KR100227303B1 - 인체 t 임파구 수용체의 베타 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 대응하는 펩티드 세그먼트 및 진단 및 치료 용도 - Google Patents

인체 t 임파구 수용체의 베타 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 대응하는 펩티드 세그먼트 및 진단 및 치료 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인체 T 임파구 수용체의 β 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 신규의 뉴클레오티드 서열, 대응하는 펩티드 세그먼트 및 그의 지단 및 치료 용도에 관한 것이다.

Description

인체 T 임파구 수용체의 β 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 대응하는 펩티드 세그먼트 및 진단 및 치료 용도
본 발명은 T-세포 수용체의 β 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 신규의 뉴클레오티드 서열, 대응하는 펩티드 세그먼트 및 그의 진단 및 치료 용도에 관한 것이다.
성숙 T 임파구 표면에서 항원을 인지하는 수용체(이하, T-세포 수용체로 표기함)는 면역 글로빈의 구조와 일정한 유사성이 있는 구조를 갖는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이들은 α 및 β 당단백질 사슬 또는 γ 및 δ 당단백질 사슬을 함유하는 헤테로다이머 구조를 함유한다(뮤이에(Meuer) 등의 참고 문헌(1), 므왱언(Moingeon) 등의 참고 문헌(2), 브렌너(Brenner) 등의 참고 문헌(3), 뱅크(Bank) 등의 참고 문헌(4) 참조).
T-세포 수용체의 디렉토리(directory)는 매우 다양한 항원 결정소를 지정할 수 있어야 한다. 이는 T-세포 수용체의 상이한 구조 영역을 코딩하는 유전자의 상이한 불연속 세그먼트의 유전적 재조합에 의해 얻어진다. 따라서, 이 유전자는 V 세그먼트(가변성 세그먼트), 임의로 D 세그먼트(다양성 세그먼트), J 세그먼트(결합 세그먼트) 및 C 세그먼트(정상(定常) 세그먼트)를 함유한다. T-세포가 분화하는 동안, 특정 유전자는 β 및 δ좌(座)에 대해서는 V, D 및 J 세그먼트의 재조합 및 α 및 β좌에 대해서는 V 및 J 세그먼트의 재조합에 의해 형성된다. 이 특정 조합 뿐만 아니라 두 사슬의 짝짓기는 조합적 다양성을 형성한다. 이 다양성은 두개의 보충 메카니즘 즉, V-D-J 또는 V-J 세그먼트의 부정확한 재조합 및 N 영역에 대응하는 뉴클레오티드의 추가에 의해 고도로 증폭된다 (데이비스(Davis) 등의 참고 문헌(5)).
일정한 수의 유전적 V 세그먼트는 이미 공지되어 있다. 이 세그먼트는 서열의 유사성의 함수로서 아군으로 분류해왔다. 정의하자면, 뉴클레오티드 서열에서 유사성이 75 %를 초과하는 세그먼트는 동일 아군의 원으로 고려해왔다(크루(Crew) 등의 참고 문헌(6)). 현재는, 약 60개의 개별적인 Vβ 유전자 세그먼트가 공지되어 있고(윌슨(Wilson) 등의 참고 문헌(7), 로빈슨(Robinson)의 참고 문헌(8), 레이더(Leider) 등의 참고 문헌(9), 레이놀드(Reynolds)의 참고 문헌(10), 리(Li) 등의 참고 문헌(11) 참조), 이들은 20개의 아군으로 분류되어 있고, 이들 중 7개의 아군은 1개의 원만을 가진다(상기 윌슨 등의 참고 문헌 참조).
게다가, 최근에는, T-세포 수용체의 가변성 부분 특히, β 또는 δ 사슬의 특정 세그먼트에 대한 단일 클론 항체가 국제 공개 제90/06758호에 기재되었다. 이 단일 클론 항체는 진단 도구로서 뿐만 아니라 치료 도구로서 예를 들면 류마티스성 관절염에 대하여 유용하다.
자기 면역 질병 치료시 α또는 β 사슬의 가변성 영역에 대응하는 합성 펩티드의 용도도 또한 기재되어 있다(참고 문헌(27) 및 (28) 참조).
인체 T-세포 수용체의 상이한 가변성 세그먼트의 발현시에 한 개체에서 다른 것으로의 변이가 존재한다는 점도 공지되어 있다(참고 문헌(27) 및 (28) 참조).
본 발명은 신규 아군에 속하거나 또는 적어도 1개의 원이 이미 공지되어 있는 아군에 속하는 신규 Vβ 유전자 세그먼트를 제공함으로써 T-세포 수용체의 β 사슬의 변성 영역을 코딩하는 유전자 세그먼트의 디렉토리를 풍요롭게 하는 것을 목적으로 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열 동정 번호 2 내지 19의 서열 중의 하나에 대응하는 Vβ 세그먼트 중의 어느 하나 및 그중 1개 이상의 뉴클레오티드가 상이한 서열로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA에 대응하는, 인체 T 임파구 수용체의 β 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
더 구체적으로, 본 발명의 목적은 서열 동정 번호 2 내지 5의 서열 중의 하나에 대응하는 Vβ 세그먼트 중의 어느 하나 및 그중 1개 이상의 뉴클레오티드가 상이한 서열로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 함유한 cDNA에 대응하는, 인체 T 임파구 수용체의 β 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 서열이다.
"그중 1개 이상의 뉴클레오티드가 상이한 서열"이라는 표현은 8개 이하의 뉴클레오티드가 상이하지만 흔히는 1 또는 2개의 뉴클레오티드가 상이하거나, 또는 1 또는 2개의 코돈의 삭제 또는 추가에 의해 상이할 수 있는 대립 유전자를 포함한다.
또한, 본 발명의 더 구체적인 목적은
- 서열 동정 번호 2 내지 5의 서열 중의 하나에 대응하는 Vβ 세그먼트 중의 어느 하나 및 그중 1 또는 2개의 뉴클레오티드가 상이한 서열로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 대응하는 cDNA에 대응하는, 인체 T 임파구 수용체의 β 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
- 서열 동정 번호 6 내지 15의 서열 중의 하나에 대응하는 Vβ 세그먼트 중의 어느 하나 및 그중 1 또는 2개의 뉴클레오티드가 상이한 서열 및 이의 단편 특히, 서열 동정 번호 8의 1 내지 155, 서열 동정 번호 9의 1 내지 125, 서열 동정 번호 10의 1 내지 111의 서열 중의 하나에 대응하는 Vβ 세그먼트 중의 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 대응하는 서열의 단편으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 중의 하나에 대응하는 cDNA에 대응하는, 인체 T 임파구 수용체의 β 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
- 서열 동정 번호 16의 1 내지 195, 서열 동정 번호 17의 1 내지 99, 서열 동정 번호 18의 1 내지 113, 서열 동정 번호 19의 1 내지 186의 서열 중의 하나에 대응하는 Vβ 세그먼트 중의 어느 하나 및 그중 1 또는 2개의 뉴클레오티드가 상이한 서열로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 대응하는 cDNA에 대응하는, 인체 T 임파구 수용체의 β 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
"뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 대응하는 cDNA에 대응하는 뉴클레오티드 서열"이라는 표현은 상기 완전한 서열 뿐만 아니라 탐침(일반적으로 적어도 10개의 뉴클레오티드를 함유함)으로서 또는 프라이머(일반적으로 적어도 15개의 뉴클레오티드를 함유함)로서 사용될 수 있는 짧은 단편을 포함하는 상기 완전한 서열의 단편을 나타낸다. 일반적인 면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 Vβ 서열의 단편인 신규 올리고뉴클레오티드 군을 포함한다.
1 또는 2개의 뉴클레오티드가 상이한 서열에 관해서 말하자면, 이들은 수개의 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 실험적으로 결정할 때 관찰되는 변이에 대응한다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 동일한 기능을 갖는 대립 유전자 및 그의 유도체에 의해 코딩되는 펩티드이다.
일반적인 면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 펩티드 서열로 구성되거나 또는 이루어지는 펩티드 뿐만 아니라 이들 펩티드의 단편을 포함한다. 또한, 1개 이상의 아미노산이 상이하지만 동일 기능을 갖는 펩티드를 포함한다. 이 펩티드는 변이 단백질을 사용한 공지된 것과 같은 변형에 대응하거나 또는 대립 유전자 변이에 대응할 수 있다. 사실상, 인체 T 수용체의 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 특정 유전자 세그먼트는 대립 유전자 변이라고 불리는 유전적 다형성(多型性) 현상에 종속하는 것으로 나타나있다(참고 문헌(29) 참조). 본 발명은 이 현상으로부터 얻어지는 펩티드를 포함한다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 다음 단계에 의해 얻었다 :
- 한 개인의 조직 임파구의 RNA를 단리하는 단계;
- 역전사효소 및 Cβ 영역 특이성 프라이머 A(서열 동정 번호 20)을 사용하여 상보성 DNA를 얻는 단계;
- DNA 폴리머라제, 폴리 C 프라이머(서열 동정 번호 21) 및 Cβ 영역 특이성 프라이머 B(서열 동정 번호 22)를 사용하여 유전자 증폭(앵커화(Anchored) 복제 연쇄 반응 또는 A-PCR에 의함)을 시키는 단계;
- DNA 폴리머라제 및 Cβ 영역 특이성 프라이머 C(서열 동정 번호 23)을 사용하여 A-PCR에 의해 새로이 증폭시키는 단계;
- 플라스미드 벡터 중에 삽입시키는 단계;
- 재조합 벡터를 이용하여 박테리아 숙주를 형질 전환시키는 단계;
- Cβ에 특이성인 표지된 올리고뉴클레오티드 D(서열 동정 번호 24)를 이용하여 재조합 박테리아 콜로니를 선별하는 단계;
- 양성 콜로니로부터 플라스미드를 추출시키는 단계; 및
- Cβ 영역을 함유한 DNA 단편을 서열화하는 단계.
본 발명은 본 발명의 서열 동정 번호 2 내지 19의 서열에 대응하는 가변성 또는 결합 β 세그먼트를 포함하는 mRNA를 발현하는 조직 임파구로부터 출발함으로써 이특이성 유전자 증폭 (복제 연쇄 반응 또는 PCR)에 의하거나 또는 다른 한편 무작위로 취한 한 개인의 체세포의 게놈 DNA에 이 PCR 기술을 적용함으로써 재생될 수 있다. 또한, 본 발명은 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성에 의해 상기 유전자 서열을 제조함으로써 재생할 수도 있다.
본 발명에 따른 펩티드는 표준 펩티드 합성법에 의해 얻을 수 있다. 또한, 이들은 본 발명에 따른 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 플라스미드와 같은 발현 벡터에 삽입하는 것 및 이 발현 벡터를 이용하여 세포를 형질 전환시키는 것을 포함하는 공지의 유전자 공학 기술을 적용하여 얻을 수도 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 및 발현 벡터 뿐만 아니라 이 벡터로 형질전환된 숙주이다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 펩티드에 속하거나 또는 그 펩티드로 이루어진 항원 결정소에 대한 항체 및 특히, 단일 클론 항체이다.
단일 클론 항체는 세포 주 배양물로부터의 항체 분자 생산을 허용하는 기술 중의 어느 하나에 의해 얻을 수 있다. 이 기술은 하이브리도마를 사용하는 상이한 기술을 포함한다.
항체는 본 발명에 따른 천연, 재조합 또는 합성 펩티드 또는 단편을 임의로 파상풍 아나톡신과 같은 면역원에 커플링시킨 후 동물에 주사하거나, 또는 대응하는 코딩 서열로 트랜스펙션시킨 재조합 세포를 포함하여 표면에서 대응하는 서열을 발현하는 인체 T 임파구를 주사함으로써 동물을 면역화시켜 생산될 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대한 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마이다.
또한, 본 발명은 T-세포 수용체의 한정된 가변성 영역과 반응성인 본 발명에 따른 단일 클론 항체의 단편 및 유도체를 포함한다. 특히, 이들 단편은 펩신을 사용한 항체 분자의 효소적 절단에 의해 얻을 수 있는 F(ab')2단편, F(ab')2단편의 디설파이드 결합의 환원에 의해 얻을 수 있는 Fab' 단편 및 환원제 존재하에 파파인을 사용한 항체 분자의 효소적 절단에 의해 얻을 수 있는 Fab 단편이다. 또한, 이들 단편은 유전자 광학에 의해 얻을 수도 있다.
예를 들면, 단일 클론 항체 유도체는 방사성 동위 원소와 같은 표지자가 결합된 항체 또는 이들 항체의 단편이다. 또한, 단일 클론 항체 유도체는 치료 활성 분자, 특히 세포 독성 화합물이 결합된 항체 또는 이들 항체의 단편이다.
본 발명의 생성물은 진단 분야 및 치료 분야에서 몇가지 용도를 갖는다.
[1. 진단 분야에서의 용도]
본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열에 함유된 올리고뉴클레오티드 β 사슬의 가변성 영역과 하이브리드화할 수 있는 검출 탐침(일반적으로 적어도 10개의 뉴클레오티드 함유함) 또는 증폭시킬 서열에 결합될 수 있는 DNA 증폭용 프라이머(일반적으로 적어도 15개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 17개의 뉴클레오티드를 함유함)를 구성하는데 사용할 수 있다.
따라서, 이 올리고뉴클레오티드는 한 환자로부터 얻은 샘플의 mRNA 중의 T-세포 수용체의 β 사슬의 가변성 영역을 코딩하는 유전자와 상동인 핵산 서열의 존재를 검출함으로써 면역 장애 진단에 사용할 수 있다. T-세포 유전자의 발현과 질병 사이의 관련성을 확립하기 위해 다른 방법들을 사용할 수 있다. 이들 방법은
a- 우성 유전자의 빈도를 결정하기 위한, 질병과 관련한 T-세포로부터 얻은 cDNA 발현 라이브러리의 생성 및 분석;
b- T-세포 수용체를 코딩하는 유전자의 유전적 다형성 또는 전위의 존재 여부를 결정하기 위한 게놈 DNA 샘플의 서던 블로트(Southern blot) 분석;
c- cDNA 획득, PCR에 의한 증폭 및 표지된 탐침과의 하이브리드화에 의한 샘플 분석;
d- T-세포를 미리 배양하지 않은 상태에서의 T-세포의 자체 하이브리드화를 포함한다.
프라이머는 상기 c에 정의된 바와 같은 방법으로 PCR 반응에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 단일 클론 항체, 이들 항체의 단편 또는 유도체는 예를 들면, 암종학의 자기 면역 질환, 알레르기, 이식 및 전염성 질환 분야에서 T-형 면역 반응을 연구하는데 사용될 수 있다. 특히, T 수용체의 상이한 가변성 β 세그먼트의 디렉토리는 그것이 혈액 또는 조직 T-세포이든 간에 연구될 수 있다. 일반적인 면에서, 사용되는 기술은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다.
시험관내 방법의 경우, 사용되는 샘플은 체액 샘플 또는 조직 샘플일 수 있다. 사용되는 기술은 특히 혈액 T 임파구를 분석하기 위한 유동 세포형광 정량법 또는 조직을 인필트레이션(infiltration)한 임파구를 연구하기 위한 이뮤노퍼옥시다제에 의한 해부병리학적 절편 상의 표지법을 포함할 수 있다.
생체내 방법의 경우, 항체, 그의 단편 또는 유도체를 통상의 경로 예를 들면 정맥내로 투여하고, 면역특이성 결합을 검출한다. 이것은 예를 들면 방사성 동위원소로 표지된 항체를 사용하는 경우에 얻을 수 있다.
[2. 치료 분야에서의 용도]
본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열중에 함유된 올리고뉴클레오티드를 치료학에서는 안티 센스(anti sense) 올리고뉴클레오티드로서 사용할 수 있다. 사실상, 시험관내에서는 문제의 유전자에 특이성인 안티 센스 올리고뉴클레오티드와 함께 인체 임파구를 인큐베이션시킴으로써 이들 임파구에서 전사 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다는 점이 공지되어 있다(참고 문헌(30)). 이 안티 센스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 16개의 뉴클레오티드를 함유한다. 특히, 이들 안티 센스 올리고뉴클레오티드는 번역 개시 부위(ATG)로부터 출발하여 위쪽의 20개의 뉴클레오티드에 대응하는 역위 및 상보성 서열이다. Vβ 유전자 세그먼트에 특이성인 안티 센스 올리고뉴클레오티드를 시험관내에서 이용하는 것이 갖는 의미는 이 Vβ 세그먼트를 함유하는 T 수용체의 발현을 폐지(또는 강력하게 감소)시킴으로써 T 임파구의 특이 반응성의 수준에서 클론 삭제 현상을 얻는다는 점이다. 이 안티 센스 올리고뉴클레오티드는 시험관내에서는 인체 T임파구 상에 사용한 후 재주사할 수 있을 뿐만 아니라, 생체내에서는 바람직하게는 생체내 안정성을 증가시키기 위한 변형 및 이들 올리고뉴클레오티드의 임파구 내로의 침투 후에 국부 또는 전신 주사에 의해 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 단일 클론 항체는 면역계를 조정하는데 사용할 수 있다. 이 방법에서는 조절 인자(effector) T-세포가 그의 특이성 항원과 상호작용하는 것을 차단하기 위해 항체를 투여할 수 있다. 또, T-세포 수용체의 β 사슬 상의 특이성 결합때문에, 클론 삭제를 얻기 위해서는 예를 들면 세포 독성 분자 또는 방사성 동위 원소에 결합된 항 T 수용체 항체를 투여할 수도 있다. 치료학에서는 T-세포의 특정 서브-어셈블리를 특이성 방식으로 활성화시키기 위해 본 발명에 따른 단일 클론 항체를 낮은 분열 촉진 농도로 사용할 수 있거나 또는 이들을 관련 수용체에 결합시킨 후 세망내피계(細網內皮系)에 의한 제거를 목적으로 이들 서브 어셈블리를 표지시키기 위해 본 발명에 따른 단일 클론 항체를 훨씬 높은 농도로 사용할 수 있다. 질병 치료시 중요한 척도는 질병과 관련된 T-세포의 서브 어셈블리를 조정하는 능력이다. 이러한 치료적 조정법의 정확한 본질 즉, T-세포의 특정 서브 어셈블리를 차단 또는 억제하는 것 또는 이와 반대로 특정 서브-어셈블리를 자극 및 활성화시키는 것은 문제의 질병 및 관련 T-세포의 특정 서브-어셈블리에 따라 좌우될 것이다.
이러한 형태의 치료는 신장 이식을 해서 거부 문제를 가지는 환자에게 있어서 항 CD3 항체를 사용한 치료와 같은 항체를 이용한 현행 치료에 비해 잇점을 가지고 있으며, 이는 본 발명으로 인해 T-세포 개체를 전체적으로 조정하는 것이 아니라 T-세포 수용체에 특이성인 β 아군을 발현하는 T-세포의 서브-어셈블리만을 조정할 것이기 때문이다.
게다가, T-세포의 반응은 종종 올리고클론이므로, 일반적으로 치료학에서는 수개의 항체의 "칵테일"을 사용하는 것이 편리하다.
이밖에, 항 Vβ 항체는 예를 들면 항체 운반 구(球)를 함유하는 칼럼을 통하여 통과시킴으로써 T 임파구를 시험관내에서 선택하는데 사용할 수 있다. 이와 같은 특정 T 임파구의 분리는 환자에게 재주사하기 전에 이들 임파구를 배양할 목적으로 사용할 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 펩티드 서열의 전부 또는 일부 즉, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 펩티드 서열 또는 이들 서열의 단편(일반적으로 적어도 8 내지 10개의 아미노산을 함유함)은 치료학에 사용될 수 있다. 사람 또는 동물에게 투여된 이들 서열 또는 단편은 미끼로서 작용할 수 있고, 즉 이들은 유해성 항원에 의해 운반되는 에피토프 상에 자신을 고정시키고, 정상 T-세포와 항원의 반응을 중단시키고, 이러한 방법으로 자기 결정소에 대해 공격적인 질병의 진전을 방지한다. 또한, 이들은 백신 제조시 면역원으로서(임의로, 단백질 담체와 복합시킨 후) 사용할 수 있다.
본 발명은 첨부한 도면을 참조하여 이하에 보다 상세히 설명할 것이다.
제1도 내지 제6도는 공지의 Vβ 서열, 및 공지의 Vβ 아군에 속하는 IGRa 08 내지 IGRa 20으로 표시한 본 발명에 의한 신규 서열의 부분 서열(서열 동정 번호 6 내지 19)를 일렬로 나타낸 것이다. 이 도면에서, 뉴클레오티드의 번호 정하기는 ATG 개시 코돈(밑줄 친 부분)에서 출발한다. 점은 동일한 뉴클레오티드를 표시한다. 리더 서열로 가정되는 서열은 그 위에 줄이 그어진 부분이다.
제7도는 Vβ 아군에 대해 특이성인 탐침을 사용하여 제한 효소로 처리한 게놈 DNA의 서던 블로트 분석을 나타낸다. 사용되는 제한 효소는 EcoRI(R 난), Hind III(H난) 및 Bam I(B난)이다. 이 도면에서 삼각형은 Cβ와 특이성 방식으로 하이브리드화한 DNA 단편의 위치를 표시한다.
- 제8도는 건강한 개인의 조직 임파구에 의해 발현되는 TCR β 사슬의 증폭된 전사체 및 함께 증폭된 β-액틴용 대조군의 오토라디오그래피에 의한 검출을 나타낸다.
- 제9도는 면역화 클론 3025 (제9(a)도), 클론 12410(제9(b)도) 및 순환 임파구(제9(c)도) 각각에 대한 단일 클론 항체 RO-73의 반응성의 세포 형광법에 의한 분석을 나타낸다.
- 대조를 위해 NKTa 또는 OKT3항체의 반응성을 각 형태의 세포에 대해서 나타낸다.
선형 방식으로 계산된 세포의 수는 형광 강도의 함수로서(로그치) 나타낸다.
- 제10도는 단일 클론 항체 JU-74의 반응성의 세포 형광법에 의한 분석을 나타낸다(제10(a)도, 제10(b)도, 제10(c)도는 각각 제9(a)도, 제9(b)도, 제9(c)도와 동일 조건임).
- 제11도는 항-CD3 항체 부재시(제11(a)도) 또는 존재시(제11(b)도) 각각에서 단일 클론 항체 RO-73에 의해 인지되는 클론 3025의 TCR 구조의 CD3 분자와의 공조정에 대한 세포형광법에 의한 분석을 나타낸다.
대조를 위하여 단일 클론 항체 NKTa, OKT3 및 항-CD2 각각에 대한 공조정 분석을 나타낸다.
- 제12도는 항-CD3 항체 부재시(제12(a)도) 또는 존재시(제12(b)도) 각각에서 단일 클론 항체 JU-73에 의해 인지되는 클론 3025의 JCR 구조의 CD3 분자와의 공조정에 대한 세포형광법에 의한 분석을 나타낸다.
- 제13도는 RO-73+세포에 의해 발현되는 TCR α사슬(제13(a)도) 및 β 사슬(제13(b)도)의 증폭된 전사체의 오토라디오그래프에 의한 관찰을 나타낸다.
[I-cDNA 획득 및 PCR에 의한 증폭]
한 개인의 조직 임파구를 DNA 원으로 사용한다. 전체 RNA는 구아니디늄 이소티오시아네이트 및 카에시움 클로라이드를 이용하는 방법(셔그윈(Chirgwin)의 참고 문헌(12)) 또는 구아니디늄 이소티오시아네이트, 페놀 및 클로로포름을 이용한 추출에 의한 일단계 방법(춈크진스키(Chomczynski)의 참고문헌(13))에 의해 제조하였다.
제1cDNA 가닥은 5 ㎍의 전체 RNA, 역전사효소, 및 서열 5'-TATCTGGAGTCATTGAGGGCGGGC(서열 동정 번호 20)으로 구성되는 Cβ 영역에 특이성인 프라이머 A를 이용하여 1시간 동안 42 ℃의 온도에서 50 ㎕의 최종 부피로 합성하였다. 이어서, 이 물질을 페놀/클로로포름을 이용한 추출 및 아세트산암모늄을 사용한 침전에 의해 정제하였다. 아가로스 겔 상에서 0.45/l kb 분율을 선택한 후, 14 단위의 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)를 함유한 CoCl2첨가 완충액 중의 RNA/cDNA 헤테로 복합체 상에 dG 말단을 37 ℃에서 30분 동안 첨가하였다. 이 반응은 70 ℃에서 10분 동안 유지시킨 후 중단시켰다. 1N NaOH(1/3 부피)를 첨가하고 샘플을 50 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켜서 RNA를 가수분해시키고, 이어서 2M 트리스 HCl(pH8) 및 1N HCl로 중화시켰다. 페놀/클로로포름 혼합물로 추출한 후, 말단 G의 제1cDNA 가닥을 에탄올로 침전시키고, 50mM의 KCl 10mM의 트리스-Cl(pH 8.3), 1.5mM의 MgCl2, 0.1%(중량/부피)의 젤라틴, 200 ㎛의 dNTP, 2.5 단위의 Taq 폴리머라제 및 100 pM의 2개의 프라이머를 함유하는 100㎕의 최종 부피에서 PCR 기술(사이끼 (SaiKi) 등의 참고 문헌(14)에 기재된 복제 연쇄 반응)을 이용하여 증폭시켰다. 사용되는 2개의 프라이머는 로(Loh) 등의 참고 문헌(15)에 기재된 폴리-C 프라이머(5'-GCATGCGCGCGGCCGCGGAGG-14C)(서열 동정 번호 21) 뿐만 아니라 Cβ 영역에 특이성인 프라이머 B (5'-TGTGGCCAGGCATGCCAGTGTGGCC)(서열 동정 번호 22)이다.
25회의 증폭 사이클을 수행한 후, 72 ℃에서 최종적으로 15분간의 신장 기간을 유지하였다. 각 사이클은 92 ℃에서 1분간 변성 단계, 55 ℃에서 2분간 하이브리드화 단계 및 72 ℃에서 4분간 신장 기간을 포함한다. 이어서, 증폭된 생성물을 에탄올로 침전시키고, 이것을 30mM의 아세트산나트륨(pH5), 50mM NaCl, 1mM ZnCl2, 5 부피% 글리세롤 중에서 재현탁시키고, 이 물질의 1/10을 1% 저융점 아가로스 겔 상에서 크기 함수로서 정제하였다.
이어서, 제2증폭 단계를 프라이머 5'-GGTGTGGGAGAATTCTGCTTCTGA(서열 동정 번호 23)을 Cβ 영역에 대해 특이성인 프라이머 C로서 사용하는 것을 제외하고는 상술한 바와 동일한 조건에 따라서 아가로스를 함유하는 밴드의 약 10% 상에서 직접적으로 수행하였다. 이어서, 반응 혼합물을 에탄올로 침전시키고 H2O 60 ㎕ 중에서 재현탁시켰다.
[II-cDNA의 클로닝 및 서열화]
제2증폭 생성물의 1/3을 Sac II로 소화시키고, 1% 아가로스 겔 상에서 분리하여, 유리 비드 상에 흡수시켜 정제한다. 이 물질을 블루스크립트 SK+벡터(스트라타진(stratagene), 미합중국 라 졸라 제품) 중에 삽입시키고, 이와 같이하여 얻은 재조합체를 사용하여 E. Coli의 XL1-블루 균주(스트라진)를 형질 전환시킨다. X-gal 및 IPTG 존재하에서 침강시킨 후, "도트 블로트 기술을 이용하여 백색 콜로니 상에서 시험을 수행하고, 32p로 표지된 cβ 영역에 특이성인 제3올리고뉴클레오티드(5'-TCTGCTTCTGATGGCTCAA)(서열 동정 번호 24)를 탐침으로서 이용한다. 양성 콜로니의 플라스미드 DNA를 추출하고, 공급자의 추천에 따라 서열화효소 2.0(미합중국 클리블랜드 소재 유나이티드 스테이츠 바이오케미칼즈(United States Biochemicals)을 이용한 디데옥시 사슬의 종결법(생거(sanger) 등의 참고문헌(16))에 의해 2개의 가닥에 대해서 서열화한다.
이와 같이 하여 얻은 서열은 립맨(Lipman) 및 피어슨(Pearson)에 의해 개발된 방법(참고문헌(17))을 이용하여 공개된 Vβ 서열과 비교하였다. 가정된 출발 코돈은 진핵 세포에서 번역 개시 분위에 대한 코작(Kozak) 공통 서열의 존재를 조사함으로써 동정하였다(코작의 참고문헌(18)). N-말단측의 소수성 리더 서열의 존재는 카이트(Kyte)에 의해 기재된 방법(참고 문헌(19))에 의한 소수성 분석에 의해 검출하였다.
[III-서던 블로트 분석]
사람의 적백혈병 세포 주 K562로부터 DNA를 추출하고, 다음 제한 효소중의 하나로 소화시켰다: Eco RI, BamH I 또는 Hind III. 이 DNA(15 ㎍)을 0.7 % 아가로스 상에서 전기 영동시키고, 트리에벨(Triebel) 등에 의해 기재된 바(참고 문헌(20))와 같이 나일론 막 상으로 옮겼다. 65 ℃에서 6 × SSC, 0.5%의 SDS, 5 × 덴하르트 및 100 ㎍의 변성된 연어 정자 DNA를 이용하여 16시간 동안 하이브리드화를 수행하였다. 이 막을 65 ℃에서 2 × SSC, 0.2%의 SDS로 세척하였다.
Vβ 특이성 탐침으로서는, 폴리-C 프라이머 및 C 프라이머를 프라이머로서 사용하는 V-J-C cDNA 증폭에 의해 얻어진 탐침을 사용한다. 이 탐침을 1% 아가로스 겔 상에서 정제하였다. 32p로 표지된 DNA 탐침은 페인버그(Feinberg) 방법(참고 문헌(21))에 의해 아가로스 상에서 정제시킨 단편으로부터 제조하였다.
[IV 결과]
A-PCR법을 사용하여, Cβ 클론과 하이브리드화는 350개의 cDNA를 클로닝한 후 서열화하였다. 이들 중, 226개의 cDNA는 V-J-Cβ 가변성 영역에만 대응한다.
본 발명의 Vβ 서열은 서열 동정 번호 2 내지 19로 서열 목록에 나타낸다. 서열 동정 번호 2 및 6 내지 9의 서열은 Vβ 아군의 신규 원에 대응하거나 또는 공지된 Vβ 신장 세그먼트에 대응하는 한편, 서열 동정 번호 3 내지 5의 서열은 3개의 신규 아군에 대응한다.
Vβ w21 아군(서열 동정 번호 2)
이 아군은 IGR b02(서열 동정 번호 2)의 클론에 의해 동정하였다.
이 서열은 코딩 부분에 대하여 HSTCRB23(윌슨 등의 참고 문헌(41))의 서열과 약 85%의 유사성을 나타낸다.
Vβ w22 아군(서열 동정 번호 3)
서열 동정 번호 3의 세그먼트는 cDNA의 23개의 상이한 클론으로부터 공통 서열로서 정의하였다. 위치 322에서는 T 대신 C가 관찰되고 위치 350에서는 G 대신 A가 관찰된다.
Vβ w23 아군(서열 동정 번호 4)
서열 동정 번호 4의 세그먼트는 4개의 상이한 클론으로부터 공통 서열로서 정의하였다. 위치 154에서는 A 대신 G가 관찰되고 위치 160에서는 G 대신 A가 관찰된다. 이는 VB12A1의 서열(상기 레이덴의 문헌)과 75.7%의 유사성을 나타내지만 Vβ 5 아군의 다른 원과는 75% 미만의 유사성을 나타낸다(제1도에 나타냄). 따라서 Vβ 5 아군의 일부가 아니다.
Vβ w24 아군(서열 동정 번호 5)
이 서열 동정 번호 5의 세그먼트는 cDNA의 2개의 상이한 클론으로부터 정의하였다.
Vβ w21 내지 Vβ w24 아군에 대응하는 Vβ 단편을 함유한 V-J-Cβ 탐침을 사용한, 엔도뉴클레아제로 소화시킨 생식 주 DNA의 서던 블로트 분석을 "저 긴축성" 하이브리드화 조건에서 수행하여, 각 군에 속하는 Vβ 유전자 세그먼트의 수를 동정하고 이들 Vβ 유전자 세그먼트를 수반하는 DNA 제한 단편을 특징지었다. 대표적인 결과는 제7도에 나타낸다.
이들 분석은 Vβ w21 아군에 대해서는 적어도 3개의 유전자 세그먼트, Vβ w23 아군에 대해서는 2개의 유전자 세그먼트 및 Vβ w22 및 Vβ w24 아군에 대해서는 1개의 유전자 세그먼트가 K 562 적백혈병 세포에 존재하는 것을 나타낸다.
생식 DNA 제한 단편의 크기는 다음과 같다 :
Vβ w21 : EcoR I 1.7-, 3- 및 6.5 kb, Hind III 2.5-, 7.2-, 11.7-, 14- 및 18kb, BamH I 5.5-, 16.5- 및 23 kb;
Vβ w22 : EcoR I 2.8 kb, Hind III 8.8 kb, BamH I 5.3 kb;
Vβ w23 : EcoR I 3.2- 및 4.4 kb, Hind III 7.4-, 15.5- 및 16.5 kb, BamH I 2.5- 및 5.7 kb;
Vβ w24 : EcoR I 8 kb, Hind III 20 kb 및 7.3 kb, BamH I 11-, 및 22 kb.
Vβ 5 아군 (제1도) :
서열 동정 번호 6 및 7(IGR b06 및 IGR b07)
이들 서열은 각각 4개의 공지 세그먼트 VB12A1(상기 레이덴의 문헌), HBP51(키무라의 참고 문헌(23)), PH24 (상기 틸링개스트의 참고 문헌) 및 PL25 (콘캐논의 참고 문헌(24))와 79 내지 86% 및 76 내지 70%의 유사성을 보여주며, 신규 원을 나타낸다.
서열 동정 번호 8 및 9(IGR b08 및 IGR b09)
이들 서열은 각각 VB12A1 및 PL25 클론의 5'측의 신장에 대응한다. 서열 동정번호 8의 경우, VB12A1에 대해서 2개의 뉴클레오티드 치환이 관찰된다.
Vβ 6 아군 (제2도) :
서열 동정 번호 10(IGR b11)
이 서열은 클론 HBP 25의 5'측 신장에 대응한다(상기 키무라의 참고 문헌).
서열 동정 번호 11(IGR b12)
신규 원임을 나타내는 서열은 PH16(상기 틸링개스트의 참고 문헌), GPPA(상기 리의 참고 문헌) 및 HT 45(키무라의 참고 문헌(25))와 94%의 뉴클레오티드 유사성을 나타낸다.
Vβ 12 아군 (제3도) :
서열 동정 번호 12(IGR b13)
신규 원임을 나타내는 이 서열은 서열 PH27(상기 틸링개스트의 참고 문헌), 및 PL 42(상기 콘캐논의 참고 문헌)와 85%를 초과하는 유사성을 나타낸다.
Vβ 13 아군 (제4도) :
서열 동정 번호 13, 14 및 15(IGR b14, IGR b15 및 IGR b16)
신규 원임을 나타내는 서열 동정 번호 13 및 14의 서열들은 각각 다른 공지 서열 HBVP 34(키무라의 참고 문헌(23)) 및 CEM(두비(Duby)의 참고 문헌(26))과 78 내지 91% 및 77 내지 79%의 유사성을 나타낸다.
서열 동정 번호 15의 서열은 HBVP34와 94%의 유사성을 나타낸다. 서열 동정 번호 15의 서열은 리더 영역에서 인트론(소문자 활자 케이스 문자로 나타냄)을 나타낸다는 점에 유의하여야 한다. 서열 동정 번호 15의 서열은 공통 서열이다. 위치 231에서는 T 대신 C가 관찰되고 위치 259에서는 G 대신 A가 관찰된다.
Vβ 7 아군 (제5도) :
서열 동정 번호 16 및 17(IGR b17 및 IGR b18)
이들 서열은 절단된 서열 PL4.19(상기 콘캐논의 참고 문헌)과 상당한 유사성을 나타내고, 번역 출발 시그날까지 5'측의 신장을 나타낸다.
서열 동정 번호 18(IGR b19)
이 서열은 5' 측의 서열 PL4.9(상기 콘캐논의 참고 문헌)를 번역 출발 시그널까지 신장한다.
Vβ 9 아군 (제6도) :
서열 동정 번호 19(IGR b20)
이 서열은 5'측의 서열 PL 2.6(상기 콘캐논의 참고 문헌)을 신장한다. 두 서열 사이의 차이는 상이한 아미노산에 대응하는 위치 98 및 100에서 관찰된다.
본 발명의 목적은 또한, 예를 들면 상기 기재된 바와 같이 환자내에서 특정 Vβ 아군의 발현 및 궁극적으로 면역 질환의 진단에 대한 연구 관점에서 볼 때, 상이한 Vβ 아군에 대응하는 DNA를 증폭시키는데 프라이머로 사용될 수 있는 상이한 Vβ 아군의 특정 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
특정 Vβ 아군의 우세한 발현에 관한 것은 이미 불완전한 범위의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 연구되어 왔다. 이러한 방식으로, 소티니(Sottini) 등의 참고 문헌(33)에는 일정 범위의 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 류마티스성 관절염에 걸린 환자내에서의 특정 Vβ의 우세한 발현이 기재되어 있다.
마찬가지로, 초이 와이.(Choi Y.) 등의 참고 문헌(32)에는 일정 범위의 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 특정 Vβ의 중간체에 의해 황색 포도상구균 독소에 의한 T 임파구의 자극이 기재되어 있다.
본 발명의 목적은 각 아군에 대해 완전히 특이적인 공지된 Vβ 아군 및 본 발명의 신규 Vβ 아군의 연구를 가능케하는 완전한 범위의 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 따라서 이 올리고뉴클레오티드를 선택하고, 아군 사이의 교차 반응을 감소시키는 천연적 서열에 비례하여 도입되어 있는 1 또는 2개의 올리고뉴클레오티드를 변형시킬 필요 및 목적을 위해 합성한다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열 동정 번호 25 내지 48의 서열에서 선택된, T-세포 수용체의 β 사슬의 가변성 영역에 대응하는 DNA 증폭용 프라이머로서 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드이다.
또한, 본 발명의 목적은 서열 동정 번호 25 내지 48의 서열에서 선택된 올리고뉴클레오티드의 T-세포 수용체의 β 사슬의 가변성 영역에 대응하는 DNA 증폭용 프라이머로서의 용도이다.
또한, 본 발명의 목적은
a) 상기 올리고뉴클레오티드 중의 하나에 의해 형성된 적어도 1쌍의 프라이머를 사용한 DNA 증폭 및
b) Cβ 탐침을 사용한 증폭된 서열의 검출
을 포함하는 것이 특징인, 생물학적 시료중에서 T 수용체의 Vβ 세그먼트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이것의 전사 생성물에 대응하는 cDNA를 검출하는 방법이다.
이 증폭에 사용된 Cβ 세그먼트에 속하는 올리고뉴클레오티드는 특히, 서열 동정 번호 49 및 50의 서열에서 선택할 수 있다.
증폭의 효율을 조사하기 위한 조작은 1쌍의 대조 프라이머의 존재하에 수행하고, 대응하는 대조 탐침을 사용하여 증폭된 대응하는 대조 서열을 검출하는 것이 바람직하다.
이러한 대조 프라이머 쌍은 2개의 Cβ 세그먼트 예를 들면 서열 동정 번호 55 및 56의 서열에 대응하는 CαE 및 CαJ 프라이머에 대응할 수 있다. 이어서, Cα 검출 탐침 (예를 들면, 서열 동정 번호 57의 서열에 대응함)을 사용한다. 그러나, 이 프라이머의 쌍은 β-액틴에 속하는 2개의 프라이머, 특히 서열 동정 번호 52 및 53의 서열에 대응하는 것으로 구성되는 것이 유리하다. 이어서, 서열 동정 번호 54의 서열과 같은 β-액틴의 서열에 대응하는 검출 탐침을 사용한다.
또한, 본 발명의 목적은
a) 서열 동정 번호 25 내지 48의 서열에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드
b) Cβ 프라이머 및
c) Cβ 탐침
을 포함한, 상기 정의된 방법 수행용 진단 키트이다.
이 밖에, 이러한 키트는
d) 1쌍의 대조 프라이머
e) 대조 탐침
을 포함하는 것이 유리하다.
이 키트는 특히
a) 서열 동정 번호 25 내지 48의 서열에 대응하는 24개의 올리고뉴클레오티드 군,
b) 서열 동정 번호 49 및 50의 서열에 대응하는 서열로부터 선택된 Cβ 프라이머,
c) 서열 동정 번호 52 및 53의 서열에 각각 대응하는 서열을 갖는 β-액틴용 1쌍의 대조 프라이머,
d) 서열 동정 번호 51의 서열에 대응하는 Cβ 탐침 및
e) 서열 동정 번호 54의 서열에 대응하는 β-액틴용 대조 탐침
을 포함할 수 있다.
서열 동정 번호 25 내지 54의 서열의 목록에 제공된 정보에 있어서, 서열 동정 번호 25 내지 45의 서열은 공지된 Vβ 1 내지 Vβ 22 아군의 클론에 속하는 서열(EMBL 데이타베이스로부터 이용가능함) 또는 1 또는 2개의 뉴클레오티드가 상이한 서열에 대응한다. 서열 동정 번호 45, 46, 47 및 48의 서열은 잠정적으로 나타낸 아군 Vβ w21, Vβ w22, Vβ w23 및 Vβ w24 (w는 임시적으로 한정된 표시를 나타냄)에 대응하는 본 발명의 신규 아군의 클론에 속하는 서열에 대응한다.
서열 동정 번호 49 및 50의 서열은 증폭용 프라이머로서 사용될 수 있는 Cβ 올리고뉴클레오티드의 2가지 예이다.
서열 동정 번호 51의 서열은 증폭된 DNA의 검출에 사용될 수 있는 Cβ 탐침의 서열이다.
마지막으로, 서열 동정 번호 52, 53 및 54의 서열은 각각 증폭을 조사하기 위해 사용될 수 있는 β-액틴의 서열에 속하는 1쌍의 올리고뉴클레오티드의 서열 및 대응하는 증폭된 DNA를 검출하기 위한 탐침의 서열이다.
서열 목록에 나타난 위치는 ATG 번역의 이미 기재된 개시 부위로부터 계산하는 5' 말단의 위치이다. 서열이 불완전할 경우(공지되어 있지 않은 5' 영역), *로 표시된) 위치는 서열의 제1뉴클레오티드에 대하여 제공된다. 밑줄 그어진 뉴클레오티드는 천연 서열에 대해 도입된 것과 짝지워지지 않는다.
올리고뉴클레오티드는 β-시아노-에틸포스포르아미다이트법(신하(Sinha N.) 등의 참고 문헌(34))을 사용하고 제작자에 의해 권장된 프로토콜에 따라 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem) 381 A 자동화 DNA 합성기로 합성하였다. 올리고뉴클레오티드는 장치 중에서 탈트리틸화하고, 지지체로부터 절단하고 암모니아로 (60 ℃에서 5시간 동안) 탈보호시켰다. 조 생성물을 0.01 M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액 (pH 5.5) 중의 아세토니트릴 구배(9 내지 15%)를 사용하는 μ-본다팩(bondapak) C18 컬럼 상의 역상 고압 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
증폭은 본 발명에 따른 프라이머, 특히, 사이끼 등의 참고 문헌(14) 및 미합중국 특허 제4,683,195호, 동제 4,683,202호, 동제 4,889,818호에 기재되어 있는 PCR(복제 연쇄 반응)에 의한 증폭 기술을 사용하여 수행하였다.
PCR에 대해서는, 변성되거나 또는 상기 기재된 역전사 효소를 사용하여 RNA로부터 얻어진 cDNA의 이중 가닥 DNA를 사용할 수 있다.
중합화제는 DNA 폴리머라제, 특히 Taq 폴리머라제이다.
일반적으로 증폭 사이클은 25 내지 40회를 반복한다.
증폭 서열을 검출하는데 사용되는 탐침은 오토라디오그래피에 의한 검출을 초래하는 방사성 동위원소로 올리고뉴클레오티드를 표지하거나 또는 화학 발광에 의한 검출을 초래하는 퍼옥시다제(ECL 애멀샴 시스템), 알칼리성 포스파타제 또는 β-갈락토시다제(트로픽스 오자임 시스템)과 같은 효소와 결합시킴으로써 얻어질 수 있다.
하기 실시예는 본 발명에 따른 검출 방법의 수행을 설명한다.
건강한 개인의 조직 임파구를 밀도 구배 원심분리에 의해 제조하였다. 전체 DNA를 이소티오시안산 구아니디늄, 페놀 및 클로로포름을 사용하여 추출시킴으로써 1 단계법으로 추출하였다(춈크진스키의 참고 문헌(13)). 상보성 DNA는 1 내지 5 ㎍의 전체 RNA, 역전사효소 및 Cβ B 프라이머를 사용하여 42 ℃에서 1시간 동안 최종 20 ㎕의 최종 부피로 합성하였다(1.25 mM).
이렇게 하여 얻은 물질을 95 ℃에서 3분 동안 가열한 후, 서열 동정 번호 25 내지 48의 서열에 대응하는 특이성 Vβ 프라이머 및 Cβ 영역에 특이성인 Cβ B 프라이머(서열 동정 번호 56)을 병행해서 사용하는 PCR 기술에 따라 증폭시켰다. 이러한 증폭은 50 mM의 KCl, 10 mM의 트리스-HCl(pH 8.3), 1.5 mM의 MgCl2, 0.1(중량/부피)%의 젤라틴, 200 ㎛의 dNTP, 0.25 단위의 Taq 폴리머라제 및 0.25 ㎛의 각 프라이머를 함유한 튜브 당 10 ㎕의 최종 부피로 수행하였다. 대조를 위한 증폭은 PCR 및 액틴에 특이성인 액트 1 및 액트 2 프라이머(서열 동정 번호 52 및 53)에 의해 제조된 877개의 염기쌍의 β-액틴의 25 mN DNA 단편에서 출발하여 각각의 튜브 중에서 수행하였다. 72 ℃에서 5분간 최종 신장 단계 후에 30회의 증폭 사이클을 수행하였다. 각각의 사이클은 94 ℃에서 1분간의 변성 단계, 65 ℃에서 1 분간의 하이브리드화 단계 및 72 ℃에서 1분간의 신장 기간을 포함한다.
이렇게 하여 얻어진 생성물을 2 % 아가로스 겔 상에서 전기 영동에 의해 분리시키고, 알칼리 완충액 중에서 나일론 막 상으로 옮기고, 폴리뉴클레오티딜 T4 키나제 효소에 의해 32p로 표지된 Cβ C 올리고뉴클레오티드 탐침(서열 동정 번호 51) 및 액트 3(서열 동정 번호 54)를 사용하여 동시에 하이브리드화시켰다. 하이브리드화는 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × 덴하르트(Denhardt's), 0.05% NaH2PO4및 100㎍/㎖의 변성된 연어 정자 DNA를 함유한 완충액 중에서 42 ℃로 16시간 동안 수행하였다. 이어서, 막을 SSC로 6회, 20mM NaH2PO4로 주변 온도에서 5분간 2회, 50 ℃에서 30분간 1회 세척한 후, 오토라디오그래피하였다.
얻어진 결과를 제8도에 나타낸다.
액틴용 대조군(877개의 염기쌍의 밴드)에서도 모든 웰에서 입증되도록 증폭이 일어날 수 있다. 대응하는 증폭 단편의 크기에 대응하는 크기를 갖는 특이성 시그날이 상기 밴드 아래에 나타나며, 각 단편은 특이성 Vβ 올리고뉴클레오티드의 좌 및 Cβ 프라이머 사이의 거리에 대응하는 길이를 갖는다.
개별적으로 시험한 후, 제8도는 다른 것에 대하여 한정된 특정 유전자 세그먼트의 선택적 발현을 나타낸다. 예를 들면, Vβ 1 및 2 아군은 다른 아군보다 더 많이 나타난다.
[항 V13 단일 클론 항체 : RO-73 및 JU-74 단일 클론 항체의 제조예]
[1) 면역화 세포]
클론 T3025(뫼비우스(Moebius) 등의 참고 문헌 (35))를 헤르센드(Hercend) 등의 참고 문헌(36)에 기재된 바와 같이 DMEM(세로메드(Seromed)제품), 8% AB형 사람 혈청, IL-2 및 TCGF를 함유하는 완전 매질 중에서 배양시켰다. IL-2 존재하에서 동종 세포에 대해 주기적으로 재자극을 수행하였다. 이들 세포에 의해 발현되는 T 수용체를 코딩하는 mRNA를 A-PCR 기술을 사용하여 서열화하고, 유전자 세그먼트 Vα 10 (서열 HAP58, 요시까이(YoshiKai) 등의 참고 문헌(37)) 및 Vβ 13 (서열 IGR b16 = 서열 동정 번호 15)의 재배열을 나타낸다.
[2) 마우스의 면역화]
생후 6주의 비오지(Biozzi) 마우스(프랑스 파리 소재 퀴리 연구소)를 클론 3025의 전체 T 세포로 면역화시켰다. 프로인트 완전 보조액 중의 세포 5 × 106개를 1차 복강내 주사한 후, 이 마우스에 프로인트 불완전 보조액 중의 세포 5 × 106개를 3주 간격으로 3회 복강내 주사하였다. 최종 복강내 주사 후 2주가 경과했을때, 이 마우스에서 2 × 106개의 생존 세포를 정맥내 주사하였다. 3일 후, 마우스는 죽었고, 비장을 제거하였다.
[3) 융합]
NS-1을 분비하지 못하는 골수종과 비장 세포의 융합은 콜러(Kohler) 및 밀스테인(Milstein)의 방법(참고 문헌 (38))에 따라서 수행하였다. NS-1 세포(콜러 및 밀스테인의 참고 문헌(39))를 DMEM(세로메드 제품), 8-아자구아닌(미합중국 미시간주 세인트 루이스 소재 시그마(Sigma) 제품), 10% 말 혈청(세로메드 제품, 로트 번호 5Z04), 페니실린 및 스트렙토마이신 (유로비오(Eurobio 제품), 글루타민(세로메드 제품, 200 mM) 및 피루브산나트륨(깁코(Gibco) 제품, 100mM)을 함유하는 매질 중에서는 배양시켰다.
골수종 세포 1개당 비장 세포 4개의 비율로 폴리 에틸렌-글리콜(PEG 1000, 머크(Merk)제품)을 이용하여 비세포를 NS-1 세포와 융합시켰다. 융합 후, 이 세포를 DMEM, 10% 말 혈청, 10% 태아 소 혈청(세로메드 제품, 로트 번호 219195), 아미노프테린(깁코 제품), 히폭산틴 및 티미딘(깁코 제품), 페니실린 및 스트렙토마이신, 글루타민, 피루브산나트륨 및 NCTC 109(유로비오 제품)를 함유하는 HAT 선택 매질 중에서 96개의 웰이 있는 플레이트(눈크(Nunc) 제품)에서 1 ㎖ 당 3 × 106개의 세포로 배양하였다. 융합 후 2일이 경과했을 때는 1개의 웰 당 50 ㎕씩, 9일이 경과했을 때는 1개의 웰 당 100 ㎕씩 신선한 매질을 웰에 첨가하였다. 10% CO2를 함유하는 인큐베이터에서 37 ℃로 배양하였다.
[4) 하이브리도마의 선별]
이와 같이 하여 얻은 하이브리도마의 상징액을 융합 후 15일이 경과했을 때 모았고, 그의 반응성을 간접 면역형광 정량법에 의해 면역화 세포를 이용하여 시험하고, 유동 세포 정량(cytometry) 분석법으로 분석하였다. 간단히 말해서, T3025 세포를 하이브리도마 상징액과 함께(세포 300,000개 당 100 ㎕) 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 세척하고, 플루오레스신 (히알레아 소재 코울터 일렉트로닉스(Coulter Electronics) 제품)과 결합시킨 마우스 항-면역글로블린 염소 항체로 표지시켰다. 이어서, 이 세포를 유동 세포 정량 분석법으로 분석하였다(코울터 프로파일). 제9(a)도 및 제10(a)도에 나타낸 바와 같이, 하이브리도마 RO-73 및 JU-74의 상징액은 면역화 클론 3025의 세포 100%를 표지시키는 것을 가능하게 하였다. 이 실험에서, 항-CD3 항체 (OKT3, 오르토-코(Ortho-Co)제품) 및 항-클로노-형 NKTa 항체 (IgG1, 헤르센드 등의 참고 문헌(40))는 각각 양성 및 음성 대조구로서 작용하였다.
[5) 항-T 수용체 특이성]
단일 클론 항체의 항-T 수용체 특이성은 다음 척도에 따라서 분석하였다 :
1-항체는 면역화 T 클론 3025를 인지해야하지만, 예를 들면 클론 12410(뫼비우스 등의 참고 문헌(35), 발현된 TCR: Vα 3/Vβ 17)과 같은 상이한 T-세포 수용체(TCR)를 운반하는 T 클론을 인지해서는 안된다.
2-이 항체는 낮은 백분율의 순환 임파구(PBL)와 반응해야 한다.
3-면역화 세포 상에서 항체에 의해 인지되는 표면의 구조는 항-CD3 항체(뮤이에(Meuer) 등의 참고 문헌(1))의 존재하에서 세포를 인큐베이션시킬 때 CD3 분자와 공조정하여야 한다.
제9도 및 제10도에 나타낸 바와 같이, 하이브리도마 RO-73 및 JU-74의 상징액은 면역화 클론 3025의 세포의 100%와 반응하고(제9(a)도 및 제10(a)도), 클론 12410의 세포의 2% 미만과 반응하고(제9(b)도 및 제10(a)도), PBL의 1 내지 3%와 반응한다(제9(c)도 및 제10(c)도).
공조정 실험에 있어서, 클론 3025의 세포(1 ㎖ 당 106개의 세포)를 매질에서만 배양하거나 또는 24개의 웰을 갖는 배양 플레이트 중에서 항-CD3 항체(OKT3) 존재하에서 배양하였다. 24시간 동안 배양시킨 후, 세포를 모아서, 하이브리도마 RO-73 또는 JU-74, 항-CD3 단일 클론 항체 또는 항-CD2 대조 단일 클론 항체(코울트로닉스 코.(Coultronics Co.) 제품)의 상징액으로 표지시키고, 이어서 유동 세포 정량 분석법으로 분석하였다. 제11도 및 제12도에 나타낸 바와 같이, 항-CD3 단일 클론 항체 존재하에서 (제11(b)도 및 제12(b)도) 인큐베이션시킨 세포의 유동 세포 정량 분석은 항-CD3 단일 클론 항체 뿐만 아니라 RO-73 및 JU-74에 대해서 형광 강도의 감소를 나타내는 반면, 항-CD2 단일 클론 항체와의 표지 강도는 항-CD 항체 부재시에(제11(a)도 및 제11(b)도) 각각 얻은 강도에 비해 증가한다. 이 결과들은 RO-73 및 JU-74 항체에 의해 인지되는 분자가 클론 T 3025의 세포 표면에서 CD3 분자와 공조정한다는 점을 가리킨다.
[b) 서브-클론의 단리]
초기 하이브리도마 RO-73 및 JU-74 각각의 세포를 조사시킨 동계(同系) 비장 세포에 대해서 완전 HAT 매질 중에서 1개의 웰 당 0.5개의 세포의 비율로 배양 플레이트 상에 분배하였다. 하이브리도마 RO-73 및 JU-74 각각에 대하여 3개의 서브-클론을 선택하였다. 이들 세포는 초기 하이브리도마의 반응성과 동일한 반응성을 갖는 단일 클론 항체를 생산한다(결과는 나타내지 않음).
이 서브-클론을 DMEM, 10% 태아 소 혈청, 10% 말 혈청, 히폭산틴, 티미딘, 페니실린 및 스트렙토마이신, 글루타민, 피루브산나트륨 및 NCTC 109를 함유하는 비(非)선택적 매질 중에서 배양한다.
하이브리도마 또는 서브-클론의 세포를 10%의 디메틸 술폭시드(DMSO, 머크제품)를 함유하는 태아 소 혈청 중에서 동결시키고, 액상 질소 중에 보관하였다.
[7) 단일 클론 항체의 이소타입화]
배양물의 상징액 중에서 면역 글로블린의 이소타입을 결정하기 위해 인노-리아(INNO-LIA) 마우스 mAb 이소타입화 키트(인노제네틱스 제품)를 사용하여 고체 지지체 상에서의 면역 확산에 의해 이소타입을 결정하였다. RO-73 및 JU-74는 이소타입 IgG1(카파)의 마우스 면역 글로블린이다.
[8) 단일 클론 항체의 정제]
무모(無毛) 마우스에서 복수(腹水)를 생산하였다. 이와 같이 하여 얻은 복수를 코튼(cotton)을 통해 여과시켜 피브린을 제거하고, 황산나트륨(18%)으로 침전시켰다. 이와 같이 하여 얻은 침착물을 PBS 완충액 중에서 현탁시키고, 완충액(NaCl 4.5M, 글리신 2.25M, pH 8.8) 중에서 1/3배 희석시키고, 적재용 완충액, (NaCl 3M, 글리신 1.5M, pH 8.8)중에서 평형시킨 프로테인 A-세파로스 4 패스트 플로우(Protein A-Sepharose 4 Fast Flow)의 칼럼 내에 적재하였다. ph를 감소시키는 연속 용출 완충액을 사용하여 pH 6에서 면역 글로블린의 주요 피크를 용출시켰다. 이 주요 피크는 트리스 완충액(50mM, pH 8)중에서 평형시킨 이온 교환 칼럼(Q 세파로스 패스트 플로우)상에서 정제시키고, NaCl 구배로 용출시켰다.
제조물의 정제는 PHAST 시스템(스웨덴 업살라 소재 파마시아(Pharmacia) LKB 제품)에서 전기 영동에 의해 확인하고, 정제된 면역 글로블린은 상기한 바와 같이 세포 3025 상의 간접 면역-형광법에 의해 시험하였다.
한 예로서, 하이브리도마 RO-73의 복수 30 ㎖에 대해서는, 프로테인 A 및 Q 세파로스 패스트 플로우 상에서의 정제 후 32 ㎎의 정제된 면역글로블린을 얻었다.
[9) 단일 클론 항체에 의해 인지되는 PBL 백분율]
단일 클론 항체 RO-73 및 JU-74 각각에 의해 인지되는 순환 임파구의 백분율을 10개의 상이한 건강한 도너(doner)에 대해서 결정하였다. 이 결과를 표1에 나타내었다. 단일 클론 항체 JU-74는 PBL의 0.5% 미만 내지 2.1 % (평균 1.08 %)를 인지하고, 단일 클론 항체 RO-73은 개인에 따라서 PBL의 0.5 % 내지 2.2 % (평균 1.09 %)를 인지한다. 주어진 한 개인에 대하여, 단일 클론 항체 RO-73 및 JU-74는 각각 거의 동일 백분율의 순환 임파구를 인지한다.
[표 1]
[10) 단일 클론 항체에 의해 인지되는 PBL의 정제]
단일 클론 항체 RO-73 및 JU-74 각각에 의해 인지되는 PBL을 자성(磁性) 비드(다이날(Dynal)소재 다이나비즈(Dynabeads) 제품)를 이용한 양성 선택 방법을 사용하여 정상 도너로부터 정제하였다. 간단히 말해서, 1 내지 4 × 109개의 PBL을 상기 정제된 단일 클론 항체 중의 하나 이상에 의해 표지시키고, 표지된 세포 1개 당 비드 3개의 비율로 마우스 항-IgG 염소 혈청으로 피복시킨 기성(旣成) 다이나비즈 M-450 비드와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 자석을 사용하여 양성 세포를 분리하였다. 수회 세척 후, 이 세포들은 자성 비드를 탈착시키기 위해 과량의 마우스 항-IgG 염소 면역 글로블린(비드 탈착제(Detach-a-beads), 다이나테크(Dynatech)제품)과 함께 인큐베이션시키고, 이어서 단일 클론 항체 RO-73 또는 단일 클론 항체 JU-74 각각으로 표지시킨 후 플럭스(flux) 세포 정량 분석법에 의해 직접 분석하였다.
선택된 양성 세포는 조사시킨 동종 세포 상에서 IL-2 존재하에 마이크로플레이트 중에서 배양시키고, 이어서 약 1주 동안 배양시킨 후 다시 자성 비드로 정제하여 순도가 95%를 초과하는 제조물을 얻었다.
단일 클론 항체 JU-74에 대해서는, 1주 배양 후, 초기에 1.7%의 JU-74+ 세포를 함유하는 건강한 도너로 부터 얻은 1 × 109개의 PBL로 부터 순도 96%의 양성세포 8×106개를 얻었다.
단일 클론 항체 RO-73에 대해서는, 10일 배양후, 초기에 2.4%의 RO-73+ 세포를 함유하는 건강한 도너로부터 얻은 1.2 × 109개의 PBL로부터 순도 98%의 양성세포 9×106개를 얻었다.
이러한 방법으로 선택된 정제된 RO-73+ 및 JU-74+ 세포로부터, 각각의 세포주를 확립하였다 : 각 주는 2개의 단일 클론 항체에 의해 100% 인지되며, 이는 2개의 단일 클론 항체가 조직 혈액에서 동일 세포를 인지한다는 점을 나타낸다.
RO-73 및 JU-74에 의해 인지되는 PBL에서 발현되는 TCR 전사체의 PCR 기술을 이용한 분석
[a) β 전사체의 분석법]
상기 Vβ1 내지 Vβ24 형 (서열 동정 번호 25 내지 48)의 Vβ 세그먼트의 특정 올리고뉴클레오티드를 RO-73+ 및 JU-74+ 세포에서 발현되는 TCR β 전사체를 분석하기 위한 특정 프라이머로서 사용하였다. 사용되는 방법은 건강한 개인의 조직 임파구에 대한 상기 실시예에 기재된 것과 동일하다. 간단히 말해서, 춈스진스키 방법(참고 문헌(13))에 따라서 RNA를 제조한 후, 역전사효소 및 Cβ B 프라이머(서열 동정 번호 50)을 사용하여 상보성 DNA를 합성하였다. 이와 같이 하여 얻은 물질은 상기한 바와 같은 서열 동정 번호 25 내지 48의 서열에 대응하는 특정 Vβ 프라이머 및 Cβ 영역의 특정 Cβ B 프라이머(서열 동정 번호 50)을 병행해서 사용하여 PCR 기술에 따른 증폭 사이클을 30회 수행하였다.
이와 같이 하여 얻은 증폭된 생성물을 2% 아가로스 겔 상의 전기 영동에 의해 분리시키고, 나일론 막 상으로 이동시켜서, 32p로 표지된 Cβ C 올리고뉴클레오티드 탐침(서열 동정 번호 51)로 하이브리드화시켰다. 이어서, 이 막을 상기한 바와 같이 세척한 후, 오토라디오그래피시켰다.
TCR β 사슬의 전사체의 서열화는 cDNA에 대한 상기 클로닝 및 서열화 방법에 따라서 수행하였다. 예를 들면, Vβ 13 아군의 특정 올리고뉴클레오티드(서열 동정 번호 37)에 의해 증폭된 물질은 효소 SacII에 의해 소화시키고, 아가로스 겔상의 전기 영동에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 얻은 물질을 pBS SK+벡터내로 도입시키고 (상기 A-PCR 기술에 대해 기재한 바대로), E. Coli XL-1 블루 박테리아를 트랜스펙션시키는데 사용하였다. 이와 같이 하여 얻은 형질 전환된 콜로니를 32p로 표지된 Cβ C 올리고뉴클레오티드 탐침(서열 동정 번호 51)을 사용하는 도트-블로트 하이브리드화법에 의해 시험하였다. 이 플라스미드 DNA를 상기한 바에 의해 서열화하였다.
[b) α 전사체의 분석법]
Vα 1 내지 Vα 29 형의 Vα 세그먼트의 특정 올리고뉴클레오티드 및 접촉 Cα 영역의 특정 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 TCR α 사슬의 전사체를 분석하는데 β 전사체에 대해 기재한 것과 유사한 방법론을 적용하였다(상보성 DNA 합성 및 PCR에 의한 증폭용 Cα B 올리고뉴클레오티드 및 검출 탐침용 Cα C 올리고뉴클레오티드). 이들 올리고뉴클레오티드의 서열을 표2에 나타내었다.
[표 2]
[C) 결과]
제13도는 단일 클론 항체 RO-73에 의해 인지되는 RO-73+ 세포에 의해 발현된 TCR α 사슬(제13(a)도) 및 β 사슬(제13(b)도)의 전사체의 분석에 대하여 얻은 결과를 나타낸다. 이들 세포에서는 수많은 상이한 Vα 세그먼트가 발현된다 (제13(a)도)는 점에 유의하여야 한다. 다른 한편, Vβ 13 아군의 서열의 특정 올리고뉴클레오티드만이 cDNA의 증폭을 허용한다(제13(b)도).
단일 클론 항체 JU-74에 의해 인지되는 JU-74+ 세포에서 발현된 TCR β 전사체에 대해서 동일한 결과를 얻었다(결과는 나타내지 않음).
이밖에, JU-74+ 세포에 의해 발현되는 Vβ 13 아군에 대응하는 β전사체는 Vβ 13 아군의 공지되거나 또는 신규의 원 5개 중에서, 단일 클론 항체 JU-74에 의해 인지되는 생성물을 가지는 원을 결정하기 위해 상기 단리된 세포로부터 서열화하였다(제4도). 표 3은 이 서열을 분석한 후 얻은 결과를 나타낸다. 얻어진 Vβ 13의 8개의 상이한 서열은 모두 상이한 J 세그먼트 및 N 영역을 가지는 신규 Vβ 13 유전자 세그먼트 IGRb16(서열 동정 번호 15)의 재배열에 대응한다.
[표 3]
이들 모든 결과는 단일 클론 항체 RO-73 및 JU-74가 Vβ 13 아군에 속하는 유전자 세그먼트의 생성물에 특이적이라는 점을 나타낸다.
더 정확하게 말하자면, 단일 클론 항체 JU-74 및 RO-73은 동일한 특이성을 가지고, 본 발명의 신규 Vβ 13 유전자 세그먼트 IGRb16 (상기 기재한 서열 동정 번호 15)의 생성물만을 인지한다.
다음 하이브리도마 세포 주를 콜렉션 내쇼날 드 컬쳐 드 마이크로오가니즘(Collection Nationale de Culture de Microorganismes; CNCM - 파스퇴르 인스티튜트(Pasteur Institute))에 1992년 2월 12일자로 수탁하였다 : JU-74 및 RO-73의 수탁 번호는 각각 I-1173 및 I-1172이다.
[참고 문헌 :]
1. 뮤이에(Meuer, S.C.) 등, J. Exp. Med. 1983. 157:705.
2. 므왱언(Moingeon, P.) 등, Nature 1986a. 323:638.
3. 브렌너(Brenner, M.B.) 등, Nature 1986. 322:145.
4. 뱅크(Bank, I.) 등, Nature 1986. 322:179.
5. 데이비스(Davis, M.M.) 등, Nature 1988. 334:395.
6. 크루(Crews, S.) 등 Cell 1981. 25:59.
7. 윌슨(Wilson, R.K.) 등, Immunological Reviews 1988c. 101:149.
8. 로빈슨(Robinson, M.A.), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989. 86:9422.
9. 레이덴(Leiden, J.M.) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. 83:4456.
10. 레이놀드(Reynolds) 1986.
11. 리(Li, Y.) 등 J. Exp. Med. 1990. 171:221.
12. 셔그윈(Chirgwin, J.M.) 등, Biochemistry 1979. 18:5294.
13. 춈크진스키(Chomczynski, P) 등, Anal. Biochem. 1987. 162:156.
14. 사이끼(Saiki, R.K.) 등, Science 1988. 239:487.
15. 로(Loh, E.Y.) 등, Science 1989. 243:217.
16. 생거(Sanger, F.) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977. 74:5463.
17. 립맨(Lipman, D.J.) 등, Science 1985. 227:1435.
18. 코작(Kozak, M.), Nucl. Acids Res. 1984. 12:857.
19. 카이트(Kyte, J.) 등, R.F., J. Mol. Biol. 1982. 157:105.
20. 트리에벨(Triebel, F.) 등, J. Immun. 1988. 140:300.
21. 페인버그(Feinberg, A.P.) 등, Anal. Bichem. 1983. 132:6.
22. 틸링개스트(Tillinghast, J.P.) 등, Science 1986. 248:879.
23. 키무라 (Kimura, N.) 등, J. Exp. Med. 1986. 164:739.
24. 콘캐논(Concannon, P.) 등, Proc.
25. 키무라(Kimura, N) 등, Eur. J. Immunol 1987. 17:375.
26. 두비(Duby, A.D.) 등, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 1986. 83:4890.
27. 노덴바크(Naudenbark, A.) 등, Nature, 341, 541.
28. 제인웨이(Janeway, C.), Nature, 341, 482.
29. 린(Lin, Y.) Exp. Med., 171, 221.
30. 아카-오베아(Acha-Orbea, H.), EMBO Journal, 1990, 9, 12, 3815.
31. 카플러(Kappler, J.), Science 244, 811.
32. 초이(Choi, Y.), PNAS, 86, 8941.
33. 소티니(Sottini A.) 등, Eur. J. Immunol, 1991, 21, 461.
34. 신하(Sinha N.) 등, Nucleic Acids Res. 1984, 12, 4539.
35. 뫼비우스(Moebius, U.) 등 Eur. J. Immunol. 1990., 20, 889.
36. 헤르센드(Hercend, T.) 등, Cellular Immunol., 1984, 86, 381.
37. 요시까이(Yoshikai, Y.) 등, J. Exp. Med., 1986, 164, 90.
38. 콜러(Kohler, G.) 및 밀스테인(Milstein, C.), Nature, 1975, 256, 495.
39. 콜러(Kohler, G) 및 밀스테인(Milstein, C.), Eur. J. Immunol., 1976, 6, 511.
40. 헤르센드(Hercend, T.) 등, J. Exp. Med., 158, 1983, 1547.
41. 윌슨(Wilson, R.K.) 등, Immunogenetics, 1990, 32, 406.
[서열 목록]

Claims (15)

  1. 서열 동정 번호 2 내지 19의 서열 중의 하나에 대응하는 Vβ 세그먼트 중의 어느 하나에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 함유한 cDNA에 대응하는, 인체 T 임파구 수용체의 β사슬의 가변성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
  2. 제1항에 있어서, 서열 동정 번호 2 내지 5의 서열 중의 하나에 대응하는 Vβ 세그먼트 중의 어느 하나에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 함유한 cDNA에 대응하는, 인체 T 임파구 수용체의 β사슬의 가변성 영역을 코딩하는 서열.
  3. 서열 동정 번호 2 내지 5의 서열 중의 하나에 대응하는 Vβ 세그먼트 중의 어느 하나에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대응하는 cDNA에 대응하는, 인체 T 임파구 수용체의 β사슬의 가변성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
  4. 서열 동정 번호 6 내지 15의 서열 중의 하나에 대응하는 Vβ 세그먼트 중의 어느 하나에서 선택되는 뉴클레오티드 서열 중의 하나에 대응하는 cDNA에 대응하는, 인체 T 임파구 수용체의 β사슬의 가변성 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
  5. 서열 동정 번호 8의 1 내지 155, 서열 동정 번호 9의 1 내지 125, 서열 동정 번호 10의 1 내지 111의 서열 중의 하나에서 선택되는, 제4항의 뉴클레오티드 서열의 단편인 뉴클레오티드 서열.
  6. 서열 동정 번호 16의 1 내지 195, 서열 동정 번호 17의 1 내지 99, 서열 동정 번호 18의 1 내지 113, 서열 동정 번호 19의 1 내지 186의 서열 중의 하나에서 선택되는, 제1항의 뉴클레오티드 서열의 단편인 뉴클레오티드 서열.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 뉴클레오티드 서열 중의 어느 하나에 의해 코딩된 펩티드.
  8. 제7항에 정의된 펩티드 중의 하나에 특이적으로 결합하는 항체.
  9. 제8항에 있어서, 단일 클론 항체 또는 그의 단편인 항체.
  10. 제9항에 따른 단일 클론 항체의 단편 Fab, Fab' 또는 F(ab')2.
  11. 검출용 마커 및(또는) 하나 이상의 치료 활성 분자가 결합된 제9항 또는 제10항에 따른 단일 클론 항체 또는 그의 단편.
  12. 제9항에 따른 항체를 생성하는 하이브리도마.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 1종 이상의 단일 클론 항체 또는 그의 단편을 함유하는, 시험관 내에서 T형 면역 반응을 진단하기 위한 조성물.
  14. 1992년 2월 12일자로 CNCM에 수탁번호 I-1172 및 I-1173으로 수탁된 항 Vβ 13 단일 클론 항체를 생성하는 하이브리도마 RO-73 및 JU-74.
  15. 제14항에 따른 하이브리도마에 의해 생성된 항 Vβ 13 단일 클론 항체.
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Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776459A (en) * 1989-07-19 1998-07-07 Connetics Corporation TCR V beta 5 peptides
US5098303A (en) * 1990-03-22 1992-03-24 Ultradent Products, Inc. Method for bleaching teeth
US7294712B2 (en) * 1990-06-04 2007-11-13 Aventis Pharma S.A. Nucleotide sequences coding for variable regions of β chains of human T lymphocyte receptors, corresponding peptide segments and the diagnostic and therapeutic uses
JPH06502997A (ja) * 1991-02-12 1994-04-07 ルセル　ユクラフ ヒトＴリンパ球レセプターのβ鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列対応するペプチドセグメント並びに診断及び治療への利用
US5552300A (en) * 1994-01-13 1996-09-03 T Cell Sciences, Inc. T cell antigen receptor V region proteins and methods of preparation thereof
FR2736831B1 (fr) * 1995-07-19 1997-08-22 Centre Nat Rech Scient Sequences nucleotidiques et peptidiques pour le traitement de la myasthenie
US6087096A (en) * 1995-11-13 2000-07-11 Dau; Peter C. Method of intrafamily fragment analysis of the T cell receptor α and β chain CDR3 regions
US6861217B1 (en) 1998-11-25 2005-03-01 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Variation in drug response related to polymorphisms in the β2-adrenergic receptor
GB2361535B (en) * 1998-11-25 2004-02-25 Univ Cincinnati Polymorphisms in the 5'leader cistron of the beta 2 - adrenergic receptor
CA2490903A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Institute For Scientific Research, Inc. Compositions and methods for the detection of human t cell receptor variable family gene expression
US7375211B2 (en) * 2005-11-18 2008-05-20 Kou Zhong C Method for detection and quantification of T-cell receptor Vβ repertoire
EP2044949A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Immutep Use of recombinant lag-3 or the derivatives thereof for eliciting monocyte immune response
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
GB2483810B (en) 2008-11-07 2012-09-05 Sequenta Inc Methods for correlating clonotypes with diseases in a population
PT2387627E (pt) 2009-01-15 2016-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp Determinação do perfil de imunidade adaptativa e métodos de geração de anticorpos monoclonais
WO2010151416A1 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of measuring adaptive immunity
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
AU2012325791B2 (en) 2011-10-21 2018-04-05 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
EP2788509B1 (en) 2011-12-09 2018-07-11 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
EP3372694A1 (en) 2012-03-05 2018-09-12 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits
SG10201507700VA (en) 2012-05-08 2015-10-29 Adaptive Biotechnologies Corp Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed pcr reactions
CN105189779B (zh) 2012-10-01 2018-05-11 适应生物技术公司 通过适应性免疫受体多样性和克隆性表征进行的免疫能力评估
WO2015160439A2 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
WO2014144495A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abvitro, Inc. Single cell bar-coding for antibody discovery
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
GB201322626D0 (en) 2013-12-19 2014-02-05 Immutep S A Combined preparations for the treatment of cancer
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
EP3114240B1 (en) 2014-03-05 2019-07-24 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
TWI777174B (zh) 2014-03-14 2022-09-11 瑞士商諾華公司 針對lag-3之抗體分子及其用途
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
US11390921B2 (en) 2014-04-01 2022-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs)
KR102541849B1 (ko) 2014-09-15 2023-06-09 에이비비트로, 엘엘씨 고-처리량 뉴클레오티드 라이브러리 서열결정
WO2016069886A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Adaptive Biotechnologies Corporation Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
EP3498866A1 (en) 2014-11-25 2019-06-19 Adaptive Biotechnologies Corp. Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing
GB201500374D0 (en) 2015-01-09 2015-02-25 Immutep S A Combined preparations for the treatment of cancer
AU2016222788B2 (en) 2015-02-24 2022-03-31 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing
AU2016242967B2 (en) 2015-04-01 2021-07-01 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible T cell receptors specific for an antigenic target
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0570027B1 (en) 1984-03-01 1999-12-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell receptor-specific for antigen polypeptides and related polynucleotides
US4786590A (en) * 1985-01-15 1988-11-22 California Institute Of Technology Diagnostic and therapeutic aspects of receptor-mediated leukemogenesis
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4886743A (en) * 1985-04-24 1989-12-12 California Institute Of Technology Diagnostic reagents based on unique sequences within the variable region of the T cell receptor and uses thereof
US4743679A (en) 1986-02-24 1988-05-10 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
US6194561B1 (en) 1986-03-13 2001-02-27 Roche Molecular Systems, Inc. Characterization and detection of sequences associated with autoimmune diseases
US4892827A (en) * 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
JPH02441A (ja) * 1986-11-19 1990-01-05 Mitsui Toatsu Chem Inc 遺伝子複合体及びこれを用いる診断法
US5447839A (en) 1988-09-09 1995-09-05 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction
US5296351A (en) * 1988-10-20 1994-03-22 Alexander A. Morley Method for diagnosis of monoclonality in leukaemia and lymphoma
US5223426A (en) * 1988-12-15 1993-06-29 T Cell Sciences, Inc. Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t-cell antigen receptor
US5043272A (en) 1989-04-27 1991-08-27 Life Technologies, Incorporated Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers
AU660660B2 (en) 1991-02-08 1995-07-06 Roussel-Uclaf Nucleotide sequences coding for alpha chain variable regions in human lymphocyte receptors and applications thereof
JPH06502997A (ja) * 1991-02-12 1994-04-07 ルセル　ユクラフ ヒトＴリンパ球レセプターのβ鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列対応するペプチドセグメント並びに診断及び治療への利用
US6084087A (en) 1991-09-27 2000-07-04 New York Society For The Ruptured And Crippled Maintaing The Hospital For Special Surgery DNA encoding conserved T-cell receptor sequences

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