KR20050016491A - 티세포 수용체 씨디알3 서열 및 검출방법 - Google Patents

티세포 수용체 씨디알3 서열 및 검출방법

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KR20050016491A
KR20050016491A KR10-2004-7019564A KR20047019564A KR20050016491A KR 20050016491 A KR20050016491 A KR 20050016491A KR 20047019564 A KR20047019564 A KR 20047019564A KR 20050016491 A KR20050016491 A KR 20050016491A
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베일러 칼리지 오브 메디신
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Abstract

본 발명은 일반적으로 다발성 경화증(MS, multiple sclerosis), 류머티스 관절염(RA, rheumatoid arthritis) 등과 같은 자가면역 질병을 치료하는 분야에 관련된다. T 세포 수용체 펩티드를 이용하여 자가면역질병을 치료 및 감시하는 방법이 개시되었다. MS 환자의 집단에서 발견된 T 세포 수용체의 핵산 및 펩티드 서열도 또한 개시되었다.

Description

티세포 수용체 씨디알3 서열 및 검출방법{T cell receptor CDR3 sequences and methods for detection}
본 발명은 일반적으로 다발성 경화증(MS, multiple sclerosis)과 같은 자가면역질병의 치료 분야에 관련된다. 특히, 이것은 몇몇 MS 환자에게서 발견되는 T-세포 수용체 핵산 및 펩티드, 그리고 그 서열을 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 MS와 같은 자가면역 질병의 처리를 위한 T-세포 수용체 펩티드 서열의 이용에 관한 것이다.
세포독성 T 림프구 또는 T 헬퍼(보조)세포 상의 T 세포 수용체(TCR, T cell receptor)에 의해 형성되는 세포내 인식복합체 및 항원제시세포(APC, antigen presenting cell) 상의 MHC/펩티드는 각 유기체(양의 선택; 음의 선택; 말단 생존) 내의 T 세포의 레퍼토리의 발현기와 적응성 면역반응의 조절(T 헬퍼) 및 효력 단계(T 킬러) 동안 TCR을 활성화하는 세포-세포 충돌의 다양한 세트에서의 공동 인식성분이다.
적응성 면역반응에서, 항원은 어떠한 항원도 인식할 수 있는 충분히 다양한 구조로 표현되는 TCR 또는 항체와 같은 과변성 분자에 의해 인식된다. 항체는 항원 표면의 어떠한 부분에도 결합할 수 있다. 그러나 TCR은 주조직적합성 복합체(MHC, major histocompatibility complex)의 classⅠ 또는 classⅡ 분자에 결합된 APC의 표면에 존재하는 항원으로부터의 짧은 펩티드에 결합함으로써 항원의 존재를 인식하는 것이 제한된다. 펩티드/MHC 복합체의 TCR 인식은 T 세포의 활성화(클론 확대)를 일으킨다.
TCR은 αβ(알파-베타) 또는 γδ(감마-델타)일 수 있는 두 개의 사슬로 구성되는 이형이량체이다. TCR의 구조는 면역글로불린(Ig)의 그것과 매우 유사하다. 각 사슬은 면역글로불린 폴드인 두 개의 세포외 영역을 가진다. 아미노 글로불린 말단영역은 매우 다양하며 가변(V) 영역이라 한다. 세포막에 가장 가까운 영역은 불변(C) 영역이다. 이들 두 영역은 면역글로불린의 그것과 유사하고 Fab단편과 닮았다. 각 사슬의 V영역은 3개의 상보성 결정영역(CDR, complementarity determining region)을 가진다. 세포막에 인접하는 각 TCR 사슬은 양 사슬간의 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기와 짧게 연결하는 서열을 갖는다.
αβ 및 γδ이형이량체를 암호화하는 유전자는 T-세포계에서만 발현된다. 네개의 TCR 좌위(α,β,γ 및 δ)는 Ig의 그것과 매우 유사한 생식계통 조직을 갖는다. α 및 γ사슬은 V 및 J단편의 재배열에 의해 생성되는 반면에, β 및 δ 사슬은 V, D 및 J단편의 재배열에 의하여 생성된다. TCR 사슬에 대한 유전자 단편은 α 사슬의 V 및 J 유전자 사이에 있는 δ사슬 유전자를 제외하고, 다른 염색체 상에 위치한다. δ사슬 유전자 단편의 위치는 중요성을 갖는다: α사슬 유전자 단편의 생산적인 재배열은 δ사슬의 C 유전자를 제거하여 주어진 세포내에서 αβ이형이량체는 γδ수용체와 함께 발현될 수 없다.
쥐에는, 약 100개의 Vα및 50개의 Jα 유전자 단편 및 단 하나의 Cα단편이 있다. δ사슬 유전자족은 20~30 V 단편과 하나의 Dβ, 여섯개의 Jβ 및 하나의 Cβ를 포함하는 두개의 동일한 반복을 갖는다. 결국, γ-사슬 유전자족은 7개의 V와 세개의 다른 J-C 반복을 포함한다. 인간에서 조직은 쥐의 그것과 같으나 단편의 수는 다양하다.
α 및 β 사슬에서 유전자 단편의 재배열은 Ig의 그것과 유사하다. α사슬은 Ig의 가벼운 사슬과 같이 V, J 및 C 유전자 단편에 의하여 암호화된다. β사슬은 Ig의 무거운 사슬과 같이 V, D 및 J 유전자 단편에 의하여 암호화된다. α사슬 유전자 단편의 재배열은 VJ결합이 되고, β사슬의 재배열은 VDJ결합이 된다. 재배열된 유전자의 전사, RNA 프로세싱 및 번역 후에, α및 β 사슬은 T 세포의 세포막내에서 이황화결합에 의해 결합발현된다.
TCR 유전자 단편은 12 뉴클레오티드(1회전) 또는 23 뉴클레오티드(2회전) 어느 한쪽의 개입 서열과 함께 헵타머 및 노나머를 포함하는 인식신호서열(RSS, recognition signal sequence)의 측면에 접한다. Ig에서처럼, 재결합 활성유전자(recombination activating gene)(RAG-1 및 RAG-2)는 재조합 작용을 초래한다. RAG1/2는 Ig 재배열에서와 같은 방식으로 RSS를 인식하고 V-J 및 V-D-J 단편을 결합한다. 간단히 말해서, 이들 효소는 유전자 단편과 RSS의 사이의 하나의 DNA 가닥을 자르고, 암호서열에서 헤어핀의 형성을 촉진시긴다. 그 신호 서열은 이후에 삭제된다.
α사슬에서의 V 및 J 단편, 그리고 β사슬에서의 V, D 및 J 단편의 조합결합은 많은 가능한 분자를 생성하고 그 때문에 TCR의 다양성이 만들어진다. 다양성은 또한 유전자 단편의 선택 결합에 의해 TCR에서 얻어진다. Ig와는 달리, β 및 δ 유전자 단편은 선택적 방법으로 결합될 수 있다. β 및 δ유전자 단편에서 RSS 측면 유전자 단편은 β사슬 내에는 VJ 및 VDJ를, δ사슬 상에는 VJ, VDJ 및 VDDJ를 생성할 수 있다. Ig의 경우처럼, 다양성은 또한 유전자 단편의 결합에서의 변이성에 의하여 생성된다.
상보성 결정영역(CDR, complementarity determining region)으로 알려진 TCR의 과변루프는 MHC 분자 및 결합 펩티드로 만들어진 복합표면을 인식한다. CDR1 및 CDR3 루프는 펩티드와 MHC 분자 양쪽에 접촉하는 반면에, α및 β의 CDR2 루프 는 단지 APC 표면상의 MHC 분자에만 접촉한다. Ig와 비교하면, TCR은 CDR1 및 CDR2에서 더 제한된 다양성을 갖는다. 그러나 TCR은 증가된 접합 다양성을 선도하는 하나 이상의 D 단편과 결합할 수 있기 때문에, TCR에서 CDR3의 다양성은 Ig의 그것보다 더 크다.
많은 자가면역 질병의 발병은 유기체 내에 존재하는 자기항원에 대해 반응하는 자가면역 T 세포에 의해 야기되는 것이라고 여겨진다. 클론선택의 전형과 반대로 모든 자기반응 T 세포가 흉선에서 제거되지는 않는다. 이들 T 세포는 자기항원의 넓은 스펙트럼을 위한 TCR과 함께 정상 T-세포 레퍼토리의 부분을 나타내고 말단에서 자연적으로 순환한다. 왜 그 과정동안 자기반응 T 세호가 흉선에서 분화를 수행하는 것이 허용되고, 말단에서 수용되는지는 명확하지 않다. 그들의 생리학적 역할은 이해되지 않지만, 이들 자기반응 T세포는 활성화될 때 자가면역 병리학의 유발에 있어서 잠재적인 위험을 갖는다. 자기반응 T 세포는 또한 자가면역 질병을 초래함이 없이 정상적인 개인으로부터 분리될 수 있다. 자기반응성의 항원 자신의 인식은 자기파괴 과정을 중재하기에는 충분하지 않는 것이 확인되었다. 자기반응 T 세포를 발병시키기 위한 필수요건 중의 하나는 그들을 반드시 활성화시키는 것이다.
자기반응 T 세포는 다발성 경화증(MS) 및 류머티스 관절염(RA, rheumatoid arthritis)과 같은 자가면역 질병의 발병에서 나타난다. MS에서 자기반응 T 세포의 발병은 일반적으로 특정의 미엘린 염기성 단백질(MBP, myelin basic protein)에서 미엘린 항원에 반응하는 T 세포로부터 발생하도록 유지된다. MBP-반응 T 세포는 생체 내 활성을 수행하고, 대조표준 개인과 반대로 MS 환자 내의 혈액 및 중추신경계 유체의 높은 전조 주파수에서 나타내는 것으로 알려진다. 이들 MBP-반응 T 세포는 예를 들어 IL-2, TNF 및 γ-인터페론과 같은 Th1 사이토카인을 생산하며, 이것은 염증성 세포가 중앙신경계로 이동하는 것을 용이하게 하고, MS에서 미엘린 파괴 염증성 반응을 악화시킨다.
MBP-반응 T 세포는 또한 동물 내의 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis)의 발병에 관련되는 것으로 나타났으며, 이것은 다발성 경화증과 유사하다. EAE는 보조제에 유화된 MBP를 주입함으로써 적극적으로 유도되거나 MBP-반응 T- 세포선 및 MBP-민감화된 동물로부터 유래된 클론을 주입함으로써 수동적으로 유도될 수 있다. 생체외에서 활성화될 때, 동일한 반응성을 가진 100-폴드 이상의 휴면 T 세포는 질병을 중재할 수 없는반면, 아주 적은 수의 MBP-반응 T 세포가 EAE 유도에 요구된다.
비활성화된 MBP-반응 T 세포로 백신접종하는 T-세포 백신접종이라고 하는 과정은 EAE에서 MBP-반응 T 세포를 고갈시키며, 이것은 EAE의 예방 및 치료에 이용되어왔다(Ben Num 등, Nature 292: 60-61(1981)). 비록 T 세포 백신접종의 기초를 이루는 메카니즘은 완전히 이해되지 않지만, TCR과의 상호작용을 통한 이디오타입 조절 네트워크 및 생각컨대 T 세포 활성표지와 작용하는 소위 항-에르고타입 T 세포 반응을 포함하는 것으로 생각된다. T 세포 백신접종에 의해 부여된 보호면역은 백신접종에 사용되는 자가면역 T 세포가 유도할 수 있는 질병에 특이적이기 때문에, 이디오타입 및 항-에르고타입 조절 네트워크는 T 세포 백신접종에 의해 유도되는 보호 면역에 필수적인 것으로 믿어진다. 또한, 면역화된 설치류에서 분리된 항-이디오타입 T 세포는 특히 관계가 먼 TCR 구조특성을 발현하는 T 세포가 아닌 면역화 T 세포클론/세포선을 인식한다. 항-이디오타입 T 세포에 의해 인식되는 TCR 결정인자는, CDR3 및 CDR2 내의 특유한 서열 다양성에 의해 예견되는 것처럼, CDR3 또는 CDR2 내에 가장 존재하기 쉽다.
EAE에서, 뇌염발생 MBP-반응 T 세포는 MBP 상의 매우 제한된 에피토프에 의하여 한정된다. 발병시키는 T-세포 반응의 다양성에서의 이러한 제한은 특이적 면역개입을 허용한다. 다양한 치료적 전략은 민감해진 동물에서 EAE의 발병을 예방하는 데에 있어서 TCR의 목표 Vβ영역에 따라서 고안되어 왔다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 Vβ유전자 생산물에 대한 목표가 되었으며, 펩티드 백신은 원인 Vβ의 CDR2 영역에 기초하였다.
EAE에 대한 몇가지 연구는 인간의 자가면역 질병에 확대되었다. 예를들어, TCR Vβ5.2에 대응하는 펩티드는 MS 환자를 치료하는 임상시도에서 이용되었으며, Vβ14 펩티드는 RA 환자에게 백신접종하는 데에 이용되었다. 미국 특허 제 5,614,192(Vandenbark)에는 CDR2의 부분을 포함하는 15~30 아미노산의 면역원성 TCR 펩티드의 이용에 의한 자가면역 질병의 치료가 발표되었다. 미국 특허 제 6,303,314호(Zhang)에는 면역원성 T 세포 활성표지 펩티드와 조합하는 특정의 면역원성 TCR 펩티드의 이용에 의한 자가면역 질병의 치료가 발표되었다.
TCR 펩티드로 백신접종이 이용될 수 있는 하나의 범위는 가령 MS와 같은 자가면역 질병 환자의 자기반응 TCR에서 발견되는 일반적인 모티프에 의한다. 이러한 통상의 모티프는 상기 모티프를 포함하는 TCR을 갖는 T 세포를 고갈시키기 위해 MS 환자에서 항-이디오타입 면역반응을 활성화하는 펩티드 백신의 주성분으로, 또는 상기 모티프를 포함하는 TCR을 갖는 T 세포를 기능적으로 방해하거나 직접 고갈시키는 항체의 조제의 목적으로 이용될 수 있다.
그러므로, 자가면역 질병의 환자로부터의 자기반응 T 세포의 TCR에서 특히 발견되는 통상의 모티프의 아미노산 서열을 결정하는 것이 바람직하다. PCR과 같은 종래의 방법에 의해 환자 샘플에서의 이러한 모티프를 쉽게 검출할 수 있는 것이 좋다. 또한 자가면역 질병의 환자를 치료하는 검출된 모티프와 동일하거나 또는 그로부터 유래한 펩티드를 이용하는 것이 바람직하다. 또한 자가면역질병 환자를 치료하기 위한 상기의 모티프에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
미국 특허 제 6,303,314호(Zhang)에는 PCR에 의한 준비된 검출을 위한 방법 뿐만 아니라 "LGRAGLTY 모티프"인 Vβ13.1 T 세포 부분의 TCR에서 발견되는 이러한 통상의 모티프가 기재되어 있으며, 이것은 아미노산 서열 Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(서열번호 10)을 갖는다. 이 모티프는 MBP(하기의 "MBP83~99")의 아미노산 83~99를 인식하는 몇개의 자기반응 T 세포의 몇개의 TCR에서 발견된다. LGRAGLTY 모티프에 기초한 펩티드는 Vβ13.1-LGRAGLTY와 결합된 자가면역 질병(예를 들면, MS)의 치료 또는 예방을 위하여 몇몇 환자에게 백신접종하기 위해 이용될 수 있다.
LGRAGLTY 모티프는 MBP 83~99를 인식하는 단 몇몇의 TCR에서만 존재하므로, 다른 TCR 서열 및 보다 특히 MBP-반응 T 세포에 의해 통상적으로 발현되는 CDR 서열을 확인할 필요가 남는다. 또한, 일반적으로 MBP-반응 T 세포에 의해 발현되는 CDR 서열을 포함하는 다른 TCR 서열을 검출할 수 있을 필요가 남는다. 결국, 다른 TCR 서열 및 더 특히 CDR서열과 관련된 자가면역 질병의 치료를 발전시킬 필요가 남아있다.
본 발명의 이해를 돕기위해 몇가지 용어를 아래와 같이 정의한다.
"PCR"은 예를 들어, 미국 특허 제 4,683,202호(1987.7.28에 Mullis에 발행)에서 일반적으로 기재된 것처럼 중합효서 연쇄 반응을 의미하며, 참고에 의하여 여기에 구체화되었다. PCR은 (DNA 또는 RNA 중합효소와 같은)중합제 및 뉴클레오티드 삼인산의 존재하에 핵산 주형에 잡종화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머를 선택하는 증폭 기술이고, 이에 의한 확장 생산물은 상기 프라이머로 부터 형성될 수 있다. 이들 생산물은 변성된 다음 이후의 검출을 용이하게 할 수 있는 핵산의 수와 양을 증폭시키는 순환반응에서의 주형으로서 사용될 수 있다. PCR 기술의 다양성은 본 기술분야에 알려져 있으며, 공개된 것과 관련되어 이용될 수 있다.
"펩티드"는 특이적 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 대한 면역응답을 이끌어낼 수 있는 고유의, 합성의 펩티드 또는 그 변형 중의 하나를 의미한다.
"프라이머"는 주형 분자상의 특이적 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적인 뉴클레오티드 합성의 개시점처럼 작용할 수 있는 고유의, 합성의 올리고뉴클레오티드 또는 그 변형 중의 하나를 의미한다.
"프로브"는 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 고유의, 합성의 올리고뉴클레오티드 또는 그 변형 중의 하나를 의미한다.
뉴클레오티드 서열의 문맥 상에서 "~로부터 유래된"은, 그 뉴클레오티드 서열이 기술된 특정 서열에 한정되는 것이 아니라, 그 서열에서의 변화를 포함하며, 이것은 또한 뉴클레오티드 추가, 고갈, 치환 또는 기술된 서열에 대한 변이가 기술된 서열의 보체에 특이적으로 결합하는 능력을 가지는 범위까지의 변형을 포함할 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드 서열의 문맥 상에서, "~로부터 유래된"은 펩티드 또는 폴리펩티드가 기술된 특정 서열에 한정되는 것이 아니라, 그 서열에서의 변화를 포함하며, 이것은 또한 아미노산 추가, 고갈, 치환 또는 리스트된 서열에서의 변이가 기술된 서열에 대한 면역응답을 이끌어낼 수 있는 능력을 가지는 범위까지의 변형을 포함할 수 있다.
펩티드 또는 폴리펩티드를 설명하는 데에 사용되는 "면역원의"는 펩티드 또는 폴리펩티드가 중재된 T 세포, 항체 중의 하나 또는 양쪽에 대한 면역반응을 유도할 수 있다는 것을 의미한다. "항원의"는 펩티드 또는 폴리펩티드가 항체에 의한 자유로운 형태로, 및/또는 항원특이적 T 세포의 경우에 MHC의 문맥에서 인식될 수 있다는 것을 의미한다.
"면역관련 질병"은 면역체계가 질병의 발생에 관련되는 질병을 의미한다. 면역관련 질병의 일부분은 자가면역 질병이다. 자가면역 질병은 류마티스 관절염, 중증성 근무력증, 다발성 경화증, 전신홍반성 낭창, 자가면역 갑상선염(하시모토 갑상선), 중증성 질병, 염증성 장 질환, 자가면역 포도막망막염, 다근염 및 특정 타입의 당뇨병을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 발표의 관점에서, 해당분야의 숙련된 자는 본 발명의 구성과 방법에 의하여 다룰 수 있는 다른 자가면역 질병을 쉽게 이해할 수 있다.
"T 세포 매개된 질병"이란 유기체 내에서 보통 발견되는 펩티드를 인식하는 T 세포의 결과로서 질병을 일으키는 것을 말한다.
질병으로부터 동물의 보호를 언급할 때의 "치료" 또는 "치료하는 것"이란, 질병을 예방, 억제, 진압 또는 완전히 제거하는 것을 의미한다. 질병의 예방은 질병의 징후에 앞서 동물에 대해 본 발명의 구성을 처리하는 것을 뜻한다. 질병 억제는 임상으로 나타나기 전, 질병의 유발 후 동물에 본 발명의 구성을 처리하는 것을 뜻한다. 질병의 진압은 질병이 임상으로 나타난 후 동물에 본 발명의 구성을 처리하는 것을 뜻한다.
첫번째 관점에서, 본 발명은 서열번호 4, 5 또는 6의 적어도 4개의 연속적인 아미노산 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 약 4~20 길이의 아미노산을 포함하는 펩티드와 관련된다. 상기 펩티드는 또한 (ⅰ) 서열번호 4 또는 6의 4, 5, 6 또는 7개의 연속적인 아미노산 또는 그로부터 유래한 서열, 또는 (ⅱ) 서열번호 5의 4, 5, 6, 7 또는 8개의 연속적인 아미노산 또는 그로부터 유래한 서열 중의 하나를 포함하는 약 4~12 길이의 아미노산일 수 있다. 상기 펩티드는 또한 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 약 4~20 길이의 아미노산일 수 있다. 상기 펩티드는 고유한 것이거나 인공적이거나 그로부터 유래한 것일 수 있다.
상기 펩티드는 서열번호 4, 5 또는 6, 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 면역반응을 이끌어내기 위한 항원으로 이용될 수 있다. 이하에서 좀더 완전히 기술된 바와 같이, 상기 펩티드에 의해 유도된 면역반응은 치료, 항체의 생산, 항체의 정제의 기초로서, 그리고 진단시험에서 이용될 수 있다.
상기 펩티드는 기술분야의 숙련된 자에게 알려진 많은 방법으로 변경될 수 있다. 상기 펩티드의 선택된 쪽의 사슬 또는 말단부 잔기는 일반적 유도체화 약품으로 이용되도록 개조할 수 있다.
시스테인 잔기는 염화아세트산 또는 염화아세트아미드와 같은 α-할로아세테이트와 반응하여 카르복시메틸 또는 카르복시아미도케틸 유도체로 될 수 있다. 시스테인 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응에 의하여 유도될 수 있다.
히스티딘 잔기는 pH5.5~7.0에서 히스티딘-특이성 시약 디에틸프로카르보네이트와의 반응에 의하여 유도될 수 있다. 파라-브로모페나실 브로마이드는 또한 pH6.0에서 0.1M 나트륨 카코틸레이트에 이용될 수 있다.
리진 및 아미노 말단부 잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응될 수 있다. 이들 약제로의 유도체화는 또한 리진 잔기의 부담을 되돌리는 효과를 갖을 수 있다. α-아미노-포함 잔기를 유도하기 위한 다른 시약들은 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드리드, 트리니트로벤젠술폰산, O-메틸이슈리아, 2,4 펜타네디온, 및 글리옥실레이트로 반응이 촉진된트랜스아미나아제와 같은 이미드에스테르를 포함한다.
아르기닌 잔기는 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린 등의 하나 또는 몇가지의 종래 시약과 반응함으로써 변화된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 기능성 그룹의 높은 pKa 때문에 알칼리성 조건에서 미리 이루어진다. 게다가, 이들 시약들은 아르기닌 엡실론-아미노 그룹 뿐만 아니라 리진 그룹과도 반응할 수 있다.
티로신 잔기는 방향성 디아조늄 성분 또는 테트라니트로메탄과 반응될 수 있다. N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄은 각각 O-아세틸 티로실 류 및 3-니트로 유도체를 형성하는 데에 이용될 수 있다. 티로신 잔기는 방사선면역분석에 이용되는 표지된 단백질을 준비하기 위해 125I 또는 131I를 이용하여 요오드화될 수 있다.
아스파라긴산 및 글루탐산의 카르복실 쪽 그룹은 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-(4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3(4 아조니아 4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드와 같은 카르보디이미드(R'--N--C--N--R')와의 반응에 의하여 변형될 수 있다. 게다가, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의하여 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환될 수 있다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 탈아미드화 되어 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸로 될 수 있다. 선택적으로, 이들 잔기는 약산성의 조건에서 탈아미노화될 수 있다.
두가지 기능의 약품에 의한 상기 펩티드의 유도체화는 상기 펩티드를 수용성 보존체 매트릭스 또는 다른 거대분자 캐리어에 가교하는데에 유용할 수 있다. 일반적으로 사용되는 가교제는 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 4-아지도살리실산의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동등한 두가지 기능을 가진 이미도에스테르 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 두 가지 기능을 가진 말레이미드를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 메틸-3-[(p-아지도파닐)디티오]프로피오디미데이트와 같은 유도체화 약품은 빛의 존재하에서 가교할 수 있는 광활성의 중간물을 생산할 수 있다. 선택적으로, 미국특허 제 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 및 4,330,440호에서 기술된 시아노겐 브로마이드로 활성화된 카르보하이드레이트 및 반응적인 기질과 같은 반응적인 수용성 매트릭스는 단백질 면역화에 사용될 수 있다.
상기 펩티드는 또한 프롤린 및 리진 잔기의 히드록실화, 세린 또는 트레오닌 잔기의 시드록실 그룹의 인산에스테르화, 리진, 아르기닌 및 히스티딘 쪽 사슬의 α-아미노 그룹의 메틸화(T.E.크레톤, 단백질: 구조 및 분자특성, W.H.Freeman & Co., 샌프란시스코, pp.79-86(1983)), N-말단부 아민의 아세틸화 및 몇가지 예에서의 C-말단부 카르복실 그룹의 아미드화에 의하여 변형된다.
상기 펩티드의 유도체화는 펩티드의 용해도, 흡수성, 생물학적 반감기와 같은 것들을 향상시킬수 있다. 유도체화는 또한 참고로서 구체화 된 레밍턴스 파마서티컬 사이언스, 16판., Mack Publishing Co., Easton, Pa.(1980)에 나타난 바와 같이 펩티드 등의 어떠한 원하지 않는 부작용을 제거하거나 감소시킬 수 있다. 상기 펩티드의 화학적 변형은 상기 펩티드의 안정성 및 순환시간의 증가 및 면역원성의 증가와 같은 특정 환경 하에서의 추가적인 이점을 제공한다. 펩티드의 화학적 유도체화에 관한 더 많은 정보는 미국 특허 6,350,730(프라이드만)에 완전히 구체화되어 있다.
상기 펩티드의 면역원성은 더 긴 펩티드 또는 폴리펩티드에 상기 펩티드를 포함함으로써, 또는 표준 결합기술을 사용하여 상기 펩티드를 KLH, 혈청단백, 파상풍 톡소이드 등과 같은 "면역학적" 캐리어에 결합함으로써 강화될 수 있다. 예를 들어 디시클로헥실카르보디이미드와 같은 농축제의 사용, 또는 Pierce Chemical Co., Rockford, Ill로 부터 구입가능한 것들과 같은 결합제의 사용과 같은 방법의 다양성은 해당 기술분야에 알려져 있다.
상기 펩티드는 또한 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 정맥내, 경구, 코, 직장, 구강, 지망막하조내, 포막내, 폐동맥, 국소부, 경피, 또는 다른 투여경로로 조직될 수 있다.
상기 펩티드는 또한 서열번호 4, 5 또는 6의 서열, 또는 그로부터 유래한 서열로 구성된 펩티드나 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 TCR로 T 세포를 활성화하기 위해 이용될 수 있다. T 세포는 본 기술분야에 알려진 어떠한 많은 방법을 사용하여 자가면역질병을 가진 환자로 부터 얻을 수 있다. 상기 T 세포는 또한 자기반응 T 세포처럼, 특정 생물형군으로 증대될 수 있다. 상기 분리된 T 세포는 그 후 시험관 내에서 펩티드로 자극될 수 있으며, 서열번호 4, 5 또는 6의 서열, 또는 그로부터 유래한 서열로 구성된 펩티드 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 TCR로 T 세포를 활성화 및/또는 T세포의 수를 확대할 수 있다. 그 다음에 활성화된 및/또는 확대된 T 세포는 상기 T 세포가 유래된 환자에게 투여될 수 있으며, 그로 인하여 서열번호 4, 5 또는 6의 서열, 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR에 의하여 자기반응 T 세포에 결합할 수 있고, 그로 인해 상기 자기반응 T 세포가 제거된다.
두번째 관점에서, 본 발명은 서열번호 4, 5 또는 6의 서열, 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와 관련된다. 상기 항체는 Fab, F(ab')2, Fd 및 단일사슬 항체(scFv)를 포함하는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 및 그 단편 및 유도체일 수 있다. 상기 항체는 서열번호 4, 5 또는 6의 서열, 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 에피토프에 충분한 결합 특이성을 나타내는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 유연 정제된 항체, 또는 그들의 혼합물일 수 있다. 상기 항체는 상기한 본 발명의 첫번째 관점에서와 같이, 해당 기술분야에서 알려진 하나 이상의 화학약품, 펩티드 또는 폴리펩티드 성분의 부착에 의하여 유도체화될 수 있다.
상기 항체는 미국특허 5,565,332(Hoomgenboom 등), 5,858,657(Winter 등), 5,871,907(Winter 등), 5,969,108(McCafferty 등) 및 6,172,197(McCafferty 등)구체화 되어 기술된 바와 같이, 파지 디스플레이와 같은 본 기술분야에 알려진 기술을 사용함으로써 확인되고 분리될 수 있다. 상기 항체는 또한 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래한 서열에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 항원으로 면역화된 생쥐, 쥐, 염소, 토끼, 양, 돼지 또는 소를 포함하나 이에 한정되지는 않는 포유류로부터 분리될 수 있다. 상기 항체는 또한 미국특허 5,565,332(Hoogenboom 등), 5,858,657(Winter 등), 5,871,907(Winter 등), 5,969,108(McCafferty 등) 및 6,172,197(McCafferty 등)에서 구체화되어 기술된 바와 같이 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다.
이하에서 좀더 완전히 기술된 바와 같이, 상기 항체는 치료의 기초로서 또는 진단분석에서 사용될 수 있다. 상기 항체는 또한 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR을 갖는 자기반응성 T 세포의 증대 또는 정제에 이용될 수 있다. 서열번호 4, 5 또는 6, 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR 을 갖는 증대되거나 정제된 자기반응성 T 세포는 함께 계류중인 미국특허출원 09/952,532(Zhang)에 따라 자가면역질병을 가진 환자에게 T 세포 백신접종하는 데에 이용될 수 있다.
세번째 관점에서, 본 발명은 펩티드 또는 첫번째 예의 발명에 따른 펩티드 또는 그 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 올리고뉴클레오티드와 관련된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4, 5 또는 6의 단편을 암호화하는 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드, 그에대해 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 약 15~30 길이의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 또한 (ⅰ) 서열번호 4 또는 6의 단편을 암호화 하는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적인 뉴클레오티드, 그에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그로부터 유래한 서열, 또는 (ⅱ) 서열번호 5의 단편을 암호화 하는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 연속적인 뉴클레오티드, 그에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그로부터 유래한 서열 중의 하나를 포함하는 약 15~30 길이의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 또한 서열번호 4, 5 또는 6을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 그에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 약 15~30 길이의 뉴클레오티드일 수 있다.
유전적 암호의 퇴화에 의하여, 많은 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 첫번째 관점의 펩티드를 암호화 할 수 있다. 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 2 또는 3의 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드, 그에 대해 상보적인 서열, 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 약 15~30 길이의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 또한 (ⅰ) 서열번호 1 또는 3의 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적인 뉴클레오티드, 그에 대해 상보적인 서열, 또는 그로부터 유래한 서열, 또는 (ⅱ) 서열번호 2의 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 연속적인 뉴클레오티드, 그에 대해 상보적인 서열, 또는 그로부터 유래한 서열 중의 하나를 포함하는 약 15~30 길이의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 또한 서열번호 1, 2 및 3의 뉴클레오티드 서열, 그에 대해 상보적인 서열, 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 길이 약 15~30의 뉴클레오티드일 수 있다.
이하에서 좀더 충분히 기술되는 바와 같이, 상기 올리고뉴클레오티드는 PCR을 위한 프라이머로 이용될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 또한 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 그로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TCR 유전자 또는 그 단편에 결합하고 또한 검출하기 위한 프로브로 이용될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 성분으로 표지될 수 있다. 검출가능한 성분의 많은 예는 32P, 35S, 비오틴 또는 디그옥시제닌을 포함하나, 이에 한정되는 것을 아니다.
네번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 세번째 관점에 따른 올리고뉴클레오티드인 제1 프라이머 및 제1 프라이머의 서열을 포함하지 않고 T 세포 내의 TCR 유전자의 Vβ부터 Cβ까지 영역의 단편 또는 그로부터 유래한 서열인 약 15~30 길이의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드인 제 2 프라이머를 포함하고, 상기 제1 및 제2 프라이머는 상기 TCR 유전자의 다른 가닥에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍에 대한 것이다. 제2 프라이머는 TCR 유전자의 Vβ-Dβ-Cβ영역을 포함하는 대략 400bp가 제1 및 제2 프라이머를 분리하는 것과 같이 Cβ영역의 서열에 상보적일 수 있다.
이하에서 좀더 충분히 기술되는 바와 같이, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 인간 T 세포로부터의 TCR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는데에 이용될 수 있다.
첫번째 관점에서, 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR은 본 발명의 두번째 관점에 따른 항체를 이용하는 면역분성을 수행함으로써 시료 내에서 검출될 수 있다. "면역분석"이라는 용어는 해당기술분야의 숙련된 자에게 잘 알려진 동시 샌드위치, 앞선 샌드위치 및 역 샌드위치 면역분석을 포함하는 것을 의미한다.
서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR의 존재를 테스트받기 위한 시료는 말단혈액단핵세포(PBMC, peripheral blood momonuclear cell)와 같은 T 세포 수용체 β사슬 유전자를 발현하는 어떠한 동물 또는 인간조직으로부터 직접 또는 간접적으로 분리될 수 있다.
여섯번째 관점에서, 서열번호 4, 5 또는 6을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그로부터 유래한 서열("목표 서열")을 포함하는 TCR 유전자는 목표서열을 포함하는 TCR 유전자의 단편을 증폭함으로써 간단히 검출될 수 있으며, 상기 증폭은 본 발명의 네번째 관점에 따른 프라이머쌍을 사용하여 수행된다.
서열번호 4, 5 또는 6을 암호화하는 목표서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR 유전자의 단편은 어떠한 특정의 PCR 기술 또는 기술분야에 알려진 장치를 이용하는 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의하여 증폭될 수 있다. 예를 들어, PCR 증폭 이전에 반응혼합물이 다음 성분들을 포함하도록 준비하는 과정이 있을 수 있다: 5 μL 10xPCR 버퍼Ⅱ(100 mM trisHCl, pH 8.3, 500 mM KCl), 3 μL 25 mM MgCl2, 1 μL 10 mM dNTP 혼합물, 0.3μL Taq 중합효소(5 U/μL)(AmpliTaq Gold, Perkin Elmer, Norwalk, Conn.), 제1 프라이머 30 pmol, 제2 프라이머 30 pmol 및 샘플 DNA 1 μL. 상기 중합효소는 적어도 95℃의 온도에서 안정될 수 있고, 50~60의 진행성을 가지며, 분당 50 뉴클레오티드보다 큰 신장율을 가질 수 있다.
상기 PCR 반응은 전체 40 순환에서 95℃에서 1분(변성), 56℃에서 20초(복원), 및 72℃에서 40초(신장)의 증폭형태로 수행될 수 있다. 첫번째 순환이 시작되기 전에, 반응 혼합물은은 약 5분 내지 15분의 기간동안 초기 변성을 수행할 수 있다. 유사하게, 최종 순환이 완료된 후, 반응 혼합물은 약 5분 내지 15분동안 최종 신장을 수행할 수 있다. 어떤 PCR 반응은 15~20 순환보다 적게 또는 50 순환보다 많이 수행될 수 있다. 특정의 PCR 반응에 따라서, 증폭 형태의 각 단계에 더 길거나 짧은 배양시간 및 더 높거나 낮은 온도가 사용될 수 있다.
목표서열을 포함하는 TCR 유전자의 존재를 테스트 받기 위한 상기 샘플은 PCR에 의해 미리 증폭된 게놈 DNA, cDNA, DNA 또는 DNA 의 어떤 다른 형태와 같은 핵산일 수 있다. 상기 샘플은 말단혈액단핵세포(PBMC)와 같은 T 세포 수용체 β사슬 유전자를 발현하는 어떤 동물 또는 인간 조직으로부터 직접 또는 간접적으로 분리될 수 있다. 게놈 DNA는 T 세포 수용체 β사슬 유전자를 발현하는 조직으로부터 직접 분리될 수 있다. cDNA는 T 세포 수용체 β사슬 유전자를 발현하는 조직으로부터 직접 분리된 mRNA의 역전사에 의하여 간접적으로 분리될 수 있다.
서열번호 4, 5 또는 6을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 T 세포 유전자의 존재를 검출하는 능력은 2단계 PCR 반응에 의하여 게놈 DNA, cDNA 또는 다른 형태의 DNA 증폭에 의해 간접적으로 샘플 DNA를 분리함으로써 향상될 수 있다. 예를 들어, 첫번째 PCR 증폭 반응은 제1 및 제2 프라이머가 반대편 가닥에 선택적으로 결합할 수 있는 단편을 포함하고 그 단편보다 큰 예비적 단편의 증폭을 수행할 수 있다. 다음에 두번째 PCR 증폭 반응은 목표 서열을 포함하는 단편을 증폭하기 위하여 제1 및 제2 프라이머와 주형으로서의 예비적 단편을 사용하여 수행될 수 있다. 만일 상기의 제1 또는 제2 프라이머 중 어느 하나가 예비적 단편을 증폭하기 위한 첫번째 PCR 반응에서 사용된다면, 상기의 두번째 PCR반응은 "반-세포소화(semi-nested)" 된다. 만일 제1 또는 제2 프라이머 중 어느 것도 예비적 단편을 증폭하기 위한 첫번째 PCR 반응에서 사용되지 않는다면, 두번째 PCR 반응은 "세포소화(nested)" 된다.
전형적인 두단계 PCR 반응에서, 서열번호 4, 5 또는 6을 암호화 하는 뉴클레오티드 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR 유전자의 단편은 TCR 단편의 Vβ으로 복원하는 제1 예비 프라이머 및 TCR 유전자의 Cβ로 복원하는 제2 예비 프라이머를 사용하며, 세포소화 또는 반-세포소화 될 수 있는 두번째 PCR 반응 전에 Vβ로부터 Vβ-Dβ-Jβ결합을 통해 Cβ까지 신장되는 예비적 단편을 증폭하는 첫번째 PCR 반응을 수행함으로써 증폭된다. 본 공개로서, 숙련된 기술자는 서열번호 4, 5 또는 6을 암호화 하는 뉴클레오티드 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 T 세포로부터의 TCR 유전자 단편의 PCR 증폭을 위한 적절한 프라이머 및 반응조건을 선택할 수 있을 것이다.
서열번호 4, 5 또는 6을 암호화 하는 뉴클레오티드 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR 유전자 단편의 증폭 후, 증폭된 생성물은 다수의 과정에 의하여 검출될 수 있다. 예를 들면, 증폭 생성물의 부분표본은 전기영동 겔 위에 놓여질 수 있으며, 전기적 영역은 DNA 분자를 크기별로 분리하는 데에 적용된다. 또다른 방법에서, 증폭 생성물의 부분표본은 SYBR 그린, 브롬화 에티듐, 또는 DNA에 결합하고 검출가능한 신호를 방출할 또 다른 분자로 착색된 겔 위에 놓여질 수 있다. 건조된 겔은 본 발명의 세번째 관점에 따른 표지된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 그로부터 자동방사선사진은 필름에 상기의 겔을 노출함으로써 얻어질 수 있다.
본 발명의 일곱번째 관점에서, 테스트 키트는 본 발명의 두번째 관점에 따른 항체를 포함한다. 상기 테스트 키트는 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR의 존재 또는 그 유도체를 위해 샘플을 분석하는 데에 사용될 수 있다.
상기 테스트 키트는 또한 자기반응성 T 세포상의 TCR의 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 추가적 항체를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 추가적 항체가 특이적으로 결합하는 상기의 TCR은 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래한 서열이 단 몇개의 TCR에만 존재하므로, 다른 TCR 서열 및 더 특히 다른 CDR 서열에 결합하는 항체를 사용하는 것은 유익한 것으로 증명될 수 있다.
테스트 키트는 또한 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR의 검출 또는 그 유도체화에 사용될 수 있는 하나 이상의 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 시약은 완충제, 양성의 대조표본, 음성의 대조표본 또는 그들의 조합일 수 있다. 상기 양성의 대조표본은 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 음성 대조표본은 서열번호 4, 5 또는 6의 서열을 포함하지 않는 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열일 수 있다.
본 발명의 여덟번째 관점에서, 테스트 키트는 본 발명의 세번째 관점에 따른 올리고뉴클레오티드인 제1 프라이머를 포함한다. 상기 테스트 키트는 또한 제1 및 제2 프라이머를 포함할 수 있으며, 이는 본 발명의 네번째 관점에 따른 프라이머쌍이다.
상기 테스트 키트는 또한 서열번호 4, 5 또는 6을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR 유전자 단편의 증폭에 사용될 수 있는 하나 이상의 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 시약은 완충제, 디옥시뉴클레오티드 삼인산, 열-안정성 DNA 중합효소, 양성의 대조표본, 음성의 대조표본 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 열-안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소일 수 있다. 상기 양성의 대조표본은 서열번호 4, 5 또는 6을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 음성의 대조표본은 서열번호 4, 5 또는 6을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는 뉴클레오티드 또는 그로부터 유래된 서열일 수 있다. 상기 테스트 키트는 또한 본 발명의 세번째 관점에서 기술된 것과 같이 표지된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 테스트 키트에 포함될 수 있는 다른 시약들은 기술분야의 기술자에게 알려져 있다.
아홉번째 관점에서, 자가면역 질병을 가진 환자는 환자로부터 샘플을 얻고, 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR을 포함하는 자기반응성 T 세포의 존재에 대해 상기 샘플을 분석함으로써 진단될 수 있다. 상기 샘플은 T 세포, 자기반응성 T 세포 또는 자기반응성 MBP83-99 T 세포에 대해 풍부하게 될 수 있다. 상기 자가면역 질병은 서열번호 4, 5 또는 6의 펩티드 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR이 T 세포상에서 발견되는 어떠한 자가면역 질병일 수 있다.
상기 자가면역 질병은 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR을 포함하는 T 세포의 수준과 대조표본으로부터의 상기 T 세포의 수준을 비교함으로써 진단될 수 있다. T 세포의 수준은 본 발명의 다섯번째 관점에 따른 면역분석에서 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR의 존재를 검출함으로써 결정될 수 있다. T 세포의 수준은 또한 서열번호 4, 5 또는 6를 포함하는 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 암호화하는 핵산의 존재를 검출함으로써 결정될 수 있다.
열번째 관점에서, 자가면역 질병은 본 발명의 첫번째 관점에 따른 펩티드의 면역원적으로 효과적인 양을 포함하는 백신을 투여함으로써, 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR을 포함하는 자기반응성의 T 세포를 갖는 몇몇 환자에서 치료될 수 있다. 백신의 투여는 면역반응을 이끌 수 있으며, 환자는 항체를 발현할 수 있고, 이것은 또한 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR을 인식하고 이에 결합하는 T 세포 반응을 유도할 수 있으며, 이것은 상기의 자기반응성 T 세포의 감소를 유도할 수 있다.
상기의 백신은 펩티드 만을, 또는 다른 TCR 펩티드 서열, 특히 다른 CDR 서열의 면역원적으로 효과적인 양과 공동으로 포함할 수 있다. 임상적 연구는 자가이식한 T 세포 백신을 받은 자가면역 환자가 MBP-반응성 T 세포에 대한 면역성에 있어서 점차적인 감소를 나타낼 수 있음을 나타낸다. 몇가지 경우에서, 자기반응성 T 세포의 재발은 MBP-반응성 T 세포에서 클론의 변화 또는 진행중인 질병경과와 잠재적으로 관련된 에피토프 확산이 진행될 수 있음을 암시하는 다른 클론집단으로부터 발생할 수 있다. 클론의 변화 또는 에피토프 확산은 자기반응성 T 세포에 의해 매개되는 자가면역 질병에서 문제 될 수 있다. 자기반응성 T 세포의 다수 집단에서의 TCR에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 다수 항원 펩티드를 포함하는 백신은 클론 변화 또는 에피토프 확산에서의 문제를 피할 수 있다.
다른 TCR 서열, 특히 CDR 서열 뿐만 아니라 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR은 자가면역 질병으로 고통받는 환자 및 상기 질병으로부터 고통받지 않는 정상인 모두에게 존재할 수 있기 때문에, TCR, 특히 CDR 및 더 특별히 CDR3 상의 에피토프에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 펩티드 또는 펩티드의 조합을 포함하는 백신은 자가면역 질병을 지닌 환자 및 정상인 모두에게 투여될 수 있다. 다른 펩티드 서열은 LGRAGLTY 모티프(서열번호 7) 및 미국특허 5,614,192호(Vandenbark)에서 공개된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
상기 백신은 T 세포 활성 표지 펩티드를 더 포함할 수 있다. 상기 T 세포활성 표지 펩티드는 미국특허 6,303,314에 기재된 표지 펩티드일 수 있으며, 참조로서 여기에 구체화되었다. 상기 백신은 또한 면역원에 대한 면역반응을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 시약은 완충제, 보강제 또는 그 조합일 수 있다. 상기 보강제는 미국특허 5,980,912(Podolski)에 따른 키토산-기초 보강제일 수 있으며, 참조로서 여기에 구체화되었다.
열한번째 관점에서, 자가면역 질병은 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR을 지닌 몇몇 환자에 있어서, 본 발명의 두번째 관점에 따른 항체를 포함하는 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있다. 상기 조성물의 투여는 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR의 감소를 유도할 수 있다.
상기 조성물은 항체 만으로, 또는 다른 TCR 서열, 특히 다른 CDR 서열에 특이적으로 결합하는 다른 항체와 공동으로 포함될 수 있다. 상술한 바와 같이, 자가면역 질병의 진행은 자기반응성 T 세포의 클론 변화와 에피토프 확산을 포함할 수 있다. 각 항체가 자기반응성 T 세포의 다수 집단에서의 TCR, 특히 CDR에 특이적으로 결합하는 다수의 항체를 포함하는 조성물은 클론 변화 또는 에피토프 확산의 문제를 피할 수 있다.
다른 TCR 서열, 특히 CDR 서열 뿐만 아니라, 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR은 자가면역 질병으로부터 고통받는 환자 및 상기 질병으로부터 고통받지 않는 정상인 모두에서 존재할 수 있기 때문에, TCR, 특히 CDR 및 가장 특히는 CDR3 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 조합으로 구성되는 조성물은 자가면역 질병을 지닌 환자 및 정상인 모두에게 투여될 수 있다.
본 발명의 열두번째 관점에서, 자가면역 질병은 본 발명의 여섯번째 관점에 따른 자가면역 질병 환자로부터의 샘플에서 서열번호 1, 2 또는 3의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR 유전자의 존재를 검출하고, 서열번호 1, 2 또는 3의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR 유전자의 양을 측정함으로써 감시될 수 있다.
자가면역 질병 징후의 고통은 자기반응성 T 세포의 수에 의하여 샘플 내에서 검출된 DNA의 양과 서로 관련될 수 있다. 또한, 샘플 내에서 검출된 DNA의 양의 증가는 상기 징후가 나타나기 전에 징후의 고통을 감소 및/또는 질병을 치료할 치료법을 적용하기 위한 표시로서 이용된다.
본 발명의 열세번째 관점에서, 자가면역 질병은 본 발명의 일곱번째 관점에 따른 자가면역 질병 환자로부터의 샘플에서 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR의 존재를 검출하고, 서열번호 4, 5 또는 6의 서열 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 TCR의 양을 측정함으로써 감시될 수 있다.
자가면역 질병 징후의 고통은 자기반응성 T 세포의 수에 의해 샘플에서 검출된 펩티드 또는 폴리펩티드의 양과 관련될 수 있다. 또한, 샘플에서 검출된 펩티드 또는 폴리펩티드의 양의 증가는 징후의 고통을 감소 및/또는 징후가 나타나기 전에 질병을 치료하기 위한 치료법을 적용하기 위한 표시로서 사용될 수 있다.
열네번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 열번째 관점에서 설명된 백신 및 본 발명의 열한번째 관점에서 설명된 항체와 같은 약학적 조성물의 제조와 관련된다. 상기 약학적 조성물은 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
질병 또는 장애의 치료에서 증상발현 전 및 임상의 치료법으로서 이용되는 약학적 조성물은 인정된 진단 및 치료의 원리를 이용하는 기술자에 의하여 생산될 수 있다. 이러한 원리는 기술분야에서 알려져 있고, 예를 들어, Harrison's Prinsiples of Internal Medicine(브라운왈드 등 저, 11판, McGraw-Hill 출판사, 뉴욕(1987))에서 출발하여 여기에 참조로써 구체화되었다. 상기 약학적 조성물은 상기 조성물의 유용한 효과를 경험할 어떤 동물에게 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물이 투여된 동물은 인간 또는 다른 포유류일 수 있다.
상기의 약학적 조성물은 그들의 의도된 목적을 이루기 위한 어떠한 수단에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구, 피하, 정맥내, 피내, 근육내, 복강내, 경피 또는 구강의 루트에 의할 수 있다. 선택적으로, 또는 동시에, 투여는 구강의 루트에 의할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 덩어리 주사 또는 시간에 따라 점차적인 관류에 의하여 비경구적으로 투여될 수 있다.
투여된 투약량은 투여자의 나이, 성별, 건강 및 체중, 공동작용하는 치료의 종류와 만일 있다면 치료의 빈도, 및 소망하는 효과의 특성에 의할 수 있다. 약학적 조성물의 투여를 위한 투약범위는 그에 의하여 기대되는 효과를 생산하기에 충분히 많을 수 있으며 그로인해 예를 들어, DH 또는 항체생산에 의해 측정되는 바와 같은 펩티드에 대한 면역반응이 이루어지고, 자가면역 질병이 상당히 예방, 억제 또는 치료된다. 상기 투약량은 원하지 않는 교차반응, 일반화된 면역억제, 과민성 반응 등의 부작용을 야기할 정도로 많지는 않을 수 있다. 인간에 있어서 상기 투약량은 약 0.001~25mg/kg(체중)의 범위일 수 있다.
상기의 약학적 조성물은 약학적으로 이용될 수 있는 조제약 속으로의 활성 조성물 과정을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 약학적으로 적합하고 수용가능한 캐리어를 더 포함할 수 있다. 약학적 조성물에 대한 첨가제는 알람(명반), 키토산 또는 기술분야에 알려진 다른 보조제와 같은 보조제의 함유물을 포함할 수 있다(예를 들어, 참조로서 여기에 구체화된 Warren 등, Ann. Rev. Immunol. 4:369-388(1986); Chedid, L., Feder. Rroc. 45:2531-2560(1986)을 참고하라). 상기 약학적 조성물은 또한 기술분야에서 알려진 방법 및 조성물을 사용하여, 방출 또는 생물활성을 향상시키는 세포내 지방입자를 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 또한 정제 및 캡슐의 형태로 경구로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 좌약의 형태 및 주사 또는 경구주입을 위한 용액의 형태로 직장에 투여될 수 있다.
상기의 약학적 조성물은 부형제와 함께 활성 성분의 약 0.001~99% 또는 약 0.01~95%를 포함할 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어 옥수수전분, 밀전분, 쌀전분, 감자전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스 및/또는 폴리비닐 피롤리돈을 사용하는 전분풀과 같은 결합제 뿐만 아니라, 예를 들어 젖당 또는 설탕인 사카리드, 만니톨 또는 소프비톨, 셀룰로오스 조제약 및/또는 예를 들어 트리칼슘 포스페이드 또는 칼슘 하이드로겐 포스페이트인 인산칼슘과 같은 부형약일 수 있다.
경구에 사용될 수 있는 다른 약학적 조제약은 글리세로 또는 소르비톨과 같은 가소제 및 젤라틴으로 만든 연성의 밀봉된 캡슐 뿐만 아니라 젤라틴으로 만든 밀어끼우는 캡슐을 포함한다. 상기 밀어끼우는 캡슐은 젖당과 같은 부형약, 전분과 같은 결합제, 및/또는 탤크나 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제 및 선택적으로 안정제를 포함할 수 있다. 연성의 캡슐에서, 활성 성분은 지방질의 오일 또는 액상 파라핀과 같은 적합한 액체에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정제가 첨가될 수 있다.
직장에 사용될 수 있는 약학적 조제약은 예를 들어 하나 이상의 상기 활성성분과 좌약 베이스의 조합으로 구성되는 좌약을 포함한다. 적합한 좌약 베이스는 예를 들어 고유의 또는 인공의 트리글리세리드 또는 파라핀 탄화수소일 수 있다. 또한, 젤라틴 직장 캡슐은 상기 활성 성분과 베이스의 조합으로 구성되어 이용될 수 있다. 가능한 베이스 물질은 예를 들어 액상 트리글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 파라핀 탄화수소를 포함한다.
비경구적 투여를 위한 적합한 제제화는 펩티드의 수용액 또는 예를 들어 수용성 염인 수용성 형태에서의 항체를 포함한다. 또한 적절한 유성 주사 현탁액과 같은 펩티드 또는 항체의 현탁액이 투여될 수 있다. 적절한 지방친화성 용매 또는 기초제는 예를 들어 참깨 기름, 또는 예를 들어 올레인산 에틸 또는 트리글리세리드인 인공적 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 예를 들어 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 기질을 포함할 수 있다. 상기 현탁액은 또한 안정제를 포함할 수 있다.
상기 펩티드 및 항체는 주사 투여를 위해 종래의 약학적으로 수용가능한 비경구적 기초제를 사용하여 제제화 될 수 있다. 이들 기초제는 무독성이고 치료에 도움이 되며, 많은 제제화가 (상기의) Remington's Phamaceutical Sciences에서 출발되었다. 부형제의 무한한 예는 물, 염수, 링거 용액, 포도당 용액 및 Hank의 등장염용액이다. 약학적 조성물은 또한 등장성, 생리적 pH 및 안정성을 유지하는 기질과 같은 소량의 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 펩티드 및 항체는 약 1.0 ng/ml ~ 100 mg/ml를 포함하는 농도에서 집합체 및 다른 물질들이 실질적으로 유리된 정제된 형태로 제제화될 수 있다.
자가면역 질명의 예방, 억제 또는 치료에 사용되는 펩티드 및 항체의 효과적인 투약량은 약 1 ng ~ 100 mg/kg(체중)의 범위 내일 수 있다. 상기의 투여량 범위는 또한 약 10 ng ~ 10 mg/kg일 수 있다. 상기의 투여량 범위는 또한 약 100 ng ~ 1 mg/kg일 수 있다.
다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하기 위한 것이다. 다음의 실시예들에 개시된 기법들은 본 발명의 실시에 있어서 잘 기능하도록 하기 위하여 본 발명자에 의하여 발견된 기법을 나타내는 것으로 당업자들에게 평가되어져야 하며, 따라서 그 실시를 위한 바람직한 방법을 구성하는 것으로 고려되어져야 한다. 그러나 당업자는 본 발명의 개시의 관점에서, 공개된 상세한 실시예에서 많은 변화가 가능하며, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서 여전히 동일 또는 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인정해야 한다.
실시예1
MS 환자에서 확인된 T 세포 수용체 Vβ-Dβ-Jβ DNA 서열
MBP의 83-99 면역우성 에피토프를 인식하는 MBP 반응성 T 세포의 20 CDR3 서열의 세트는 유전자 은행으로부터 선택되었다. 상기의 20 서열 중에서 어떤 것이 일반적으로 발현되는지 여부를 확인하기 위해서 40명의 MS환자 및 15명의 대조표준인으로부터의 말단혈액림프구 견본은 두 단계 RT-PCR 및 미국특허 6,303,314(Zhang)호에 기재된 RT-PCR에 근거한 프라이머를 사용하여 스크린된다.
간단히 말해서, 전체 RNA는 RNeasy 미니키트(Qiagen, Santa Clarita, CA)를 사용하여 MS 환자 및 대조군으로부터의 T 세포에서 추출된다. 전체 RNA 로부터 역전사된 첫번째 가닥 cDNA는 Vβ류 특이적 프라이머 및 Cβ프라이머를 사용하여 PCR 증폭의 첫 순환이 진행되고, Vβ-Dβ-Jβ프라이머 및 Cβ프라이머를 사용하여 세포소화 또는 반-세포소화 된 PCR의 두번째 순환이 진행된다. 상기의 증폭된 PCR 생성물은 90분 동안 5 mHg에서 진공 블럿(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여, 1%의 아가로오스에 전기영동으로 분리되고, 양으로 대전된 나일론 막(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)에 전사되었다. DNA는 UV 가교에 3분간 노출됨으로써 막위에 고정되었고, 적어도 한시간 동안 68℃에서 미리 혼성화되었다. 0.1 mg/ml의 폴리(A)는 목표가 아닌 DNA에 대한 프로브의 비특이적 결합을 감소시키기 위해 미리 혼성화된 용액(5xSSC, 1% 블록킹 용액, 0.1% N-라우릴사르코신, 0.02% SDS)에 첨가되었다. 혼성화 온도 및 세정 조건은 엄격한 혼성화 조건을 확보하기 위하여 다른 CDR3 특이적 프로브에 따라 최적화되었다. 혼성화는 5xSSC, 1%의 블록킹 용액, 0.1%의 N-라우릴사르코신, 0.02%의 SDS, 및 상기 CDR3 영역을 암호화 하는 뉴클레오티드 서열에 특이적인 디그옥시제닌으로 표지된 프로브 0.3 pmol/ml을 포함하는 완충액에서 수행되었다.
DNA 혼성 생성물의 검출은 제작사(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)의 지시에 따라 디그옥시제닌 발광 검출키트(Digoxigenin Luminescent Detection Kit)를 사용하여 수행되었다. 다음에 상기의 막은 실온에서 15~30분간 X-RAY 필름에 노출되었다.
테스트된 20개의 서열 중에서, 세개의 CDR3-암호화된 서열은 대조군 견본과는 반대로 MS 유래된 견본의 높은 비율에서 검출되었다. 표 1은 각 서열에서의 CDR3 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 뿐만 아니라, 세개의 검출된 CDR3-암호화된 서열 각각을 포함하는 TCR 유전에 대한 유전자 은행 허가번호(Genbank Accession Number)를 나타낸다. 표 2는 MS-유래된 견본 및 대조군 PBL 견본에서의 CDR3-암호화된 서열의 양성 검출의 전체 퍼센트를 나타낸다.
MBP 83-99에 특이적인 CDR3 서열
Genbank 허가번호 V 유전자 CDR3 서열
MS2002-DH(서열번호 7) BV17 gcc agt agt act gac tgg agc (서열번호 1)A S S T D W S (서열번호 4)
MS2002-18(서열번호 8) BV5.2 agc agc ttg agg ggg gcg cta aac att (서열번호 2)S S L R G A L N I (서열번호 5)
MSFRANS1 E3(서열번호 9) BV9 agc agc caa gat cgt ttt tgg (서열번호 3)A S Q D R F W (서열번호 6)
CDR3 DNA의 양성 검출의 퍼센트
Genbank 허가번호 MS 환자에서의 % 대조군에서의 %
MS2002-DH 57.5% 33%
MS2002-18 50% 6.7%
MSFRANS1 E3 80% 20%
많은 연구들이 특정 Vβ-Dβ-Jβ유전자 산물의 차별적인 이용을 지지하지 않기 때문에, 표 2의 결과는 놀라운 것이다. 예를 들어, 미국특허 6,303,314(Zhang)에 기술된 LGARAGLTY 모티프는 단 몇몇의 개체에서만 발견된다. 반대로, MBP 자기반응성 T 세포클론은 개체에서 상대적으로 제한되는 Vβ-Dβ-Jβ유전자 이용의 이질적인 패턴을 전형적으로 보여준다. Vβ-Dβ-Jβ유전자 이용의 이질성은 병원(病原)의 자기반응성 T 세포를 치료적으로 제거하기 위한 접근에 따른 펩티드 백신의 사용가능성을 상당히 손상시킬 수 있다고 기술분야에서 일반적으로 인식되었다. 여기에서의 결과는 하나 이상의 펩티드에 근거한 백신이 병원의 자기반응성 T 세포의 제거에 유용한 것임이 입증될 수 있음을 처음으로 나타낸다.
실시예 2
항-MBP-반응성 T 세포 수용체 모노클로날 항체의 조제
항-MBP-반응성 T 세포 수용체 모노클로날 항체를 생산하는 혼성 세포선을 제조하는 과정은 특이적인 MBP-반응성 T 세포 수용체 단백질로부터의 펩티드 모티프로 미리 주어진 BALB/c 쥐들의 골수종 세포와 BALB/c 쥐의 비장세포의 용해와 관계된다.
1. 용해를 위한 비장세포의 준비
특이적 MBP-반응성 T 세포로부터의 펩티드 모티프는 정제된 재조합 T 세포 수용체로부터 또는 펩티드 합성에 의하여 분리될 수 있다. 펩티드 모티프는 95% 이상의 순도로 정제되고, 완전한 프로인트 보조액(Freund's adjuvant)에 유화된 약 30ug의 피하투여에 의하여 성숙한 BALB/c 또는 C57B46 수컷 쥐를 면역화하는 데에 이용된다. 상기 쥐는 2주후에 피하로 주입된 불완전 보조액에서 펩티드 모티프의 추가 접종으로 재면역화되었다. 2~6주가 더 지난 후, 20~40ug의 펩티드 모티프는 정맥내로 투여되고, 2~4일 후 쥐들은 희생되고, 비장 세포 현탁액은 게프터 등(Gefter 등, Somatic Cell Genetics 3:231)에 의하여 제시된 방법으로 제조된다. 적혈구는 40℃의 NH4Cl(0.83%)에서 15분간 배양하기 위해 용해된다. 결과로서 생긴 세포현탁액은 이후에 단백질제거 배지(RRMI 1640, 7.5mM HEPES로 완충, pH 7.2)에서 원심분리되는 열-비활성화된 송아지 혈청을 통하여 원심법에 의해 세정된다.
2. 용해를 위한 골수종 세포의 준비
P3U1으로부터 유래되고 옐튼 등(Yelton, Curr.Top. Microbiol. immunal. 81:1-7)에 의하여 기술된 바와 같이 HPRT(E.C2.4.2.8)에서 부족한 골수종 세포는 10%의 태아 송아지 혈청과 15%의 말 혈청을 포함하는 이글(Eagle)의 최소필수배지(MEM, minimum essential medium)에서 유지된다. 골수종 세포의 성장은 선택적인 하이포크산틴(hypoxanthine)-아미노프테린(aminopeterin)-티미딘(thymidine)(HAT) 배지에 의하여 억제된다.
3. 혼성의 생산
혼성의 생산은 107 BALB/c 골수종 세포를 펩티드 모티프 면역화된 BALB/c 또는 C57B1/6 쥐로부터 얻어진 108 비장 세포와 혼합함으로써 이루어진다. 상기 세포혼합물은 800xg에서 원심분리되고, 상기 세포들은 제프터(Gefter) 등에 의해 기술된(1977) 과정을 따르는 혈청없이 최소필수배지(MEM)에서 희석된 폴리에틸렌 글리콜(PEG 1000)의 50% 용액(w/v)에 혼합하기 위해 재현탁된다.
결과적인 하이브리도마 세포는 Galfre 및 Milstein Meth(Enzymol. 73:3, 1975)가 기술한 바와 같은 제한 희석에 의해 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지에서 복제된다. 상기 펩티드 모티프를 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포선이 선택된다.
4. MBP-반응성 T 세포 수용체 항체의 생산을 위한 클론의 테스트
린브로(유체 연구실) 미량역가 96 웰 플레이트(Linbro (Flow Lab) microtiter 96 well plate)는 50~100 μg의 펩티드 모티프 또는 T 세포 수용체 단백질로 덮혀지고, 20℃에서 하룻밤동안 배양된다. 웰(well)을 카네이션 인스턴트 우유 5% 및 0.085 아지드 나트륨을 포함하는 0.1 M 트리스(pH 7.5)--1% 노니뎃(nonidet) p-40으로 세번 세척한 후 0.05 ml의 배지 상청액이 첨가되고 40℃에서 하룻밤동안 배양된다. 상기 상청액은 RIA 완충액으로 세번 세척한 후 제거되며, 상기 항체는 하이브리도마 스크리닝 키트(Hybridoma Screening Kit)(Bethesda 연구소)를 사용하여 검출된다. 비특이적 결합을 위한 대조군은 상기의 제2 항체 또는 배지 상청액 중 어느 하나를 뺌으로써 포함된다.
여기에 완전하게 기술된 발명은 아래에 제신된 발명의 정신 또는 범위로부터 벗어나지 않고 당업자가 많은 변화와 변경을 가할 수 있을 것이다.
여기에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 발명의 개시의 관점에서 과도한 실험을 수행하지 않고도 만들어지고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 제기된 실시예에 의하여 기술된 반면에, 본 발명의 개념, 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 여기에 기술된 조성물 및/또는 방법에 그리고 방법의 단계 및 그 순서에서 변화가 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 보다 특히, 어떤 화학적 및 생리학적으로 관계된 어떤 시약은 동일 또는 유사한 결과를 얻는 한에는 여기에 기술된 시약을 대체할 수 있다. 이러한 모든 유사한 기질 및 당업자에게 명백한 변경은 첨부된 청구항에 의해 한정되는 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
실시예 3
MS 환자의 치료를 위한 효과적인 펩티드-기초 백신의 확인
이 시도를 위한 포함기준은 적어도 2년동안 임상적으로 규정된 MS 환자, RR-MS에 대해 1.5~6.5 그리고 2차진행 MS(SP-MS, secondary progressive MS)환자에 대해 4.0~8.0의 범장애상태척도(EDSS, expanded disability scale score) 기준선, 그리고, 해제-완화 MS(RR-MS, releasing-remitting MS)단에 대한 연구시작 전 지난 2년간 적어도 한번의 악화이다. 상기 환자들은 본 연구가 시작되기 전 적어도 3개월동안 스테로이드를 포함하는 어떠한 면역억제 약물도 사용하지 않았다. 스테로이드는 본 연구동안에 악화가 발생하면 허용된다. 피로, 경련 및 수포증을 위한 징후 치료는 금지되지 않는다. 상기 환자들은 서열번호 4, 5, 6, 10 또는 미국특허 5,614, 192(Vandenbark)에 개시된 CDR 서열을 포함하는 TCR로 자기반응성 T 세포의 존재를 테스트 받는다.
백신은 서열번호 4, 5, 6, 10 또는 그로부터 유래된 서열을 포함하는 서열과함께 펩티드 기초 항원의 면역학적으로 효과적인 양을 포함하여 준비된다. 전체 15개 백신은 다음과 같이 테스트 된다; (ⅰ) 네개의 항원 중 하나(전체 4개), (ⅱ) 네개의 항원 중 두개의 조합(전체 6개), (ⅲ) 4개의 항원 중 세개의 조합(전체 4개), 및 (ⅳ) 항원 중 네개의 조합(전체 4개). 각 환자는 두달 간격으로 테스트 백신 중 하나의 피하주사를 세번 받는다.
다음에 환자들은 장애의 확인된 진행, EDSS, 재발율 및 MRI 손상 활동이 개시되는 시점동안 관찰된다. 상기 결과는 MS의 고유적 역사의 평가로서 제공된(Jacobs 등, 1996, European Study Group, 1998) RR-MS 및 SP-MS 환자에서의 최근의 임상적인 시도의 위약부문 뿐만 아니라, 상기 환자 자신의 사전치료 과정과 비교된다. 진행 시간은 적어도 두달간 지속된 EDSS 상(Poster 등, 1983)의 적어도 1.0의 증가에 의하여 결정된다. 신경학상의 시험에서의 객관적 변화(EDSS 상의 적어도 0.5 포인트의 악화)에 의해 수반되는, 연구 중의 악화는 새로운 신경학상의 징후의 출현 또는 적어도 48시간 동안 지속되는 미리존재하는 신경학적 징후의 악화에 의하여 밝혀진다. 환자들은 예정된 정기 방문 사이에 일어난 일을 보고하도록 지시받고, 만일 징후가 악화될 암시가 있으면 신경과 의사에게 진찰을 받는다.
안전 평가는 불리한 결과, 치명적 신호 및 정기 방문에서의 신체검사를 포함한다. 펩티드 기초 백신접종 전과 후에 환자 연구에서의 임상적 변화의 차이는 윌콕슨 랭크섬 테스트(Wilcoxon's rank-sum test)를 사용하여 분석된다.
실시예 4
펩티드 기초 백신을 이용하는 MS 환자의 치료
MS의 임상적 징후의 진행을 늦추는 데에 효과적인 것으로 확인된 실시예 3에서의 백신은 MS 환자에게 투여된다. 백신치료를 받는 환자들은 어떤 지속의 MS를 앓고 있을 수 있고, 어떠한 알려진 기준에 의하여 진단될 수 있다.
상기 펩티드는 서열번호 4, 5 또는 6의 서열, 또는 그로부터 유래한 서열로 구성된 펩티드나 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 TCR로 T 세포를 활성화하기 위해 이용될 수 있다. T 세포는 본 기술분야에 알려진 어떠한 많은 방법을 사용하여 자가면역질병을 가진 환자로 부터 얻을 수 있다. 상기 T 세포는 또한 자기반응 T 세포처럼, 특정 생물형군으로 증대될 수 있다. 상기 분리된 T 세포는 그 후 시험관 내에서 펩티드로 자극될 수 있으며, 서열번호 4, 5 또는 6의 서열, 또는 그로부터 유래한 서열로 구성된 펩티드 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 TCR로 T 세포를 활성화 및/또는 T세포의 수를 확대할 수 있다. 그 다음에 활성화된 및/또는 확대된 T 세포는 상기 T 세포가 유래된 환자에게 투여될 수 있으며, 그로 인하여 서열번호 4, 5 또는 6의 서열, 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 TCR에 의하여 자기반응 T 세포에 결합할 수 있고, 그로 인해 상기 자기반응 T 세포가 제거된다.
SEQUENCE LISTING <110> BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE OPEXA PHARMACEUTICALS INC. Zhang, Jingwu <120> T CELL RECEPTOR CDR3 SEQUENCES AND METHODS FOR DETECTION <130> 05627.0007.00PC00 <140> PCT/US2003/017873 <141> 2003-06-05 <150> US 60/386,287 <151> 2002-06-05 <160> 7 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gccagtagta ctgactggag c 21 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agcagcttga ggggggcgct aaacatt 27 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 agcagccaag atcgtttttg g 21 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Ser Ser Thr Asp Trp Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Ser Leu Arg Gly Ala Leu Asn Ile 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ser Gln Asp Arg Phe Trp 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr 1 5

Claims (21)

  1. 서열번호 4, 5 및 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 암호화하는 서열의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드, 그에 대한 보체 또는 그 유도체를 포함하는 15~30 길이의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서,
    서열번호 4, 5 및 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 암호화하는 서열의 적어도 15개의 연속적 뉴클레오티드, 그에 대한 보체 또는 그 유도체를 포함하는 15~30 길이의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드.
  3. 제 1항에 있어서,
    서열번호 4, 5 및 6으로구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 암호화하는 서열, 그에 대한 보체 또는 그 유도체를 포함하는 15~30 길이의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드.
  4. T 세포 수용체 유전자의 동일 가닥 상에서 발견되지 않는 하기 제1 및 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍:
    (a) 서열번호 4, 5 및 6로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 암호화하는 서열의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드, 그에 대한 보체 또는 그 유도체를 포함하는 15~30 길이의 뉴클레오티드의 제1 프라이머; 및
    (b) 상기 제1 프라이머의 서열을 포함하지 아니하고, T 세포에서 T 세포 수용체의 Vβ부터 Cβ까지의 영역에서 발견되는 15~30 길이의 뉴클레오티드의 핵산을 포함하는 제2 프라이머.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 제2 프라이머는 서열번호 7, 8 및 9로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 쌍.
  6. 다음을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브:
    (a) 서열번호 4, 5 및 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 암호화하는 서열의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드, 그에 대한 보체 또는 그 유도체를 포함하는 10~30 길이의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드; 및
    (b) 표지부위.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 표지부위는 32P, 35S, 비오틴(biotin) 및 디그옥시제닌(digoxigenin)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
  8. 다음을 포함하는 서열번호 4, 5 및 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 T 세포 수용체 모티프, 또는 그 유도체를 발현하는 MBP83-99를 검출하는 방법:
    (a) MBP83-99 T 세포로부터 핵산 샘플을 얻는 단계;
    (ⅰ) 상기 핵산 샘플을 T 세포 수용체 유전자의 동일 가닥에서 발견되지 않는 하기의 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 서열로부터 선택된 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계:
    (ⅱ) 서열번호 4, 5 및 6로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 암호화하는 서열의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드, 그에 대한 보체 또는 그 유도체를 포함하는 15~30 길이의 뉴클레오티드의 제1 올리고뉴클레오티드; 및
    (ⅲ) 상기의 제1 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함하지 않고, T 세포에서 T 세포 수용체 유전자의 Vβ부터 Cβ까지의 영역에서 발견되는 15~30 길이의 뉴클레오티드의 제2 올리고뉴클레오티드,
    (b) T 세포 수용체 모티프를 암호화하는 핵산의 존재를 검출하는 단계.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 제2 프라이머는 서열번호 7, 8 및 9로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 핵산 샘플의 단편은 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기의 검출단계는 다음을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 탐침하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    (a) 서열번호 4, 5 및 6로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 암호화하는 서열, 그에 대한 보체 또는 그 유도체를 포함하는 올리고뉴클레오티드; 및
    (b) 표지부위.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 검출단계는 방사선자기법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 서열번호 4, 5 및 6으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열을 암호화하는 서열의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드, 그에 대한 보체, 또는 그 유도체를 포함하는 15~30 길이의 뉴클레오티드의 제1 뉴클레오티드를 포함하는 테스트 키트.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기의 제1 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함하지 않고 T 세포에서 T 세포 수용체 유전자의 Vβ에서 Cβ영역에서 발견되는 제2 올리고뉴클레오티드를 더 포함하며, 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 서열은 T 세포 수용체 유전자의 동일 가닥에서 발견되지 않는 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 제2 프라이머는 서열번호 7, 8 또는 9로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
  16. 제 13항에 있어서,
    표지부위를 더 포함하고, 상기 표지부위는 32P, 35S, 비오틴(biotin) 및 디그옥시제닌(digoxigenin)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 테스트 키트.
  17. 다음을 포함하는 자가면역 질병 감시방법.
    (a) 인간으로부터 MBP83-99 T 세포를 얻는 단계;
    (b) 서열번호 4, 5 및 6으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열을 암호화 하는 핵산 또는 그 유도체의 존재를 검출하는 단계
    (ⅰ) MB83-99 T 세포로부터 핵산 샘플을 얻는 단계
    (ⅱ) 상기 핵산 샘플을, T 세포 수용체 유전자의 동일 가닥에서는 발견되지 않는 하기의 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 서열로부터 선택된 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계.
    a. 서열번호 4, 5 및 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 암호화하는 서열의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드, 그에 대한 보체, 또는 그 유도체를 포함하는 15~30 길이의 뉴클레오티드의 제1 올리고뉴클레오티드.
    b. 상기의 제1 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함하지 않고, T 세포에서 T 세포 수용체 유전자의 Vβ에서 Cβ까지의 영역에서 발견되는 제2 올리고뉴클레오티드.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 제2 프라이머는 서열번호 7, 8 및 9로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 서열번호 4, 5 또는 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열 또는 그 유도체를 포함하는 제1 펩티드 및 선택적으로 약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 백신.
  20. 제 19항에 있어서,
    적어도 서열번호 4, 5, 6 및 7로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 그 유도체를 포함하는 제2 펩티드를 더 포함하고, 선택적으로 약학적으로 수용가능한 캐리어를 더 포함하며, 상기 제1 및 제2 펩티드의 서열은 다른 것을 특징으로 하는 백신.
  21. 제 19항 또는 제 20항 중 어느 한 항에 따른 백신을 자가면역 질병 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 질병을 치료하는 방법.
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