CA2079881C - Sequences nucleotidiques codant pour des regions variables de chaines .beta. des recepteurs des lymphocytes t humains, segments peptidiques correspondants et les applications diagnostiques et therapeutiques - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouvelles séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes .beta. des récepteurs des lymphocytes T humains, les segments peptidiques correspondant s et les applications diagnostiques et thérapeuti- ques.

Description

Séauences nucléotidiaues codant pour des régions variables de chaînes B des récetpteurs des lymbhocytes Thumains , segments peotidiaues corresuondants et les apolications diagnostiques et thérapeutiques.

La présente invention concerne de nouvelles séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaines p des récepteurs des cellules T, les segments peptidiques cor-respondants et les applications diagnostiques et thérapeuti-ques.
Il est connu que les récepteurs reconnaissant les antigè-nes à la surface des lymphocytes T matures (désignés ci-après récepteurs des cellules T) possèdent une structure ayant une certaine analogie avec celles des immunoglobulines.,Ainsi, ils comprennent des structures hétérodimériques comportant des chaînes glycoprotéiques cz et p.ou des chaînes glycoprotéiques y et 6 (voir Meuer et al. (1), Moingeon et al. (2), Brenner et al. (3), Bank et al. (4)).
Le répertoire des récepteurs des cellules T doit pouvoir faire face à l'immense diversité des déterminants antigéni-ques. Ceci est obtenu par recombinaison génétique des diffé-rents segments discontinus des gènes qui codent pour les différentes régions structurales des récepteurs des cellules T. Ainsi, les gènes comprennent des segments V (segments variables), éventuellement des segments D (segments de diver-sité), des segments J (segments de jonction) et des segments C
(segments constants). Pendant la différenciation des cellules T, des gènes spécifiques sont créés par recombinaison des segments V, D et J pour les locus p et 6 et des segments V et J pour les locus a et p. Ces combinaisons spécifiques ainsi que l'appariement des deux chaînes créent la diversité combi-natoire. Cette diversité est fortement amplifiée par deux mécanismes supplémentaires, à savoir la réunion imprécise des segments V-D-J ou V-J et l'addition de nucléotides correspon-dant à la région N (Davis et al. (5)).
On connaît déjà un certain nombre de segments géniques V.
Ces segments ont été groupés en sous-familles en fonction de

2 la similarité des séquences. Par définition, les segments qui présentent plus de 75 % de similarité dans la séquence nucléo-tidique ont été considérés comme des membres de la même sous famille (Crews et al. 6)). Actuellement, on connaft environ 60 segments géniques Vp distincts (Wilson et al. (7), Robinson (8), Leider et al. (9), Li et al. (11) qui ont été classés en 20 sous-familles dont 7 avec un seul membre (voir Wilson et al. déjà cité).
On a par ailleurs décrit récemment dans WO 90/06758 des anticorps monoclonaux dirigés contre des segments spécifiques des parties variables des récepteurs des cellules T, notamment des chaines p et 6. Ces anticorps monoclonaux sont utiles non seulement comme outils de diagnostic mais également comme outils thérapeutiques, par exemple vis-à-vis de l'arthrite rhumatoïde.
On a également décrit l'utilisation de peptides synthéti-ques correspondant à des régions variables des chaînes a ou p dans le traitement des maladies auto-immunes (27 et 28).
Il est par ailleurs connu qu'il existe des variations d'un individu à un autre dans l'expression des différents segments variables du récepteur T chez l'homme (27 et 28).
La présente invention vise à enrichir le répertoire des segments géniques codant pour des régions variables des chai-nes 0 des récepteurs des cellules T en fournissant de nouveaux segments géniques VQ appartenant à des nouvelles sous familles ou appartenant à des sous-familles dont on connaît déjà au moins un membre.
La présente invention a ainsi pour objet des séquences nucléotidiques codant poùr des régions variables de chaines p des récepteurs des lymphocytes T humains, correspondant à des ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vp correspondant à l'une des séquences SEQ ID N' 2 à 19, et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.

2a Plus spécifiquement, la présente invention concerne une séquence nucléotidique codant pour une région variable de chaînes R de récepteur des lymphocytes T humains, correspondant à un ADNc comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID No 15, et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.

La présente invention a plus particulièrement pour objet des séquences codant pour des régions variables des chaines Q
des récepteurs des lymphocytes T humains, correspondant à des ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi

3 2a'8, 19 8 8 1 l'un quelconque des segments Vp correspondant à l'une des séquences SEQ ID N 2 à 5, et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.
Par l'expression "et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides", on englobe les allèles qui présentent jusqu'à 8 nucléotides de différence, mais le plus souvent 1 ou 2 nucléotides de différence, ou qui peuvent différer par la délétion ou l'addition d'un ou deux codons.
La présente invention a également plus particulièrement pour objet - des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes p des récepteurs des lymphocytes T hu-mains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments VQ correspondant à l'une des séquences SEQ ID N' 2 à 5, et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides, - des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes p des récepteurs des lymphocytes T hu-mains correspondant à des ADNc correspondant à l'une des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vp correspondant à l'une des séquences SEQ ID N' 6 à
15, les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides et les fragments de celles-ci, notamment les fragments des séquences qui correspondent à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vp correspondant à l'une des séquences 1 à 155 de SEQ ID N' 8 1 à 125 de SEQ ID N' 9 1 à 111 de SEQ ID N' 10, et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides, - des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes p des récepteurs des lymphocytes T
humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quel-conque des segments Vp correspondant à l'une des séquences 1 à 195 de SEQ ID N 16 1 à 99 de SEQ ID N 17 WO 92/13950 ~.~ PCT/FR92/00130 ~, fî èJ l' 4 1 à 113 de SEQ ID N 18 1 à 186 de SEQ ID N 19, et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.
Par l'expression "séquences nucléotidiques correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques", on désigne aussi bien les séquences complètes que des fragments de ces séquences, y compris des fragments courts qui trouvent des applications en tant que sondes (géné-ralement comportant au moins 10 nucléotides) ou en tant qu'amorce (comportant généralement au moins 15 nucléotides).
La présente invention englobe d'une manière générale l'ensem-ble des nouveaux oligonucléotides qui sont des fragments des séquences Vp selon l'invention.
Quant aux séquences qui diffèrent par un ou deux nucléo-tides, elles correspondent à des variations que l'on a observé
expérimentalement lors de la détermination de la séquence nucléotidique de plusieurs ADNc.
La présente invention a également pour objet les peptides codés par des séquences nucléotidiques selon l'invention ainsi que les allèles et les dérivés de ceux-ci qui possèdent la même fonction.
D'une manière générale, la présente invention englobe les peptides constitués par ou comprenant une séquence peptidique codée par les séquences nucléotidiques selon l'invention ainsi que les fragments de ces peptides. Elle englobe également les peptides qui diffèrent de ceux-ci d'un ou plusieurs aminoacides et qui possèdent la même fonction. Ces peptides peuvent correspondre à des modifications telles que celles connues avec les mutéines ou à des variations allèliques. il a en effet été montré en particulier que certains segments géniques codant pour des régions variables de chaînes du récepteur T chez l'homme.étaient soumis à un phénomène de polymorphisme génétique appelé variation allèlique (29). La présente invention englobe les peptides provenant de ce phénomène.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont été
obtenues selon les étapes suivantes :
- isolement des ARN de lymphocytes périphériques d'un individu - obtention de l'ADN complémentaire à l'aide de reverse transcriptase et d'une amorce A spécifique de la région CQ
(SEQ ID N' 20) ;
- amplification génique (par Anchored Polymerase Chain Reaction ou A-PCR) à l'aide d'une ADN polymérase, d'une amorce poly'C (SEQ ID N' 21) et d'une amorce B spécifique de la région Co (SEQ ID N' 22) ;
- nouvelle amplification par A-PCR à l'aide de ADN poly-mérase et d'une amorce C spécifique de la région Co (SEQ ID N' 23) ;
- insertion dans un vecteur plasmidique - transformation d'un hote bactérien avec le vecteur recombinant ;
- criblage des colonies bactériennes recombinantes avec un oligonucléotide D spécifique de CQ (SEQ ID N' 24) marqué ;
- extraction des plasmides des colonies positives, - et séquençage des fragments d'ADN contenant la région C'a.
La présente invention peut être reproduite notamment par amplification génique bispécifique (polymerase chain reaction ou PCR) en partant de lymphocytes périphériques exprimant les ARNm incluant les segments p variables ou jonctionnels correspondant aux séquences ID N' 2 à 19 de l'invention ou alternativement en appliquant cette technique de PCR à de l'ADN génomique de toute cellule somatique d'un individu pris au hasard. L'invention peut aussi bien être reproduite en préparant les séquences géniques ci-dessus par synthèse chimique d'oligonucléotides.
Les peptides selon l'invention peuvent être obtenus par synthèse peptidique classique. Ils peuvent être également obtenus par application des techniques connues de génie géné-tique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour un peptide selon l'invention dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression.
La présente invention a donc également pour objet des plasmides et des vecteurs d'expression comprenant une séquence d'ADN codant pour un peptide selon l'invention ainsi que hotes transformés avec ce vecteur.
La présente invention a également pour objet des anti-corps et notamment des anticorps monoclonaux, dirigés contre un déterminant antigénique appartenant à ou comprenant un peptide selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par toutes les techniques qui permettent la production de molécules d'anticorps à partir de culture de lignée cellulaire. Ces techniques comprennent les différentes techniques utilisant des hybridomes.
La production d'anticorps peut être obtenue chez l'animal par immunisation des animaux par injection des peptides ou des fragments selon l'invention, qu'ils soient naturels, recombi-nants ou synthétiques, éventuellement après couplage à un agent immunogène tel que l'anatoxine tétanique, ou encore par injection de lymphocytes T humains exprimant les séquences correspondantes à leur surface, y compris des cellules recom-binantes transfectées avec les séquences codantes correspon-dantes.
La présente invention a également pour objet des hybri-domes produisant des anticorps monoclonaux dirigés contre les polypeptides selon l'invention.
La présente invention englobe également les fragments et les dérivés d'anticorps monoclonaux selon l'invention qui sont réactifs avec des régions variables définies des récepteurs des cellules T. Ces fragments sont notamment les fragments F(ab')2 qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la pepsine, les fragments Fab' qui peuvent être obtenus par réduction des ponts disulfure des fragments F(ab')2 et les fragments Fab qui peuvent être obte-nus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la papaïne en présence d'un agent réducteur. Les fragments peu-vent être également obtenus par génie génétique.
Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont par exemple des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liés des marqueurs tel qu'un radioisotope. Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont également des anticorps ~
2 ~ . ~0 ~ ~.
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ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liées des molécules thérapeutiquement actives, notamment des composés cytotoxiques.
Les produits de l'invention trouvent plusieurs types d'application dans le domaine du diagnostic et dans le domaine de la thérapeutique.

1- Les applications dans le domaine du diagnostic Les oligonucléotides contenus dans les séquences nucléo-tidiques selon l'invention peuvent être utilisés pour consti-tuer des sondes de détection (généralement au moins 10 nucléo-tides) capables de s'hybrider à une région variable d'une chaîne P ou des amorces pour l'amplification d'ADN (comportant généralement au moins 15 nucléotides et de préférence au moins 17 nucléotides) capables de se lier à une séquence à
amplifier.
Les oligonucléotides trouvent ainsi une application dans le diagnostic des désordres immunitaires en détectant la présence de séquences d'acides nucléiques homologues d'un gène codant pour des régions variables de chaînes p des récepteurs des cellules T dans l'ARNm d'un échantillon d'un patient.
Différentes méthodes peuvent être utilisées pour établir un lien entre l'expression des gènes des cellules T et une maladie. Ces méthodes comprennent a-'la production et l'analyse de banques d'expressions d'ADNc obtenu à partir de cellules T liées à la maladie pour déterminer la fréquence de gènes dominants b - l'analyse d'échantillons d'ADN génomique par Southern blot pour déterminer s'il existe des polymorphismes génétiques ou des réarrangements des gènes codant pour les récepteurs des cellules T ;
c - l'analyse d'échantillons par obtention d'ADNc, âmpli-fication par PCR et hybridation avec des sondes marquées d - l'hybridation in situ de cellules T sans culture préalable des cellules T.
Les amorces trouvent une application dans des réactions de PCR dans une méthode telle que celle définie sous c.
Les anticorps monoclonaux, les fragments ou les dérivés J C~ 8 de ces anticorps selon l'invention peuvent être utilisés pour étudier des réponses immunitaires de type T, par exemple dans le domaine des maladies auto-immunes de la cancérologie, de l'allergie, de la transplantation et des maladies infec-tieuses. En particulier, le répertoire des différents segments variables Q du récepteur T peut être étudié, qu'il s'agisse de cellules T du sang ou des tissus. D'une manière générale, les techniques utilisées peuvent être des méthodes in vitro ou in vivo.
Dans les méthodes in vitro, les échantillons utilisés peuvent être des échantillons de fluides corporels ou des échantillons de tissus. Les techniques utilisées peuvent inclure notamment la cytofluorimétrie de flux pour analyser les lymphocytes T du sang, ou des marquages par immunopéroxy-dase sur coupe anatomopatho-logique pour étudier les lympho-cytes infiltrant les tissus.
Dans les méthodes in vivo, les anticorps, leurs fragments ou leurs dérivés sont administrés par les voies habituelles, par exemple par la voie intraveineuse, et l'on détecte les liaisons immunospécifiques. Ceci peut être obtenu pa,F exemple dans le cas où l'on utilise un anticorps marqué par un radio-isotope.

2 Les applications dans le domaine thérapeutique Les oligonucléotides contenus dans les séquences nucléo-tidiques selon l'invention peuvent être utilisés en thérapeu-tique comme oligonucléotides antisens. On sait en effet qu'il est possible in vitro d'inhiber l'expression d'un gène trans-crit dans des lymphocytes humains en incubant ces lymphocytes avec un olignoculéotide antisens spécifique du gène en ques-tion (30). Ces oligonucléotides antisens comprennent générale-ment au moins 10 et de préférence au moins 16 nucléotides. Ces oligonucléotides antisens peuvent être notamment les séquences inversées et complémentées correspondant aux 20 nucléotides en amont du site d'inititation de la traduction (ATG). L'intérêt d'une utilisation in vitro d'oligonucléotides antisens spéci-fique d'un segment génique Vp est d'abolir (ou de diminuer ,, .

fortement) l'expression d'un récepteur T compfeTlantcésegment Vp et donc d'obtenir un phénomène de délétion clonale au niveau de la réactivité spécifique des lymphocytes T. Les oligonucléotides antisens peuvent non seulement être utilisés in vitro sur des lymphocytes T humains qui sont ensuite réin-jectés, mais également in vivo par injection locale ou systé-mique de préférence après modification pour augmenter la stabilité in vivo et la pénétration à l'intérieur des lympho-cytes de ces oligonucléotides.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être utilisés pour moduler le système immunitaire. C'est ainsi que les anticorps peuvent être administrés pour bloquer l'inter-action des cellules T effectrices avec leur antigène spécifi-que. On peut également administrer des anticorps anti-récep-teurs T liés par exemple à une molécule cytotoxique ou à un radioisotope de façon à obtenir une délétion clonale, grâce à
la fixation spécifique sur une chaîne p d'un récepteur de cellule T. Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être utilisés en thérapeutique à des concentrations faiblement mitogéniques de façon à activer de façon spécifique certains sous-ensembles de cellules T ou peuvent être utilisés à des concentrations beaucoup plus élevées pour se fixer aux récep-teurs concernés et ainsi marquer ces sous-ensembles en vue de leur élimination par le système réticulo-endothélial. Un critère important pour le traitement d'une maladie est l'apti-tude à moduler des sous-ensembles de cellules T liées à une maladie. La nature exacte de cette modulation thérapeutique, à
savoir bloquer ou supprimer un sous-ensemble particulier de cellules T ou au contraire stimuler et activer un sous-ensemble particulier, dépendra de la maladie en question et du sous-ensemble spécifique de cellules T concerné.
Ce type de traitement présente un avantage par rapport aux traitements actuels utilisant des anticorps tels que le traitement par des anticorps anti CD3 chez des patients ayant subi une transplantation rénale et ayant un problème de rejet, étant donné que grâce à l'invention il n'y aura pas de modula-tion de la totalité de la population des cellules T mais seulement du sous-ensemble de cellules T exprimant la sous-famille particulière de récepteurs de cellules T.
Par ailleurs, la réponse des cellules T étant souvent oligoclonale, il convient généralement d'utiliser en thérapeu-tique des "cocktails" de plusieurs anticorps.
5 On peut en outre utiliser les anticorps anti V/3 pour sélectionner in vitro des lymphocytes T, par exemple par passage sur une colonne contenant des billes portant l'anti-_ corps. Cette séparation de certains lymphocytes T peut être utilisée en vue d'une mise en culture de ces lymphocytes avant 10 de les réinjecter au patient.
En outre, on peut utiliser en thérapeutique tout ou partie des séquences peptidiques selon l'invention, c'est-à-dire les séquences peptidiques codées par les séquences nucléotidiques selon l'invention ou les fragments de ces séquences (comprenant généralement au moins 8 à 10 amino-acides). Ces séquences ou fragments administrés à l'homme ou à
l'animal, peuvent agir en tant que leurre, c'est-à-dire qu'ils vont se fixer sur l'épitope porté par l'antigène néfaste et empêcher la réaction des cellules T normales avec l'antigène, en empêchant ainsi le développement d'une maladie agressive contre les déterminants du soi. Ils peuvent aussi être uti-lisés en tant qu'immunogènes dans la fabrication de vaccins (éventuellement après couplage à des porteurs protéiques).
On décrira ci-après plus en détail la présente invention, en se reportant aux Fig. annexées sur lesquelles :
- les Fig. 1 à 6 donnent en alignement à la fois des séquences Vp connues et des séquences partielles des nouvelles séquences selon l'invention (SEQ ID N' 6 à 19), notées IGRa 08 à IGRa 20 appartenent à des sous-familles Vp connues. Sur ces Figures, la numérotation des nucléotides commence au codon ATG
d'initiation (qui est souligné). Les points indiquent les nucléotides identiques. Les séquences qui sont supposées être des séquences leader sont surlignées.
- La Fig. 7 donne les analyses par Southern blot de l'ADN
génomique traité par une enzyme de restriction en utilisant des sondes spécifiques des sous-familles Vp. Les enzymes de restriction utilisées sont EcoR I (colonne R), Hind III
(colonne H) et BamH I (colonne B). Sur cette Figure, les il 2079881 triangles marquent les positions des fragments d'ADN
s'hybridant de façon spécifique avec Cg.
- La Fig. 8 représente la détection par autoradiographie des transcrits amplifiés des chaînes Q du TCR exprimé par les lymphocytes périphériques d'un individu sain, et du contrôle 0-actine co-amplifié.
- La Fig. 9 représente l'analyse par cytofluorimétrie de la réactivité de l'anticorps monoclonal RO-73 respectivement vis-à-vis du clone immunisant 3025 (9A), du clone 12410 (9B) et des lymphocytes circulants (9C).
La réactivité-témoin des anticorps NKTa ou OKT3 est donnée respectivement pour chaque type de cellule.
Le nombre de cellules comptées (échelle linéaire) est donné en fonction de.l'intensité de la fluorescence (échelle logarithmique).
- La Fig. 10 représente l'analyse par cytofluorimétrie de la réactivité de l'anticorps monoclonal JtJ-74 (Fig. 10A, 10B, 10C : mêmes conditions que pour les Fig. 9A, 9B, 9C).
- La Fig. 11 représente l'analyse par cytofluorimétrie de la comodulation avec la molécule CD3 de la structure TCR du clone 3025 reconnue par l'anticorps monoclonal RO-73 respecti-vement en absence (Fig. 11A) ou en présence d'anticorps anti-CD3 (Fig. 11B).
La comodulation-témoin est donnée respectivement avec les anticorps monoclonaux NKTa, OKT3 et anti-CD2.
- La Fig. 12 représente l'analyse par cytofluo-rimétrie de la comodulation avec la molécule CD3 de la structure TCR du clône 3025 reconnue par l'anticorps monoclonal JU-73, respec-tivement en absence (Fig. 12A) ou en présence d'anticorps anti-CD3 (Fig. 12B).
- La Fig. 13 représente la détection par autoradiographie des transcrits amplifiés des chaînes a (Fig. 13A) et des chaînes Q(Fig. 13B) du TCR exprimé par les cellules RO-73+.

I- Obtention de 18ADNc et amnlificatiar. par PCR

On a utilisé comme source d'ARN des lymphocytes périphé-riques d'un individu. L'ARN total a été préparé selon la :. 12 méthode à l'isothiocyanate de guanidinium et au chlorure de césium (Chirgwin (12)) ou selon la méthode en une seule étape par extraction avec de l'isothiocyanate de guanidinium, du phénol et du chloroforme (Chomczynski (13)).
Le premier brin d'ADNc a été synthétisé dans un volume final de 50 microlitres à une températur'e de 42= C pendant 1 heure en utilisant 5 microgrammes d'ARN total, la reverse transcriptase et une amorce A spécifique de la région Cp constituée par la séquence 5'-TATCTGGAGTCA TTGAGGGCGGGC (SEQ
ID N' 20). Ce matériau a été ensuite purifié par extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l'acétate d'ammonium.
Après sélection d'une fraction 0,45/1 kb sur gel d'agarose, on a réalisé l'addition d'une extrémité dG sur l'hétéro duplex ARN/ADNc dans un tampon d'addition COC12 avec 14 unités de terminal désoxynucléotidyl transférase (Tdt) pendant 30 mn à
37' C. La réaction a été stoppée par maintien à 70 C pendant 10 mn. NaOH 1N (1/3 de volume) a été ajouté et l'échantillon a été mis à incuber à 50' C pendant 1 heure pour hydrolyser l'ARN puis a été neutralisé avec du Tris HCl 2M pH 8 et HC1 1N. Après extraction par un mélange phénol/ chloroforme le premier brin d'ADNc à extrémité G a été précipité avec de l'éthanol et soumis à une amplification en utilisant la tech-nique PCR (Polymerase Chain Reaction décrite par Saiki et al.
(14)) dans un volume final de 100 microlitres contenant 50 mM
de KC1, 10 mM de Tris-Cl pH 8.3, 1,5 mM de MgC12, 0,1 %
(poids/ volume) de gélatine, 200 micromoles de dNTP, 2,5 unités de Taq polymérase et 100 picomoles de deux amorces. Les deux amorces utilisées sont, d'une part, une amorce poly-C
(5'-GCATGCGCGCGGCC GCGGAGG-14C) (SEQ ID N' 21) décrite par Loh et al. (15) ainsi qu'une amorce B spécifique de la région Cp (5'-TGTGGCCAGGCATGCCAGTGTGGCC) (SEQ ID N' 22).
On effectue 25 cycles=d'amplification suivis par une période de 15 mn d'élongation finale à 72' C. Chaque cycle comprend une étape de dénaturation à 92' C pendant 1 minute, une étape d'hybridation à 55' C pendânt 2 mn et une période d'élongation à 72' C pendant 4 mn. Les produits amplifiés sont ensuite précipités par de l'éthanol, remis en suspension dans de l'acétate de sodium 30 mM pH5, NaCl 50 mM, ZnC12 1 mM, glycérol 5 % en volume, et 1/10 de ce matériau est purifié en fonction de la taille sur un gel d'agarose à bas point de fusion 1 %.
Une seconde phase d'amplification est ensuite réalisée directement sur approximativement 10 # de la bande contenant l'agarose en suivant les mêmes conditions que précédemment, sauf qu'on utilise comme amorce C spécifïque de la région Cp l'amorce 5'-GGTGTGGGAGAA TTCTGCTTCTGA (SEQ ID N 23). Le mélange de réaction est ensuite précipité par l'éthanol et remis en suspension dans 60 l H20.
II - Clonage et sé ençaqe des ADNç

1/3 du produit de la seconde amplification est mis à
digérer avec Sac II, séparé sur gel d'agarose 1 % et purifié
par adsorption sur des billes de verre. Le matériau est inséré
dans le vecteur Bluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, U.S.A.) et les recombinants obtenus sont utilisés pour transformer des souches XL1-bleu de E. Coli (Stratagene). Après dépôt en présence de X-gal et IPTG, on fait un test sur les colonies blanches en utilisant une technique "dot blot" et comme sonde un troisième oligonucléotide spécifï.que de la région CO
(5'-TCTGCTTCT GATGGCTCAA) (SEQ ID N' 24) marqué au 32 P. On extrait l'ADN plasmidique des colonies positives et on séquence sur les deux brins par le procédé par terminaison de chaîne didésoxy (Sanger et al. (16)) avec de la Sequenase*2,0 (United States Biochemicals, Cleveland, Etats-Unis) en suivant les recommandations du fournisseur.
Les séquences obtenues ont été comparées aux séquences publiées Vp en utilisant la méthode développée par Lipman et Pearson (17). Les codons de départ présumés ont été identifiés en recherchant la présence de la séquence consensus Kozak pour les sites d'initiation des traductions dans les cellules eucaryotes (Kozak (18)). La présence de séquences leader hydrophobes du côté N-terminal a été décelée par analyse de l'hydrophobicité selon la méthode décrite par Kyte (19).

* (marque de commerce) III - Analyse flar Southern blot L'ADN a été extrait de la lignée cellulaire érythroleucé-mique humaine K562 et mis à digérer avec l'une des enzymes de restriction suivantes : Eco RI, BamH I ou Hind III. L'ADN (15 microgrammes) a été soumis à une électrophorèse sur agarose 0,7 % et a été transféré sur des membranes de Nylon comme décrit par Triebel et al. (20). Les hybridations ont été
réalisées à 65' C avec 6 x SSC, 0,5 % de SDS, 5 x Denhardt's et 100 microgrammes d'ADN de sperme de saumon dénaturé pendant 16 heures. Les membranes ontaété lavées à 65 C avec 2 x SSC, 0,2 % de SDS.
On a utilisé comme sondes Vp spécifiques des sondes obtenues par amplification d'ADNc V-J-C en utilisant comme amorce l'amorce poly-C et l'amorce C. Les sondes ont été
purifiées sur gel d'agarose 1 %. Des sondes d'ADN marquées au 32P ont été préparées à partir des fragments purifiés sur agarose par la méthode de Feinberg (21).

IV - Résultats En utilisant la méthode A-PCR, 350 ADNc qui hybrident avec la sonde CJ3 ont été clonés, puis séquencés. Parmi ceux-ci, 226 ADNc correspondent à des régions variables V-J-Cp uniques.
Les séquences Vp de l'invention figurent dans la liste des séquences sous les SEQ ID N' 2 à 19. Les séquences SEQ ID
N' 3 à 5 correspondent à 3 sous familles nouvelles tandis que les séquences SEQ ID N' 2 et 6 à 19 correspondent à de nouveaux membres de sous-familles Vp connues ou à des exten-sions de segments Vp connus.

Sous-famille VQ w21 (SEQ ID N= 2) Cette sous-famille a été identifiée par le clone IGR b02 (SEQ ID N' 2).
Cette séquence présente pour la partie codante une homo-logie d'environ 85 ô avec la séquence HSTCRB23 (Wilson et al.
(41) ) .

correspondant à ces différentes sous-familles Vp, en vue par exemple d'une étude de l'expression de certaines sous-familles Vp chez un patient et finalement d'un diagnostic des désordres inmmunitaires, comme indiqué plus haut.
L'expression prédominante de certaines sous-familles de Vp a déjà été étudiée à l'aide d'une gamme incomplète d'oligo-nucléotides.
Ainsi, Sottini et al. (33) ont mis en évidence à l'aide d'une gamme d'oligonucléotides une expression prédominante de certains Vo chez des patients atteints d'arthrite rhumatoïde.
De même, Choi Y. et al (32) ont mis en évidence à l'aide d'une gamme d'oligonucléotides la stimulation de lymphocytes T
par des toxines deStaphylococcus aureus par l'intermédiaire de Vo spécifiques.
La présente invention vise à fournir une gamme complète d'oligonucléotides permettant l'étude à la fois des sous-familles Vp connues et des nouvelles sous- familles VQ
de l'invention et qui soient tout-à-fait spécifiques de chaque sous-famille. Les oligonucléotides ont donc été choisis et synthétisés dans ce but et au besoin des modifications de un ou deux nucléotides ont été introduites par rapport aux séquences naturelles pour réduire les réactivités croisées entre sous-familles.
La présente invention a ainsi également pour objet des oligonucléotides, utilisables comme amorces pour l'amplifica-tion d'ADN correspondant à des régions variables de chafnes des récepteurs de cellules T, choisis parmi les séquences SEQ
ID N' 25 à 48.
La présente invention a également pour objet l'utilisa-tion, comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à
des régions variables de chaînes des récepteurs des cellules T, d'oligônucléotides choisis parmi les séquences SEQ ID N' 25 à 48.
La présente invention a également pour objet un procédé
de détection de séquences nucléotidiques codant pour des segments Vp des récepteurs T ou d'ADNc correspondant aux produits de transcription de celles-ci, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend WO 92/13950 PC.T/FR92/00130 17 2~ 1 ~VC i Sous-famille V/3 13 (Fig. 4) SEQ ID N 13, 14 et 15 (IGR b14, IGR b15 et IGR b16) Les séquences SEQ ID N 13 et 14 qui représentent de nouveaux membres présentent une homologie respectivement de 78 à 91 % et de 77 à 79 % avec les autres séquences connues HBVP34 (Kimura (23)) et CEM (Duby (26)).

La séquence SEQ ID N 15 présente une homologie de 94 %
avec HBVP34. Il est à noter que la séquence SEQ ID N 15 présente un intron (représenté en caractères minuscules) dans la région leader. La séquence SEQ ID N' 15 est une séquence consensus. On a observé en position 231 un C au lieu d'un T et en position 259 un A au lieu d'un G.
Sous-famille Vp 7 (Fig. 5) SEQ ID N 16 et 17 (IGR b17 et IGR b18) Ces séquences présentent une forte homologie avec la séquence PL4.19 tronquée (Concannon, déjà cité) et la prolon-gent du côté 5' jusqu'au signal de début de la traduction.
SEQ ID N' 18 (IGR b19) Cette sécjuence prolonge la séquence PL4.9 (Concannon, déjà cité) du côté 5' jusqu'au signal de début de la traduction.

Sous-famille Vp 9 (Fig. 6) SEQ ID N' 19 (IGR b20) Cette séquence prolonge la séquence PL2.6 (Concannon, déjà cité) du côté 5'. on'observe une différence entre les deux séquences aux positions 98 et 100 correspondant à des aminoacides différents.
La présente invention vise également à fournir des oligo-nucléotides spécifiques des différentes sous-familles VQ, qui sont utilisables comme amorces pour l'amplification d'ADN

a Sous-famille VQ w22 (SEQ ID N' 3) Le segment SEQ ID N 3 a été défini comme séquence consensus à partir de 23 clones distincts d'ADNc. On a observé
en position 322 un C au lieu d'un T et en position 350 un A au lieu d'un G.

Sous-famille VQ w23 (SEQ ID N= 4) Le segment ID N' 4 a été défini comme séquence consensus à partir de 4 clones distincts. On a observé en position 154 un G au lieu d'un A et en position 160 un A au lieu d'un G. Il présente une homologie de 75,7 % avec la séquence VB12A1 (Leiden déjà cité) mais présente une homologie inférieure à
75 % avec les autres membres de la sous-famille VQ 5 (repré-sentés sur la Fig. 1). Il ne fait donc pas partie de la sous-famille VQ 5.

Sous-famille Vp w24 (SEQ ID N' 5) Le segment SEQ ID N' 5 a été défini à partir de 2 clones distincts d'ADNc.
Les analyses par Southern blot d'ADN de lignée germinale soumis à une digestion par les endonucléases, en utilisant des sondes V-J-Cp comprenant des fragments Vp correspondant aux sous-familles Vp w21 à Vp w24 ont été réalisées dans des conditions d'hybridation de "faible stringence" pour identi-fier le nombre de segments géniques Vp appartenant à chaque famille et pour caractériser des fragments de restriction d'ADN portant ces segments géniques Vp. Des résultats repré-sentatifs sont reportés sur la Figure 7.
Ces analyses sont compatibles avec la présence dans les cellules érythroleucémiques K 562 d'au moins trois segments géniques pour la sous-famille V w21, deux pour la sous-famille Vp w23 et un pour les sous-familles Vp w22 et Vp w24.
Les tailles des fragments de restriction de l'ADN
germinal sont les suivantes :
Vp w21 : EcoR I 1,7-,3- et 6,5 kb, Hind III 2,5-, 7,2-, 11,7-, 14- et 18 kb, BamH 1 5,5-, 16,5- et 23 kb;

WO 92/13950 2 0'~ ~ ~ 8,L PCT/FR92/00130 V,B w22 ; EcoR I 2,8 kb, Hind III 8,8 kb, BamH I 5,3 kb;
V,6 w23 : EcoR I 3,2- et 4,4 kb, Hind III 7,4-,15,5- et 16,5 kb, BamH I 2,5- et 5,7 kb ;
Vo w24 : EcoR I 8 kb, Hind III 20 kb et 7,3 kb, BamH I 11,- et 22 kb.

Sous-famille VQ 5 (Fig. 1) :

SEQ ID N' 6 et 7 (IGR b06 et IGR b07) Ces séquences présentent une homologie respectivement de 79 à 86 % et de 76 à 70 % avec les 4 segments précédemment connus VB12A1 (Leiden déjà cité), HBP51 (Kimura (23)), PH24 (Tillinghast déjà cité) et PL25 (Concannon (24)) et représen-tent de nouveaux membres.
SEQ ID N 8 et 9 (IGR b08 et IGR b09) Ces séquences correspondent à des extensions du côté 5' des clones VB12A1 et PL25 respectivement. Pour SEQ ID N' 8 deux substitutions de nucléotides sont observées par rapport à
VB12A1.

Sous-famille VQ 6 (Fig. 2) SEQ ID N' 10 (IGR bll) Cette séquence correspond à une extension du côté 5' du clone HBP25 (Kimura, déjà cité).

SEQ ID N' 11 (IGR b12) Cette séquence qui représente un nouveau membre présente une homologie des nucléotides de 94 % avec PH 16 (Tillinghast, déjà cité), GPPA (Li, déjà cité) et HT45 (Kimura (25)).

Sous-famille Vp 12 (Fig. 3) :
-35 SEQ ID N' 12 (IGR bl3), Cette séquence qui représente un nouveau membre corres-pond à plus de 85 % d'homologie avec les séquences PH27 (Tillinghast, déjà cité) et PL42 (Concannon, déjà cité).

WO 92/13950 PCI'/FR92/00130 19 20 7 9 I31 8; 1.
a) l'amplification de l'ADN avec au moins une paire d'amorces formée par l'un des oligonucléotides définis ci-dessus et un oligonucléotide appartenant au segment Cp, et b) la détection des séquences amplifiées avec une sonde CQ.
L'oligonucléotide appartenant un segment Cp utilisé
pour l'amplification peut être notamment choisi parmi les séquences SEQ ID N 49 et 50.
Pour contrôler l'efficacité de l'amplification, on opère avantageusement en présence d'une paire d'amorces contrôle et on détecte la séquence contrôle correspondante amplifiée à
l'aide d'une sonde contrôle correspondante.
Cette paire d'amorces contrôle peut correspondre à deux segments Ca, par exemple les amorces CaE et CaJ correspondant aux séquences SEQ ID N 55 et 56. On utilise alors une sonde de détection Ca (correspondant par exemple à la séquence SEQ
ID N' 57). Mais cette paire d'amorces est avantageusement constituée par deux amorces appartenant à la p-actine, notam-ment celles correspondant aux séquences SEQ ID N' 52 et 53. On utilise alors une sonde de détection correspondant à une séquence de la /j-actine, telle la séquence SEQ ID N' 54.
La présente invention a également pour objet un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé précédemment défini, qui comprend a) au moins un oligonucléotide choisi parmi les séquences SEQ
ID N' 25 à 48, b) une amorce Cp, c) une sonde Cp.
Un tel kit contient avantageusement en outre d) une paire d'amorces contrôle, e) une sonde contrôle.
Ce kit peut notamment comprendre a) l'ensemble des 24 oligonucléotides correspondant aux séquences SEQ ID N' 25 à 48, b) une amorce Cp choisie parmi les séquences correspondant aux séquences SEQ ID 49 et 50, c) une paire d'amorces contrôle pour la p-actine ayant une séquence correspondant respectivement aux séquences SEQ ID N' 52 et 53, WO 92/13950 ~j ~ ry ~~~j ~ PCT/FR92/00130 (~ ( 20 d) une sonde C/3 correspondant à la séquence SEQ ID N 51, e) une sonde contrôle pour la p-actine correspondant à la séquence SEQ ID N 54.
Dans l'information donnée dans la liste des séquences pour les séquences 25 à 54, les séquences SEQ ID N 25 à 45 correspondent à des séquences appartenant à des clones des sous-familles connues Vp 1 à VQ 20 (accessibles dans la base de données EMBL) ou à des séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides. Les séquences SEQ ID N' 45, 46, 47 et 48 correspondent à des séquences appartenant à des clones de nouvelles sous-familles de l'invention, correspondent à des sous-familles dénommées provisoirement Vp w2l, Vp w22, VQ w23 et VQ w24 (w indiquant que la désignation est dans l'attente d'une désignation définitive).
Les séquences SEQ ID N 49 et 50 sont deux exemples d'oligonucléotides Cp qui peuvent être utilisés comme amorces pour l'amplification.
La séquence SEQ ID N 51 est la séquence d'une sonde CQ
qui peut être utilisée pour la détection des ADN amplifiés.
Enfin, les séquences SEQ ID N 52, 53 et 54 sont respec-tivement les séquences d'une paire d'oligonucléotides appar-tenant à la séquence de la p-actine qui peuvent être utilisés pour le contrôle de l'amplification et la séquence d'une sonde pour détecter les ADN amplifiés correspondants.
Dans la liste des séquences la position indiquée est la position de l'extrémité 5' à compter du site d'initiation prédictif de la traduction ATG. Dans le cas où les séquences sont incomplètes (région 5' inconnue), la position (marquée avec un astérisque) est donnée par rapport au premier nucléo-tide de la séquence. Les nucléotides soulignés correspondent aux mésappariements introduits par rapport à la séquence naturelle.
Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un synthéti-seur d'ADN automatisé Applied Biosystems 381 A en utilisant la méthode au p-cyanoéthylphosphoramidite (Sinha N. et al.
(34)) et en suivant le protocole recommandé par le fabricant.
Les oligonucléotides ont été détritylés dans l'appareil, clivés du support et déprotégés par l'ammoniac (à 60 C

pendant 5 heures). Les produits bruts ont été purifiés par chromatographie haute pression en phase inversée sur une colonne de -bondapak C18*en utilisant un gradient d'acétoni-trile (9 à 15 %) dans un tampon acétate de triéthylammonium 0,01 M à pH 5,5.
L'amplification effectuée en utilisant les amorces selon l'invention peut être notamment la technique d'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) telle que décrite par Saiki et al. (14) et brevets US-A-4 683 195, 4 683 202,

4 889 818.
Pour la PCR, on peut utiliser un ADN double brin que l'on dénature ou un ADNc obtenu à partir d'ARN à l'aide de réverse transcriptase comme mentionné plus haut.
L'agent de polymérisation est une ADN polymérase, notam-ment la Taq polymérase.
Généralement, le cycle d'amplification est répété 25 à 40 fois.
Les sondes que l'on utilise pour la détection des séquences amplifiées peuvent être obtenues par marquage d'oligonucléotides avec un isotope radioactif, ce qui conduit à une détection par autoradiographie, ou par couplage avec une enzyme telle que la peroxydase (système ECL Amersham), la phosphatase alcaline ou la p-galactosidase (système Tropix Ozyme), ce qui conduit à une détection par chimioluminescence.
L'exemple suivant illustre la mise en oeuvre du procédé
de détection selon l'invention.
Les lymphocytes périphériques d'un individu sain ont été
préparés par centrifugation sur un gradient de densité. L'ARN
total a été extrait selon la méthode en une seule étape par extraction avec de l'isothiocyanate de guanidium, du phénol et du chloroforme (Chomczynski, 13). L'ADN complémentaire a été
synthétisé dans un volume final de 20 l à 42 C durant 1 heure en utilisant 1 à 5 g d'ARN total, la réverse transcrip-tase et l'amorce CQ B (1,25 M).
Le matériel obtenu a ensuite été chauffé à 95' C durant 3 minutes avant d'être soumis à une amplification selon la technique PCR en utilisant en parallèle chacune des amorces Vp spécifiques correspondant aux séquences SEQ ID N 25 à 48 et * (marque de commerce) 207Q881. 22 l'amorce Cp B spécifique de la région Cp (SEQ ID N 50).
Cette amplification a été réalisée dans un volume final de 10 l par tube contenant 50 mM de KC1, 10 mM de tris-HC1 pH 8,3, 1,5 mM de MgC12 0,1 % (poids/ volume) de gélatine, 200 M de dNTP, 0,25 unités de Taq polymérase et 0,25 M de chaque amorce. Dans chaque tube, une amplification contrôle a été
réalisée à partir de 25 mM d'un fragment d'ADN de p-actine de 877 paires de bases préparé par PCR et des amorces Act 1 et Act 2 (SEQ ID N' 52 et 53) spécifiques de l'actine. 30 cycles d'amplification ont été effectués suivis d'une étape d'élon-gation finale de 5 minutes à 72 C. Chaque cycle comprenait une étape de dénaturation à 94 C pendant 1 minute, une étape d'hybridation à 65 C pendant 1 minute et une période d'élon-gation à 72 C pendant 1 minute.
Les produits obtenus ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2 %, transférés sur des membranes de nylon dans un tampon alcalin et hybridés simultanément.avec les sondes oligonucléotides CPC (SEQ ID N' 51) et Act 3 (SEQ
ID N= 54) marquées au 32P par l'enzyme polynucléotidyl T4 kinase. L'hybridation a été réalisée à 42 C pendant 16 heures dans un tampon contenant 6 x SSC, 0,5 % SDS, 5 x Denhart's, 0,05 % P04H2Na et 100 g/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. Les membranes ont ensuite été lavées avec du 6 x SSC, 20mM P04H2Na, deux fois à température ambiante pendant 5 minutes et une fois à 50 C pendant 30 minutes puis autoradio-graphiées.
Les résultats obtenus sont indiqués sur la figure 8.
Le contrôle d'actine (bande de 877 paires de bases) permet de vérifier l'amplification dans tous les puits. Il apparaît en-dessous de cette bande un signal spécifique dont la taille correspond à la taille des fragments amplifiés corespondants, chaque fragment ayant une longueur correspon-dant à la distance entre l'emplacement de l'oligonucléotide spécifique Vp et l'amorce Cp.
Chez l'individu testé, la Figure 8 met en évidence l'expression préférentielle de certains segments géniques définis par rapport à d'autres. Par exemple, les sous-familles Vp 1 et 2 sont plus représentées que les autres WO 92/13950 PCr/FR92/00130 23 207(01891.
sous-familles.

Exemple de orécaration d'anticorps monoclonaux anti VQ13 :
anticorps monoclonaux RO-73 et Jû-74 1) Cellules immunisantes Le clone T'3025 (Moebius et al. (35)) a été cultivé en milieu complet comprenant du DMEM (Seromed), 8 % de sérum humain AB, de l'IL-2 et du TCGF comme décrit par Hercend et al. (36). Des restimulations périodiques ont été effectuées sur cellules allogéniques en présence d'IL-2. Les ARN messa-gers codant pour le récepteur T exprimés par ces cellules ont été séquencés par la technique d'A-PCR et représentent des réarrangements des segments géniques ValO (séquence HAP58, Yoshikai et al. (37)) et V/313 (séquence IGRb16=SEQ ID N 15 indiquée ci-dessus).

2) Immunisation des souris Des souris Biozzi de 6 semaines (Institut Curie, Paris, France) ont été immunisées avec les cellules T entières du clone 3025. Après une première injection intrapéritonéale de 5 x 106 cellules en adjuvant complet de Freund, les souris ont reçu trois injections intrapérito-néales de 5 x 106 cellules en adjuvant incomplet de Freund à trois semaines d'intervalle.
Deux semaines après la dernière injection intrapéritonéale, les souris ont reçu 2 x 106 cellules viables en injection intraveineuse. Les souris ont été sacrifiées trois jours plus tard et la rate a été prélevée.

3) Fusion La fusion des cellules spléniques avec le myélome non secrétant NS-1 a été menée selon la méthode de Kohler et Milstein (38). Les cellules NS-1 (Kohler et Milstein (39)) ont été cultivées en milieu comprenant du DMEM (Seromed), de la 8-azaguanine (Sigma, Saint Louis, MI), 10 % de sérum de cheval (Seromed, lot n 5Z04), de la pénicilline et de la strepto-mycine (Eurobio), de la glutamine (Seromed, 200 mM) et du pyruvate de sodium (Gibco, 100 mM).

WO 92/13950 2 ~ ,,~ ~ PCT/FR92/00130 Cl(' 24 Les spénocytes ont été fusionnés avec les cellules NS-1 par le polyéthylène-glycol (PEG 1000, Merck) avec un rapport de 4 cellules spléniques pour une cellule de myélome. Après la fusion, les cellules ont été cultivées à 3 x 106 cellules par ml en plaques de 96 puits (Nunc) dans un milieu de sélection HAT contenant du DMEM, 10 % de sérum de cheval, 10 % de sérum de veau foetal (Seromed, lot n 219195), de l'aminoptérine (Gibco), de l'hypoxanthine et de la thymidine (Gibco), de la pénicilline et de la streptomycine, de la glutamine, du pyru-vate de sodium et du NCTC 109 (Eurobio). Du milieu frais a été
ajouté dans les puits 2 jours (50 Ml par puits) et 9 jours après la fusion (100 l par puits). La culture a été réalisée à 37" C, dans un incubateur contenant 10 % de C02.

4) Criblage des hybridomes Le surnageant des hybridomes obtenus a été récolté 15 jours après la fusion et testé pour sa réacti-vité avec la cellule immunisante par immunofluorescence indirecte et ana-lyse en cytométrie de flux. En bref, les cellules T3025 ont été incubées à 4' C pendant 30 minutes avec le surnageant d'hybridome (100 l pour 300 000 cellules), lavées et marquées avec un anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de souris conjugué à la fluoresceine (Coulter Electronics, Hialeah, FL).
Les cellules ont ensuite été analysées par cytofluorométrie (Coulter Profile). Comme le montrent les figures 9A et 10A, les surnageants des hybridomes RO-73 et JU-74 permettent le marquage de 100 % des cellules du clone immunisant 3025. Un anticorps anti-CD3 (OKT3 Ortho-Co) et l'anticorps anti-clono-type NKTa (IgG1, Hercend et al. (40)) servaient respectivement de contrôles positif et négatif dans cette expérience.

5) Spécificité anti-récepteur T
La spécificité anti-récepteur T des anticorps monoclonaux a été analysée selon les critères suivants :
1 - les anticorps doivent reconnaître le clone T 3025 immunisant mais pas un clone T portant un récepteur des cellules T (TCR) différent, par exemple le clone 12410 (Moebius et al., (35), TCR exprimé : Va3/Va17).

25 2~~~9c"81 2 - Les anticorps doivent réagir avec un faible pourcen-tage de lymphocytes circulants (PBL).
3 - La structure de surface reconnue par les anticorps sur la cellule immunisante doit co-moduler avec la molécule CD3 lors de l'incubation des cellules en présence d'anticorps anti-CD3 (Meuer et al. (1)).
Comme le montrent les figures 9 et 10, les surnageants des hybridomes RO-73 et JU-74 réagissent avec 100 % des cellules du clone 3025 immunisant (Fig. 9A et 10A), moins de 2 % des cellules du clone 12410 (Fig. 9B et 10B) et 1 à 3 % des PBL (Fig. 9C et 10C).
Pour les expériences de co-modulation, les cellules du clone 3025 (106 cellules par ml) ont été incubées en milieu seul ou en présence d'anticorps anti-CD3 (OKT3) dans des plaques de culture de 24 puits. Après 24 heures d'incubation, les cellules ont été récoltées et marquées avec le surnageant d'hybridome RO-73 ou JU-74, l'anticorps monoclonal anti-CD3 ou un anticorps monoclonal contrôle anti-CD2 (Coultronics Co.) puis analysées par cytofluorimétrie. Comme le montrent les Figures 11 et 12, l'analyse par cytofluorimétrie des cellules incubées en présence d'anticorps monoclonal anti-CD3 (Fig. 11B
et 12B) montre une diminution de l'intensité de fluorescence pour l'anticorps monoclonal anti-CD3 ainsi que pour RO-73 et JU-74, alors que l'intensité du marquage avec l'anticorps monoclonal anti-CD2 augmente par comparaison à l'intensité
obtenue respectivement en absence d'anticorps anti-CD3 (Fig.
11A et Fig. 11B). Ces résultats indiquent que la molécule reconnue par les anticorps RO-73 et JU-74 co-module avec la molécule CD3 à la surface des cellules du clone T 3025.

6) Isolement d'un sous-clone Les cellules des hybridomes initiaux, respectivement RO-73 et JU-74, ont été réparties en plaques de culture à raison de 0,5 cellule par puits en milieu HAT complet, sur des cellules spléniques syngéniques irradiées. 3 sous-clones ont été sélectionnés pour chacun des hybridomes RO-73 et JU-74.
Ces cellules produisent des anticorps monoclonaux dont la réactivité est identique à celle des hybridomes initiaux (résultats non montrés).
Les sous-clones ont été cultivés en milieu non sélectif contenant du DMEM, 10 % de sérum de veau foetal, 10 % de sérum de cheval, de l'hypoxanthine, de la thymidine, de la pénicil-line et de la streptomycine, de la glutamine, du pyruvate de sodium et du NCTC 109.
Les cellules d'hybridomes ou de sous-clones ont été
congelées dans du sérum de veau foetal contenant 10 % de di-méthyl-sulfoxyde (DMSO, Merck) et conservées dans l'azote 10.liquide.

7) Isotypage des anticorps monoclonaux Les isotypes ont été déterminés par immunodiffusion sur support solide en utilisant un kit "INNO-LIA mouse mAb isotyping" (Innogenetics) pour la détermination des isotypes d'immunoglobulines dans les surnageants de culture. RO-73 et JU-74 sont des immunoglobulines de souris d'isotype IgGl, kappa.

8) Purification des anticorps monoclonaux Des ascites ont été produites dans des souris nudes. Le liquide d'ascite obtenu a été filtré sur coton pour éliminer la fibrine et précipité par le sulfate de sodium (18 %). Le culot obtenu a été mis en suspension dans du tampon PBS, dilué
1/3 dans du tampon (NaCl 4,5 M, glycine 2,25 M, pH 8,8) et chargé sur une colonne de Protéine A-Sepharose 4 Fast Flow équilibrée dans le tampon de charge (NaCl 3M, glycine 1,5 M, pH 8,8). Un pic majoritaire d'immunoglobulines a été élué à pH
6 en utilisant des tampons d'élution successifs de pH décrois-sant. Ce pic majoritaire a été purifié sur colonne échangeuse d'ions (Q Sepharose Fast Flow) en tampon Tris 50 mM, pH 8 et élué par un gradient de NaCl.
La pureté de la préparation a été vérifiée par électro-phorèse dans un système PHAST (Pharmacia LKB, Uppsala, Suède) et les immunoglobulines purifiées ont été testées en immuno-fluorescence indirecte sur la cellule 3025, comme indiqué
précédemment.
A titre d'exemple, pour 30 ml d'ascite de l'hybridome RO-20 7~a~~ j.

73, on obtient après purification sur Proteine A et Q
Sepharose Fast Flow, 32 mg d'immunoglobulines purifiées.

9) Pourcentage de PBL reconnus par les anticorps monoclonaux Les pourcentages de lymphocytes circulants reconnus respectivement par les anticorps monoclonaux RO-73 et JU-74 ont été déterminés pour 10 donneurs sains différents. Les résultats sont montrés dans le Tableau 1. L'anticorps monoclo-nal JU-74 reconnaît moins de 0,5 % à 2,1 % des PBL (moyenne 1,08 %) et l'anticorps monoclonal RO-73 reconnaît de 0,5 % à
2,2 % des PBL selon les individus (moyenne 1,09 %). Pour un individu donné, les anticorps monoclonaux RO-73 et JU-74 reconnaissent respectivement environ les mêmes pourcentages de lymphocytes circulants.

Réactivité des anticorps monoclonaux RO-73 et JII-74 avec les cellules du sang périphériques Donneur RO-73 JII-74 BQ 2,2 2,1 BY 0,9 1,1 BZ <0,5 <0,5 CA 0,5 <0,5 CB 0,5 0,6 CD l,8 1,7 CE 0,4 0,3 CH 1,6 1,3 CI 1,4 1,2 CJ 1,1 1,5

10) Purification des PBL reconnus par les anticorps monoclonaux Les PBL reconnus respectivement par les anticorps mono-clonaux RO-73 et JU-74 ont été purifiés à partir d'un donneur normal en utilisant un procédé de sélection positive par des billes magnétiques (Dynabeads, Dynal). En bref, 1 à 4 x 109 PBL ont été marqués par l'un ou l'autre des anticorps monoclo-naux purifiés ci-dessus et incubés avec les billes Dynabeads M-450 prêtes à l'emploi recouvertes par un sérum de chèvre anti-IgG de souris, dans la proportion de 3 billes pour une cellule marquée. Les cellules positives ont ensuite été
séparées grâce à un aimant. Après plusieurs lavages, les cellules ont été incubées avec un excès d'immunoglobulines de chèvre anti-IgG de souris ("Detach-a-beads", Dynatech) pour détacher les billes magnétiques puis directement analysées en cytométrie de flux après marquage par l'anticorps monoclonal RO-73 ou l'anticorps monoclonal JU-74, respectivement.
Les cellules positives sélectionnées ont été cultivées en microplaque en présence d'IL-2 sur des cellules allogéniques irradiées puis à nouveau purifiées par les billes magnétiques après environ une semaine de culture afin d'obtenir une prépa-ration d'une pureté supérieure à 95 %.
Pour l'anticorps monoclonal JU-74, 8 x 106 cellules positives à 96 % de pureté ont été obtenues, après une culture d'une semaine, à partir de 1 x 109 PBL d'un donneur sain contenant initialement 1,7 % de cellules JU-74+.
Pour l'anticorps monoclonal RO-73, 9 x 106 cellules positives à 98 % de pureté ont été obtenues, après 10 jours de culture, à partir de 1,2 x 109 PBL d'un donneur sain contenant initialement 2,4 % de cellules RO-73+.
A partir des cellules RO-73+ et JU-74+ purifiées ainsi sélectionnées, des lignées cellulaires ont été respectivement établies; chaque lignée est reconnue à 100 % par les deux anticorps monoclonaux, ce qui montre que les deux anticorps monoclonaux reconnaissent les mêmes cellules dans le sang périphérique.

WO 92/13950 PCI'/FR92/00130 29 2R3 7988i

11) Analyse des transcrits du TCR exprimés dans les PBL
reconnus par RO-73 et JU-74 par les techniques de PCR
a) Méthode d'analyse des transcrits p La gamme des oligonucléotides spécifiques des segments VQ
de type Vp1 à VQ24 décrite ci-dessus (SEQ ID N 25 à N' 48) a été utilisée comme amorces spécifiques pour analyser les transcrits Q du TCR exprimés dans les cellules RO-73+ et JU-74+. La procédure employée est identique à celle décrite dans l'exemple ci-dessus pour les lymphocytes périphériques d'un individu sain. En bref, après préparation de l'ARN selon la méthode de Chomczynski (13), l'ADN complémentaire a été syn-thétisé en utilisant la réverse transcriptase et l'amorce Cp B
(SEQ ID N 50). Le matériel obtenu a été soumis à 30 cycles d'amplification selon la technique PCR en utilisant en paral-lèle chacune des amorces Vp spécifiques correspondant aux séquences SEQ ID N 25 à 48 et l'amorce C,0 B spécifique de la région CQ (SEQ ID N 50) comme décrit précédemment.
Les produits amplifiés obtenus ont été séparés par élec-trophorèse sur un gel d'agarose à 2 %, transférés sur des membranes de nylon et hybridés avec la sonde oligonucléoti-dique CQ C (SEQ ID N 51) marquée au 32P. Les membranes ont ensuite été lavées comme décrit ci-dessus puis autoradiogra-phiées.
Le séquençage des transcrits de la chaîne p des TCR a été
réalisé en suivant la méthode de clonage et de séquençage décrite précédemment~pour l'ADNc. Par exemple, le matériel amplifié par l'oligonucléotide spécifique de la sous-famille V013 (SEQ ID N 37) a été digéré par l'enzyme SacII et purifié
par électrophorèse sur gel d'agarose. Le matériel obtenu a été
introduit dans le vecteur pBS SK+ (comme décrit plus haut pour la technique d'A-PCR] et utilisé pour transfecter les bacté-ries E. Coli XL-1-blue. Les colonies transformées obtenues ont été testées par hybridation en dot-blot en utilisant la sonde oligonucléotidique Cp C (SEQ ID N' 51) marquée au 32P. L'ADN
plasmidique a été séquencé comme décrit précédemment.
b) Méthode d'analyse des transcrits a Une méthodologie semblable à celle décrite pour les , 20 6~à3f,C~ 30 transcrits Q a été appliquée à l'analyse des-transcrits de la chaîne a du TCR en utilisant comme amorces spécifiques une gamme d'oligonucléotides spécifiques des segments Va de type Val à Va29 et des oligonucléotides spécifiques de la région constante Ca (oligonucléotide Ca B pour la synthèse de l'ADN
complémentaire et l'amplification par PCR et oligonucléotide Ca C pour la sonde de détection). Les séquences de ces oligo-.nucléotides sont indiquées dans le Tableau 2.

Sequence Zype 5'-GGCATTAACGGTTTTGAGGCTGGA-3' Val 5'-CAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGÇ-3' Va2 5'-CCGGGCAGCAGACACTGCTTCTTA-3' Va3 5'-TTGGTATCGACAGCTTCCCTCCCA-3' Va4 5'-CGGCCACCCTGACCTGCAACTATA-3' Va5 5'-TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCT-3' Vaô
5'-GCAACATGÇTGGCGGAGCACCCAC-3' Va7 5'-CATTCGTTCAAATGTGGGCAAAAG-3' Va8 5'-CCAGTACTCCAGACAACGCCTGCA-3' Va9 5'-CACTGCGGCCCAGCCTGGTGATAC-3' Va10 5'-CGCTGCTCATCCTCCAGGTGCGGG-3' Va11 5'-TCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCA-3' Va1Z
5'-TTCATCAAAACCCTTGGGGACAGC-3' Va13 5'-CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTT-3' Va14 5'-TTGCAGACACCGAGACTGGGGACT-3' Va15 5'-TCAACGTTGCTGAAGGGAATCCTC-3' Va16 5'-TGGGAAAGGCCGTGCATTATTGAT-3' Va17 5'-CAGCACCAATTTCACCTGCAGCTT-3' Va18 ~5'-ACACTGGCTGCAACAGCATCCAGG-3' Va19 40=i 31 2 ~i~ ~; ry t' TABLEAU 2 (suite) Sequence Zype 5'-TCCCTGTTTATCCCTGCCGACAGA-3' Va20 5'-AGCAAAATTCACCATCCCTGAGCG-3' Va2' 5'-CCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGA-3' Va22 5'-TGCCTCGCTGGATAAATCATCAGG-3' Vccg 2 3 5'-CTGGATGCAGACACAAAGCAGAGC-3' Va:w24 5'-TGGCTAÇGGTACAAGCÇGGACCCT-3' Va,w25 5'-AGC,GCAGCCATGCAGGCAT.gTACC-3' Vaw26 5'-AAGCCCGTCTCAGCACCCTCCACA-3' Vaw27 5'-TGGTTGTGCACGAGÇGAGACACTG-3' Vay28 5'-GAAGGGTGGAGAACAGATGCGTCG-3' Va,p+29 5'-ATACACATCAGAATTCTTACTTTG-3' Ce 5'-GTTGCTCCAGGCCGCGGCACTGTT-3' CaB
5'-GTCACTGGATTTAGAGTCT-3' CaC

c) Résultats La Figure 13 montre les résultats obtenus pour l'analyse des transcrits des chaînes c(Fig. 13 A) et des chaînes p (Fig. 13B) du TCR exprimés par les cellules RO-73+ reconnues par l'anticorps monoclonal RO-73. On constate que de nombreux segments Va différents sont exprimés dans ces cellules (Figure 13A). Par contre, seul l'oligonucléotide spécifique des séquences de la-sous-famille VP13 permet une amplification de l'ADNc (Figure 13B).
Des résultats identiques ont été obtenus pour les transcrits Q du TCR exprimés dans les cellules JU-74+ recon-nues par l'anticorps monoclonal JU-74 (résultats non montrés).
De plus, les transcrits p qui correspondent à la sous-famille VP13 exprimés par les cellules JU-74+ ont été
séquencés à partir des cellules isolées précédemment afin de déterminer, parmi les 5 membres connus ou nouveaux de la sous-famille VP13 (Figure 4), ceux dont les produits sont reconnus par l'anticorps monoclonal JU-74. Le tableau 3 montre les résultats obtenus après analyse de ces séquences. Les huit séquences différentes de VP13 obtenues correspondent toutes à
un réarrangement du segment génique nouveau V013 IGRb16 (SEQ
ID N' 15) avec des segments J et des régions N différents.

Expression des transcrits de la chaîne dans les cellules JU-74+

ADNo Vp membre Jp Region clones N
B001 13 IGRb16I J2.1 +
B002 13 IGRb16I J1.6 +
B006 13 IGRb16I Jl.l +
B007 13 IGRb16I J2.1 +
B009 13 IGRbl6I J1.6 +
BO10 13 IGRb16I J2.6 +
BO11 13 IGRbl6I J1.3 +
B012 13 IGRb16I J1.2 +
L'ensemble de ces résultats montre que les anticorps monoclonaux RO-73 et JU-74 sont spécifiques des produits de segments géniques appartenant à la sous-famille V013.
Plus précisément, les anticorps monoclonaux JU-74 et RO-73 ont la méme spécificité et reconnaissent exclusivement le produit du segment génique nouveau VQ13 IGRb16 de l'invention (SEQ ID N 15 indiquée ci-dessus).
Les lignées cellulaires hybridomes suivantes ont été
déposées auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM - Institut Pasteur) : JU-74 et RO-73 le

12 février 1992 sous les numéros I-1173 et 1-1172 REFERENCES
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2~ d 7~L~ j 36 LISTE DES SEQUENCES

I - INFORMATION GENERALE

(1) DEMANDEUR : Société dite ROUSSEL UCLAF
(2) TITRE DE L'INVENTION

Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables des chaînes ,Q des récepteurs des lymphocytes T humains, segments peptidi-ques correspondants et les applications diag-nostiques et thérapeutiques.

(3) NOMBRE DE SEQUENCES : 56 CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 387 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 02 SEQUENCE VQ w21 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

MBT

GGT ACC AGG CTC CTC TGC CGG GTG GCC TTC TGT CTC CTG (;TG GAA GAA 96 Gly Thr Arg Leil Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Leu Leu Val Glu Glu Leu Ils Glu Ala Gly Val Val Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ils Ile Glu Lys Lys Gln Pr0 Val Ala Phe Trp Cys Asn Pro Ils Ser Gly Hia Asn Thr Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Asn Lsu Gly Gln Gly Pro Glu Lsu Lau ATT CGA TAT GaG AAT GAG GAA GCA GTA GAC GAT TCA CAG TTC CCT AAG 288 Ile Arg Tyr Glu Asn Glu Glu Ala Val Asp psp Ssr Gin Lsu Pro Lys GAT CGA TTT TC~..' GCA GAG AGG CTC AAA GGA GTA GAC TCC ACT CTC AAG 336 Asp Arg Phs Ser Ala Glu Arg Lau Lys Gly Val Asp Ser Thr Lau Lys ATC CAG CCT GCI. GAG CTT GGG GAC TCG GCC GTG TAT CTC TGT GCC AGC 384 Ile Gln Pro Ala Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser AGC .387 sar Us 38 CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 395 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm SEQUENCE CONSENSUS
ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 03 SEQUENCE VQ w22 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

CTGCC ATG GA4 A~C TGG CTC GTA TGC TGG GCA ATT TTT AGT CTC TTG 95 Met Asp Thr Trp Leu Val Cys Trp Ala Ile Phe Sar Lou Lou Lys Ala Gly Leu lhr Glu Pro Glu Val Thr Gln Thr Pro Ser His Gln Val Thr Gln Met Gly Gln Glu Val Ile Leu Arg Cys Val Pro Ile Ser AAT CAC TTA TAC 1'TC TAT TGG TAC AGA CAA ATC TTG GGG CAG AAA GTC 239 Aan Hia Leu Tyr Phs Tyr Trp Tyr Arg Gin I1= Leu Gly Gln Lys Val Glu Phe Leu Val Ser Phe Tyr Aan Asn Glu Ile Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe Asp Aap Gln Phe ser Val Glu Arg Pro Asp Gly Ser Aan Phe Thr Leu Lys Ile Arg Ser Thr Lys Leu Glu Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Ala Ser Ser WO 92/13950 PCr/FR92/00130 39 14, ~8 8~.

CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 329 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm SEQUENCE CONSENSUS
ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 04 SEQUENCE Vp w23 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

Met Leu Cys Leu Leu Gly Ala Gly Ser Val GCT GCT GGA GTC hTC CAG TCC CCA AGA CAT CTG ATC AAA GAA AAG AGG 95 Ala Ala Gly Val ile Gln Ser Pro Arg llis Leu Ilo Lys G.Lu Lys Arg Glu Thr Ala Thr f.3u Lys Cys Tyr Pro Ile Pro Arg Hie Asp Thr Val Tyr Trp Tyr Gin Gln Gly Pro Gly Gln Asp Pro Gln Phe Lou Ilo Sur 45 50 Si 9 Phe Tyr Glu Lys f4et Gin Ser Asp Lys Gly Ser Ile Pro Asp Arq Phe TCA GCT CAA CAG rTC AGT GAC TAT CAT TCT GAA CTG AAC ATG AGC TCC 287 Ser Ala Gln Gln Phe Ser Asp Tyr His Ser Glu Leu Asn Met Ser Ser Leu Glu Lau Glj+ Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser WO 92/13950 (~ ~1 ) PCT/FR92/00130 JN ~,9 iJ lJ li i ... ,_ CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-5 pondante LONGUEUR : 366 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 05 15 SEQUENCE VQ w24 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

Met Gly Pro Gly Leu Lau Hia Trp Met Ala Leu. Cys Leu Leu Gly Thr Gly His Gly Asp Ala Met Val Ile Gin Asn Pro Arg Tyr Gin Val Thr Gln Phe Gly Lys Pro Val Thr Leu Ser Cys Ser Gln Thr Leu Asn His Asn Val Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu Leu Phe His Tyr Tyr A8p Lys Asp Phe Asn Asn Glu Ala Asp Thr Pro Aap Aon Phe Gin S.r Arg Arg Pro Aan Thr Ser. Phe Cys Phe Leu Asp Ile Arg Ser Pro Gly Leu Gly Aap Ala Ala Met Tyr Leu Cys Ala Thr Ser 2079Sna.

CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 238 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphôcytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 06 Gly Gin Gin Ala Thr i,au Arq Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Thr ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ala,isu Gly Lau Giy Leu Gln Leu Leu Leu Trp Tyr Aaap Glu Gly Glu Glu Arq Asn Arg Gly Asn Phe Pro Pro AGA 'll'T TCA GGT CGC CAG TTC CC'r AA'l' 'l'A'l' ACC 'l'C'r CAG CTG AAT GTG

Arg Phe ser Gly Arg Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn Val Asn Ala Leu Glu Iau Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Als 8er 8er CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 192 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 07 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

Thr Val Ser Trp 'ryr Gln Gin Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ila Phe Gln Tyr Tyr Arq Glu Glu Glu Asn Gly Arg Gly Asn Ser Pro Pro Arg Phe Ser Gly Lou Gin Phe Pro Asn Tyr Ser Sor Glu Lou Asn Val 11ain Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser 50. 55 60 43 2 0 7 9 S'a, CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 371 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 08 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

GAAC'1CAC1'G GG'ri'C7rCCC CACGACGACC AAUCCCTGAA 'l'CAGCI'CCAG 50 TGCTGCG'TGC CCCACTGTCC C ATG GGC CCT GGG CTC CTC TGC TGG 95 Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Val Leu Leu Cys Iqu Leu Gly Ala Gly Pro Val Asp Ala Gly Val Thr Gin Ser Pro Thr His Leu Ile Lys Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro ile Ser Glu His Lys Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln GTC CTG GGT CAG GGG CCC CAG TTT ATC TTr CAC 'l'AT TAT GAG AAA GAA 287 Val Leu Gly Gln Gly Pro Cln Pho Ilc Pho Cin 'Pyr 'l'yr Glu Ly,s Glu GAG AGA GGA ACA GCA AAC 7"TC CCT CAT CCA 'i"rC 'l'CA GCT CGC CAG TTC 335 Glu Arg Gly Arg Gly Asn Phe Pro Asp Arg Phe Ser Ala Arg Gln Phe CCT AAC TAT AGC 'rCT GAG CTG AAT GTG AAC GCC T'rG TTG CTG GGG GAC 383 Fro Asn Tyr Ser Sur Glu Le.u Asn Val Aan Ala Leu Leu Leu Gly Asp TCG GCC CTG TA'l' CTC TGT GCC AGC AGC 410 Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser 71v)44 CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 380 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 09 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

AAGCCCTGAA TCAGATGCAG 'l'GCTL'CC'TGTC CCTCTGTGCC ATG GGC 47 Met Gly Pro Gly Leu Iw+iu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala Gly Lau GTG GAC GCT GL.1 C'~C ACC C1lA AGT CCC ACA CAC C'PG ATC AAA ACC AGA 143 Val Asp Ala Gly Yal 'l'hr Gin Snr 1lro 'l'hr Ilis Lou llo Lys 'l'hr Arq Gly Gltn Gln Va.l Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly Hie Asp Thr 3'5 40 45 GTG TCC TGG TAC' CAA CAG GCC CTG GGT CAG GGC CCC CAG 'rTT ATC TTT 239 Val Ser Trp Tyu Gln Gin Ala Leu Gly Gln Cly Pro Gln Phe xle Phe Gin Tyr Tyr Gl~i Glu Glu Glu Arg Gln Arq Gly Asn l'tin Pro Aep Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn Val Asn GCC TTG TTG C+G GGG GAC TCG GCC CTC TAT CTC TGT GCC AGC AGC 380 Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser 2~79~t~;.:
~

CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-5 pondante LONGUEUR : 351 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 11 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

Met Gly Thr Sar Iwu Lau Cys Trp Val Val Leu Gly Pha Leu Gly Thr Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr Gln Val Thr Lys Arg Gly Gln Asp Val Ala Lau Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Val Ser Lau Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Gin Gly Pro Glu Pha Leu Thr Tyr Phe Asn Tyr Glu Ala Gln Gln Arp Lys Ser Gly Lau Pro Asn Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly 8ar Iis Sar Thr Leu=Thr Ils Gln Arg Thr Glu Gln Arg Asp Ser Ala Met Tyr Arg Cys Ala Ser Sar.

CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 238 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 12 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

A AAG GAT GTA GAG CTC AGG TCT GAT CCA A'1=T '1CA GGT CAT ACr GCC 46 Lys Asp VaL Glu Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Thr Ala Lou Tyr Trp Tyr Arg Gln Ser L u Gly Gln Gly Tau Glu Phe Leu Ile 25 11) Tyr Phe Gln Gly Asn Ser Ala Pro Asp Lys Ser Gly Leu Pro Asn Asp CGG TTC TTT GC:: GTC AGG CCT GAG GGA TCC GTC TCT ACT CTG AGG ATC 190 Arq Phe Phe Ala Val Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Arq Ile CAC CGC ACA GAc; CGG GGG GAC TCA GCC GTG TAT CPC 'l'GT GCC AGC AGC 238 Gin Arq Thr Glu Arg G1y Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser r O

XIII - INFORMATION POUR SEQ ID N' 12 CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 294 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 13 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

Ser Gly His Arq Aop Ala Glu Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Lys Ils Thr Glu Thr Gly Arg Gin Val Thr Leu Ala Cye tlie Gin Thr Trp Aun CAC AAC AAT A'YC TTC TGG TAT CGA CAA GAC CTG CCA CAT GGG CTC AGG 144 His Asn Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly His Gly Leu Arg.
35 40 . 45 CTG ATC CAT TAC TCA TAT GGT G'l'r CAA GAC AC'r nAC AAA GCA GAA GTC 192 Lau Ile Hia Tyr Ser Tyr Gly Val Gln Asp Thr Asn Lys Gly Glu Val Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ser Asn Thr Glu Asp Leu Pro Leu ACT CTG GAG TC: GCT GCC TCC TCC CAG ACA TCT GTA TAT TTC TGC GCC 288 Thr I.eu Glu Se; Ala Ala Ser Ser Gin Thr Scr Val Tyr Phe Cy~ Ala Sar Ser CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 369 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 14 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

Met Ser Ile Gly Lau Lau Cye Cys Val Al, Nho Soc Lou lnu 'Prp A1n a;nr vro Vnl Ann Aln Gly GTC ACT CAG ACi CCA AAA TTC CAG GTC CTG AAG ACA GGA CAG AGC ATG 144 Val Thr Gln Th: Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr Gly G1n Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gin Asp Met Asn ftis Asn Scr Mct Tyr Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Mot Gly tAU Arq Lou ilo 'Pyr Tyr Sor Ala 8or 55 60 G i 70 Glu Gly Thr Thr i,yp Lys Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val Sar Arg Leu Asn Lys Arg Glu Phe Ser Leu Arg Leu Glu Ser Ala Ala Pro TCC CAG ACA TC: GTG TAC TTC TGT GCC AGC ACC 369 Sor Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Thr 2079()~.' :
XV - INFORMATION POUR SEQ ID N' 14 CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 356 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 15 SEQUENCE V(3 13 DESCRIPTION-DE LA SEQUENCE

Met Arq Ile Arq Lcu Lcu Cys Cys Val Ala 1 5 tn Pha Ser Leu Leu Trp Ala Giy Pro Val Ile Ala Gly Ila Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ila Leu Ala Ala Gly Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys ACC CAG GAT ATG AGA CAT AAT GCC ATG TAC TGG TA'r AGA CAA GA'r CTA 191 Thr Gln Asp Mat Arg His Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Lau GGA CTG GGG C'PA AGG Cl'C A'l'C CAT 'l'A'l' '1CA AA'l' AC'l' CCA CG'L' ACC
AC'l' 239 Gly Leu Gly Leu Arg Lau ile His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr GGC AAA GGA GAA GTC CCT GAT GGT TAT AGT G'l'C 'l'CC AGA GCA AAC ACA 287 Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr Ser Val Sor Arg Ala Asn Thr Asp Asp Pha Pro Lau Thr Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phs Cys Ala Ser Ser WO 92/13950 PCI'lFR92/00130 20 9~U' CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-5 pondante LONGUEUR : 345 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
15 NOM DE L'ADN : IGR b 16 SEQUENCE Vp DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

AAGGCCt,.ACC CCCTTTCCAT TGGGGCTGCA GCATCAGCTC TTTCCPICTC 50 TGCAGGT CCA GTG AAT GCT GGT CTC ACT CAG.ACC CCA AAA TTC CGC 96 Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Arg ATC CTG AAG ATA GGA CAG AGC ATG ACA CTG CAG 'PG'r GCC CAG GAT ATG 144 ile Leu Lys Ile Gly Gin Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met AAC CAT AAC TAC A'l'G TAC 1'CG 'rAT CCA CAA CAC CCA CCC A'l'C CCC CTC 192 Asn Hia Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu AAG CTG ATT TA'l' TAT TCA GTT GG'1' CCT GC'i' A'l'C AC'P GAT AAA GCA GAA 240 Lys Lau ile Tyr Tyr Sar Val Gly Ala G'ly Ilo Thr Asp Lys Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Sar 'rhr Thr Glu Asp Phe Pro Lau Arg Leu Glu Leu Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Sar Ser 51 ~~~9 8 ? i.

CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 450 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 17 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

CCGAGG~-'AG C ATG GGC TGC AGG CTG CTC TGC TGT GCG GTT CTC 144 Met Gly Cys Arq Leu Leu cys cys Ala Va1 Leu Cys isu Leu Gly Ala Val Pro Met Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg His Leu Val Met Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu CAA CAT CTG GGu CAT AAC GCT ATG TAT TGC TAC AAG CAA AGT GC'r AAG 288 Gin Hia Leu Gly Hia Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gin 8ar Ala Lys Lys Pro Leu Glu Leu Met Phe Val Tyr Asn Phe Lys Glu Gln Thr Glu AAC AAC AGT G'l'G CCA AGT CGC TTC TCA CC'P GAA 'l'GC CCC AAC AGC TC'T 384 Mn Asn Sar Val Pro Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser Hia Leu Cys Leu Hia Leu His Thr Leu Gln Pro Glu Asp SerAla LeC
95 100 105, Tyr Leu Cys Ala Ser Thr 7 9 t~.! 52 CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 354 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 18 SEQUENCE V{3 7 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

AGACCCGAGG CTAGC ATG GGC TGC AGG CTG CTC TGC TCT GCG GTT CTC 48.
Met Cly Cys Arg Leu Leu Cys Ser Ala Val Lau Cys Leu Lsu Gly Ala Val Pro Met Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg His Leu Val Met Gly Met Thr Asn Lys t,ys sor Leu Lys Cys Glu ] 0 35 ' 4 0 Gin Hia Leu Gly His Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Ser Ala Lys Lys Pro Lau Glu Leu Met Phe Val Tyr Ser Leu Glu Glu Arg Val Glu Asn Asn Ser Vai. Pro Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser 8er His Leu Se; Leu His Leu His Thr Leu Gin Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Lu Cys Ala Ser Ser t 'J

CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 368 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 19 SEQUENCE V(3 7 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

AGAGGC::CCA TCTCAGACCC GAGGCTAGC ATG GGC TGC AGG CTG'CTC 47 Met Gly Cys Arq Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala Val Pro Ile Asp Thr Glu Val Thr Gln 'Phr Pro Lys His Leu Val Met Gly Met Thr Asn Lys Lys=

Ssr,Lau Lys Cys Glu Gln His Met Gly His Arg Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu Met Phe Val Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Ils Asn Glu Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Pro Glu 75 80 8S ..

Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn Leu Ris Leu His Ala Lau Gln Pro ' 90 95 100 G1u,Asp Ser Ala Lau Tyr Leu Cys Ala Sar Ser 2â~; 9 8 8 54 ~.

CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-pondante LONGUEUR : 432 paires de bases NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm ORIGINE
ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 20 DESCRIPTION DE LA SEQUENCE

CACTGCAGAC C4 %GAATCCTG CCCTGGGCCT TGCC'rCC'l'C'r CCCTCACTCT CCC ATG 96 MET

GGC TGC AGG CTu CTC TGC TGT GTG GTC TTC TGC CTC CTC CAA GCA GGT 144 Gly Cys Arg Lcu Leu Cys Cys Val Val Pho Cys [.ou Lou Gln Ala Gly Pro Leu Asp 'l'hr Ala Val Sor Cln 'lhr Llro I,yn 'I'yr iru Val 'Phr Gln Mat Gly Asn Ast-+ Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His Asp Thr Mat Tyr Trp Tyr Lys Gin Asp Sar Lys Lys Pha Leu Lys Ils Mat TTT AGC TAC AAr AAT AAG GAG CTC ATT ATA AAT GAA ACA GTT CCA AAT 336 Pha Sar Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ila Ile Asn Glu Thr Val Pro Asn CGC TTC TCA CCT AAA TCT CCA GAC AAA GCT CAC T'TA AAT CTT CAC ATC 384 Arq Pha Ssr Pro Lys Sar Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His Ile Asn Ser Leu Glt. Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser ~!}r)t'i ?CJ~
XXI - INFORMATION POUR SEQ ID N 20 à 24 OLIGONUCLEOTIDES

SEQ ID N' 20 5'-TATCTGGAGTCATTGAGGGCGGGC
10 SEQ ID N' 21 5'-GCATGCGCGCGGCCGCGGAGG-14C
SEQ ID N 22 5'-TGTGGCCAGGCATGCCAGTGTGGCC
SEQ ID N 23 5'-GGTGTGGGAGAATTCTGCTTCTGA
SEQ ID N' 24 5'-TCTGCTTCTGATGGCTCAA.

J.

SEQ ID Sequence Type Clone Position N.

-------25 5'-CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC-3' V81 HBVT73 251 26 5'-GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA-3' V82 MOLT4 210 27 5'-CGCTTCTCCCGGATTCTGGAGTCC-3' V83 DT259 232*
28 5'-TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA-3' V84 DT110 257 29 5'-AGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC-3' V85 VB12A1 199*
30 5'-TCTCAGGTGTGATCCAAATTCGGG-3' V06 ATL12.2 117 31 5'-CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC-3' V87 PL4.9 169 32 5'-CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC-3' V08 PH11 170 33 5'=TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC-3' V89 PL2.6 .201*
34 5'-CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC-3' V810 ATL12-1 299 35 5'-TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA-3' V81t PL3.12 297 36 5'-TGTCACCAGACTGgGAACCACCAC-3' V812 VBPH27 109*
37 5'-CACTGCgGTGT,&CCCAGGATATGA-3' V813 CEM-VB1 116 38 5'-GGGCTçGGCTTAAGGCAGAçCTAC-3' V814 VBPH21 175 39 5'-CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG-3' V815 ATL2-1 262 40 5'-GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG-3' V816 HBP42 192*
41 5'-CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC-3' V817 VBPH29 254

42 5'-TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA-3' V818 HUT102 173*

43 5'-TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA-3' vBy9 HBVT02 279

44 5'-TCTCAATGCCCCAAGAACGCACCC-3' V820 HBVT72 274

45 5'-TCCAACCTGCAAGGCTTGAçGACT-3' VB.w21 IGRbOlI 318

46 5'-AAGTGATCTTGCGCTGTGTCCCCA-3' Vaw22. IGRbO3 110 4.7 5'-GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCA-3' VBw23 IGRaO4 155 48 5'-CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCC-3' V13w24 IGRaO5 95 49 5'-GGTGTGGGAGAATTCTGCTTCTGA-3' CaA 71 50 5'-ACCAGCTCAGCTCCGCGGGGTCGG-3' (;8s 135 51 5'-TCTGCTTCTGATGGCTCAA-3' CBC 58 52 5'-ATTTGCGGTGGACGATGGAGGGdC-3' AOt1 4-actine 1161 53 5'-GGCATCGTCACCAACTGGGACGAC-3' Act 2 6-actine 261 5=4 51-ACCACCACGGCGGAGCGGG-3' ACt3 D-actine 642 ST~ 5'-GTTGCTCCAGGCCCCGGCACTGTT-3' Co(E 201 56 5'-CCCTGACCCTGCCCTGTACCAGCT-3' Co4 J 12 57 5'-GTCACTGGATTTAGAGTCT-3' Ca C 57

Claims (22)

REVENDICATIONS

1. Séquence nucléotidique codant pour une région variable de chaînes .beta. de récepteur des lymphocytes T
humains, correspondant à un ADNc comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID No 15, et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.

2. Peptides codés par la séquence nucléotidique selon la revendication 1, ainsi que les allèles qui possèdent la même fonction.

3. Vecteurs d'expression comprenant une séquence d'ADN codant pour l'un des peptides selon la revendication 2.

4. Hôtes cellulaires transformés avec un vecteur selon la revendication 3.

5. Anticorps dirigés contre un déterminant antigéni-que d'un des peptides définis à la revendication 2.

6. Anticorps selon la revendication 5, qui est un anticorps monoclonal ou un fragment de celui-ci.

7. Fragment Fab, Fab' ou F(ab')2 d'un anticorps monoclonal selon la revendication 6.

8. Dérivés d'un anticorps monoclonal ou d'un fragment de celui-ci selon la revendication 6 ou 7, auxquels sont liés un marqueur détectable et/ou au moins une molécule thérapeutique.

9. Hybridomes produisant un anticorps selon la revendication 6.

10. Composition de diagnostic comprenant un ou plusieurs anticorps monoclonaux, fragments ou dérivés de ceux-ci selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

11. Composition thérapeutique comprenant un ou plusieurs anticorps monoclonaux, fragments ou dérivés de ceux-ci selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, et un excipient thérapeutiquement acceptable.

12. Composition selon la revendication 11, comprenant des dérivés contenant une molécule cytotoxique ou un radioisotope.

13. Composition thérapeutique comprenant au moins l'un des peptides définis à la revendication 2, et un excipient thérapeutiquement acceptable.

14. Utilisation, en tant qu'amorces pour l'amplifi-cation d'ADN, de séquences nucléotidiques d'au moins 17 nucléotides comprises dans la séquence selon la revendica-tion 1.

15. Utilisation, en tant que sonde de détection, de séquences nucléotidiques d'au moins 10 nucléotides comprises dans la séquence selon la revendication 1.

16. Oligonucléotides, utilisables comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à des régions variables de chaînes .beta. des récepteurs de cellules T, correspondant à

des séquences nucléotidiques d'au moins 17 nucléotides consécutifs comprises dan la séquence SEQ ID NO 15.

17. Procédé de détection de séquences nucléotidiques codant pour des segments V.beta. des récepteurs T ou d'ADNc correspondant aux produits de transcription de celles-ci, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend:
a) l'amplification de l'ADN avec au moins une paire d'amorces formée par l'un des oligonucléotides selon la revendication 16 et un oligonucléotide appartenant au segment C.beta., et b) la détection des séquences amplifiées avec une sonde C.beta..

18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'on effectue l'amplification en présence d'une paire d'amorces contrôle et la détection à l'aide d'une sonde contrôle.

19. Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend:
a) au moins un oligonucléotide selon la revendica-tion 16, b) une amorce C.beta., et c) une sonde C.beta..

20. Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend:

a) au moins un oligonucléotide selon la revendica-tion 16, b) une amorce C.beta., c) une paire d'amorces contrôle, d) une sonde C.beta., et e) une sonde contrôle.

21. Hybridomes RO-73 et JU-74 produisant des anticorps monoclonaux anti V.beta.13 déposés à la CNCM le 12 février 1992 sous les n o s I-1172 et I-1173.

22. Anticorps monoclonaux anti V.beta.13 produit par les hybridomes selon la revendication 21.