HUT77484A - Peptidek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények - Google Patents

Description

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US95/12686

A nemzetközi közzététel száma: WO 96/11214

A találmány tárgyát peptid szekvenciák, valamint azok alkalmazása képezi, amely szekvenciák befolyásolják az anti-idiotipusos T-sejtek aktivitását. A számunkra érdekes anti-idiotipusos T-sejtek aktivitása a T-sejteknek ahhoz a képességéhez kapcsolódik, hogy felismerik az anti-p277 T-sejteket. A jelen találmány szerinti peptidek tehát fontos eszközök az inzulin-dependens diabétesz mellituszhoz (IDDM) kötődő betegség diagnosztizálásában, megelőzésében, enyhítésében vagy kezelésében.

Az I-es típusú diabétesz, vagy IDDM egy autoimmun betegség, amit T-sejtek okoznak, amelyek megtámadják és elroncsolják a hasnyálmirigy szigetekben levő inzulintermelő sejteket [ Castano és mtsai: Type-I Diabetes: A

Chronic Autoimmune Disease of Humán, Mouse, and Rat, Annu. Rév. Immunoi. _8, 647-679 (1990)] . Az IDDM-ben kicsúcsosodó autoimmun folyamat tünetek nélkül kezdődik és halad előre. A betegség klinikailag csak akkor nyilvánul meg, ha a β-sejtek kumulatív vesztesége meghaladja a megmaradt β-sejtek inzulintermelő képességét. Valóban, a glükóz homeosztázis összeomlásáról és a klinikai IDDMről azt gondolják, hogy csak akkor lép fel, ha a β-sejtek

80-90%-át inaktiválta az immunrendszer. Tehát azok a betegek, akiket már azonosítani lehet, hogy IDDM-ben szenvednek, β-sejtjeik autoimmun roncsolása előrehaladott állapotában vannak. Emellett a kezdődő, pre-klinikai cukorbetegség diagnosztizálása a β-sejt autoimmunitás immu• · ·· ···· ·· • · · · · • · · · · · ·· ·· · ··· nológiai markereinek kimutatása révén csak akkor tehető meg, ha az autoimmun folyamat már beindult. Ezért megkezdődött a terápiás kutatómunka, azaz az, hogy biztonságos, specifikus és hatékony módját találjuk meg az autoimmun folyamat kikapcsolásának.

A jelen találmány szerzői korábban vizsgálták ezt a kérdést, tanulmányozva a NŐD egértörzsben kifejlődő spontán cukorbetegséget, amiről úgy gondolják, hogy kiváló modellje a humán IDDM-nek [ Castano és mtsai: Type-I Diabetes: A Chronic Autoimmune Disease of Humán, Mouse, and Rat, Annu. Rév. Immunoi. EJ 647-679 (1990);

Bowman és mtsai: Prevention of Diabetes in the NŐD

Mouse: Implications fór Therapeutic Intervention in Humán Disease; Immunoi. Today 15(3), 115-120 (1994); Williams,

G.: IDDM, Long Honeymoon, Sweet Ending, Láncét 343, 684-685 (1994)] . A NŐD egerekben egyhónapos kor körül fejlődik ki inzulitisz, ami egy enyhe, sziget-előtti beszűrődés formájában kezdődik, majd előrehaladva súlyos, szigeten belüli gyulladást okoz. A hiperglikémia, ami a nem-elegendő inzulinmennyiségre utal, a mi tenyészetünkben a nőstényekben körülbelül háromhónapos korban kezdődik. Hathónapos korra majdnem mindegyik nőstény NŐD egérben súlyos cukorbetegség fejlődik ki, és a legtöbb elpusztul inzulin-kezelés nélkül. A hím NŐD egerekben ritkábban fordul elő a betegség, aminek az oka nem világos. A NŐD egerek cukorbetegségéről kimutatták, hogy autoimmun T-sejtek okozzák [Bendelac és mtsai: Syngeneic

- 4 • ·

Transfer of Autoimmune Diabetes from Diabetic NŐD Mice to

Healthy Neonates: Requirement fór both L3T4+ és Ly+ - 2+ T Cells; J. Exp. Med. 166, 823-832 (1987)] .

A T-sejtek reaktivitását és a különböző antigénekkel szemben kialakuló antigéneket kimutatták humán IDDM betegekben, valamint NŐD egerekben [Éliás, D. : The NŐD Mouse: A Model fór Autoimmune Insulin-Dependent

Diabetes; Autoimmune Disease, Models, A Guidebook, 147161 (1994)], és az nem világos, hogy a lehetséges megcélzott antigének bármelyikével szemben kialakuló immunitás a fő oka a betegségnek. Az ok kérdése mellett a terápia is kérdés.

Azt kimutatták, hogy megelőzhetjük az autoimmun folyamat beindulását NŐD egerekben, ha az egereket a cukorbetegség fellépte előtt különböző manipulációknak vetjük alá, azaz például korlátozott diéta, vírusfertőzés, vagy az immunrendszer aspecifikus serkentése [ Bowman és mtsai: Prevention of Diabetes in the NŐD Mouse: Implications fór Therapeutic Intervention in Humán Disease; Immunoi. Today 15(3), 115-120 (1994)] . A NŐD cukorbetegség megelőzhető úgy is, hogy immunológiai toleranciát indukálunk a pre-diabetikus egerekben a glutaminsav-dekarboxiláz (GAD) antigénnel szemben [ Kaufman és mtsai:

Spontaneous Loss of T-cell Tolerance to Glutamic Acid Decarboxylase in Murine Insulin-Dependent Diabetes;

Natúré 366, 72-75 (1993); Tisch és mtsai: Immuné

Response to Glutamic Acid Decarboxylase Correlates with

Insulitis in Non-Obese Diabetic Mice; Natúré 366, 72-75 (1993)] .

Az anti-idiotípusos T-sejtek olyan T-sejtek, amelyek felismerik más T-sejtek antigén receptoraiból származó peptideket [ Lider, 0. és mtsai: Anti-idiotypic network induced by T cell vaccination against experimental autoimmune encephalomyelitis; Science 239, 181 (1988)] .

Az a vélemény alakult ki, hogy az anti-idiotípusos T-sejtek szerepet játszanak azon T-sejtek aktivitásának szabályozásában, amely T-sejtek receptorpeptidjeit (TCR) felismerik. Az autoimmun T-sejtek lehetnek az anti-idiotípusos T-sejtekkel végzett szabályozás tárgyai: az antiidiotípusos T-sejteket a következő esetekben mutatták ki: rágcsálók szándékos T-sejt vakcinálása után a kísérleti autoimmun encephalomyelitis (EAE) modellben [Lider, 0. és mtsai: Anti-idiotypic network induced by T cell vaccination against experimental autoimmune encephalomyelitis; Science 239, 181 (1988)]; vagy emberekben, akik szklerózis multiplexben (MS) szenvednek [ Zhang, J. és mtsai: MHC-restricted depletion of humán myelin basic protein-reactive T cells by T cell vaccination; Science 261, 1451 (1993)], autoimmun T-sejtekkel.

A 261,648 számú európai szabadalmi bejelentésben leírják az egy autoimmun betegségre specifikus, aktivált T-sejtek használatát az ilyen betegség kezelésére. A Tsejteket először előnyösen nyomással kezelik, kémiai keresztkötést okozó ágenssel kezelik, és/vagy citoszkele1 • · · · · · · • · · · ·· ··

............

tális roncsoló ágenssel kezelik, azért, hogy fokozzák immunogén tulajdonságukat. A teljes kezelt sejtet vagy annak egy frakcióját használhatjuk vakcinaként az ellen az autoimmun betegség ellen, amelyre specifikus a T-sejt.

Az autoimmun T-sejtek leállítására ismert eljárásban az alanyt az adott autoimmun specifitással rendelkező attenuált vagy avirulens T-sejtekkel, vagy azok fragmenseivel illetve frakcióival immunizálják. Az alany úgy reagál, hogy legalább két típusú szabályozó T-sejtet aktivál: anti-ergotípusos T-sejteket, amelyek felismerik a T-sejt aktiváló markereket, és anti-idiotípusos T-sejteket, amelyek láthatóan felismerik a patogén endogén autoimmun T-sejteken jelenlevő ön-antigén receptorokat. A kísérleti állatokban végzett T-sejt vakcináció hatékonyan indukálja a már létrejött betegség permanens remisszióját, valamint megelőzi a betegséget. Egy T-sejt receptor β-lánca peptidszekvenciájának használatát írták le patkányok vakcinálására kísérleti autoimmun encephalomyelitis ellen [ Howll és mtsai: Vacination against Experimental Allergic Encephalomyelitis with T cell Receptor Peptides; Science 246, 668-670 (1989); (erratum at Science 247, 1167 (1990)); Vandenbark és mtsai: Immunization with a Synthetic T-Cell Receptor V-region Peptide Protects against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis; Natúré 341, 541-544 (1989)], ezzel alátámasztva azt a következtetést, hogy az autoimmun Tr • · · ·· · ·· • · · · · » ·· ·· ·· ·· ·········· sejt receptor képes létrehozni egy megcélzott epitopot a szabályozó T-sejtek számára.

A jelen találmányban azt mutatjuk be, hogy a cukorbetegség spontán kifejlődését NŐD egerekben egy ellenszabályozott hálózat szabályozza, amelyben az antiidiotípusos T-sejtek specifikusak egy olyan autoimmun T sejt TCR VDJ peptidjére, amely T-sejt általában expresszálódik a nem-elhízásos cukorbeteg (NŐD) törzsekben [ Kikutani, H. és mtsai: The murine autoimmune diabetes model: NŐD and related strains; Advances in Immunoi. 51,

285-322 (1992)] .

A hsp60 és p277 peptid funkcionális szerepe az IDDM-ben

A jelen találmány szerzőinek laboratóriumában korábban igazolták, hogy a 60 kDa-os hősokk fehérje (hsp60) egy epitopja a célpontja egy autoimmun támadásnak az I-es típusú diabétesz mellitúszban, ami spontán fejlődik ki a NŐD egértörzsben [Éliás, D. és mtsai: Induction and therapy of autoimmune diabetes in the nonobese-diabetic (NOD/Lt) mouse by a 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 87, 1576-1580 (1990)] . Ezt a fehérjét korábban hsp65 néven említették, ma azonban hsp60 néven említik, a pontosabb molekulasúly-meghatározás fényében; bármi a neve, a fehérje ugyanaz. Ebben a laboratóriumban korábban azonosítottak egy peptidfragmenst a humán hsp60 szekvenciából, aminek p277 a jelzése (5. számú szekvenτ • ·· ·· ··· · ·· ··· · · · ·· ·····« · _ ········ . 8 . ··· ·· ·· · ··· cia), ami egy célpont epitopot tartalmaz a cukorbetegséget befolyásoló T-sejtek számára [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991); WO 90/10449 számú PCT publikáció] .

Ebben a laboratóriumban izoláltunk egy T-sejt kiónt is, jele C9 klón, amely felismeri a p277 peptidet, és képes cukorbetegséget előidézni [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)] . Mind a p277 peptidről, mind a C9 T-sejtekről kiderült, hogy funkcionális szerepük van a cukorbetegség szabályozásában: a NŐD egerek vakcinálása a C9 Tsejtekkel vagy a p277 peptiddel képes megakadályozni [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)] , vagy éppen visszafordítani a cukorbetegséget [Éliás, D. és mtsai: Peptide therapy fór diabetes in NŐD mice; Láncét 343,

704 (1994)] . Mindkét terápiás vakcinálás aktiválja az anti-idiotípusos T-sejteket.

A C9-es kiónról kiderült, hogy egy T-sejt receptor (TCR) β-láncot expresszál, amely egy, a VDJ peptidszekvenciája által meghatározott idiotopot hordoz. Az azonos r

vagy hasonló VDJ szekvenciákról kiderült, hogy a NŐD és egyéb egértörzsekben jelenlevő diabetogén T-sejtek is tartalmazzák.

A jelen találmány tárgya egy peptid, amely legalább 7, de előnyösen körülbelül 7-24 aminosav csoportot tartalmaz, amelyben megtalálható az alábbi képletű VDJ régió:

V-D-J amelyben V jelentése az A-S dipeptid szekvencia, D jelentése az L-G dipeptid szekvencia, J jelentése az NQ-D tripeptid szekvencia, a dőlt betűk a megfelelő aminosav standard egybetűs rövidítését jelentik. A D régióban előnyösen 2-5 aminosav található.

A jelen találmány specifikus megvalósítási módja szerint a peptid tartalmaz egy V szegmenst, ami tartalmazza az A-S-S tripeptid szekvenciát. A többiekben a peptid tartalmaz egy D szegmenst, ami tartalmazza az L-G-G tripeptid szekvenciát, az R-L-G tripeptid szekvenciát, vagy az L-G-L-G-A pentapeptid szekvenciát (a 4. számú szekvencia 4-8-as csoportjai).

A jelen találmány tárgya továbbá egy legalább 7, de előnyösen 8-24 aminosavat tartalmazó peptid, aminek képlete νβ-ϋ-ΰβ gén, amiben a νβ szegmens a νβ gén, előnyösen a humán νβ gén, által kódolt fehérje C-terminálisáról

1-10 aminosavat tartalmaz, amelyben a három utolsó C-terminális aminosav tartalmazza az A-S₂ dipeptid szekvenciát, a D régióban összesen 2-5 aminosav van, közte az L-G • ·

- 10dipeptid szekvencia, míg a ύβ szegmens 1-10 aminosavat tartalmaz egy JP gén, előnyösen egy humán jp gén által kódolt fehérje N-terminális végéről.

A specifikus peptidek közé tartoznak azok, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, amelyek előnyösen körülbelül 24 aminosav csoportot tartalmaznak. Ilyenek például az A-S-R-L-G-N-Q-D (3. számú szekvencia), az A-SS-L-G-L-G-A-N-Q-D (4. számú szekvencia) és az A-S-S-L-GA-N-Q-D (16. számú szekvencia).

A jelen találmány tárgyát képezik bizonyos DNS konstrukciók, amelyek peptideket kódolnak, beleértve azokat az oligonukleotidokat, amelyek olyan polinukleotid szekvenciát tartalmaznak, amely az előzőkben említett DNS szekvenciáknak legalább egy részével komplementer. A találmány tárgyát képezik továbbá a peptideket tartalmazó gyógyászati készítmények, beleértve azokat a készítményeket, amelyek jól használhatók vakcinákként vagy olyan ágensként, amellyel ki lehet mutatni az anti-p277 Tsejtek felismerésében szerepet játszó idiotípusos Tsejtek jelenlétét.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a peptideket és egy második molekulát, beleértve egy második peptidet, polipeptidet vagy kis szerves molekulát tartalmazó konjugátumok.

Amint azt korábban említettük, a találmány fontos tárgya egy olyan módszer leírása, amely egy egyedben befolyásolja az anti-idiotípusos T-sejt aktivitást.

• ·· ···· ·· • · · · 9 9 9

- 11 Például az anti-idiotípusos T-sejt aktivitást erősíti, ha egy betegnek a találmány szerinti pepiidből annyit adunk be, amennyi hatékonyan fokozza az anti-idiotípusos sejtek aktivitását.

A jelen találmány szerinti peptid használható a Tsejtek, előnyösen autológ T-sejtek in vitro aktiválására, amiket azután újra be lehet adni a betegnek, hogy megtámadják a betegséget okozó T-sejteket.

A jelen találmány további tárgyai nyilvánvalóak a szakterületen jártas szakember számára az alábbiakban következő részletes leírás, beleértve a találmány előnyös megvalósítási módjait is, fényében.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt raj zokat.

1. ábra: A TCR νβ gén C9 kiónban való használatának meghatározása PCR-rel. 1-19-es sáv: a 19 különböző νβ amplifikációs reakció a Οβ oligonukleotid primerrel. s.m.

sáv: fx/HaelII méret marker. A gélt egy belső Οβ oligonukleotid próbával hibridizáltatjuk, ezért nyomtatjuk ki a méret-markert. A νβ2 és a νβ12 pozitív csíkok jelzik, hogy ezek a szegmensek megvannak a C9 kiónban.

2. ábra: A C9 VDJ átrendeződéssel homológ szekvenciák jelenléte, PCR-rel meghatározva különböző T-sejt vonalakban, a specifikus C9 VDJ oligonukleotid primer alkalmazásával. Az első négy sávban láthatjuk a C9 (1-es sáv), C7 (2), N4 (3) NŐD vonalakkal, valamint egy anti- 12• · ovalbumin vonallal (4) kapott eredményeket. A következő sávokban láthatók a C57BL/6 anti-p277 vonalak, amiket különböző számú serkentés! ciklus után kaptunk: 1 serkentés (5-ös sáv), 2 serkentés (6-os sáv), 5 serkentés, két különböző sávban (6-os és 7-es sáv) és 6 serkentés (9-es sáv) , valamint a C57BL/6 anti-OVA vonal (10-es sáv) . Meg kell jegyeznünk, hogy nincs jel sem a NŐD és C57BL/6 anti-OVA vonalak (4-es és 10-es sávok), sem a C57BL/6 vonal első anti-p277 serkentéséről (5-ös sáv). A rokon N4 kiónnal kapott gyenge jel (3-as sáv) mutatja a vizsgálat pontosságát.

3A. és 3B. ábrák: A C9 VDJ átrendeződéssel homológ szekvenciák jelenléte az anti-p277 C57BL/6 vonalak PCR amplifikálásában. A νβ panel amplifikálását, amint azt az

1. ábránál ismertettük, az anti-p277 C57BL/6 vonalak cDNS mintáival hajtottuk végre 2 serkentés után (3A. ábra) illetve 6 serkentés után (3B. ábra). Gélben végzett hibridizációt hajtottunk végre a C9 VDJ specifikus oligonukleotid próbával.

4A. és 4B. ábrák: Spontán anti-idiotipusos válaszok naiv nőstény (4A.) és hím (4B. ábra) NŐD egerekben. A hsp60 (idiotípus) hsp60-ra és a C9 kiónra (anti-idiotípus) adott T-sejt válaszokat mértük naiv nőstény és hím NŐD egerekben. Tíz nőstény és tíz hím NŐD egeret öltünk le 4, 6, 8, 10, 13 és 21-hetes korukban, majd lépüket kivettük egy T-sejt szaporodási vizsgálathoz. A lépsejteket 200 000 sejt/0,2 cm³ koncentrációban vizsgáltuk mikro·« ··»· ·· titer lukakban, hogy milyen szaporodási választ adnak vagy a humán hsp60-ra (5 pg/ml), vagy a C9 kiónra (20 000 sejt/luk, 5000 rad-dal besugározva). A szaporodási választ ³H-timidinnek a tenyészethez való adásával mérjük, egy 72 órás serkentés utolsó 16 órájában. A beépült ³H-timidin mennyiségét egy β-számlálóval mérjük, majd a serkentési indexet (Sí) (cpm beépülés antigén jelenlétében) /(cpm beépülés antigén távollétében) formában számítjuk. Az egyes egereket külön vizsgáltuk, és kiszámítottuk az átlag±SD értéket minden egyes időpontra.

5A. és 5B. ábra: A C9 kiónnal vagy a C9VDJ-flagellinnel végzett immunizáció anti-idiotípusos válaszokat gerjeszt.

5A. ábra: Kilenchetes nőstény NŐD egereket immunizálunk vagy a C9 klón sejtekkel vagy egy anti-OVA T-sejtvonal 5xl0⁶ aktivált T-sejtjeivel 0,1 ml PBS-ben, intraperitoneálisan. Kilenc nappal később a lépeket eltávolítjuk egy szaporodási vizsgálathoz, a 4. ábránál ismertetett módon. A szaporodási vizsgálatban használt antigének a következők: C9 klón, N4 klón, az anti-OVA vonal. Mindegyik T-sejtet 20 000 sejt/luk koncentrációban alkalmazzuk, 5000 rad-dal besugározva, a C9VDJASSLGGNQDTOY (az

1. számú szekvencia 47-58-as csoportjai) és az N4VDJ ASSLWTNQDTOY (2. számú szekvencia) szintetikus peptideket 5 gg/ml koncentrációban.

·«·· ·· ♦ · ·

5Β. ábra: Kilenchetes nőstény NŐD egereket immunizálunk vagy 100 pg C9VDJ-flagellinnel vagy csak flagellinnel 0,1 ml PBS-ben intraperitoneálisan. A szaporodási vizsgálatokat az 5A. ábránál leírt módon hajtjuk végre.

6. ábra: A flagellinhez vagy OVA-hoz konjugált C9VDJ-vel végzett immunizáció anti-idiotípusos válaszokat indukál. Kilenchetes nőstény BALB/c vagy NŐD egereket immunizálunk flagellinnel, C9VDJ-flagellinnel vagy C9VDJOVA-val, csoportonként 5 egérrel, egerenként 100 μg antigénnel, intraperitoneálisan. A C9VDJ-flagellint és a f lagellint 0,1 ml PBS-ben injekciózzuk be, a C9VDJ-OVA-t 0,1 ml IFA-ban készített emulzióban injekciózzuk be. Kilenc nappal később a lépeket eltávolítjuk és egy szaporodási vizsgálatban teszteljük a C9VDJASSLGGNQDTOY (az 1. számú szekvencia 47-58-as csoportjai) és az N4VDJ ASSLWTNQDTOY (2. számú szekvencia) szintetikus peptidek 5 μg/ml koncentrációjával szemben.

7A. és 7B. ábra: Cukorbetegséggel szembeni védelem anti-idiotípusos T-sejtekkel

7A. ábra: Hathetes nőstény NŐD egereket vakcinálunk 100 μg csak C9VDJ-flagellinnel, PBS-ben, intraperitoneálisan, vagy kezelés nélkül hagyjuk őket, csoportonként 10 egeret. A cukorbetegséget hiperglikémia alapján követjük 2,5 hónapos kortól és tovább, azt tekintjük hiperglikémiának, ha a vércukorszint meghaladja a 11,1 mmol/1 értéket.

- 15V» · » · · ·· • · · « · · · ·· · » W «

7B. ábra: Tíz öthetes nőstény NŐD egeret oltunk be besugárzott (5000 rád) C9 klón sejtekkel, 5x 10⁶ aktivált T-sejt 0,1 ml PBS-ben intraperitoneálisan. Két héttel később a lépeket eltávolítjuk, majd összegyűjtjük a szplenocitákat. Tíz azonos korú kezeletlen naiv NŐD nőstény egeret ingerlünk a besugárzott C9 klónnal, milliliterenként 8x 10 szplenocitával és 0,8x 10 besugárzott 09 klónsejttel szemben. A naiv NŐD egerekből származó szplenocitákat NŐD nőstények besugárzott ConA-szelektált Tsejt blasztjaival szemben ingereljük. 48 órás ingerlés után az aktivált T-sejteket Lymphoprep-en (Nycomed, Norway) végzett centrifugálással választjuk el az inaktivált sejtektől, kétszer mossuk PBS-sel, majd egerenként 10⁷ sejttel hathetes nőstény NŐD egerekbe injekciózzuk intraperitoneálisan. Mindegyik csoportban 10 egér van, 10 egér nem kap kezelést. A cukorbetegség kifejlődését a 7A. ábrán jelzett módon követjük.

8A. ábra: Az anti-C9 T-sejt szaporodáshoz nincs szükség APC-re. Az anti-C9 T-sejtvonal hathetes naiv nőstény NŐD egerek szplenocitáiból származik, a szakirodalomban közölt leírás szerint [Éliás, D. és mtsai:

Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)], besugárzott C9 T klón sejtekkel végzett ismételt ingerlésekkel. Egy anti-OVA T-sejtvonal in vivő OVA-val meghajtott nőstény NŐD egerekből származik. Ezeknek a

- 16vonalaknak a szaporodási válaszait az anti-C9 sejtvonallal végzett négyórás serkentés és az anti-OVA sejtvonallal végzett 17 órás serkentés után végezzük, lukanként 50000 sejttel. Az anti-C9 sejtvonalat aktivált és inaktivált (5000 rád) C9 klónsejtekkel (50000 sejt per luk) szemben vizsgáljuk, valamint az anti-OVA sejtvonalat vizsgáljuk OVA-val szemben (SIGMA), lukanként 10 gg-ot alkalmazva. Az APC besugárzott (3000 rád) hím szplenociták voltak, lukanként 200 000. Annak biztosítására, hogy a szaporodásban használt C9 klón vagy az anti-C9 klónsejt vonal nincs APC-vel szennyezve, ezeket a sejteket APCként használjuk az anti-OVA vonalhoz. A szaporodási vizsgálatot a szplenocitákra a 4. ábrán ismertetett módon végezzük.

9. ábra: A p277 peptiddel végzett kezelés anti-C9 választ indukál. 12 hetes nőstény NŐD egereket immunizáltunk p277-tel vagy p278-cal IFA-ban, egerenként 100 μgmal, szubkután, illetve kezeletlenül hagyjuk, csoportonként 10 egérrel. A kezelés után 2 vagy 5 héttel mindegyik csoportból 5 egeret ölünk le, lépjeiket eltávolítjuk, és egyenként vizsgáljuk egy szaporodási vizsgálatban C9VDJ peptiddel (5 pg/ml), a 4. ábránál ismertetett módon.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásban szereplő táblázatokat.

1. Táblázat: A kiválasztott NŐD és C57BL/6 vonalak aminosav szekvenciái. Jelezzük a különböző νβ és ύβ szegmenseket. A C9 VDJ átrendeződésből származó aminosav- és

- 17* »V ···· #-»

4· V · · « « * * • *·· · · ς, « »·· <· ·· · ··*· nukleinsav szekvencia különbségeket félkövér betűkkel jelezzük. A 4-1-E.2 NŐD klón szekvenciája Nakano és munkatársai publikációjából származik [Nakano, N. és mtsai: T cell receptor V gene usage of isiét β cell-reactive T cells is nőt restricted in non-obese diabetic mice; J.

Exp. Med. 173, 1091 (1991)] .

2. Táblázat: A C9 VDJ és VJ szöveti eloszlása különböző korú NŐD egerekben, specifikus oligonukleotid primerekkel végzett PCR amplifikálással kimutatva.

nd=nincs kísérlet

3. Táblázat: Az anti-idiotípusos anti-C9 válaszok mind MHC I mind MHC II osztály korlátozottak. Hat öthetes NŐD nőstényt oltunk be 5x 10⁹ C9 klónsejttel, intraperitoneálisan. Kilenc nappal később a lépeket eltávolítjuk, majd egyesítjük a szplenocitákat. A szplenociták szaporodási válaszai vagy a besugárzott (5000 rád) C9 klónsejtekre (20000 per luk) vagy a C9VDJ peptidre (5 gg/ml) .

Ahhoz hogy meghatározzuk az MHC restrikciót, az I-es és ΙΙ-es osztályú haplotípusokra specifikus monoklonális ellenanyagokat adunk hozzá, 2 mmol ammóniumszulfáttal tisztított IgG-t. Az alábbi ellenanyagokat használjuk: anti-I-A: MKD6, anti-K^c: K9-18-10 és anti-D^b: 28-14-8. A százalékos gátlást 100-nak határozzuk meg (1-SI az ellenanyag jelenlétében /Sí ellenanyag nélkül).

Az autoimmun betegségekben szerepet játszó Tsejteket azok a genetikai elemek jellemzik, amelyeket az autoimmun T-sejt receptoraik (TCR) készítésére hasz• · · · ·

- 18nálnak. A jelen találmányban egy naiv, pre-diabeteszes NŐD egérből izolált C9 klón által expresszált TCR a és β láncait szekvenáljuk. A C9 klón specifikusan reagál a 60 kDa-os hősokk fehérje (hsp60) molekula egy meghatározott peptid epitopjával. A C9 klón NŐD diabéteszben működik: az aktivált C9 sejtek adoptíven viszik át a diabéteszt, vagy, ha attenuáltak, akkor a C9 arra használható, hogy NŐD egereket vakcináljunk diabétesszel szemben [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)] . Igazoltuk, hogy a C9 ΤΟΕβ lánc a Vpl2 variábilis (V) génszegmensből és a J_p2,5 kapcsoló (J) génszegmensből áll. A Vpl2 szekvenciát és a Jp2,5 szekvenciát publikálták és ismertek [ Behlke és mtsai: Alternative Splicing of Murine T-cell Receptor β-chain

Transcripts; Natúré 322, 379-382 (1984); Mallssen és mtsai: Mouse T Cell Antigén Receptor: Structure and Organization of Constant and Joining Gene Segments Encoding the β Polypeptide; Cell 37, 1101-1110 (1984)] .

Tehát a 09Τ0Εβ teljes VDJ szegmensének szekvenciája az 1.

számú szekvenciavázlaton látható, beleértve az L-G-G D szegmenst.

A C9 ΤΟΗβ lánc VDJ szekvenciája expresszálódik a mi összes NŐD egerünkben. Ez a VDJ szekvencia kéthetes korban kimutatható a csecsemőmirigyben, egyhónapos korban

- 19pedig a lépben. A VDJ szekvencia emellett megtalálható az iznulitisz sziget beszűrődéseiben. Emellett egy C9-szerű VDJ szekvenciát izoláltunk diabeteszes C57BL/6 egerekből származó anti-p277 T-sejtekből, amely egerekben a diabéteszt a p277 peptiddel végzett aktív immunizációval indukáltuk. Érdekes módon a C9-szerű VDJ szekvencia különböző νβ génszegmensekhez kapcsolva expresszálható. A diabetogén NŐD T-sejt klón publikált szekvenciája, amelynek ismeretlen a specifitása, és Japánban függetlenül izolálták, egy olyan β láncot mutat, amely a 09 β láncától csak két aminosavban tér el [Nakano, N. és mtsai: T cell receptor V gene usage of isiét β cell-reactive T cells is nőt restricted in non-obese diabetic mice; J.

Exp. Med. 173, 1091 (1991)] . A diabetikus humán T-sejt kiónról is kiderült, hogy hasonló VDJ motívumot tartalmaz [ Durinovic-Bello, I és mtsai: HLA-DQ-restricted, Isletspecific T Cell Clones of a Type I diabetic Patient: T Cell Receptor Sequence Similarities to Insulitis-inducing T-cells of Nonobese Diabetic (NŐD) Mice; I3^th International Immunology and Diabetes Workshop (1994); Durinovic-Bello, I és mtsai: HLA-DQ-restricted, Isletspecific T Cell Clones of a Type I diabetic Patient: T Cell Receptor Sequence Similarities to Insulitis-inducing

T-cells of Nonobese Diabetic (NŐD) Mice, Diabetes 43,

1318-1325 (1994. november)] . Tehát a C9 νΏΗβ kapcsoló régió szekvencia egy közös elemnek tűnik az autoimmun

TCR-ben, amely mind a NŐD egerek és az emberek spontán

- 20diabeteszéhez mind a C57BL/6 egerek indukált diabéteszéhez kötődik.

A NŐD törzs egereiben spontán módon kifejlődik autoimmun inzulitisz körülbelül egyhónapos korban, ami néhány hónappal később nyílt inzulinfüggő diabétesz mellitusszá (IDDM) fejlődik [ Kikutani, H. és mtsai: The murine autoimmune diabetes model: NŐD and related strains; Advances in Immunoi. 51, 285-322 (1992)] . A jelen találmány szerzői felfedezték, és korábban publikálták, hogy az autoimmun IDDM folyamatokat két faktorral lehet befolyásolni: a 60 kDa-os hősokk fehérje (hsp60) p277 peptidje elleni T-sejt immunitással [ Éliás, D. és mtsai: Induction and therapy of autoimmune diabetes in the non-obese-diabetic (NOD/Lt) mouse by a 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 87, 1576-1580 (1990)] , és az anti-idiotípusos T-sejtekkel, amelyek felismerik az antip277 T-sejteket [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)] . A NŐD egerekben a nyílt IDDM-et megelőzi a spontán T-sejt aktivitás a p277 peptiddel szemben, ami megfelel a humán hsp60 szekvencia 437-460-as pozíciójának; a p277-tel reagáló T-sejt kiónok, azaz például a C9 klón képes adoptíven átvinni a hiperglikémiát és a korai inzulitiszt, és a p277 peptiddel magával végzett vakcinálás önmagában képes megakadá-21-

lyozni [ Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)] , vagy éppen visszafordítani az IDDM-et [Éliás, D. és mtsai: Peptide therapy fór diabetes in NŐD mice; Láncét 343, 704 (1994)] . A p277 peptiddel végzett kezelés az anti-p277 immunitás korlátozása jelzi. Tehát a p277 elleni T-sejt immunitás láthatóan funkcionálisan részt vesz a NŐD diabéteszben .

A p277 immunitás funkcióját az egér diabéteszben olyan kísérletekkel terjesztették ki, amelyek azt mutatták, hogy a nem-diabetikus C57BL/6 törzsből származó hím egerekben indukálható az inzulitisz és a hiperglikémia kifejlődése, hordozó fehérjékhez, azaz például OVA-hoz vagy BSA-hoz konjugált p277-tel [Éliás, D. és mtsai: Induction in diabetes in standard mice by immunization to the p277 peptide of hsp60; kísérő dokumentáció (1994)] . Az anti-p277 T-sejtekről kiderült, hogy adoptíven viszik át a diabéteszt a naiv C57BL/6 egerekre.

Ami a NŐD diabétesz C9 anti-p277 T-sejtekre reagáló anti-idiotípusos T-sejtekkel való szabályozását illeti, kiderítettük, hogy ha a C9 kiónt attenuáljuk, akkor arra használható, hogy a NŐD egereket IDDM-mel szemben vakcináljuk [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy

-22of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)] . Mivel a T-sejt vakcinálás szabályozó hatásait a vakcináló T-sejt TCR-jéhez kapcsolják [Lider, 0. és mtsai: Anti-idiotypic network induced by T cell vaccination against experimental autoimmune encephalomyelitis; Science 239, 181 (1988); Zhang, J. és mtsai: MHC-restricted depletion of humán myelin basic protein-reactive T cells by T cell vaccination; Science 261, 1451 (1993)] , ezért a jelen találmányhoz vezető vizsgálatokat a prototípus anti-p277 C9 T-sejtklón TCR-jére irányítottuk, hogy meghatározzuk a- és β-láncainak szekvenciáját, és hogy vizsgáljuk a C9

TCR eloszlását a NŐD egerek különböző T-sejt populációiban. A C9 TCR β-lánc jellemző VDJ szekvenciáját is vizsgáltuk a p277-re reagáló C57BL/6 egerek T-sejtjeiben, és más, publikált TCR szekvenciákkal hasonlítottuk össze.

Ezek a vizsgálatok a C9 TCR β-lánc VDJ szekvenciája meghatározásához vezettek (1. számú szekvencia). Meghatároztuk, hogy a nonapeptid, beleértve a V szegmens három C-terminális aminosavát, a D szegmens három csoportját és a J szegmens három N-terminális aminosavát (az 1. számú szekvencia 47-55-ös csoportjai), a C9 ΤΟΗβ lánc immunogén részét képezi. Erről a pepiidről kimutattuk, hogy a NŐD egér modellben a diabétesz lényeges korlátozását okozza. Emellett felhasználható az IDDM korai diagnosztizálására is, valamint az IDDM p277-tel való kezelésének monitorozására.

-23Számos egyéb kiónnak vizsgáltuk a VDJ régióját, amely kiónok szintén felismerték a humán hsp60 p277 peptidjét. Ezek a kiónok is diabetogének voltak, és a NŐD egereket vakcinálni lehetett a diabétesz kifejlődésével szemben. Ezekről kiderült, hogy ugyanazzal a VDJ szekvenciával rendelkeznek, mint amit a C9-re meghatároztunk. Egy másik sejtvonal, az N4 vonal, amely se nem diabetogén, se nem vakcinái diabétesszel szemben, olyan szekvenciával rendelkezik, amely eltér a CD9 peptid szekvenciájától. Az eltérés lényege az, hogy a D régió 3 peptidjéből kettő tér el (Leu-Trp-Thr a Leu-Gly-Gly-vel szemben).

Nemrég publikálták egy másik NŐD klón, a 4-1-E.2 VDJ szekvenciáját [ Nakano, N. és mtsai: T cell receptor V gene usage of isiét β cell-reactive T cells is nőt restricted in non-obese diabetic mice; J. Exp. Med. 173, 1091 (1991)], amely klónról leírták, hogy átviszi az inzulitiszt diabetesz-mentes 1-E⁺ transzgenikus NŐD egerekbe. Tehát feltételezhető, hogy ennek a kiónnak a ΤΟΚβ lánca VDJ régiója szintén képes lesz aktiválni azokat a T-sejteket, amelyek felismerik az autoimmun Tsejteket. Az erre a TCR$ láncra leírt szekvenciából hiányzik egy szerin a V-szegmens C-terminálisáról, ugyanazt a tripeptidet tartalmazza a J-szegmens N-terminálisán, és D-szegmensként az Arg-Leu-Gly tripeptidet tartalmazza. Tehát ebben a szekvenciában ugyanaz a Leu-Gly dipeptid található a C9 ΤΟϊ<β D-szegmensben, és a V-szegmens C-ter-

- 24minálisán ugyanaz az Ala-Ser dipeptid található mint a C9 TCRP láncban.

A diabetikus C57BL/6 egerek szplenocitáiból származó anti-p277 T-sejtvonal VDJ régióját is tanulmányoztuk, annak a ténynek a fényében, hogy ezek a sejtvonalak képesek adoptíven átvinni az inzulitiszt és a hiperglikémiát. Amint az a 3. táblázatban látható, a V-szegmens C-terminálisa és a J-szegmens N-terminálisa ugyanaz mint a C9ben, míg a D-szegmens szekvenciája Leu-Gly-Leu-Gly-Ala (a 4. számú szekvencia 4-8-as csoportjai). Mivel ez a klón felismeri az autoimmun T-sejteket, ezért az várható, hogy a 4. számú szekvenciának megfelelő peptid ugyanúgy használható mint az 1. számú szekvencia 47-55-ös csoportjai.

Emellett, mivel a Leu-Gly dipeptid ismétlődik, ezért azt tételezzük fel, hogy egy megszintetizált Leu-Gly-Ala Dszegmens ugyanúgy fog működni, mint a C9 szekvencia, amelyben a D-szegmens Leu-Gly-Gly. Tehát a 16. számú szekvencia nonapeptidje is működőképes a jelen találmány szerint.

Annak fényében, hogy a diabetogénnek ismert kiónok VDJ szekvenciájára milyen szekvenciát határoztunk meg, azokkal a kiónokkal szemben, amelyek nem diabetogének, a jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja egy olyan peptid, amely minimum hét aminosavat tartalmaz a V-D-J képletben, amiben V jelentése az A-S dipeptid, D jelentése az L-G dipeptid szekvencia és J jelentése az N-Q-D tripeptid szekvencia. A D régió előnyösen 2-5

aminosavat tartalmaz. Az A-S dipeptidet tartalmazó Vszegmens tripeptid közvetlen szomszédja a D-szegmensnek, és a J Q-D tripeptidje közvetlen szomszédja a Dszegmensnek.

A jelen találmány szerinti peptid maximum körülbelül 24 aminosavat tartalmaz. A V-szegmens bármilyen további aminosava előnyösen megfelel a V_p12 génszegmens szekvenciájának [ Behlke és mtsai: Alternative Splicing of Murine T-cell Receptor β-chain ’ Transcripts; Natúré 322,

379-382 (1984)] , és a J-szegmensben bármely hozzáadott peptid megfelel a J_p2.5 szegmensnek [ Mallssen és mtsai:

Mouse T Cell Antigén Receptor: Structure and Organization of Constant and Joining Gene Segments Encoding the β Polypeptide; Cell 37, 1101-1110 (1984)] .

Az előzőkben megtárgyalt előnyös peptidcsoportok mellett azokat a szekvenciákat, amelyek lényegében megfelelnek ezeknek, de amelyekből egy vagy több aminosavat kivágtunk, hozzáadtunk vagy egy másik aminosavval helyettesítettünk, szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartozónak tekintünk, mindaddig, amíg megvan az a képességük, hogy immunológiai keresztreakciót adjanak az eredeti pepiiddel, azaz az általuk aktivált T-sejtek felismerik és korlátozzák az autoimmun anti-p277 Tsej teket.

Ahhoz hogy lényegében megfeleljünk egy ilyen pepiidnek, bármelyik jelen találmány szerinti peptid szekvenciájában a változásnak viszonylag minimálisnak kell lennie.

• · ··· ·

-26Tehát a jelen találmányban ismertetett peptideknek lényegében megfelelő peptidek könnyen megszintetizálhatók és vizsgálható a megfelelő biológiai aktivitásuk. A diabétesz korlátozására alkalmas vakcinaként való működésre képes biológiai aktivitás szűrővizsgálatára legmegfelelőbb kísérlet az, ha a konstrukciót NŐD egerek vakcinálására használjuk és meghatározzuk, hogy az ilyen vakcinálás hatékonyan gátolja-e a betegséget az ismertetett módon, a 7. ábrán bemutatott kísérleti eredményeknek megfelelően. Annak a ténynek a fényében, hogy a kritikus régió viszonylag rövid, nincs szükség fölösleges kísérletezésre ahhoz, hogy minor helyettesítéseket, hozzáadásokat és deléciókat végezzünk, majd megvizsgáljuk a terméket, hogy a megfelelő biológiai aktivitással rendelkezik-e, főleg a 3. táblázatban levő motívum-információ fényében.

Az itt ismertetett peptidek mellett azok olyan sói és funkcionális származékai is használhatók, amelyek képesek immunológiai keresztreakciót adni az említett peptidekkel.

A továbbiakban a sók szakkifejezés jelentése a fehér j emolekulának mind a karboxicsoport sóit, mind az aminocsoport savaddíciós sóit jelenti. A karboxicsoport sóit a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel állíthatjuk elő. Ide tartoznak a szervetlen sók, azaz például a nátrium-, kalcium-, ammónium-, vasvagy cinksók és hasonlók, valamint a szerves bázisokkal, azaz például az aminokkal, úgymint a trietanolaminnal,

-π argininnel vagy lizinnel, piperidinnel, prokainnal és hasonlókkal képezett sók. A savaddíciós sók közé tartoznak például az ásványi savakkal, azaz például a sósavval vagy kénsavval képezett sók, valamint a szerves savakkal, azaz például az ecetsavval vagy oxálsavval képezett sók.

A funkcionális származékok szakkifejezés jelentése a továbbiakban olyan származékok, amelyek vagy az aminosav oldalláncokon, vagy az N-terminális vagy C-terminális csoportokon előforduló funkciós csoportokból állíthatók elő, a szakterületen ismert módszerekkel, mindaddig, amíg gyógyászatilag elfogadhatók maradnak azaz nem rontják el a fehérje aktivitását, nem okozzák toxikus tulajdonságok kialakulását a készítményekben és nem érintik előnytelenül a készítmények antigén tulajdonságait.

Ezek közé a származékok közé tartoznak például a karboxilcsoportok alifás észterei, a karboxicsoport ammóniával vagy primer- illetve szekunder aminnal való reakcióban előállított amidjai, az acil-egységekkel képezett aminosavcsoportok szabad aminocsoportjai N-acil származékai (azaz például alkanoil- vagy karbociklusos aroilcsoportok), vagy a szabad hidroxicsoport acil-egységekkel képezett O-acil származékai (például a szeril- vagy treonilcsoportoké).

A peptideknek a jelen találmány szerinti alkalmazása a vakcinaként való alkalmazás IDDM és kezdődő IDDM kezelésére. Ha egy megfelelő immunogén adjuvánssal, azaz például olajjal együtt adjuk be, immunogén válasz keltése

- 28céljából olyan T-sejtek keletkezése váltható ki, amelyek képesek korlátozni az autoimmun anti-p277 T-sejteket. Ha a betegről kimutatták, hogy már az IDDM kezdődő, klinikai tünetek nélküli állapotában van, akkor a jelen találmány szerinti szerinti peptid injekciózásával az autoimmunitás korlátozását okozhatjuk, és ezáltal leállíthatjuk az autoimmun folyamatot, mielőtt jelentős károkat okozna. A jelen találmány szerinti peptiddel végzett vakcinálás használható terápiás ágensként is, arra a célra, hogy leállítsuk az autoimmun folyamatot még akkor is, ha túlzottan előrehaladt, amint azt a jelen találmány szerzőinek laboratóriumában kimutatták, NŐD egerek p277 peptiddel való kezelésével kapcsolatban [Éliás, D. és mtsai: Peptide therapy fór diabetes in NŐD mice; Láncét 343,

704 (1994)] .

A jelen találmány tárgya az IDDM megelőzésére vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény, amely tartalmaz egy gyógyászatilag elfogadható hordozót, valamint aktív adalékanyagként egy, a jelen találmány szerinti peptidet, annak sóját vagy funkcionális származékát. A gyógyászatilag elfogadható hordozó előnyösen egy olaj, azaz például például ásványolaj amulzió, amit inkomplett Freund féle adjuvánsként (IFA) ismernek. Azonban az IFA, valamint a komplett Freund féle adjuváns (CFA; ásványolaj készítmény, amely különböző mennyiségű elpusztított Mycobactérium-ot tartalmaz) nem alkalmas embereknek való beadásra, mivel az ásványolaj nem metabolizálható és a • ·

-29szervezet nem bontja le. Nemrég derült ki, hogy bizonyos zsíremulziók, amit sok éve használnak humán páciensek intravénás táplálására, szintén használhatók hordozóként a peptid-terápiában, a jelen találmány szerinti peptideket alkalmazva. Ilyen emulzió például a kereskedelmi forgalomban levő Intralipid és Lipofundin zsíremulzió. Az Intralipid a Kabi Pharmacia (Svédország) regisztrált márkavédjegye a 3,169,094 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésben leírt, intravénás táplálásra alkalmazott zsíremulzióra. A Lipofundin a B.Braun Melsungen (Németország) regisztrált márkavédjegye. Mindkettő szójaolajat tartalmaz zsírként (100 vagy 200 g 1000 ml desztillált vízben: 10 illetve 20%). Tojássárgája foszfolipideket használnak emulgeálószerként az Intralipidben (12 g/1 desztillált víz) és tojássárgája lecitint használnak a Lipofundinban (12 g/1 desztillált víz) . Az izotonicitást mind az Intralipid mind a Lipofundin esetében 25 g/1 glicerin hozzáadásával biztosít j ák.

Amellett, hogy a jelen találmány szerinti peptideket közvetlenül beadható vakcinaként alkalmazzák, a jelen találmány szerinti peptidek használhatók arra is, hogy egy IDDM-ben vagy kezdődő IDDM-ben szenvedő beteg autológ T-sejtjeit aktiváljuk. Tehát az autológ T-sejtek kinyerhetők a kezelendő betegből, előnyösen a perifériális vérből elválasztva. Az ilyen T-sejteket azután egy, a jelen találmány szerinti pepiiddel való in vitro érint- 30-

keztéssel aktiváljuk, olyan módszerekkel, amelyek jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára. Az ilyen specifikus és aktivált T-sejteket azután ugyanannak a betegnek adjuk be, amelyikből eredetileg származnak, azzal a céllal, hogy leszabályozzuk az autoimmun Tsej teket.

A jelen találmány tárgya továbbá az ilyen specifikus és aktivált T-sejtek készítménye. Az ilyen T-sejtek beadása passzív immunizációt biztosít az autoimmun T-sejtekkel szemben, ezzel korlátozva az autoimmun folyamatot. Nem szükséges, hogy az IDDM teljes gyógyulását elérjük, ahhoz, hogy a módszer a jelen találmány jól használható legyen. Mindaddig, amíg az autoimmun folyamat bizonyos korlátozását elérjük, a jelen találmány szerinti terápiás készítmények és módszerek gyakorlati jelentőséggel bírnak .

A jelen találmány szerinti peptidek jól használhatók továbbá a diabétesz korai diagnosztizálására, előnyösen a klinikai tünetek megjelenése előtti állapotban, vagy röviddel a klinikai diagnózis után, valamint a betegség megállítására és az IDDM immunológiai kezelése folyamatának követésére, és főleg a p277 kezelésre. A kérdéses beteg szérumában olyan T-sejtek találhatók, amelyek szaporodnak vagy más módon fejtik ki immunológiai funkciójukat, azaz például citokineket expresszálnak a jelen találmány szerinti pepiiddel való érintkezés hatására, ez a jele a betegség meglétének. Amint az a 4. ábráról

- 31 ·· · ·· · ·» • · · · • · · «> · · · ·· · látható, az anti-idiotípusos ellenanyagok a betegség korai fázisában vannak jelen a legnagyobb mennyiségben. Emellett egy beteg ilyen T-sejtjei számának mennyiségi vagy fél-mennyiségi elemzése korrelál a korlátozási kezelés hatékonyságával. Minél nagyobb ezeknek a T-sejteknek a mennyisége, annál jobb a kezelés menete. Tehát ha ezeknek az ellenanyagoknak a mennyisége időben nő, akkor hatékony a kezelés. Ha a számuk csökken, akkor a kezelés nem hatékony és módosítani kell, hogy megpróbáljuk fokozni az ilyan T-sejtek mennyiségét.

Ennek megfelelően a jelen találmány tárgyát képezik továbbá az IDDM diagnosztizálására és leállítására, valamint a kezelés menetének követésére szolgáló módszerek.

Példa

Anyagok és Módszerek

Állatok

NOD/L: az egereket saját állatházunkban neveljük a Weizmann Institute of Science-ben. A tenyészállomány Dr. E.H. Leiter ajándéka. A C57BL/6 és BALB/c egereket a Jackson Laboratories-tól szereztük be (Bar Harbor, ME,

USA) .

Antigének

Az OVA-t a Sigma Chemical Co.-tól szerezetük be (St. Louis, MO, USA) . A rekombináns humán hsp60-t Dr. Ruurd van dér Zee-től kaptuk (University of Utrecht). A

VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED p277 szintetikus peptidet (5.

számú szekvencia) Fmoc kémiával szintetizáltuk meg, HPLC oszlopon tisztítottuk fordított fázisú kromatográfiával, CM12 oszlopot használva (Merck, FRO) . A szekvenciát aminosav elemzéssel igazoltuk. A p277 peptidet OVA-hoz konjugáltuk l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimiddel (EDC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), a szakirodalomban ismertetett módszerrel [ Bauminger, S. és mtsai: The use of carbodiimides in the preparation of immunizing conjugates; Methods in Enzymology 70, 151 (1980)] .

Immunizáció

6-8 hetes C57BL/6 hím egereket szubkután injekciózunk 50 pg, IFA-ban emulgeált p277-OVA konjugátummal (Difco, Detroit, MI, USA), összesen 0,2 ml térfogatban. A egereket az immunizálás után 2, 3 és 4 héttel kivéreztetjük, majd a vér cukortartalmát Beckman Glucose Analyzer II-vel határozzuk meg (Beckman, Palo Alto, CA, USA). Akkor állapítunk meg hiperglikémiát, ha a plazma glükózkoncentrációja nagyobb mint 11,1 mmol/1, 10 órakor, éheztetés közben mérve. Ezt a glükózkoncentrációt választottuk a hiperglikémia határának, mivel 3 SD-vel nagyobb, mint 200 kezeletlen, nem-diabeteszes egérben mért plazma glükózkoncentráció átlaga [Éliás, D. és mtsai: Induction in diabetes in standard mice by immunization to the p277 peptide of hsp60; kísérő dokumentáció (1994)] . Egy NŐD anti-OVA T-sejt kiónt Dr. Anne Cooke bocsájtott rendelkezésünkre (Cambridge,

-33Anglia). Az anti-p277 és anti-OVA T-sejtvonalakat C57BL/6 egerek kiürülő nyirokmirigyeiből állítjuk elő, kilenc nappal az immunizálás után, a szakirodalomban közölt leírás szerint [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)] . Kimutattuk, hogy a hiperglikémiát adoptíven átvihetjük NŐD egerek C9 és egyéb anti-p277 T-sejt kiónjaival [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)], valamint C57BL/6 egerek anti-p277 T-sejtvonalakkal [Éliás, D. és mtsai: Induction in diabetes in standard mice by immunization to the p277 peptide of hsp60 ;

kísérő dokumentáció (1994)] .

RNS és cDNS készítmények

Sejtvonalak p277-es inkubálással a leírás szerint végzett háromnapos aktiválás után [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)] a T-sejt blasztokat összegyűjtjük, majd egy Ficoll gradiensen elválasztjuk a sejttörmeléktől és a kísérő sejtektől, mossuk PBS-ben és még 2 napig tenyészt< ·

- 34jük a leírás szerint 10% T-sejt növekedési faktort tartalmazó közegben [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)] , hogy biztosítsuk azt, hogy a tenyészetek csak élő Tsejteket tartalmaznak. A T-sejteket azután összegyűjtjük, PBS-ben mossuk és gyorsan lefagyasztjuk folyékony nitrogénben. Mindegyik mintát homogenizáljuk, majd az össz-RNS-t RNAzol kittel kivonjuk (Cinna/Biotecx, Friendswood TX, USA). Az össz-RNS-ből körülbelül 5 pg-ot átírunk első cDNS szállá cDNS ciklus kit 20 μΐ-es reakcióelegyében (Invitrogen, San Diego CA, USA), primerként oligo dT-t használva.

Lép és csecsemőmirigy

NOD/L nőstény és hím egerekből, valamint C57BL/6 hím egerekből eltávolítjuk a lépeket és a csecsemőmirigyet, majd azonnal lefagyasztjuk folyékony nitrogénben. Az RNSt és a cDNS-t az előzőek szerint állítjuk elő.

Hasnyálmirigy szigetsejtek

A hasnyálmirigy szigetsejteket nőstény NŐD egerekből izoláljuk Gotoh módszerével [Gotoh, M. és mtsai: Reproducible high yield of rat islets by stationary in vitro digestion following pancreatic ductal or portai venous collagenase digestion; Transplantation 43, 725- 35730 (1987)] . Röviden, kollagenázt injekciózunk az epevezetékbe, a vezetéket azután lezárjuk és a hasnyálmirigyet kivágjuk. A kollagenázos emésztést vízfürdős rázóberendezésben végezzük 30-45 percig, 37 °C-on, majd a szövetet alaposan mossuk PBS-ben. A szigetsejteket kézzel szedjük ki az emésztményből, boncoló mikroszkópot használva, majd folyékony nitrogénben lefagyasztjuk. Az RNS-t és a DNS-t az előzőkben ismertetett módon állítjuk elő.

PCR amplifikálás

Vfi panel

A cDNS készítményből három μΐ-t teszünk egy reakcióelegybe, amely tartalmaz PCR puffért, 1 μπιοί dNTP elegyet, 1 μιηοΐ Cp prímért (Operon Technologies, Alameda, CA, USA) és 2 E/ml Taq polimerázt (USB, Cleveland, OH, USA) . Ezt az elegyet osztjuk szét 19 reakcióedénybe, mindegyik különböző νβ-specifikus oligonukleotid prímért tartalmaz, amiket az Operon Technologies-től szereztünk be (Alameda, CA, USA). A primer végkoncentrációja 1 μιηοΐ/ΐ. Az amplifikálást egy PCR berendezésben végezzük (Perkin Elmer) 30 ciklusban. A ciklus profilja a következő: denaturálás 60 mp, 94 °C; illesztés 60 mp 55 °C; hosszabbítás 60 mp 72 °C. Mindegyik amplifikációs reakcióelegyből nyolc μΐ-t elektroforézisnek vetünk alá

2%-os agaróz gélen (FMC, Rockland ME, USA), etídium-bromiddal festjük (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA),

• ·· · majd UV-fénnyel tesszük láthatóvá. Gélben való hibridizálást hajtunk végre [ Scahfer, R. és mtsai: Optimizing oligonucleotide probes fór DNA fingerprinting; Electrophoresis _9' 369 (1988)] egy óra hosszat, 0,5 pmol/ml, Οβ-ra specifikus P jelölt oligonukleotiddal. Az amplifikált termékeket közvetlenül szekvenáljuk, Casanova és munkatársai leírása szerint, a Sequenase version II kit (USB) alkalmazásával [Casanova, J.-L. és mtsai: Optimál conditions fór directly sequencing doublestranded PCR products with Sequenase; Nucleic Acids Research 18, 4028 (1990)] .

C9 VDJÜ-specifikus oligonukleotid

A C9 VD^-specifikus és egyéb oligonukleotidokat a

Hadah Hospital, Department of Molecular Biology and Genetic Engineering-nél szintetizálták (Mount- Scopus, Jeruzsálem, Izrael). A C9 νϋύβ-ερεοίίikus oligonukleotid a következő: 5'-TTAGGGGGTAACCAAGAC-3' (a 6. számú szekvencia 10-27-es bázisai). Mindegyik vizsgált cDNS mintából egy μΐ-t teszünk a C9 VDjp oligonukleotidot és a Οβ oligonukleotid prímért tartalmazó reakcióelegybe, majd az előzőek szerint elemezzük. Nagyobb specifitást érünk el, ha az illeszkedési hőmérsékletet 65 °C-ra növeljük. Egy ³P-jelölt C9 νϋύβ-ερεοίίikus oligonukleotidot használunk próbaként a gélben végzett hibridizáláshoz, egy PCR-rel amplifikált νβ panelt használva a leírás szerint ·· · ·

- 37[ Scahfer, R. és mtsai: Optimizing oligonucleotide probes fór DNA fingerprinting; Electrophoresis 9, 369 (1988)] .

C9 Vg, amplifikálás

A C9 cDNS első szál preparátumból 5 μΐ-t farkazunk dGTP-vel, 100 mmol/1 dGTP-t valamint terminális transzferázt alkalmazva a gyártó által ajánlott körülmények között (Boehringer Mannheim, FRG), 50 μΐ össztérfogatban, percig. A farkazó reakcióelegyből 10 μΐ-t teszünk egy rögzített PCR reakcióelegybe [ Acha-Orbea, H. és mtsai: Limited heterogeneity of T cell receptors from Lymphocytes mediating autoimmune encephalomyelitis allows specific immuné intervention; Cell 54, 263-273 (1988)] .

Az első PCR Ca oligonukleotid primer (Cal) szekvenciája a következő: 5' -TGGCGTTGGTCTCTTTGAAG-3' (7. számú szekvencia) , a második PCR amplifikációban használt hálós oligonukleotid primer (Ca2) szekvenciája a következő: 5'CGGCACATTGATTTGGGAGTC-3' (8. számú szekvencia). Az amplifikáció termékét a Ca3 oligonukleotid próbával mutatjuk ki: 5' -ACACAGCAGGTTCTGGTTC-3' (9. számú szekvencia), ami pBluescript SK+ plazmádba van klónozva (Stratagene), és a Sequenase™ Version II kit felhasználói kézikönyvében ismertetett módszerrel szekvenáljuk.

C9 VJfic-specifikus nukleotid

- 38• ·· ·· ···· · • · · ·· · · · • · · · · ·

Megszintetizálunk egy 5' -ATGAGAGGGCCTAATTAC-3' szekvenciájú (10. számú szekvencia) C9 VJa-specifikus oligonukleotidot, amit azután a Ca.2 primerrel együtt különböző vonalak PCR amplifikálására használunk a C9 VDJP amplifikálására leírt módon.

Eredmények

A C9 TCR nukleotid szekvenciája

A C9 TCR a és β nukleotid szekvenciájának meghatározására cDNS-t készítünk a C9 kiónból extrahált mRNSből. A PCR amplifikálást egy Cβ konstans régió oligonukleotid primerrel végezzük, valamint egyenként a 20 νβspecifikus oligonukleotid primerrel.

A 19 különböző νβ amplifikációs reakcióból csak a νβ2 és a νβ12 amplifikációs termékek voltak láthatók (1.

ábra). Mindkét PCR termék közvetlen szekvenálása után a \^2-ről kiderült, hogy nem jó (nincs a leolvasási keretben) . Ezzel szemben, a νβ12 benne van a leolvasási keretben, és emiatt adott jelet (1. táblázat).

Az α-lánc V-régiójának nagyobb száma és variabilitása egy hasonló panel-megközelítést működésképtelenné tenne. Ezért az α-lánc szekvenálására egy rögzített PCR-t használtunk, dGTP farkazott cDNS-sel, hálózatos konstans régió oligonukleotid primereket alkalmazva. A C9 VJa szekvenciájáról kiderült, hogy az MRGPNW (11. számú szék• · • ·

- 39vencia), a Va BMB-volt [Sherman, D.H. és mtsai:

Molecular analysis of antigén recognition by insulinspecific T-cell hibridomas from B6 wild-type and bml2 mutant mice; Mól. Cell. Biology Ί_, 1865 (1987)] , a Ja 16 volt [ Koop, B.F. és mtsai: Organization, structure and function of 95 kb of DNA Spanning the murine T-cell receptor Ca/Cs region; Genetics 13, 1209 (1992)] .

TCR alkalmazás egyéb NŐD T-sejtvonalakban

Tanulmányoztunk egyéb, ugyanabból a NŐD limfocita pool-ból származó T-sejt vonalakat, mint amelyekből a C9 klón származik. A C7, NI és N26 vonalak, amelyek felismerik a humán hsp60 p277 peptidjét, diabetogének voltak és NŐD egereket lehetett valük vakcinálni kifejlődő diabétesszel szemben [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with. a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)] . Vizsgáltuk az N4 vonalat is, amely reagál a Mycobacterium tuberculosis hsp65 fehérjével, de nem reagál a humán hsp60 fehérjével, és se nem diabetogén, se nem lehet vele vakcinázni diabétesszel szemben [ Éliás, D.

és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a

T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88,

3088-3091 (1991)] . Tehát ez egy független OVA-vonal.

Mivel az a és β TCR láncok CDR3 régiói mind hozzájárulnak egy idiotípushoz, ezért specifikus oligonukleotid próbákat készítettünk a 09 klón VJa és VD^ régiói alapján. Az a konstans régió és a VJa oligonukleotid primerek felhasználásával csak az anti-p277 T-sejt vonallal szemben kaptunk PCR amplifikációt. A β-lánc konstans régió és a νϋΟβ oligonukleotid primerek PCR amplifikálást eredményeztek mindegyik anti-p277 T-sejt vonalnál. Azonban kimutatható egy gyenge amplifikációs csík az N4 vonalnál is (2. ábra, 3. sáv) . A NŐD vagy C57BL/6 egerekből előállított anti-OVA vonalak negatívak voltak (2. ábra, 4. és 10. sáv).

A további elemzéshez 19 νβ-specifikus és a β-lánc konstans régió oligonukleotid primerjének paneljét használjuk PCR amplifikálás céljára. Az összes általunk talált NŐD anti-p277 T-sejt vonalban találtunk többek között egy νβ12 amplifikációt, amit szekvenáltunk és azonosnak találtunk a C9 νβ-val. Az N4 sejtvonalból származó cDNS amplifikálásával egyebek között kaptunk egy νβΐΐ PCR terméket is. A termék szekvenálásával kiderült, hogy van egy olyan νοοβ régiója, amely hasonlít a C9 νοοβ-Γβ, egy 3 bázispáros eltérés kivételével, amint az az 1. táblázatban látható. Meg kell jegyeznünk, hogy a C9 és az N4 nagyon hasonló VDJ szekvenciái két különböző νβ gén átrendezési termékei. A C9 és az N4 VDJ szekven• ·· ·

-41 ciájában megfigyelhető minimális különbség erősen eltérő PCR amplifikálásokból származott (2. ábra), igazolva ezzel a PCR primer használhatóságát a C9 idiotóp és az azzal rokon szekvenciák szűrővizsgálatában.

Az 1. táblázatban látható egy NŐD klón VDJ szekvenciája β lánca is, a 4-1-E.2, amit Nakano és munkatársai publikáltak [Nakano, N. és mtsai: T cell receptor V gene usage of isiét β cell-reactive T cells is nőt restricted in non-obese diabetic mice; J. Exp. Med. 173, 1091 (1991)] . Erről a kiónról leírták, hogy az inzulitiszt átviszi diabetesz-mentes 1-E⁺ transzgenikus NŐD egerekbe. Azonban nem írták le a specifikus antigénjét. Meg kell jegyeznünk, hogy a 4-1-E.2, a C9-hez hasonlóan, expresszálja a νβ12 ύβ2.5 géneket, és a VDJ szekvenciája hasonlít a C9-ére: C9-ASSLGGNQD (az 1. számú szekvencia

47-55-ös csoportjai); 4-1-E.2-ASRLGNQD (3. számú szekvencia) .

A C9 VDJfi és a VJfic szekvenciák eloszlása a NŐD szövetekben

A mi NŐD tenyészetünkben az inzulitisz először egyhónapos korban jelentkezik. Az inzulitisz intenzitása fokozódik, és az inzulintermelő sejtek elroncsolódnak. A nőstény egerekben körülbelül háromhónapos korban kezdődik el a nyílt hiperglikémia kifejlődése, és lényegében hathónapos korára mindegyik nőstény egér klinikailag beteg és meghal, hacsak nem kap inzulinkezelést. A hím egerek• ·· ·

-42nél az inzulitisz kifejlődésében késés mutatkozik, és csak 50%-ukban fejlődik ki nyílt DDM. Annak megvizsgálására, hogy a C9 VDJp átrendeződés korrelál-e az autoimmun betegség kifejlődésével, cDNS-t készítünk 0,5, 1, 2, 3 és 4 hónapos NŐD egerek lépjeiből és csecsemőmirigyeiből, mindegyik korcsoportban 5 egér szerveit egyesítjük. Egyés kéthónapos NŐD nőstények szigetsejteit vizsgáljuk. A cDNS mintákat PCR-rel amplifikáljuk, a VDjp vagy VJa primerekkel és a megfelelő konstans régió primerrel. Mindegyik VJa-val mint primerrel végzett reakció negatív volt; de a VDjp-val mint primerrel végzett PCR amplifikálást eredményezett mind a nőstény mind a hím egereknél. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze. A csecsemőmirigy készítmények mindegyik korban pozitívak, mind a nőstényeknél, mind a hímeknél. A lépekben a C9 átrendeződés nyilvánvaló a nőstényeknél egyhónapos kortól, a hímeknél kéthónapos kortól. A VDjp-t a gyulladásos szigetsejtekben is ki lehetett mutatni. Tehát úgy tűnik, hogy a C9 VDJP próba az egyes NŐD egerekben egyformán meglevő idiotípust mutat ki. Úgy tűnik, hogy a C9 VDjpspecifikus jel progressziója a csecsemőmirigyből a lépbe és a szigetsejtekbe korrelál a kóros folyamat kifejlődésével .

TCR β alkalmazása a C57BL/6 anti-p277 T-sejt vonalakban • · · ···

-43Mivel a p277 szerepet játszik a NŐD egér diabéteszben, ezért megvizsgáltuk, hogy az ezzel a peptiddel szemben végzett immunizáció indukál-e betegséget azokban az egerekben, amelyek nem hajlamosak a diabéteszre, és azt találtuk, hogy egy fehérje hordozóhoz konjugált p277 képes hiperglikémiát, inzulitiszt és inzulin auto-ellenanyagokat indukálni C57BL/6 egerekben [Éliás, D. és mtsai: Induction in diabetes in standard mice by immunization to the p277 peptide of hsp60; kísérő dokumentáció (1994)] . Ezért létrehoztunk p277/OVA-val immunizált diabeteszes C57BL/6 egerek szplenocitáiból származó antip277 T-sejt vonalakat. A vonalakat mikrotiter lukakban szaporítottuk, és ismételten ingereltük p277-tel, besugárzott autológ szplenociták jelenlétében. A kapott Tsejt vonalak képesek voltak adoptíven átvinni az inzulitiszt és a hiperglikémiát, míg a kontroll anti-OVA Tsejt vonalak erre nem voltak képesek [Éliás, D. és mtsai: Induction in diabetes in standard mice by immunization to the p277 peptide of hsp60; kísérő dokumentáció (1994)] .

Vizsgáltuk az anti-p277 vonalak νβ használatát p277tel végzett 1, 2, 5 és 6 ingerlés után. Az egyes ingerlések után néhány lukból származó mintát egyesítünk elemzés és további tenyésztés céljából. Amint az előzőkben ismertettük, cDNS-t készítettünk és ezt használtuk a νβ panel amplifikálására. Az első két serkentéssel gyakorlatilag mindegyik νβ primerrel kaptunk amplifikálást. Két minta ·· ···· • · • · · « ·· · φ ··· ·· ·· · ····

-44az ötödik ingerlés után korlátozottabb νβ használatot mutatott: 1, 2, 6, 7, 9 és 19 az egyiknél, és 1, 14, 15, 16 és 18 a másiknál. A hatodik ingerlés után egy korlátozott amplif ikációs tömböt kaptunk: 3, 5, 7, 8 és 11. Tehát egyik νβ sem kapcsolódott a p277 felismeréshez.

PCR amplifikálást végzünk a C9 VDJB és a Οβ régió oligonukleotid primerekkel, a különböző ingerlésekből származó cDNS mintákkal. A 2. ábrán az első ingerlést kivéve mindegyik ingerlésnél látható pozitív amplifikáció (5. sáv). Annak kiderítésére, hogy a νβ amplifikációk tartalmazzák-e a C9-szerű VDJB átrendeződést, a második és hatodik ingerlés PCR paneljeit a C9 VDJB oligonukleotid próbához hibridizáljuk. Amint az a 3A. ábráról látható, a νβ6, 8, 11 és 16 hibridizált a próbával a második ingerlésnél, de a hatodik ingerlésnél (3B. ábra) csak a νβ8 és 11 volt pozitív. A második ingerlésből származó νβ6 amplifikációs terméket klónoztuk, és VDJ szekvenciájáról kiderítettük, hogy több hasonlósága van a C9 VDJB~ val (1. táblázat). Kaptunk még további hat, de a VDJB szekvenciákkal rokonságban nem levő szekvenciát (nem mutatjuk). Átvizsgáltuk kéthónapos hím C57BL/6 és BALB/c egerek csecsemőmirigy- és lépsejtjeit, a C9 VDJB oligonukleotid primer alkalmazásával. A C57BL/6 csecsemőmirigyek és lépek is pozitívak voltak. A BALB/c egerekben azonban csak a csecsemőmirigyek voltak pozitívak.

-45A VDJ PCR próba validálása

Ebben a vizsgálatban a diabetogén NŐD klón C9 TCR a és β láncait kódoló RNS szekvenciáját meghatározzuk, és

VJa valamint νόβ próbákat használunk azoknak a TCR szekvenciáknak a kimutatására, amelyek a különböző T-sejt populációkban levő C9-ekével rokonok. A C9 νϋύβ primer specifitását azzal igazoljuk, hogy ezt az oligonukleotidot a β-lánc νβ-val és Οβ-val való PCR amplifikálásával kapott termékkel hibridizáltatjuk. A C9 VDJβ oligonukleotiddal mint primerrel kapott PCR megbízhatóságát azzal igazoljuk, hogy mindegyik érintett célpont TCR szekvenciáit megvizsgáljuk: az N4 klón, amiben egy három bázispárra (2 aminosavra) kiterjedő eltérés van a C9 νϋύβ primertől, csak egy gyenge PCR terméket eredményezett (2. ábra), míg a C57BL/6 anti-p277 vonal, amely egy olyan kiónt tartalmaz, amelyben szintén egy 3 bázispárra terjedő eltérés található (1. táblázat), sokkal erősebb PCR jelet ad. Azonban a B6 kiónban levő 3 nem-homológ nukleotid közelebb van a C9 primer szekvencia 5' végéhez mint az N4 VDJβ 3 bázispárnyi nem-homológ nukleotidja, ami valószínűleg azt eredményezi, hogy szigorú körülmények között sokkal hatékonyabb amplifikálást kapunk. Tehát levonhatjuk azt a következtetést, hogy a mi C9 VDJβ-nk ésszerű próba olyan szekvenciák kimutatására, amelyek jól megközelítik a C9 szekvenciát.

-46A TCR α és β láncai CDR3 szegmenseit (VJa és VDJP) a

Va és νβ gének. 3' végének a Ja és DJβ gének 5' végével való, láthatóan véletlenszerű rekombinációja hozta létre.

A véletlenszerűséget tovább fokozzák az N inszerciók, olyan nukleotidok, amelyeket nem genetikai templát irányít [Epplen, J.T. és mtsai: Mammalian T-lymphocyte antigén receptor genes: genetic and nongenetic potential to generate variability; Hűm. Génét. 75, 300-310 (1987)] . A CDR3 szekvenciák gyakorlatilag korlátlan potenciális variabilitása a T-sejt repertoár diverzitását hozza létre; tehát illeszkedik, hogy a CDR3 szegmensek, a TCR struktúra néhány modellje szerint, érintkezésbe lépnek az MHC molekulák hasadékában [ Chothia, C. és mtsai: The outline structure of the T-cell ab receptor; The EMBO J. 2' 3745-3755 (1988)] . A CDR3 szegmensek meghatározzák emellett a T-sejt klón legegyénibb jellemzőit is. Tehát a CD3 szegmensek alkotják egy klón idiotípusá(ai)t is, valamint egyedi eszközeit a cél-epitop felismerésére. A CDR3 szegmensek meghatározzák mind azt, hogy egy klón miként lát egy antigént, mind azt, hogy miként tekinthető egyedi sejtnek.

Közös VJD motívumok általában

A C9 νϋΰβ szegmensek erősen elterjedtek az egyes NŐD egerek között. Ki lehet mutatni a különböző NŐD egerek csecsemőmirigyében, a lépben és a szigetsejtek beszűrődéseiben, valamint az anti-p277 T-sejt kiónokban és vona-47·· ·· ·»·· ·♦ • · · · · · · ·· · · · · ··· ·· · · » ···· lakban. Ezzel szemben a C9 VJa szekvencia nincs ennyire elterjedve, és nem mutatható ki a csecsemőmirigyekből, lépekből vagy szigetsejt beszűrődésekből vett T-sejt mintákban. A C9 VDjp fontosságát az a megfigyelés is sugallja, hogy a C57BL/6 egerekben levő anti-p277 T-sejtek tartalmaznak olyan kiónokat is, amelyekben a VDjp régiók PCR és szekvencia-elemzés alapján hasonlítanak a C9-ére, annak a ténynek ellenére, hogy a C57BL/6 kiónok más Vp géneket használnak (VP6, 8, 16) mint amilyeneket a vpi2

NŐD egér. A C9-szerű VDJp szegmensek jelenléte a C57BL/6 anti-p277 együtt szintén említésre méltó, mivel a C57BL/6 és a NŐD egerek különböző H-2 allélekkel rendelkeznek, jóllehet a D^b-jük azonos [ Kikutani, H. és mtsai: The murine autoimmune diabetes model: NŐD and related strains; Advances in Immunoi. 51, 285-322 (1992)] . Egy

VDjp motívum jelenlétének különböző MHC génekhez kapcsolódva van precedense egy olyan motívum esetében, amely közös mielin bázikus fehérjére specifikus Lewis patkány T-sejtekben, valamint néhány olyan T-sejtben, amely szklerózis multiplexben szenvedő emberekből származik [ Oksenberg, R.J. és mtsai: Selection fór T-cell receptor vp-Dp-jp rearrangements with specifity fór a myelin basic protein peptide in brain lesions of multiple sclerosis; Natúré 362, 68-70 (1993)] . Jóllehet a humán T-sejtek specifitása nem volt ismert, a közös VDjp motívum alapján

-48·· «*»· ·· • < » » · · · *· · · · « az volt várható, hogy az epitop egy mielin bázikus fehérje lehet.

A C9 VDJ motívum expressziója emberben

Az, hogy kimutattuk a C9 VDjp-szerű szegmenst különböző NŐD, C57BL/6 és BALB/c egerekben, azt sugallja, hogy létezik egy közös VDJ motívum. Valóban, a függetlenül izolált 4-1-E-2 NŐD kiónról leírták [Koop, B.F. és mtsai: Organization, structure and function of 95 kb of DNA Spanning the murine T-cell receptor Ca/Cs region; Genetics 13, 1209 (1992)] , hogy a C9-hez hasonlóan, használja a νβ12-ό és a jp2.5-öt és egy olyan VDJ régiója van (SRLGNQDTQY) (12. számú szekvencia), amely nagyon hasonlít a C9-ére, és csak annyiban tér el tőle, hogy az S helyett egy R-t tartalmaz, és van benne egy plusz G (SSLGGNQDTQY) (az 1. számú szekvencia 48-58-as csoportjai); a különbségeket aláhúztuk. A 4-1-E.2 kiónról azt is leírták, hogy adoptíven átviszi az inzulitiszt nem-diabeteszes 1-E⁺ transzgenikus NŐD egerekbe [ Koop, B.F. és mtsai: Organization, structure and function of 95 kb of DNA Spanning the murine T-cell receptor Ca/Cs region; Genetics 13, 1209 (1992)] . A 4-1-E.2 kiónról kiderült, hogy adoptívan szaporodik a szigetsejtek jelenlétében, de nem írták le azt az antigént, amelyet ez a klón ismer fel. Érdekes módon Durinovic-Bello és munkatársai leírták egy olyan T-sejt klón (K2.12) izolálását egy diabeteszes emberből, amelynek a TCR VDJ motívuma SRLGNQ volt (2-7-es • ·· > - «^»· »♦ • · · · * Μ 1 · * * · · · · « ·« · ·· ·· ·> ··««

-49motívum a 3. számú szekvenciából) [Durinovic-Bello, I. és mtsai: HLA-DQ-restricted, Islet-specific T-cell clones of a Type I diabetic Patient: T Cell Receptor Sequence Similarities to Insulitis-inducing T-cells of Nonobese

Diabetic (NŐD) Mice; 13th International Immunology and Diabetes Workshop (1994)] . Ahhoz, hogy a C9 motívum kimutatható legyen, sok esetben úgy tűnik, hogy arra van szükség, hogy a motívumot hordozó kiónokat amplifikáljuk. Egy ilyen amplifikálást a pozitív szelekciónak tulajdoníthatunk; ha egyszer a 09 VDJp-szerű rekombináció véletlenül létrejön, akkor az azt hordozó VDjp-t szaporodásra hajtja. Valójában a C9 VDjp markert először a csecsemőmirigyben mutatták ki és csak később a periférián, majd végül a NŐD egerek szigetsejtjeiben, az inzulitisz során. Azoknál a hím NŐD egereknél, amelyek felgyorsult inzulitisszel és diabétesszel rendelkeztek, szintén kiderült, hogy a C9 VDjp marker megtalálható a szigetsejtjeikben (nem közölt adatok) . A C9 VDJ motívum korai pozitív szelekcióját alátámasztja az N inszerciós nukleotidok viszonylag kis száma [ Engler, P. és mtsai: N region diversity of a transgenic substrate in fetal and aduit lymphoid cells; J. Exp. Med. 176, 1399 (1992)] , valószínűleg csak a három tta nukleotid, amelyek az L aminosavat kódolják (lásd 1. táblázat).

A C9 VDJ motívum lehet funkcionális és szabályozhatja az

IDDM-et ·»·· ·» • ·

- 50Attól függetlenül, hogy milyen mechanizmus szelektálja pozitívan a C9-szerű kiónokat a csecsemőmirigyben, az világos, hogy az anti-C9 anti-idiotípusos T-sejtek képesek szabályozni a diabetogén C9-szerű kiónok aktivitását a periférián: a T-sejt vakcinálás C9-cel az antip277 reaktivitásának korlátozásához vezet, és megakadályozza a diabétesz kifejlődését NŐD egerekben [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88,

3088-3091 (1991)] .

A jelen találmány szerint a C9 VDJ idiotípusra specifikus anti-idiotípusos T-sejtek szabályozzák az IDDM-et NŐD egerekben: az anti-idiotípusos T-sejt reaktivitás jelen van a prediabetikus NŐD egerekben, és spontán csökken, ahogy a diabetogén folyamat kifejlődik; A C9-cel szembeni T-sejt vakcinálás aktiválja az anti-idiotípusos aktivitást és megakadályozza az IDDM-et; az anti-idiotípusos T-sejt vonalak képesek adoptívan átvinni az IDDMmel szembeni rezisztenciát; és az idiotípusos VDJ peptiddel végzett vakcinálás felerősíti az anti-idiotípusos T-sejtek reaktivitását és IDDM elleni rezisztenciát indukál. Az anti-idiotípusos T-sejtek képesek válaszolni az intakt C9 T-sejteken található VDJ idiotópokra, anélkül hogy antigén-bemutató sejteket adnánk hozzá. Ezek a megfigyelések igazolják, hogy léteznek természetes anti-idiotípusos T-sejtek, célpont TCR epitopjuk és

- 51 szerepük az autoimmun betegségek szabályozásában. Úgy tűnik, hogy a betegség kifejeződése függ a diabetogén Tsejtek és a szabályozó anti-C9 VDJ anti-idiotipusos Tsejtek közötti egyensúlytól.

Bizonyíték a spontán anti-idiotipusos hálózatra

A mi tenyészetünkben a NŐD egerekben inzulitisz fejlődik ki körülbelül egyhónapos korban. Mindegyik nőstény egérben nyílt diabétesz fejlődik ki négyhónapos korára. Ezzel szemben a hím egereknek csak körülbelül 50%-ában fejlődik ki klinikai diabétesz, és ez hathónapos korukig történik. Ezért tanulmányoztuk a nőstény és hím NŐD egerek hsp60-ra, a célpont saját antigénre, és a C9re, a prototípus anti-hsp60 T-sejtre adott T-sejt válaszait. A 4. ábrán láthatók a különböző korú nőstény és hím NŐD egerekből vett lépsejtek T-sejt szaporodási válaszai. Négyhetes nőstény egerek (1. ábra, felső panel), a kimutatható inzulitisz felléptekor nem mutattak T-sejt reaktivitást a hsp60-ra, míg reagáltak a C9-cel. A korral a C9-cel szembeni spontán anti-idiotipusos válasz lecsökkent, míg a C9-szerú reaktivitás nőtt a hsp60-nal szemben. A klinikai diabétesz feltűnésekor mindkét típusú Tsejt reaktivitás eltűnt.

A hím egerekben (4. ábra, alsó panel) az anti-C9 anti-idiotipusos reaktivitás később csökkent le mint a sokkal érzékenyebb nőstényekben. Az idő előrehaladtával az anti-idiotipusos reaktivitás lecsökkent, de nem tűnt

- 52el, és az anti-hsp60 reaktivitás mérsékelt szinten maradt és a hím egereknek körülbelül a fele nem lett cukorbeteg. Ezek az eredmények a kezeletlen NŐD egerekben azt sugallják, hogy az autoimmun diabétesz kifejlődése negatívan kötődik az anti-C9 anti-idiotípusos T-sejtekhez és pozitívan kötődik az anti-hsp60 (C9-szerű) T-sejtekhez.

Bizonyíték arra, hogy a VDJ szekvencia a C9 idiotípus

Az 5. ábrán azt láthatjuk, hogy a C9-nek az anti-C9 T-sejtek által felismert idiotípusos peptidje a TCR béta lánc VDJ peptidje. Háromhónapos nőstény NŐD egereket vakcinázunk vagy nem vakcinázunk besugárzott C9 T-sejtekkel, majd vizsgáljuk T-sejtjeiknek különböző NŐD serkentő Tsejtekre és VDJ peptidekre adott szaporodását: C9, N4 vagy anti-ovalbumin (anti-OVA). Az N4 kiónt, amely nem képes befolyásolni a diabéteszt illetve nem használható ellene vakcinaként, C9-cel együtt izoláltuk prediabetikus NŐD egerekből [Éliás, D. és mtsai: Vaccination against autoimmune diabetes with a T-cell epitope of humán 65-kDa heatshock protein; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 3088-3091 (1991)] . Az N4 reagál a mikobakteriális hsp65-tel, de ez a reakció nem szignifikáns a humán vagy egér hsp60-nal vagy a hsp60 p277 peptidjével. Korábban azt találtuk, hogy az N4 és a C9 3 nukleotidban (2 aminosavban) tér el egymástól a β-lánc

VDJ régiójában, és az anti-OVA T-vonal ettől teljesen eltérő TCR a és β láncokat expresszál (1. táblázat) . A

- 53prediabetikus NŐD egerek T-sejt szaporodási aktivitást mutattak a C9 kiónra és a C9 VDJ peptidre, attól függően, hogy vakcinázva voltak-e a kontroll T-sejtekkel vagy nem voltak vakcinázva (5. ábra, felső panel). A C9-cel való vakcinázást követően jelentős erősödés volt a C9-re és a C9 VDJ peptidre adott válaszban. Nem volt válasz az N4-re vagy az N4 VDJ peptidre vagy az anti-OVA-ra (5. ábra, felső panel).

Ahhoz, hogy igazoljuk az érintetlen C9 sejtekre és annak VDJ peptidjére adott válaszok ekvivalenciáját, NŐD egereket vakcináztunk olyan C9 VDJ szegmenssel, amit génsebészeti módszerekkel úgy változtattunk meg, hogy a flagellinben expresszálódjanak és vizsgáltuk a T-sejt válaszokat a fentiekben alkalmazott T-sejtekre és peptidekre. Az 5. ábra alsó panelja azt mutatja, hogy a C9 VDJ konstrukció felerősíti az érintetlen C9 sejtekre, valamint a C9 VDJ peptidre adott specifikus választ. A 6. ábrán látható, hogy a C9 VDJ peptidre adott T-sejt válasz erősíthető, ha a peptidet az ovalbumin hordozóval (ÓVA), valamint a C9 VDJ - flagellin konstrukcióval konjugáljuk. Ennek következtében különböző hordozó molekulák használhatók anti-idiotípusos válaszok indukálására.

Azt is meg kell jegyeznünk, hogy mind a BALB/c egerek mind a NŐD egerek tudnak válaszolni a C9 VDJ-konjugátumokra (6. ábra). Tehát a C9 VDJ idiotípusra adott válasz nem korlátozódik a NŐD egerekre. Ennek megfelelően • ·· · · ··· · ·· ··· ·· · ·· • · · · · · · ·· ·· ·· · · •·· ·· · · * ···

- 54úgy tűnik, hogy a TCR β-lánc képezi a C9 immunológiai identitását, amit az anti-idiotipusos T-sejtek látnak.

Az IDDM kezelése: Anti-idiotipusos T-sejtekkel és a VDJ pepiiddel

A 7. ábráról látható, hogy az anti-C9 anti-idiotípusos T-sejtek képesek védelmet nyújtani a spontán diabétesszel szemben. Mind az anti-C9 T-sejtek adoptív transzferé (7. ábra, felső panel) mind a C9 VDJ konstrukcióval végzett aktív vakcinálás (7. ábra, alsó panel) hatékonyan gátolja a betegséget.

A T-sejt bemutatja a VDJ idiotópot

A C9 T-sejt közvetlenül bemutatja a saját TCR peptidjét az anti-C9 T-sejteknek. A 8. ábrán bemutatott kísérletben az anti-C9 T-sejteket elválasztjuk az APC-től és a tisztított C9 T-sejtek is mentesek az APC-től. Mind a C9 T-sejtek mind az anti-C9 anti-idiotipusos T-sejt populáció funkcionálisan mentesnek tűnik a standard APC aktivitástól: ezek a sejtek képesek az OVA-t bemutatni az anti-OVA T-sejteknek. Azonban a C9 sejtekről kiderült, hogy serkentik az anti-idiotipusos anti-C9 T-sejteket. Valóban, ha APC-t adunk a T-sejt tenyészethez, akkor ez nem fokozza, hanem inkább csökkenti a T-sejt kölcsönhatást. Tehát úgy tűnik, hogy az anti-C9 T-sejtek felismerik a C9 β-lánc VDJ epitopját, amit a C9 maga mutat be.

·· · ··· ·

A VDJ idiotípus kötődik az MHC-hez

A C9-nek TCR peptidje anti-idiotípusos T-sejteknek való bemutatásánál használt fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) eleme vizsgálatára monoklonális ellenanyagokat használtunk az anti-C9 válasz blokkolására. A 3. táblázatban látszanak az anti-C9 válasz érintetlen C9sejttel való erősítésének eredményei. Az érintetlen C9-re vagy az APC-n levő C9 VDJ-re adott válasz legnagyobb részét blokkolják a K^d MHC molekulára specifikus ellenanyagok. Az anti-IA ellenanyagok is blokkolják a választ, de kisebb mértékben. Nem figyelhető meg gátlás a D^b molekula elleni ellenanyagokkal, jóllehet mind a Kd mind a Db molekulák expresszálódnak NOD-ben. Tehát úgy tűnik, hogy az anti-C9 anti-idiotípusos T-sejt reaktivitást mind a Kelemre való MHC-I osztály, mind az MHC-II osztály korlátozza. A mind az I-es mind a ΙΙ-es osztály által való korlátozásra vonatkozó megfigyelés kompatibilis azzal, hogy mind CD4 mind CD8 anti-idiotípusos T-sejtek megfigyelhetők T-sejt vakcinálás után EAE-ben [Lider, 0. és mtsai: Anti-idiotypic network induced by T cell vaccination against experimental autoimmune encephalomyelitis; Science 239, 181 (1988)] . A CD4 T-sejtek általában felismerik a peptid epitopjaikat az MHC I-es osztályú molekulák nyílásában. Tehát úgy tűnik, hogy a C9 VDJ peptid, vagy annak egy része képes arra, hogy kötődjön az

- 56IA^N0D vagy K^D molekulákhoz, de nem képes kötődni a D^b molekulához .

Idiotípusos hálózati szabályozás

Az itt bemutatott eredmények tisztázzák az autoimmunitás T-sejtek által végzett szabályozásának jelenségét egy spontán betegségben, kimutatva, hogy az anti-idiotípusos T-sejtek mesterséges közbelépés nélkül vannak jelen, hogy a betegség megnyilvánulása kötődik az idiotípusos T-sejtek és az anti-idiotípusos T-sejtek közötti egyensúly felbomlásához, hogy az idiotípusos peptid a TCR lánc egy VDJ szegmense, és hogy az idiotípusos T-sejt a saját idiotípusát a szabályozó anti-idiotípusos sejteknek mutatja be [Cohen, I.R.: The cognitive paradigm and the immunological homunculus; Immunoi. Today 13, 490 (1992)] . Tehát létezik egy hálózat, amelyikről úgy tűnik, hogy a hsp60 p277 epitopot a C9 közös TCR idiotípusos peptidjéhez kapcsolja, és emellett az anti-idiotípusos szabályozó populációhoz. Úgy tűnik, hogy a spontán antiidiotípusos hálózat különösen működőképes az I-es típusú diabétesz NŐD egér modelljében.

Az összes idézett publikációt, beleértve a folyóirat-cikkeket vagy kivonatokat, Amerikai Egyesült Államokbeli vagy külföldi szabadalmi bejelentéseket, megadott Amerikai Egyesült Államok-beli vagy külföldi szabadalmakat vagy bármely más referenciát, teljes egészében referenciának tekintjük, beleértve az összes adatot, tábláza• · · ·

- 57tot, ábrákat, és szöveget, amit az idézett referenciában bemutatnak. Emellett az idézett referenciákban idézett referenciák teljes tartalmát is referenciának tekintjük.

Az ismert módszerekre, szokványos módszerekre való hivatkozás semmiképen nem jelenti annak elismerését, hogy a jelen találmány bármely szempontja, leírása, megvalósítási módja megtalálható a korábbi szakirodalomban.

A specifikus megvalósítási módok előzőkben megadott leírása tehát teljesen leírja a találmány általános természetét, amit mások, a szakterületen közismert tudást alkalmazva (beleértve az itt idézett referenciák tartalmát) könnyen módosíthatják és/vagy adaptálhatják ezeknek a specifikus megvalósítási módoknak a különböző alkalmazásait, anélkül, hogy eltérnének a jelen találmány általános koncepciójától. Tehát az ilyen adaptációk és módosítások véleményünk szerint az ismertetett megvalósítási módok vagy azok ekvivalensei tartományába tartoznak, az itt ismertetett kitanítás alapján. Azt is nyilvánvalónak tartjuk, hogy az itt alkalmazott nevezéktan és frazeológia célja az ismertetés és nem a korlátozás, tehát a jelen találmány terminológiáját és frazeológiáját a szakterületen jártas szakembernek az itt bemutatott kitanítás alapján kell interpretálnia, a szakterületen jártas szakember számára ismert tudással kombinálva.

• ·

VDJ régió szekvencia

ncia száma	csoport)	csoport)	CO	14		in i—l
ös	*X>
co	13
<D	1		0)
>	m		1
	in		σι
<D	1		I
N	Γ~		1—
co	’tr
<	i—1		CM
CZL	m		m		in		m
0			•
	cm		CM		CM		CM
		o		o		O		o
	1	fO	1	c0	1	(Ö	1	(0
	Q	0	Q	0	Q	0	a	0
		fO		(0		fO		fO
•J		Π3		<0		<0		<e
	σ	o	a	o	a	o	a	u
		o		o		u		o
		(0		(Ű		(Ü		fO -
	z	(0	z	(Ü	z	(0	z	(0
								4-)
								o
								0
								0
							<	0
Q								0
co		4->		O		(0		0
'Φ		0		(0		0	0	4J
	0	tn	Eh	0	0	0		o
Z		0		0		0	Z	(0
		0		σ		4->		0
	0	0	s	4->	►q	o	0	o
		(0		(Ü		(0		o
		4->		4-1		θ'		4J
	►q	4-1	z	4->	CZ	(0	z	o
		4->		O				4J
		0		0				0
	co	Φ	co	m			CO	rC
>		u		fO		o		O
	0		0		0		0
	co	fO	CO	fO	co	fO	co	rö
		o		(0		o		ü
		u		ο		u		O
	<	0	<	0	<	0	<	0
ex	CM		x—1		CM
>	i—I		,—1		r—1		<D
					C\]
c					•
Ό					Cd
r—I					1		1-
z	CTi		*>r		1— 1		CM
	0		Z		’T		03
							ΚΏ
Sh
'Φ							z
0							03
cd	Q		Q		a
	O		O		o		m
	Z		z		z		0

··· ·

C9 VDJ és a VJ eloszlása NŐD egerekben

	szigetsejtek	na	na	1	1	1	+	na	na	(0 c	na
e Ή a:	lép	1	1	1	+	1	+	1	+	íO c	na
	Csecsemőmirigy	1	+	1	+	1	+	1	+	na	na
	szigetsej tek	na	na	1	+	1	1	na	na	na	na
>1 C Ό 4J ω *o Z	lép	1	1	1	+	1	1	1	+	1	+
	Csecsemőmirigy	1	+	1	+	1	+	1	+	1	+
Próba	8	02.	8	co.	8	ex	8	cX	8	ex
Kor	! (Hónap)	0, 5		t—1		CM		co

Az anti-idiotípusos anti-C9 válaszokat mind az MHC-1 mind az MHC-

Gátlás %	1	28	72	o	o	32	o	CM
Szaporodási válasz (Sí)	m	CO	K CM	m l£>	o h. Γ-	1—1 m	2,8	CD <0
Blokkoló ellenanyag (2 mmol/1)	nincs	anti I-A	3 -H 4-> c (0	„Q Thue	nincs	anti I-A	3 •H 4-> C f0	anti Du
Serkentő (in vitro)	besugárzott C9	besugárzott C9	besugárzott C9	besugárzott C9	C9 VDJ peptid	C9 VDJ peptid	C9 VDJ peptid	C9 VDJ peptid
Immunizálás (in vivő)	C9 klón: 5x 10°	C9 klón: 5x 10”	C9 klón: 5x 10”	C9 klón: 5x 10”	C9 klón: 5x 10”	C9 klón: 5x 10”	C9 klón: 5x 10”	C9 klón: 5x 10”

- 61 Az alábbiakban közöljük a leírásban szereplő szekvenciákat .

A SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) BENYÚJTÓ:

(A) NÉV: YEDA Research and Development Co. Ltd at the Weizmann Institute of Science (B) UTCA: P.O.Box 95 (C) VÁROS: Rehovot (E) ORSZÁG: Izrael (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 76100 (G) TELEFON: 972-8-470617 (H) TELEFAX: 972-8-470739 (A) NÉV: Cohen, írun R (B) UTCA: 11 Hanki Street (C) VÁROS: Rehovot (E) ORSZÁG: Izrael (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 76354 (A) NÉV: Éliás, Dana (B) UTCA: 57 Derech Yavne (C) VÁROS: Rehovot (E) ORSZÁG: Izrael (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 76344 (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Peptidek, és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények

- 62(iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 16 (v) SZÁMÍTÓGÉPES FORMA:

(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: FLOPPY LEMEZ (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC KOMPATIBILIS (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: PATENTIN RELEASE #1.0, VERSION #1.30 (EPO)

1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 68 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia

Ser

Tyr

Phe

Arg

Ser

Lys

Ser

Leu

Met

Glu

Asp

Gly

Gly

Alá

1

5

10

Phe

Lys

Asp

Arg

Phe

Lys

Alá

Glu

Asn

Leu

Asn

Ser

Ser

Phe

15

20

25

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Gin

Pro

Thr

Glu

Pro

Lys

Asp

Ser

Alá

30

35

40

Val

Tyr

Leu

Cys

Alá

Ser

Ser

Leu

Gly

Gly

Asn

Gin

Asp

Thr

45

50

55

Gin

Tyr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Arg

Leu

Leu

Val

Leu

2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 12 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia

Ala Ser Ser Leu Trp Thr Asn Gin Asp Thr Gin Tyr

10

3. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 8 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia

Ala Ser Arg Leu Gly Asn Gin Asp

5

4. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 11 aminosav (B) Típus: aminosav • · ·

-64(C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia

Alá Ser Ser Leu Gly Leu Gly Alá Asn Gin Asp

10

5. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 24 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia

Val Leu Gly Gly Gly Cys Alá Leu Leu Arg Cys Ile Pro Alá

10

Leu Asp Ser Leu Thr Pro Alá Asn Glu Asp

20

6. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 27 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS ·»«· ·*

- 65(xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia

GCCAGCAGTT TAGGGGGTAA CCAAGAC

7. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia

Thr Gly Gly Cys Gly Thr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Cys Thr

10

Thr Thr Gly Alá Alá Gly

20

8. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 8. számú szekvencia

CGGCACATTG ATTTGGGAGT C

9. számú szekvenciavázlat

- 66(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 9. számú szekvencia

ACACAGCAGG TTCTGGTTC

10. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 18 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 10. számú szekvencia

ATGAGAGGGC CTAATTAC

11. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 6 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 11. számú szekvencia • * · · «I · · · · ··

- 67Met Arg Gly Pro Asn Trp

5

12. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 10 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 12. számú szekvencia

Ser Arg Leu Gly Asn Gin Asp Thr Gin Tyr

10

13. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 27 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 13. számú szekvencia

GCAAGAAGCT TATGGGACAA CCCAGAC

14. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 24 bázispár

-68(B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 14. számú szekvencia

GCCAGCAGAC TGGGAAACCA AGAC

15. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 33 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 15. számú szekvencia

GCCAGCAGTC TCCGACTGGG GGCTAACCAA GAC

16. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 9 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: 16. számú szekvencia

Alá Ser Ser Leu Gly Alá Asn Gin Asp ••Μ **

Claims (12)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Peptid, amely legalább 7, előnyösen körülbelül 7-24 aminosavat tartalmaz, lényegében megfelel a V-D-J képlet VDJ régiójának, aholis V jelentése az A-S dipeptid szekvencia, D előnyösen 2-5 aminosavat tartalmaz, beleértve az L-G dipeptid szekvenciát és J tartalmazza az N-Q-D tripeptid szekvenciát, illetve a peptid funkcionális származéka vagy konjugátuma.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti peptid amelyben (a) V jelentése az A-S-S tripeptid szekvencia; (b) D tartalmazza az L-G-G tripeptid szekvenciát, az R-L-G tripeptid szekvenciát vagy az L-G-L-G-A pentapeptid szekvenciát (a 4. számú szekvencia 4-8-as csoportjai); (c) a V-nek az A-S dipeptid szekvenciája része a ”D-vel szomszédos tripeptidnek; vagy (d) az N-Q-D tripeptid szekvencia szomszédos D-vel.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti peptid, amelyben V tartalmaz egy νβ szegmenst, amely szegmens legalább egy részét tartalmazza a νβ gén által kódolt fehérje C-terminális végének és (a) az említett νβ szegmens

   C-terminális tripeptid szekvenciája tartalmazza az A-S dipeptid szekvenciát; (b) az említett szegmens 1-10 aminosav csoportot tartalmaz a νβ gén által kódolt fehérje C-terminális végéről; vagy (c) az említett νβ gént a νβ6, νβ8, νβ12 és νβ16 közül választhatjuk.
4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti peptid, amelyben J tartalmaz egy JP szegmenst, amely szegmens tartalmazza egy Jp gén által kódolt rész N-terminálisának legalább egy részét és (a) az említett jp szegmens N-terminális tripeptid szekvenciája N-Q-D; (b) az említett szegmens 1-10 aminosavat tartalmaz a jp gén által kódolt fehérje N-terminálisáról; vagy (c) az említett jp gén a

   Jp2.5.
5. 5. Maximum körülbelül 24 aminosavat tartalmazó peptid, amely tartalmazza az alábbi szekvenciákat: (a) AS-S-L-G-G-N-Q-D (az 1. számú szekvencia 47-55-ös csoportjai); (b) A-S-R-L-G-N-Q-D (3. számú szekvencia); (c) A-S-S-L-G-L-G-A-N-Q-D (4. számú szekvencia); vagy (d) AS-S-L-G-A-N-Q-D (16. számú szekvencia).
6. 6. DNS konstrukció, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptidet kódoló polinukleotid szekvenciát vagy annak komplementerét tartalmazza.
7. 7. Inzulin-dependens diabétesz mellitusz elleni gyógyászati készítmény, amely az anti-idiotípusos Tsejteknek az anti-p277 T-sejtek felismerési képességéhez kötődő anti-idiotípusos T-sejt aktivitást befolyásolja, előnyösen potenciálja, amelyben az 1-5 igénypontok bármelyike szerinti peptid, vagy az 1-5 igénypontok bármelyike szerinti peptiddel szemben aktivált T-sejtek és egy gyógyászatilag elfogadható hordozó található.

   -71
8. 8. Az anti-277 T-sejtek felismerésében szerepet játszó anti-idiotípusos T-sejtek jelenlétének kimutatására szolgáló ágens, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptidet tartalmaz.
9. 9. A 8. igénypont szerinti ágens, amely egy kimutatható jelöléshez van konjugálva.
10. 10. Konjugátum, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptidet, valamint egy második molekulát, polipeptidet vagy egy kis szerves molekulát tartalmaz.
11. 11. Oligonukleotid, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptidet kódoló DNS szekvenciának legalább egy részével komplementer polinukleotid szekvenciát tartalmaz.
12. 12. Eljárás az IDDM diagnosztizálására, fázisának megállapítására vagy az IDDM kezelés menetének követésére, azzal jellemezve, hogy elemezzük a vizsgálandó beteg szérumának T-sejtjeit, hogy miként szaporodnak, mennyi a citokin termelésük, ha az 1-5 igénypontok bármelyike szerinti pepiiddel érintkezésbe hozzuk in vitro.