KR20120044941A - 적응 면역의 측정방법 - Google Patents

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할란 에스. 로빈스
에두스 에이치. 워런
크리스토퍼 스캇 칼손
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프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터
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Abstract

면역경쟁의 측정방법이 기재되어 있다. 본 발명의 방법은 면역계를 손상시키는 질환 또는 상태, 및 재구성을 목적으로 하는 치료법의 효과를 평가하는 수단을 제공한다. 본 발명의 방법은 혈액 세포로부터 다양한 T 세포 수용체(TCR) 베타 쇄 가변 영역의 수를 계산함으로써 T 세포 다양성의 정량화에 기반한다.

Description

적응 면역의 측정방법{METHOD OF MEASURING ADAPTIVE IMMUNITY}
본원은 2009년 6월 25일자로 출원되고 전체가 본원에서 참조로서 도입되는 미국 가출원 제61/220,344호의 이익을 우선권으로 청구한다.
적응 면역계 세포로부터 추출한 핵산의 대규모 서열분석을 사용하여 T 세포 수용체 유전자 또는 항체 유전자의 다양성을 분석함으로써 환자의 적응 면역을 측정하는 방법이 기재되어 있다.
면역경쟁 (immunocompetence)은, 살아 있는 생물체(예: 박테리아 또는 진균), 바이러스, 또는 병원체로부터 분리되어 백신에 도입된 특정한 항원성 성분일 수 있는 병원체에 대한 노출 후에 정상 면역 반응(즉, 항체 생성 및/또는 세포 매개 면역성)을 생성하는 신체의 능력이다. 면역경쟁은 면역결핍(immunodeficient) 또는 면역-비경쟁(immuno-incompetent) 또는 면역손상(immunocompromised)과 반대이다. 몇몇 예는 완전 작용성 면역계를 아직 갖지 않지만 모계 전달된 항체를 가질 수 있는 신생아(면역결핍); 면역계가 약화되었거나 약화되고 있는 말기 AIDS 환자(면역-비경쟁); 수용체 신체가 공여된 기관을 거부할 수 없도록 약물을 투약한 이식 수용체(면역손상); 중장년층에서 T 세포 기능의 연령 관련 감쇠; 또는 방사선 또는 화학요법 약물에 노출된 개체일 수 있다. 이들 용어는 중복되는 경우도 있지만 모두 이상 면역계의 지표이다. 림프구와 관련하여, 면역경쟁은 B 세포 또는 T 세포가 성숙 상태이고 항원을 인식하여 사람에게 면역 반응을 갖게 하는 것을 의미한다.
면역경쟁은 B 세포(면역글로불린, Ig) 및 T 세포 (T-세포 수용체, TCR)에 의해 코딩된 고도의 다형태 수용체를 사용하여 임의의 잠재적 외래 항원에 특이적인 면역 반응을 갖게 하는 적응 면역계의 능력에 의존한다.
B 세포에 의해 발현된 Ig는 4개의 폴리펩티드 쇄, 즉 2개의 중쇄 (H 쇄)와 2개의 경쇄(L 쇄)로 구성되어 H2L2 구조를 형성하는 단백질이다. H 및 L 쇄의 쌍 각각은 VL 및 VH 영역으로 이루어진 초가변성 도메인 및 불변 도메인을 함유한다. Ig의 H 쇄에는 몇개의 형태, μ, δ, γ, α 및 β가 있다. 개체 내에서 Ig의 다양성은 주로 초가변성 도메인에 의해 결정된다. H 쇄의 V 도메인은 3개 형태의 생식세포주 유전자 세그먼트, 즉 VH, DH 및 JH 세그먼트의 조합 연결에 의해 생성된다. 초가변성 도메인 서열 다양성은 Ig 유전자 재배열의 공정 동안 VH-DH, DH-JH 및 VH-JH 결합부에서 뉴클레오티드의 독립적인 부가 및 결실에 의해 추가로 증가된다. 이러한 측면에서, 면역경쟁은 Ig의 다양성에 반영된다.
αβ T 세포에 의해 발현된 TCR은 각각 TCRA 및 TCRB 유전자에 의해 발현된 2개의 통막(transmembrane) 폴리펩티드 쇄(α 및 β)로 구성된 단백질이다. 유사한 TCR 단백질은 TCRD 및 TCRG 부위로부터 감마-델타 T 세포에서 발현된다. 각각의 TCR 펩티드는 프레임워크 영역(FR) 및 불변 영역 뿐만 아니라 가변 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. αβ T 세포의 서열 다양성은 α 및 β쇄 가변 도메인의 제3 상보성 결정 영역(CDR3) 루프의 아미노산 서열에 의해 주로 결정되며, 다양성은 각각 β쇄 부위에서 가변(Vβ), 다양성(Dβ) 및 결합(Jβ) 유전자 세그먼트 사이, 및 α 쇄 부위에서 유사한 Vα 및 Jα 유전자 세그먼트 사이의 재조합 결과이다. TCR α 및 β 쇄 부위에서 이러한 다수의 유전자 세그먼트의 존재는 다수의 특이적 CDR3 서열을 코딩하게 한다. CDR3 서열 다양성은 TCR 유전자 재배열 공정 동안 Vβ-Dβ, Dβ-Jβ 및 Vα-Jα 결합부에서 뉴클레오티드의 독립적인 부가 및 결실에 의해 추가로 증가된다. 이러한 측면에서, 면역경쟁은 TCR의 다양성에 반영된다.
자가면역 질환에 있어서 면역손상된 적응 면역 또는 이상조절된 적응 면역의 면역경쟁이든지, 다양한 세팅에서 환자의 적응 면역 면역계를 평가 또는 측정하는 방법이 오랫동안 요구되어 왔다. 환자의 면역경쟁을 평가하여 질환 상태 또는 노화 효과를 진단하는 방법에 대한 요구가 존재한다. 동일한 방식으로, 면역계를 변형시키는 치료 결과는 치료를 받는 동안 환자의 면역경쟁을 평가함으로써 모니터링되어야 한다. 반대로, 치료 반응을 모니터링하기 위해 자가면역 질환 격발 및 경감의 맥락에서 적응 면역계를 모니터링하는 방법이 요구되거나 예방학적 치료를 증상 전에 개시할 필요가 있다.
본 발명의 한 가지 양태는,
단일 작용성 V 세그먼트 또는 V 세그먼트의 소부류에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 V-세그먼트 프라이머 및
(b) J 세그먼트에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 J-세그먼트 프라이머를 포함하는 조성물로서,
상기 V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머는 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 TCR CDR3 영역을 증폭시켜 TCR 유전자의 다양성을 정량화하기에 충분한 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는, 조성물이다. 본 발명의 한 가지 양태는, 각각의 V 세그먼트 프라이머가 단일 Vβ 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하고 각각의 J 세그먼트 프라이머가 Jβ 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하며, V 세그먼트 및 J 세그먼트가 TCRβ CDR3 영역을 증폭시키는 조성물이다. 또 다른 양태는, 각각의 V 세그먼트 프라이머가 단일 작용성 Vα 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하고 각각의 J 세그먼트 프라이머가 Jα 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하며, V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머가 TCRα CDR3 영역을 증폭시키는 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는, V 세그먼트 프라이머가 보존된 세그먼트와 하이브리드화하고 유사한 어닐링 강도를 갖는 조성물이다. 또 다른 양태는 V 세그먼트 프라이머가 재조합 시그날 서열(RSS)에 대해 Vβ 세그먼트 내의 위치 -43에 고정되어 있는 조성물이다. 또 다른 양태는 다수의 V 세그먼트 프라이머가 45개의 상이한 Vβ 유전자에 특이적인 적어도 45개 프라이머로 구성되어 있다. 또 다른 양태는 V 세그먼트 프라이머가 서열번호: 1 내지 45로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 갖는다. 또 다른 양태는 V 세그먼트 프라이머가 서열번호: 58 내지 102로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 갖는다. 또 다른 양태는 각각의 Vβ 세그먼트에 대해 V 세그먼트 프라이머가 존재한다.
본 발명의 또 다른 양태는 J 세그먼트 프라이머가 Jβ 세그먼트의 보존된 프레임워크 영역 요소와 하이브리드화하고 유사한 어닐링 강도를 갖는 조성물이다. 청구항 제2항의 조성물은 다수의 J 세그먼트 프라이머가 13개의 상이한 Jβ 유전자에 특이적인 적어도 13개의 프라이머로 구성된다. 또 다른 양태는 청구항 제2항의 조성물은 J 세그먼트 프라이머가 서열번호: 46 내지 57로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 갖는다. 또 다른 양태는 J 세그먼트 프라이머가 서열번호: 102 내지 113으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 갖는다. 또 다른 양태는 각각의 Jβ 세그먼트에 대해 J 세그먼트 프라이머가 존재한다. 또 다른 양태는 모든 J 세그먼트 프라이머가 동일한 보존 모티프에 어닐링되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 증폭된 DNA 분자가 상기 보존된 모티프로부터 출발하고, 적절한 서열을 증폭시켜 J 세그먼트를 진단학적으로 동정하며, CDR3 결합부를 포함하고 V 세그먼트로 확장하는 조성물이다. 또 다른 양태는 증폭된 Jβ 유전자 세그먼트가 각각 RSS 부위 하류의 위치 +11 내지 +14에서 4개의 유니크(unique) 염기 태그를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열분석 올리고뉴클레오티드 세트를 추가로 포함하는 조성물이고, 서열분석 올리고뉴클레오티드는 증폭된 DNA 분자 내의 영역에 하이브리드화한다. 소정 양태는 서열분석 올리고뉴클레오티드가 RSS 부위 하류의 위치 +11 내지 +14에서 증폭된 Jβ 유전자 세그먼트 내의 4개 염기 태그에 인접하여 하이브리드화한다. 또 다른 양태는 서열분석 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 58 내지 70으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 양태는 V 세그먼트 또는 J 세그먼트가 밀접하게 관련된 서열의 병합에 의해 서열 에러-보정을 함유하도록 선택된다. 또 다른 양태는 mRNA로부터 cDNA를 생성하는 범용 C 세그먼트 프라이머를 추가로 포함하는 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는,
단일 작용성 V 세그먼트 또는 V 세그먼트의 소부류에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 V-세그먼트 프라이머 및
J 세그먼트에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 J-세그먼트 프라이머를 포함하는 조성물로서,
상기 V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머는 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 TCRG CDR3 영역을 증폭시켜 항체 중쇄 유전자의 다양성을 정량화하기에 충분한 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는, 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는,
단일 작용성 V 세그먼트 또는 V 세그먼트의 소부류에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 V-세그먼트 프라이머 및
J 세그먼트에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 J-세그먼트 프라이머를 포함하는 조성물로서,
상기 V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머는 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 항체 중쇄(IGH) CDR3 영역을 증폭시켜 항체 중쇄 유전자의 다양성을 정량화하기에 충분한 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는, 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는,
단일 작용성 V 세그먼트 또는 V 세그먼트의 소부류에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 V-세그먼트 프라이머 및
J 세그먼트에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 J-세그먼트 프라이머를 포함하는 조성물로서,
상기 V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머는 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 항체 경쇄(IGL) VL 영역을 증폭시켜 항체 경쇄 유전자의 다양성을 정량화하기에 충분한 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는, 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는,
단일 작용성 V 세그먼트 또는 V 세그먼트의 소부류에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 V 세그먼트 프라이머를 선택하는 단계;
J 세그먼트에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 J 세그먼트 프라이머를 선택하는 단계; 및
V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머를 게놈 DNA 샘플과 조합하여 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 CDR3 영역을 증폭시킴으로써 TCR 유전자의 다양성을 정량화하기에 충분한 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는 단계를 포함하는 방법이다.
본 발명의 한 가지 양태는 각각의 V 세그먼트 프라이머가 단일 작용성 Vβ 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하고, 각각의 J 세그먼트 프라이머가 Jβ 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하며, V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머와 게놈 DNA 샘플의 조합이 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 TCR CDR3 영역을 증폭시켜 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는 방법이다. 또 다른 양태는 각각의 V 세그먼트 프라이머가 단일 작용성 Vα 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하고, 각각의 J 세그먼트 프라이머가 Jα 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하며, V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머와 게놈 DNA 샘플의 조합이 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 TCR CDR3 영역을 증폭시켜 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 증폭된 DNA 분자를 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법이다. 또 다른 양태는 서열분석 단계가, 증폭된 DNA 분자 내의 영역과 하이브리드화하는 서열분석 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하는 방법이다. 또 다른 양태는 증폭된 DNA 분자 중에서 TCRβ CDR3 서열의 전체 다양성을 계산하는 단계를 추가로 포함하는 방법이다. 또 다른 양태는 정상 사람 피검체의 전체 다양성이 1*106 초과의 서열, 2*106 초과의 서열 또는 3*106 초과의 서열임을 나타내는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 환자의 TCR CDR3 서열의 다양성을 측정하는 단계 및 피검체의 다양성을 정상 피검체로부터 수득한 다양성과 비교하는 단계를 포함하는, 사람 환자에서 면역결핍을 진단하는 방법이다. 본 발명의 양태는, TCR 서열의 다양성을 측정하는 단계가
단일 작용성 V 세그먼트 또는 V 세그먼트의 소부류에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 V 세그먼트 프라이머를 선택하는 단계;
J 세그먼트에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 J 세그먼트 프라이머를 선택하는 단계;
V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머를 게놈 DNA 샘플과 조합하여 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 TCR CDR3 영역을 증폭시킴으로써 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는 단계;
증폭된 DNA 분자를 서열분석하는 단계; 및
증폭된 DNA 분자 중에서 TCR CDR3 서열의 전체 다양성을 계산하는 단계를 포함하는 방법이다.
본 발명의 양태는 다양성의 비교는 하기 수학식을 사용하여 계산함으로써 측정하는 방법이다:
Figure pct00001
상기 수학식에서,
G(λ)는 파라미터 λ1, ···, λs의 경험적 분포 함수이고,
nx는 정확하게 x배 서열분석된 클론형 수이고,
Figure pct00002
이다.
본 발명의 또 다른 양태는 게놈 DNA의 적어도 2개 샘플의 다양성이 비교되는 방법이다. 또 다른 양태는 게놈 DNA의 하나의 샘플이 환자의 것이고 다른 샘플이 정상 피검체의 것이다. 또 다른 양태는 게놈 DNA의 하나의 샘플이 치료학적 치료 전의 환자의 것이고 다른 샘플이 치료 후의 환자의 것이다. 또 다른 양태는 게놈 DNA의 2개의 샘플이 치료 동안 상이한 시간에서 동일한 환자의 것이다. 또 다른 양태는 질환이 게놈 DNA의 샘플 중에서 다양성의 비교에 기초하여 진단된다. 또 다른 양태는 사람 환자의 면역경쟁이 비교에 의해 평가된다.
TCR 및 Ig 유전자는 체세포 돌연변이를 통해 수백만의 특이적 단백질을 생성할 수 있다. 이들의 다양성 생성 메카니즘에 기인하여, 이들 유전자의 초가변성 상보성 결정 영역은 수백만의 리간드와 상호작용할 수 있는 서열을 코딩할 수 있고, 이들 영역은 단백질의 코그네이트(cognate) 리간드의 결합을 나타내는 세포에 시그날을 전달할 수 있는 불변 영역에 연결된다.
적응 면역계는 다양성이 충분한 T 세포 및 B 세포 항원 수용체의 레퍼터리를 생성하여 다수의 잠재적 병원체를 인지하는 몇몇 전략을 사용한다. MHC 분자에 의해 제공된 펩티드 항원을 주로 인지하는 αβ 및 γδ T 세포에 있어서, 대부분의 이러한 수용체 다양성은 T 세포 수용체(TCR) α 및 β 쇄(또는 γ 및 δ 쇄)의 제3 상보성 결정 영역(CDR3) 내에 함유되어 있다. 적응 면역계가 1018개 이하의 특이적 TCR αβ 쌍을 형성할 수 있는 것으로 평가되고 있지만, TCR CDR3 다양성의 직접 실험 평가는 가능하지 않았다.
본원에 기재된 것은 단일 분자 DNA 서열분석에 기반하여 TCR CDR3 다양성을 측정하고, 이러한 접근법을 2명의 건강한 성인의 말초혈 T 세포로부터 분리된 수백만의 재배열된 TCRβ 유전자에서 CDR3 영역을 서열분석하는데 사용하는 신규한 방법이다.
개체가 노출될 수 있는 임의의 대다수의 잠재적 외래 항원에 특이적인 면역 반응을 갖게 하는 적응 면역계의 능력은 B 세포(면역글로불린) 및 T 세포(T 세포 수용체; TCR)에 의해 코딩된 고도의 다형태 수용체에 의존한다. 주요 조직접합성 복합체(MHC) 부류 I 및 II 분자에 의해 제공된 펩티드 항원을 주로 인지하는 αβ T 세포에 의해 발현된 TCR은 2개의 통막 폴리펩티드 쇄(α 및 β)로 구성된 헤테로이합체 단백질이고, 각각의 폴리펩티드 쇄는 하나의 가변 도메인과 하나의 불변 도메인을 함유한다. αβ T 세포의 펩티드 특이성은 α 및 β 쇄 가변 도메인의 제3 상보성 결정 영역(CDR3) 루프에서 코딩된 아미노산 서열에 의해 대부분 결정된다. β 및 α 쇄의 CDR3 영역은 각각 β 쇄 부위에서 불연속 가변(Vβ), 다양성(Dβ) 및 결합(Jβ) 유전자 세그먼트 사이의 재조합 및 α 쇄 부위에서 유사한 Vα 및 Jα 유전자 세그먼트 사이의 재조합에 의해 형성된다. TCR α 및 β 쇄 부위에서 이러한 다중 유전자 세그먼트의 존재는 다수의 특이적 CDR3 서열을 코딩하게 한다. CDR3 서열 다양성은 TCR 유전자 재배열의 공정 동안 Vβ-Dβ, Dβ-Jβ 및 Vα-Jα 결합부에서 뉴클레오티드의 주형 독립적 부가 및 결실에 의해 추가로 증가된다.
성인 사람 αβ T 세포 레퍼토리에서 수용체의 다양성을 평가하는 이전의 시도는 당해 레퍼토리의 잘 규정된 소형 서브세트(subset)에서 발현된 재배열된 TCR α 및 β 쇄 유전자를 검사한 다음, 이들 서브세트에 존재하는 다양성을 전체 레퍼토리에 대해 외삽하여, 개체당 대략 106개의 유니크 TCRβ 쇄 CDR3 서열(이들 유니크 TCRβ CDR3 서열의 10 내지 20%는 항원 경험된 CD45RO+ 구획에서 세포에 의해 발현된다)을 평가하는 것에 의존한다. 이들 평가의 정확도 및 정밀도는 수백개 서열에서 관찰된 다양성을 전체 레퍼토리에 대해 외삽할 필요성에 의해 심각하게 제한되며, αβ T 세포 레퍼토리에서 유니크 TCRβ 쇄 CDR3 서열의 실제 수는 1×106개보다 현저히 많다.
고처리량의 DNA 서열분석 기술에 있어서의 최근 발전은 모세관 기반 기술보다 현저히 난해한 서열분석을 가능하게 했다. 각 말단에 범용 PCR 적응 서열을 포함하는 주형 분자의 복합체 라이브러리는 고체 표면 상에 고정된 상보성 올리고뉴클레오티드 론(lawn)에 하이브리드화된다. 고체상 PCR은 하이브리드화된 라이브러리를 증폭시켜 표면 상에 수백만의 주형 클러스터를 생성하기 위해 사용된다(라이브러리 각각은 본래 라이브러리와 동일한 단일 DNA 분자의 다중(약 1,000) 복제를 포함한다). 각 클러스터 내의 분자내의 30 내지 54 bp 간격은 가역적 염료-종결 화학을 사용하여 서열분석되어, 수백만의 T 세포에 포함된 재배열된 TCRβ 쇄 CDR3 영역의 게놈 DNA로부터 동시에 서열분석된다. 이러한 접근법은 αβ T 세포의 모집단에서 유니크하게 재배열된 TCRβ CDR3 영역의 상당한 분획을 직접 서열분석할 수 있게 하고, 이에 의해 모집단에서 각 CDR3 서열의 상대 도수를 평가할 수 있게 한다.
T 세포의 한정된 샘플에서 측정된 다양성으로부터 전체 αβ T 세포 레퍼토리 중의 TCRβ CDR3 서열의 다양성에 대한 정확한 평가는 샘플에서 관찰되지 않은 레퍼토리에 존재하는 CDR3 서열의 수에 대한 평가를 필요로 한다. 전체 αβ T 세포 레퍼토리에서 TCRβ 쇄 CDR3 다양성은 수백만의 αβ T 세포를 함유하는 혈액 샘플에서 관찰된 유니크 TCRβ CDR3 서열의 수에 대한 직접 측정을 사용하여 평가되었다. 본원에서의 결과는 이전 평가보다 몇배 높은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 구획에서 TCRβ CDR3 다양성에 대한 하한을 동정한다. 또한, 본원의 결과는 항원 경험한 T 세포의 CD45RO+ 구획에서 적어도 1.5×106개의 유니크 TCRβ CDR 3 서열이 존재하고, 이들 중의 대부분은 상대적으로 낮은 도수로 존재함을 입증한다. 항원 경험한 세포에서 TCRβ CDR3 서열의 이러한 다양한 모집단의 존재는 이전에는 입증되지 않았다.
각각의 건강한 개체에서 TCRβ 쇄의 다양한 풀은 평가된 이론적 공간으로부터 1011개 초과의 가능한 서열의 샘플이다. 그러나, 재배열된 TCR의 실현된 세트는 이러한 이론적 공간으로부터 균일하게 샘플링되지 않았다. Vβ의 차이 및 Jβ의 차이는 천배 이상의 도수 차이로 발견된다. 추가로, 뉴클레오티드의 삽입 비율은 강력하게 바이어스(biased)되어 있다. 실현된 TCRβ 서열의 이러한 감소된 공간은 사람 사이의 공유된 β 쇄의 가능성을 유도한다. 본원에 기재된 방법으로 생성된 서열 데이타와 함께, 생체내 J 유용성, V 유용성, 모노뉴클레오티드 및 디뉴클레오티드 바이어스, 및 위치 의존적 아미노산 유용성은 컴퓨터화할 수 있다. 이들 바이어스는 TCRβ가 선택되는 서열 공간의 크기를 현저히 좁게 하고, 이는 상이한 개체가 동일한 아미노산 서열을 갖는 TCRβ 쇄를 공유함을 시사한다. 본원의 결과는 수천개의 이러한 동일한 서열의 개개 사람 게놈 사이에서 쌍으로 공유되어 있음을 나타낸다.
분석 기술은 프라이머의 2개 풀을 사용하여 고도의 다중화 PCR 반응을 제공한다. "정방향" 풀은 유전자 내에 각각의 V 세그먼트에 특이적인 프라이머를 갖는다(고도 보존된 영역을 표적화하는 수개의 프라이머가 사용되어, 다수의 V 세그먼트를 동시에 포획한다). "역방향" 풀 프라이머는 결합("J") 세그먼트에서 보존된 서열에 어닐링된다. 증폭된 세그먼트 풀은 적절한 서열을 포함하여 각각의 J 세그먼트를 동정하고, J 세그먼트 특이적 프라이머가 재서열분석을 위해 어닐링되도록 한다. 이는 개체에 존재하는 체세포 재배열의 다수 분획을 직접 관찰할 수 있게 한다. 이는 또한 개체 중의 TCR 레퍼토리를 대조군의 TCR 레퍼토리에 대해 자가면역 질환(또는 표적 질환 지표)과 신속하게 비교할 수 있게 한다.
적응 면역계는 이론적으로 다양성이 큰 T 세포 수용체 CDR3 서열을 생성할 수 있다(임의의 하나의 개체에서 임의의 한번의 시간에 발현되는 것 이상으로). 그러나, 이러한 이론적 다양성의 분획이 실제로 성인 αβ T 세포 레퍼토리에서 사용되는 것을 측정하는 종래의 시도는 다양성의 정확한 평가를 허용하지 않았다. 본원에 기재된 것은 한정된 샘플에서 다양성 측정을 사용하는 레퍼토리 다양성의 평가에 대한 단일 분자 DNA 서열분석 및 분석적 컴퓨터 접근법에 기초하는, 당해 문제에 대한 새로운 접근법을 개발하는 것이다. 당해 분석은 성인 레퍼토리에서 유니크 TCRβ CDR3 서열의 수가 당해 레퍼토리 작은 세그먼트의 소모적인 모세관 서열분석에 기반한 종래의 평가치를 현저히 초과하는 것을 증명했다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 관찰된 CD45RO- 모집단(천연 T 세포가 풍부함)에서 TCRβ 쇄 다양성은 종래 보고된 것보다 5배 크다. 중요한 발견은 항원 경험한 CD45RO+ T 세포에서 발현된 유니크 TCRβ CDR3 서열의 수이다. 본원의 결과는 당해 수가 종래의 다른 결과에 기반하여 예상된 것보다 10 내지 20배 많음을 나타낸다. CD45RO+ 세포에서 CDR3 서열의 도수 분포는 T 세포 레퍼토리가 작은 클론 크기를 갖는 다수의 클론을 함유함을 시사한다.
본원의 결과는 TCRβ 쇄의 실현된 세트가 서열의 거대 잠재적 공간으로부터 균일하지 않게 샘플링됨을 나타낸다. 특히, 생식 세포주에 보다 유사한 β 쇄 서열(V-D 및 D-J 경계에서 소수의 삽입 및 결실)은 비교적 높은 도수로 생성되는 것처럼 보인다. 생식 세포주에 유사한 TCR 서열은 V의, D의 및 J의 생식 세포주 서열이, 소수의 다형태를 원칙으로 하여, 사람 모집단 중에서 공유되어 있기 때문에 상이한 사람 사이에서 공유되어 있다.
성숙 αβ T 세포에 의해 발현된 T 세포 수용체는 2개의 구성 쇄가 TCR α 및 β 쇄 가변 부위의 독립적 재배열 사건에 의해 생성되는 헤테로이합체이다. α 쇄는 β 쇄보다 다양성이 작고, 따라서 α의 보다 높은 분획이 개체 사이에서 공유되어 있고, 수백개의 정확한 TCR αβ 수용체가 개체 쌍 사이에서 공유되어 있다.
세포
B 세포 및 T 세포는 골수, 흉선, 임파선, 말초 조직 및 혈액을 포함하는 다양한 조직 샘플로부터 수득할 수 있지만, 말초혈이 가장 용이하게 수득된다. 말초혈 샘플은 피검체로부터 정맥절개에 의해 수득된다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 기술, 예를 들면, 피콜-하이파크(Ficoll-HypaqueR) 밀도 구배 분리에 의해 분리된다. 바람직하게는, 전체 PBMC가 분석에 사용된다. 대신에, B 및/또는 T 림파구는 각 피검체를 위해 다수 구획으로 유동 분류될 수 있다: 예를 들면, 형광 표지된 항-사람 항체, 예를 들면, CD4 FITC (클론 M-T466, Miltenyi Biotec), CD8 PE (클론 RPA-T8, BD Biosciences), CD45RO ECD (클론 UCHL-1, Beckman Coulter) 및 CD45RO APC (클론 UCHL-1, BD Biosciences)를 사용하는 CD8+CD45RO+/- 및 CD4+CD45RO+/-. 전체 PBMC의 염색은 항체의 적절한 조합으로 수행할 수 있고, 이어서 세포를 분석 전에 세척한다. 림파구 서브세트는 FACS 분류, 예를 들면, BD FACSAriaTM 세포 분류 시스템 (BD Biosciences)에 의해 및 결과를 FlowJo 소프트웨어 (Treestar Inc.)로 분석함으로써 및 표면 또는 비드에 고정된 특이적 항체를 수반하는 개념상 유사한 방법에 의해 분리할 수 있다.
핵산 추출
전체 게놈 DNA는 세포로부터, 예를 들면, QIAamp® DNA 혈액 미니 키트 (QIAGEN®)를 사용하여 추출한다. 단일 반수체 게놈의 대략적 질량은 3 pg이다. 바람직하게는 적어도 100,000 내지 200,000개 세포를 다양성 분석에 사용한다(즉, 이배체 T 세포로부터 약 0.6 내지 1.2 ㎍ DNA). PBMC를 공급원으로 사용하면, T 세포의 수는 전체 세포의 약 30%인 것으로 평가될 수 있다.
또는, 게놈 DNA 및 mRNA 둘 다를 포함하는 세포로부터 전체 핵산을 분리할 수 있다. 다양성이 핵산 추출물 중의 mRNA로부터 측정되어야 하는 경우, mRNA는 측정 전에 cDNA로 전환되어야 한다. 이는 당업자의 방법에 의해 용이하게 수행할 수 있다.
DNA 증폭
다중 PCR 시스템을 사용하여 게놈 DNA, 바람직하게는 CDR3 영역, 보다 바람직하게는 TCRα, TCRγ 또는 TCRδ CDR3 영역, 가장 바람직하게는 TCRβ CDR3 영역으로부터 재배열된 TCR 부위를 증폭시킨다.
일반적으로, 다중 PCR 시스템은 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개, 바람직하게는 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39개, 가장 바람직하게는 40, 41, 42, 43, 44 또는 45개 정방향 프라이머(여기서, 각각의 정방향 프라이머는 서열번호: 114 내지 248에 나타낸 하나 이상의 TRB V 영역 세그먼트에 상응하는 서열에 특이적이다) 및 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7개, 바람직하게는 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 역방향 프라이머(여기서, 각각의 역방향 프라이머는 서열번호: 249 내지 261에 나타낸 하나 이상의 TRB J 영역 프라이머에 상응하는 서열에 특이적이다)를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 모든 J 세그먼트에 대해 J 세그먼트 프라이머가 존재한다.
바람직하게는, 인트론/엑손 경계를 교차하지 않도록 프라이머가 설계된다. 정방향 프라이머는 바람직하게는, 이들 프라이머 중에서 서열 보존을 최대화하기 위해, V 세그먼트 사이의 비교적 강력한 서열 보존 영역에서 V 세그먼트에 어닐링되어야 한다. 따라서, 이는 각 프라이머의 상이한 어닐링 특성에 대한 가능성을 최소화하고, 따라서 V 및 J 프라이머 사이의 증폭된 영역은 충분한 TCR V 서열 정보를 함유하여 사용된 특이적 V 유전자 세그먼트를 동정한다.
바람직하게는, J 세그먼트 프라이머는 J 세그먼트의 보존된 요소와 하이브리드화하고, 유사한 어닐링 강도를 갖는다. 가장 바람직하게는, 모든 J 세그먼트 프라이머는 동일한 보존된 프레임워크 영역 모티프에 어닐링된다. 정방향 및 역방향 프라이머는 둘 다 바람직하게는 DNA 서열분석기에 적합한 범용 정방향 프라이머 서열로 5' 말단에서 변형된다.
예를 들면, 다중 PCR 시스템은 각각 작용성 TCR Vβ 세그먼트에 특이적인 45개 정방향 프라이머(표 1), 및 각각 TCR Jβ 세그먼트에 특이적인 13개 역방향 프라이머(표 2)을 사용할 수 있다. Xn 및 Yn은 각각 길이 n 및 m의 폴리뉴클레오티드에 상응하고, 이는 분석의 판독에 사용되는 단일 분자 서열분석 기술에 특이적일 수 있다.
TCR-Vβ 정방향 프라이머 서열
TRBV 유전자 세그먼트(s) SEQ ID NO: 프라이머 서열*
TRBV2 1 XnTCAAATTTCACTCTGAAGATCCGGTCCACAA
TRBV3-1 2 XnGCTCACTTAAATCTTCACATCAATTCCCTGG
TRBV4-1 3 XnCTTAAACCTTCACCTACACGCCCTGC
TRBV(4-2, 4-3) 4 XnCTTATTCCTTCACCTACACACCCTGC
TRBV5-1 5 XnGCTCTGAGATGAATGTGAGCACCTTG
TRBV5-3 6 XnGCTCTGAGATGAATGTGAGTGCCTTG
TRBV(5-4, 5-5, 5-6, 5-7, 5-8) 7 XnGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCCTTG
TRBV6-1 8 XnTCGCTCAGGCTGGAGTCGGCTG
TRBV(6-2, 6-3) 9 XnGCTGGGGTTGGAGTCGGCTG
TRBV6-4 10 XnCCCTCACGTTGGCGTCTGCTG
TRBV6-5 11 XnGCTCAGGCTGCTGTCGGCTG
TRBV6-6 12 XnCGCTCAGGCTGGAGTTGGCTG
TRBV6-7 13 XnCCCCTCAAGCTGGAGTCAGCTG
TRBV6-8 14 XnCACTCAGGCTGGTGTCGGCTG
TRBV6-9 15 XnCGCTCAGGCTGGAGTCAGCTG
TRBV7-1 16 XnCCACTCTGAAGTTCCAGCGCACAC
TRBV7-2 17 XnCACTCTGACGATCCAGCGCACAC
TRBV7-3 18 XnCTCTACTCTGAAGATCCAGCGCACAG
TRBV7-4 19 XnCCACTCTGAAGATCCAGCGCACAG
TRBV7-6 20 XnCACTCTGACGATCCAGCGCACAG
TRBV7-7 21 XnCCACTCTGACGATTCAGCGCACAG
TRBV7-8 22 XnCCACTCTGAAGATCCAGCGCACAC
TRBV7-9 23 XnCACCTTGGAGATCCAGCGCACAG
TRBV9 24 XnGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTG
TRBV10-1 25 XnCCCCTCACTCTGGAGTCTGCTG
TRBV10-2 26 XnCCCCCTCACTCTGGAGTCAGCTA
TRBV10-3 27 XnCCTCCTCACTCTGGAGTCCGCTA
TRBV(11-1, 11-3) 28 XnCCACTCTCAAGATCCAGCCTGCAG
TRBV11-2 29 XnCTCCACTCTCAAGATCCAGCCTGCAA
TRBV(12-3, 12-4, 12-5) 30 XnCCACTCTGAAGATCCAGCCCTCAG
TRBV13 31 XnCATTCTGAACTGAACATGAGCTCCTTGG
TRBV14 32 XnCTACTCTGAAGGTGCAGCCTGCAG
TRBV15 33 XnGATAACTTCCAATCCAGGAGGCCGAACA
TRBV16 34 XnCTGTAGCCTTGAGATCCAGGCTACGA
TRBV17 35 XnCTTCCACGCTGAAGATCCATCCCG
TRBV18 36 XnGCATCCTGAGGATCCAGCAGGTAG
TRBV19 37 XnCCTCTCACTGTGACATCGGCCC
TRBV20-1 38 XnCTTGTCCACTCTGACAGTGACCAGTG
TRBV23-1 39 XnCAGCCTGGCAATCCTGTCCTCAG
TRBV24-1 40 XnCTCCCTGTCCCTAGAGTCTGCCAT
TRBV25-1 41 XnCCCTGACCCTGGAGTCTGCCA
TRBV27 42 XnCCCTGATCCTGGAGTCGCCCA
TRBV28 43 XnCTCCCTGATTCTGGAGTCCGCCA
TRBV29-1 44 XnCTAACATTCTCAACTCTGACTGTGAGCAACA
TRBV30 45 XnCGGCAGTTCATCCTGAGTTCTAAGAAGC
TCR-Jβ 역방향 프라이머 서열
TRBJ 유전자 세그먼트 SEQ ID NO: 프라이머 서열*
TRBJ1-1 46 YmTTACCTACAACTGTGAGTCTGGTGCCTTGTCCAAA
TRBJ1-2 47 YmACCTACAACGGTTAACCTGGTCCCCGAACCGAA
TRBJ1-3 48 YmACCTACAACAGTGAGCCAACTTCCCTCTCCAAA
TRBJ1-4 49 YmCCAAGACAGAGAGCTGGGTTCCACTGCCAAA
TRBJ1-5 483 YmACCTAGGATGGAGAGTCGAGTCCCATCACCAAA
TRBJ1-6 50 YmCTGTCACAGTGAGCCTGGTCCCGTTCCCAAA
TRBJ2-1 51 YmCGGTGAGCCGTGTCCCTGGCCCGAA
TRBJ2-2 52 YmCCAGTACGGTCAGCCTAGAGCCTTCTCCAAA
TRBJ2-3 53 YmACTGTCAGCCGGGTGCCTGGGCCAAA
TRBJ2-4 54 YmAGAGCCGGGTCCCGGCGCCGAA
TRBJ2-5 55 YmGGAGCCGCGTGCCTGGCCCGAA
TRBJ2-6 56 YmGTCAGCCTGCTGCCGGCCCCGAA
TRBJ2-7 57 YmGTGAGCCTGGTGCCCGGCCCGAA
표 1의 45개 정방향 PCR 프라이머는 48개 작용성 가변 세그먼트 각각에 상보성이고, 표 2의 13개 역방향 PCR 프라이머는 TRB 부위(TRBJ)로부터의 작용성 결합(J) 유전자 세그먼트 각각에 상보성이다. TRB V 영역 세그먼트는 서열번호: 114 내지 248의 서열목록에서 동정되고, TRB J 영역 세그먼트는 서열번호: 249 내지 261에서 동정된다. 프라이머는 적절한 정보가 증폭된 서열 내에 존재하여 V 및 J 유전자를 유니크하게 동정하도록 설계되었다(V 유전자 재조합 시그날 서열(RSS) 상류의 서열의 > 40개 염기 쌍 및 J 유전자 RSS 하류의 > 30개 염기 쌍). 대체 프라이머는 각 TCR 아단위 유전자의 V 및 J 영역으로부터 당업자에 의해 선택될 수 있다.
정방향 프라이머는 DNA 서열분석기(표 1의 Xn)에 적합한 범용 정방향 프라이머 서열로 5' 말단에서 변형된다. 유사하게는, 모든 역방향 프라이머는 범용 역방향 프라이머 서열(표 2의 Ym)로 변형된다. 이러한 범용 프라이머의 한 가지 예는 일루미나 GAII 단일 말단 판독 서열분석 시스템의 경우에 표 3 및 4에 제시되어 있다. 45개 TCR Vβ 정방향 프라이머는, 이들 프라이머 중에서 서열 보존을 최대화하도록, Vβ 세그먼트 사이의 비교적 강력한 서열 보존 영역에서 Vβ 세그먼트에 어닐링된다.
TCR-Vβ 정방향 프라이머 서열
TRBV 유전자 세그먼트(s) SEQ ID NO: 프라이머 서열*
TRBV2 58 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTTCAAATTTCACTCTGAAGATCCGGTCCACAA
TRBV3-1 59 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCTCACTTAAATCTTCACATCAATTCCCTGG
TRBV4-1 60 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCTTAAACCTTCACCTACACGCCCTGC
TRBV(4-2, 4-3) 61 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCTTATTCCTTCACCTACACACCCTGC
TRBV5-1 62 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCTCTGAGATGAATGTGAGCACCTTG
TRBV5-3 63 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCTCTGAGATGAATGTGAGTGCCTTG
TRBV(5-4, 5-5, 5-6, 5-7, 5-8) 64 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCCTTG
TRBV6-1 65 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTTCGCTCAGGCTGGAGTCGGCTG
TRBV(6-2, 6-3) 66 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCTGGGGTTGGAGTCGGCTG
TRBV6-4 67 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCCTCACGTTGGCGTCTGCTG
TRBV6-5 68 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCTCAGGCTGCTGTCGGCTG
TRBV6-6 69 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCGCTCAGGCTGGAGTTGGCTG
TRBV6-7 70 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCCCTCAAGCTGGAGTCAGCTG
TRBV6-8 71 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCACTCAGGCTGGTGTCGGCTG
TRBV6-9 72 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCGCTCAGGCTGGAGTCAGCTG
TRBV7-1 73 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCACTCTGAAGTTCCAGCGCACAC
TRBV7-2 74 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCACTCTGACGATCCAGCGCACAC
TRBV7-3 75 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCTCTACTCTGAAGATCCAGCGCACAG
TRBV7-4 76 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCACTCTGAAGATCCAGCGCACAG
TRBV7-6 77 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCACTCTGACGATCCAGCGCACAG
TRBV7-7 78 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCACTCTGACGATTCAGCGCACAG
TRBV7-8 79 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCACTCTGAAGATCCAGCGCACAC
TRBV7-9 80 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCACCTTGGAGATCCAGCGCACAG
TRBV9 81 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTG
TRBV10-1 82 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCCCTCACTCTGGAGTCTGCTG
TRBV10-2 83 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCCCCTCACTCTGGAGTCAGCTA
TRBV10-3 84 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCTCCTCACTCTGGAGTCCGCTA
TRBV(11-1, 11-3) 85 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCACTCTCAAGATCCAGCCTGCAG
TRBV11-2 86 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCTCCACTCTCAAGATCCAGCCTGCAA
TRBV(12-3, 12-4, 12-5) 87 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCACTCTGAAGATCCAGCCCTCAG
TRBV13 88 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCATTCTGAACTGAACATGAGCTCCTTGG
TRBV14 89 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCTACTCTGAAGGTGCAGCCTGCAG
TRBV15 90 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGATAACTTCCAATCCAGGAGGCCGAACA
TRBV16 91 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCTGTAGCCTTGAGATCCAGGCTACGA
TRBV17 92 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCTTCCACGCTGAAGATCCATCCCG
TRBV18 93 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCATCCTGAGGATCCAGCAGGTAG
TRBV19 94 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCTCTCACTGTGACATCGGCCC
TRBV20-1 95 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCTTGTCCACTCTGACAGTGACCAGTG
TRBV23-1 96 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCAGCCTGGCAATCCTGTCCTCAG
TRBV24-1 97 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCTCCCTGTCCCTAGAGTCTGCCAT
TRBV25-1 98 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCCTGACCCTGGAGTCTGCCA
TRBV27 99 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCCTGATCCTGGAGTCGCCCA
TRBV28 100 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCTCCCTGATTCTGGAGTCCGCCA
TRBV29-1 101 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCTAACATTCTCAACTCTGACTGTGAGCAACA
TRBV30 102 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCGGCAGTTCATCCTGAGTTCTAAGAAGC
TCR-Jβ 역방향 프라이머 서열
TRBJ 유전자 세그먼트 SEQ ID NO: 프라이머 서열*
TRBJ1-1 103 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTTACCTACAACTGTGAGTCTGGTGCCTTGTCCAAA
TRBJ1-2 468 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTACAACGGTTAACCTGGTCCCCGAACCGAA
TRBJ1-3 104 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTACAACAGTGAGCCAACTTCCCTCTCCAAA
TRBJ1-4 105 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTCCAAGACAGAGAGCTGGGTTCCACTGCCAAA
TRBJ1-5 484 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTAGGATGGAGAGTCGAGTCCCATCACCAAA
TRBJ1-6 106 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTCTGTCACAGTGAGCCTGGTCCCGTTCCCAAA
TRBJ2-1 107 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTCGGTGAGCCGTGTCCCTGGCCCGAA
TRBJ2-2 108 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTCCAGTACGGTCAGCCTAGAGCCTTCTCCAAA
TRBJ2-3 109 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACTGTCAGCCGGGTGCCTGGGCCAAA
TRBJ2-4 110 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTAGAGCCGGGTCCCGGCGCCGAA
TRBJ2-5 111 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTGGAGCCGCGTGCCTGGCCCGAA
TRBJ2-6 112 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTGTCAGCCTGCTGCCGGCCCCGAA
TRBJ2-7 113 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTGTGAGCCTGGTGCCCGGCCCGAA
* 볼드체 서열은 서열 분석을 위한 범용 R 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
이 시스템을 사용하여 재배열된 TCRβ CDR3 영역에 애한 전체 PCR 생성물은 대략 200 bp 길이일 것으로 예상된다. 게놈 주형은 45개 TCR Vβ F 프라이머의 풀("VF 풀") 및 12개 TCR Jβ R 프라이머의 풀("JR 풀")을 사용하여 PCR 증폭시킨다. 예를 들면, 50 ㎕ PCR 반응물을 1.0 μM VF 풀(각각의 유니크 TCR Vβ F 프라이머에 대해 22 nM), 1.0 μM JR 풀(각각의 유니크 TCRBJR 프라이머에 대해 77 nM), IX QIAGEN 다중 PCR 마스터 혼합물(QIAGEN 파트 넘버 206145), 10% Q-용액(QIAGEN) 및 16 ng/㎕ gDNA와 함께 사용할 수 있다.
IGH 프라이머 세트는, 천연 B 세포의 초기 자극 후에 관찰되는 바와 같이, 재배열된 IGH 유전자 내의 체세포 초돌연변이에 대한 가능성을 조절하기 위해 설계되었다. 결과적으로, 모든 프라이머는 정상보다 약간 길게 설계되었고, 작용성 및 비작용성 체세포 돌연변이체 둘 다에 대해 내성이 있는 3개 이상의 뉴클레오티드의 고도 보존된 서열 내로 각 프라이머의 3' 말단을 고정하도록 설계되었다.
IGHJ 역방향 프라이머는 IGHJ 세그먼트 내의 고도 보존된 GGGG 서열 모티프 상에 각각의 PCR 프라이머의 3' 말단을 고정하도록 설계되었다. 이들 서열은 표 5에 제시되어 있다. 밑줄친 서열은 결실될 수 있는 RSS 내의 10개 염기 쌍이다. 이들은 바코드 설계로부터 제외되었다. 볼드체 서열은 IGH J 역방향 PCR 프라이머의 역방향 보체이다. 이탤릭체 서열은 J 동정을 위한 바코드이다(8개 바코드는 6개 유전자 및 유전자 내의 2개 대립유전자를 나타낸다). 밑줄친 세그먼트 내의 추가의 서열은 추가의 대립유전자 동정을 나타낼 수 있다.
Figure pct00003
IGHJ 역방향 PCR 프라이머의 서열은 표 6에 제시되어 있다.
Figure pct00004
V 프라이머는 2개의 보존된 트립토판(W) 코돈 사이의 FR2 보존 영역에 설계되었다.
프라이머 서열은 당해 코돈을 보존하는 모든 IGHV 부류에 있어서 트립토판 코돈 상의 3' 말단에 고정되어 있고, 마지막 3개 뉴클레오티드(트립토판의 TGG)는 체세포 초돌연변이에 대해 내성이 있는 것으로 예상되는 서열 상에 고정되고, 이는 각 프라이머에 있어서 6개 뉴클레오티드 중의 5개 뉴클레오티드의 3' 고정을 제공한다. 상류 서열은 정상보다 추가로 연장되고, 디제너레이트(degenerate) 뉴클레오티드를 포함하여, 표 7에 제시된 바와 같이, 프라이머의 어닐링 특성을 현저하게 변화시키지 않고서 미스매치가 초돌연변이(또는 밀접하게 관련된 IGH V 부류 사이)에 의해 유도되도록 한다. V 유전자 세그먼트의 서열은 서열번호: 262 내지 420이다.
IgH V 세그먼트 SEQ ID NO: 서열
>IGHV1 443 TGGGTGCACCAGGTCCANGNACAAGGGCTTGAGTGG
>IGHV2 444 TGGGTGCGACAGGCTCGNGNACAACGCCTTGAGTGG
>IGHV3 445 TGGGTGCGCCAGATGCCNGNGAAAGGCCTGGAGTGG
>IGHV4 446 TGGGTCCGCCAGSCYCCNGNGAAGGGGCTGGAGTGG
>IGHV5 447 TGGGTCCGCCAGGCTCCNGNAAAGGGGCTGGAGTGG
>IGHV6 448 TGGGTCTGCCAGGCTCCNGNGAAGGGGCAGGAGTGG
>IGH7_3.25p 449 TGTGTCCGCCAGGCTCCAGGGAATGGGCTGGAGTTGG
>IGH8_3.54p 450 TCAGATTCCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGAG
>IGH9_3.63p 451 TGGGTCAATGAGACTCTAGGGAAGGGGCTGGAGGGAG
열 사이클 조건은 당업자의 방법을 따를 수 있다. 예를 들면, PCR 발현 열 사이클러(Hybaid, Ashford,UK)를 사용하면, 하기 사이클 조건이 사용될 수 있다: 95℃에서 15분 동안 1회 사이클, 94℃에서 30초 동안, 59℃에서 30초 동안 및 72℃에서 1분 동안 25 내지 40회 사이클, 이어서 72℃에서 10분 동안 1회 사이클.
서열분석
서열분석은 증폭된 DNA 분자 내의 규정된 영역에 하이브리드화하는 서열분석 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 달성된다.
바람직하게는, 증폭된 J 유전자 세그먼트는 각각 RSS 부위로부터 하류의 위치 +11 내지 +14에 유니크한 4개 염기 태그를 갖는다. 따라서, 서열분석 올리고뉴클레오티드는 RSS 부위 하류의 위치 +11 내지 +14에서 증폭된 Jβ 유전자 세그먼트 내에 4개 염기 태그에 인접하여 하이브리드화한다.
예를 들면, TCRB에 대한 서열분석 올리고뉴클레오티드는 당해 "태그"의 하류에서 관찰된 컨센서스 뉴클레오티드 모티프에 어닐링하도록 설계되어, 판독된 서열의 처음 4개 염기는 J 세그먼트를 유니크하게 동정할 것이다(표 8).
서열분석 올리고뉴클레오티드
서열분석 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 올리고뉴클레오티드 서열
Jseq 1-1 470 ACAACTGTGAGTCTGGTGCCTTGTCCAAAGAAA
Jseq 1-2 471 ACAACGGTTAACCTGGTCCCCGAACCGAAGGTG
Jseq 1-3 472 ACAACAGTGAGCCAACTTCCCTCTCCAAAATAT
Jseq 1-4 473 AAGACAGAGAGCTGGGTTCCACTGCCAAAAAAC
Jseq 1-5 474 AGGATGGAGAGTCGAGTCCCATCACCAAAATGC
Jseq 1-6 475 GTCACAGTGAGCCTGGTCCCGTTCCCAAAGTGG
Jseq 2-1 476 AGCACGGTGAGCCGTGTCCCTGGCCCGAAGAAC
Jseq 2-2 477 AGTACGGTCAGCCTAGAGCCTTCTCCAAAAAAC
Jseq 2-3 478 AGCACTGTCAGCCGGGTGCCTGGGCCAAAATAC
Jseq 2-4 479 AGCACTGAGAGCCGGGTCCCGGCGCCGAAGTAC
Jseq 2-5 480 AGCACCAGGAGCCGCGTGCCTGGCCCGAAGTAC
Jseq 2-6 481 AGCACGGTCAGCCTGCTGCCGGCCCCGAAAGTC
Jseq 2-7 482 GTGACCGTGAGCCTGGTGCCCGGCCCGAAGTAC
판독된 서열의 J 및 V 세그먼트의 지정에 사용된 정보는 증폭된 서열 내에 전적으로 함유되어 있고, PCR 프라이머의 속성에 의존하지 않는다. 이들 서열분석 올리고뉴클레오티드를 선택하고, 이에 의해 또 다른 J 세그먼트에 특이적인 올리고뉴클레오티드에 의한 하나의 J 세그먼트에 대한 서열분석 반응의 혼잡 프라이밍은 올바른 서열분석 올리고뉴클레오티드로부터의 서열 데이타와 동일한 뉴클레오티드를 정확하게 개시하는 서열 데이타를 생성할 수 있다. 이러한 방식으로, 서열분석 올리고뉴클레오티드의 혼잡 어닐링은 생성된 서열 데이타의 품질에 영향을 미치지 않았다.
V 세그먼트의 제2 보존된 시스테인과 J 세그먼트의 보존된 페닐알라닌 사이의 뉴클레오티드로서 규정된 CDR3 영역의 평균 길이는 35±3이고, 따라서 Jβ 세그먼트 태그로부터 개시하는 서열은 판독된 50개 염기 쌍에서 완벽한 V-D-J 결합을 거의 언제나 포획할 것이다.
TCR βJ 유전자 세그먼트는 길이가 대략 50개 염기쌍이다. 미스매치된 서열을 어닐링하고 연장시키는 PCR 프라이머는 혼잡 프라이머로서 지칭된다. TCR Jβ 역방향 PCR 프라이머는 서열분석 올리고뉴클레오티드와의 중첩을 최소화하여 다중 PCR과 관련하여 혼잡 프라이밍을 최소화하도록 설계된다. 13개 TCR Jβ 역방향 프라이머는 서열분석 프라이머와의 최소 중첩과 함께 컨센서스 스플라이스 부위 모티프의 3' 말단에 고정된다. TCR Jβ 프라이머는 디폴트 파라미터하에 서열분석 프로그램을 사용하는 일정 어닐링 온도를 제공한다.
서열분석 반응에 있어서, IGHJ 서열분석 프라이머는 표 9에 제시된 바와 같이 보존된 CAG 서열까지 3개 뉴클레오티드가 이어져있다.
Figure pct00005
서열 데이타의 처리
서열분석 결과의 신속한 분석을 위해, 알고리즘이 당업자에 의해 개발될 수 있다. 바람직한 방법은 다음과 같다.
서열분석 전에 TCRβ CDR3 영역을 증폭시키는 PCR 단계의 사용은, 상이한 Vβ 및 Jβ 유전자 세그먼트를 사용하는 CDR3 영역의 PCR 증폭 효율에 있어서의 차이에 기인하여, 당해 서열의 추정된 상대적 풍부함(abundance)에서 조직적인 바이어스를 잠재적으로 도입할 수 있다. 각각의 PCR 증폭 사이클은 평균 크기 1.51/15=1.027의 바이어스를 잠재적으로 도입한다. 따라서, 25회 사이클의 PCR은 독특한 CDR3 영역 서열의 추정된 상대적 풍부함에서 평균 크기 1.02725=1.95의 전체 바이어스를 도입한다.
서열분석된 판독치를 CDR3 서열을 포함하는 것들에 대해 여과한다. 서열분석기 데이타 처리는 각 판독치의 1차 서열에서 에러를 제거하고 당해 데이타를 압축하는 일련의 단계를 수반한다. 복잡성 여과기는 서열분석기로부터 잘목 판독한 서열의 대략 20%를 제거한다. 이어서, 서열은 13개 TCRB J-영역 중의 하나 및 54 V-영역 중의 하나 둘 다에 대해 최소의 6개 염기 매치를 갖도록 하는 것이 필요하다. 파지(phage) 서열을 함유하는 대조군 레인에 필터를 적용하면, 7백만 내지 8백만개 서열 중의 단지 하나의 서열만이 이들 단계를 통과했다. 마지막으로, 가장 인접한 알고리즘을 사용하여, PCR 에러 및 서열분석 에러 둘 다를 제거하기 위해, 밀접하게 관련된 서열의 병합에 의해 당해 데이타를 유니크 서열로 정리한다.
당해 데이타를 분석하면, PCR 생성물 중의 서열 비율은 혈액에서 클론형의 진정한 분포를 평가하기 전에 서열 데이타로부터 역방향으로 유도된 작업이어야 한다. 관찰된 각 서열에 있어서, 본원의 데이타에서 소정 수의 시간, 즉 당해 서열이 특정 크기의 PCR 풀로부터 샘플링되는 가능성이 평가된다. 서열분석된 CDR3 영역이 PCR 생성물의 대규모 풀로부터 무작위로 샘플링되기 때문에, 각 서열에 대한 관찰 수는 푸아송(Poisson) 분포로부터 수득했다. 푸아송 파라미터는 PCR용 주형을 제공한 T 세포 게놈의 수에 따라 정량화된다. 단순한 푸아송 혼합물 모델은 둘 다 이들 파라미터를 평가하고 각 분포로부터 수득되는 각 서열에 대한 쌍대 확률(pairwise probability)을 제공한다. 이는 혈액으로부터 수득한 각 서열의 풍부함을 재구성하는 기대 최대화 방법이다.
다양성을 평가하기 위해, "미지 종(unseen species)" 공식이 사용된다. 당해 공식을 적용하기 위해, 유니크한 적응 면역 수용체(예: TCRB) 클론형을 종 대신에 취한다. 수학적 해결책은 TCRβ"종" 또는 클론형의 전체 수, S에 대해, 서열분석 실험이 서열 s의 x s 복제를 관찰함을 제공한다. 모든 관찰되지 않은 클론형에 있어서, x s 는 0이고, 각각 TCR 클론형은 파라미터 λs를 갖는 푸아송 방법에 따라 채혈로 "포획된다". T 세포 게놈의 수는 제1 측정 1 및 제2 측정에서 서열분석된다. 다수의 유니크 서열이 존재하기 때문에, 적분은 합을 나타낸다. G(λ)가 파라미터 λ1, ···, λs의 경험적 분포 함수이고, nx이 정확하게 x배 서열분석된 클론형의 수이면, 클론형의 전체 수, 즉 다양성 E의 측정치는 다음 수학식에 의해 제공된다:
Figure pct00006
소정 실험에 있어서, T 세포가 몇몇 임의 공급원(채혈)으로부터 샘플링되는 경우, 당해 수학식을 사용하여 전체 공급원 중의 종의 전체 다양성을 평가한다. 당해 아이디어는 각 크기에서 클론형의 샘플링된 수가 전체 공급원 내의 클론형의 근본적인 분포를 평가하기에 충분한 정보를 함유한다는 것이다. 당해 수학식을 유도하기 위해, 정확한 측정을 반복하는 경우에 예상되는 새로운 종의 수를 평가했다. 수학식의 한계는 측정을 무한대로 반복해도 존재한다. 당해 결과는 전체 근본적인 공급원 모집단에서 종의 기대 수이다. 값 △(t), 즉 제2 측정으로 관찰된 신규 클론형의 수는 바람직하게는 하기 수학식을 사용하여 측정되어야 한다:
Figure pct00007
상기 수학식에서, msmt1 및 msmt2는 각각 측정 1 및 2로부터 클론형의 수이다. 1-e - λt의 테일러 팽창은 △(t)= E(x 1 )t-E(x 2 )t 2 +E(x 3 )t 3 -....을 제공하고, 이는 기대치 E( n x )를 제1 측정에서 관찰된 수로 치환함으로써 접근할 수 있다. 제1 측정에서 관찰된 수에 사용하여, 이 수학식은 1.6*105 신규한 유니크 서열이 제2 측정에서 관찰되어야 한다는 것을 예상한다. 제2 측정의 실제 값은 1.8*105 신규 TCRβ 서열이었고, 이는 예상이 전체 다양성에 대한 유효한 하한을 제공한다는 것을 암시한다. 오일러 변형(Euler's transformation)이 △(∞)을 위한 하한을 생성하기 위해 △(t)를 조정하는데 사용되었다.
다양성 측정을 사용한 질환의 진단
다양성의 측정을 하기와 같이 질환 또는 치료 효과 진단에 사용할 수 있다. T 세포 및/또는 B 세포 수용체 레퍼토리를, 예를 들면, 백혈병에 대한 조혈 간세포 이식(HSCT) 치료 후에 다양한 시점에서 측정할 수 있다. TCRB 레퍼토리의 다양성의 변화 및 전체 다양성의 변화 둘 다를 사용하여 면역경쟁을 측정할 수 있다. 이식 후의 면역 재구성의 예상 속도에 대한 기준이 사용된다. 임의의 두 시점 사이의 다양성의 변화 속도를 사용하여 치료를 적극적으로 변형시킬 수 있다. 고정된 시점에서의 전체 다양성이 또한 중요한 척도이고, 이는 당해 기준을 사용하여 상이한 환자를 비교할 수 있기 때문이다. 특히, 전체 다양성은 면역 재구성의 임상적 정의와 상호관련되어야 하는 척도이다. 이 정보를 사용하여, 예를 들면, HSCT 후에 항생제, 항바이러스제 및 항균제의 예방적 약물 섭생을 변형시킬 수 있다.
동종이계 조혈 세포 이식 후의 면역 재구성의 평가는 다양성의 변화를 측정하여 결정할 수 있다. 이들 기술은 또한, 백신접종에 대한 T 세포 반응의 분석에 의해 측정한 바와 같이, 노화에 따르는 임파구 다양성 감퇴의 분석을 향상시킬 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 αβ T 세포의 생성, 성장 및 발달에 대해 직접 효과를 갖는 조사 치료제(예: 인터류킨-7(IL-7))를 평가하는 수단을 제공한다. 더욱이, 이들 기술을 흉선 T 세포 모집단의 연구에 적용하는 것은 흉선세포의 포지티브 및 네가티브 선택 뿐만 아니라 T 세포 수용체 유전자 재배열의 과정을 통찰할 것이다.
충분한 작용성 면역계를 갖지 않지만 모계 전달된 항체를 가질 수 있는 신생아는 면역결핍 상태이다. 신생아는 이의 면역계가 자동적으로 발달할 때까지 다수의 질병에 감수성이고, 본 발명의 적응 면역계의 측정은 신생아 환자에서 유용성을 입증할 것이다.
임파구 다양성은 기타 선천적 또는 후천적 면역결핍 상태에서 평가될 수 있다. 면역계가 약화되었거나 약화되고 있는 AIDS 환자를 모니터링하여, 질환 단계를 측정하고 면역경쟁의 재구성을 목적으로 하는 요법에 대한 환자의 반응을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법의 또 다른 적용은 수용체 신체가 공여된 기관을 거부하지 않도록 약물 치료 중인 고체 기관 이식 수용체를 위한 진단적 측정법을 제공하는 것이다. 일반적으로, 이들 환자는 면역억제 요법하에 있다. 숙주의 면역경쟁의 모니터링은 이식 전후에 보조할 수 있다.
방사선 또는 화학요법 약물에 노출된 개체는 골수 이식을 하거나, 달리는 관련된 면역경쟁과 함께 T 세포 모집단의 보충을 필요로 한다. 본 발명의 방법은 골수 이식 또는 이들 치료 과정에서 림프구의 재구성을 정성적 및 정량적으로 평가하는 수단을 제공한다.
다양성을 측정하는 한 가지 방식은, 게놈 DNA의 적어도 2개 샘플을 비교하는 것이며, 바람직하게는 게놈 DNA 중의 하나의 샘플은 환자의 것이고 다른 샘플은 정상 피검체의 것이거나, 달리는 게놈 DNA의 하나의 샘플은 치료학적 처리 전의 환자의 것이고 다른 샘플은 치료 후의 환자의 것이거나, 게놈 DNA의 2개 샘플이 치료 동안 상이한 시점에서의 동일한 환자의 것이다. 또 다른 진단 방식은, 예를 들면, 사람 환자의 면역경쟁이 비교에 의해 평가되는, 게놈 DNA의 샘플 중에서 다양성의 비교에 기반할 수 있다.
바이오마커
개체 사이의 공유된 TCR 서열은 암, 자가면역 질환 및 감염성 질환을 포함하는 다양한 질병에 대한 새로운 부류의 잠재적 바이오마커를 나타낸다. 이들은 다수의 사람 질환에 대해 보고된 공공 T 세포이다. TCR은 T 세포가 클론 연장의 결과이기 때문에 바이오마커로서 유용하며, 이에 의해 면역계는 신속한 세포 분열을 통해 이들 바이오마커를 증폭시킨다. 증폭 후에, TCR은 표적이 작은 경우(예: 초기 단계 종양)에도 용이하게 검출된다. TCR은 또한, 다수의 경우에 T 세포가 추가로 원인이 되어 질환에 관여할 수 있고 따라서 약물 표적을 구성할 수 있기 때문에 바이오마커로서 유용하다. T 세포 자가 상호작용은 자가면역과 관련된 몇몇 질환, 예를 들면, 다발성 경화증, I형 당뇨병 및 류마티스성 관절염에서 중요 역할을 담당하는 것으로 생각된다.
적응 면역계 세포로부터 추출한 핵산의 대규모 서열분석을 사용하여 T 세포 수용체 유전자 또는 항체 유전자의 다양성을 분석함으로써 환자의 적응 면역을 측정 할 수 있다. 그로 인해 본 발명의 방법은 면역계를 손상시키는 질환 또는 상태, 및 재구성을 목적으로 하는 치료법의 효과를 평가하는 수단을 제공할 수 있다.
실시예
실시예 1: 샘플 획득, PBMC 분리, FACS 분류 및 게놈 DNA 추출
35세 및 37세의 2명의 건강한 남성 공여체로부터의 말초 혈액 샘플은 프레드 허친슨 암 연구 센터(FHCRC)의 임상 심사 위원회로부터 승인된 형식을 사용하여 서면 고지에 입각한 동의와 함께 수득했다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 Ficoll-Hypaque® 밀도 구배 분리로 분리했다. T-림프구는 각 대상 CD8+CD45RO+/- 및 CD4+CD45RO+/-에 대해 4개의 구획으로 유동 분류했다. 림프구의 특성화를 위해, 다음과 같이 접합된 항-사람 항체를 사용했다: CD4 FITC(클론 M-T466, Miltenyi Biotec), CD8 PE(클론 RPA-T8, BD Biosciences), CD45RO ECD(클론 UCHL-1, Beckman Coulter) 및 CD45RO APC(클론 UCHL-1, BD Biosciences). 전체 PBMC의 염색은 4℃에서 20분 동안 적합한 항체의 조합으로 수행하고, 염색된 세포를 분석 전에 1회 세척했다. 림프구 아집단을 BD FACSAriaTM 세포-분류 시스템(BD Biosciences)으로 FACS 분류로 분리했다. 데이타는 FlowJo 소프트웨어(Treestar Inc.)를 사용하여 분석했다.
전체 게놈 DNA를 분류된 세포로부터 QIAamp®DNA 혈액 미니 키트(QIAGEN®)를 사용하여 추출시켰다. 단일 반수체 게놈의 대략적인 질량은 3 pg이다. 각 T 세포 구획에서 수백만개의 재배열된 TCRB를 샘플링하기 위해, 6 내지 27 ㎍의 주형 DNA를 각 구획으로부터 수득했다(참조: 표 10).
CD8+/CD45RO- CD8+/CD45RO+ CD4+/CD45RO- CD4+/CD45RO+ 　공여체
세포(x106) 9.9 6.3 6.3 10 2
DNA (ug) 27 13 19 25
PCR 사이클 25 25 30 30
클러스터 (K/tile) 29.3 27 102.3* 118.3*
VJ 서열 (x106) 3.0 2.0 4.4 4.2
세포 4.9 4.8 3.3 9 1
DNA 12 13 6.6 19
PCR 사이클 30 30 30 30
클러스터 116.3 121 119.5 124.6
VJ 서열 3.2 3.7 4.0 3.8
세포 NA NA NA 0.03 PCR
바이어스 평가
DNA NA NA NA 0.015
PCR 사이클 NA NA NA 25 + 15
클러스터 NA NA NA 1.4 / 23.8
VJ 서열 NA NA NA 1.6
실시예 2: 실질적 T 세포 수용체 β 쇄 스펙트라타이핑
실질적 TCR β 쇄 스펙트라타이핑은 다음과 같이 수행했다. 상보성 DNA는 분류된 T 세포 집단으로부터 추출된 RNA로부터 합성했고, 재배열된 TCR β 쇄 CDR3 영역의 다중 PCR 증폭용 주형으로서 사용했다. 각 다중 반응은 TCR β 쇄 불변 영역에 특이적인 6-FAM-표지된 안티센스 프라이머, 및 2 내지 5개의 TCR β 쇄 가변(TRBV) 유전자 특이적 센스 프라이머를 함유한다. 모든 23개의 작용성 Vβ 부류를 연구했다. PCR 반응은 다음 사이클 조건하에 하이바이드 (Hybaid) PCR 고속 열 사이클러(Hybaid, Ashford, UK) 상에서 수행했다: 95℃에서 6분 동안 1 사이클, 94℃에서 30초 동안, 58℃에서 30초 동안 및 72℃에서 40초 동안 40 사이클, 이어서 72℃에서 10분 동안 1 사이클. 각 반응은 최종 용적 20 ㎕로 cDNA 주형, 500 uM dNTP, 2 mM MgCl2 및 AmpliTaq 골드 완충제 중의 AmpliTaq 골드 DNA 폴리머라제(Perkin Elmer) 1 유닛을 함유한다. 완료 후, PCR 생성물의 분획을 1:50으로 희석하고, DNA 분석기를 사용하여 분석했다. DNA 분석기의 아웃풋은 공지된 크기 표준을 함유하는 참조 샘플의 형광 강도 자취를 비교하여 형광 강도 대 길이의 분포로 전환시켰다.
실시예 3: TCRβ CDR3 영역의 다중 PCR 증폭
CDR3 결합(junction) 영역은 다음과 같이 조작적으로 규정된다. 결합은 V-영역의 제2 보존된 시스테인으로 개시하여 J-영역의 보존된 페닐알라닌으로 종결된다. 관찰된 서열의 역방향 보충물을 취하고 플랭킹 영역을 해독하여, 결합 경계를 정의하는 아미노산을 동정했다. 이들 경계 사이의 뉴클레오티드의 수는 길이를 결정하고, 따라서 CDR3 영역의 프레임을 결정한다. 서열분석을 위한 주형 라이브러리를 생성하기 위해, 다중 PCR 시스템을 선택하여 게놈 DNA로부터 재배열된 TCRβ 부위를 증폭시켰다. 다중 PCR 시스템은 각각 작용성 TCR Vβ 세그먼트에 특이적인 45개의 정방향 프라이머(표 3), 및 각각 TCR Jβ 세그먼트에 특이적인 13개의 역방향 프라이머(표 4)를 사용한다. 프라이머를 선택하여, 적당한 정보가 증폭된 서열 내에 존재하여 V 및 J 유전자를 유니크하게 동정하는 것을 제공한다(V 유전자 재조합 시그날 서열(RSS)의 서열 상류의 40개 초과 염기 쌍, 및 J 유전자 RSS의 하류의 30개 초과 염기 쌍).
정방향 프라이머는 5' 말단에서 일루미나 GA2 클러스터 스테이션 고체-상 PCR과 상용성인 범용 정방향 프라이머 서열로 변형된다. 유사하게는, 역방향 프라이머 모두는 GA2 범용 역방향 프라이머 서열로 변형된다. 각 정방향 프라이머의 3' 말단은 재조합 시그날 서열(RSS)에 비해 Vβ 세그먼트 중의 위치 -43에서 고정되어 증폭된 영역 내에서 유니크한 Vβ 태그 서열을 제공한다. 각 Jβ 세그먼트에 특이적인 13개의 역방향 프라이머를, 각 프라이머의 3' 말단을 인트론/엑손 접합을 교차시키면서, 3' 인트론에 고정시켰다. Jβ 세그먼트의 증폭된 부분에 상보성인 Jβ 세그먼트에 상보성인 13개의 서열분석 프라이머를 설계하여, 서열의 처음 소수의 염기가 유니크한 Jβ 태그 서열을 포획하도록 한다.
평균 J 결실은 4bp +/- 2.5bp 이고, 이는 10개 초과의 뉴클레오티드의 J 결실이 1% 미만의 서열에서 발생한다는 것을 의미한다. 13개의 상이한 TCR Jβ 유전자 세그먼트는 각각 RSS 부위 하류의 위치 +11 내지 +14에서 유니크한 4개의 염기 태그를 가졌다. 따라서, 올리고뉴클레오티드의 서열분석은 이 "태그"의 바로 하류에서 관찰된 컨센서스 뉴클레오티드 모티프에 어닐링되도록 설계되어, 서열 판독의 처음 4개 염기가 J 세그먼트를 유니크하게 동정하도록 했다(표 5).
서열 판독의 J 및 V 세그먼트를 지정하는데 사용되는 정보는 증폭된 서열에 완전히 함유되고, PCR 프라이머의 동일성에 의존하지 않는다. 이러한 서열분석 올리고뉴클레오티드를 선택하여, 다른 J 세그먼트에 특이적인 올리고뉴클레오티드에 의한 하나의 J 세그먼트에 대한 서열분석 반응의 혼잡 프라이밍이 올바른 서열분석 올리고뉴클레오티드로부터의 서열 데이타로서 동일한 뉴클레오티드에서 정확하게 개시하는 서열 데이타를 생성할 수 있다. 이러한 방식으로, 서열분석 올리고뉴클레오티드의 혼잡 어닐링은 생성된 서열 데이타의 품질에 영향을 미치지 않았다.
V 세그먼트의 제2 보존된 시스테인과 J 세그먼트의 보존된 페닐알라닌 사이의 뉴클레오티드로서 관례에 따라 정의된 CDR3 영역의 평균 길이는 35+/-3이고, 따라서 Jβ 세그먼트 태그로부터 개시하는 서열은 거의 항상 50 bp 판독에서 완전한 VNDNJ 결합을 포획한다.
TCR βJ 유전자 세그먼트는 길이가 대략 50 bp이다. 미스매치 서열에 어닐링되어 연장되는 PCR 프라이머는 혼잡 프라이머로서 칭명된다. 다중 PCR의 맥락에서, 특히 유전자 부류 맥락에서 혼잡 프라이밍의 위험 때문에, TCR Jβ 역방향 PCR 프라이머를 서열분석 올리고뉴클레오티드와의 중첩을 최소화하도록 설계했다. 따라서, 13개 TCR Jβ 역방향 프라이머를 서열분석 프라이머와의 최소 중첩으로 컨센서스 스플라이싱 부위 모티프 상의 3' 말단에 고정시킨다.
TCR Jβ 프라이머를 디폴트 파라미터하에 OligoCalc 프로그램 (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)을 사용하여 일정한 어닐링 온도 (50 mM 염 중 58°)를 위해 설계했다 .
45개의 TCR Vβ 정방향 프라이머는, 두가지 명시적 목적을 위해, Vβ 세그먼트 사이의 비교적 강력한 서열 보존 영역에서 Vβ 세그먼트에 어닐링하도록 설계했다. 첫째, 이들 프라이머 사이의 서열 보존의 최대화는 각 프라이머의 차별(differential) 어닐링 특성에 대한 가능성을 최소화한다. 둘째, 프라이머는 V 및 J 프라이머 사이의 증폭된 영역이 사용된 특이적 Vβ유전자 세그먼트를 동정하기에 충분한 TCR Vβ 서열 정보를 함유하도록 선택했다. 이는 TCR Vβ 프라이머에 의한 혼잡 프라이밍의 경우에, 잘못된 TCR Vβ유전자 세그먼트 지정 위험을 제거한다. TCR Vβ 정방향 프라이머는 TCRβ 부위에서 모든 공지된 비-위유전자용 (non-pseudogene)으로 설계되었다.
이러한 시스템을 사용하여 성공적으로 재배열된 TCRβ CDR3 영역을 위한 전체 PCR 생성물은 길이가 약 200 bp일 것으로 기대된다. 게놈 주형은 45개 TCR Vβ F 프라이머의 등몰량 풀("VF 풀") 및 13개 TCR Jβ R 프라이머의 등몰량 풀("JR 풀")을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 50 ㎕ PCR 반응을 1.0 μM VF 풀(각각의 유니크한 TCR Vβ F 프라이머에 대해 22 nM), 1.0 μM JR 풀(각각의 유니크한 TCRBJR 프라이머에 대해 77 nM), 1X QIAGEN 다중 PCR 마스터 혼합물(QIAGEN 파트 번호 206145), 10% Q-용액(QIAGEN) 및 16 ng/ul gDNA로 설정했다. 하기 열 사이클 조건을 다음 사이클 조건하에 PCR 고속 열 사이클러(Hybaid, Ashford, UK)에 사용했다: 95℃에서 15분 동안 1 사이클, 94℃에서 30초 동안, 59℃에서 30초 동안 및 72℃에서 1분 동안 25 내지 40사이클, 이어서 72℃에서 10분 동안 1 사이클. PCR의 12 내지 20개 웰을, 재배열된 TCRβ CDR3 부위의 수천 내지 수백만 중의 수백을 샘플링하기 위해 각 라이브러리에 대해 수행했다.
실시예 4: 서열 데이타의 전처리
서열분석기 데이타 처리는 각 판독의 1차 서열에서 에러를 제거하고, 데이타를 압축하는 일련의 단계를 포함한다. 첫째, 복합성 필터는 서열분석기로부터 잘못 판독된 서열의 약 20%를 제거한다. 이어서, 서열은 13개 J-영역 중의 하나 및 54개 V-영역 중의 하나 모두에 대한 최소 6개의 염기 매치를 가질 것을 필요로 했다. 파지 서열을 함유하는 대조군 레인에 필터를 적용한 후, 평균 7백만 내지 8백만 중의 단지 하나의 서열만이 펄스 (false) 포지티브 없이 이들 단계를 통과했다. 최종적으로, 가장 근접한 알고리즘을 사용하여 밀접하게 관련된 서열의 병합에 의해 데이타를 유니크한 서열로 정리함으로써 PCR 에러 및 서열분석 에러 둘 다를 제거했다(참조: 표 10).
실시예 5: PCR 풀 및 혈액 샘플 중의 상대적 CDR3 서열 풍부함 평가
데이타 정리 후, 혈액 재구성에서 T-세포 서열의 근본적 분포는 서열 데이타로부터 유도했다. 과정은 다음 3단계를 사용한다: 1) 말초 혈액으로부터 채취한 T-세포 유동 분류, 2) PCR 증폭 및 3) 서열분석. 데이타를 분석하여, PCR 생성물 중의 서열 비율은, 혈액 중의 클론형의 진정한 분포를 평가하기 전에, 서열 데이타로부터 역방향 작업으로 유도되어야 한다.
본원의 데이타에서 소정의 시간에 관찰된 각 서열에 있어서, 당해 서열이 특정 크기의 PCR 풀로부터 샘플링되는 확률을 평가한다. 서열분석된 CDR3 영역은 PCR 생성물의 대규모 풀로부터 무작위로 샘플링되기 때문에, 각 서열에 대한 관찰 수는 푸아송 분포(Poisson distributions)로부터 수득된다. 푸아송 변수는 PCR용 주형을 제공한 T 세포 게놈의 수에 따라 정량화된다. 단순한 푸아송 혼합물 모델은 이들 파라미터를 평가하고, 각 분포로부터 수득된 각 서열에 대한 쌍대 확률을 제공한다. 이는 혈액으로부터 수득된 각 서열의 풍부함을 재구성하는 기대 최대화 방법이다.
실시예 6: 진정한 다양성 평가를 위한 미지 종 모델
혼합물 모델은 혈액으로부터 수득한 각 TCRβ CDR3 종의 도수를 재구성할 수 있지만, 더 큰 문제는 얼마나 많은 유니크한 CDR3 종이 공여체에 존재하는지의 여부이다. 이는 이용가능한 샘플이 각 공여체 중에서 제한되고, 이들 기술이 치료를 받는 환자에게서 합리적으로 수득될 수 있는 보다 작은 용적의 혈액으로 외삽됨에 따라 장래에 보다 중요해지기 때문에 대답할 필요가 있는 기본적인 질문이다.
수학적인 해결책은 TCRβ"종" 또는 클론형의 전체 수, S에 대해, 서열분석 실험은 서열 s의 x s 복제를 관찰한다. 모든 관찰되지 않은 클론형에 있어서, x s 는 0이고, 각 TCR 클론형은 변수 λs를 갖는 푸아송 방법에 따라 채혈로 "포획된다". T 세포 게놈의 수는 제1 측정 1, 및 제2 측정에서 서열분석된다. 다수의 유니크 서열이 존재하기 때문에, 적분은 합을 나타낸다. G(λ)가 변수 λ1, ···, λs의 경험적 분포 함수이고, nx가 정확하게 x배 서열분석된 클론형의 수이면, 다음과 같다:
Figure pct00008
값 △(t)는 제2 서열분석 실험에서 관찰된 신규 클론형의 수이다.
Figure pct00009
1-e - λt의 테일러 팽창은 △(t)= E(x 1 )t-E(x 2 )t 2 +E(x 3 )t 3 -....을 제공하고, 이는 기대치 E( n x )를 제1 측정에서 관찰된 수로 치환함으로써 접근할 수 있다. 제1 측정에서 관찰된 수에 사용하여, 이 수학식은 1.6*105개 신규 유니크 서열이 제2 측정에서 관찰되어야 한다는 것을 예측한다. 제2 측정의 실제 값은 1.8*105개 신규 TCRβ 서열이었고, 이는 예측이 전체 다양성에 대한 유효한 하한을 제공한다는 것을 암시한다. 오일러 변형(Euler's transformation)이 △(∞)을 위한 하한을 생성하기 위해 △(t)를 조정하는데 사용되었다.
실시예 7: 에러 보정 및 바이어스 평가
1차 서열 데이타에서 서열 에러는 다음 2개의 공급원으로부터 주로 유도한다: (1) TCRβ CDR3 주형 서열의 PCR에 의한 증폭 동안 발생하는 뉴클레오티드 오편입, 및 (2) CDR3 서열의 PCR-증폭된 라이브러리의 서열분석 동안 도입된 기본 호출의 에러. 대량의 데이타는 이러한 2개의 공급원에 기인하는 1차 서열 데이타에서 대부분의 에러를 보정하는 올바른 에러 보정 방식을 실행하도록 한다. 에러 보정 후, 프레임내 유니크 CDR3 서열의 수 및 각 유니크 서열의 관찰 수는 두 공여체로부터 4개의 유동 분류된 T 세포 모집단 각각에 대해 표로 만들었다. 4개의 유동 혈구계산에 의해 정의된 모집단에서 CDR3 서열의 상대 도수 분포는 항원-경험 CD45RO+ 모집단이 CD45RO- 모집단보다 높은 상대 도수로 상당히 많은 유니크 CDR3 서열을 함유한다는 것을 증명한다. CD4, CD8 및 CD45RO의 발현에 의해 구별되고, 혈액에 존재하는 4개의 상이한 T 세포 아집단에서 관찰된 TCRβ CDR3 서열의 도수 막대그래프는 10개의 유니크 서열이 각각 CD4+CD45RO+(항원 경험) T 세포 샘플에서 200회 관찰되었고, 이는 CD4+CD45RO- 모집단에서 관찰된 도수의 2배 이상이었다는 것을 보여주었다.
서열분석 직전에 TCRβCDR3 영역을 증폭시키는 PCR 단계의 사용은 상이한 Vβ 및 Jβ 유전자 세그먼트를 사용하는 CDR3 영역의 PCR 증폭 효율의 차이에 기인하여 서열의 추정된 상대적 풍부함에 조직적 바이어스를 잠재적으로 도입할 수 있다. 이러한 임의의 바이어스의 크기를 평가하기 위해, 약 30,000개의 유니크 CD4+CD45RO+ T 림프구 게놈 샘플로부터 TCRβCDR3 영역을 PCR의 25 사이클을 통해 증폭시켰고, 이 때 PCR 생성물을 절반으로 갈랐다. PCR 생성물의 절반은 비축하고, 나머지 절반은 PCR의 추가 15 사이클 동안, 전체 40 사이클 증폭 동안 증폭시켰다. 이어서, 25 사이클 및 40 사이클 동안 증폭된 PCR 생성물을 서열분석하고 비교했다. 25 사이클 서열의 95% 이상이 또한 40 사이클 샘플에서 발견되었고, 이들 샘플 사이의 서열의 도수를 비교할 경우, 선형 상관(linear correlation)이 관찰된다. 25 사이클 레인에서 소정수 관찰된 서열에 있어서, PCR 바이어스 및 추출 변동(sampling variance)의 조합은 40 사이클에서 관찰수의 평균에 대한 변동을 설명한다. 보존적으로 선에 대한 평균 변동(1.5배)이 전적으로 PCR 바이어스에 있다고 간주하여, PCR 증폭의 각 사이클은 평균 크기 1.51/15 = 1.027의 바이어스를 잠재적으로 도입한다. 따라서, PCR의 25 사이클은 명백한 CDR3 영역 서열의 추정된 상대적 풍부함에서 평균 크기 1.02725 = 1.95의 전체 바이어스를 도입한다.
실시예 8: Jβ 유전자 세그먼트 사용
각 TCR β 쇄 중의 CDR3 영역은 13개의 Jβ 유전자 세그먼트 중의 하나로부터 유도된 서열을 포함한다. 2개 공여체로부터의 4개의 상이한 T 세포 모집단에서 CDR3 서열의 분석은 13개의 상이한 Jβ 유전자 세그먼트로부터 유도된 서열을 도입한 전체 서열의 분획이 20배 이상 변한다는 것을 증명한다. 단일 공여체로부터 4개의 상이한 T 유동 혈구계산에 의해 정의된 T 세포 중 Jβ 사용은 소정의 공여체 내에서 비교적 일정했다. 또한, 2개 공여체 중에서 관찰되고, GA를 사용하여 서열분석된 T 세포로부터 게놈 DNA의 분석에 의해 추정된 Jβ 사용 패턴은 제대혈로부터 및 건강한 성인 공여체로부터의 T 세포에서 관찰된 것과 정성적으로 유사하고, 이들 둘 다는 소모적 모세관 기반 기술을 사용하여 서열분석된 T 세포로부터 cDNA의 분석으로부터 추정되었다.
실시예 9: 뉴클레오티드 삽입 바이어스
TCR α 및 β 쇄 중의 CDR3 결합부에서 다량의 다양성은 효소 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)에 의한 비-주형화 뉴클레오티드 삽입에 의해 생성된다. 그러나, 생체내에서, 선택은 예측불가성을 초래하는 TCR 레퍼토리의 형상화에 중요한 역할을 한다. TdT 뉴클레오티드 삽입 도수는, 선택과 무관하게, 프레임 외 TCR 서열을 사용하여 계산했다. 이러한 서열은 제2 대립유전자가 기능적 재배열을 갖는 T 세포 중의 1개의 대립유전자 상에서 수행된 비-기능적 재배열이다. TdT의 모노-뉴클레오티드 삽입 바이어스는 C 및 G를 지지한다(표 11).
프레임 외 데이타 중의 모노-뉴클레오티드 바이어스
A C G T
레인 1 0.24 0.294 0.247 0.216
레인 2 0.247 0.284 0.256 0.211
레인 3 0.25 0.27 0.268 0.209
레인 4 0.255 0.293 0.24 0.21
유사한 뉴클레오티드 도수가 프레임 서열에서 관찰된다(표 12).
프레임 내 데이타 중의 모노-뉴클레오티드 바이어스
A C G T
레인 1 0.21 0.285 0.275 0.228
레인 2 0.216 0.281 0.266 0.235
레인 3 0.222 0.266 0.288 0.221
레인 4 0.206 0.294 0.228 0.27
프레임 외 TCR 서열로부터 N 영역을 사용하여 디-뉴클레오티드 바이어스를 측정했다. 디-뉴클레오티드 바이어스의 난외(marginal) 기여도를 분리하기 위해, 디-뉴클레오티드 도수를 두 염기 각각의 모노뉴클레오티드 도수로 나누었다. 측정은 다음과 같다:
Figure pct00010
m에 대한 매트릭스는 표 13에서 발견된다.
프레임 외 데이타의 디-뉴클레오티드 승산비(odd-ratio)
A C G T
A 1.198 0.938 0.945 0.919
C 0.988 1.172 0.88 0.931
G 0.993 0.701 1.352 0.964
T 0.784 1.232 0.767 1.23
다수의 디뉴클레오티드는 제시된 바의 상하에 있다. 예를 들면, GG 쌍을 발견할 승산 (odd)은 매우 높다. 코돈 GGN이 글리신으로 해독되기 때문에, 다수의 글리신이 CDR3 영역에서 기대된다.
실시예 10: CDR3 영역 중의 아미노산 분포
TCRβ 쇄의 CDR3 영역 중의 아미노산의 분포는 V, D 및 J 영역을 위한 생식세포 서열, TdT의 삽입 바이어스 및 선택에 의해 형상화된다. 4개의 상이한 T 세포 하위-구획에 대한 당해 영역에서의 아미노산의 분포는 상이한 세포 아형태 사이에 매우 유사하다. 고정 길이(아미노산 중의 위치 의존 분포)의 β 쇄로 서열의 분리는 6개의 화학적 성질: 작은, 특별한 및 큰 소수성, 중간 극성, 산성 및 염기성으로 분류된다. 분포는, 특히 위치 5에서 고비율의 산성 염기를 갖는 CD8+ 항원 경험 T 세포 이외에, 실질적으로 동일하다.
특히 흥미로운 것은 이들이 부류 I 및 부류 II HLA 분자 각각에 의해 제공된 펩티드에 결합함에 따르는 CD8+ 및 CD4+ TCR 서열의 비교이다. CD8+ 항원 경험 T 세포는 고비율의 산성 아미노산을 갖는 소수의 위치를 갖는다. 이는 부류 II에서가 아니라 HLA 부류 I 분자 상에서 발견된 염기성 잔기와의 결합을 수행할 수 있다.
실시예 11: 상이한 사람에게서 발견된 동일한 아미노산 서열을 갖는 TCR β 쇄
TCR β 쇄 서열을 아미노산으로 해독한 후, 2개 공여체 사이의 쌍을 비교했다. 수천의 정확한 서열 매치가 관찰되었다. 예를 들면, CD4+ CD45RO- 하위 구획을 비교하면, 공여체 1로부터의 250,000개의 유니크 아미노산 서열 중 약 8,000개가 공여체 2와 정확하게 매치했다. 아미노산 수준에서 이러한 매치 서열 중의 다수는 제3 코돈 위치에서 다수의 뉴클레오티드 차이를 갖는다. 상기 언급한 실시예에 따라, 1,500/8,000 동일한 아미노산 매치가 5 초과의 뉴클레오티드 미스매치를 가졌다. 임의의 2개 T 세포 아형태 사이에는 유니크 TCRβ 서열의 4 내지 5%가 동일한 아미노산 매치를 갖는 것으로 밝혀졌다.
1) TCR 발달 동안의 선택이 이러한 통상적 서열을 생성하는지, 그리고 2) TdT에 의한 뉴클레오티드 삽입 도수에서의 큰 바이어스가 유사한 뉴클레오티드 서열을 창출하는지의 두가지 가능성을 시험했다. 프레임내 쌍 매치를 프레임외 쌍 매치와 비교했다(참조: 상기 실시예 1 내지 4). 프레임을 변경하면 유전자 코드의 특징 모두가 보존되고, 따라서 서열 바이어스가 전체 관찰의 원인이면, 동일한 수의 매치가 발견되어야 한다. 그러나, 프레임외 매치의 거의 2배 가량 많은 프레임내 매치가 발견되고, 이는 단백질 수준에서의 선택이 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다.
수천개의 동일한 TCR β 쇄 아미노산 서열에 대한 이러한 발견을 확인하기 위해, 2개 공여체를 제3 공여체인 44세 CMV+ 백인 여성으로부터의 CD8+ CD62L+ CD45RA+ (천연 유사) TCR에 대하여 비교했다. 제3 공여체와 각각의 본래 2개의 공여체 사이의 아미노산 수준에서 수천개 서열의 많은 동일한 쌍 매치가 발견되었다. 대조적으로, 460개 서열이 모든 3개 공여체 사이에 공유되었다. 공여체 사이의 유니크 서열의 전체 수에서의 큰 변화는 출발 물질 및 서열분석기 상으로 적재량 변화의 산물이고, 공여체의 혈액 중의 진정한 다양성에 대한 변화를 나타내는 것은 아니다.
실시예 12: 고도수 클론형은 생식 세포주에 보다 유사하다.
모든 T세포 아구획 내에서 상이한 서열 사이의 복제 수의 변화는 10,000배 이상의 계수 범위였다. 복제 수와 상관되는 유일한 특성은 (삽입 수 + 결실 수)이고, 이는 역으로 상관된다. 분석 결과는 결실이 복제 수와 역상관 관계로 삽입보다 작은 역할을 함을 나타낸다.
삽입 및 결실이 보다 적은 서열은 생식 세포주에 보다 유사한 수용체 서열을 갖는다. 생식 세포주에 유사한 서열의 수 증가에 대한 한 가지 가능성은 이들이 T 세포 발달 동안 다수의 형성이다. 생식 세포주 서열은 사람 사이에 공유되기 때문에, 공유된 TCRβ 쇄는 소수의 삽입 및 결실을 갖는 TCR에 의해 생성된다.
실시예 13: V 유전자 세그먼트 사용 및 CDR3 길이에 의한 TCRβ CDR3 서열의 "스펙트라타입" 분석
TCR 다양성은 통상 TCR 스펙트라타이핑 기술을 사용하여 평가되었고, 이는 서열 수준에서 TCR CDR3 다양성을 평가하는 것이 아니라, 동일한 Vα 또는 Vβ 유전자 세그먼트를 사용하는 αβ T 세포의 서브세트에서 mRNA로서 발현된 TCRα 또는 TCRβ CDR3 길이의 다양성을 평가하는 RT-PCR 기반 기술이다. 건강한 젊은 성인의 제대혈 또는 말초혈에서 발견되는 바와 같이, TCR CDR3 서열의 다양한 레퍼토리를 갖는 폴리클로날 T 세포 모집단의 스펙트라타입은 다수의 3개 뉴클레오티드인 8 내지 10개의 상이한 길이의 CDR3 서열을 통상 함유하고, 이는 프레임내 전사체에 대한 선택을 반영한다. 스펙트라타이핑은 또한 각각의 특정한 길이를 갖는 CDR3 서열의 상대 도수에 대한 개략적인 정량적 정보를 제공한다. 서열분석기를 사용하여 T 세포 게놈 DNA로부터 TCRβ CDR3 영역의 직접 서열분석이 스펙트라타이핑에 의해 동정된 CDR3 길이 다양성을 정확하게 포획할 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, "실질적" TCRβ 스펙트라타입(하기 실시예 참조)을 서열 데이타로부터 생성하고 통상의 PCR 기술을 사용하여 생성한 TCRβ 스펙트라타입과 비교했다. 실질적 스펙트라타입은 통상의 스펙트라타입에 존재하는 모든 CDR3 길이 및 상대 도수 정보를 함유했다. 직접 TCRβ CDR3 서열분석은 통상의 스펙트라타입에 존재하는 TCR 다양성 정보 모두를 포획한다. 표준 TCRβ 스펙트라타입 데이타와 서열에 대한 계산된 TCRβ CDR3 길이 분포의 비교는 공여체 1로부터 CD4+CD45RO+ 세포에 존재하는 대표적인 TCR Vβ 유전자 세그먼트를 사용한다. 각각의 Vβ 부류 내에 상이한 길이를 갖는 특이적 CDR3 서열의 도수 막대그래프와 비교하여 서열 데이타 내에 함유된 정보의 감소는 스펙트라타입 데이타에 함유된 모든 정보를 용이하게 재생한다. 또한, 실질적 스펙트라타입은 통상의 PCR 기반 스펙트라타이핑에 의해 검출되지 않는 CDR3 길이가 매우 짧고 매우 긴 희귀한 CDR3 서열의 각 Vβ 부류 내의 존재를 나타냈다.
실시예 14: 전체 CDR 서열 다양성의 평가
에러 보정 후, 서열분석기 유동 세포 (flow cell)의 각 레인에서 관찰된 특이적 CDR3 서열의 수는 통상 1×105개를 초과했다. 각 레인에서 서열분석된 PCR 생성물이 2개의 공여체 각각에 존재하는 T 세포 게놈의 소분획으로부터 반드시 유도되는 경우, 각 개체의 전체 T 세포 레퍼토리에서 특이적 TCRβ CDR3 서열의 전체 수는 훨씬 높은 것처럼 보인다. 따라서, 전체 레퍼토리에서 유니크 서열 수의 평가는 혈액 내에 존재하지만 샘플에서 관찰되지 않는 추가의 특이적 CDR3 서열 수의 평가를 필요로 한다. 무한 샘플에 존재하는 종 다양성의 측정을 사용하여 거대하고 복잡한 모집단에서 전체 종 다양성의 평가는 조직학적으로 "미지 종 문제"로 지칭했다(상기 실시예 참조). 해결책은 새로운 종 수의 측정, 또는 실험이 반복되는 경우, 즉 서열분석이 반복적으로 말초혈 T 세포의 동일한 샘플, 예를 들면, 서열분석기 유동 세포의 상이한 레인에서 TCRβ CDR3 PCR 생성물의 동일하게 제조된 라이브러리에서 관찰되는 TCRβ CDR3 서열 수의 측정 및 신규 CDR3 서열 수의 계수로 개시한다. 공여체 2로부터 CD8+CD45RO- 세포에 있어서, 제2 레인에서 신규 CDR3 서열의 예상 및 관찰된 수는 5% 이내이고(상기 실시예 참조), 이는 당해 분석적 해결책이 사실 전체 레퍼토리에서 특이적 TCRβ CDR3 서열의 전체 수를 평가하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.
4개의 유동 세포 분석학적 규정된 T 세포 구획에서 특이적 TCRβ CDR3 서열의 전체 수에 대한 수득 평가치는 표 14에 제시되어 있다.
TCR 레퍼토리 다양성
공여체 CD8 CD4 CD45RO 다양성
1 + - + 6.3*105
+ - - 1.24*106
- + + 8.2*105
- + - 1.28*106
총 T 세포 다양성 3.97*106
2 + - + 4.4*105
+ - - 9.7*105
- + + 8.7*105
- + - 1.03*106
총 T 세포 다양성 3.31*106
흥미롭게, 이들 모집단에서 전체 TCRβ 다양성은 말초혈에서 3 내지 4백만개의 유니크 서열 사이에 존재한다. 놀랍게도, CD45RO+ 또는 항원 경험한 구획은 대략 150만개의 이들 서열을 구성한다. 이는 예상된 것보다 적어도 큰 정도이다. 이러한 불일치는 낮은 상대 도수에서 관찰된 다수의 이들 서열에 기인하는 것 같고, 이는 심층 서열분석을 통해 유일하게 검출될 수 있다. 2개 공여체에서 각 구획의 평가된 TCRβ CDR3 레퍼토리 크기는 서로 20% 이내이다.
본원의 결과는 달성된 TCRβ 수용체 다양성이 이전의 평가치(약 4*106개 독특한 CDR3 서열)보다 적어도 5배 높음을 증명하고, 특히 종래 보고된 것(약 1.5*106개 독특한 CDR3 서열)보다 CD45RO+ 항원 경험 αβ T 세포 중에서 훨씬 큰 TCRβ 다양성을 시사한다. 그러나, TCR 서열 데이타의 생물정보 분석은 모노뉴클레오티드 및 디뉴클레오티드 함량에서 강력한 바이어스를 나타내고, 이는 사용된 TCR 서열이 이론적 크기보다 훨씬 적은 분포로부터 샘플링됨을 암시한다. 서열의 심각하게 제한된 공간으로부터 샘플링된 각 개인에서 TCRβ 쇄의 거대 다양성과 함께 TCR 서열 풀의 중첩이 각 개인 사이에서 예상될 수 있다. 사실, 당해 결과는 정확한 아미노산 매치를 갖는 약 5%의 CD8+ 천연 TCRβ 쇄가 3명의 상이한 개체의 각 쌍 사이에서 공유됨을 나타냈다. TCRα 풀이 이미 이론적 TCRβ 다양성보다 실질적으로(substantially) 작은 것으로 측정되었기 때문에, 이들 결과는 수백 내지 수천개의 진정한 공공 αβ TCR이 발견될 수 있음을 나타낸다.
<110> FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER <120> METHOD OF MEASURING ADAPTIVE IMMUNITY <130> IPA110921 <150> US 61/220,344 <151> 2009-06-25 <160> 484 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 1 ntcaaatttc actctgaaga tccggtccac aa 32 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV3-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 2 ngctcactta aatcttcaca tcaattccct gg 32 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV4-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 3 ncttaaacct tcacctacac gccctgc 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV(4-2, 4-3) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 4 ncttattcct tcacctacac accctgc 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV5-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 5 ngctctgaga tgaatgtgag caccttg 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV5-3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 6 ngctctgaga tgaatgtgag tgccttg 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV(5-4, 5-5, 5-6, 5-7, 5-8) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 7 ngctctgagc tgaatgtgaa cgccttg 27 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV6-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 8 ntcgctcagg ctggagtcgg ctg 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV(6-2, 6-3) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 9 ngctggggtt ggagtcggct g 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV6-4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 10 nccctcacgt tggcgtctgc tg 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV6-5 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 11 ngctcaggct gctgtcggct g 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV6-6 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 12 ncgctcaggc tggagttggc tg 22 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV6-7 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 13 ncccctcaag ctggagtcag ctg 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV6-8 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 14 ncactcaggc tggtgtcggc tg 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV6-9 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 15 ncgctcaggc tggagtcagc tg 22 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV7-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 16 nccactctga agttccagcg cacac 25 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV7-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 17 ncactctgac gatccagcgc acac 24 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV7-3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 18 nctctactct gaagatccag cgcacag 27 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV7-4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 19 nccactctga agatccagcg cacag 25 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV7-6 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 20 ncactctgac gatccagcgc acag 24 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV7-7 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 21 nccactctga cgattcagcg cacag 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV7-8 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 22 nccactctga agatccagcg cacac 25 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV7-9 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 23 ncaccttgga gatccagcgc acag 24 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV9 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 24 ngcactctga actaaacctg agctctctg 29 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> 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Synthetic DNA: TRBV11-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 29 nctccactct caagatccag cctgcaa 27 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV(12-3, 12-4, 12-5) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 30 nccactctga agatccagcc ctcag 25 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV13 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 31 ncattctgaa ctgaacatga gctccttgg 29 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV14 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 32 nctactctga aggtgcagcc tgcag 25 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: 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(1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 37 ncctctcact gtgacatcgg ccc 23 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV20-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 38 ncttgtccac tctgacagtg accagtg 27 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV23-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 39 ncagcctggc aatcctgtcc tcag 24 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV24-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 40 nctccctgtc cctagagtct gccat 25 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV25-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 41 nccctgaccc tggagtctgc ca 22 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV27 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 42 nccctgatcc tggagtcgcc ca 22 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV28 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 43 nctccctgat tctggagtcc gcca 24 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV29-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 44 nctaacattc tcaactctga ctgtgagcaa ca 32 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV30 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal forward primer <400> 45 ncggcagttc atcctgagtt ctaagaagc 29 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBJ1-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal reverse primer <400> 46 nttacctaca actgtgagtc tggtgccttg tccaaa 36 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBJ1-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal reverse primer <400> 47 nacctacaac ggttaacctg gtccccgaac cgaa 34 <210> 48 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBJ1-3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal reverse primer <400> 48 nacctacaac agtgagccaa cttccctctc caaa 34 <210> 49 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBJ1-4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal reverse primer <400> 49 nccaagacag agagctgggt tccactgcca aa 32 <210> 50 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBJ1-6 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal reverse primer <400> 50 nctgtcacag tgagcctggt cccgttccca aa 32 <210> 51 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBJ2-1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal reverse primer <400> 51 ncggtgagcc gtgtccctgg cccgaa 26 <210> 52 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBJ2-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal reverse primer <400> 52 nccagtacgg tcagcctaga gccttctcca aa 32 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBJ2-3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal reverse primer <400> 53 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<211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV2 <400> 58 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atcttcaaat ttcactctga agatccggtc 60 cacaa 65 <210> 59 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV3-1 <400> 59 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctgctcac ttaaatcttc acatcaattc 60 cctgg 65 <210> 60 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV4-1 <400> 60 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctcttaaa ccttcaccta cacgccctgc 60 <210> 61 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV(4-2, 4-3) <400> 61 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctcttatt ccttcaccta cacaccctgc 60 <210> 62 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV5-1 <400> 62 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctgctctg agatgaatgt gagcaccttg 60 <210> 63 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV5-3 <400> 63 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctgctctg 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296 <210> 413 <211> 296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: IGHV3-25*02 <400> 413 gagatgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggcaaagc ctgcgtggtc cccgagactc 60 tcctgtgcag cctctcaatt caccttcagt agctactaca tgaactgtgt ccgccaggct 120 ccagggaatg ggctggagtt ggtttgacaa gttaatccta atgggggtag cacatacctc 180 atagactccg gtaaggaccg attcaatacc tccagagata acgccaagaa cacacttcat 240 ctgcaaatga acagcctgaa aaccgaggac acggccctct attagtgtac cagaga 296 <210> 414 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: IGHV3-25*03 <400> 414 gagatgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggcaaagc ctgcgtggtc cccgagactc 60 tcctgtgcag cctctcaatt caccttcagt agctactaca tgaactgtgt ccgccaggct 120 ccagggaatg ggctggagtt ggttggacaa gttaatccta atgggggtag cacatacctc 180 atagactccg gtaaggaccg attcaatacc tccagagata acgccaagaa cacacttcat 240 ctgcaaatga acagcctgaa aaccgaggac acggccctgt attagtgtac caga 294 <210> 415 <211> 298 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: IGHV3-63*01 <400> 415 gaggtggagc tgatagagtc catagagggc ctgagacaac ttgggaagtt cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt caccttcagt agctactgaa tgagctgggt caatgagact 120 ctagggaagg ggctggaggg agtaatagat gtaaaatatg atggaagtca gatataccat 180 gcagactctg tgaagggcag attcaccatc tccaaagaca atgctaagaa ctcaccgtat 240 ctccaaacga acagtctgag agctgaggac atgaccatgc atggctgtac ataaggtt 298 <210> 416 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: IGHV3-63*02 <400> 416 gaggtggagc tgatagagtc catagagggc ctgagacaac ttgggaagtt cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt caccttcagt agctactgaa tgagctgggt caatgagact 120 ctagggaagg ggctggaggg agtaatagat gtaaaatatg atggaagtca gatataccat 180 gcagactctg tgaagggcag attcaccatc tccaaagaca atgctaagaa ctcaccgtat 240 ctgcaaacga acagtctgag agctgaggac atgaccatgc atggctgtac ataa 294 <210> 417 <211> 298 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: IGHV3-32*01 <400> 417 gaggtggagc tgatagagtc catagaggac ctgagacaac ctgggaagtt cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctagatt cgccttcagt agcttctgaa tgagccgagt tcaccagtct 120 ccaggcaagg ggctggagtg agtaatagat ataaaagatg atggaagtca gatacaccat 180 gcagactctg tgaagggcag attctccatc tccaaagaca atgctaagaa ctctctgtat 240 ctgcaaatga acactcagag agctgaggac gtggccgtgt atggctatac ataaggtc 298 <210> 418 <211> 296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: IGHV3-54*01 <400> 418 gaggtacagc tggtggagtc tgaagaaaac caaagacaac ttgggggatc cctgagactc 60 tcctgtgcag actctggatt aaccttcagt agctactgaa tgagctcaga ttcccaagct 120 ccagggaagg ggctggagtg agtagtagat atatagtagg atagaagtca gctatgttat 180 gcacaatctg tgaagagcag attcaccatc tccaaagaaa atgccaagaa ctcactctgt 240 ttgcaaatga acagtctgag agcagagggc acggccgtgt attactgtat gtgagy 296 <210> 419 <211> 296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: IGHV3-54*04 <400> 419 gaggtacagc tggtggagtc tgaagaaaac caaagacaac ttgggggatc cctgagactc 60 tcctgtgcag actctggatt aaccttcagt agctactgaa tgagctcaga ttcccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg agtagtagat atatagtagg atagaagtca gctatgttat 180 gcacaatctg tgaagagcag attcaccatc tccaaagaaa atgccaagaa ctcactctgt 240 ttgcaaatga acagtctgag agcagagggc acggccgtgt attactgtat gtgagt 296 <210> 420 <211> 207 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: IGHV3-54*02 <400> 420 tagctactga atgagctcag attcccaggc tccagggaag gggctggagt gagtagtaga 60 tatatagtac gatagaagtc agatatgtta tgcacaatct gtgaagagca gattcaccat 120 ctccaaagaa aatgccaaga actcactccg tttgcaaatg aacagtctga gagcagaggg 180 cacggccgtg tattactgta tgtgagg 207 <210> 421 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ4_1 <400> 421 tgaggagacg gtgaccaggg ttccttggcc c 31 <210> 422 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ4_3 <400> 422 tgaggagacg gtgaccaggg tcccttggcc c 31 <210> 423 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ4_2 <400> 423 tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc c 31 <210> 424 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ3_12 <400> 424 ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc cc 32 <210> 425 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ6_1 <400> 425 ctgaggagac ggtgaccgtg gtcccttgcc cc 32 <210> 426 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ6_2 <400> 426 tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc c 31 <210> 427 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ6_34 <400> 427 ctgaggagac ggtgaccgtg gtccctttgc cc 32 <210> 428 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ2_1 <400> 428 ctgaggagac agtgaccagg gtgccacggc cc 32 <210> 429 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ5_1 <400> 429 ctgaggagac ggtgaccagg gttccttggc cc 32 <210> 430 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ5_2 <400> 430 ctgaggagac ggtgaccagg gttccctggc cc 32 <210> 431 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ1_1 <400> 431 ctgaggagac ggtgaccagg gtgccctggc cc 32 <210> 432 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJSEQ4_1 <400> 432 tgaggagacg gtgaccaggg ttccttggcc ccag 34 <210> 433 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJSEQ4_3 <400> 433 tgaggagacg gtgaccaggg tcccttggcc ccag 34 <210> 434 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJSEQ4_2 <400> 434 tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc ccag 34 <210> 435 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJSEQ3_12 <400> 435 ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc cccag 35 <210> 436 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJSEQ6_1 <400> 436 ctgaggagac ggtgaccgtg gtcccttgcc cccag 35 <210> 437 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJSEQ6_2 <400> 437 tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34 <210> 438 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJSEQ6_34 <400> 438 ctgaggagac ggtgaccgtg gtccctttgc cccag 35 <210> 439 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJSEQ2_1 <400> 439 ctgaggagac agtgaccagg gtgccacggc cccag 35 <210> 440 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJSEQ5_1 <400> 440 ctgaggagac ggtgaccagg gttccttggc cccag 35 <210> 441 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJSEQ5_2 <400> 441 ctgaggagac ggtgaccagg gttccctggc cccag 35 <210> 442 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJSEQ1_1 <400> 442 ctgaggagac ggtgaccagg gtgccctggc cccag 35 <210> 443 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHV1 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 443 tgggtgcacc aggtccangn acaagggctt gagtgg 36 <210> 444 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHV2 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 444 tgggtgcgac aggctcgngn acaacgcctt gagtgg 36 <210> 445 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHV3 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 445 tgggtgcgcc agatgccngn gaaaggcctg gagtgg 36 <210> 446 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHV4 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 446 tgggtccgcc agscyccngn gaaggggctg gagtgg 36 <210> 447 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHV5 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 447 tgggtccgcc aggctccngn aaaggggctg gagtgg 36 <210> 448 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHV6 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 448 tgggtctgcc aggctccngn gaaggggcag gagtgg 36 <210> 449 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGH7_3.25p <400> 449 tgtgtccgcc aggctccagg gaatgggctg gagttgg 37 <210> 450 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGH8_3.54p <400> 450 tcagattccc aagctccagg gaaggggctg gagtgag 37 <210> 451 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGH9_3.63p <400> 451 tgggtcaatg agactctagg gaaggggctg gagggag 37 <210> 452 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ4*01/1-48 <400> 452 actactttga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 48 <210> 453 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ4*03/1-48 <400> 453 gctactttga ctactggggc caagggaccc tggtcaccgt ctcctcag 48 <210> 454 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ4*02/1-48 <400> 454 actactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 48 <210> 455 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ3*01/1-50 <400> 455 tgatgctttt gatgtctggg gccaagggac aatggtcacc gtctcttcag 50 <210> 456 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ3*02/1-50 <400> 456 tgatgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc gtctcttcag 50 <210> 457 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ6*01/1-63 <400> 457 attactacta ctactacggt atggacgtct gggggcaagg gaccacggtc accgtctcct 60 cag 63 <210> 458 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ6*02/1-62 <400> 458 attactacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct 60 cag 63 <210> 459 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ6*04/1-63 <400> 459 attactacta ctactacggt atggacgtct ggggcaaagg gaccacggtc accgtctcct 60 cag 63 <210> 460 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ6*03/1-62 <400> 460 attactacta ctactactac atggacgtct ggggcaaagg gaccacggtc accgtctcct 60 cag 63 <210> 461 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ2*01/1-53 <400> 461 ctactggtac ttcgatctct ggggccgtgg caccctggtc actgtctcct cag 53 <210> 462 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ5*01/1-51 <400> 462 acaactggtt cgactcctgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcctca g 51 <210> 463 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ5*02/1-51 <400> 463 acaactggtt cgacccctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca g 51 <210> 464 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ1*01/1-52 <400> 464 gctgaatact tccagcactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc ag 52 <210> 465 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ2P*01/1-61 <400> 465 ctacaagtgc ttggagcact ggggcagggc agcccggaca ccgtctccct gggaacgtca 60 g 61 <210> 466 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ1P*01/1-54 <400> 466 aaaggtgctg ggggtcccct gaacccgacc cgccctgaga ccgcagccac atca 54 <210> 467 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: >IGHJ3P*01/1-52 <400> 467 cttgcggttg gacttcccag ccgacagtgg tggtctggct tctgaggggt ca 52 <210> 468 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBJ1-2 <400> 468 aatgatacgg cgaccaccga gatctaccta caacggttaa cctggtcccc gaaccgaa 58 <210> 469 <211> 284 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBV2*02 <400> 469 gaacctgaag tcacccagac tcccagccat caggtcacac agatgggaca ggaagtgatc 60 ttgcactgtg tccccatctc taatcactta tacttctatt ggtacagaca aatcttgggg 120 cagaaagtcg agtttctggt ttccttttat aataatgaaa tctcagagaa gtctgaaata 180 ttcgatgatc aattctcagt tgaaaggcct gatggatcaa atttcactct gaagatccgg 240 tccacaaagc tggaggactc agccatgtac ttctgtgcca gcag 284 <210> 470 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 1-1 <400> 470 acaactgtga gtctggtgcc ttgtccaaag aaa 33 <210> 471 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 1-2 <400> 471 acaacggtta acctggtccc cgaaccgaag gtg 33 <210> 472 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 1-3 <400> 472 acaacagtga gccaacttcc ctctccaaaa tat 33 <210> 473 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 1-4 <400> 473 aagacagaga gctgggttcc actgccaaaa aac 33 <210> 474 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 1-5 <400> 474 aggatggaga gtcgagtccc atcaccaaaa tgc 33 <210> 475 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 1-6 <400> 475 gtcacagtga gcctggtccc gttcccaaag tgg 33 <210> 476 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 2-1 <400> 476 agcacggtga gccgtgtccc tggcccgaag aac 33 <210> 477 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 2-2 <400> 477 agtacggtca gcctagagcc ttctccaaaa aac 33 <210> 478 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 2-3 <400> 478 agcactgtca gccgggtgcc tgggccaaaa tac 33 <210> 479 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 2-4 <400> 479 agcactgaga gccgggtccc ggcgccgaag tac 33 <210> 480 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 2-5 <400> 480 agcaccagga gccgcgtgcc tggcccgaag tac 33 <210> 481 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 2-6 <400> 481 agcacggtca gcctgctgcc ggccccgaaa gtc 33 <210> 482 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: Jseq 2-7 <400> 482 gtgaccgtga gcctggtgcc cggcccgaag tac 33 <210> 483 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBJ1-5 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t; 5 end modified with universal reverse primer <400> 483 nacctaggat ggagagtcga gtcccatcac caaa 34 <210> 484 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA: TRBJ1-5 <400> 484 aatgatacgg cgaccaccga gatctaccta ggatggagag tcgagtccca tcaccaaa 58

Claims (45)

  1. (a) 단일 작용성 V 세그먼트 또는 V 세그먼트의 소부류에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 V-세그먼트 프라이머 및
    (b) J 세그먼트에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 J-세그먼트 프라이머를 포함하는 조성물로서,
    상기 V 세그먼트 및 J-세그먼트 프라이머는 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 TCR 또는 IG CDR3 영역을 증폭시켜 TCR 또는 IG 유전자의 다양성을 정량화하기에 충분한 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 V-세그먼트 프라이머가 단일 Vγ 세그먼트 또는 유사한 Vγ 세그먼트 부류에 상보성인 서열을 포함하고, 각각의 J 세그먼트 프라이머가 Jγ 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하며, V 세그먼트 및 J-세그먼트 프라이머는 TCRγ CDR3 영역을 증폭시키는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 각각의 V-세그먼트 프라이머가 단일 Vδ 세그먼트 또는 유사한 Vδ 세그먼트 부류에 상보성인 서열을 포함하고, 각각의 J 세그먼트 프라이머가 Jδ 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하며, V 세그먼트 및 J-세그먼트 프라이머는 TCRδ CDR3 영역을 증폭시키는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 각각의 V-세그먼트 프라이머가 단일 Vα 세그먼트 또는 유사한 Vα 세그먼트 부류에 상보성인 서열을 포함하고, 각각의 J 세그먼트 프라이머가 Jα 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하며, V 세그먼트 및 J-세그먼트 프라이머는 TCRα CDR3 영역을 증폭시키는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 각각의 V-세그먼트 프라이머가 단일 Vβ 세그먼트 또는 유사한 Vβ 세그먼트 부류에 상보성인 서열을 포함하고, 각각의 J 세그먼트 프라이머가 Jβ 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하며, V 세그먼트 및 J-세그먼트 프라이머는 TCRβ CDR3 영역을 증폭시키는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, V 세그먼트가 유사한 어닐링 강도를 갖는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 모든 J 세그먼트 프라이머가 동일한 보존된 프레임워크 영역 모티프에 어닐링되는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 증폭된 DNA 분자가 상기 보존된 모티프로부터 출발하고 J 세그먼트를 진단학적으로 동정하며 V 세그먼트로의 결합을 포함하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 증폭된 DNA 분자 내의 영역에 하이브리드화하는 서열분석 올리고뉴클레오타이드 세트를 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 증폭된 DNA가 V-D-J 결합을 확장하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 V-세그먼트 또는 J-세그먼트가, 밀접하게 관련된 서열의 병합에 의해 서열 에러-보정을 함유하도록 선택되는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, mRNA로부터 cDNA를 생성하기 위한 범용 C 세그먼트 프라이머를 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제5항에 있어서, 상기 V 세그먼트 프라이머가 재조합 시그날 서열(RSS)에 대해 Vβ 내의 위치 -43에 고정되어 있는 조성물.
  14. 제5항에 있어서, 상기 다수의 V 세그먼트 프라이머가 14개의 상이한 Vβ 유전자에 특이적인 적어도 14개 프라이머로 이루어진 조성물.
  15. 제5항에 있어서, 상기 V 세그먼트 프라이머가 서열번호: 1 내지 45로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 갖는 조성물.
  16. 제5항에 있어서, 상기 V 세그먼트 프라이머가 서열번호: 58 내지 102로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 갖는 조성물.
  17. 제5항에 있어서, 각각의 Vβ 세그먼트 또는 Vβ 세그먼트 부류에 대한 V 세그먼트 프라이머가 존재하는 조성물.
  18. 제5항에 있어서, 상기 프라이머가 인트론/엑손 경계를 교차하지 않는 조성물.
  19. 제5항에 있어서, 상기 J 세그먼트 프라이머가 Jβ 세그먼트의 보존된 요소와 하이브리화하고, 유사한 어닐링 강도를 갖는 조성물.
  20. 제5항에 있어서, 상기 다수의 J 세그먼트 프라이머가 5개의 상이한 Jβ 유전자에 특이적인 적어도 5개의 프라이머로 이루어진 조성물.
  21. 제5항에 있어서, 상기 J 세그먼트 프라이머가 서열번호: 46 내지 57 및 483으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 갖는 조성물.
  22. 제5항에 있어서, 상기 J 세그먼트 프라이머가 서열번호: 103 내지 113, 468 및 484으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 갖는 조성물.
  23. 제5항에 있어서, 각각의 Jβ 세그먼트에 대한 J 세그먼트 프라이머가 존재하는 조성물.
  24. 제5항에 있어서, 상기 증폭된 Jβ 유전자 세그먼트가 RSS 부위 하류의 위치 +11 내지 +14에 유니크(unique)한 4개 염기 태그를 갖는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 서열분석 올리고뉴클레오티드가 RSS 부위 하류의 위치 +11 내지 +14에서 증폭된 Jβ 유전자 세그먼트 내에 4개 염기 태그에 인접하여 하이브리드화하는 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 서열분석 올리고뉴클레오티드가 서열번호: 470 내지 482로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  27. (a) 단일 작용성 V 세그먼트 또는 V 세그먼트의 소부류에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 V 세그먼트 프라이머 및
    (b) J 세그먼트에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 J 세그먼트 프라이머를 포함하는 조성물로서,
    상기 V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머는 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 항체 중쇄(IGH) VH 영역을 증폭시켜 항체 중쇄 유전자의 다양성을 정량화하기에 충분한 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는, 조성물.
  28. (a) 단일 작용성 V 세그먼트 또는 V 세그먼트의 소부류에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 V 세그먼트 프라이머 및
    (b) J 세그먼트에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 J 세그먼트 프라이머를 포함하는 조성물로서,
    상기 V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머는 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 항체 경쇄(IGL) VL 영역을 증폭시켜 항체 경쇄 유전자의 다양성을 정량화하기에 충분한 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는, 조성물.
  29. (a) 단일 작용성 V 세그먼트 또는 V 세그먼트의 소부류에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 V 세그먼트 프라이머를 선택하는 단계;
    (b) J 세그먼트에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 J 세그먼트 프라이머를 선택하는 단계; 및
    (c) V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머를 게놈 DNA 샘플과 조합하여 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 TCR CDR3 영역을 증폭시킴으로써 TCR 유전자의 다양성을 정량화하기에 충분한 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 각각의 V 세그먼트 프라이머가 단일 Vβ 세그먼트 또는 Vβ 세그먼트 부류에 상보성인 서열을 포함하고, 각각의 J 세그먼트 프라이머가 Jβ 세그먼트에 상보성인 서열을 포함하며, V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머와 게놈 DNA 샘플과의 조합이 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 TCRB CDR3 영역을 증폭시켜 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 증폭된 DNA 분자를 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 서열분석 단계가, 증폭된 DNA 분자 내의 소정 영역과 하이브리드화하는 서열분석 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 증폭된 DNA 분자 중에서 TCRβ CDR3 서열의 전체 다양성을 계산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 방법은 정상 사람 피검체의 전체 다양성이 1*106개 초과의 서열임을 나타내는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 방법은 정상 사람 피검체의 전체 다양성이 2×106개 초과의 서열임을 나타내는 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 방법은 정상 사람 피검체의 전체 다양성이 3×106개 초과의 서열임을 나타내는 방법.
  37. 환자의 TCR CDR3 서열의 다양성을 측정하는 단계; 및
    피검체의 다양성을 정상 피검체로부터 수득한 다양성과 비교하는 단계를 포함하는,
    사람 환자에서 면역결핍을 진단하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, TCR 서열의 다양성을 측정하는 단계가
    (a) 단일 작용성 V 세그먼트 또는 V 세그먼트의 소부류에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 V 세그먼트 프라이머를 선택하는 단계;
    (b) J 세그먼트에 상보성인 서열을 각각 포함하는 다수의 J 세그먼트 프라이머를 선택하는 단계;
    (c) V 세그먼트 및 J 세그먼트 프라이머를 게놈 DNA 샘플과 조합하여 다중 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 TCR CDR3 영역을 증폭시킴으로써 다수의 증폭된 DNA 분자를 생성하는 단계;
    (d) 증폭된 DNA 분자를 서열분석하는 단계; 및
    (e) 증폭된 DNA 분자 중에서 TCR CDR3 서열의 전체 다양성을 계산하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 다양성의 비교는 하기 수학식을 사용하여 계산함으로써 측정하는 방법.
    Figure pct00011

    상기 수학식에서,
    G(λ)는 파라미터 λ1, ···, λs의 경험적 분포 함수이고,
    nx는 정확하게 x배 서열분석된 클론형의 수이고,
    Figure pct00012
    이다.
  40. 제38항에 있어서, 게놈 DNA의 적어도 2개 샘플의 다양성이 비교되는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 게놈 DNA의 하나의 샘플이 환자의 것이고 다른 샘플이 정상 피검체의 것인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 게놈 DNA의 하나의 샘플이 치료학적 치료 전의 환자의 것이고 다른 샘플이 치료 후의 환자의 것인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 게놈 DNA의 2개 샘플이 치료 동안 상이한 시간에서의 동일한 환자의 것인 방법.
  44. 제40항에 있어서, 질환이 게놈 DNA의 샘플 중에서 다양성의 비교에 기초하여 진단되는 방법.
  45. 제40항에 있어서, 사람 환자의 면역경쟁이 비교에 의해 평가되는 방법.
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