FR2675156A1 - Sequences nucleotidiques codant pour des regions variables de chaines alpha des recepteurs des lymphocytes t humains, segments peptidiques correspondants et les applications diagnostiques et therapeutiques. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouvelles séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes alpha des récepteurs des lymphocytes T humains, les segments peptidiques correspondants et les applications diagnostiques et thérapeutiques.

Description

La présente invention concerne de nouvelles séquences nucléotidiques codant pour des régions variables des chainesa des récepteurs des cellules T, les segments peptidiques correspondants et les applications diagnostiques et thérapeutiques.

I1 est connu que les récepteurs reconnaissant les antigènes à la surface des lymphocytes T matures (désignés ci-après récepteurs des cellules T) possèdent une structure ayant une certaine analogie avec celles des immunoglobulines. Ainsi, ils comprennent des structures hétérodimériques comportant des chaînes glycoprotéiqueso( et/S ou des chaînes glycopro téiques } et # (voir Meuer et al. (1), Moingeon et al.

(2), Brenner et al. (3), Bank et al. (4)).

Le répertoire des récepteurs des cellules T doit pouvoir faire face à l'immense diversité des déterminants antigéniques. Ceci est obtenu par recombinaison génétique des différents segments discontinus des gènes qui codent pour les différentes régions structurales des récepteurs des cellules T. Ainsi, les gènes comprennent des segments V (segments variables), éventuellement des segments D (segments de diversité), des segments J (segments de jonction) et des segments
C (segments constants). Pendant la différenciation des cellules T, des gènes spécifiques sont créés par recombinaison des segments V, D et J pour les locus/5 et ff et des segments V et J pour les locus g et
Ces combinaisons spécifiques ainsi que l'appariement des deux chaines créent la diversité combinatoire.

Cette diversité est fortement amplifiée par deux mécanismes supplémentaires, à savoir la réunion imprécise des segments V-D-J ou V-J et l'addition de nucléotides correspondant à la région N (Davis et al.

(5)).

On connait déjà un certain nombre de segments géniques V. Ces segments ont été groupés en- sous-familles en fonction de la similarité des séquences. Par définition, les segments qui présentent plus de 75 % de similarité dans la séquence nucléotidique ont été considérés comme des membres de la même sous famille (Crews et al. 6)). Les segments géniques V 06 connus ont ainsi été classés en 22 sous familles dont 14 avec un seul membre (voir Concannon et al. (7), Kimura et al. (8), Wilson et al. (9)).

Par ailleurs, environ 60 segments géniques Jo( ont été décrits (9).

On a par ailleurs décrit récemment dans WO: 90/06758 des anticorps monoclonaux dirigés contre des- segments spécifiques des parties variables des récepteurs des cellules T, notamment des chaînes P et
Ces anticorps monoclonaux sont utiles non seulement comme outils de diagnostic mais également comme outils thérapeutiques, par exemple vis-à-vis de l'arthrite rhumatoîde.

On a également décrit l'utilisation de peptides synthétiques correspondant à des régions variables des chaînes 9 ou P dans le traitement des maladies auto-immunes (23 et 24).

I1 est connu par ailleurs qu'il existe des variations d'un individu à un autre dans l'expression des différents segments variables du récepteur T chez l'homme (27 et 28).

La présente invention vise à enrichir le répertoire des segments géniques codant pour des régions variables de chaines g des récepteurs des cellules T en fournissant d'une part de nouveaux segments géniques Vg appartenant à des nouvelles sous familles ou appartenant à des sous-familles dont on connaît déjà au moins un membre et d'autre part, de nouveaux segments géniques J α
La présente invention a ainsi pour objet des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes 4 des récepteurs des lymphocytes
T humains, correspondant à des ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque
a - des segments Vα; correspondant à l'une des séquences SEQ ID N 1 à 11, et
b - des segments J 4 correspondant à l'une des séquences SEQ ID N 12 à 20, et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.

La présente invention a plus particulièrement pour objet
- des séquences codant pour des régions variables des chaines 2 des récepteurs des lymphocytes
T humains, correspondant à des ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments V i correspondant à lune des séquences SEQ ID N 1 à 10, et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.

- des séquences codant pour des régions variables des chaînes α des récepteurs des lymphocytes
T humains, correspondant à des ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments J A correspondant à l'une des séquences SEQ ID N 12 à 20, et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.

Par l'expression "et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides", on englobe les allèles qui présentent jusqu'à 8 nucléotides de différence, mais le plus souvent 1 ou 2 nucléotides de différence ou qui peuvent différer par la délétion ou l'addition d'un ou deux codons.

La présente invention a également plus particulièrement pour objet
- des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables des chaînes 4 des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments V g correspondant à l'une des séquences SEQ ID N 1 à 5, et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides,
- des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes 9 des récepteurs des.

lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vi corres- pondant à l'une des séquences
1 à 467 de SEQ ID N 6
1 à 77 de SEQ ID N 7
1 à 151 de SEQ ID N 8
291 à 386 de SEO ID N 9
1 à 260 de SEQ ID N 10 et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides,
- des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes g des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie de la séquence nucléotidique correspondant à la SEQ ID N 11 et qui comprennent le nucléotide 108,
- des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes i des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Jg(corres- pondant à l'une des séquences SEQ ID N" 12 à 20 et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.

Par l'expression "séquences nucléotidiques correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques", on désigne aussi bien les séquences complètes que des fragments de ces séquences y compris des fragments courts (oligonucléotides) qui ' trouvent des applications en tant que sondes (comportant généralement au moins 10 nucléotides) ou'en tant qu'amorce (comportant généralement au moins 15 nucléotides). D'une manière générale, l'invention englobe l'ensemble des nouveaux oligonucléoti- des qui sont des fragments des séquences V g et selon 1' invention.

Quant aux séquences qui diffèrent par un ou deux nucléotides, elles correspondent à des variations que l'on a observé expérimentalement lors de la détermination de la séquence nucléotidique de plusieurs
ADNc.

La présente invention a également pour objet les peptides codés par des séquences nucléotidiques selon l'invention ainsi que les allèles et les dérivés de ceux-ci qui possèdent la même fonction.

La présente invention a également pour objet les peptides constitués ou comprenant une séquence peptidique codée par tout ou partie de la séquence 108 à 364 de SEQ ID N" 11.

D'une manière générale, la présente invention englobe les peptides constitués par ou comprenant une séquence peptidique codée par les séquences nucléotidiques selon l'invention ainsi que les fragments de ces peptides. Elle englobe également les peptides qui diffèrent de ceux-ci d'un ou plusieurs amino-acides et qui possèdent la même fonction. Ces peptides peuvent correspondre à des modifications telles que celles connues avec les mutéines ou à des variations allèliques. Il a été en effet montré en particulier que certains segments géniques codant pour des régions variables de chaînes du récepteur T chez l'homme étaient soumis à un phénomène de polymorphisme génétique appelé variation allèlique (25). La présente invention englobe les peptides provenant de ce phénomène.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont été obtenues selon les étapes suivantes
- isolement des ARN de lymphocytes périphé-.

riques d'un individu
- obtention de lVADN complémentaire à l'aide de reverse transcriptase et d'une amorce A spécifique de la région r /(SEQ ID N 21)
- amplification génique (par Anchored
Polymerase Chain Reaction ou A-PCR) à l'aide d'une ADN polymérase, d'une amorce poly C (SEQ ID N 22) et d'une amorce B spécifique de la région C g (SEQ ID N 23) ;
- nouvelle amplification par A-PCR à l'aide de ADN polymérase et d'une amorce C spécifique de la région Cα (SEQ ID N 24) ;
- insertion dans un vecteur plasmidique
- transformation d'un hote bactérien avec le vecteur recombinant ;
- criblage des colonies bactériennes recombinantes avec un oligonucléotide D spécifique de (SEQ ID N 25) marqué ;
- extraction des plasmides des colonies positives,
- et séquençage des fragments d'ADN contenant la région < .

La présente invention peut être reproduite notamment ' par amplification génique bispécifique (polymerase chain reaction ou PCR) en partant des lymphocytes périphériques expriment les ARNm incluant les segments variables ou jonctionnels correspondant aux séquences ID N" 1 à 20 de l'invention ou alternativement en appliquant cette technique de PCR à de 1'ADN génomique de toute cellule somatique d'un individu pris au hasard. L'invention peut aussi bien être reproduite en préparant les sequences géniques ci-dessus par synthèse chimique d'oligonucléotides.

Les peptides selon l'invention peuvent être obtenus par synthèse peptidique classique. Ils peuvent être également obtenus par application des techniques connues de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour un peptide selon l'invention dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression.

La présente invention a donc également pour objet des plasmides et des vecteurs d'expression comprenant une séquence d'ADN codant pour un peptide selon l'invention ainsi que des hotes transformés avec ce vecteur.

La présente invention a également pour objet des anticorps, et notamment des anticorps monoclonaux, dirigés contre un déterminant antigénique appartenant à ou comprenant un peptide selon l'invention.

Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par toutes les techniques qui permettent la production de molécules d'anticorps à partir de culture de lignée cellulaire. Ces techniques comprennent les différentes techniques utilisant des hybridomes.

La production d'anticorps peut être obtenue chez l'animal par immunisation des animaux par injection des peptides ou des fragments selon l'invention, qu'ils soient naturels, recombinants ou synthétiques, éventuellement après couplage à un agent immunogène tel que l'anatoxine tétanique, ou encore par injection des lymphocytes T humains exprimant les séquences correspondantes à leur surface, y compris des cellules recombinantes transfectées avec les séquences codantes correspondantes.

La présente invention a également pour objet des hybridomes produisant des anticorps monoclonaux dirigés contre les polypeptides selon l'invention.

La présente invention englobe également lesfragments et les dérivés d'anticorps monoclonaux selon l'invention qui sont réactifs avec des régions variables définies des récepteurs des cellules T. Ces fragments sont notamment les fragments F(ab')2 qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la pepsine, les fragments
Fab' qui peuvent être obtenus par réduction des ponts disulfure des fragments F(ab')2 et les fragments Fab qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la papaïne en présence d'un agent réducteur. Ces fragments peuvent être également obtenus par génie génétique.

Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont par exemple des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liés des marqueurs tel qu'un radioisotope. Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont également des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liées des molécules thérapeutiquement actives, notamment des composés cytotoxiques.

Les produits de l'invention trouvent plusieurs types d'application dans le domaine du diagnostic et dans le domaine de la thérapeutique.

1 - Les applications dans le domaine du diagnostic
Les oligonucléotides contenus dans les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisés pour constituer des sondes de détection (généralement au moins 10 nucléotides) capables de s'hybrider à une région variable de chaîne 4 ou des amorces pour l'amplification d'ADN (comportant généralement au moins 15 nucléotides et de préférence au moins 17 nucléotides) capables de se lier à une séquence à amplifier.

Les oligonucléotides trouvent ainsi une application dans le diagnostic des désordres immunitaires en détectant la présence de séquences d'acides nucléiques homologues d'un gène codant pour des régions variables de chaines i des récepteurs des cellules T dans l'ARNm d'un échantillon d'un patient.

Différentes méthodes peuvent être utilisées pour établir un lien entre l'expression des gènes des cellules T et une maladie. Ces méthodes comprennent
a - la production et l'analyse de banques d'expressions d'ADNc obtenu à partir de cellules T liées à la maladie pour déterminer la fréquence de gènes dominants
b - l'analyse d'échantillons d'ADN génomique par Southern blot pour déterminer s'il existe des polymorphismes génétiques ou des réarrangements des gènes codant pour les récepteurs des cellules T ;
c - l'analyse d'échantillons par obtention d'ADNc, amplification par PCR et hybridation avec des sondes marquées
d - l'hybridation in situ de cellules T sans culture préalable des cellules T.

Les amorces trouvent une application dans des réactions de PCR dans une méthode telle que celle définie sous c ci-dessus.

Les anticorps monoclonaux, les fragments ou les dérivés de ces anticorps selon l'invention, notamment les anticorps anti V,peuvent être utilisés pour étudier des réponses immunitaires de type T, par exemple dans le domaine des maladies auto-immunes de la cancérologie, de l'allergie, de la transplantation et des. maladies infectieuses. En particulier, le répertoire des différents segments variables du récepteur T peut être étudié, qu'il s'agisse de cellules T du sang ou des tissus. D'une manière générale, les techniques utilisées peuvent être des méthodes in vitro ou in vivo.

Dans les méthodes in vitro, les échantillons utilisés peuvent être des échantillons de fluides corporels ou des échantillons de tissus. Les techniques utilisées peuvent inclure notamment la cytofluorimétrie de flux pour analyser les lymphocytes
T du sang ou des marquages par immunopéroxydase sur coupe anatomopathologique pour étudier les lymphocytes infiltrant les tissus.

Dans les méthodes in vivo, les anticorps, leurs fragments ou leurs dérivés sont administrés par les voies habituelles, par exemple par la voie intraveineuse, et l'on détecte les liaisons immunospécifiques. Ceci peut être obtenu par exemple dans le cas ou l'on utilise un anticorps marqué par un radioisotope.

2 - Les applications dans le domaine thérapeutique
Les oligonucléotides contenus dans les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisés en thérapeutique comme oligonucléotides antisens. On sait en effet qu'il est possible in vitro d'inhiber l'expression d'un gène transcript dans des lymphocytes humains en incubant ces lymphocytes avec un oligonucléotide antisens spécifique du gène en question (26). Ces oligonucléotides antisens comprennent généralement au moins 10 et, de préférence, au moins 16 nucléotides. Ces oligonucléotides antisens peuvent être notamment les séquences inversées et.

complémentées correspondant aux 20 nucléotides en- amont du site d'initiation de la traduction (ATG).

L'intérêt d'une utilisation in vitro d'oligonucléotides antisens spécifique d'un segment génique Vu ou est d'abolir (ou de dimnuer fortement) l'expression d'un récepteur T comprenant ce segment Voyou Ji et donc d'obtenir un phénomène de délétion clonale au niveau de la réactivité spécifique des lymphocytes T.

Les oligonucléotides ante sens peuvent non seulement être utilisés in vitro sur des lymphocytes T humains qui sont ensuite réinjectés, mais également in vivo par injection locale ou systémique de préférence après modifications pour augmenter la stabilité in vivo et la pénétration à l'intérieur des lymphocytes T de ces oligonucléotides.

Les anticorps monoclonaux selon l'invention, notamment les anticorps anti V , peuvent être utilisés pour moduler le système immunitaire. C'est ainsi que les anticorps peuvent être administrés pour bloquer l'interaction des cellules T effectrices avec leur antigène spécifique. On peut également administrer des anticorps anti-récepteurs T liés par exemple à une molécule cytotoxique ou à un radioisotope de façon à obtenir une délétion clonale, grâce à la fixation spécifique sur une chaine g d'un récepteur de cellule T.Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être utilisés en thérapeutique à des concentrations faiblement mitogéniques de façon à activer de façon spécifique certains sous-ensembles de cellules T ou peuvent être utilisés à des concentrations beaucoup plus élevées pour se fixer aux récepteurs concernés et ainsi marquer ces sous-ensembles en vue de leur élimination par le système réticulo-endothélial. Un critère important pour le traitement d'une maladie est l'aptitude à..

moduler des sous-ensembles de cellules T liées à une maladie. La nature exacte de cette modulation thérapeutique, à savoir bloquer ou supprimer un sousensemble particulier de cellules T ou au contraire stimuler et activer un sous-ensemble particulier, dépendra de la maladie en question et du sous-ensemble spécifique de cellules T concerné.

Ce type de traitement présente un avantage par rapport aux traitements actuels utilisant des anticorps tels que le traitement par des anticorps anti CD3 chez des patients ayant subi une transplantation rénale et ayant un problème de rejet, étant donné que grâce à l'invention il n'y aura pas de modulation de la totalité de la population des cellules T mais seulement du sous-ensemble de cellules T exprimant la sous-famille 4 particulière de récepteurs de cellules
T.

Par ailleurs, la réponse des cellules T étant souvent oligoclonale, il convient généralement d'utiliser en thérapeutique des "cocktails" de plusieurs anticorps.

On peut en outre utiliser les anticorps anti
V &alpha; pour sélectionner in vitro des lymphocytes T, par exemple par passage sur une colonne contenant des billes portant l'anticorps. Cette séparation de certains lymphocytes T peut être utilisée en vue d'une mise en culture de ces lymphocytes avant de les réinjecter au patient.

En outre, on peut utiliser en thérapeutique tout ou partie des séquences peptidiques selon l'invention, c'est-à-dire les séquences peptidiques codées par les séquences nucléotidiques selon l'invention ou les fragments de ces séquences (comprenant généralement au moins 8 à 10 aminoacides). Ces séquences ou ces fragments, administrés à l'homme ou à l'animal, peuvent agir en tant que leurre, c'est-à-dire qu'ils.

vont se fixer sur l'épitope porté par l'antigène.

néfaste et empêcher la réaction des cellules T normales avec l'antigène, en empêchant ainsi le développement d'une maladie agressive contre les déterminants du soi. Ils peuvent aussi être utilisés en tant qu'immunogènes dans la fabrication de vaccins (éventuellement après couplage à des porteurs protéiques).

On décrira ci-après plus en détail l'obtention des séquences nucléotidiques selon l'invention, en se reportant aux Fig. annexées sur lesquelles
- les Fig. 1 A à E donnent en alignement à la fois une séquence V i connue et une séquence partielle d'une extension selon l'invention pour les séquences respectives SEQ ID N" 6 à 10, notées IGRa 08 à IGRa 12. Sur ces Figures, la numérotation des nucléotides commence au codon ATG d'initiation (qui est souligné). Les points indiquent les nucléotides identiques. Les séquences qui sont supposées être des séquences leader sont surlignées.

- La Fig. 2 donne en alignement les nouvel les séquences J9(SEQ ID N" 12 à 20) notées IGRJa 01 à
IGRJa 09. Dans ces séquences les signaux de recombinaison de la lignée germinale sont soulignés. Les aminoacides correspondant aux codons hautement conservés sont marqués au-dessus des séquences. Les codons correspondant à une substitution en une position d'un aminoacide conservé sont doublement soulignés.

- La Fig. 3 donne les analyses par Southern blot de l'ADN génomique traité par une enzyme de restriction en utilisant des sondes spécifiques des séquences SEQ ID N" 1 à 5. Les enzymes de restriction utilisées sont EcoRI (colonne R), Hind III (colonne H): et Bam III (colonne B). Sur cette Figure, les triangles marquent la position des fragments d'ADN s'hybridant de façon spécifique avec C i.

I - Obtention de l'ADNc et amplification par PCR
On a utilisé comme source d'ARN des lymphocytes périphériques d'un individu.

L'ARN total a été préparé selon la méthode à l'isothiocyanate de guanidinium et au chlorure de césium (Chirgwin (10)) ou selon la méthode en une seule étape par extraction avec de l'isothiocyanate de guanidinium, du phénol et du chloroforme (Chomczynski (11)).

Le premier brin d'ADNc a été synthétisé dans un volume final de 50 microlitres à une température de 42" C pendant 1 heure en utilisant 5 microgrammes d'ARN total, la reverse transcriptase et une amorce A spécifique de la région C i constituée par la séquence 5'-GTTGCTCCAGGCCACAGCACTG (SEQ ID N" 21). Ce matériau a été ensuite purifié par extraction au phénol/chloro forme et précipitation à l'acétate d'ammonium. Après sélection d'une fraction 0,45/1 kb sur gel d'agarose, on a réalisé l'addition d'une extrémité dG sur l'hétéro duplex ARN/ADNc dans un tampon d'addition CoC12 avec 14 unités de terminal désoxynucléotidyl transférase (Tdt) pendant 30 mn à 37 C. La réaction a été stoppée par maintien à 70" C pendant 10 mn.NaOH 1N (1/3 de volume) a été ajouté et l'échantillon a été mis à incuber à 50 C pendant 1 heure pour hydrolyser l'ARN puis a été neutralisé avec du Tris HCl 2M pH 8 et HCl îN. Après extraction par un mélange phénol/ chloroforme le premier brin d'ADNc à extrémité G a été précipité avec de l'éthanol et soumis à une amplification en utilisant la technique PCR (Polymerase Chain.

Reaction décrite par Saiki et al. (12)) dans un volume final de 100 microlitres contenant 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-Cl pH 8.3, 1,5 mM de MgC12, 0,1 % (poids/ volume) de gélatine, 200 micromoles de dNTP, 2,5 unités de Taq polymérase et 100 picomoles de deux amorces. Les deux amorces utilisées sont, d'une part, une amorce poly-C (5'-GCATGCGCGCGGCCGCGGAGG-14C) (SEQ
ID N" 22) décrite par Loh et al. (13) ainsi qu'une amorce B spécifique de la région C 9 (5'-GTCCATAGACCTC
ATGTCCAGCACAG) (SEQ ID N" 23).

On effectue 25 cycles d'amplification suivis par une période de 15 mn d'élongation finale à 72" C.

Chaque cycle comprend une étape de dénaturation à 92"
C pendant 1 minute, une étape d'hybridation à 55" C pendant 2 mn et une période d'élongation à 72" C pendant 4 mn. Les produits amplifiés sont ensuite précipités par de l'éthanol, remis en suspension dans de l'acétate de sodium 30 mM pH5, NaCl 50 mM, ZnCl2 1 mM, glycérol 5 % en volume, et 1/10 de ce matériau est purifié en fonction de la taille sur un gel d'agarose à bas point de fusion 1 %.

Une seconde phase d'amplification est ensuite réalisée directement sur approximativement 10 * de la bande contenant l'agarose en suivant les mêmes conditions que précédemment, sauf qu'on utilise comme amorce C spécifique de la région C Cd l'amorce 5'-ATACACATCAGAATTCTTACTTTG (SEQ ID N" 24). Le mélange de réaction est ensuite précipité par l'éthanol et remis en suspension dans 60 ul H2O.

Il - Clonage et séquençage des ADNc
1/3 du produit de la seconde amplification est mis à digérer avec Sac II, séparé sur gel d'agarose 1 % et purifié par absorption sur des billes de verre. Le matériau est inséré dans le vecteur
Bluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, U.S.A.) et les recombinants obtenus sont utilisés pour transformer des souches XL1-bleu de E. Coli (Stratagene). Après dépôt en présence de X-galactosidase et IPTG, on fait un test sur les colonies blanches en utilisant une technique "dot blot" et comme sonde un troisième oligonucléotide spécifique de la région C g (5'-GTCACTGG
ATTTAGAGTCT) (SEQ ID N 25) marqué au 32p.On extrait 1'ADN plasmidique des colonies positives et on séquence sous les deux brins par le procédé par terminaison de chaine didésoxy (Sanger et al. (14)) avec de la Sequenase 2,0 (United States Biochemicals, Cleveland, Etats-Unis) en suivant les recommandations du fournisseur. Sauf pour la séquence SEQ ID N 5, toutes les séquences nucléotidiques ont été déterminées sur les deux brins en utilisant au moins deux clones distincts d'ADNc.

Les séquences obtenues ont été comparées aux séquences publiées V&alpha; et J&alpha;. en utilisant la méthode développée par Lipman et Pearson (15). Les codons de départ présumés ont été identifiés en recherchant la présence de la séquence consensus Kozak pour les sites d'initiation des traductions dans les cellules eucaryotes (Kozak (16)). La présence de séquences leader hydrophobes du côté N-terminal a été décelée par analyse de l'hydrophobicité selon la méthode décrite par Kyte (17).

III - Analyse par Southern blot
L'ADN a été extrait de la lignée cellulaire érythroleucémique humaine K562 et mis à digérer avec l'une des enzymes de restriction suivantes : Eco RI,
Bam HI ou Hind III. L'ADN (15 microgrammes) a été soumis à une électrophorèse sur agarose 0,7 g et a été transféré sur des membranes de Nylon comme décrit par
Triebel et al. (18). Les hybridations ont été réalisées à 65 C avec 6 X SSC, 0,5 % de SDS, 5 X
Denhardt's et 100 microgrammes d'ADN de sperme de saumon dénaturé pendant 16 heures. Les membranes ont été lavées à 65 C avec 2 X SSC, 0,2 g de SDS.

On a utilisé comme sondes V&alpha; spécifiques des sondes obtenues par amplification d'ADNc V-J-C ( > 500 bp) comprenant des fragments V&alpha; correspondant aux séquences SEQ ID N 1 à 5 en utilisant comme amorce l'amorce poly-C et l'amorce C. Les sondes ont été purifiées sur gel d'agarose 1 *. Des sondes d'ADN marquées au 32P ont été préparées à partir des fragments purifiés sur agarose par la méthode de Feinberg (19).

IV - Résultats
En utilisant la méthode A-PCR, 308 ADNc qui hybrident avec la sonde C &alpha; ont été clonés, puis séquencés. Parmi ceux-ci, 172 ADNc correspondent à des régions variables V-J-C&alpha; uniques.

Les séquences Vet Sonde l'invention figurent dans la liste des séquences respectivement sous les SEQ ID N 1 à 11 et SEQ ID N 12 à 20. Les séquences SEQ ID N 1 à 5 correspondent à des sous familles nouvelles (dénommées respectivement V&alpha;24, V&alpha;25, V&alpha;26, Va 27 et V&alpha;29) tandis que les séquences SEQ ID
N 6 à 11 correspondent à des extensions de segments V&alpha; connus.

1. Séquences Vcorrespondant à des sous-familles nouvelles
Les analyses par Southern blot d'ADN de lignée germinale soumis à une digestion par les endonucléases, en utilisant des sondes V-J-C&alpha; compre- nant des fragments V&alpha; correspondant aux séquences SEQ
ID N 1 à 5 ont été réalisées dans des conditions d'hybridation de "faible stringence" pour identifier le nombre de segments géniques V i appartenant à chaque famille et pour caractériser des fragments de restriction d'ADN portant ces segments géniques V&alpha;.

Des résultats représentatifs sont reportés sur la
Figure 3.

Ces analyses montrent que la sous famille correspondant à la séquence SEQ ID N 3 comprend au moins deux segments géniques alors que les autres séquences (SEQ ID N 1, N 2, N 4 et N 5) correspondent probablement à des membres uniques.

Les tailles des fragments de restriction de 1'ADN germinal sont les suivantes
SEQ ID N 1 : Ecà RI 4,7 kb, Hind III 3,7 kb
SEQ ID N 2 : Eco RI 2,2 kb, Hind III 4,8 et 5,7 kb,
Bam HI 25 kb
SEQ ID N 3 : Eco RI 4,6 et 7,5 kb, Hind III 4,2 et
6,4 kb, Bam HI 23 et 4,5 kb
SEQ ID N 4 : Eco RI 7,6 kb, Hind III 18 kb, Bam HI 9
et 0,9 kb
SEQ ID N 5 : ECO RI 5,9 et 4,8 kb, Hind III 6,6 kb,
Bam HI 6,5 kb.

2. Séquences correspondant à des extensions de séquences V connues
SEQ ID N 6 (IGR a 08) : Cette séquence correspond à une extension du côté 5' de la séquence du clone Vo?l AE11 (Klein et al. (21)). Les deux séquences alignées sont représentées sur la Figure 1A.

SEQ ID N 7 (IGR a 09) : Cette séquence correspond à une extension codant pour l'extrémité NH2 terminale de la séquence V < 2 AF110 (Klein déjà cité). Les deux séquences alignées sont représentées sur la Fig. 1B.

La séquence ID N 7 correspond à une séquence consensus. On a observé en position 206 l'existence d'un T au lieu dtun C.

SEQ ID N-" 8 (IGR a 010) : Cette séquence correspond à une extension de la région 5' du clone V Oc HAP35 (Yoshikai (22)). Les deux séquences alignées sont représentées sur la Fig. 1C. La séquence ID N 8 correspond à une séquence consensus. On a observé en position 307 l'existence d'un G au lieu d'un A et en position 360 l'existence d'un T au lieu d'un C.

SEQ ID N 9 (IGR a 11) : Cette séquence correspond à une extension du côté 3' de la séquence V&alpha; 7 HAP12 (Yoshikai déjà cité). L'alignement des sequences est représenté sur la Fig. 1D. La séquence ID N 9 correspond à une séquence consensus. On a observé en position 86 l'existence d'un C au lieu d'un T.

SEQ ID N 10 (IGR a 12) : Cette séquence comprend la région codante complète d'un gène de la sous famille
V 22 qui précédemment avait été identifié par la séquence partielle 113 bp AC9 (Klein déjà cité). Les deux séquences alignées sont représentées sur la Fig.

1E.

SEQ ID N 11 (IGRa 13) : Cette séquence correspond pour une partie aux clones HAVT 32 et HAVT 35 (appar- tenant à la sous-famille V&alpha; &alpha; 16 (8) et qui ont été décrits comme des pseudogènes. En fait, par suite de l'addition d'un nucléotide en position 108, la SEQ ID
N 11 code pour une région variable originale d'un récepteur des lymphocytes T.

3. Séquences JJ
On a représenté sur la Fig. 2 l'ensemble des nouvelles séquences JO( . Parmi les 9 segments Jo(, la plupart d'entre eux présentent une séquence d'aminoacides hautement conservée FGXGT des segments Ji comme décrit par Yoshikai déjà cité. Cependant, pour le segment IGRJa 07 le résidu thréonine est remplacé par un résidu isoleucine.

De plus, à la place du résidu phénylanine, on a trouvé un résidu cystéine dans IGRJa 02G.

La présente invention vise également à fournir des oligonucléotides spécifiques des différentes sous-familles V &alpha; , qui sont utilisables comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à ces différentes sous-familles V56 , en vue par exemple d'une étude de l'expression de certaines sous-familles V g chez un patient et finalement d'un diagnostic des désordres immunitaires, comme indiqué plus haut.

L'expression prédominante de certaines sousfamilles de Vo a déjà été étudiée à l'aide d'une gamme incomplète d'oligonucléotides. Ainsi, Nitta et al. (29) ont décrit l'expression prédominante des gènes V g 7 dans les lymphocytes infiltrant les tumeurs. Par ailleurs, Sottini et al. (30) ont décrit chez des patients atteints d'arthrite rhumatoïde l'étude du répertoire des Vp(.

La présente invention vise à fournir une gamme complète d'oligonucléotides permettant l'étude à la fois des sous-familles V &alpha; connues et des nouvelles sous-familles V&alpha; de linvention et qui soient tout-à -fait spécifiques de chaque sous-famille. Les oligonucléotides ont donc été choisis et synthétisés dans ce but et au besoin des modifications de un ou deux nucléotides ont été introduites par rapport aux séquences naturelles pour réduire les réactivités croisées entre sous-familles.

La présente invention a ainsi également pour objet des oligonucléotides, utilisables comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à des régions variables de chaînes A des récepteurs de cellules T, choisis parmi les séquences SEQ ID N 26 à 54.

La présente invention a également pour objet l'utilisation, comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à des régions variables de chaînes des récepteurs de cellules T, d'oligonucléotides choisis parmi les séquences SEQ ID N 26 à 54.

La présente invention a également pour objet un procédé de détection de séquences nucléotidiques codant pour des segments V &alpha; des récepteurs T ou d'ADNc correspondant aux produits de transcription de celles-ci, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend a) l'amplification de l'ADN avec au moins une paire d'amorces formée par un oligonucléotide choisi parmi les séquences SEQ ID N 26 à 54 et un oligonucléotide appartenant au segment C l , et b) la détection des séquences amplifiées avec une sonde
L'oligonucléotide appartenant au segment C utilisé pour l'amplification peut être notamment choisi parmi les séquences SEQ ID N 55 et 56.

Pour contrôler l'efficacité de l'amplification, on opère avantageusement en présence d'une paire d'amorces contrôle et on détecte la séquence contrôle correspondante amplifiée à l'aide d'une sonde contrôle correspondante.

Cette paire d'amorces contrôle peut correspondre à deux segments C&alpha;. Mais cette paire d'amorces est avantageusement constituée par deux amorces appartenant à la A-actine, notamment celles correspondant aux séquences SEQ ID N 58 et 59. On utilise alors une sonde de détection correspondant à une séquence de la -actine, telle que la séquence SEQ ID
N 60.

La présente invention a également pour objet un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé précédemment défini, qui comprend a) au moins un oligonucléotide choisi parmi les séquences SEQ ID N 26 à 54, b) une amorce C 04, c) une sonde Cot -
Un tel kit contient avantageusement en outre d) une paire d'amorces contrôle, e) une sonde contrôle.

Ce kit peut notamment comprendre a) l'ensemble des 29 oligonucléotides correspondant aux séquences SEQ ID N 26 à 54, b) une amorce C C&alpha; choisis parmi les séquences correspondant aux séquences SEQ ID N 55 et 56, c) une paire d'amorces contrôle pour la ss-actine ayant une séquence correspondant respectivement aux séquences SEQ ID N 58 et 59, d) une sonde C&alpha; correspondant à la séquence SEQ ID N 57, e) une sonde contrôle pour la p-actine correspondant à la séquence SEQ ID N 60.

Dans l'information donnée dans la liste des séquences pour les séquences 26 à 60, les séquences
SEQ ID N 26 à 47 correspondent à des séquences appartenant à des clones de sous-familles connues V&alpha; 1 à V&alpha; 22 (accessibles dans la base de données EMBL) ou à des séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.

Les séquences SEQ ID N 49, 50, 51, 52 et 54 correspondant à des séquences appartenant à des clones de nouvelles sous-familles de l'invention, correspondent à des sous-familles dénommées provisoirement V&alpha;w24, V&alpha;w25, V&alpha;w26, V&alpha;w27 et V&alpha;w29 (w indiquant que la désignation est dans l'attente d'une désignation définitive).

Les séquences SEQ ID N 48 et 53 correspondent à des séquences appartenant à des clones respectivement IGRaOl et IGRaO6 de sous-familles connues mais n'ayant pas encore reçu de désignation définitive (respectivement V i w23 et -V o( w28) dont un élément membre a déjà été décrit (respectivement Hinkkanen A.

et al. (31) et Bernard O. et al. (32)). La séquence complète de IGRaO6 n'a pas encore été publiée.

Les séquences SEQ ID N" 55 et 56 sont deux exemples d'oligonucléotides qui peuvent être utilisés comme amorces C 9 pour l'amplification.

La séquence SEQ ID NO 57 est la séquence d'une sonde r 'qui peut être utilisée pour la détec- tion des ADN amplifiés.

Enfin, les séquences SEQ ID N 58, 59 et 60 sont respectivement les séquences d'une paire d'oligonucléotides appartenant à la séquence de la -actine qui peuvent être utilisées pour le contrôle de l'amplification et la séquence d'une sonde pour détecter les ADN amplifiés correspondants.

Dans la liste des séquences, la position indiquée est la position de l'extrémité 5' à compter du site d'initiation prédictif de la traduction ATG.

Dans le cas où les séquences sont incomplètes (région 5' inconnue), la position (marquée avec un astérisque) est donnée par rapport au premier nucléotide de la séquence. Les nucléotides soulignés correspondent aux mésappariements introduits par rapport à la séquence naturelle.

Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un synthétiseur d'ADN automatisé Applied Biosystems 381 A en utilisant la méthode au F -cyanoéthylphosphoramidite (Sinha et al. (33)) et en suivant le protodole recommandé par le fabricant. Les oligonucléotides ont été détritylés dans l'appareil, clivés du support et déprotégés par l'ammoniac (à 60 C pendant 5 heures). Les produits bruts ont été purifiés par chromatographie haute pression en phase inversée sur une colonne de -bondapak C 18 en utilisant un gradient d'acétonitrile (9 à 15 *) dans un tampon acétate de triéthylammonium 0,01 M à pH 5,5.

L'amplification effectuée en utilisant les amorces selon l'invention peut être notamment la technique par PCR (Polymerase Chain Reaction) telle que décrite par Saiki et al. (12) et brevets US-A-4 683 195, 4 683 202, 4 889 818.

Pour la PCR, on peut utiliser un ADN double brin que l'on dénature ou un ADNc obtenu à partir d'ARN à l'aide de réverse transcriptase comme mentionné plus haut.

L'agent de polymérisation ' est une ADN polymérase, notamment la Taq polymérase.

Généralement, le cycle d'amplification est répété 25 à 40 fois.

Les sondes que l'on utilise pour la détection des séquences amplifiées peuvent être obtenues par marquage d'oligonucléotides avec un isotope radioactif, ce qui conduit à une détection par autoradiographie, ou par couplage avec une enzyme telle que la peroxydase (système ECL Amersham), la phosphatase alcaline ou la p-galactosidase (système Tropix
Ozyme), ce qui conduit à une détection par chimioluminescence.

L'exemple suivant illustre la mise en oeuvre du procédé de détection selon l'invention.

Les lymphocytes périphériques d'un individu sain ont été préparés par centrifugation sur un gradient de densité. L'ARN total a été extrait selon la méthode en une seule étape par extraction avec de l'isothiocyanate de guanidium, du phénol et du chloroforme (Chomczynski, 11). L'ADN complémentaire a été synthétisé dans un volume final de 20 p l à 42" C durant 1 heure en utilisant 1 à 5 Wg d'ARN total, la réverse transcriptase et l'amorce C&alpha;B (1,25 M).

Le matériel obtenu a ensuite été chauffé à 95 C durant 3 minutes avant d'être soumis à- une amplification selon la technique PCR en utilisant en parallèle chacune des amorces Va spécifique correspondant aux séquences SEQ ID N 26 à 54 et l'amorce C&alpha;B spécifique de la région C &alpha; (SEQ ID N 56). Cette amplification a été réalisée dans un volume final de 10 Vî par tube contenant 50 mM de KC1, 10 mM de tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM de MgC12 0,1 * (poids/volume) de gélatine, 200 M de dNTP, 0,25 unités de Taq polymérase et 0,25 M de chaque amorce.Dans chaque tube, une amplification contrôle a été réalisée à partir de 25 mN d'un fragment d'ADN de ss-actine de 877 paires de bases préparé par PCR et des amorces Act 1 et Act 2 (SEQ ID N 58 et 59) spécifiques de l'actine. 30 cycles d'amplification ont été effectués suivis d'une étape d'élongation finale de 5 minutes à 72 C. Chaque cycle comprenait une étape de dénaturation à 94 C pendant 1 minute, une étape d'hybridation à 65 C pendant 1 minute et une période d'élongation à 72 C pendant 1 minute.

Les produits obtenus ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2 %, transférés sur des membranes de nylon dans un tampon alcalin et hybridés simultanément avec les sondes oligonucléotides Co(C (SEQ ID N 57) et Act 3 (SEQ ID N 60) marquées au 32P par l'enzyme polynucléotidyl T4 kinase.

L'hybridation a été réalisée à 42 C pendant 16 heures dans un tampon contenant 6 X SSC, 0,5 % SDS, 5 X
Denhart's, 0,05 n PO4H2Na et 100 jAg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. Les membranes ont ensuite été lavées avec du SSC 6 X, 20mM P04H2Na, deux fois à température ambiante pendant 5 minutes et une fois à 50 C pendant 30 minutes puis autoradiographiées.

Les résultats sont montrés sur la figure 4.

Le contrôle d'actine (bande de 877 paires de bases) permet de vérifier l'amplification dans tous les puits. Il apparaît en-dessous de cette bande un signal spécifique dont la taille correspond à la taille des fragments amplifiés correspondants, chaque fragment ayant une longueur correspondant à la distance entre l'emplacement de l'oligonucléotide spécifique VOL et l'amorce C
Chez 11 individu testé, la Figure 4 met en évidence l'expression préférentielle de certains segments géniques définis par rapport à d'autres. Par exemple, les sous-familles V&alpha;27, 28 et 29 sont moins bien représentées que les sous-familles Vau 2, 3 et 6.

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20. Mengle-Gaw, L., et al., The EMBO Journal, 1987.

6:2273.

21. Klein, M.H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
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22. Yoshikai, Y., et al., J. Exp. med. 1986. 164:90.

23. Naudenbark A., et al., Nature, 341, 541.

24. Janeway C., Nature, 341, 482.

25. Lin Y., J. Exp. Med., 171, 221.

26. Acha-Orbea H., EMBO Journal, 1990,9, 12, 3815.

27. Kappler J., Science, 244, 811 28. Choi, Y., PNAS, 86, 8941.

29. Nitta T. et al., Science 1990, 249, 672.

30. Sottini A. et al., Eur. J. Immunol., 1991, 21,
461.

31. Hinkkanen A. et al., Immunogenetics, 1989, 29,
131.

32. Bernard O. et al., Oncogene, 1988, 2, 195.

33. Sinha N. et al., Nucleic Acids Res. 1984, 12,
4539.

LISTE DES SEQUENCES
I - INFORMATION GENERALE
(1) DEMANDEUR : Société dite ROUSSEL UCLAF
(2) TITRE DE L'INVENTION
Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables des chaînes &alpha; des récep-
teurs des lymphocytes T humains, segments
peptidiques correspondants et les applica
tions diagnostiques et thérapeutiques.

(3) NOMBRE DE SEQUENCES : 60
Il - INFORMATION POUR SEQ ID N 1
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 371 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :IGR a 02
SEQUENCE Vi w24
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGTCAACTTC TGGGAGCAGT CTCTGCAGAA TAAAA ATG AAA AAG CAT 47
Met Lys Lys His
1
CTG ACG ACC TTC TTG GTG ATT TTG TGG CTT TAT TTT TAT AGG GGG AAT 95
Leu Thr Thr Phe Leu Val Ile Leu Trp Leu Tyr Phe Tyr Arg Gly Asn 5 10 15 20
GGC AAA AAC CAA GTG GAG CAG AGT CCT CAG TCC CTG ATC ATC CTG GAG 143
Gly Lys Asn Gln Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu Ile Ile Leu Glu
25 30 35
GGA AAG AAC TGC ACT CTT CAA TGC AAT TAT ACA GTG AGC CCC TTC AGC 191
Gly Lys Asn Cys Thr Leu Gln Cys Asn Tyr Thr Val Ser Pro Phe Ser
40 45 50
AAC TTA AGG TGG TAT AAG CAA GAT ACT GGG AGA GGT CCT GTT TCC CTG 239
Asn Leu Arg Trp Tyr Lys Gln Asp Thr Gly Arg Gly Pro Val Ser Leu
55 60 65
ACA ATC ATG ACT TTC AGT GAG AAC ACA AAG TCG AAC GGA AGA TAT ACA 287
Thr lie Net Thr Phe Ser Glu Asn Thr Lys Ser Asn Gly Arg Tyr Thr
70 75 80
GCA ACT CTG GAT GCA GAC ACA AAG CAA AGC TCT CTG CAC ATC ACA GCC 335
Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Lys Gln Ser Ser Leu His Ile Thr Ala 85 90 95 1:00
TCC CAG CTC AGC GAT TCA GCC TCC TAC ATC TGT GTG 371
Ser Gln Leu Ser Asp Ser Ala Ser Tyr Ile Cys Val
105 110
III - INFORMATION POUR SEQ ID N 2
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 400 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :IGR a 03 SEQUENCE $&alpha; w25
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
GACTCTAAGC CCAAGAGAGT TTCTTGAAGC AAAAAAAAAA 40
AAAACCCATT CAGGAAATAA TTCTTTGCTG ATAAGG ATG CTC CTT GAA CAT TTA 94
Met Leu lieu Glu His lieu
1 5
TTA ATA ATC TTG TGG ATG CAG CTG ACA TGG GTC AGT GGT CAA CAG CTG 142
Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp Val Ser Gly Gln Gn Leu
10 15 20
AAT CAG AGT CCT CAA TCT ATG TTT ATC CAG GAA GGA GAA GAT GTC TCC 190
Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln Glu Gly Glu Asp Val Ser
25 30 35
ATG AAC TGC ACT TCT TCA AGC ATA TTT AAC ACC TGG CTA TGG TAC AAG 238
Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn Thr Trp Leu Trp Tyr Lys
40 @ 45 50
CAG GAC CCT GGG GAA GGT CCT GTC CTC TTG ATA GCC TTA TAT AAG GCT 286
Gln Asp Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Ile Ala Leu Tyr Lys Ala 55 60 65 70
GGT GAA TTG ACC TCA AAT GGA AGA CTG ACT GCT CAG TTT GGT ATA ACC 334
Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr Ala Gln Phe Gly Ile Thr
75 80 85
AGA AAG GAC AGC TTC CTG AAT ATC TCA GCA TCC ATA CCT AGT GAT GTA 382
Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala Ser Ila Pro Ser Asp Val
90 95 100
GCC ATC TAC TTC TGT GCT 400
Gly Ile Tyr Phe Cys Ala
105
IV - INFORMATION POUR SEQ ID N 3
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 339 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :IGR a 04
SEQUENCE V&alpha; w26
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGCTAAGGG ATG GAG ACT GTT CTG CAA GTA CTC CTA GGG ATA TTG GGG 48
Mat Glu Thr Val Leu Gln Val Leu Leu Gly Ile Leu Gly
1 5 10
TTC CAA GCA GCC TCG GTC AGT AGC CAA GAA CTG GAG CAG AGT CCT CAG 96
Phe Gln Ala Ala Trp Val Ser Ser Gln Glu Leu Glu Gln Ser Pro Gln
15 20 @ 25
TCC TTG ATC GTC CAA GAG GGA AAG AAT CTC ACC ATA AAC TGC ACG TCA 144
Ser Leu Ile Val Gln Glu Gly Lys Aen Leu Thr Ile Asn Cys Thr Ser 30 35 40 45
TCA AAG ACG TTA TAT GGC TTA TAC TGG TAT AAG CAA AAG TAT GGT GAA 192
Ser Lys Thr Leu Tyr Gly Leu Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Tyr Gly Glu
50 55 60
GGT CTT ATC TTC TTG ATG ATG CTA CAG AAA GGT GGG GAA GAG AAA AGT 240
Gly Leu Ile Phe Leu Met Met Leu Gln Lys Gly Gly Glu Glu Lys Ser
65 70 75
CAT GAA AAC ATA ACT GCC AAG TTG GAT GAG AAA AAG CAG CAA AGT TCC 288
His Glu Lys Ile Thr Ala Lys Leu Asp Glu Lys Lys Gln Gin Ser Ser
80 85 90
CTG CAT ATC ACA GCC TCC CAG CCC AGC CAT GCA GGC ATC TAC CTC TGT 336
Leu His Ile Thr Ala Ser Gln Pro Ser His Ala Gly Ile Tyr Leu Cys
95 100 105
GGA 339
Gly 110
V - INFORMATION POUR SEQ ID N" 4
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE :~nucléotide et sa protéine corres
pondant
LONGUEUR : 335 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :IGR a 05
SEQUENCE Vi w27
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGAAAAAAAA AATGAAGAAG CTACTAGCAA TGATCCTGTG GCTTCAACTA 50
GACCGGTTAA GTGGAGAGCT GAAAGTG GAA CAA AAC CCT CTG TTC 95
Glu Gln Asn Pro Leu Phe
1 5
CTG AGC ATG CAG GAG GGA AAA AAC TAT ACC ATC TAC TGC AAT TAT TCA 143
Leu Ser Met Gln Glu Gly Lys Asn Tyr Thr Ile Tyr Cys Asn Tyr Ser
10 15 20
ACC ACT TCA GAC AGA CTG TAT TGG TAC AGG CAG GAT CCT GGG AAA AGT 191
Thr Thr Ser Asp Arg Leu Tyr Trp Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Lys Ser
25 30 35
CTG GAA TCT CTG TTT GTG TTC CTA TCA AAT GGA GCA GTG AAG CAG GAG 239
Leu Glu Ser Leu Phe Val Leu Leu Ser Asn Gly Ala Val Lys Gln Glu
40 45 50
GGA CGA TTA ATG GCC TCA CTT GAT ACC ÀAA GCC CGT CTC AGC ACC CTC 287
Gly Arg Leu Met Ala Ser Leu Asp Thr Lys Ala Arg Leu Ser Thr Leu 55 60 65 70
CAC ATC ACA GCT GCC GTG CAT GAC CTC TCT GCC ACC TAC TTC TGT GCC 335
His Ile Thr Ala Ala Val His Asp Leu Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
75 80 85
VI - INFORMATION POUR SEQ ID N 5
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 361 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :IGR a 07
SEQUENCE V&alpha;w29
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
GAAGCTGACT GGATATTCTG GCAGGCCAAG G ATG GAG ACT CTC CTG 46
Met Glu Thr Leu Leu 1 @
AAA GTG CCT TCA GGC ACC TTG TTG TGG CAG TTG ACC TGG GTG GGA AGC 94
Lys Val Pro Ser Gly Thr Leu Leu Trp Gln Leu Thr Trp Val Gly Ser
10 15 20
CAA CAA CCA GTG CAG AGT CCT CAA GCC GTG ATC CTC CGA GAA GGG GAA 142
Gln Gln Pro Val Gln Ser Pro Gin Ala Val Ile Leu Arg Glu Gly Glu
25 30 35
GAT GCT GTC ACC AAC TGC AGT TCC TCC AAG GCT TTA TAT TCT GTA CAC 190
Asp Ala Val Thr Asn Cys Ser Ser Ser Lys Ala Leu Tyr Ser Val Hie
40 45 50
TGG TAC AGG CAG AAG CAT GGT GAA GCA CCC GTC TTC CTG ATG ATA TTA 238
Trp Tyr Arg Gln Lys His Gly Glu Ala Pro Val Phe Leu Met Ile Leu
55 60 65
CTG AAG GGT GGA GAA CAG ATG CGT CGT GAA AAA ATA TCT GCT TCA TTT 286
Leu Lys Gly Gly Glu Gln Met Arg Arg Glu Lys île Ser Ala Ser Phe 70 - 75 80 85
AAT GAA AAA AAG CAG CAA AGC TCC CTG TAC CTT ACG GCC TCC CAG CTC 334
Asn Glu Lys Lys Gln Gln Ser Ser Leu Tyr Leu Thr Ala Ser Gln Leu
90 95 100
AGT TAC TCA GGA ACC TAC TTC TGC GGG 361
Ser Tyr Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Gly
105 110
VII - INFORMATION POUR SEQ ID NO 6
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 569 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :IGR a 08
SEQUENCE VZ1
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
TCAGTTTCTT 10
CTTCCTGCAG CTGGTTGAGT TCTTTCCAGA CAAAGACAAG TGACAAGAAT TAGAGGTTTA 70
AAAAGCAACC AGATTCATCT CAGCAGCTTT TGTAGTTTTA AATAAGCAAG GAGTTTCTCC 130
AGCGAAACTT CCTCACACCT CTTGGTCTTG GTCTCTTCAG ACACTTTCCT TCCTGTTCTC 190
TGGAGATCTT GCAGAAAAGA GCCTGCAGTG TTTCCCTTGC TCAGCC ATG CTC CTG 245
Met Leu Leu
1
GAG CTT ATC CCA CTG CTG GGG ATA CAT TTT GTC CTG AGA ACT GCC AGA 293
Glu Leu île Pro Leu Leu Gly Ile His Phe Val Leu Arg Thr Ala Arg
5 10 15
GCC CAG TCA GTG ACC CAG CCT GAC ATC CAC ATC ACT GTC TCT GAA GGA 341
Ala Gln Ser Val Thr Gln Pro Asp Ile His Ile Thr Val Ser Glu Giy 20 25 30 35
GCC TCA CTG GAG TTC AGA TGT AAC TAT TCC TAT GGG-GCA ACA CCT TAT 389
Ala Ser Leu Glu Leu Arg Cys Asn Tyr Ser Tyr Gly Ala Thr Pro Tyr
40 45 50
CTC TTC. TGG TAT GTC CAG TCC CCC GGC CAA GGC CTC CAG CTG CTC CTG 437
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Gln Leu Leu Leu
55 60 65
AAG TAC TTT TCA GGA GAC ACT CTG GTT CAA GGC ATT AAA GGC TTT GAG 485
Lys Tyr Phe Ser Gly Asp Thr Leu Val Gln Gly Ile Lys Gly Phe Glu
70 75 80
GCT GAA TTT AAG AGG AGT CAA TCT.TCC TTC AAC CTG AGG AAACCC TCT 533
Ala Glu Phe Lys Arg Ser Gln Ser Ser Phe Asn Leu Arg Lys Pro Ser
85 90 95
GTG CAT TGG AGT GAT GCT GCT GAG TAC TTC TGT GCT 569
Val His Trp Ser Asp Ala Ala Glu Tyr Phe Cys Ala 100 105- 110
VIII - INFORMATION POUR SEQ ID N 7
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 330 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE :ADNc pour ARNm
SEQUENCE CONSENSUS
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR a 09
SEQUENCE V&alpha;2
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AAA TCC TTC AGA GTT TTA CTA GTG ATC CTG TGG CTT CAG CTG AGC CGG 48
Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser Arg
1 5 10 15
GTT TCG AGC CAA CAG AAG GAG GTG GAG CAG AAT TCT GGA CCC CTC AGT 96
Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser
20 25 30
GTT CCA GAG GGA GCC ATT GCC TCT CTC AAC TGC ACT TAC AGT GAC CGA 144
Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg
35 40 45
GGT TCC CAG TCC TTC TTC TCG TAC AGA CAA TAT TCT GGG AAA AGC CCT 192
Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro
50 55 60
GAG TTC ATA ATG TCC ATA TAC TCC AAT GGT GAC AAA GAA GAT GGA AGG 240
Glu Leu Ile Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg
65 70 75 80
TTT ACA CGA CAG CTC AAT AAA GCC AGC CAG TAT GTT TCT CTG CTC ATC 288
Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile
85 90 95
AGA GAC TCC CAG CCC AGT GAT TCA GCC ACC TAC CTC TGT GCC 330
Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala
100 105 110
Ix - INFORMATION POUR SEQ ID N 8
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 400 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
SEQUENCE CONSENSUS
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :IGR a 10
SEQUENCE V&alpha;5
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
GCCAAACAGA ATGGCTTTTT GGCTGAGAAG GCTGGGTCTA CATTTCAGGC 50
CACATTTGGG GAGACGA ATG GAG TCA TCC CTG GGA GGT GTT TTG
Met Glu Ser Ser Leu Glv Glv Val Lau
1 5
CTG ATT TTC TGG CTT CAA GTG GAC TGG GTG AAG AGC CAA AAC ATA GAA 142
Leu Ile Leu Trp Leu Gln Val Asp Trp Val Lys Ser Gln Lys Ile Glu 10 15 20 - 25
GAG AAT TCC GAG GCC CTG AAC ATT CAG GAG GGT AAA ACG GCC ACC CTG 190
Gln Asn Ser Glu Ala Leu Asn Ile Gln Glu Gly Lys Thr Ala Thr Leu
30 35 40
ACC TGC AAC TAT ACA AAC TAT TCT CCA GCA TAC TTA CAG TGG TAC CGA 238
Thr Cys Asn Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ala Tyr Leu Gln Trp Tyr Arg
45 50 55
CAA GAT CCA GGA AGA GGC CCT GTT TTC TTG CTA CTC ATA CGT GAA AAT 286
Gln Asp Pro Glv Arg Gly Pro Val Phe Leu Leu Leu Ile Arg Glu Asn
60 65 70
GAG AAA GAA AAA AGG AAA GAA AGA CTG AAG GTC ACC TTT GAT ACC ACC 334
Glu Lys Glu Lys Arg Lys Glu Arg Leu Lys Val Thr Phe Asp Thr Thr
75 80 85
CTT AAA CAG AGT TTC TTT CAT ATC ACA GCC TCC GAG CCT GCA GAC TCA 382
Leu Lys Gln Ser Leu Phe His Ile Thr Ala Ser Gln Pro Ala Asp Ser 90 95 100 105
GCT ACC TAC CTC TCT GCT .400
Ala Thr Tyr Leu Cys Ala
110
X - INFORMATION POUR SEQ ID N 9
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 386 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
SEQUENCE CONSENSUS
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :IGR a 11
SEQUENCE V&alpha;7
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
GCCTTCTGCA GACTCCAATG GCTCAGGAAC TGGGAATGCA GTGCCAGGCT 50
CGTGGTATCC TGCAGCAG ATG TGG GGA GTT TTC CTT CTT TAT GTT 95
Met Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val
1 5
TCC ATG AAG ATG GGA GGC ACT ACA GGA CAA AAC ATT GAC CAG CCC ACT 143
Ser Met Lys Met Gly Gly Thr Thr Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr 10 15 20 25
GAG ATG ACA GCT ACG GAA GGT GCC ATT GTC CAG ATC AAC TCG ACG TAC 191
Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr
30 35 40
CAG ACA TCT GGG TTC AAC GGG CTG TTC TGG TAC CAG CAA CAT CGT GGC 239
Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly
45 . 50 55
GAA GCA CCC ACA TTT CTG TCT TAC AAT GTT GTC GAT GGT TTG GAG GAG 287
Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu
60 65 70
AAA GGT CGT TTT TCT TCA TTC CTT AGT CGG TCT AAA GGG TAC AGT TAC 335
Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr
75 80 85
CTC CTT TTG AAG GAG GTG CAG ATG AAA GAC TCT GCC TCT TAC GTG TGT 383
Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys 90 95 100 105 CGT 386
Ala
XI - INFORMATION POUR SEQ ID N" 10
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 383 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE :ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR a 12
SEQUENCE Vo(22
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
TGTGACTTCT TCATGTTAAG GATCAAGACC ATTATTTGGG TAACACACTA 50
AAG ATG AAC TAT TCT CCA GGC TTA GTA TCT CTG ATA CTC TTA CTG 95
Met Asn Tyr Ser Pro Gly Leu Val Ser Leu Ile Leu Leu Leu
1 5 . 10
CTT GGA AGA ACC CGT GGA GAT TCA GTG ACC CAG ATG GAA GGG CCA GTG 143
Leu Gly Arg Thr Arg Gly Asp Ser Val Thr Gln Met Glu Gly Pro Val 15 20 25 30
ACT CTC TCA GAA GAG GCC TTC CTG ACT ATA AAC TGC ACG TAC ACA GCC 191
Thr Leu Ser Glu Glu Ala Phe Leu Thr Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Ala
35 40 45
ACA GGA TAC CCT TCG CTT TTC TCG TAT GTC CAA TAT CCT GGA GAA GGT 239
Thr Gly Tyr Pro Ser Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Glu Gly
50 55 60
CTA CAG CTC GTG CTG AAA GCC ACG AAG CGT GAT GAC AAG GGA AGC AAC 287
Leu Gln Leu Leu Leu Lys Ala Thr Lys Ala Asp Asp Lys Giy Ser Asn
65 70 75
AAA GGT TTT GAA GCC ACA TAC CGT AAA GAA ACC ACT TCT TTC CAC TTG 335
Lys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Arg Lys Glu Thr Thr Ser Phe His Leu
80 85 90
GAG AAA GGC TCA GTT CAA GTG TCA GAC TCA GCG GTG TAC TTC TGT GCT 383
Glu Lys Gly Ser Val Gln Val Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 95 100 105 110
XII - INFORMATION POUR SEQ ID N 11
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 364 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :IGR a 13
SEQUENCE V&alpha; 16
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AATCCCGCCC GCCGTGAGCT TAGCTGGAGC C ATG GCC TCT CGA CCC 46
Met Ala Ser Ala Pro
1 5
ATC TCG ATG CTT GCG ATG CTC TTC ACA TTG AGT GGG CTG AGA GCT CAG 94
Ile Ser Met Leu Ala Met Leu Phe Thr Leu Ser Gly Leu Arg Ala Gln
10 15 20
TCA GTG CGT CAG CCG GAA GAT CAG GTC AAC GTT GCT GAA GGG AAT CCT 142
Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly Asn Pro
25 30 35
CTG ACT GTG AAA TGC ACC TAT TCA GTC TCT GGA AAC CCT TAT CTT TTT 190
Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr Leu Phe
40 45 50
TCG TAT GTT CAA TAC CCC AAC CGA CCC CTC CAG TTC CTT CTG AAA TAC 238
Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu Lys Tyr
55 60 65
ATC ACA GGG GAT AAC CTG GTT AAA GGC AGC TAT GGC TTT GAA CGT GAA 286
Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu Ala Glu 70 75 80 85
TTT AAC AAG AGC CAA ACG TCC TTC CAC CTG AAG AAA CGA TCT GCC CTT 334
Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser Ala. Leu
90 95 100
GTG AGC GAC TCG CGT TTG TAC TTC TGT CGT 364
Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala
105 110
XIII - INFORMATION POUR SEQ ID N 12
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 264 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :Ja 01
SEQUENCE J
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
CCTTCAAGGA AAATTAAGGC AAATAGAATT GGGCTGGGGA GTTGCTACTT ATTAGTATTC 60
CTCCCACGTT CTAACCTAAT TATAAGGAGG TTGTTTTGGC CATGGGCAGT CATCTCAGGT 120 TTTGTTTTCC TGCTTTCCTC CCTAACCTCC ACCTGTCTTC CTAGAGGCCT GAGTCAAGGT 180
TATTGCAATA GCACTAAAGA CTGTGT AAC ACC AAT GCA GGC AAA TCA ACC TTT 233
Asn Thr Asn Ala Gly Lys Ser Thr Phe
1 5
GGG GAT GGG ACT ACG CTC ACT GTG AAG CCA 264
Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro
10 15
XIV - INFORMATION POUR SEQ ID N 13
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 277 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : Ja 02
SEQUENCE J
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AAGGACACAG ACTGCCTGCA TGAAGGCTGG AGCTGGGCCC AGGATGAGGA AAGGCCTCAG 60 GAAGGAAGGG CTGACACGAA ATAAGGAATA CCATGGCATT CATGAGATGT GCGTCTGAAT 120
CCTCTCTCTT GCCTGAGAAG CTTTAGCTTC CACCTTGAGA CACAAAACAT GTGGTTATGA 180
AGAGATGACA AGGTTTTTGT AAAAGAATGA GCCATTGTGG ATA GGC TTT GGG AAT 234
Ile Glv Phe Glv Asn
1 5
GTG CTG CAT TGC GCG TCC GGC ACT CAA TGT ATT GTT TTA CCA 277
Val Leu His Cys Gly Ser Gly Thr Gln Val Ile Val Leu Pro
10 15
XV - INFORMATION POUR SEQ ID N" 14
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE :-nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 58 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULES : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : Ja 03
SEQUENCE
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AA ACC AGT GGC TCT AGG TTG AGG TTT GGG GAA GGA ACA GAG GTC ACA 47
Thr Ser Gly Ser Arg Leu Thr Phe Gly Glu Gly Thr Gln Leu Thr
1 5 10 15
GTG AAT CCT CA 58
Val Asn Pro
XVI - INFORMATION POUR SEQ ID N 15
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 60 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE :ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : Ja 04
SEQUENCE J g
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
TA GAT ACT GGA CCC TTC AAA ACT ATC TTT GGA CGA GGA ACA AGA CTA 47
Asp Thr Gly Gly Phe Lys Thr Ile Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu
i 5 10 15
TTT GTT AAA CGA A 60
Phe Val Lys Ala
XVII - INFORMATION POUR SEQ ID NO 16
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 59 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :Ja 05
SEQUENCE J A
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
C CTA ACT GGG CGA AAC AAC GTC TTC TTT GGG ACT GGA ACG AGA CTC 46
Leu Thr Gly Ala Asn Asn Val Phe Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu
1 5 10 15
ACC GTT CTT CCC T 59
Thr Val Leu Pro XVII I - INFORMATION POUR SEQ ID N" 17
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR-: 60 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : Ja 06
SEQUENCE J
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AT GGA GGA AGC CAA GGA AAT CTC ATC TTT GGA AAA CCC ACT AAA CTC 47
Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu
L 5 10 15
TCT GTT AAA CCA A 60
Ser Val Lys Pro
XIX - INFORMATION POUR SEQ ID N 18
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucleotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 56 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :Ja O7
SEQUENCE J&alpha;
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
GGA GCC AAT AGT AAC CTG ACA TTT GGA AAA GGA ATA AGT CTC AGT GTT 48
Gly Ala Asn Ser Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val 1 5 10 15
AGA CCA CA 56
Arg Pro
XX - INFORMATION POUR SEQ ID N" 19
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 57 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :Ja 08
SEQUENCE J
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
CT GGT CCC TAC AAT AAG CTG ATT TTT GGA CGA GGC ACC ACG CTC CGT 47
Gly Gly Tyr Asn Lys Leu Ile Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Ala
1 5 10 15
GTA CAC CCA T 57
Val His Pro
XXI - INFORMATION POUR SEQ ID N" 20
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres
pondante
LONGUEUR : 50 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULES : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN :Ja 09
SEQUENCE J
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
T GGA AAC AAG CTG GTC TTT CCC CGA GGA ACC ATT CTG AGA GTC ARG 46
Gly Asn Lys Leu Val Phe Gly Ala Gly Thr Ile Leu Arg Val Lys
1 5 10 15
TCC T 50
Ser
XXII - INFORMATION POUR SEQ ID N" 21 à 25
TYPE OLIGONUCLEOTIDES
DESCRIPTION DES SEQUENCES
N" 21 A (5'-GTTGCTCCAGGCCACAGCACTG)
N 22 poly C (5'-GCATGCGCGCGGCCGCGGAGG-14C)
N 23 B (5'-GTCCATAGACCTCATGTCCAGCACAG)
N 24 C (5'-ATACACATCAGAATTCTTACTTTG)
N 25 D (5'-GTCACTGGATTTAGAGTCT)
XXIII - INFORMATION POUR SEQ ID N' 26 à 60
TYPE OLIGONUCLEOTIDES
DESCRIPTION DES SEQUENCES
SEQ ID Sequence Type Clone Position N - 26 5'-GGCATTAACGGTTTTGAGGCTGGA-3' Val AB22 235 27 5'-CAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGC-3' V&alpha;2 IGRa09 93* 28 5'-CCGGGCAGCAGACACTGCTTCTTA-3' Va3 HAPOS 297 29 5'-TTGGTATCGACAGCTTCCCTCCCA-3' V&alpha;4 HAP08 153 30 5'-CGGCCACCCTGACCTGCAACTATA-3' VQ5 IGRalO 113 31 5'-TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCT-3' Va6 HAPO1 287
32 5'-GCAACATGCTGGCGGAGCACCCAC-3' V&alpha;7 IGRall 159 33 5'-CATTCGTTC AATGTGGGCAAAAG-3' Va8 HAP41 204 34 5'-CCAGTACTCCAGACAACGCCTGCA-3' Va9 HAVP36 168 35 5'-CACTGCGGCCCAGCCTGGTGATAC-3' ValO HAP58 282 36 5'-CGCTGCTCATCCTCCAGGTGCGGG-3' V&alpha;11 AB19 254* 37 5'-TCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCA-3' V&alpha;;12 V12MA483 213* 38 5'-TTCATCAAAACCCTTGGGGACAGC-3' Val3 HAVT15 152 39 5'-CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTT-3' Va14 HAVT20 181
40 5'-TTGCAGACACCGAGACTGGGGACT-3' V&alpha;15 HAVT31 278
41 5'-TCAACGTTGCTGAAGGGAATCCTC-3' V&alpha;16 IGRa13 89
42 5'-TGGGAAAGGCCGTGCATTATTGAT-3' V&alpha;17 AB11 204
43 5'-CAGCACCAATTTCACCTGCAGCTT-3' V&alpha;18 AB21 114
44 5'-ACACTGGCTGCAACAGCATCCAGG-3 Val9 AC24 162
45 5'-TCCCTGTTTATCCCTGCCGACAGA-3' Va20 AE212 232
46 5'-AGCAAAATTCACCATCCCTGAGCG-3' V&alpha;21 AF211 92
47 5'-CCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGA-3' V&alpha;22 IGRa12 197
48 5'-TGCCTCGCTGGATAAATCATCAGG-3' V&alpha; ;w23 IGRa01 246
49 5'-CTGGATGCAGACACAAAGCAGAGC-3' V&alpha;w24 IGRa02 259 50 5'-TGGCTACGGTACAAGCCGGACCCT-3' V&alpha;w25 IGRa03 148
51 5'-AGCGCAGCCATGCAGGCATGTACC-3' V&alpha;w26 IGRa04 299
52 5'-AAGCCCGTCTCAGCACCCTCCACA-3' V&alpha;w27 IGRa05 268* 53 5'-TGGTTGTGCACGAGCGAGACACTG-3' V&alpha;w28 IGRa06 95
54 5'-GAAGGGTGGAGAACAGATGCGTCG-3' V&alpha;w29 IGRa07 210
55 5'-ATACACATCAGAATTCTTACTTTG-3' CaA 129 56 5'-GTTGCTCCAGGCCGCGGCACTGTT-3' C&alpha;B 201 57 5'-GTCACTGGATTTAGAGTCT-3' CaC 57 58 5' -ATTTGCGGTGGACGATGGAGGGGC-3 ' Act1 B-actine 1161 59 5'-GGCATCGTCACCAACTGGGACGAC-3' Act 2 ss-actine 261 60 5'-ACCACCACGGCGGAGCGGG-3' Act 3 ss-actine 642

Claims (31)

REVENDICATIONS

1. Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaines g des récepteurs des lymphocytes T humains, correspondant à des ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque

a - des segments V &alpha; correspondant à l'une des séquences SEQ ID N 1 à 11, et b - des segments J&alpha; &alpha; correspondant à l'une des séquences SEQ ID N 12 à 20 et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.

2. Séquences selon la revendication 1 codant pour des régions variables des chaînes 4 des récepteurs des lymphocytes T humains, corespondant à des

ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments V&alpha; correspondant à l'une des séquences SEQ ID N 1 à 10, et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.

3. Séquences selon la revendication 1 codant pour des régions variables des chaines g des récepteurs des lymphocytes T humains, correspondant à des

ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments J A correspondant à l'une des séquences SEQ ID N 12 à 20, et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.

4. Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaines i des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments V&alpha;corres- pondant à l'une des séquences SEQ ID N 1 à 5, et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.

5. Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaines < des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vv corres- pondant à l'une des séquences

1 à 467 de SEQ ID N 6

1 à 77 de SEQ ID N 7

1 à 151 de SEQ ID N 8

291 à 386 de SEQ ID N 9

1 à 260 de SEQ ID N 10 et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.

6. Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaines &alpha; des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie de la séquence nucléotidique correspondant à la SEQ ID N 11 et qui comprennent le nucléotide 108.

7. Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaines A des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments JX corres- pondant à l'une des séquences SEQ ID N 12 à 20 et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.

8. Peptides codés par l'une quelconque des séquences nucléotidiques telles que définies à l'une quelconque des revendications 1 à 7, ainsi que les allèles et les dérivés de ceux-ci qui possèdent la même fonction.

9. Peptides constitués par ou comprenant une séquence peptidique codée par tout ou partie de la séquence 108 à 364 de SEQ ID N" 11.

10. Vecteurs d'expression comprenant une séquence d'ADN codant pour l'un des peptides tel que défini à la revendication 8 ou à la revendication 9.

11. Hotes transformés avec un vecteur selon la revendication 10.

12. Anticorps dirigés contre un déterminant antigénique d'un des peptides définis à la revendication 8 ou à la revendication 9.

13. Anticorps selon la revendication 11 qui est un anticorps monoclonal ou un fragment de celui-ci.

14. Fragment Fab, Fab' ou (Fab')2 d'un anticorps monoclonal selon la revendication 13 et dérivés de celui-ci.

15. Dérivés d'un anticorps monoclonal ou d'un fragment de celui-ci selon la revendication 13 ou 14 auxquels sont liés un marqueur détectable et/ou au moins une molécule thérapeutique.

16. Hybridomes produisant un anticorps selon la revendication 13.

17. Composition de diagnostic comprenant un ou plusieurs anticorps monoclonaux, fragments ou dérivés de ceux-ci tels que définis à l'une quelconque des revendications 13 à 15.

18. Composition thérapeutique comprenant un ou plusieurs anticorps monoclonaux, fragments ou dérivés de ceux-ci tels que définis à l'une des revendications 13 à 15.

19. Composition selon la revendication 18 comprenant des dérivés contenant une molécule cytotoxique ou un radioisotope.

20. Composition thérapeutique comprenant au moins l'un des peptides définis à la revendication 8 ou à la revendication 9.

21. Composition thérapeutique comprenant des oligonucléotides antisens correspondant à l'une quelconque des séquences d'un segment V &alpha; ou dans l'une quelconque des séquences d'un segment J&alpha; &alpha; telles que définies à l'une quelconque des revendications 4 à 7.

22. Utilisation, en tant qu'amorces pour l'amplification d'ADN, de séquences nucléotidiques d'environ au moins 17 nucléotides comprises dans l'une quelconque des séquences d'un segment voÇ ou dans l'une quelconque des séquences d'un segment J&alpha; &alpha; telles que définies à l'une quelconque des revendications 4 à 7.

23. Utilisation, en tant que sonde de détection, de séquences nucléotidiques d'environ au moins 10 nucléotides comprises dans l'une quelconque des séquences d'un segment V g ou dans l'une quelcon- que des séquences d'un segment J &alpha; telles que définies à l'une quelconque des revendications 4 à 7.

24. Oligonucléotides, utilisables comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à des régions variables de chaînes cd des récepteurs de cellules T, choisis parmi les séquences SEQ ID N 26 à 54.

25. Utilisation, comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à des régions variables de chaines des récepteurs de cellules T, d'oligonucleotides selon la revendication 24.

26. Utilisation selon la revendication 25 d'oligonucléotides choisis parmi les séquences SEQ ID

N 49, 50, 51, 52 et 54.

27. Procédé de détection de séquences nucléotidiques codant pour des segments-Vi des récepteurs T ou d'ADNc correspondant aux produits de transcription de celles-ci, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend

a) l'amplification de l'ADN avec au moins une paire d'amorces formée par l'un des oligonucléotides selon la revendication 24 et un oligonucléotide appartenant au segment C & , et

b) la détection des séquences amplifiées avec une sonde C&alpha;

28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que lTon effectue l'amplification en présence d'une paire d'amorces contrôle et la détection à l'aide d'une sonde contrôle.

29. Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'il comprend

a) au moins un oligonucléotide selon la revendication 24,

b) une amorce

c) une sonde C.

30. Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il comprend

a) au moins un oligonucléotide selon la revendication 24,

b) une amorce

c) une paire d'amorce contrôle,

d) une sonde Coi,

e) une sonde contrôle.

31. Kit selon la revendication 29 ou la revendication 30 comprenant

a) l'ensemble des 29 oligonucléotides selon la revendication 24,

b) une amorce Ci choisie parmi les séquences correspondant aux séquences SEQ ID N 55 et 56,

c) une paire d'amorces contrôle pour la ss-actine ayant une séquence correspondant respectivement aux séquences SEQ ID NC 58 et 59,

d) une sonde C&alpha;correspondant à la séquence

SEQ ID N 57, e) une sonde contrôle pour la p -actine correspondant à la séquence SEQ ID N 60.