp Thr Phe Tyr Ala 50 55 60
Pro Lys Leu Gin Gly Arg Val Thr Met Ser Thr Asp Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg Gly Arg lie Thr Leu Phe Gly Glu Val 100 105 110 lie Leu Arg Ala Gly Trp Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 115 120 125
Thr Val Ser 130 <210> 239 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens
63 1333977 15881YY00 <400> 239
Gly Arg Ala Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys I . 5 10 15 .
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe 20 25 30
Ser Asn Asn Asn Met Asn Trp Val Arg Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Ala Ser lie Ser Phe Gly Ser His Tyr lie Ser Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 65 70 75 80
Ala Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Thr Arg Cys Arg Gly Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Tyr Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 240 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 240
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 15 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe 20 25 30
Ser Asn Asn Asn Met Asn Trp Val Arg Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Ala Ser lie Ser Phe Gly Ser His Tyr lie Ser Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 65 70 75 80 64 1333977 15881YY00
Ala Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Thr Arg Cys Arg Gly Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Tyr Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 241 <211> 130 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 241
Gly Arg Ala Gin Met Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Gin Ser Ser Gly Gly Pro Pro 20 25 30
Lys Ser Tyr Thr Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Pro 35 40 45
Glu Trp Met Gly Gly lie lie Leu lie Phe Gly Pro Pro Asn Tyr Ala 50 55 60
Gin Lys Phe Gin Asp Arg Leu Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn 65 70 75 80
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met 85 90 95
Tyr Tyr Cys Val Thr Ala Pro Asp Asp Thr Gly Thr lie Leu Ala Arg 100 105 110
His Asn Arg Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125
Val Ser 130 <210> 242 <211> 130
<212> PRT 65 1333977 15881YY00 <213> homo sapiens <400> 242
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Glu Ser Leu Lys He Ser Cys Gin Ala Ser Gly Tyr Gly Phe 20 25 30
Thr Val Tyr Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Leu Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Asn 50 55 60
Pro Ser Phe Gin Gly Gin Val Thr He Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser 65 70 75 80
Thr Thr Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala lie 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Leu Asp Ser Tyr Asp Val Phe Thr Gly Tyr 100 105 110
Asn Leu Gly Gly Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125
Val Ser 130 <210> 243 <211> 117 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC一FEATURE <222> (6).7(6) <223> Xaa corresponds to a stop codon <400> 243
Gly Arg Ala Lys Val Xaa Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 15 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Pro Leu 20 25 30 66 1333977 15881YY00
Asn Arg Tyr lie Met Asn Trp Val Arg Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Leu Ser Ser lie Ser Ser Thr Ser Ser Tyr He Tyr Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 65 70 75 80
Ser Leu Phe Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asn Thr His Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 244 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 244
Gly Arg Ala Gin Met Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Tyr Val 20 25 30
Phe Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Pro Glu Trp Met Gly 35 40 45
Gly lie lie Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 50 55 60
Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met 65 70 75 80
Asp Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr lie Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr 100 105 110 67 1333977 15881YY00
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 245 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 245
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 5 10 15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe 20 25 30
Ser Thr Tyr Ala lie Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Gly lie lie Pro lie Phe Ala Ser Arg Asp Tyr Ala 50 55 60
Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr Val Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg 65 70 75 80
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Gly Gly Thr Arg Leu Tyr Tyr Ala Leu 100 105 110
Asn Val Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 <210> 246 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 246
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Ser Phe 20 25 30 68 1333977 15881YY00
Ser Thr Tyr Ser lie Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Gly He. Asn Pro He Phe Ala Thr Arg Asp Tyr Ala 50 55 60
Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg 65 70 75 80
Thr Val Tyr Met Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Phe Gly Gly Thr Arg Leu Tyr Tyr Ala Leu 100 105 110
Asn Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 247 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 247
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 5 10 15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Pro Gly Gly Tyr Val 20 25 30
Phe Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Pro Glu Trp Met Gly 35 40 45
Gly lie lie Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe Gin 50 55 60
Gly Arg lie Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met 65 70 75 80
Asp Leu Ser Asn Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr He Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr 100 105 110 69 1333977 15881YY00
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 248 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 248 120 125
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 15 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe 20 25 30
Ser Asn Asn Asn Met Asn Trp Val Arg Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Ala Ser lie Ser Phe Gly Ser His Tyr lie Ser Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 65 70 75 80
Ala Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Thr Arg Cys Arg Gly Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Tyr Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 <210> 249 <211> 130 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 249
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser Cys Gin Ala Ser Gly Tyr Gly Phe 20 25 30
Thr Val Tyr Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 70 1333977 15881YY00
Glu Trp Leu Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Asn 50 55 60
Pro Ser Phe Gin Gly Gin Val Thr He Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser 65 70 75 80
Thr Thr Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala lie 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Leu Asp Ser Tyr Asp Val Phe Thr Gly Tyr 100 105 110
Asn Leu Gly Gly Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125
Val Ser 130 <210> 250 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 250
Gly Arg Ala Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Gly Tyr Val 20 25 30
Phe Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45
Gly lie lie Ser Asn Phe Arg Thr Ala Glu Tyr Ala Arg Lys Phe Gin 50 55 60
Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr lie Tyr Met 65 70 75 80
Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Val 85 90 95
Ser Ala Pro Arg Asp Thr Ser Thr lie Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr 100 105 110 71 1333977 15881YY00
Phe Phe Asp Thr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 251 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 251
Gly Arg Ala Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 15 10 15
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe 20 25 30
Arg Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Val lie Ser Phe Asn Gly Asp Gin lie Phe Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Glu Asn Ser Lys Asn 65 70 75 80
Thr Leu His Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Arg Leu Leu Phe Cys Ser Gly Gly Arg Cys 100 105 110
Asp Met Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 252 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 252
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Tyr Val 20 25 30 72 1333977 15881YY00
Phe Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly His Gly Pro Glu Trp Met Gly 35 40 45
Gly lie He Thr Asn Phe Gly Thr Ala Thr Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 50 55 60
Gly Arg Val Ser He Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Phe Tyr Met 65 70 75 80
Asp Leu Asn Asn Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Ser Ala Pro Arg Asp Thr Ser Thr lie Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr 100 105 110
Phe Phe Asp Phe Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 253 <211> 116 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MI SC 一 FEATURE <222> (4).7(4) <223> Xaa corresponds to a stop codon <400> 253
Gly Arg Ala Xaa Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 1 5 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30
Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Gly His Val Lys Ser Met Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp 50 55 60
Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75 80
Glu Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr 85 90 95 73 1333977 15881YY00
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr His Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser 115 <210> 254 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 254
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Pro Gly Gly Tyr Val 20 25 30
Phe Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Pro Glu Trp Met Gly 35 40 45
Gly lie He Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe Gin 50 55 60
Gly Arg lie Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met 65 70 75 80
Asp Leu Ser Asn Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr lie Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr 100 105 110
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 255 <211> 131 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 255 120 125
Gly Arg Ala Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys 1 5 10 15 74 1333977 15881YY00
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Gin Ala Ser Gly Gly Thr Phe 20 25 30
Ser Asn Tyr Gly He Asn Trp Val Arg His Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Gly lie Val Pro lie Tyr Gly Pro Pro Lys Tyr Ala 50 55 60
Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Asp Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Arg Thr Val Phe Gly Ser Gly Thr Tyr 100 105 110
Arg Pro Gly Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly lie Gly Thr Thr Val 115 120 125
Thr Val Ser 130 <210> 256 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens <220> < 2 21 > MISC_FEATURE <222> (4).7(4) <223> Xaa corresponds to a stop codon <400〉 256
Gly Arg Ala Xaa Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 15 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe 20 25 30
Ser Asn Asn Asn Met Asn Trp Val Arg Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Ala Ser lie Ser Phe Gly Ser His Tyr lie Ser Tyr Ala 50 55 60 75 1333977 7 6 T m 5 2 R o 15881YY00
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 65 70 75 80
Ala Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Thr Arg Cys Arg Gly Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Tyr Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210〉 <211> <212> <213> <400>
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 1 5 10 15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Tyr Val 20 25 30
Phe Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Pro Glu Trp Met Gly 35 40 45
Gly lie lie Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 50 55 60
Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met 65 70 75 80
Asp Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr lie Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr 100 105 110
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125
<210> 258 <211> 124 <212> PRT 76 1333977 15881YY00 <213> homo sapiens <400> 258
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Glu Gly Gly Thr Phe 20 25 30
Ser Thr Tyr Val lie Ser Trp Met Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Gly lie Val Pro lie Phe Asn Thr Pro Asn Tyr Ala 50 55 60
Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser 65 70 75 80
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Gly Gly Thr Arg Ser Tyr Tyr Ala Leu 100 105 110
Gly Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 259 <211> 122 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 259
Gly Arg Ala Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys 1 5 10 15
Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu 20 25 30
Gly Thr Thr Gly Val Asn Val Gly Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Leu Glu Trp Leu Ala Leu lie Ser Trp Gly Gly Gly Lys His Tyr 50 55 60 77 1333977 15881YY00
Ser Pro Ser Leu Asn Ser Arg lie Thr Leu Thr Lys Asp Ala Ser Arg 65 70 75 80
Glu Gin Val Val Val Leu Thr Met Ala Asn Met Asp Pro Val Asp Thr 85 90 95
Gly Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg lie Val Gly Thr His Gly Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 260 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 260
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val Val Arg 15 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30
Asp Glu Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Ala Phe lie Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Thr Asn Ala Lys Asn 65 70 75 80
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Thr Lys Leu Gly Met Ser Tyr Phe 100 105 HO
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 261 <211> 130 <212> PRT <213> homo sapiens 78 1333977 15881YY00 <400> 261
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Glu Ser Leu Lys He Ser Cys Gin Ala Ser Gly Tyr Gly Phe 20 25 30
Thr Val Tyr Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Leu Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Leu Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Asn 50 55 60
Pro Ser Phe Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser 65 70 75 80
Thr Thr Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala lie 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Leu Asp Ser Tyr Asp Val Phe Thr Gly Tyr 100 105 110
Asn Leu Gly Gly Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr 115 120 125
Val Ser 130 <210> 262 <211> 123 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 262
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Ala Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu 20 25 30
Lys Asn Tyr Gly lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Trp lie Ser Ala Asp Asn Gly Asp Thr Thr Thr Ala 50 55 60 79 1333977 15881YY00
Leu Asn Leu Arg Gly Arg Val Ser Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn 65 70 75 80
Thr Val Tyr Met Glu Val Lys Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala lie 85 90 * 95
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Phe Tyr Ser Gly Ser Tyr Arg Ser Phe Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 263 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 263
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 15 10 15
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ala Ser Val 20 25 30
Ser Gly Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Tyr He Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Ser Leu Ser Val Asp Thr Ala Lys 65 70 75 80
Ser Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 85 90 95 lie Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Arg Arg Thr Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser 100 105 110
Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 264 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens 80 1333977 15881YY00 <400> 264
Gly Arg Ala Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 1 5 10 . 15
Pro Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe 20 25 30
Ser Thr Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp lie Gly Tyr lie Gin Asn Ser Val Asn Thr Asn Tyr Asn Pro 50 55 60
Ser Leu Lys Ser Arg Val lie lie Ser Val Asp Thr Ser Asn Asn Gin 65 70 75 80
Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Gly Trp Gly Pro Arg Gly Gly He Tyr Phe 100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 265 <2X1> 126 <212> PRT <2X3> homo sapiens <400> 265
Gly Arg Ala Lys Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Gly Tyr Val 20 25 30
Phe Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45
Gly lie lie Ser Asn Phe His Thr Ala Glu Tyr AXa Gin Lys Phe Gin 50 55 60 81 1333977 15881YY00
Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr lie Tyr Met 65 70 75 80
Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Val 85 90 95
Ser Ala Pro Arg Asp Thr Ser Thr lie Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr 100 105 110
Phe Phe Asp Thr Trp Gly Gin Gly 115 <210> 266 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 266 120
Thr Leu Val Thr Val Ser 125
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Arg Lys Thr Pro Gly Gly Tyr Val 20 25 30
Phe Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Pro Glu Trp Met Gly 35 40 45
Gly He lie Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe Gin 50 55 60
Gly Arg 工le Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met 65 70 75 80
Asp Leu Ser Asn Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr lie Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr 100 105 110
Phe Phe Asp Ser Trp Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 267 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens 82 1333977 15881YY00 <400> 267
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe 20 25 30
Ser Thr Tyr lie Phe Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Gly lie Asn Pro lie Phe Ala Thr Arg Asp Tyr Pro 50 55 60
Lys Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg 65 70 75 80
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Gly Gly Thr Arg Leu Tyr Tyr Ala Leu 100 105 110
Asn Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 268 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 268
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val Val Arg 1 5 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30
Asp Glu Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Lys Trp Val Ala Phe lie Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Ser Asn Ala Lys Asn 65 70 75 80 83 1333977 15881YY00
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe 85 90 95
Tyr Cys Cys Ala Arg Asp Pro Arg Thr Lys Leu Gly Met Ser Tyr Phe 100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 269 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 269
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe 20 25 30
Ser Thr Tyr Ala lie Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Gly lie lie Pro lie Phe Ala Ser Arg Asp Tyr Ala 50 55 60
Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg 65 70 75 80
Thr Val Tyr Met Glu Pro Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Gly Gly Thr Arg Leu Tyr Tyr Ala Leu 100 105 1X0
Asn Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210〉 <211> <212〉 <213> o 6 T m 7 2 R o sapiens
84 <400> 1333977 15881YY00
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 1 5 10 15
Pro Ser Glu-Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ala Ser Val 20 25 30
Ser Gly Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Tyr lie Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Ser Leu Ser Val Asp Thr Ala Lys 65 70 75 80
Ser Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 85 90 95
Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Arg Arg Thr Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser 100 105 110
Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 <21〇> 271 <211> 124 <212〉 PRT <213> homo sapiens <400> 271
Gly Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10 15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe 20 25 30
Ser Thr Tyr Ala lie Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Met Gly Gly lie lie Pro lie Phe Ala Ser Axg Asp Tyr Ala 50 55 60
Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg 65 70 75 80 85 1333977 15881YY00
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Gly Gly Thr Arg Leu Tyr Tyr Ala Leu 100 105 110
Asn Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 272 <211> 123 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 272
Gly Arg Ala Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Val Val Lys 15 10 15
Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ala Leu 20 25 30
Gly Thr Thr Gly Val Ala Val Gly Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Leu Glu Trp Leu Gly Leu lie Asp Trp Asn Asp Asp Arg Arg Tyr 50 55 60
Arg Pro Ser Leu Lys Thr Arg Leu Thr lie Thr Gin Asp Met Ser Arg 65 70 75 80
Asn Gin Val Val Leu Arg Leu Thr Asn Leu Asp Pro Leu Asp Thr Gly 85 90 95
Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Val Val Pro Ala Thr Arg Ala Phe Asp 100 105 110
Phe Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 273 <211> 122 <212〉 PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC FEATURE <222> (52)T .(52) 86 1333977 15881YY00 <223> Xaa corresponds to a stop codon <400> 273
Gly Arg Ala Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro T-hr Leu Val Lys 15 10 15
Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu 20 25 30
Tyr Thr Thr Gly Val Gly Val Gly Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Leu Glu Xaa Leu Ala Arg lie Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr 50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr He Thr Lys Asp Ala Ser Lys 65 70 75 80
Asn Gin Val Val Leu Lys Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala 85 90 95
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Met Gly Val Val Leu Pro Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 274 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 274
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Leu Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin His lie Ser 20 25 30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Cys Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 87 1333977 15881YY00
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser 65 70 75
Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser 85 90 95
Leu 80 Thr
Ser Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Thr Val Glu lie Lys 100 105 <210> 275 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 275
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 15 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie 20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45
Leu lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser 65 70 75
Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Lys Tyr Asn Ser 85 90 95
Ser Ser Leu Phe Leu 80 Ala
Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 276 <211〉 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400〉 276
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 1 5 10 15
Ser 88 1333977 15881YY00
Leu Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin His He Ser 20 25 30 Asn Tyr lie Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr lie Thr Ser Leu 65 70 75 80 Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Gly Thr 85 90 95 Ser Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Thr Val Glu lie Lys 100 105 <210> 277 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 277 Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Thr 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Gin Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 80 Arg Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Gly Pro 85 90 95 Val Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 278 <210> 89 1333977 15881YY00 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 278 、
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Sex 1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gin Pro lie Ser 20 25 30
Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys lie 35 40 45
Leu lie Phe Gly Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr lie Thr Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 工le Cys Gin Gin Ser Lys Ser Pro 85 90 95
Pro Tyr Asn Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 <210> 279 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 279
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly 20 25 30
Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gin Ser Glu Thr Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 80 90 1333977 15881YY00
Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Phe 85 90 95
Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Phe Lys 100 105 110 <210> 280 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 280
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Asn 20 25 30 lie Asn Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu 35 40 45
Leu He Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gin Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin lie Tyr Ser His 85 90 95
Val Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 281 <211> 115 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 281
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser 15 10 15
Leu Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30 91 1333977 15881YY00
Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45
Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 50 55 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 80
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Gin Gin Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val 100 105 110
Glu lie Lys 115 <210〉 282 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400〉 282
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Gly Asp Arg lie Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Thr 20 25 30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Gin Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 80
Arg Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Gly Pro 85 90 95
Val Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 92 1333977 15881ΥΎ00 <210> 283 <211> 115 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 283
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser 15 10 15
Leu Gly Glu Arg Ala Thr He Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30
Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45
Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 50 55 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 80
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Gin Gin Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val 100 105 no
Glu lie Lys 115 <210> 284 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 284
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Gly 20 25 30
Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Ser Gly Ala Ser Thr Leu Gin Ser Trp Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 93 1333977
15881YYOO
Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu Asn Arg Tyr 85 90 95
Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 285 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 285
Leu Ala Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Ser 20 25 30
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Pro Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Phe Thr lie Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Cys Asp Ser Leu 85 90 95
Pro Pro Val Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys 100 105 <210> 286 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC一FEATURE <222> (93)7. (93) <223> Xaa corresponds to a stop codon 94 1333977 15881YY00 <400> 286
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ala Leu Ser 15 10 15
Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gin Ser Val Phe 20 25 30
Gly Asp Phe Leu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 35 40 45
Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Xaa Tyr Gly Asp 85 90 95
Ser Val Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gly He Lys 100 105 110 <210> 287 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 287
Leu Ala Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ala Leu Ser 15 10 15
Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gin Ser Val Phe 20 25 30
Gly Asp Phe Leu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 35 40 45
Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Gly Asp 85 90 95 95 1333977 15881YY00
Sex Val Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 288 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> [45)7. (45) <223> Xaa corresponds to a stop codon <400> 288
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Pro Gly Gin Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Asn 20 25 30 Arg Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Xaa Ala Pro Arg 35 40 45 Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80 Leu Glu Arg Asp Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gin Tyr Gly Ser 85 90 95 Ser Pro Asn Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210〉 289 <211> 110 <212> PRT <213> ： homo sapiens <400> 289 Leu Ala Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser 20 25 30 96 1333977
15881YYOO
Thr Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Arg Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 35 40 45
Leu Leu lie His Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Gly Ser 85 90 95
Ser Pro Gin Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 <210> 290 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 290
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Thr Thr Cys Arg Thr Ser Gin Ser lie Phe 20 25 30 lie Asn Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gin Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin lie Tyr Ser Gin 85 90 95
Val Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 291 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens 97 1333977 15881YY00 <400> 291
Leu Ala Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Asn 20 25 30
Ser Asp Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 35 40 45
Leu Leu Met Ser Gly Ala Thr Ser Arg Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin Tyr Gly Ser 85 90 95
Ser Asp Asn Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 292 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 292
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser 20 25 30
Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Lys Tyr Asp Ser Gly 85 90 95 98 1333977 15881YY00
Leu Arg Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys 100 105 110 3 ο T m 9 1 R 〇 sapiens <210〉 <211> <212> <213〉 <400> 293
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser 20 25 30
Asn Phe Leu Ala Trp His Gin Gin Lys Pro Gly Gin Val Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Gly Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Lys Tyr Asp Ser Gly 85 90 95
Leu lie Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Val Glu lie Lys 100 105 110 <210> 294 <211> 115 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 294 Leu Ala .Asp Val Val 1 5 10 15
Leu Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30
Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45 99 1333977 15881YY00
Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 50 55 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 80
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Gin Gin Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Leu Gly Gin Gly Thr Lys Val 100 105 110
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Leu Ala Asp Val Val Met Thr Xaa Ser Pro Gly Thr Leu Ala Leu Ser 15 10 15
Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gin Ser Val Phe 20 25 30
Gly Asp Phe Leu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 35 40 45
Leu Leu lie Tyr Val Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Cys Gin Gin Tyr Gly Asp 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 85
Ser Val Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Arg 100 105 110 100 1333977 15881YY00 <210> 296
<211> 110 <212> PRT .<213> homo sapiens . <400> 296
Leu Ala Glu Thr Thr Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 15 10 15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser 20 25 30
Thr Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Arg Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 35 40 45
Leu Leu lie His Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Gly Ser 85 90 95
Ser Pro Gin Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu 工le Lys 100 105 110 <210> 297 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 297
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 15 10 15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Asn 20 25 30
Ser Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ala Pro Arg 35 40 45
Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg 50 55 60 101 1333977 15881YY00
Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin Tyr Gly Ala 85 90 95
Ser Asp Asn Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 8 9 Tm 9 o R 〇 sapiens <210〉 <211> <212> <213> <400> 298
Leu Ala Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie lie 20 25 30
Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Val 35 40 45
Leu lie Phe Gly Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin lie He Arg Tyr 85 90 95
Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Val Glu lie Lys 100 105 <210> 299 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 299
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 15 10 15 102 1333977 15881YY00
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Asn 20 25 30
Ser Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 35 40 45
Leu Leu Val Ser Gly Ala Thr Asn Arg Ala Thr Asp lie Pro Asp Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin Tyr Gly Ser 85 90 95
Ser Glu Asn Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Arg 100 105 110 <210> 300 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 300
Leu Ala Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Pro Phe Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Leu Ser 20 25 30
Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Val Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu Asp Thr Tyr 85 90 95
Pro Leu Thr Leu Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 301 <210> 103 1333977 15881YY00 <211> 115 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 301
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser 1 5 10 15
Leu Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30
Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45
Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 50 55 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 80
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Gin Gin Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val 100 105 110
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Leu Ala Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser 15 10 15
Leu Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30
Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45
Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 50 55 60 104 1333977 15881YY00
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 80
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Gin Gin Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Phe Gly Gin Gly Thr Arg Val 100 105 110
Glu lie Lys 115 <210> 303 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 303
Leu Ala Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ala Leu Ser 15 10 15
Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gin Ser Val Phe 20 25 30
Gly Asp Phe Leu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 35 40 45
Pro Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Gly Asp 85 90 95
Ser Val Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 304 <211> 110 <212> PRT <213〉 homo sapiens <400> 304 105 1333977 15881YY00
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Asn 20 25 30
Ser Asp Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 35 40 45
Leu Leu Met Ser Gly Ala Thr Ser Arg Ala Thr Asp lie Pro Asp Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin Tyr Gly Ser 85 90 95
Ser Asp Asn Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 305 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 305
Leu Ala Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Gly Asp Ser Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser 20 25 30
Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Lys Lys Pro Gly Lys Val Pro Arg Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Glu Tyr Ser Asn Ala 85 90 95 106 1333977 15881YY00
Thr Lys Val His lie Lys 105 110
Leu lie Phe Thr Phe Gly Pro Gly 100 <210> 306 <211> 110 <212> PRT <213〉 homo sapiens <400> 306
Leu Ala Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Gly 20 25 30
Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Ser Gly Ala Ser Thr Leu Gin Ser Trp Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu Asn Arg Tyr 85 90 95
Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 307 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 307
Leu Ala Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 * 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Thr lie Ser 20 25 30
Asn His Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu He Tyr Val Gly Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 107 801333977 15881YY00
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Gly 65 70 75 Gin Prc > Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser 85 90 95 Ser Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 308 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 308 Leu Ala Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu 1 5 10 15 Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val 20 25 30 Thr Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Arg Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 35 40 45 Leu Leu lie His Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Gly 85 90 95 Ser Pro Gin Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> , 309 <211> 109 <212> ； PRT <213> ] tiomo sapiens <400> 309 Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 1 5 10 15 80 108 1333977 15881YY00
Leu Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin His lie Ser 20 25 30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
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Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr 85 90 95
Ser Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Thr Val Gly lie Lys 100 105 <210> 310 <211> 109 <212> PRT <213> homo·sapiens <400> 310
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Lys 20 25 30
Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Val Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Phe Gly Thr 85 90 95
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15881YYOO <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400〉 311
Leu Ala Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Ser Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Asn 20 25 30
Lys Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gin Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 80
Gin Thr Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Asp Met 85 90 95
Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 <210> 312 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 312
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 15 10 15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Tyr 20 25 30
Ser Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ala Pro Arg 35 40 45
Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg 50 55 60
Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80 110 1333977
15881YYOO
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin Tyr Gly 85 90 95 Ser Asp Asn Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 313 <211> 115 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 313 Leu Ala Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 1 5 10 15 Leu Gly Glu Lys Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu 20 25 30 Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys 35 40 45 Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 50 55 60 Gly Val Pro A.sp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Gin Gin Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Phe Gly Gin Gly Thr Lys 100 105 110 80
Glu lie Lys 115 <210> 314 <211> 110 <212〉 PRT <213> homo sapiens <400> 314
Leu Ala Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15 111 1333977 15881YY00
Val Gly Asp Arg Val Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser 20 25 30
Asn Phe Leu Ala Trp Phe- Gin Gin Lys Pro Gly Gin Val Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Val Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr lie Asn Gly Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Asp Ser Gly 85 90 95
Leu lie Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 <210> 315 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 315
Leu Ala Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Thr lie Ser 20 25 30
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Gly Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Pro 85 90 95
Ser Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 316 112 1333977 15881YY00 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 316
Leu Ala Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Ser 20 25 30
Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Lys Tyr Asp Ser Gly 85 90 95
Leu Arg Phe Thr Phe Gly Pro Gly Ala Lys Val Asp lie Lys 100 105 110 <210> 317 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 317
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15
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Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu Val Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
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Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Cys Cys Gin Gin Ser Phe Gly Thr 85 90 95
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Leu Ala Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15
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Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu 65 70 75 80
Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Lys Tyr Asp Ser Gly 85 90 95
Leu Arg Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys 100 105 110 <210> 319 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 319
Leu Ala Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Ser Ser Thr Leu Ser Ala Ser 1 — 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn lie Asn 20 25 30 114 1333977 15881YY00 lie Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu lie Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Thr Gly Leu 65 70 75 80 Arg Pro Asp Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His Tyr Asp Gly Asn 85 90 95 Ser Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Val Asp lie Gin 100 105 <210> 320 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 320 Leu Ala Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly 20 25 30 Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu lie Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gin Ser Glu Thr Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 SO Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Phe 85 90 95 Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Ala Glu Phe Lys 100 105 110 <210〉 321 <211〉 402 <212> DNA <213> Artificial 115 1333977 15881YY00 <220> <223> Vector sequence <_> 321 gctagcgctg gttgggcagc gagtaataac aatccagcgg ctgccgtagg caataggtat 60 ttcattatga ctgtctcctt ggcgactagc tagtttagaa ttaattcgtg aaattgttat 120 ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc 180 taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagatctta 240 ctccccatcc ccctgttgac aattaatcat cggctcgtat gatgtgtgga attgtgagcg 300 gataacaatt tcacacagga aacaggagat atacatatga aatacctgct gccgaccgct 360 gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag ccggggcgcg cc 402 <210> 322 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 322 tattggcgcg ccatggccgc ccagtctgtg acccagc 37 <210> 323 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 323 tattggcgcg ccatggccgc ccagaagata actcaa 36 <210> 324 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 324 tattggcgcg ccatggccga tgctaagacc acccag 36 <210> 325 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 325 tattggcgcg ccatggccgc ccagacagtc actcag <210> 326 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial 116 36 1333977 15881YY00 <400> 326 tattggcgcg ccatggccaa acaggaggtg acacaga <210> 327 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 327 tattggcgcg ccatggccgg agactcggtt acccaga <210> 328 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 328 tattggcgcg ccatggccgg agattcagtg acccaga <210> 329 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 329 tattggcgcg ccatggccag caattcagtc aagcaga <210> 330 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <4〇〇> 330 tattggcgcg ccatggccgg acaaaacatt gaccag <210> 331 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 331 tattggcgcg ccatggccaa aaatgaagtg gagcaga <210〉 332 <211> 3Ί <212> DNA <213> Aritficial <400> 332 tattggcgcg ccatggccga agaccaggtg acgcaga <210> 333 <211> 37 1333977 15881YY00 <212> DNA <213> Aritficial <400> 333 tattggcgcg ccatggccgg aatacaagtg gagcaga <210> 334 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 334 tattggcgcg ccatggccct acatacactg gagcaga <210> 335 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 335 tattggcgcg ccatggccga agacaaggtg gtacaaa <210> 336 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 336 tattggcgcg ccatggccga aaaccaggtg gagcaca <210> 337 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 337 tattggcgcg ccatggccca ggagaatgtg gagcag <210> 338 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 338 tattggcgcg ccatggccgg agagagtgtg gggctg <210> 339 <211> 3Ί <212> DNA <213> Aritficial <400> 339 tattggcgcg ccatggccgg agaggatgtg gagcaga 1333977 15881YY00 <210> 340 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 340 tattggcgcg ccatggccag ccaaaagata gaacaga <210> 341 <21X> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 341 tattggcgcg ccatggccag tcaacaggga gaagag <210> 342 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 342 tattggcgcg ccatggccca acaaccagtg cagagt <210> 343 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 343 tattggcgcg ccatggccag ccaagaactg gagcaga <210> 344 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 344 tattggcgcg ccatggccgg tcaacagctg aatcaga <210> 345 <211> 37 <212> DNA <213> Aritficial <400> 345 tattggcgcg ccatggccac ccagctgctg gagcaga <210> 346 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial 361333977 15881YY00 <400> 346 tattggcgcg ccatggccca <210> 347 - <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 347 tattggcgcg ccatggccat <210> 348 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 348 tattggcgcg ccatggccga <210> 349 <211> 36 <212〉 DNA <213> Aritficial <400> 349 tattggcgcg ccatggccgg <210> 350 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 350 36 36 36 tattggcgcg ccatggccaa ggaccaagtg tttcag 36 > > > > 0 12 3 X 1 1 1 2 2 2 2 < < < < 351 21 DNA Aritficial <400> 351 taggcagaca gacttgtcac t 21 <210> <211> <212> <213> 352 43 DNA Aritficial <400> 352 gccatggcgc gccaatagct agccggtgaa gaagtcgccc aga <210> 353 <211> 43 120 43 431333977 15881YY00 <212> DNA <213> Aritficial <400> 353 gccatggcgc gccaatagct agccgatgcc atggtcatcc aga <210> 354 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 354 gccatggcgc gccaatagct agccgaagcc caagtgaccc aga 43 <210> 355 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 355
gccatggcgc gccaatagct agcccatgcc aaagtcacac aga 43 <210> 356 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 356 gccatggcgc gccaatagct agccgacaca gccgtttccc aga 43 <210> 357 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 357 gccatggcgc gccaatagct agccgaaacg ggagttacgc aga 43 <210> 358 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 358
gccatggcgc gccaatagct agccgaacct gaagtcaccc aga 43 <210> 359 <211〉 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 359 gccatggcgc gccaatagct agccgaagct gacatctacc aga 43 121 1333977 15881YY00 <210> <211> <2X2> <213> 360 43 DMA Aritficial <400> 360 gccatggcgc gccaatagct agccatatct ggagtctccc aca <210> <2X1> <212> <213> 361 43 DNA Aritficial <400> 361 gccatggcgc gccaatagct agccgatgct ggaatcaccc aga <210> <211> <212> <213> 362 43 DNA Aritficial <400> 362 gccatggcgc gccaatagct agccaatgct ggtgtcactc aga <210> <211> <212> <213> 363 42 DNA Aritficial <400> 363 gccatggcgc gccaatagct agccagtgct gtcgtctctc aa <210> <211> <212> <213> 364 42 DNA Aritficial <400> 364 gccatggcgc gccaatagct agccgacgct ggagtcacac aa <210> <211> <212〉 <213> 365 43 DNA Aritficial <400> 365 gccatggcgc gccaatagct agccgatggt ggaatcactc agt <210> <211> <212> <213> 366 42 DNA Aritficial 1333977
15881YYOO <400> 366 gccatggcgc gccaatagct agccactgct gggatcaccc ag 42 <210 367 <211> 43 <212> DNA <213〉 Aritficial <400> 367 gccatggcgc gccaatagct agccgaagct ggagttgccc agt 43 <210> 368 <2il> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 368 gccatggcgc gccaatagct agccgaagct ggagtggttc agt 43 <210> 369 <211> 43 <21.2> DNA <213> Aritficial <400> 369 gccatggcgc gccaatagct agccgaagct ggagttactc agt 43 <210> 370 <211> 42 <212> DNA <213> Aritficial <400> 370 gccatggcgc gccaatagct agccgatgct gtagttacac aa 42 <210> 371 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 371 gccatggcgc gccaatagct agccgatgct ggagttatcc agt 43 <210> 372 <211> 42 <212> DNA <213> Aritficial <400> 372 gccatggcgc gccaatagct agccggtgct ggagtctccc ag 42 <210> 373 <211> 43 123 1333977 15881YY00 <212> DNA <213> Aritficial <400> 373 gccatggcgc gccaatagct agccgatgct gatgttaccc aga 43 <210> 374 <211> 43 <212> DNA <213> Aritficial <400> 374 gccatggcgc gccaatagct agcctctcag actattcatc aat 43 <210> 375 21
<211> 21 <212> DNA <213> Aritficial <400> 375 caggcacacc agtgtggcct t <210> 376 <211> 36 <212> DNA <213> Aritficial <400> 376 caccttagag ctcttagagt ctctcagctg gtacac 36 <210> 377 <211> 33 <212> DNA <213> Aritficial <400> 377 33 gacattatgc atgatctctg cttctgatgg etc
124

Claims (1)

  1. ^133977 --- 126165號中文申請專利範圍修正本 請專利範圍： 修正曰期：99.0,2 f祕月V日修1 正:基塗連結複數個有興趣之非連續性核苷酸序列之方法，該方法包括： ^ 乡重分子增财聰序巾，使肖触自單離之單_細胞胡基因型細 胞群作為模板，增幅有興趣之核苷酸序列；以及 b)使步驟a)增幅之有興趣之核苷酸序列產生連結， 其中，該有興趣之核苷酸序列包括免疫球蛋白可變區編碼序列，該連結產 生輕鏈可變區編碼序列連接重鏈可變區編碼序列的同源對。 2_如申請專稿圍第丨奴方法，其巾該多重分子增幅作餘序係 W - PCR增幅作用。 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中鮮重RT_pc：R增幅側係—種二步 驟之過程’其包括於多重PCR增幅作用前進行個別的逆轉錄㈤步驟。 4. ，請，利範圍第2項之方法，其中該多重RT_pcR增幅作用係於單一步 進行，該單-步驟包括在初始時，將所有欲進行逆轉錄㈤及多重卿择 幅作用所需之成分加入單一容器中β θ 1奴奴’其中該有興趣之核嵌序列之連接，係 於/、進仃夕重为子增幅作用相同之容器中進行。 、 1項之方法’其中該有興趣之贿酸序列之連接，係 重重且-延伸引子混合物，於該多重p⑶增幅作用中產生。 接合咖第1項之方法’其中該有興趣之酿序列之連結係由 個引9子延伸引子混合物包括多 組成員的重疊-延伸尾雜合之重4_延魏1 L可與其㈣子組之引子 =====/= 叫延伸引谢物包括： 互補； 球蛋白輕鏈區編碼序列之有意義股 b)至少一個Vl5,引子或Va弓丨子，該 或輕鏈可變區領導序列之反義股 ”免疫球蛋白輕鏈可變區編碼序列 互補’且可齡之引子縣引子組； 6048-6508-PF1 1333977 垃入&或jH引子’該引子與免疫球蛋白固定重鏈域編碼序列或重鏈 接合區編碼序列之有意義股互補；以及 子或Va51子’該引子與免疫球蛋白重鏈可變區編碼序列 Π由 列之反義股互補，且可與步驟〇之引子形成引子組。 11.如申請專利範圍第1()項之方法，其中步驟b)之引子係Vll引子，其與序 丨=98之基㈣定區具有至少90%之序列相似性，以及步驟d)之引 子^引子’其與序列識職：86至92之基因—特定區具有至少寶。之序 似性。 12•如申請專利範圍第丨項之方法，其中該單—細胞或同基因型細胞群係得 自含有淋巴細胞之細胞分液。 13•如巾請專利範圍第12項之方法，其中該含有淋巴細胞之細胞分液包括 全血、骨髓、單核細胞、或白血球細胞。 14·如申明專利範圍第12項之方法，其中該含有淋巴細胞之細胞分液擴增 為B淋巴細胞系之細胞。 15. 如申明專利範圍第12項之方法’其中該含有淋巴細胞之細胞分液擴增 為漿細胞。 ' 16. 如申清專利範圍第12項之方法，其中該含有淋巴細胞之細胞分液擴增 為抗原-專一性。 17. 種產生同源對基因庫之方法，該同源對包括經連結之可變區編碼序 列，該方法包括： a) 由捐贈者提供含有淋巴細胞之細胞分液； b) 視需要自該細胞分液中擴增特定之淋巴細胞群； c) 取得經單離之單-細胞群，包括將得自該細胞分液之細胞個別地分配至 數個容器中；以及 d) 根據申請專利範圍第1至16項中任一項之方法，使驗單離之單一細胞 群所含的可變區編碼序列進行增幅及連結。 a 18.如^請專利範圍第17項之方法，其中於進行增幅作用及連結（步驟d) 則，將該單一細胞群中之經單離的單—細胞擴展成同基因型細胞群。 19.如申請專利範圍第π項之方法，其中該含有淋巴細胞之細胞分液包括 全血、骨髓、單核細胞、或白血球細胞。 6048-6508-PF1 2 1333977 20. 如申請專利範圍第17項之 為B淋巴細_之細胞。 麵，其中該含有淋巴細胞之細胞分液擴增 21. 如申請專利範圍第17項之大、1 _ 為漿細胞。 π去，其中該含有淋巴細胞之細胞分液擴增 為抗Π〜法，其中該含有淋巴細胞之細胞分液擴增 23.如申請專利範圍第17項之方 ^ + 對基因庫插入载體中。 ’更已括將，德结之核甘酸序列或同源 24_如申請專利範圍第23項之士^ ^ 體、呈現載體或表現載體。、方去’其中該載體係選自選殖載體、穿梭載 25.如申請專利範圍第23項之方生.^ 基因庫之各個成員，包括免疫球蛋之膽酸糊或同源對 序列，且赫嘛人ρ Μ驗 鏈可變區編碼序列連接輕鏈可變區編碼 載體的結構中。3、’ 一❹個免疫球蛋白岐域或其片段之序列的 一性，馳藉由挑選姆有所欲標的專 產生可變區編碼序列之標的-專—性同源對的基因庫。 土因庫’ 的基法，更包括將該可變區編碼序列之同源對 ;:r，一，，或;選二== 29.如申請專利範圍第23項之方法，更包括下列步驟： 經連結之痛酸序列之片段的載體，導入宿主細胞中； b) 於適合表現之條件下培養該宿主細胞；以及 c) 獲得該插入宿主細胞之載體所表現的蛋白質產物。 =如申請翻細第29奴方法，其巾純 該早株抗體包括輕鏈可賴與重鏈可變區之騎士 _種早株抗體， 31. -種經連結之可變區編碼序列所構成之同源對之基因庫，獲自如申請專 6048-6508-PF1 , 切 3977 利範圍第17項之方法’財朗源對之各個顧包括 碼序列連接免疫球蛋白重鏈可麵編碼相。 蛋㈣鏈可變區編 32.如申請專利範圍第31項之基因庫，其令該同源對之 球蛋白輕鏈可變區編碼序列連接重鏈可變區編碼序列。 目成貝包括免疫 球蛋龄32項之基轉，其中該各個成員編碼選自人類免疫 «, Ι,ΑΙ ^ Ι.Λ2 ^ IgD . IgE . IgGJ ^ IgG2 . IgG3 ^ IgG4 ^ 4 ^ 34. -種可魏編妨狀同源對之子_基， . 35. —種宿主細胞群’包括申請專利範圍第31項之基因庫。 着 36. 如申請專利範圍第35項之宿主細胞群，其中該細胞係哺乳動物細胞。 37. —種宿主細胞群，包括申請專利範圍第34項之子_基因庫。 38. 如申請專利範圍第37項之宿主細胞群，其中該細胞係哺乳動物細胞。
    6048-6508-PF1 4 1333977
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