JPH10507345A

JPH10507345A - ペプチド及びこれを含む薬剤組成物

Info

Publication number: JPH10507345A
Application number: JP8512640A
Authority: JP
Inventors: アールコーエン、イルン; エリアス、ダナ
Original assignee: イェダリサーチアンドディヴェロップメントカンパニー、リミテッド
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-10
Publication date: 1998-07-21
Also published as: KR970706306A; AU3946295A; FI971427A; EP0783524B1; WO1996011214A1; KR100381711B1; CZ103197A3; SK44197A3; AU708301B2; PL319831A1; DE69534024T2; CA2201935A1; EP0783524A1; FI971427A0; IL111196A0; HUT77484A; NO971517L; EP0783524A4; ATE289611T1; NO971517D0

Abstract

(57)【要約】本発明は一般にペプチド配列及びこれらの使用方法に関し、この配列は抗−イディオタイプＴ細胞の活性を調節する。問題の抗−イディオタイプＴ細胞はこれらのＴ細胞が抗−ｐ２７７細胞を認識する能力に関係する。従って、本発明のペプチドはインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）に関連する疾病の診断、予防、軽減又は治療において重要な手段を含む。

Description

【発明の詳細な説明】ペプチド及びこれを含む薬剤組成物発明の分野本発明は一般にペプチド配列及びその使用方法に関し、この配列は抗イディオタイプＴ細胞の活性を調節する。問題の抗イディオタイプＴ細胞の活性はこれらのＴ細胞が抗−ｐ２７７Ｔ細胞を認識する能力に関係する。従って、本発明のペプチドはインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）に関連する疾病の診断・予防・軽減及び治療の重要な手段を含む。発明の背景Ｉ型糖尿病又はＩＤＤＭは、膵臓の小島に存在するインシュリン生産細胞を攻撃し破壊するＴ細胞に起因する自己免疫疾患である（２３）。ＩＤＤＭの自己免疫過程は症状を発現することなく開始し、進行する。この疾病はβ−細胞の累積的損失量がインシュリンを供給する残留β−細胞の量を越えた場合に臨床的に表面化する。実際、グルコース恒常性の破壊と臨床的なＩＤＤＭは、８０−９０％のβ−細胞が免疫系により不活性化された後に生ずるものと考えられる。従って、ＩＤＤＭに罹患したと特定される患者はβ−細胞の自己免疫破壊の進行した段階に至る。更に、β−細胞自己免疫の免疫学的マーカーを検出することによる前臨床段階の糖尿病の早期診断は自己免疫過程が開始した後にのみ行うことができる。従って、治療法を探索するということは、既に進行している自己免疫過程を停止する安全・明確且つ有効な方法を見い出すことである。以前、本発明者は、ヒトＩＤＤＭの忠実なモデルと考えられるＮＯＤ種のマウスに進行している自然発症性糖尿病の研究によりこの問題を検討した（２３−２５）。ＮＯＤマウスは生後約１ケ月でインシュリン炎を発症し、これは島周辺部の穏やかな浸潤として開始し、重篤な島間の炎症という過程をたどる。インシュリン不足を証明する高血糖症は本発明者のコロニーの雌では生後約３ケ月で始まる。生後６ケ月迄に殆ど全ての雌ＮＯＤマウスは重篤な糖尿病を発病し、インシュリン療法を行わなかった場合殆ど死亡する。雄ＮＯＤマウスは低い罹病率を示すがその理由は明らかでない。ＮＯＤマウスの糖尿病は自己免疫Ｔ細胞に起因することが示されている（２６）。種々の抗原に対するＴ細胞の反応性及び自己抗体は、ＮＯＤマウスの場合と同様に、ヒトＩＤＤＭ患者においても検出されており（２７）、考えられ得るいかなる標的抗原がこの疾病の主なる原因であるかは明らかではない。治療の問題は因果関係の問題の背後にある。ＮＯＤマウスにおける自己免疫過程の開始は、糖尿病の始まる前に、マウスを食事制限、ウィルス感染又は免疫系の不特定な刺激のような種々の操作の対象とすることにより防止することができることが示されている（２４）。また、ＮＯＤ糖尿病は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）抗原に対する免疫寛容を前糖尿病マウスに誘発することにより防止される（２８、２９）。抗−イディオタイプＴ細胞は、他のＴ細胞の抗原受容体由来のペプチドを認識するＴ細胞である（６）。抗−イディオタイプＴ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ペプチドを認識するＴ細胞の活性の調節に関連すると考えられる。自己免疫Ｔ細胞は抗−イディオタイプＴ細胞による調節の対象となり、抗−イディオタイプＴ細胞は実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）のモデルのげつ歯類（６）又は自己免疫性Ｔ細胞による多原性硬化症（ＭＳ）に罹患している人（７）に対する意図的なＴ細胞のワクチン接種により検出されてきた。欧州特許出願第２６１６４８号はこのような疾病の治療のため、自己免疫疾患に特異的な活性化Ｔ細胞を使用することを開示する。このＴ細胞は、好ましくは最初に圧力処理され、免疫原性を向上させるため化学的架橋剤及び／又は細胞骨格分裂剤により処理される。処理された全体の細胞又はその断片はＴ細胞が特異的である自己免疫疾患に対するワクチンとして用いることができる。自己免疫Ｔ細胞を抑止する公知の方法においては、対象は特定の自己免疫特性を有する希釈化又は弱毒化されたＴ細胞又はその断片あるいは破片により免疫される。対象は少なくとも２種類の調節Ｔ細胞、即ち、Ｔ細胞活性化マーカーを認識する抗−エルゴタイプＴ細胞及び病原性内因性自己免疫Ｔ細胞上に存在する自己抗原リセプターを認識する抗−イディオタイプＴ細胞を活性化することにより応答する。実験動物におけるＴ細胞ワクチン接種は、疾病の予防と同様、完全治癒を誘発することにおいても有効である。実験的な自己免疫性脳髄膜炎に対するラットのワクチン接種において、Ｔ細胞リセプターβ鎖のペプチド配列を使用することは開示されており（３０、３１）、従って、自己免疫性Ｔ細胞リセプターそのものは調節Ｔ細胞の標的エピトープを供給することができるという結論は支持される。本発明では、ＮＯＤマウスの糖尿病の自然発症は、抗−イディオタイプＴ細胞が非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）種のマウスに共通して現れる自己免疫Ｔ細胞のＴＣＲＶＤＪペプチドに特異的である抗−調節型ネットワークにより調節されることを示す（１）。ＩＤＤＭにおけるｈｐｓ６０及びｐ２７７ペプチドの作用的役割本発明者の研究室は、かつて、６０ＫＤａ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）のエピトープがマウスのＮＯＤ種において自然発症するＩ型糖尿病における自己免疫攻撃の標的であることを示した。このタンパク質は以前はｈｓｐ６５と称されていたが、現在は分子量に関するより正確な情報を参照してｈｓｐ６０と称されており、いずれの名称を用いてもタンパク質は同一である。この研究室はかつて、ペプチドｐ２７７（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）５）と称されるヒトｈｓｐ６０配列からペプチド断片を特定しており、これはＴ細胞によりもたらされる糖尿病の標的エピトームを含む（３；ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１０４４９）。また、この研究室はＣ９と称されるＴ細胞のクローンを単離しており、これはペプチドｐ２７７を認識し、糖尿病の原因となる（３）。ｐ２７７ペプチド及びＣ９Ｔ細胞は糖尿病を調製する作用的役割を有するということが知られている。希釈化されたＣ９Ｔ細胞又はペプチドｐ２７７によるＮＯＤマウスのワクチン接種は、糖尿病を予防（３）し、又は治療（４）することができる。これらの治療的ワクチン接種は抗−イディオタイプ調節Ｔ細胞を活性化する。発明の要約Ｃ９クローンは、ＶＤＪペプチド配列により特定されるイディオタイプ抗原決定基を生ずるＴ細胞リセプター（ＴＣＲ）β鎖を表すことが見い出された。同一の又は類似のＶＤＪ配列はＮＯＤ及び他の種のマウスに存在する他の糖尿病誘発性Ｔ細胞により共有されることが示された。本発明によれば、ペプチドは少なくとも７、好ましくは約７〜２４個のアミノ酸残基を有し、このアミノ酸は式Ｖ−Ｄ−Ｊで表される“ＶＤＪ”領域を有する。上式において“Ｖ”は配列Ａ−Ｓのジペプチドを含み、“Ｄ”は配列Ｌ−Ｇのジペプチドを含み、“Ｊ”は配列Ｎ−Ｑ−Ｄのポリペプチドを含み、イタリック体の文字は対応するアミノ酸の標準的な一字の略字を表す。Ｄ領域は、好ましくは、２−５個のアミノ酸残基を有する。本発明の具体的実施例においては、ペプチドはセグメント“Ｖ”を含み、これは配列Ａ−Ｓ−Ｓのトリペプチドを含む。他の実施例においては、ペプチドはセグメント“Ｄ”を有し、これは配列Ｌ−Ｇ−Ｇのトリペプチド、配列Ｒ−Ｌ−Ｇのトリペプチド又は配列Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ａのペンタペプチドを含む（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４の残基４−８）。本発明の他の実施例においては、式Ｖβ−Ｄ−Ｊβの少なくとも７、好ましくは８−２４のアミノ酸残基を有するペプチドが提供される。上式において、セグメント“Ｖβ”はＶβ遺伝子、好ましくはヒトＶβ遺伝子によりコードされるタンパク質のＣ−末端の１から約１０個までのアミノ酸残基を含み、Ｃ−末端アミノ酸残基の最後の３つは配列Ａ−Ｓのジペプチドを含み、“Ｄ”領域は配列Ｌ− Ｇのジペプチドを含む２−５のアミノ酸残基を有し、セグメント“Ｊβ”はＪβ 遺伝子、好ましくはヒトＪβ遺伝子によりコードされるタンパク質のＮ−末端の１〜約１０のアミノ酸を含む。この特定のタンパク質は好ましくは２４以下のアミノ酸残基を有しており、これは配列Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｑ−Ｄ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１の残基４７−５５）、配列Ａ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｑ−Ｄ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３）、配列Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｎ−Ｑ− Ｄ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４）及び配列Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ａ− Ｎ−Ｑ−Ｄ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１６）を含む。また、本発明が意図するものは、ペプチドをコードする特定のＤＮＡ構造であって、これは上記ＤＮＡ配列の少なくとも１部に相補的なポリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。同様に、このペプチドを含む薬剤組成物が意図され、これは抗ｐ２７７Ｔ細胞の認識に関連する抗−イディオタイプＴ細胞の存在を検出するための有用なワクチン又は物質の調製を含む。また、本発明はペプチド及び第２分子を含む複合体を対象としたものであり、これは第２ペプチド、ポリペプチド又は低有機分子を含む。上述したように、本発明の重要な目的は個体において抗−イディオタイプＴ細胞活性を調節する方法を開示することである。例えば、抗−イディオタイプＴ細胞活性は、抗−イディオタイプＴ細胞活性を増強するのに有効な量の本発明のペプチドを個体に投与することによって強化される。本発明のペプチドは、インビトロでＴ細胞、好ましくは同原のＴ細胞を活性化するために用いることができ、これは疾病の原因であるＴ細胞を攻撃するために患者に再投与されることができる。本発明の他の目的は、発明の好ましい実施例を含む以下の詳細な説明を参酌することにより、通常の知識を有する者にとっては明らかであろう。図面の簡単な説明図１Ｃ９クローンを用いたＴＣＲＶβ造伝子のＰＣＲによる決定。レーン１−１９：Ｃβオリゴヌクレオチドプライマーによる１９の異なるＶβ 増幅反応。レーンｓ．ｍ．：ｆｘ／ＨａｅＩＩＩサイズマーカー。ゲルは内部のＣβオリゴヌクレオチドプローブと交配され、サイズマーカーがプリントされる。Ｖβ２及びＶβ中の２つの陽性バンドはＣ９クローンにおけるこれらのセグメントの存在を示す。図２特異的Ｃ９ＶＤＪオリゴヌクレオチドプライマーを用いた異なるＴ細胞ラインにおけるＰＣＲにより決定されたＣ９ＶＤＪ再配列に相当する配列の存在。最初の４つのレーンはＮＯＤラインＣ９（レーン１），Ｃ７（２），Ｎ４（３）及び抗オバルブミンライン（４）の結果を示す。次のラインは異なる回数の刺激サイクル後に得られたＣ５７ＢＬ／６抗−ｐ２７７ラインを示す：１回刺激（レーン５）、２回刺激（レーン６）、５回刺激，二つの異なるライン（レーン７及びレーン８）及び６回刺激（レーン９）及びＣ５７ＢＬ／６抗−ＯＶＡライン（レーン１０）。ＮＯＤ及びＣ５７ＢＬ／６抗−ＯＶＡライン（レーン４及び１０）及びＣ５７ＢＬ／６ライン（レーン５）の最初の抗−ｐ２７７刺激からはシグナルが出ていないことに留意すべきである。Ｎ４クローン（レーン３）から得られた弱い信号は測定法の正確性を示している。図３Ａ及び３Ｂ抗−ｐ２７７Ｃ５７ＢＬ／６ラインのＰＣＲ増幅におけるＣ９ＶＤＪ再配列に相当する配列の存在。図１に示すように、Ｖβパネル増幅は、２回の増幅（図３Ａ）及び６回の増幅（図３Ｂ）の後、抗−ｐ２７７Ｃ５７ＢＬ／６ラインのｃＤＮＡサンプルにより行われた。ゲルハイブリダイゼーションはＣ９ＶＤＪ特定オリゴヌクレオチドプローブにより行われた。図４Ａ及び４Ｂ雌（図４Ａ）及び雄（図４Ｂ）ＮＯＤマウスにおける自然発症的抗−イディオタイプ応答。ｈｓｐ６０（イディオタイプ）及びＣ９クローン（抗−イディオタイプ）に対するＴ細胞応答は雌及び雄のＮＯＤマウスにおいて測定された。１０匹の雌及び１０匹の雄ＮＯＤマウスは生後４，６，８，１０，１３及び２１週で犠牲となり、Ｔ細胞増殖反応測定法のために膵臓が摘出された。膵臓細胞は、ヒトｈｓｐ６０（５μｇ／ml）又はＣ９クローン（２００００細胞／ウェル、５０００で照射）に対する増殖応答のため、マイクロタイタウェルにおいて２０００００細胞／０．２ccでテストされた。増殖応答は、７２時間の刺激の中の最後の１６時間、培養液に３Ｈ−チミジンを加えることにより測定された。取り込まれた３Ｈ−チミジンはβ−カウンターにより測定され、刺激指数（ＳＩ）は、抗体存在下でのｃｍｐ取込／抗体不存在下でのｃｍｐ取込として計算された。個々のマウスは別々に試験され、各々の時点における平均値±ＳＤが計算された。図５Ａ及び５ＢＣ９クローン又はＣ９ＶＤＪ−フラジェリンに対する免疫は抗−イディオタイプ応答を上昇する。図５Ａ：生後９週のＮＯＤ雌マウスは、９クローン細胞又は０．１ｍｌＰＢＳ中の５Ｘ１０６の活性Ｔ細胞抗−ＯＶＡＴ細胞ラインを腹腔内に注入することにより免疫された。９日後、脾臓細胞が、図４に示すように、殖反応測定法のために摘出された。増殖反応測定法に用いられた抗体はＣ９クローン、Ｎ４クローン、抗−ＯＶＡライン、５０００ｒａｂで照射された２００００細胞／ウェルのＴ細胞、Ｃ９ＶＤＪＡＳＳＬＧＧＮＱＤＯＱＹ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１の残基４７−５７）及びＮ４ＶＤＪＡＳＳＬＷＴＮＱＤＧＱＹ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２）合成ペプチドの５ｕｇ／ｍｌであった。図５Ｂ：生後９週のＮＯＤ雌マウスが１００μｇのＣ９ＶＤＪ−フラジェリン又は０．１ml ＰＢＳ中のフラジェリンを腹腔内に注入することにより免疫された。増殖反応測定法は図５Ａに示されるように行われた。図６フラジェリン又はＯＶＡに接合したＣ９ＶＤＪによる免疫は抗イディオタイプ応答を誘発した。生後９週のＢＡＬＢ／ｃ又はＮＯＤ雌マウスはフラジェリン，Ｃ９ＶＤＪ−フラジェリン又はＣ９ＶＤＪ−ＯＶＡに対して免疫され、これはグループ毎に５匹のマウスに対し、マウス毎に１００mgの抗体を腹腔内投与することにより行われた。Ｃ９ＶＤＪ−フラジェリン及びフラジェリンは０．１ml ＰＢＳ中に注入され、Ｃ９ＶＤＪ−ＯＶＡは０．１mlのＩＦＡエマルジョン中に注入された。９日後、膵臓が摘出され、図４に示されリゲンドで増殖反応測定法により試験された。増殖応答はＣ９ＶＤＪＡＳＳＬＧＧＮＱＤＴＱＹ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１の残基４７−５８）及びＮ４ＶＤＪＡＳＳＬＷＩＮＱＤＴＱＹ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２）合成ペプチドの５μｇ／ mlに対してテストされた。図７Ａ及び７Ｂ抗イディオタイプＴ細胞による糖尿病からの保護。図７Ａ：生後６週のＮＯＤ雌マウスがＰＢＳ中のＣ９ＶＤＪフラジェリンの１００μｇを腹腔内に注入することによりワクチン接種され、同数のマウスはこの処理を受けなかった。各々のグループは１０匹のマウスを含む。糖尿病は生後２ 1/2ヶ月から血糖値により監視され、１１．１mmol／Ｌを越える血糖レベルが高血糖症と見なされた。図７Ｂ：１０匹の生後５週のＮＯＤ雌マウスが０．１mlのＰＢＳ中に５×１０６後の活性化Ｔ細胞を含む照射（５０００ｒａｂ）Ｃ９クローン細胞により接種された。２週間後、膵臓が摘出され膵臓細胞がプールされた。同一週齢の未処理のＮＯＤ雌マウスも犠牲となり、膵臓細胞がプールされた。Ｃ９接種マウスの膵臓細胞は、Ｃ９クローン、ml当たり８×１０５個の膵臓細胞及び８×１ 0６個の照射Ｃ９クローンにより刺激された。ＮＯＤマウスからの膵臓細胞はＮＯＤ雌マウスのＴ細胞プラストにより刺激された。４８時間の刺激後、活性Ｔ細胞はリンフォベップ（ライコムド，ノルウェー）で遠心分離により不活性細胞と分離され，ＰＢＳにより洗浄され、生後６週のＮＯＤ雌マウスに対して１０７個の細胞が腹腔内に注入された。各々の群は１０個のマウスを含み、１０匹のマウスが処理されなかった。糖尿病の進行は図７Ａに示されるように監視された。図８抗−Ｃ９Ｔ細胞ラインの増殖はＡＰＣを必要としない。抗−Ｃ９Ｔ細胞ラインは、増殖Ｃ９Ｔクローン細胞により繰り返し刺激された生後６週のＮＯＤ雌マウスの膵臓細胞より得られた。抗−ＯＶＡＴ細胞ラインはＯＶＡによりインビボでプライムされたＮＯＤ雌マウスから得られた。これらのラインの増殖応答は、ウェル毎に５００００個の細胞が、抗−Ｃ９ラインで４回刺激された後、及び抗 −ＯＶＡラインで１７回刺激された後テストされた。抗−Ｃ９ラインはウェル毎に５万個、活性化され照射された（５０００ｒａｂ）Ｃ９クローンに対してテストされ、抗−ＯＶＡラインは、ウェル毎に１０μｇずつＯＶＡ（シグマ）に対してテストされた。ＡＰＣはウェル毎に２０万個のＮＯＤ雄膵臓細胞に照射された（３０００ｒａｂ）。増殖に用いられた抗−Ｃ９ライン又はＣ９クローン細胞がＡＰＣで汚染されないことを確実にするため、本発明者は抗−ＯＶＡラインのためのＡＰＳとしてこれらの細胞を用いた。増殖反応測定法が図４に示される方法で膵臓細胞に対して行われた。図９ｐ２７７ペプチドによる処理が抗−Ｃ９応答を誘発する。生後１２週のＮＯＤ雌マウスがＩＦＡ中のｐ２７７又はｐ２７８をマウス毎に１００μｇ皮下注入されることにより免疫され、グループ毎に１０個のマウスが処理を受けなかった。処理の２又は５週後、各々のグループの５匹のマウスが犠牲になり、膵臓が摘出され、図４に示される方法によりＣ９ＶＤＪペプチドに５μｇ／mlに対する増殖反応測定法でテストされた。表の簡単な説明表１選択されたＮＯＤ及びＣ５７ＢＬ／６ラインのアミノ酸配列。異なるＶβ及びＪβセグメントが示されている。アミノ酸及びヌクレオチド配列とＣ９ＶＤＪ再配列との相違点は太文字でマークされている。ＮＯＤクローン４−１−ｅ．２の配列はナカノらから引用する。表２種々の年齢のＮＯＤマウスにおけるＣ９ＶＤＪ及びＶＪの細胞分配の特定のオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲ増幅による検出 Nd：未処理表３抗−イディオタイプ抗−Ｃ９応答はＮＨＣクラスＩ及びクラスＩＩにおいて制限される。生後６週のＮＯＤ雌マウスの５匹が５×１０６個のＣ９クローン細胞の腹腔内接種を受けた。９日後、膵臓が摘出され、膵臓細胞が補完された。ウェル当たり２万個の照射された（５０００ｒａｄ）Ｃ９クローン細胞又は５ μｇ／mlのＣ９ＶＤＪペプチドに対する膵臓細胞の放射応答。クラスＩ及びＩＩハプロタイプに特有なＭＭＨＣ制限モノクロナル抗体を決定するため、硫酸アンモニウムで精製されたＩｇＧ５mlが加えられた。以下の抗体が用いられた。抗 −Ｉ−Ａ：ＭＫＤ６、抗−Ｋｃ：Ｋ９−１８−１０及び抗−Ｄｂ：２８−１４− ８。疎外パーセンテージは１００として決定された（抗体存在下の１−ＳＩ／抗体不存在下のＳＩ）。好ましい実施例の詳細な説明自己免疫疾患に関連するＴ細胞は自己免疫Ｔ細胞リセプター（ＴＣＲ）を構成するために用いられる遺伝学的要因によって特徴づけられる。本発明では、前糖尿病ＮＯＤマウスより単離されたＣ９クローンによって表されるＴＣＲのα及び β鎖の配列が決定された。特にＣ９クローンは６０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）分子のペプチドエピトープ（ｐ２７７）と反応する。Ｃ９クローンはＮＯＤ糖尿病において作用的であり、活性Ｃ９細胞は糖尿病を養子伝達することができ、希釈した場合、Ｃ９は糖尿病に対するＮＯＤマウスのワクチン接種のために用いることができる（３）。Ｃ９ＴＣＲβ鎖はＶβ１２可変型（Ｖ）遺伝子セグメント及びＪβ２．５結合（Ｊ）遺伝子セグメントを含む。Ｖβ１２配列及びＪβ２．５配列は既に刊行物公知となっており、知られている（３２、３３）。従って、Ｃ９ＴＣＲβの全体のＶＤＪセグメントの配列は配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に示されており、これはＬ−Ｇ−Ｇ−Ｄセグメントを含む。Ｃ９ＴＣＲβ鎖のＶＤＪ配列は私達の全てのＮＯＤマウスに現れている。このＶＤＪ配列は生後２週間のマウスの胸腺及び生後１ヶ月のマウスの膵臓において検出可能であった。ＶＤＪ配列はインシュリン生産島においても見い出される。さらにＣ９様のＶＤＪ配列はｐ２７７ペプチドに対する能動的な免疫により誘起された糖尿病を有するＣ５７ＢＬ／６に由来する抗−ｐ２７７Ｔ細胞から単離された。興味あることには、Ｃ９様のＶＤＪ配列は異なるＶβ遺伝子セグメントに連結するように表されることができる。糖尿病遺伝子を有するＮＯＤＴ細胞クローンの公知の配列であって日本で単離され、特性がよく知られていないものはＣ９のβ鎖とアミノ酸の２つが異なるのみであることが示されている（１６）。糖尿病ヒトＴ細胞クローンは同様のＶＤＪモチーフを生ずることが知られている（２１、２２）。従って、Ｃ９ＶＤＪβ連結領域の配列はＮＯＤマウスの自然発症的な糖尿病及びヒトのそれと関連する自己免疫をＴＣＲにおいて共有し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの糖尿病を誘発することが明らかである。ＮＯＤストレインのマウスは生後１ヶ月で自己免疫性インシュリン炎を発症し、これは数カ月後に明らかなインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）になる（１）。本発明者は自己免疫性ＩＤＤＭ過程は２つの要素、６０ＫＤａ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）のｐ２７７ペプチドに対するＴ細胞の免疫性（２）及び抗−ｐ２７７Ｔ細胞を認識する抗イディオタイプＴ細胞（３）により影響されるということを発見し、既に発表している。ＮＯＤマウスにおける明白なＩＤＤＭは、ヒトｈｓｐ６０配列の位置４３７−４６０に相当するペプチドｐ２７７に対するＴ細胞の活性に依存し、Ｃ９クローンのようなｐ２７７に反応するＴ細胞クローンは高血糖症及び早期のインシュリン炎を養子伝達し、ｐ２７７ペプチドによるワクチン接種はＩＤＤＭを予防し（３）又は緩和する（４）。ペプチドｐ２７７による処理は抗−ｐ２７７免疫のダウンレギュレーションでマークされた。従って、ｐ２７７に対するＴ細胞免疫はＮＯＤ糖尿病において作用的に関連することが明らかとなった。マウス糖尿病におけるｐ２７７免疫の作用は、糖尿病でないマウスのＣ５７ＢＬ／６ストレインがＯＶＡ又はＢＳＡのようなキャリアタンパク質に結合したｐ２７７に対する免疫によってインシュリン炎及び高血糖症を誘発することを示す実験により証明される（５）。抗−ｐ２７７Ｔ細胞ラインは天然Ｃ５７ＢＬ／６マウスに糖尿病を養子伝達することが見い出されている。Ｃ９抗−ｐ２７７Ｔ細胞に応答する抗−イディオタイプＴ細胞によるＮＯＤ糖尿病の調節に関し、本発明者は、希釈されたＣ９クローンはＩＤＤＭに対するマウスのワクチン接種に用いられるということを見い出した（３）。Ｔ細胞によるワクチン接種の調節効果は、ワクチン接種されるＴ細胞のＴＣＲに関係するため（６，７）、本研究は、そのα及びβ鎖の配列を決定し、ＮＯＤマウスの種々のＴ細胞個体分中のＣ９ＴＣＲの分配を調査するため、プロトタイプの抗−ｐ２７７Ｃ９Ｔ細胞クローンのＴＣＲを対象とした。Ｃ９ＴＣＲβ鎖の特徴的なＶＤＪ配列は又ｐ２７７に応答するＣ５７ＢＬ／６マウスのＴ細胞においても研究され、他の出版されたＴＣＲ配列と比較された。これらの研究はＣ９ＴＣＲβ鎖のＶＤＪ遺伝子セグメントの配列の決定につながった（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１）。ＶセグメントのＣ−末端の３つのアミノ酸、Ｄセグメントの３つの残基及びＪセグメントの３つのＮ−末端アミノ酸（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１）を含むノナペプチドはＣ９ＴＣＲβ鎖の免疫遺伝子部分を構成するということが知られている。このペプチドはＮＯＤマウスモデルにおいて糖尿病を実質的にダウンレギュレーションすることが示されている。これはＩＤＤＭの早期の診断及びＩＤＤＭのｐ２７７処理のモニタリングのために使用されることができる。また、他の幾つかのクローンのＶＤＪ溶液もまた研究されており、このクローンも又ヒトｈｓｐ６０のｐ２７７ペプチドを認識し、糖尿病誘発性であり、進行中の糖尿病に対しＮＯＤマウスを免疫することができる。これらはＣ９として確立されているような同一のＶＤＪ配列を有することが知られている。他の細胞ライン即ちＮ４ラインは、糖尿病誘発性でもなく糖尿病に対するワクチンともならないが、Ｄ領域の３つのペプチドのうち２つが異なるという点でＣＤ９ペプチドと異なる配列を有している（Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに対してＬｅｕ−Ｔｒｐ− Ｔｈｒ）。他のＮＯＤクローン，４−１−Ｅ．２のＶＤＪ配列は近年発表され（１５），このクローンはインシュリン炎を非糖尿病性１−Ｅ遺伝子操作型ＮＯＤマウスに遺伝するということが報告された。従って、このクローンのＴＣＲβ鎖のＶＤＪ領域は自己免疫Ｔ細胞を認識するＴ細胞を活性化するため操作可能であるということが予想される。このＴＣＲβ鎖の報告された配列はＶセグメントのＣ−末端の一部分が欠落しているが、ＪセグメントのＮ−末端において同一のポリペプチドを有し、ＤセグメントにおいてＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙのポリペプチドを有する。従って、この配列はＣ９ＴＣＲβのＤセグメントにおいてＬｅｕ−Ｇｌｙのジペプチドを、ＶセグメントのＣ−末端のＡｌａ−ＳｅｒのジペプチドをＣ９ＴＣＲβ鎖と共有する。糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスの膵臓細胞由来の抗−ｐ２７７Ｔ細胞ラインのＶＤＪ領域は、これらの細胞ラインがインシュリン炎及び高血糖症を養子伝達することができるという事実に鑑み研究されている。表３に示されるように、ＶセグメントのＣ−末端及びＪセグメントのＮ−末端はＣ９と同一であり、ＤセグメントはＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４の残基４−８）である。このクローンは自己免疫Ｔ細胞を認識するので、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４のペプチドは配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１の残基４７−５５のペプチドと同一方法で使用することができる。更に、Ｌｅｕ−Ｇｌｙジペプチドは繰り返しているので、合成されたＬｅｕ−Ｇｌｙ−ＡｌａのＤセグメントは、ＤセグメントがＬｅｕ−Ｇｌｙ−ＧｌｙであるＣ９配列と同一の方法で操作することができるであろうということが予測される。従って、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１６のノナペプチドはまた本発明においても使用することができる。糖尿病誘発遺伝子であるとされるクローンのＶＤＪ領域の配列と決定されているものとそうでないものと比較に基づき、本発明の好ましい実施例は式Ｖ−Ｄ− Ｊの少なくとも７個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、上式においてＶはジペプチドＡ−Ｓを含み、Ｄは配列Ｌ−Ｇのジペプチドを含み、Ｊは配列Ｎ−Ｑ −Ｄのポリペプチドを含む。Ｄ領域は好ましくは２−５個のアミノ酸を有する。好ましくは、Ａ−Ｓのジペプチドを含むＶセグメントのポリペプチドはＤセグメントに隣接し、ＪのＮ−Ｑ−ＤのポリペプチドはＤセグメントに隣接する。本発明のペプチドは約２４個のアミノ酸を有することができる。好ましくは、Ｖセグメントの追加的なアミノ酸はＶβ１２遺伝子セグメントの配列に相当し（３２）、Ｊセグメントの追加的なペプチドはＪβ２．５セグメントに相当する（３３）。上述の好ましいペプチド残基の他、１又はそれ以上のアミノ酸が抹消され付加され又は他のアミノ酸と置換された配列であってこれに実質的に相当する配列は、これらが原ペプチドと免疫学的に交差反応し、これによって活性化されたＴ細胞が自己免疫性抗−ｐ２７７Ｔ細胞を認識し調節する限り、本発明に包含される。このようなペプチドと実質的に対応するため、本発明の好ましいペプチドのいずれかの配列の変化は比較的小さくなければならない。従って、本発明の開示されたペプチドに実質的に対応するペプチドは容易に合成され、適切な生物活性の試験に供されることができる。糖尿病をダウンレギュレートするためのワクチンとして作用するという生物学的活性のスクリーニングのために行われる最も好ましい実験は、実際にＮＯＤマウスのワクチン接種により実行されるテストであり、これによってこのようなワクチン接種が図７に示されるような実験と同一の方法で疾病を有効に予防するかどうかが試験される。臨界領域が比較的短いという事実に鑑みるに、本質的でない置換、追加及び抹消及び適切な生物活性のための生成物のスクリーニング、特に表３から収集されるモチーフ情報を参考にすることは不必要な実験ではないと考えられる。本明細書で議論されるペプチドの他、前記ペプチドと免疫学的に交差反応する能力を有するこれらの塩及び作用的誘導体もまた用いられることができる。ここで塩という用語は、カルボキシル基の塩及びタンパク質分子のアミノ基に酸が付加したもの両方を意味する。カルボキシル基の塩は当該技術分野において公知の方法により調製することができ、これは無機塩、例えばナトリウム，カルシウム、アンモニウム，鉄又は亜鉛塩又はこれと同等のもの及び有機塩基の塩、例えばアミンにより形成される塩、例えばトリエタノールアミン、アルギニン又はリシン、ピペリジン、プロカリン及びこれらと同様なものを含む。酸が付加された塩は例えば、無機酸例えば、塩酸又は硫酸及び有機酸の塩、例えば、酢酸又はシュウ酸を含む。ここで作用的誘導体は、当該技術分野において知られているようなＮ−又はＣ −残基又は残基の側鎖として生じている作用基から調製されることができる誘導体を含み、本発明においてはこれらが薬剤学的に適用可能である限り本発明に含まれる。即ち、それを含む化合物が毒性を有さず、この抗体物質の特性に好ましくない影響を与えない限り用いることができる。これらの誘導体は例えば、カルボキシル基の脂肪酸エステル、アンモニア又は第１級もしくは第２級アミンとの反応により生じるカルボキシル基のアミド、アシル化合物と形成されたアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（例えば、アルカノイル又は炭素環式アロイル基）又は遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（例えば、セリル又はトレオニル残基）を含む。本発明のペプチドの治療法的使用方法は、ＩＤＤＭを治療するためのワクチンである。免疫学的応答を誘発するため、油のような適切な免疫学的アジュバントと共に投与した場合、免疫応答が誘発され、Ｔ細胞が上昇し、これによって抗− ｐ２７７Ｔ細胞をダウンレギュレートする。患者がＩＤＤＭの前臨床的段階にある場合、本発明によるペプチドの注射することにより自己免疫性をダウンレギュレートし、かなりの恒久的な損失が生じる前に自己免疫過程を抑制する。本発明のペプチドを用いたワクチン接種は、疾病が進行がした後であっても、自己免疫過程を抑制するための治療剤として用いることができ、これはペプチドｐ２７７によるＮＯＤマウスの処理に関連して本発明者の研究室により近年示されている（４）。また、本発明はＩＤＤＭの予防又は治療のための薬剤組成物を提供し、これは薬剤学的に適用可能な担体と有効成分としての本発明によるペプチドの有効量又はこれらの塩もしくは作用的誘導体を含む。薬剤学的に適用可能な担体は不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）として知られているようなミネラルオイルのエマルジョンのようなオイル担体である。しかしながら、ＩＦＡは完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ：種々の量のマイコバクテリウムの死骸を含むミネラルオイルの調製物）と同様、ヒトに対する使用は好ましくない。なぜならば、ミネラルオイルは代謝可能なものではなく、人体により分解されることができないからである。近年、ヒト患者の静脈注射用栄養剤として長年用いられてきた特定の脂肪エマルジョンが本発明のペプチドを用いたペプチド療法の担体として機能することができるということが明らかにされている。これらのエマルジョンの二つの例はイントラリピッド及びリポファンリンとして知られている商用的に入手可能な脂肪エマルジョンである。“イントラリピッド”は静脈注射用栄養剤のための脂肪エマルジョンのスウェーデンのカビファーマ社の登録商標であり、米国特許第３，１６９，０９４号に記載されている。“リポファンリン”はドイツのビー．ブラウンネルスンゲンの登録商標である。双方とも脂肪として大豆油を含んでいる（１０００mlの蒸留水に１００又は２００ｇ：各々１０％又は２０％）。イントラリピッドでは、乳化剤として卵黄リン資質が用いられており (１２ｇ／ｌ蒸留水)、リポファンリンでは卵黄のレチシンが用いられている(１２ｇ／ｌ蒸留水)。イントラリピッド及びリポファンリンの双方において、等張性はグリセロールを加えることに起因する（２５ｇ／ｌ）。本発明のペプチドは直接投与によるワクチンとして使用する他、ＩＤＤＭ又は初期ＩＤＤＭの患者のＴ細胞を活性化するために用いることができる。従って、Ｔ細胞はＩＤＤＭ患者から取り出され、好ましくは抹消血から分離されることにより処理される。次に、このようなＴ細胞は、この発明の技術の分野における通常の知識を有する者にとって公知である方法により、本発明のペプチドとインビトロ系で接触することにより活性化される。このような特定の活性化されたＴ細胞は、Ｔ細胞が摘出された同一患者に投与され、自己免疫Ｔ細胞を抑制するように調節する。また、本発明はこのような特定の活性化されたＴ細胞の組成物を含む。このようなＴ細胞の投与は自己免疫Ｔ細胞に対する受身免疫として機能し、これによって自己免疫過程をダウンレギュレートする。本発明が有用であるというためにはＩＤＤＭを完治する必要はない。自己免疫過程のいくらかの抑制調節が得られる限り、本発明の治療用組成物及び方法は実用的有用性を有するものである。また、本発明のペプチドは、特に前臨床段階又は臨床診断の直後において、疾病を明らかにし、ＩＤＤＭの免疫学的な治療、及び特にｐ２７７治療の過程を監視することに加え、糖尿病の早期診断に有用である。問題の患者の血清が、本発明のペプチドと接触するサイトカインの存在を示す場合のように、免疫作用を増殖し或いは免疫作用を表すＴ細胞を含む場合、これは疾病の存在を示す兆候である。図４に示すように、抗−イディオタイプ抗体は本疾病の早期段階にかなり多量に存在する。さらに、患者中のこのようなＴ細胞の数の定量または準定量分析はこの抑制調節処理の有効性と関連する。このようなＴ細胞の数が多ければ多いほど治療の過程はより良好であったことを示す。従って、このような抗体の数が全時間に渡って増加する場合、治療は有効である。数が減少する場合、治療はさほど効果的でなく、このようなＴ細胞の数が増加するように改良するべきである。したがって、本発明は更にＩＤＤＭの診断及び検出さらにはその治療の過程をモニタリングする方法を含む。発明の実施の形態：物質及び方法動物ＮＯＤ／Ｌ；マウスはウイズマンインストチュウトオブサイエンスにおける動物施設において育てられた。飼育の基礎はＥ．Ｈ．レイター博士の贈与による。Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウスはＵＳＡ，ＭＥ，バーハーバーのジャクソンラボラトリーズから入手した。抗原ＯＶＡは米国，ＭＯ，セントルイスのシグマケミカル社から購入した。組換型ヒトｈｓｐ６０はユニバーシティオブユトレヒトのルールートサンデルゼー博士より提供された。合成ペプチドｐ２７７ＶＬＧＧＧＣＡＬＬＲＣＩＰＡＬＤＳＬＴＰＡＮＥＤ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：５）は標準的なフモック化学により合成され、ＣＭ１２カラム（メルクＦＲＯ）を用いた逆相クロマトグラフィーによりＨＰＬＣで精製された。配列はアミノ酸分析で確認された。ペプチドｐ２７７は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミデ（ＥＤＣ，シグマケミカル社，セントルイス，ＭＯ，ＵＳＡ）により（８）に記載されるようにＯＶＡと接合された。免疫生後６−８週のＣ５７ＢＬ／６雄マウスは、ＩＦＡ（デフコ，デトロイト，ＭＩ，ＵＳＡ）中で総量０．２mlに乳化されたｐ２７７−ＯＶＡ複合体の５０μｇが静脈注射された。マウスは免疫後２、３、４週間飼育され、血中のグルコースがベックマングルコースアナライザーＩＩ（ベックマン，パラアルト，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてテストをされた。１０時間の非絶食条件下で１１．１mmol／ｌ以上のプラズマグルコース濃度が検出された場合に高血糖症と規定される。グルコースのこの濃度は、２００匹の未処理の非糖尿病マウスで測定されたプラズマグルコース濃度の平均値より大きいという理由で高血糖の境界として選ばれた（５）。Ｔ細胞ライン前糖尿病ＮＯＤ膵臓由来のＮＯＤＴ細胞ライン及びクローンは（３）に記載されるように、組換型ｈｓｐ６０に対する応答によりインビトロ系で選択された。ＮＯＤ抗−ＯＶＡＴ細胞クローンはイギリス，ケンブリッジのアンクック博士より提供された。抗−ｐ２７７及び抗−ＯＶＡＴ細胞ラインは前述された免疫（３）の９日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのリンパ節から調製された。本発明者は、高血糖症が、ＮＯＤマウスのＣ９及び他の抗−ｐ２７７Ｔ細胞クローン（３）及びＣ５７ＢＬ／６マウスの抗−ｐ２７７Ｔ細胞ライン（５）により養子移転されることがてきるということが示された。ＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製細胞ラインＴ細胞をｐ２７７と培養することにより３日間活性化した後（３）、フィコールグラジュエントで、Ｔ細胞ブラストが収集され、細胞残骸及び副細胞から分離され、ＰＢＳで洗浄され、更に（３）に記載されるような１０％のＴ細胞増殖因子を含む培地で更に２日間培養され、これによって、カルチャが生きているＴ細胞のみを含むようにした。その後、Ｔ細胞は収集され、ＰＢＳで洗浄され、液体窒素で急速冷凍された。各々のサンプルは均質化され、全てのＲＮＡはＲＮＡｚｏｌキット（シナ／バイオテック，フェンズウッド，ＴＸ，ＵＳＡ）により抽出された。約５μｇのＲＮＡは、プライマーとしてオリゴｄＴを用いたｃＤＮＡサイクルキット（インビトロゲン、サンディェゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）の２０mlの反応中でｃＤＮＡの第１ストランドに転写された。膵臓及び胸腺膵臓及び胸腺はＮＯＤ／Ｌ雌及び雄マウス及びＣ５７ＢＬ／６雄マウスより摘出され、直ちに液体窒素で凍結された。ＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製は上述のように行われた。膵臓島膵臓島はゴトウの方法により雌ＮＯＤマウスより調製された（９）。簡単には、コラゲナーゼを胆管に注入し、胆管を結紮され膵臓が刺激された。コラゲナーゼの消化が３０−４０分間３７℃の震盪湯浴で行われ、組織が広範囲に渡ってＰＢＳで洗浄された。島は解剖顕微鏡を用いて消化物から精選され、液体窒素で凍結された。ＲＮＡ及びｃＲＮＡの調製は上述のように行われた。ＰＣＲ増幅ＶβパネルｃＤＮＡ調製物の３μｌが、ＰＣＲ緩衝液、１μＭｄＮＴＰ混合物，１μＭのＣβプライマー（オペロンテクノロジーズ，アラメダ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び２Ｕ／mlのＴａｑポリメラーゼ（ＵＳＢ，クイブランド，ＯＨ，ＵＳＡ）を含む反応混合物中に注入された。この混合物は、各々オペロンテクノジーズ（アラーメダ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した異なるＶβ特異的オリゴヌクレオチドのプライマーを含む１９の試験管に分配された。プライマーの最終濃度は１μＭであった。増幅はＤＮＡサーモサイクラー（ペルキンエルマー）中で３０サイクル行われた。サイクルの概要は以下の通りである。９４℃で６０秒間変成，５５℃で６０秒間徐冷及び７２℃で６０秒間伸長。各々の増幅反応液は２％アガロースゲル（ＦＭＣ，ロックランド，ＭＥ，ＵＳＡ）上で電気泳動され、臭化エチジュウム（シグマケミカルＣｏ．，セントルイス，ＭＯ，ＵＳＡ）で着色され、ＵＶ光で可視状態となった。ゲル中のハイブリダイゼーション（１０）がＣβに特異的な３０Ｐ−標識オリゴヌクレオチドプローブの０．５pmol／mlと共に１時間行われた。増幅生成物は、シークナーゼ（商標名）バージョンＩＩキット（ＵＳＢ）を用いてカサノバら（１１）の方法に従い直接的配列決定が行われた。Ｃ９ＶＤＪβ特異性オリゴヌクレオチドＣ９ＶＤＪβ特異性の及び他のオリゴヌクレオチドがイスラエル，エルサレム，Ｍｔ．スコップスのハダーサホスピタルのモルキュラーバイオロジーアンドゲネテックエンジニアリング部において合成された。Ｃ９ＶＤＪβ特異的オリゴヌクレオチドの配列は５′−ＴＴＡＧＧＧＧＧＴＡＡＣＣＡＡＧＡＣ−３′（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：６の塩基１０−２７）である。試験される各々のｃＤＮＡサンプルの１mlが、Ｃ９ＶＤＪβオリゴヌクレオチド及びプライマーとしてのＣβオリゴヌクレオチドを含む反応混合液に混合され、上述の方法で分析された。徐冷温度を６５℃に上げることにより高い特異性が達成された。３２ｐ−標識Ｃ９ＶＣＪβ特異性オリゴヌクレオチドが、（１０）で記載されるＰＣＲにより増幅されるＶβパネルによるゲルハイブリダイゼーションにおいてプローブとして用いられた。Ｃ９Ｖα増幅５mlのｃＤＮＡの第１ストランドの調製が、製造元（ボーエリンカー・マンハイム，ＦＲＧ）により推薦される条件下でターミナルトランスフェラーセ（ＴｄＴ）と総量５０μｌ中のｄＧＴＰの１００ｍＭを用いて３０分間行われた。１０ μｌのテーリング反応液がアッチャ−オルベアらの方法に従い（１２）、アンカーされているＰＣＲ反応に加えられた。第１のＰＣＲＣα オリゴヌクレオチドプライマー（Ｃα１）の配列は５′−ＴＧＧＣＧＴＴＧＧＴＣＴＣＴＴＴＧＡＡＧ−３′（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：７）であり、第２のＰＣＲ増幅に用いられたネストされているオリゴヌクレオチドプライマー（Ｃα２）はの配列は５′−ＣＧG ＣＡＣＡＴＴＧＡＴＴＴＧＧＧＡＧＴＣ−３′（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：８）であった。増幅生成物はｐブルースクリプトＳＫ（＋）（ストラトゲン）にクローン化されたオリゴヌクレオチドプローブ(Ｃα３) ，５′−ＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴＴＣ−３′（配列番号(ＳＥＱＩＤＮＯ)９）により検出され、シークナーゼ（商標名）バージョンＩＩキットの使用者マニュアルにしたがって配列決定された。Ｃ９ＶＪα特異性ヌクレオチド配列５′−ＡＴＧＡＧＡＧＧＧＣＣＴＡＡＴＴＡＣ−３′（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０）を有するＣ９ＶＪα特異性オリゴヌクレオチドが合成され、Ｃ９ＶＤＪβ増幅で説明したように、Ｃαにプライマーと共にＴＣＲ増幅のプライマーとして用いられた。結果Ｃ９のＴＣＲヌクレオチド配列Ｃ９ＴＣＲのα及びβ鎖のヌクレオチド配列を決定するため、Ｃ９クローンから抽出されたｍＲＮＡからｃＤＮＡが調製された。ＰＣＲ増幅は、Ｃβコンスタント領域のオリゴヌクレオチドプライマー及び２０のＶβ特定オリゴヌクレオチドプライマーの各々を用いて行われた。１９の異なるＶβ増幅反応のうち、Ｖβ２及びＶβ１２のＰＣＲ増幅の生産物のみが可視的であった（図１）。両方のＴＣＲ生産物の配列を直接的に決定した後、Ｖβ２は非生産的であることがわかった（判読フレーム外）。反対に、Ｖβ １２はフレーム内にあり、それゆえ生産的であった（表１）。 α鎖Ｖ−領域の多量の数及び可変性により、同様のパネル増幅方法を行うことができなくなった。従って、α鎖の配列を決定するため、本発明者はネストしたコンスタント領域のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ｃＤＮＡをテールしているｄＧＴＰでアンカーされているＰＣＲを用いた。Ｃ９のＶＪα配列はＭＲＧＰＮＷ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１１）であり、ＶαはＢＭＢであり（１３）、Ｊαは１６であることが判明した（１４）。他のＮＯＤＴ細胞ラインにおけるＴＣＲの使用本発明者は、Ｃ９クローンを生産するＮＯＤリンパ球の同一プール由来の他のＴ細胞ラインについて研究した。ヒトｈｓｐ６０のｐ２７７ペプチドを認識するＣ７、Ｎ１及びＮ２６ラインは糖尿病誘発性であり、進行中の糖尿病に対してＮＯＤマウスのワクチン接種することができる（３）。本発明者は、また、結核菌ｈｓｐ６５と反応するが、ヒトｈｓｐ６０とは反応せず、糖尿病誘発性でなく、糖尿病に対するワクチンとしての効果を奏しないＮ４ライン（３）、及び未処理の抗−ＯＶＡラインについても研究した。 α及びβＴＣＲ鎖のＣＤＲ３領域は各々イディオタイプ抗原決定基に貢献することができるので、本発明者はＣ９クローンのＶＪα及びＶＤＪβ領域に基づき特異的なオリゴヌクレオチドプロープを調製した。このαコンスタント領域及びＶＪαオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、本発明者は抗−ｐ２７７Ｔ細胞ラインのためだけのＰＣＲ増幅を行った。β鎖コンスタント領域及びＶＤＪβオリゴヌクレオチドプライマーは全て抗−ｐ２７７Ｔ細胞ラインであるという結果となった。しかしながら、Ｎ４ラインを示す弱い増幅バンドが検出された（図２、レーン３）。ＮＯＤ又はＣ５７ＢＬ／６マウス由来の抗−ＯＶＡラインは陰性であった（図２、レーン４及び１０）。更に分析を行なうため、本発明者はＴＣＲ増幅のため１９のＶβ特異的なβ鎖コンスタント領域のオリゴヌクレオチドのパネルを用いた。本発明者が見出した全てのＮＯＤ抗−ｐ２７７Ｔ細胞ラインにおいて、配列決定されたＶβ１２増幅がＣ９Ｖβと同一であることが示された。Ｎ４細胞ライン由来のｃＤＮＡ増幅はＶβ１１ＰＣＲ生産物を生産した。生産物の配列決定は、３ｂｐの相違点を除き、Ｃ９ＶＤＪβに類似するＶＤＪβ領域を示す生産物を表１に示すように明らかにした。Ｃ９及びＮ４のかなり類似するＶＤＪ配列は二つの異なるＶβ遺伝子の組み替え生産物であった。Ｃ９及びＮ４のＶＤＪ配列における僅かな相違は顕著に異なるＰＣＲ増幅という結果をもたらし（図２）、これはＣ９イディオタイプ抗原決定基及び関連配列のスクリーニングの手段としてのＴＣＲプライマーの有用性を示している。また、表１はナカノらにより発表されたＮＯＤクローン、４−１−Ｅ．２のβ 鎖ＶＤＪ配列を含む（１５）。このクローンはインシュリン炎を非糖尿病１−Ｅ＋遺伝子組換型ＮＯＤマウスに移転すると報告されている。しかしながら、その特異的抗原は報告されていない。４−１−Ｅ．２は、Ｃ９と同様に、Ｖβ１２、Ｊβ２．５遺伝子を表し、Ｃ９と同様なＶＤＪ配列を有するということに留意すべきである：Ｃ９−ＡＳＳＬＧＧＮＱＤ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１の残基４７−５５）、４−１−Ｅ．２−ＡＳＲＬＧＮＱＤ(配列番号(ＳＥＱＩＤＮＯ)：３)。ＮＯＤ組織におけるＣ９ＶＤＪβ及びＶＪβ配列の分配本発明者のＮＯＤコロニーにおいて、インシュリン炎は最初に生後１ヶ月当たりで明らかになる。インシュリン炎の程度は進行し、インシュリン生産性β細胞は破壊される。雌マウスは生後約３ヶ月で明らかな高血糖症が発症し、生後６ヶ月迄に実質的に全ての雌マウスは臨床的な疾病状態になりインシュリンによる治療をしなければ死亡する。雄マウスはインシュリン炎の進行の遅れを明らかに示し、約５０％が明らかなＩＤＤＭを示す。Ｃ９ＶＤＪβ再配列の存在が自己免疫疾患の進行に関連するか否かを調べるため、本発明者は生後０．５，１，２，３及び４ケ月のＮＯＤマウスの膵臓及び胸腺からｃＤＮＡを調製し、各々の月齢の５匹のマウスの器官を保存した。島は生後１及び２ヶ月のＮＯＤ雌マウスから研究した。ｃＤＮＡサンプルはＶＤＪβ又はＶＪαプライマー及び対応するコンスタント領域プライマーを用いてＰＣＲにより増幅された。ＶＪαをプライマーとして用いたＴＣＲ反応は陰性であり、ＶＤＪβをプライマーとして用いたＴＣＲは雌及び雄の双方のＮＯＤマウスにおいて増幅を生じた。この結果は表２に示される。胸腺の標本は雄及び雌の双方において全ての月齢で陽性であった。膵臓において、Ｃ９再配列は雌においては生後１ヶ月から雄においては生後２ヶ月から明らかであった。ＶＤＪβは炎症を起こしている島においても検出された。従って、Ｃ９ＶＤＪβプローブは、個々のＮＯＤマウスが共有するイディオタイプを検出すると思われる。胸腺から膵臓及び島へのＣ９ＶＤＪβ特異的なシグナルの進行は疾病過程の進行と相互関連があるように思われる。Ｃ５７ＢＬ／６の抗−ｐ２７７Ｔ細胞ラインにおけるＴＣＲβの使用ｐ２７７はＮＯＤマウスの糖尿病において一定の役割を果たすので、本発明者はこのペプチドに対する免疫が糖尿病の傾向を示さないマウスにおいて疾病を誘発するか否かを試験し、タンパク質キャリアに接合したｐ２７７がＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて高血糖症、インシュリン炎及びインシュリン自己抗体を誘発することができることを示した（５）。従って、本発明者はｐ２７７／ＯＶＡに対して免疫の糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスの膵臓細胞由来の抗−ｐ２７７Ｔ細胞ラインを確立した。このラインはマイクロタイタウェルで増殖され照射された自然発生的な膵臓細胞の存在下でｐ２７７により繰り返し刺激された。その結果生じたＴ細胞ラインはインシュリン炎及び高血糖症を養子移転するが、対象の抗 −ＯＶＡＴ細胞ラインはこれらを移転しなかった（５）。本発明者はｐ２７７で１，２，５及び６回刺激された後の抗−ｐ２７７ラインのＶβの使用を分析した。各々の刺激の後、いくつかのウェルのサンプルは分析及び更なる培養のためプールされ。上述のように、ｃＤＮＡはＶβパネル増幅のために調製され用いられた。最初の２回の刺激は実質的に全てのＶβプライマーのための生産的な増幅を生じた。５回の刺激の後の２つの明確なサンプルが制限されたＶβ使用、一方については１、２、６、７、９、他方については１、１４、１５、１６、１８を示した。６回の刺激後限定的な増幅アレー：３、５、７、８及び１１が見い出された。従って、特定のＶβはｐ２７７認識に関連していなかった。Ｃ９ＶＤＪβ及びＣβ領域のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＴＣＲ増幅は異なる刺激を受けたｃＤＮＡサンプルに行われた。図２は最初の刺激を受けた全てのサンプルにおいて陽性の増幅を示す（レーン５）。どのＶβ増幅がＣ９様のＶＤＪβ再配列を含むかを調べるため、本発明者は２回及び６回の刺激を受けたＰＣＲパネルをＣ９ＶＤＪβオリゴヌクレオチドプローブと共にハイブリダイズした。図３Ａに示されるように、第２回目の刺激においてプローブとハイブリダイズされたＶβ６，８，１１及び１６が陽性を示したが、６回の刺激(図３Ｂ)においてはＶβ８及び１１のみが陽性を示した。２回の刺激からのＶβ６増幅生成物はクローン化されそのＶＤＪ配列はＣ９ＶＤＪβに対する幾らかの同一性が見い出された（表１）。追加的に六つの未処理のＶＤＪβ配列が得られた（図示せず）。本発明者は、又、Ｃ９ＶＤＪβオリゴヌクレオチドプライマーを用い、生後２ヶ月の雄Ｃ５７ＢＬ／６及びＤＡＬＤ／Ｃマウスの胸腺及び膵臓細胞を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６の胸腺及び膵臓は陽性であった。しかしながら、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては、胸腺のみが陽性であった。ＶＤＪＴＣＲプローブの無効本研究において、糖尿病性ＮＯＤクローンＣ９のＴＣＲのα及びβ鎖をコードするＲＮＡの配列が決定され、ＶＪα及びＶＤＪβプローブが種々のＴ細胞個体群においてＣ９と関連するＴＣＲ配列を検出するために用いられた。Ｃ９ＶＤＪ βプライマーの特異性は、Ｖβ及びＣβプライマーを用いたこのオリゴヌクレオチドとβ鎖ＴＣＲ増幅の生産物とのハイブリダイゼーションにより示された。Ｃ９ＶＤＪβオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲの信頼性は、関連する標的のＴＣＲ配列を調べることにより確認された。Ｃ９ＶＤＪβプライマーと３ｄｐ（２個のアミノ酸）の相違を有するＮ４クローンは僅かなＰＣＲ生成物を生じるのみであるが、一方、３ｂｐの相違を有するクローンを含むＣ５７ＢＬ／６抗ｐ２７７ラインは（表１）より顕著なＰＣＲシグナルを与えた。しかしながら、Ｄ６クローンからの３つの非自然的なヌクレオチドは過酷な条件下でより効率的な増幅を生じるＮ４ＶＤＪβの３つのｂｐ非自然発生的なヌクレオチドよりＣ９プライマー配列の５′末端に隣接して存在する。それゆえ、本発明者は、本発明者のＣ９ＶＤＪβはＣ９配列に隣接する配列を検出するための有効なプローブであると結論することができる。ＴＣＲ（ＶＪα及びＶＤＪβ）のα及びβ鎖のＣＤＲ３セグメントはＶα及びＶβ遺伝子の３′末端と各々Ｊα及びＤＪβ遺伝子の５′末端との無作為な組換えにより生産される。この無作為さはＮ挿入、すなわち遺伝的雛型の対象とならないヌクレオチドにより強化される（１６）。ＣＤＲ３セグメントの実際的に制限されていない潜在的な可変性はＴ細胞のレパートリーの相違点を作りだす。従って、ＴＣＲ構造のモデルによれば、ＣＤＲ３セグメントはＭＨＣ分子の裂け目に存在するペプチドエピトープと接触する（１７）。また、ＣＤＲ３セグメントはＴ細胞クローンの最も個体的な特性を規定する。従って、ＣＤＲ３セグメントは標的エピトープの認識のための個人的な道具と同様に、クローンのイデオトープを構成する。ＣＤＲ３セグメントはいかなる方法でクローンが抗原を認識し、クローンが個々の細胞に認識されるかの両方の問題を決定する。一般的に共有されるＶＤＪモチーフＣ９ＶＤＪβセグメントは顕著であり個々のＮＯＤマウスは共通するように思われる。これは抗−ｐ２７７Ｔ細胞クローン及びラインと同様に、異なるＮＯＤマウスの胸腺、膵臓及び島浸潤において検出された。対照的に、Ｃ９ＶＪα配列は豊富であり、胸腺、膵臓、又は島浸潤からのＴ細胞サンプルでは検出されなかった。Ｃ９ＶＤＪβの重要性は、Ｃ５７ＢＬ／６クローンはＮＯＤマウスＶβ １２と異なるＶβ遺伝子（Ｖβ６，８，１６）であるという事実にもかかわらず、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中の抗−ｐ２７７Ｔ細胞はＴＣＲによりＶＤＪβ領域を有するいう事実によっても示唆される。Ｃ５７ＢＬ／６抗−ｐ２７７Ｔ細胞中のＣ９様ＶＤＪβセグメントの存在は、これらがＤを共有するにもかかわらず、Ｃ５７ＢＬ／６及びＮＯＤマウスが異なるＨ−２を有するというてんで、注目すべきである。異なるＭＨＣ遺伝子に関連するＶＤＪβモチーフの存在は疾病の基礎となるタンパク質に特異的なルイスラットＴ細胞及び多元性硬化症に罹患しているヒト由来のＴ細胞に共通のモチーフである（１８）。ヒトＴ細胞の抗原特異性は未知であるにもかかわらず、共通のＶＤＪβモチーフを基礎とすれば、エピトープが疾病の基礎となるタンパク質であるということが示唆される。Ｃ９ＶＤＪモチーフのヒトにおける表現異なるＮＯＤ，Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣ９ＶＤＪβ 様のセグメントの検出は、共通のＶＤＪモチーフの存在を示唆する。実際、４１ −Ｅ．２と称される別々に単離されたＮＯＤクローンは、Ｃ９のように、Ｖβ１２及びＪβ２．５を使用し、Ｃ９とかなり共通なＶＤＪ領域（ＳＲＬＧＮＱＴＴＱＹ）（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１２））を有し、これはＶＤＪ領域においてＲの位置におけるＳ及びＧの付加という点において異なっている（ＳＳＬＧＮＱＤＴＱＹ）（配列番号（ＳＥＧＩＤＮＯ）：１の残基４８−５８）相違点は下線で示す）。クローン４−１−Ｅ．２は非糖尿病性１−Ｅ．遺伝子組換型ＮＯＤマウスにおいてインシュリン産出性を移転することが示されていた（１５）。４−１−Ｅ．２クローンは島の存在下で増殖することが示されているが、このクローンによって認識される抗原についての報告は存在しない。興味深いことには、デリノビィック−ベロらは、ＳＲＬＧＮＱ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）の残基２−７）のＴＣＲＶＤＪモチーフにより糖尿病のヒトからＴ細胞クローン（Ｋ２．１２）の単利を報告した（要約参照，２１）。Ｃ９ＶＤＪβモチーフが多くの例で検出されるためには、このモチーフを生産するクローンの増幅が必要である。このような増幅は正の選択に起因するものであり、一旦Ｃ９ＶＤＪβ様の組換えが偶然生じると、ＶＤＪβを生ずるクローンは増殖される。実際、Ｃ９ＶＤＪβのマーカーは最初に胸腺で検出され、後に抹消部分で検出され、最後にＮＯＤマウスの島で検出された。インシュリン炎及び糖尿病が進行しているＮＯＤ雄マウスはＣ９ＶＤＪβマーカーを島中に有することが知られている（図示せず）。Ｃ９ＶＤＪモチーフの早期の正の選択は、比較的少量のＮ挿入ヌクレオチド（１９）、おそらくＬアミノ酸をコードする３つのｔｔａヌクレオチドのみにより支持される（表１参照）。Ｃ９ＶＤＪモチーフは作用的でありＩＤＤＭを調節することができる。胸腺でＣ９様のクローンの正の選択がされるメカニズムにかかわらず、抗−Ｃ９抗−イディオタイプＴ細胞は抹消部分において糖尿病誘発性Ｃ９様のクローンの活性を調節することができるということが明らかである。Ｃ９によるＴ細胞のワクチン接種は抗−ｐ２７７反応性をダウンレギュレートし、ＮＯＤマウスにおける糖尿病の進行を防止する（３）。更にＣ９ＶＤＪペプチドそのものに対するＮＯＤマウスの免疫は糖尿病の進行に対する抵抗性を誘発する（以下参照）。個々のＮＯＤマウスにおけるＣ９ＶＤＪβイディオタイプ抗原決定基の存在はＣ９クローンによるＴ細胞のワクチン接種が殆ど全てのＮＯＤマウスを効果的に治療することができるということを説明することができる（３）。本発明によれば、Ｃ９ＶＤＪイディオタイプに特異的な抗−イディオタイプＴ細胞はＮＯＤマウスにおけるＩＤＤＭを調節する。抗−イディオタイプＴ細胞の反応性は前糖尿病のＮＯＤマウスに存在し、糖尿病の過程が進行すると自然に下降する。Ｃ９に対するＴ細胞ワクチン接種は抗−イディオタイプ活性を活性化しＩＤＤＭを防止する。抗−イディオタイプＴ細胞ラインはＩＤＤＭに対する抵抗性を養子伝達する。イディオタイプＶＤＪペプチドによるワクチン接種は抗−イディオタイプＴ細胞の活性を上昇し、ＩＤＢＭに対する抵抗性を誘発する。抗− イディオタイプＴ細胞は前細胞中に存在する抗原を加えることなく、完全なＣ９Ｔ細胞に存在するＶＤＪイディオタイプ抗原決定基に反応することができる。このような観察結果は、抗−イディオタイプＴ細胞、これらの標的ＴＣＲエピトープ及び自己免疫疾患をコントロールする役割の自然的な存在を示す。これらの疾病の発現は、糖尿病Ｔ細胞及び調節型抗−Ｃ９ＶＤＪ抗−イディオタイプＴ細胞のバランスに依存するものと思われる。自然発生的抗イディオタイプネットワークの証明本発明者のコロニーのＮＯＤマウスは生後約１ヶ月でインシュリン炎を発現した。雌のマウスはすべて生後４ヶ月迄に真性の糖尿病に進行した。対照的に雄のマウスの約５０％のみが生後６ヶ月迄に臨床的糖尿病に進行した。したがって本発明者は、標的自己抗原であるｈｓｐ６０及び抗−ｈｓｐ６０Ｔ細胞のプロトタイプであるＣ９に対するＴ細胞の応答性を調べるため雌及び雄のＮＯＤマウスに研究した。図４は、種々の月齢において雌及び雄のＮＯＤマウスより摘出された膵臓細胞のＴ細胞増殖応答を示す。生後４週の雌のマウス（図１、上部パネル）は、検出可能なインシュリン炎の開始時点において、ｈｓｐ６０に対するＴ細胞活性を示さなかったが、Ｃ９に対しては反応した。月齢の進行とともに、Ｃ９に対する自然発症的抗−イディオタイプ反応性は下降し、一方、ｈｓｐ６０に対するＣ９様の反応性は上昇した。臨床的糖尿病の開始後、両方のタイプのＴ細胞の反応性は消失した。雄マウスにおいては（図４、下部パネル）、抗−Ｃ９抗−イディオタイプ反応性は、より感受性の強い雌よりも、下降した。Ｃ９様の抗−ｈｓｐ６０の反応性もまた後に上昇した。時間の経過とともに、抗−イディオタイプ反応性は下降したが、消失せず、抗−ｈｓｐ６０の反応性は、約半数のマウスが糖尿病にかからなかったので、適切なレベルのままであった。未処理のＮＯＤマウスにおけるこれらの結果は、自己免疫疾患の進行は抗−Ｃ９抗−イディオタイプＴ細胞と否定的に関連し、抗−ｈｓｐ６０（Ｃ９様）Ｔ細胞と肯定的に関連するということを示唆した。ＶＤＪ配列がＣ９イディオタイプであることの証明図５は抗−Ｃ９Ｔ細胞により認識されるＣ９のイディオタイプペプチドはＴＣＲβ鎖のＶＤＪペプチドであることを示す。照射されたＣ９Ｔ細胞で免疫された或いは免疫されなかった生後３ヶ月の雌ＮＯＤマウスは種々のＮＯＤ刺激性Ｔ細胞及びＶＤＪペプチド：Ｃ９、Ｎ４又は抗オバルブミン（抗−ＯＶＡ）に対するＴ細胞増殖性をテストされた。糖尿病の伝達またはこれに対するワクチン接種をできないＮ４クローンは、前糖尿病のＮＯＤマウスから単離された（３）。Ｎ４はミコバクテリアｈｓｐ６５と反応するが、ヒト又はマウスのｈｓｐ６０又はｈｓｐ６０のｐ２７７ペプチドとは反応しない。本発明者は、Ｎ４及びＣ９はβ 鎖ＶＤＪ領域において３個の核酸(２個のアミノ酸)が異なり、抗−ＯＶＡＴラインは完全に未処理のＴＣＲα及びβ鎖を表すことを示した（表１）。糖尿病のＮＯＤマウスは、これらがコントロールＴ細胞でワクチン接種されているか又はワクチン接種されていないか（図５，上部パネル）にかかわらず、Ｃ９クローン及びＣ９ＶＤＪペプチドに対する増殖反応性を示した。Ｃ９によるワクチン接種の後、Ｃ９及びＣ９ＶＤＪペプチドに対する応答のかなりの上昇があった。Ｎ４又はＮ４ＶＤＪペプチドに若しくは抗−ＯＶＡに対する反応は存在しなかった（図５，上部パネル）。完全なＣ９細胞及びそのＶＤＪペプチドに対する応答の等価性を確認するため、フラジェリン内で発現されるように遺伝子工学的な操作を受けたＣ９ＶＤＪセグメントでワクチン接種し、Ｔ細胞及び上記で使用したペプチドに対するＴ細胞の反応性をテストした。図５，下部パネルは、Ｃ９ＶＤＪペプチドと同様に、完全なＣ９細胞に対する特異的反応を上昇するということを示す。図６は、Ｃ９ＶＤＪペプチドに対するＴ細胞の応答は、Ｃ９ＶＤＪ−フラジェリン構造と同様に、オバルバミン担体（ＯＶＡ）にペプチドが接合している場合、上昇することができるということを示した。従って、種々の担体モデルが、抗イデオタイプ応答を誘発するために用いられることができる。また、ＮＯＤマウスと同様に、ＢＡＬＤ／ｃマウスは、Ｃ９ＶＤＪ−複合体に応答することができる（図６）。従って、Ｃ９ＶＤＪイディオタイプに対する応答はＮＯＤマウスに制限されていない。したがって、ＴＣＲβ鎖のＶＤＪペプチドは抗−イディオタイプＴ細胞に認識されたＣ９の免疫学的な独自性を構成する。抗−イディオタイプＴ細胞及びＶＪＤペプチドによるＩＤＤＭの処理図７は、抗−Ｃ９抗−イディオタイプＴ細胞は自然発症的糖尿病に対して保護することを示す。抗−Ｃ９Ｔ細胞（図７、上部モデル）の養子移転及びＣ９ＶＤＪ構造（図７、下部パネル）による能動的ワクチン接種は両方とも疾病の阻害に」有効であった。Ｔ細胞はＶＤＪイデオトープを与え授与するＣ９Ｔ細胞はそのＴＣＲペプチドを直接抗−Ｃ９Ｔ細胞に与える。図８に示す実験において、抗−Ｃ９Ｔ細胞はＡＰＣ及びＡＰＣを含まない生成されたＣ９Ｔ細胞から分離された。Ｃ９Ｔ細胞及び抗−Ｃ９抗−イディオタイプＴ細胞の個体群は標準的なＡＰＣ活性を表さなかった。これらの細胞は、ＯＶＡを抗−ＯＶＡＴ細胞に授与することができなかった。しかしながら、Ｃ９細胞は抗−イディオタイプ抗−Ｃ９Ｔ細胞を刺激することが見い出された。実際に、ＡＰＣをＴ細胞カルチャーに付加することによっては、Ｔ細胞の相互作用を強化せず、実際のところ減少するように思える。従って、抗−Ｃ９Ｔ細胞はＣ９それ自体により表されるＣ９β鎖ＶＤＪエピトープを認識することが明らかになる。ＶＤＪイデオトープはＭＨＣと関連するＣ９がそのＴＣＲペプチドを抗−イディオタイプＴ細胞に授与するに際し用いられる主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）要素をテストするため、本発明者は抗−Ｃ９応答をブロックするモノクロナル抗体を用いた。表３はＣ９細胞に対し抗−Ｃ９応答が上昇している結果を示す。ＡＰＣにおける完全なＣ９又はＣ９ＶＤＪに対する大部分の応答はＫｄＭＨＣ分子に特異的な抗体によりブロックされた。抗−ＩＡ抗体は又応答をブロックしたが、より少ない程度であった。Ｋｄ及びＤｂ分子はＮＯＤにおいて表されているが、Ｄｂ分子に対する抗体によっては疎外が起きなかった。従って、抗−Ｃ９抗−イディオタイプＴ細胞の反応性はＫ要素に制限されるＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩであることが明らかになった。クラスＩ及びクラスＩＩの制限はＥＡＥにおいてＴ細胞でワクチン接種された後のＣＤ４及びＣＤ８抗−イデオタイプＴ細胞の観察の結果と調和する（６）。ＣＤ４Ｔ細胞は通常ＭＨＣクラスＩＩ分子の裂け目のペプチドエピトープを認識し、ＣＤ８Ｔ細胞は通常ＭＨＣクラスＩ分子の裂け目のペプチドエピトープを認識する。従って、Ｃ９ＶＤＤペプチド又はその一部分は、ＩＡ又はＫｄ分子と関連し、Ｄｂ分子とは関連しないということが明らかとなった。イデオタイプネットワーク調節上述の結果は、抗−イディオタイプＴ細胞が人工的な介入なしに存在し、疾病の発現はイディオタイプＴ細胞と抗−イディオタイプＴ細胞間のバランスの変化に関係し、イディオタイプペプチドはＴＣＲ鎖のＶＤＪセグメントであり、イディオタイプＴ細胞は自己のイデオトープを調製抗−イディオタイプＴ細胞に授与するということを示すことにより（２０）、自然発症的な疾病における自己免疫のＴ細胞による調節の減少が明らかになる。従って、ｈｓｐ６０ｐ２７７エピトープをＣ９の共有されるＴＣＲイディオタイプペプチド、更には抗−イディオタイプ調節個体群に連結するネットワークが存在する。この自然的な抗−イディオタイプネットワークはＩ型糖尿病のＮＯＤマウスモデルにおいて特に作用的であると思われる。本明細書中に引用された参照文献は出版された雑誌、記事又は要約、又は対応する米国もしくは外国特許出願又は発行された米国又は外国特許、更には他の参照文献を含むものであるが、全体として本明細書に一体化され、これは、引用された文献中の全てのデータ、表、数値及びテキストを含む。更に、ここに引用した参照文献中で参照されている参照文献の全体の内容もまた本明細書に一体化される。公知の方法のステップ、従来の方法のステップ、公知の方法または従来の方法への参照は、本発明の説明及び実施例が関連技術において開示・教示または示唆されていることを認めるものではない。上述の実施例の説明は本発明の一般的性質を明らかにしているので、本技術の属する分野の通常の知識を適用することにより（ここに引用した参照文献の内容を含む）、不必要な実験を行うことなく、本発明の一般的な概念から離れることなく、容易に実施例の変更及び／又は応用を行うことができる。したがって、このような変更及び応用は、本明細書中における教示及び指導に基づき、実施例と均等の意味及び範囲内であると意図される。本明細書中で用いられた用語は発明の説明のためのものであり、発明を限定するものではないので、本明細書の用語は本明細書の開示及び教示を参照して、発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者の知識と組合わせることにより、通常の知識を有する者により解釈されねばならない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年７月８日【補正内容】【図５】【図７】【図８】【図９】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＹＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも７、好ましくは約７−２４個のアミノ酸残基を有し、実質的に、式Ｖ−Ｄ−Ｊの”ＶＤＪ”領域に相当するペプチド（式中、”Ｖ”は配列Ａ−Ｓのジペプチドを含み、”Ｄ”は好ましくは２−５のアミノ酸残基を有し、配列Ｌ−Ｇのジペプチドを含み、”Ｊ”は配列Ｎ−Ｑ−Ｄのトリペプチド又はこの塩若しくは作用的誘導体を含む。）。２． ”Ｖ”はトリペプチド配列Ａ−Ｓ−Ｓを含む請求項１記載のペプチド。３． ”Ｄ”はトリペプチド配列Ｌ−Ｇ−Ｇ、トリペプチド配列Ｒ−Ｌ− Ｇ又はペンタペプチド配列Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ａ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４の残基４−８）のいずれかを含む請求項１記載のペプチド。４． ”Ｖ”のジペプチド配列Ａ−Ｓは”Ｄ”に隣接するトリペプチドの一部である請求項１−３のいずれか１項に記載のペプチド。５． ”Ｊ”のトリペプチド配列Ｎ−Ｑ−Ｄは”Ｄ”に隣接している請求項１−５いずれか１項に記載のペプチド。６．前記”Ｖ”はＶβ遺伝子によりコードされるタンパク質のＣ−末端の少なくとも一部を含むＶβセグメントを含む請求項１−５のいずれか１項に記載のペプチド。７．前記ＶβセグメントのＣ−末端トリペプチド配列は配列Ａ−Ｓのジペプチドを含む請求項６記載のペプチド。８．前記セグメントはＶβ遺伝子によりコードされるタンパク質のＣ− 末端の１から約１０までのアミノ酸残基を含む請求項６記載のペプチド。９．前記Ｖβ遺伝子はＶβ６、Ｖβ８、Ｖβ１２及びＶβ１６からなる群から選択される請求項６記載のペプチド。１０．”Ｊ”はＪβ遺伝子によりコードされるタンパク質のＮ−末端の少なくとも一部を含む”Ｊβ”セグメントを含む請求項１−３のいずれか１項に記載のペプチド。１１．前記ＪβセグメントのＮ−末端トリペプチド配列はＮ−Ｑ−Ｄである請求項１０記載のペプチド。１２．前記セグメントはＪβ遺伝子によりコードされるタンパク質のＮ− 末端の１から約１０個のアミノ酸残基を含む請求項１０記載のペプチド。１３．前記Ｊβ遺伝子はＪβ２．５である請求項１０記載のペプチド。１４．配列Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｑ−Ｄ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１の４７−５５の残基）を含む約２４個までのアミノ酸残基を有するペプチド。１５．配列Ａ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｑ−Ｄ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３）を含む約２４個までのアミノ酸残基を有するペプチド。１６．配列Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｎ−Ｑ−Ｄ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４）を含む約２４個までのアミノ酸残基を有するペプチド。１７．配列Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｎ−Ｑ−Ｄ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１６）を含む約２４個までのアミノ酸残基を有するペプチド。１８．請求項１−３又は１４−１７のいずれか１項のペプチド又はその補体をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構造。１９．請求項１−３又は１４−１７のいずれか１項のペプチドを含む薬剤組成物。２０．ワクチンである請求項１９の薬剤組成物。２１．請求項１−３又は１４−１７のいずれか１項のペプチドを含む抗− ｐ２７７Ｔ細胞の認識に関与する抗−イディオタイプＴ細胞の存在を検出する薬剤。２２．検出ラベルと接合している請求項２１記載の薬剤。２３．請求項１−３又は１４−１７のいずれか１項のペプチドと第２分子とを含む複合体。２４．前記第２分子はポリペプチドである請求項２３の複合体。２５．前記第２分子は低有機分子である請求項２３の複合体２６．個体の抗−イディオタイプＴ細胞の活性を調節する方法であって、前記活性は抗−イディオタイプＴ細胞が抗−ｐ２７７Ｔ細胞を認識する能力に関連し、前記抗−イディオタイプＴ細胞の活性を調節するのに有効な請求項１−３又は１４−１７のいずれか１項記載のペプチドの一定量を個体に投与する方法。２７．前記活性が増強されている請求項２６記載の方法。２８．請求項１−３又は１４−１７のいずれか１項のペプチドをコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。２９．請求項１−３又は請求項１４−１７のいずれか１項記載のペプチドに対して同原Ｔ細胞を活性化し、これを患者に再投与するインシュリン−依存性糖尿病の予防及び治療方法。３０．請求項１−３又は請求項１４−１７のいずれか１項記載のペプチドとインビトロ系で接触することにより増殖又はサイトカイン生産性の試験を行なう対象である血清のＴ細胞の測定を行なうＩＤＤＭの診断若しくはステージングの方法、又はＩＤＤＭの治療過程の監視方法。