JP2003520606A

JP2003520606A - 癌抗原ｎｙｅｓｏ−１由来の新規ｍｈｃクラスｉｉ拘束ｔ細胞エピトープ

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Publication number: JP2003520606A
Application number: JP2001554422A
Authority: JP
Inventors: ワン、ロン−フ; エイ．ロウゼンバーグ、スティーヴン; ゼン、ガン
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2003-07-08
Anticipated expiration: 2021-01-26
Also published as: AU785151B2; EP2311950A1; US10251912B2; AU3306201A; WO2001055393A2; US20160354409A1; WO2001055393A3; US7619057B2; EP2333065B1; JP5588363B2; JP2011135874A; EP2311951A1; US20050136402A1; EP1252309A2; US8754046B2; US20140335053A1; US20100021468A1; CA2398743A1; US9447144B2; CA2398743C

Abstract

(57)【要約】本発明は、癌抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１由来の新規ＭＨＣクラスＩＩエピトープの同定及び単離を開示する。ＮＹ−ＥｓＯ−１由来の新規ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＨＬＡクラスＩＩ拘束様式で、特にＨＬＡ−ＤＲ又はＨＬＡ−ＤＰ拘束様式でＣＤ４⁺Ｔリンパ球によって認識される。遺伝子産物は、癌患者の予防、治療及び診断のための免疫治療的戦略の有望な候補である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、癌診断及び癌ワクチンを含む癌治療の領域に関する。より詳細には
、本発明は、癌ペプチドＮＹ−ＥＳＯ−１由来の新規なヒトＭＨＣクラスＩＩ拘
束Ｔ細胞エピトープ及びそのアナログ並びにＭＨＣＩＩクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エ
ピトープ又はその部分をコードするＤＮＡ配列の単離と精製に関する。特に、本
発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピ
トープに関する。本発明は更に、個体における癌及び前癌の検出、診断及び治療
の方法に関する。

【０００２】発明の背景Ｔ細胞は、腫瘍増殖を制御し、腫瘍退行を媒介するのに重要な役割を果たす。
Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫の分子的基盤を理解するために、ＣＤ８⁺Ｔ細胞によって
認識される多くの腫瘍抗原が、メラノーマや他の種類の癌で同定されてきた（１
〜３）。これらの研究は、分子的に明確な腫瘍抗原由来のペプチドを用いる幾つ
かの臨床試験に至った（４〜７）。ｇｐ１００由来の修飾ペプチドを用いる臨床
試験は、転移性メラノーマの患者の治療に対し治療的効力の幾分かの証拠をもた
らしたが（４）、これらの研究は主にＣＤ８⁺Ｔ細胞の使用に焦点をあてていた
。ヒト及び動物研究の両方からの証拠の増大は、最適の癌ワクチンがＣＤ４⁺及
びＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方の参加を必要とすることを示した（８，９）。更に、腫
瘍特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ陰性腫瘍細胞に対する防御免疫を
産生するのに必要とされる（１０，１１）。それ故、このような抗原の同定は、
癌ワクチンの開発及びＣＤ４⁺Ｔ細胞が宿主免疫応答を制御する機構を我々が理
解するために重要である。

【０００３】今までに、ほんの限られた数のＭＨＣクラスＩＩ拘束腫瘍抗原が同定された。
チロシナーゼ、ｇｐ１００及びＭＡＧＥ−３などの幾つかの公知のＭＨＣクラス
Ｉ拘束腫瘍抗原は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞によって認識されるＭＨＣクラスＩＩ拘束エ
ピトープを含むことが示された（１２〜１５）。腫瘍特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞を用
いて、未知のＭＨＣクラスＩＩ拘束腫瘍抗原を同定するために、最近、遺伝的ア
プローチが開発された。これは、ＣＤＣ２７、ＴＰＩ及びＬＤＦＰを含む幾つか
の変異腫瘍抗原の同定に至った（１６，１７）。それらのうち、ＴＰＩは、生化
学的アプローチによって独立に同定された変異抗原である（１８）。

【０００４】ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子は、抗体スクリーニングによって以前に同定され（１
９）、最近、ＭＨＣクラスＩ拘束腫瘍抗原としても同定された（２０，２１）。
ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する高力価の抗体がまた、癌患者から検出された（２２）
。ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃＤＮＡは、２つの重複するオープンリーディングフレー
ム由来の２つの遺伝子産物をコードしていた（２０）。正常精巣での発現を除く
その厳密な腫瘍特異的発現パターン、並びにメラノーマ、乳癌、前立腺癌、肺癌
及び他の癌を含む多くの腫瘍での高頻度の発現（１８，２０，２３）の故に、Ｎ
Ｙ−ＥＳＯ−１は、種々の癌タイプに対する免疫治療の開発のための重要な免疫
標的の可能性がある（２４）。

【０００５】ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＣＴＬ及び抗体免疫応答の両方が癌患者で示された
が、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質におけるＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトー
プは報告されなかった。

【０００６】本発明は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞によって認識されるＮＹ−ＥＳＯ−１由来の新規な
ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの同定と単離である。本発明の癌エピト
ープは、哺乳動物において癌を阻害又は予防する免疫原及びワクチンとして有用
であり、癌又は前癌を検出する診断薬として有用である。

【０００７】発明の概要本発明の１つの目的は、ＣＤ４⁺Ｔリンパ球によってＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ
細胞エピトープとして認識される新規ペプチド及びその部分を提供することであ
る。本発明の抗原性癌ペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１（本明細書ではＣＡＧ−３
と交換可能に使用される用語）遺伝子（配列番号１）（Genbank登録番号 AF0385
67; 8:9）内もしくは部分によって、又はその変異体もしくはホモログ（例えば
、ＬＡＧＥ遺伝子）（Genbank登録番号 AJ223040, AJ223041及びAJ223093）内も
しくは部分によってコードされる。

【０００８】本発明の１局面は、癌の進展及び転移からレシピエントを防御するＣＤ４⁺Ｔ
リンパ球を誘発できる癌ワクチンとして有用である、ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子に
よってコードされるＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体であ
る。本発明はまた、癌の阻害又は予防のために、あるいはＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝
子産物を発現している細胞の増殖を阻害するために、有効量の癌ワクチンを投与
する方法に関する。

【０００９】本発明の１局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子によってコードされるＨＬＡ−Ｄ
Ｒ及びＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ、又はその変異体及びホモログである
。これらは、ＣＤ４⁺Ｔリンパ球及び抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体応答を誘発でき、
次いで、癌の進展からレシピエントに防御及び／又は治療的利益を提供し、かつ
転移からの防御を提供する免疫原及び癌ワクチンとして有用である。本発明はま
た、癌を阻害又は予防し、ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子産物を発現している細胞の増
殖を阻害し、かつ転移を阻害するために、有効量の癌ワクチンを投与する方法に
関する。

【００１０】本発明の別の局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エ
ピトープ又はその変異体を単独で、又は１つ以上の免疫刺激分子と組み合わせて
含む医薬組成物である。医薬組成物は、腫瘍及び癌に対する免疫応答を誘発する
ために、少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピ
トープを含むか、又はＮＹ−ＥＳＯ−１抗原特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞を刺激するエ
ピトープの組み合わせを含む。医薬組成物は、ＣＤ８⁺Ｔリンパ球の産生のため
に、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来の１つ以上のＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープを
更に含んでもよい。ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープと
ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープは各々、別のエピトープ
として提供されてもよいし、又は一緒に結合されて、マルチマーの形態で提供さ
れてもよい。癌エピトープ又はその変異体は、癌の予防又は治療のために、免疫
原又はワクチンとして提供されてもよい。医薬組成物は、哺乳動物の癌を治療又
は予防する方法に有用である。治療方法において、医薬組成物は、哺乳動物の癌
を予防又は阻害する有効な量において哺乳動物に投与される。

【００１１】本発明の別の局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＨＬＡ−ＤＲ及び／又はＨＬＡ
−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体を単独で、又は１つ以上の免疫刺激
分子と組み合わせて含む医薬組成物である。医薬組成物は、腫瘍及び癌に対する
免疫原反応を誘発するために、少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ拘束Ｔ細胞エピトープ又は少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＰ
拘束Ｔ細胞エピトープ、又はＮＹ−ＥＳＯ−１抗原特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞を刺激
するＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの組み合わせを含む。医薬組成物は
、ＣＤ８⁺Ｔリンパ球の産生のために、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来の１つ以上のＭＨ
ＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープを更に含んでもよい。ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬ
Ａ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ又はＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞
エピトープ、及びＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープは各
々、別個のエピトープとして提供されてもよいし、一緒に結合されてもよい。癌
エピトープ又はその変異体は、癌の予防又は治療のために、免疫原又はワクチン
として提供されてもよい。医薬組成物は、哺乳動物における癌の治療又は予防の
方法において有用である。治療方法において、医薬組成物は、哺乳動物の癌の予
防又は阻害のためにＣＤ４⁺Ｔ細胞及び／又は抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体応答を誘
発するのに有効な量において哺乳動物に投与される。

【００１２】本発明の別の目的は、ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子、その部分又はホモログに由来
するＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体
をコードしているＤＮＡ配列の翻訳によって、同上を製造する方法である。

【００１３】本発明の別の目的は、ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子、その部分又はホモログに由来
するＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープもしくはＨＬＡ−Ｄ
Ｐ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそれらの変異体又は誘導体をコードしているＤＮＡ
配列の翻訳によって、同上を製造する方法である。

【００１４】本発明の更なる局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ
Ｉ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体をコードする単離されたＤＮＡ又はＲＮ
Ａ配列、及びそれらの相補配列、並びにワクチンとしての該ＤＮＡ又はＲＮＡ配
列の使用、及びＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又は
その変異体の製造方法における該ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の使用である。本発明は
更に、プローブ、プライマー又はアンチセンスとしての使用のために、該ＤＮＡ
又はＲＮＡ配列のオリゴヌクレオチドを提供する。

【００１５】本発明の更なる局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトー
プ、ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ、又はそれらの変異体及びそれらの組み
合わせをコードする単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ配列、並びにＮＹ−ＥＳＯ−１
のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ、ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ、又
はそれらの変異体及びそれらの組み合わせの製造方法における該ＤＮＡ又はＲＮ
Ａ配列の使用である。本発明は更に、プローブ、プライマー又はアンチセンスと
しての使用のために、該ＤＮＡ又はＲＮＡ配列のオリゴヌクレオチドを提供する
。

【００１６】本発明は更に、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ
細胞エピトープ又はその変異体をコードする核酸配列のみを含むか、又は少なく
とも１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列を組み合わせて含むベク
ターを提供する。

【００１７】本発明は更に、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束細胞エ
ピトープ又は少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそれらの
変異体若しくは組み合わせをコードする核酸配列のみを含むか、又は少なくとも
１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列を組み合わせて含むベクター
を提供する。

【００１８】本発明はまた、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束細
胞エピトープ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列のみを含むか、又は少なく
とも１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列を組み合わせて含むベク
ターによってトランスフェクトされた、又は形質導入された宿主細胞を提供する
。ベクター及び宿主細胞は、ワクチンとして役立ちうる。ワクチンにおいて、Ｍ
ＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの発現により、ワクチンで免疫化した哺乳
動物において腫瘍抗原特異的ＣＤ４⁺Ｔリンパ球の刺激が生ずる。

【００１９】本発明はまた、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束細胞エ
ピトープ又は少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそれらの
変異体若しくは組み合わせをコードするＤＮＡ配列のみを含むか、又は少なくと
も１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列を組み合わせて含むベクタ
ーによってトランスフェクトされた、又は形質導入された宿主細胞を提供する。
ベクター及び宿主細胞は、ワクチンとして役立ちうる。ワクチンにおいて、ＨＬ
Ａ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ及び／又はＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープの
発現により、ワクチンで免疫化した哺乳動物において腫瘍抗原特異的ＣＤ４⁺Ｔ
リンパ球の刺激が生ずる。

【００２０】本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそ
の変異体の検出により、哺乳動物における癌又は前癌の診断方法を提供する。

【００２１】本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ及び／又は
ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそれらの変異体の検出により、哺乳動物
における癌又は前癌の診断方法を提供する。

【００２２】ヒト前腫瘍性及び腫瘍性細胞及び組織の診断方法を提供することは、本発明の
更に別の目的である。本発明によれば、この方法は、ヒトから細胞、組織、又は
その抽出物を単離し、そしてＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エ
ピトープ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はそれらの部
分を検出するか、又はＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列によって発現されたエピト
ープ若しくはその変異体を検出することを含む。ここで、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配
列又は発現産物の増大の検出／増大は、前腫瘍及び腫瘍の指標となる。

【００２３】ヒト前腫瘍性及び腫瘍性細胞及び組織の診断方法を提供することは、本発明の
更に別の目的である。本発明によれば、この方法は、ヒトから細胞、組織、又は
その抽出物を単離し、そしてＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピト
ープ又はＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそれらの変異体をコードするＤ
ＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はその部分を検出するか、又はそれらのＤＮＡ配列も
しくはＲＮＡ配列によって発現されたエピトープ若しくはその変異体若しくは組
み合わせを検出することを含む。ここで、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列又は発現産物
の増大の検出／増大は、前腫瘍及び腫瘍の指標となる。

【００２４】本発明の別の目的は、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ
拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列の１つ以上のコピ
ーをそのゲノムに組み込んだトランスジェニック動物を提供することである。Ｄ
ＮＡ配列の組み込みにより、エピトープの発現又は過剰発現が生じる。このよう
なトランスジェニック動物は、癌の治療に有用な治療薬のスクリーニングのため
に有用である。

【００２５】本発明の更に別の目的は、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ
拘束Ｔ細胞エピトープ又は少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ
又はそれらの変異体又は組み合わせをコードするＤＮＡ配列の１つ以上のコピー
をそのゲノムに組み込んだトランスジェニック動物を提供することである。ＤＮ
Ａ配列の組み込みにより、エピトープの発現又は過剰発現が生じる。このような
トランスジェニック動物は、癌の治療に有用な治療薬のスクリーニングのために
有用である。

【００２６】本発明の更に別の局面は、治療薬としての使用に関する、並びに診断及び検出
アッセイにおける使用に関する、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細
胞エピトープ又はその変異体と反応性のあるモノクローナル、ポリクローナル及
び組換え抗体である。モノクローナル及びポリクローナル抗体は、単独でキット
の形態で、又は診断及び検出アッセイで通常使用される他の試薬と一緒にキット
の形態で提供されてもよい。

【００２７】本発明の更に別の局面は、治療薬としての使用に関する、並びに診断及び検出
アッセイにおける使用に関する、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エ
ピトープ又はＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープと反応性のあるか、あるいはＨ
ＬＡ−ＤＰ分子との組み合わせにおいてＨＬＡ−ＤＰエピトープと、又はＨＬＡ
−ＤＲ分子との組み合わせにおいてＨＬＡ−ＤＲエピトープと反応性のあるか、
あるいはそれらの変異体と反応性のあるモノクローナル、ポリクローナル及び組
換え抗体である。モノクローナル及びポリクローナル抗体は、単独でキットの形
態で、又は診断及び検出アッセイで通常使用される他の試薬と一緒にキットの形
態で提供されてもよい。

【００２８】発明の詳細な説明本発明は、免疫系のＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４⁺Ｔリンパ球によって免疫学
的に認識されるＮＹ−ＥＳＯ−１の癌エピトープ、その部分、誘導体又は変異体
を包含する。本発明の癌エピトープは、免疫系のＣＤ４⁺Ｔ細胞との相互作用に
よって、体液性媒介免疫応答を特異的に引き起こす。抗原性癌エピトープとＣＤ
４⁺Ｔ細胞とのこの相互作用は、ヒトを含む哺乳動物における癌の予防、除去、
又は減少において、ＣＤ４⁺Ｔ細胞が抗原性癌エピトープに反応し、免疫系の他
の細胞をリクルートすることを引き起こす。

【００２９】本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、原発
性もしくは転移性メラノーマ、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝癌、非ホジキ
ンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頚癌、膀胱癌、腎癌、頭
部及び頚部癌、神経芽腫及び腺癌（例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、甲
状腺癌など）を含むが、それらに限定されない癌の一部を形成するか、又はそれ
らの癌に由来する。

【００３０】メラノーマという用語は、メラノーマ、転移性メラノーマ、メラノサイト又は
メラノサイト関連母斑細胞由来のメラノーマ、悪性メラノーマ、黒色上皮腫、黒
色肉腫、インサイチュメラノーマ（melanoma in situ）、表在拡大型メラノーマ
、結節型（nodular）メラノーマ、悪性ほくろ性メラノーマ、末端性ほくろ性メ
ラノーマ、浸潤性メラノーマ又は家族性非定型奇胎及びメラノーマ（familial a
typical mole and melanoma）（ＦＡＭ−Ｍ）症候群を含むが、それらに限定さ
れない。

【００３１】癌、特にメラノーマの患者の自己ＣＤ４⁺Ｔリンパ球によって認識される癌エ
ピトープ又はその誘導体は特に興味深い。ＭＨＣ（又はＨＬＡ）クラスＩＩ拘束
ＣＤ４⁺Ｔリンパ球、特にＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔリンパ球及び／又はＨＬＡ−ＤＰ
拘束Ｔリンパ球によって認識される癌エピトープ又はその誘導体は更に興味深い
。一実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ癌エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲ分子の状況にお
いてＣＤ４＋Ｔリンパ球によって認識される。別の実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ
癌エピトープは、ＨＬＡ−ＤＰ分子の状況においてＣＤ４＋Ｔリンパ球によって
認識される。

【００３２】本発明の「癌エピトープ」は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束及びＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔリン
パ球などのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔリンパ球を誘発するＮＹ−ＥＳＯ−１の部分
又は変異体部分を包含する。このようなリンパ球は、腫瘍細胞に由来する完全長
ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ、及び天
然でプロセスされた抗原と特異的に反応しうる。

【００３３】本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、サイ
ズにおいて約９アミノ酸乃至約３０アミノ酸、好ましくは、長さにおいて約１０
乃至約１５アミノ酸に変わりうる。

【００３４】好適な実施態様では、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細
胞エピトープは、長さにおいて約９乃至１０アミノ酸である。

【００３５】一実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピト
ープは、アミノ酸配列：Ｘａａ₁ＫＥＦＴＶＳＸａａ₂（配列番号４）及びその変
異体又は誘導体を含む、長さにおいて少なくとも約１０アミノ酸のペプチドであ
る。Ｘａａ₁及びＸａａ₂のアミノ酸、及びＮ末端及びＣ末端でのこれらの位置に
おけるアミノ酸数は、エピトープが、ＣＤ４⁺Ｔリンパ球に結合し、刺激する能
力を保持するかぎり、変わりうる。エピトープは、約１０乃至約３０アミノ酸、
好ましくは２０アミノ酸未満、より好ましくは約１０乃至約１５アミノ酸を含み
うる。

【００３６】本発明の別の実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞
エピトープは、式：Ｘａａ₁ＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＸａａ₂（配列番号５）（式中
、Ｘａａ₁はアミノ酸ではないか、又は１乃至約１０個の天然のアミノ酸であり
、好ましくは１乃至約５個のアミノ酸である；Ｘａａ₂はアミノ酸ではないか、
又は長さにおいて１乃至約７個のアミノ酸である）によって表されることができ
る。

【００３７】本発明の別の実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞
エピトープは、アミノ酸配列：ＱＤＡＰＰＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩ
ＬＴＩＲＬ（配列番号６）又はそのフラグメント若しくは誘導体を含む。

【００３８】また、本発明の範囲には、配列番号４、５又は６と部分配列相同性を有する癌
ペプチド又はその部分が包含される。部分アミノ酸配列相同性とは、配列番号４
、５又は６と少なくとも８５％の配列相同性、好ましくは、少なくとも９５％の
配列相同性又はそれ以上を有し、かつＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束
特異的ＣＤ４⁺Ｔリンパ球を刺激するという生物学的機能を有するペプチドを意
味する。哺乳動物ホモログは、霊長類及びマウスホモログを含むがそれらに限定
されない本発明の範囲に含まれる。

【００３９】一実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピト
ープは、アミノ酸配列：ＡＰＰＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬ（配列番号７）；ＡＰＰＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳ（配列番号８）；ＡＰＰＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶ（配列番号９）；ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１０）；ＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１１）；ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１２）；ＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１３）；ＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１４）；ＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲ（配列番号１５）；ＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬ（配列番号１６）；ＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬ（配列番号１７）；ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩ（配列番号１８）；又はそれらの変異体若しくは誘導体を含む。

【００４０】好適な実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エ
ピトープはアミノ酸配列：

【００４１】

【数１】

【００４２】及びその変異体若しくは誘導体を含む。

【００４３】上記配列内に置換を有するエピトープは、本発明に包含される。置換アミノ酸
により、配列番号１９と比較して等価な又は増大した結合が生じるならば、天然
に存在するアミノ酸の置換は、１個以上のアンカー位置でありうる。配列番号１
９のアンカー位置は、位置１−Ｌｅｕ、位置４−Ｇｌｕ、位置６−Ｔｈｒ、位置
７−Ｖａｌであると予測される。一実施態様では、アラニンは、位置１でロイシ
ンの代わりに置換される。

【００４４】本発明の別の実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ
細胞エピトープは、アミノ酸配列：ＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬＳＬＬ
Ｍ（配列番号２０）、又はその部分、変異体及び誘導体を含む。一実施態様にお
いて、配列番号２０の部分はアミノ酸配列：ＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬＳ（配列番号２９）；ＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱ（配列番号３０）；ＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ（配列番号３１）又はそれらの変異体及び誘導体を含む。

【００４５】本発明の別の実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ
細胞エピトープは、アミノ酸配列：ＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ（配列番号２１）その部分、変異体及び誘導体を含む。一実施態様では、配列番号２１の部分は、
アミノ酸配列：ＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ（配列番号３２）；ＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ（配列番号３３）；ＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱ（配列番号３４）；又はそれらの変異体及び誘導体を含む。

【００４６】ＮＹ−ＥＳＯ−１癌エピトープ及びその誘導体は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ
４⁺Ｔリンパ球によって認識される。ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープと組み合わせ
て認識されるクラスＩＩ分子としては、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬ
Ａ−ＤＲ４及びクラスＩＩペプチド結合の縮重のために機能する他のクラスＩＩ
分子などの少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲが挙げられるが、それに限定されない
。一実施態様では、癌ペプチドによって認識されるＨＬＡサブタイプは、ＨＬＡ
−ＤＲ４サブタイプである。別の実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１癌エピトープ
は、ＨＬＡ−ＤＲ１及びＨＬＡ−ＤＲ４と結合する。

【００４７】別の実施態様では、エピトープは、以下：Ｘａａ₁ＩＴＱＸａａ₂ＦＸａａ₃ＰＸａａ₄（配列番号５１）（式中、Ｘａａ₁は、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、
Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ及びそれらの組み合
わせからなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ₂は、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、Ｃｙｓ
、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、及びそれらの組み合わせからなる群から選
択されるアミノ酸であり；Ｘａａ₃は、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、Ｌｅｕ
、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、及びそれらの組み合わせ
からなる群から選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ₄は、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、Ｖａｌ
、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、及びそれらの組み合わせからなる
群から選択されるアミノ酸である）の一般的なアミノ酸モチーフを含む、ＮＹ−
ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープである。

【００４８】また、配列番号５１と部分配列相同性を共有する癌ペプチド又はその部分は、
本発明の範囲に包含される。部分アミノ酸配列相同性とは、配列番号５１と少な
くとも８５％の配列相同性、好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性又はそ
れ以上を有し、かつＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束特異的ＣＤ４⁺Ｔ
リンパ球、好ましくはＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔリンパ球を刺激するという生物学的機
能を有するペプチドを意味する。哺乳動物ホモログは、霊長類及びマウスホモロ
グを含むがそれらに限定されない本発明の範囲に含まれる。ホモログはまた、Ｌ
ＡＧＥ遺伝子などのＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子以外の遺伝子によってコードされう
る配列番号５１と配列相同性を有するペプチドを含む。

【００４９】上記配列内に置換を有するエピトープは、本発明に包含される。置換アミノ酸
により、配列番号５１と比較して等価な又は増大した結合が生じるならば、天然
に存在するアミノ酸の置換は、１個以上のアンカー位置でありうる。配列番号５
１のアンカー位置は、位置１、７、及び９、即ち、それぞれＷ、Ｌ、及びＶ残基
であると推定される。これらのアンカー残基の置換は、「Ｗ」残基の代わりにＦ
、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｖ及びＡ；「Ｌ」残基の代わりにＦ、Ｙ、Ｍ、Ｖ、Ｉ及びＡ；「
Ｖ」残基の代わりにＹ、Ｉ、Ａ、Ｌ及びＰでありうるが、それらに限定されない
。別の置換は、配列番号１の５位としてＣ残基を含みうるが、それは、残基Ｓ、
Ｖ、Ａ及びＴでありうるが、それらに限定されない。

【００５０】一実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ
は、アミノ酸配列：Ｘａａ₁ＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＸａａ₂（配列番号５２）及び
その変異体又は誘導体を含む、長さで少なくとも約１０アミノ酸のペプチドであ
る。Ｘａａ₁及びＸａａ₂は、アミノ酸ではないか、又は１つ以上の同じ、又は種
々の天然に存在するアミノ酸でありうる。エピトープがＣＤ４⁺Ｔリンパ球、特
にＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４⁺Ｔリンパ球と結合／及びそれらを刺激する能力を保
持するかぎりは、Ｎ末端及びＣ末端でのこれらの位置でのアミノ酸の数は変りう
る。エピトープは、約１０乃至約３０アミノ酸、好ましくは２０アミノ酸未満、
より好ましくは約１０乃至約１５アミノ酸を含みうる。

【００５１】一実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープは、
アミノ酸配列： 151-SCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSG-177（配列番号５３）； SLLMWITQCFLPVF（配列番号５４）； LLMWITQCFLPVFL（配列番号５５）； LMWITWCFLPVFLA（配列番号５６）； MWITQCFLPVFLAQ（配列番号５７）； WITQCFLPVFLAQP（配列番号５８）； ITQCFLPVFLAQPP（配列番号５９）； QQLSLLMWITQCFL（配列番号６０）； QLSLLMWITQCFLP（配列番号６１）； LSLLMWITQCFLPV（配列番号６２）；及びそれらの誘導体を含む。

【００５２】ＮＹ−ＥＳＯ−１癌エピトープ及びその誘導体は、ＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４⁺
Ｔリンパ球、及びその誘導体、好ましくはＨＬＡ−ＤＰ４拘束ＣＤ４⁺Ｔリンパ
球によって認識される。ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープと組み合わせて認識される
クラスＩＩ分子としては、ＨＬＡ−ＤＰ及びクラスＩＩペプチド結合の縮重のた
めに機能するクラスＩＩ分子を含む。癌ペプチドによって認識される好適なＨＬ
Ａサブタイプは、ＨＬＡ−ＤＰＢ１^*０４０１−０４０２対立遺伝子及び機能縮
重のために、該ペプチドに結合しうる他の対立遺伝子である。

【００５３】本発明の別の実施態様は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４⁺Ｔリンパ球を誘発す
るように有効に作用するために、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細
胞エピトープに十分な相同性を有する該エピトープの誘導体及び変異体を包含す
る。このようなペプチドは、１つ以上の位置、特にアンカー位置で保存的アミノ
酸変化を有しうる。保存的アミノ酸変化とは、特定の位置での、元々存在した同
じタイプのアミノ酸でのアミノ酸の変化、即ち、疎水性アミノ酸の代わりに交換
された疎水性アミノ酸、塩基性アミノ酸の代わりに塩基性アミノ酸などを意味す
る。このようなアミノ酸変化は、ペプチドの全体の電荷やコンフィギュレーショ
ンを有意には変えず、それ故、このような変異体は、癌ペプチドの抗癌活性を維
持するか、又は増大させる。このような保存的変化の例は、当業者に周知であり
、本発明の範囲内である。

【００５４】本発明はまた、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの
機能的に等価な変異体に関する。「機能的に等価な変異体」としては、部分配列
相同性を有するペプチド、１つ以上の特異的な保存及び／又は非保存的アミノ酸
変化を有するペプチド、ペプチド結合体、キメラタンパク質、融合タンパク質及
びペプチドが挙げられる。

【００５５】本発明の別の局面は、ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞及びＨＬＡクラスＩ拘束ＣＤ８ ⁺ Ｔリンパ球の両方、特にＨＬＡ−Ａ拘束Ｔリンパ球、好ましくはＨＬＡ−Ａ２
拘束Ｔリンパ球のためのエピトープとして機能するＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドで
ある。一実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束及びＨＬＡクラス
Ｉ拘束エピトープとしては、アミノ酸配列：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配
列番号５４）並びにその変異体及びホモログが挙げられる。変異体としては、Ｒ
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶ（配列番号６３）を含むＥＳＯｐ１５６Ｒ−１６９
及びＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＲ（配列番号６４）を含むＥＳＯｐ１５７−１
７０Ｒを含むがそれらに限定されない、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番
号５４）における１つ以上の置換を有するペプチドが挙げられるがそれらに限定
されない。このような置換は、ネイティブ配列の免疫学的機能活性を保持しつつ
、ペプチドを水溶液により可溶性にする。高度に水溶性のペプチドは９０％超の
純度まで容易に精製されうる。

【００５６】ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、初代（primar
y）臨床単離体、細胞株などからのような天然源から精製単離できる。ＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、少なくとも９０％純粋、
好ましくは少なくとも９５％純粋及びほぼ１００％純粋である。エピトープは、
当業界公知の化学合成又は組換えＤＮＡ技術によっても得ることができる。化学
合成の技術は、J.M.Steward and J.D.Young, “Solid Phase Peptide Synthesis
”, W.H.Freeman & Co., San Francisco, 1969； M.Bodansky et al “Peptide
Synthesis”, John Wiley & Sons, Second Edition, 1976，及びJ.Meienhofer,
“Hormonal Proteins and Peptides”, Vol.2, p.46, Academic Press, New Yor
k, 1983 及びE.Schroder and K.Kubke, “The Peptides", Vol.1, Academic Pr
ess, New York, 1965に記載されている。

【００５７】ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、当業界公知の方法に
よって、医薬として許容できる担体と共に医薬組成物へと製剤化できる。本組成
物は、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球を誘発するために免疫原とし
て有用であり、そして抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を誘発するのに有用でありうる。
本組成物はまた、癌を予防又は治療するためのワクチンとして有用である。本組
成物は更に、少なくとも１つの免疫刺激分子を含みうる。ＭＨＣクラスＩＩ特異
的Ｔ細胞応答を刺激するために、癌エピトープ又はその部分と一緒に使用される
免疫刺激分子としては、１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ
分子、又はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している細胞が挙げられるがそれらに限
定されない。本組成物は、免疫増強のために、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−
１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２など、並びにＩＬ−１〜
ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｉ
ＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、Ｉ−３０９、ＰＦ−４、ＩＰ
−１０、ＬＤ−７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、又はそれらの組
み合わせを含むがそれらに限定されないサイトカインなどを含む他の刺激分子を
更に含んでもよい。

【００５８】刺激分子は、物理的に分離した実体として提供され得るか、又はＢ細胞、マク
ロファージ若しくは樹状細胞などの抗原提示細胞の膜中に提供され得るか、リポ
ソームの膜中に提供され得るか、又は形質導入若しくはトランスフェクトされた
細胞の表面上に発現され得る。ＭＨＣクラスＩＩ免疫刺激分子のＤＮＡ配列は、
GenBankなどから入手できる。ＨＬＡ−ＤＰ免疫刺激分子のＤＮＡ配列は、GenBa
nk/EMBL/DNA Data Bank of Japan(DDBJ) at GenBank, National Center for Bio
technology Information, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894 USA 又は
そのウエブサイトから入手できる。

【００５９】本発明の医薬組成物は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＲ又はそのＨＬＡ−Ｄ
Ｐ拘束Ｔ細胞癌ペプチドに加えて、ＮＹ−ＥＳＯ−１からの幾つかの異なるＭＨ
ＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを含んでもよい。これらには、ＬＰＶＰＧＶ
ＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１０）、ＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴ
（配列番号６５）、ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ（配列番号６６）、
及びそれらの組み合わせなどのＨＬＡ−ＤＲ拘束エピトープ及びその変異体が挙
げられるがそれらに限定されない。

【００６０】本発明の医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４⁺Ｔリンパ球を誘発する
ことに加えて、ＭＨＣクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球を誘発するために、Ｍ
ＨＣクラスＩ拘束ＮＹ−ＥＳＯ−１癌ペプチドを必要に応じて含んでもよい。Ｍ
ＨＣクラスＩ拘束ＮＹ−ＥＳＯ−１癌ペプチドとしては、式：Ｘａａ₁Ｘａａ₂Ｘａａ₃ＧＰＧＧＧＡＰＸａａ₄（配列番号２２）（式中、Ｘａａ₁は、アミノ酸ではないか、又は１乃至約２０個の天然のアミノ
酸、好ましくは１乃至５個のアミノ酸であり；Ｘａａ₂は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＡｒｇであり；Ｘａａ₃は、Ｓｅｒ、又はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒなどの保
存的置換であり；Ｘａａ₄は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、好ましくはＡｒｇ）並びにそれらのフラグメン
ト及び誘導体によって表される癌ペプチドが挙げられるがそれらに限定されない
。一実施態様では、医薬組成物で使用されるＭＨＣクラスＩ拘束ＮＹ−ＥＳＯ−
１癌ペプチドとしては、アミノ酸配列：ＡＳＧＰＧＧＧＡＰＲ（配列番号２３）
が挙げられる。

【００６１】ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ及びＮＹ−ＥＳＯ
−１ＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープは各々、別個のエピトープとして提
供されてもよいし、単一ペプチドとして一緒に結合されてもよい。エピトープは
、当業界公知の方法によって、一緒に結合されてもよいし、化学的に合成されて
もよい。化学リンカー、ペプチドリンカー、ペプチド結合などは、エピトープを
結合するために使用できる。一実施態様では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープのＣ
末端は、ペプチド結合により、ＭＨＣクラスＩエピトープのＮ末端に直接結合さ
れる。

【００６２】ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、癌の予防又は
治療方法において有用であり、そしてヒトを含む哺乳動物における癌又は前癌を
検出するための診断アッセイにおいて有用である。診断アッセイにおいて、本発
明のＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープペプチド、その
変異体及び誘導体は、腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するヘルパー免疫応答を検
出するのに有用である。ＮＹ−ＥＳＯ−１は腫瘍細胞（免疫が特別免除された部
位である正常精巣を除く）に専ら発現されるので、該タンパク質に対する免疫応
答は、患者において早期の癌の検出のための指標として使用できる。ヘルパーＴ
細胞応答の発展は、該タンパク質に対して検出できる抗体の発展よりも早い出来
事でありうるので、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ
ペプチドに対するヘルパーＴ細胞応答の検出は、早期の癌の検出に有用である。
ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するヘルパーＴ細胞応答の検出方法において、ＮＹ−ＥＳ
Ｏ−１ＨＬＡクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープペプチドは、基板又は固体支持
体に適用される。患者からのリンパ球は、インフルエンザウイルス由来のペプチ
ドなどのコントロールペプチドと並行して、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩ
Ｉ拘束Ｔ細胞エピトープペプチドの存在下で生育される。次いで、ＥＬＩＳＰＯ
Ｔ及びＥＬＩＳＡなどの技術を用いて、特異的なサイトカイン放出を測定する。
陰性コントロールと比較した、ヘルパーＴ細胞免疫応答の増大の検出は、患者に
おける前癌又は早期の癌の指標となる。

【００６３】本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束結合ペプチドは、任意の一
定の標的抗原及び／又はハプテンに対する抗体及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答の
産生を増大させるために使用できる。詳細には、これらのペプチドは、抗体及び
／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答が意図される標的抗原ペプチド、タンパク質又は任意
の他のハプテンに対して結合又は共有結合することができる。任意の標的ハプテ
ン又はタンパク質とのＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束エピトープペプ
チドの結合は、破傷風トキソイド、アルブミンなどの通常のＴ細胞癌タンパク質
と同様に、任意の標的抗原、ハプテン、又はタンパク質の免疫原性の増大におい
て、免疫学的Ｔ細胞キャリアペプチドとして作用するはずである。増大は、標的
ハプテン又はタンパク質に対するより高力価の抗体、ＩｇＭからＩｇＧ又はＩｇ
Ａ抗体へのイムノグロブリンクラススイッチング、及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応
答の誘発において明白でありうる。このような標的抗原、ハプテン又はタンパク
質の例としては、ＴＲＰ２、ＧＰ１００、ＴＲＰ１、ｇｐ１２０及び他のＨＩＶ
抗原、マラリア抗原、それらのエピトープなどが挙げられるがそれらに限定され
ない。同様に、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束エピトープをコードす
る核酸配列は、標的抗原又はそのエピトープへの免疫原性を増大させるために、
標的抗原又はそのエピトープをコードする核酸配列と共に、操作されたワクチン
構築物に組み込まれることができる。この局面に関する例としては、クラスＩＩ
エピトープの核酸配列を、標的遺伝子とフレームを合わせて、裸のＤＮＡもしく
はＲＮＡ、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルスなどの形態の任
意のワクチン構築物に組み込むことが挙げられる。例えば、プラスミドワクチン
の形態のＴＲＰ２抗原の免疫原性を増大させるために、ＮＹ−ＥＳＯ−１クラ
スＩＩエピトープの核酸配列は、ＴＲＰ２遺伝子と同じオープンリーディングフ
レームにおいて融合されることができる。次いで、ＴＲＰ２のみをコードするプ
ラスミドを用いる代わりに、患者を免疫化するためにハイブリッドプラスミドが
使用される。

【００６４】癌エピトープ又はその変異体は、放射性標識、ビオチン、フルオレセインなど
の他の成分が結合している誘導体の形態でありうる。特異的な器官、腫瘍、又は
細胞型への特異的ターゲティングを可能とするターゲティング剤をエピトープに
結合させることもできる。このようなターゲティング剤は、ホルモン、サイトカ
イン、細胞レセプターなどでありうる。エピトープは、単独で、又は他の試薬と
組み合わせて、キットの形態で製造できる。

【００６５】本発明の別の局面は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束エピ
トープを用いて、癌に対する腫瘍特異的体液性媒介免疫を誘導するのに有用な免
疫原又はワクチンである。免疫原及びワクチンは、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ
４＋Ｔリンパ球及び抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を誘発する。必要に応じて、免疫原
及びワクチンは、ＣＤ８⁺Ｔリンパ球を誘発するために、ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｍ
ＨＣクラスＩ拘束エピトープを含んでもよい。

【００６６】癌免疫治療へのアプローチは、能動又は受動カテゴリーに分けることができる
。能動免疫治療は、腫瘍に対する免疫応答を増大させる試みにおいて、癌患者に
対する癌抗原による直接的な免疫化を含む。受動免疫治療は、直接的に抗腫瘍応
答を媒介するという目標をもって、抗腫瘍反応性を有する免疫細胞又は抗体など
の免疫試薬の投与を指す。

【００６７】能動免疫治療における大部分の従来の試みは、免疫応答を刺激できる量と形態
で腫瘍抗原を含むという期待をもって、完全な癌細胞又は癌細胞抽出物のいずれ
かを用いた。しかし、癌抗原とエピトープの分子的同定は、ヒト癌の治療に関す
る免疫治療を開発するための新しい可能性を有する。これらのアプローチの幾つ
かの要約を表１に示す。

【００６８】

【表１】

【００６９】少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ特異的Ｔ細胞エピトー
プをコードする遺伝子の、E.coli、酵母又はバキュロウイルスなどの高効率発現
系への挿入は、免疫化において使用するための精製腫瘍エピトープを大量に得る
機会を提供する。あるいは、イムノドミナントエピトープは、インビトロで容易
に合成でき、そして免疫化のために、単独で、又はアジュバントとの組み合わせ
、脂質／リポソームもしくはヘルパーペプチドとの結合などの免疫原性を増大さ
せるために意図された形態で大量に精製でき、あるいは、抗原提示細胞にパルス
することもできる。ＭＨＣクラスＩＩ抗原への結合効率を増大させるための、イ
ムノドミナントペプチドの個々のアミノ酸の修飾は、ネイティブタンパク質と比
較して、免疫原性を増大させる可能性を有しうる。

【００７０】筋肉内又は皮膚内に直接注射される「裸の」ＤＮＡを用いる最近の技術は、コ
ードされた抗原に対し細胞免疫応答と体液性免疫応答の両方を生じさせることが
示されている（Cooney,E.L., A.C.Collier, P.D.Greenberg, R.W.Coombs, J.Zar
ling, D.E.Arditti, M.C.Hoffman, S.L.Hu, 及び L.Correy, 1991, Lancet 337:
567； Wolff,J.A., R.W.Malone, P.Williams, W.Chong, G.Acsadi, A.Jani, 及
び P.L.Felgner, Science 247:1465； Davis,H.L., R.G.Whalen, 及び B.A.Deme
niex, 1993, Hum.Gene.Ther. 4:151； Yang,N.S., J.Burkholder, B.Roberts, B
.Martinelli, 及び D.McCabe, 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:9568； Will
iams,R.S., S.A.Johnston, M.Riedy, M.J.DeVit, S.G.McElligott, 及び J.C.Sa
nford, 1991,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:2726； Fynan,E.R., Webster, D.H.F
uller, J.R.Haynes, J.C.Santoro, 及び H.L.Robinson, 1995, Proc.Natl.Acad
.Sci. USA 90:11478； Eisenbraum,M.D., D.H.Fuller, 及び J.R.Haynes, 1993,
DNA and Cell Bio. 12:791； Fuller,D.H. 及び J.R.Haynes, 1994, AIDS Res.
Hum.Retrovir. 10(11):1433； Acsadi,G., G.Dickson, D.R.Love, A.Jani, F.S.
Walsh, A.Gurusinghe, J.A.Wolff, 及び K.E.Davies, 1991, Nature 352:815）
。非生存ＤＮＡベクターを用いる技術は、製造の容易さと投与の安全性という利
点を有する。本発明の核酸配列は、癌に対する免疫原として、及びＤＮＡワクチ
ンとして有用である。ＮＹ-ＥＳＯ-１ＭＨＣクラスＩＩ特異的Ｔ細胞エピトー
プの本発明の核酸配列、又は１つ以上の変異体ＮＹ-ＥＳＯ-１ＭＨＣクラスＩ
Ｉ拘束Ｔ細胞エピトープを有する完全長ＮＹ-ＥＳＯ-１タンパク質をコードする
核酸配列は、癌細胞に対する体液性反応を誘発させる量で、遺伝子銃を用いて投
与できる。ナノグラム量がこのような目的のために有用である。

【００７１】免疫化の有効な形態は、免疫原性分子をコードする遺伝子の、ＢＣＧ、サルモ
ネラ又はリステリアなどの組換え細菌への、又はワクシニア、鶏痘、又はアデノ
ウイルスなどの組換えウイルスへの組み込みを含む。ＮＹ-ＥＳＯ-１ＭＨＣク
ラスＩＩ特異的Ｔ細胞エピトープをコードする遺伝子は、単独で、又は免疫刺激
分子をコードする遺伝子もしくは感染後に免疫応答を増大させることができる他
の遺伝子と組み合わせて発現させることができる。構築物は、更なるＮＹ-ＥＳ
Ｏ-１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ及び／又は少なくとも１つのＮ
Ｙ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩ特異的Ｔ細胞エピトープをコードする遺伝子を
更に含んでもよい。

【００７２】マウスモデルでのモデル腫瘍抗原についての研究は、インターロイキン−２（
ＩＬ−２）又はＢ．７．１の遺伝子の組み込みが、モデル腫瘍エピトープの免疫
原性を増大でき、これらのエピトープを担う樹立された肺転移の退行を媒介さえ
できることを示した。能動免疫治療、次いでＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、
ＩＬ−１２又はＩＬ−１５などの免疫刺激サイトカインの外来性投与はまた、免
疫応答を改善するために使用できる。

【００７３】ヒト腫瘍抗原を認識できる遺伝子的に修飾された免疫細胞による受動免疫治療
（通常、養子免疫治療と言われる）は、転移性メラノーマの選択された患者にお
ける癌の退行を媒介するのに有効である。抗原提示細胞上に存在する腫瘍抗原イ
ムノドミナントエピトープに対しヒトリンパ球をインビトロで感作するインビト
ロ技術が開発された。反復性のインビトロ刺激によって、ヒト腫瘍抗原をコード
する遺伝子をクローンするために使用されたＴＩＬよりも、これらの抗原を認識
するずっと大きな能力をもった細胞が得られる。このように、癌ペプチドによる
反復性のインビトロ感作によって、ＴＩＬの５０乃至１００倍の能力をもったリ
ンパ球を得ることができる。これらの細胞の養子移転（adoptive transfer）は
、従来の増殖したＴＩＬよりも、インビボで腫瘍退行を媒介するのに有効であり
うる。

【００７４】一実施態様において、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、ＤＲ４−ＩＥトランスジ
ェニックマウスの免疫化後、同定された幾つかの候補ＤＲＢ１^*０４０１ペプチ
ドで刺激された。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、合成ペプチドＥＳ
Ｏｐ１６１−１８０によるインビトロ感作で産生された。このＣＤ４⁺Ｔ細胞株
は、ＨＬＡＤＰ４（コーカソイドの約４３〜７０％に存在する優勢なＭＨＣク
ラスＩＩ対立遺伝子（５２））によって提示されるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを
認識した。更に、ＨＬＡＤＰ４ハプロタイプは、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対し高力
価のＡｂを産生するメラノーマ患者の９１％（１１人のうち１０人）が有してい
たが、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性腫瘍を有し、検出可能なＡｂをプロセシングしない
３人の患者では発現されなかった。インビトロ刺激の結果は、ＨＬＡＤＰ−４
拘束Ｔ細胞が、ＮＹ−ＥＳＯ−１Ａｂを有する６人の患者のうち５人の患者か
ら産生できることを示した。これらの結果は、ＤＰ４の状況において、ＣＤ４⁺
Ｔ細胞によるＮＹ−ＥＳＯ−１の認識は、この抗原に対し抗体応答を開始するこ
れらの患者の能力と関連しうることを示唆した。

【００７５】癌の予防又は阻害の方法において、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束
Ｔ細胞エピトープは、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、腹腔内、クモ膜下、胸膜
腔内、子宮内、直腸、膣、局所、腫瘍内などを含むがそれらに限定されない幾つ
かの経路の１つを介し投与できる。

【００７６】投与は、経粘膜又は経皮膚手段によってされてもよい。経粘膜又は経皮膚投与
のために、透過すべきバリアに適切な浸透剤が製剤において使用される。このよ
うな浸透剤は一般的に当業界公知であり、例えば、経粘膜のための胆汁塩及びフ
シジン酸誘導体が挙げられる。更に、界面活性剤が透過を容易にするために使用
されうる。経粘膜投与は、例えば、鼻腔スプレー、又は坐剤によってされ得る。
経口投与の場合、癌ペプチド、腫瘍抗原、その部分又は変異体が、カプセル、錠
剤及びトニック（tonic）などの通常の経口投与形態に製剤化される。

【００７７】一般的に、レシピエントに、レシピエントの体重１ｋｇ当たり少なくとも約１
ｎｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｍｇ、より好ましくは体重１
ｋｇ当たり少なくとも約１０ｍｇ又はそれ以上のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラ
スＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの投与量を提供することが望ましい。体重１ｋｇ当
たり約１ｍｇ乃至約１００ｍｇの範囲が好適であるが、より低い又はより高い投
与量も投与できる。投与量は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ特異的ＣＤ
４⁺Ｔリンパ球のクローナル増殖（clonal expansion）をプライムし、刺激し、
及び／又は引き起こすのに有効であり、次いで、それは、レシピエントの癌の予
防又は阻害をすることができる。

【００７８】投与は、少なくとも１回行われ、またボーラス又は連続的投与として与えられ
ることができる。数週間乃至数ヶ月の期間での複数回の投与は好ましくありうる
。その後の投与は、示されたように投与されうる。

【００７９】治療方法において、ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを含む
ワクチンは、哺乳動物において癌を予防するのに有効な量、又は局所的な癌を有
する哺乳動物において転移を予防するのに有効な量で哺乳動物に投与される。必
要に応じて、ワクチンは、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激するために、複数の異な
るＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ及び／又はＮＹ−
ＥＳＯ−１クラスＩ拘束癌ペプチド又はエピトープを含みうる。

【００８０】腫瘍を有する動物における腫瘍負荷を減少させる方法において、本方法は、腫
瘍負荷の部位にＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの有
効量を投与することを含み、該量は、該部位で腫瘍のサイズを減少させるのに有
効であり、かつ腫瘍部位からの転移を阻害しうる。

【００８１】治療方法の別の実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細
胞エピトープを含む免疫原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４⁺Ｔ
リンパ球と抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を誘発するのに有効な量で哺乳動物に投与さ
れる。免疫原は、単独で、又はアジュバント、免疫調節剤などと組み合わせて提
供されうる。

【００８２】治療の別の方法において、自己リンパ球又は腫瘍浸潤リンパ球が、癌患者から
得られうる。リンパ球は、培養で増殖され、そして癌エピトープ特異的ＣＤ４⁺
リンパ球は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ単独の
存在下で、又はサイトカインの少なくとも１つの免疫刺激分子と組み合わせての
存在下で、培養することによって増殖される。次いで、エピトープ特異的ＣＤ４ ⁺ リンパ球は、患者の癌を減少又は除去するのに有効な量において、単独で、又
はエピトープと組み合わされて、注入によって患者に戻される。

【００８３】免疫化後、ワクチンの効力は、抗体力価、特異的な溶解活性、特異的サイトカ
イン産生、腫瘍退行、又はこれらの組み合わせによって評価されるように、ＮＹ
−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩＴ細胞エピトープを認識する免疫細胞の産生
によって評価されうる。免疫化される哺乳動物が既に癌又は転移性癌に罹患して
いるならば、ワクチンは、免疫調節剤（例えばＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０
、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、インターフェロン、腫瘍壊死因子など）、シスプラ
チナムなどの化学療法剤、ガンシクロビルなどの抗ウイルス剤、アンホテリシン
Ｂ、抗生物質などのような他の治療と共に投与されうる。

【００８４】本発明の別の局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピト
ープをコードするＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子のＤＮＡ配列である。

【００８５】一実施態様では、ＤＮＡ配列は、ＣＤ４⁺Ｔリンパ球によって認識されるＭＨ
ＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする配列番号１又は２の部分及びそ
の機能的に等価な配列変異体を含む。また、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピト
ープをコードする配列番号１又は２の部分と相補的な核酸配列及び反相補的な核
酸配列も本発明に包含される。

【００８６】一実施態様では、ＤＮＡ配列は、配列番号４〜２１又は２９〜３４の少なくと
も１つを含むＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする。

【００８７】別の実施態様では、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮ
Ａ配列は、以下：ＣＡＧＧＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＴＧＣＣＡＧＧＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＣＣＧＡＣＴＣ（配列番号２４）又はその機能性部分又は変異体を含む
。

【００８８】別の実施態様では、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮ
Ａ配列は、以下：ＡＧＡＣＣＡＣＣＧＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴ（配列番号２５）又はその機能性部分
又は変異体を含む。

【００８９】別の実施態様では、ＤＮＡ配列は、以下：ＴＧＧＡＴＣＡＣＧＣＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＧＣＣＣＧＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＧＣ（配列番号２６）又はその機能性部分
又は変異体を含む。

【００９０】本発明の別の局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞エ
ピトープをコードするＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子のＤＮＡ配列である。

【００９１】一実施態様では、ＤＮＡ配列は、ＣＤ４⁺Ｔリンパ球によって認識されるＨＬ
Ａ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする１つ以上の配列番号５１〜６４及び
その機能性等価配列変異体をコードする核酸配列を含む。ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細
胞エピトープをコードする核酸配列と相補的及び反相補的な核酸配列も本発明に
包含される。

【００９２】包括的な暗号（generic code）の縮重に起因して、ＤＮＡ配列の変異により、
等価なＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープの翻訳がなされよう。結果として、置換によ
って、ＮＹ−ＥＳＯ−１癌抗原ＨＬＡ−クラスＩＩ拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞によって
認識されるＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープの発現が生じる限り、置換は本発明の範
囲に含まれる。

【００９３】ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子に由来するオープンリーディングフレームＤＮＡ配列
の全て又は部分は、他の哺乳動物種におけるＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩ
Ｉ拘束Ｔ細胞エピトープのホモログを同定、単離するために、プローブとして使
用できる。一実施態様では、ヒトｃＤＮＡ配列は、マウスホモログ核酸配列のた
めに哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用される。陽
性クローンを選択し、配列決定する。ｃＤＮＡライブラリーが合成できる組織源
の例としては、真皮、表皮、固形腫瘍、メラノーマ、メラノサイトなどが挙げら
れるがそれらに限定されない。当業者は、ホモログを検出するのに使用される適
切なハイブリダイゼーション条件を理解しよう。ライブラリーの核酸ハイブリダ
イゼーション構築のための通常の方法及びクローニング技術は、Sambrook et al
, (eds)(1989)“Molecular Cloning. A Laboratory Manual” Cold Spring Harb
or Press, Plainview, New York； Ausubel al(eds) “Current Protocols in M
olecular Biology”(1987), John Wiley and Sons, New York, New Yorkに記載
されている。

【００９４】本発明の別の局面は、癌を有する哺乳動物から単離された生物学的サンプルに
おける本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを転
写するＲＮＡの検出と定量のための核酸プローブである。コントロールＲＮＡサ
ンプルに対するＲＮＡレベルの変化は、哺乳動物における該疾病の診断や予後に
有用である。

【００９５】一実施態様では、ｍＲＮＡは、癌又は前癌を有すると疑われる患者の組織から
得られ、そして健康なコントロール患者由来のｍＲＮＡと比較される。コントロ
ールと比較した場合、患者における本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩ
Ｉ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするｍＲＮＡの定量的及び／又は定性的増大は
、患者における癌又は前癌の指標となる。ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡとハイブリダイ
ズできるオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出できる。

【００９６】本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコード
する配列に基づくオリゴヌクレオチド対の組み合わせは、選択されたＲＮＡ配列
を増大させる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）方法を用いて、
生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡを検出するためのＰＣＲプライマーとして使
用できる。本発明はまた、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピ
トープをコードするＤＮＡとＲＮＡの検出のためのインサイチュＰＣＲとインサ
イチュＲＴ−ＰＣＲを包含する。標的核酸のコピー数が非常に小さいとき、又は
核酸の異なる形態を区別しなければならないとき、該技術は好適である。該方法
は、正常細胞から前癌細胞及び癌細胞を検出し、区別するのに特に有用である。

【００９７】本発明はまた、ｍＲＮＡ上のある相補（「センス」）領域と結合し、ＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１の合成阻害に至るアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。このよ
うなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１２乃至約２５モノヌクレオチドの
１本鎖核酸であり、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エ
ピトープをコードする配列に対しアンチセンスである。このようなアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、Molecular Biology and Biotechnology R.A.Meyers（編
VCH Publishers,Inc., New York, NY, 1995, pp.38-44のUhlmann,E.ら, Antise
nse oligonucleotides, structure and function に記載のように、当業界公知
の方法によって製造できる。

【００９８】本発明はまた、少なくとも１つ以上のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘
束Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを包含する。ベクタ
ーは、１つ以上の変異体ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピト
ープを有する完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み
うる。必要に応じて、ベクターはまた、少なくとも１つの免疫刺激分子をコード
するＤＮＡ配列を含んでもよい。ベクターはまた、少なくとも１つ以上のＮＹ−
ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡ配列を含
んでもよい。ベクターはまた、細胞や組織におけるＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣク
ラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの局在を検出するのに使用される緑色蛍光タンパ
ク質をコードする遺伝子を含んでもよい。

【００９９】真核発現ベクターとしては、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベ
クター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベ
クター、バキュロウイルスベクター、ヒトパピローマウイルスベクター、ウマ脳
炎ベクター、インフルエンザウイルスベクターなどが挙げられるがそれらに限定
されない。

【０１００】本発明は、遺伝子、そのフラグメント又は変異体のオープンリーディングフレ
ーム核酸配列によってコードされた少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣ
クラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを発現する新規組換えウイルスを包含する。組
換えウイルスはまた、少なくとも１つの免疫刺激分子を発現してもよい。組換え
ウイルスは、哺乳動物、特にヒトにおける癌の予防又は治療の目的のために、哺
乳動物において体液性免疫応答を誘発又はアップレギュレートできる。

【０１０１】組換えウイルスに感染した宿主細胞は、１つ以上のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣ
クラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを単独で、又は少なくとも１つの免疫刺激分子
と組み合わせて発現する。宿主細胞はまた、ＨＬＡクラスＩＩ分子を発現する組
換えウイルスに感染されてもよい。

【０１０２】組換えワクシニアウイルスベクターから外因性遺伝子産物を構築、発現する方
法は、Perkusら Science 229:981-984, 1985； Kaufmanら Int.J.Cancer 48:900
-907,1991； Moss Science 252:1662,1991； Smith及びMoss Bio Techniques No
v/Dec, p.306-312,1984；並びに米国特許第4,738,846号に開示されている。Sutt
er及びMoss（Proc.Nat'l Acad Sci. U.S.A. 89:10847-10851,1992）及びSutter
ら（Virology 1994）は、本発明でウイルスベクターとして使用できる非複製組
換えアンカラウイルス（ＭＶＡ，修飾ワクシニアアンカラ）のベクターとしての
構築と使用を開示する。Baxby及びPaoletti（Vaccine 10:8-9, 1992）は、本発
明のウイルスベクターとして使用のための、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス
及び他のトリ種を含む非複製ポックスウイルスのベクターとしての構築と使用を
開示する。

【０１０３】本発明のベクターは、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピト
ープの発現のために適切な宿主細胞中に置かれうる。真核宿主細胞株としては、
ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、昆虫細胞、樹状
細胞などの抗原提示細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。必要に応じ
て、宿主細胞はまた、刺激分子を発現してもよい。宿主細胞が、少なくとも１つ
のＭＨＣ（又はＨＬＡ）クラスＩＩ分子と組み合わせてＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨ
ＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの両方を発現する場合、真核発現系は、適切
なグリコシル化を可能にするように使用されるのが好ましい。宿主細胞による癌
エピトープと免疫刺激分子の両方の発現は、抗原認識、及び抗原特異的Ｔ細胞の
増殖又はクローナル増殖において助けとなるように、特異的Ｔ細胞に必要なＭＨ
ＣクラスＩＩ拘束ペプチドを提供し、Ｔ細胞に適切なシグナルを提供する。全体
としての結果は、免疫系のアップレギュレーションである。免疫応答のアップレ
ギュレーションは、癌又は前癌細胞の増殖の阻害のための、癌抗原特異的ＣＤ４ ⁺ リンパ球の増加及び体液性免疫の他のエフェクター細胞の増加によって明白と
なる。

【０１０４】ＤＮＡは、当業界公知の方法によるトランスフェクション、形質導入、リポソ
ームなどによって宿主細胞に挿入できる（Sambrook et al, 1989, “Molecular
Cloning A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor press, Plainview, New
York）。リポソームの場合、Nabel,E.G.et al, 1992, Hum.Gene.Ther. ３:367-2
75； Nabel,G.J. et al, 1992, Hum.Gene.Ther. 3:649-656； Stewart,M.J. e
t al 1992, Hum.Gene.Ther. ３:399-410； Nabel,G.J. et al 1993 Proc.Natl. Acad.Sci.USA 90:11307-11311；及びHarrison,G.S. et al 1995 Bio Techniques 19:816-823に開示のように、カチオン性脂質が好ましく、例えば、中性リン脂
質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と複合した、ポリ
カチオン性脂質であるジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシ
エチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）が好ましい。

【０１０５】宿主細胞によって発現される組換えＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束
Ｔ細胞エピトープは、当業界公知の標準的タンパク質精製方法によって細胞溶解
液又は細胞上清から精製できる。これらとしては、分子ふるいクロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点フォーカシング、ゲル電気泳動、ア
フィニティクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣなどが挙げられるがそ
れらに限定されない（Ausubel et al, 1987, Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley and Sons, New York, NY）。イムノアフィニティクロマト
グラフィーも、イムノアフィニティ剤として、本明細書記載の抗癌タンパク質抗
体又はその抗原結合フラグメントを用いて精製のために使用できる。

【０１０６】組換えウイルスはまた、治療薬又はワクチンとして使用できる。このような使
用において、より低い、又はより高い投与量も投与できるが、レシピエントに、
哺乳動物１ｍｇ当たり約１０⁵乃至約１０¹⁰プラーク形成ユニットの範囲におけ
る組換えウイルスの投与量を提供することが望ましい。

【０１０７】組換えウイルスベクターは、メラノーマなどの癌の如何なる証拠の前に、又は
メラノーマなどの癌に罹患した哺乳動物における該疾病の退行を媒介するために
、哺乳動物に導入できる。哺乳動物にウイルスベクターを投与する方法の例とし
ては、エキソビボで細胞を組換えウイルスに曝すこと、又は冒された組織内に組
換えウイルスを注入すること、又はウイルスの静脈内、皮下、皮内、筋肉内など
への投与が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、組換えウイルスベク
ター又は組換えウイルスベクターの組み合わせは、癌病巣中への直接的注入、又
は適切な医薬として許容できる担体中での局所適用によって、局所投与されるこ
とができる。問題の核酸配列を担持する組換えウイルスベクターの量は、ウイル
ス粒子の力価に基づく。免疫化のための好適な範囲は、哺乳動物、好ましくはヒ
ト当たり約１０⁵乃至１０¹⁰ウイルス粒子である。

【０１０８】本発明は、少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞
エピトープをコードするＤＮＡ配列の１つ以上のコピーをゲノム中に組み込まれ
たトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニック動物作出の一般的方
法は、Krimpenfortら，米国特許第5,175,384号、Leder ら，米国特許第5,175,38
3号、Wagnerら，米国特許第5,175,385号、Evansら，米国特許第4,870,009号、及
びBernsら，米国特許第5,174,986号に記載されている。遺伝子の組み込みにより
、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの過剰発現、発現
の変化、又はＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープのマル
チプル形態もしくは変異体の発現が生じる。得られるトランスジェニック動物は
、癌の進行又は本発明の腫瘍抗原の研究において有用である。動物モデルは、癌
治療のためのワクチンや化学療法剤をスクリーニングするのに有用である。トラ
ンスジェニック動物はまた、癌の進行の研究において有用である。

【０１０９】本発明は更に、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピ
トープによる免疫化によって誘発される抗体又は抗原結合部分を含む。ＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープがほんの数個のアミノ酸から
なる場合、エピトープは、抗体応答を誘発するために、キャリアタンパク質に結
合されてもよい。ＫＬＨ、破傷風トキソイド、アルブミンなどのキャリアタンパ
ク質及び結合方法は、当業界公知である。抗体は、インタクトなＮＹ−ＥＳＯ−
１タンパク質及びＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の天然のプロセスされた形態と同
様に、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープに対
する特異性を有し、それらと反応もしくは結合する。

【０１１０】典型的な抗体分子は、インタクトなイムノグロブリン分子、実質的にインタク
トなイムノグロブリン分子、又は抗原結合部位を含むイムノグロブリン分子のこ
れらの部分（Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）₂、ヒト化キメラ抗体、
及びＦ（ｖ）のような当業界公知のイムノグロブリン分子の部分を含む）である
。ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、当業界公知の方法によって製造で
きる（Kohler and Milstein (1975) Nature 256,495-497； Burdonら（編）(198
5) “Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, Vol.
13, Elsevier Science Publishers, アムステルダム中のCambell “Monoclonal
Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and H
uman Hybridomas”）。抗体又は抗原結合フラグメントはまた、遺伝子工学によ
って製造できる。重鎖及び軽鎖遺伝子両方の発現のための技術は、ＰＣＴ特許出
願公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４２４、Huse et al(1989)Scienc
e 246:1275-1281及び米国特許第4,946,778号の主題である。１つ以上の相補的決
定領域を有するヒト化イムノグロブリン及び該抗体の製造方法は、米国特許第５
，５８５，０８９号及び第５，５３０，１０１号に開示されている。

【０１１１】一実施態様において、本発明の抗体は、生物学的サンプルにおけるＭＨＣクラ
スＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを含むＮＹ-ＥＳＯ-１ペプチド又は部分を検出する
イムノアッセイで使用される。抗体又はその抗原結合フラグメントは、癌に冒さ
れた哺乳動物からの組織生検サンプル中で、癌ペプチドを検出するために使用さ
れることができる。病気の組織内でのＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束
Ｔ細胞エピトープの評価は、哺乳動物での病気の悪化を予測するために使用でき
るか、又は治療の効力を診断しうる。イムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ
、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、化学発
光アッセイ、免疫組織化学アッセイなどであり得、そしてインビトロ、インビボ
、又はインサイチュで行うことができる。ＥＬＩＳＡについて当業界公知の標準
的技術は、“Methods in Immunodiagnosis”（第２版）, Rose及びBigazzi（編
）, John Wiley & Sons, 1980； Campbellら，“Methods and Immunology”, W.
A.Benjamin, Inc., 1964；及びOellerich,M. 1984, J.Clin.Chem.Clin.Biochem.
22:895-904に記載されている。免疫組織化学の通常の方法は、Harlow及びLane(
編)(1988) “Antibodies A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, New York； Ausbelら(編)(1987) Current Protocols In M
olecular Biology, John Wiley and Sons (New York, NY)に記載されている。こ
のような検出アッセイのために適切な生物学的サンプルとしては、細胞、組織生
検材料、全血、血漿、血清、痰、脳脊髄液、胸膜液、尿などが挙げられるがそれ
らに限定されない。

【０１１２】本発明の抗体又は抗原結合フラグメントはまた、免疫治療でも使用できる。抗
体又はその抗原結合フラグメントは、癌の重篤度、程度又は持続時間を防止、軽
減又は減衰させるために十分な量で哺乳動物に提供される。

【０１１３】引用された全ての論文及び特許は、引用により本明細書に含まれるものとする
。

【０１１４】本発明を、ある特定の実施態様に関し上に記載するが、多数のバリエーション
が可能で、代わりの材料や試薬を、本発明を逸脱すること無しに使用できること
が理解されよう。幾つかの場合に、このようなバリエーション及び置換は何らか
の実験を必要とするかも知れないが、慣用的な試験のみを含むであろう。

【０１１５】特定の実施態様の上の記載は、本発明の一般的な性質を十分に示し、他の者は
、現在の知識を適用することによって、種々の適用のために、一般的概念を逸脱
すること無しに、このような特定の実施態様を容易に改変し、及び／又は採用で
きる。それ故、このような改変や修飾は、開示された実施態様の等価物の意味内
と範囲内に包含されるように意図される。

【０１１６】実施例１材料および方法組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の生成および解析：完全長ＮＹ−ＥＳＯ−
１遺伝子をコードする細菌発現ベクターを構築するために、本発明者らは一対の
プライマー、ＮｄｅＩ部位を含むＥＳＯ−５ｐ（５’ＧＣＴＣＣＧＧＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＡＧＧＣＣＧＧＧＧ）（配列番号３５）およびＸｈｏＩ
部位を含むＥＳＯ−３ｐ（５’ＡＡＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＣＴＴ
ＡＧＣＧＣＣＴＣＴ）（配列番号３６）を用いて、ＰＣＲフラグメントを作製し
た。ＰＣＲ産物の制限酵素による消化およびゲル精製の後、ＮＹ−ＥＳＯ−１を
コードするＤＮＡフラグメントをポリヒスチジンペプチドをコードするＤＮＡと
ｐＥＴ−２８（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，マジソン，ＷＩ）内でインフレームに融
合させた。同様のストラテジーを、最初の７４のアミノ酸残基のみを含むトラン
ケートＮＹ−ＥＳＯ−１であるＥＳＯ１−７４の発現ベクターを構築するのにも
使用した。正確なプラスミド構築物を保持するＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３
）を３７℃で対数期まで増殖させ、次いで、イソプロピル−ｄ−チオガラクトシ
ド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭまで添加し３時間振盪することによってタン
パク質産生を誘導した。細菌抽出物の可溶性画分を得た。またＮＹ−ＥＳＯ−１
をＮｉ²⁺アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製タンパク質の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を先の報告（２５）のように行った。精製タンパク質のＮ
末端配列を自動Ｅｄｍａｎ分解により決定した。

【０１１７】血清およびＰＢＭＣ：転移性メラノーマの患者由来の血清を−８０℃で保存し
た。正常ドナーの血清をＮＩＨのクリニカルセンターの血液バンクから得た。転
移性メラノーマの患者ＴＥのＭＨＣクラスＩＩ遺伝子型はＨＬＡ−ＤＲ１^*０４
０１，１^*１５０１であった。この患者をｇｐ１００：２０９−２１７（２１０
Ｍ）ペプチド＋高用量のＩＬ−２で処置し、目的である腫瘍退行の実験に付した
。

【０１１８】ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質に対する抗体の検出：５０ｌのＰＢＳＴ（０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水）に希釈した約５０ｎｇの精
製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎ
ｃ，デンマーク）の各ウェルに室温で終夜吸着させた。コントロールプレートは
１ウェルあたり１５０ｎｇのＢＳＡでコートした。プレートをＰＢＳＴ中５％ド
ライミルクで少なくとも２時間ブロックし、洗浄し、そして１００ｌの希釈血
清サンプルをロードした。全ての血清サンプルはＰＢＳＴ中３％ドライミルクを
用いて１：２５、１：２５０、および１：２５００に希釈した。この３つの異な
る希釈の各サンプルをＮＹ−ＥＳＯ−１コートしたプレートおよびＢＳＡコート
したプレート上にロードした。室温で１時間インキュベーションした後、プレー
トを洗浄し、ＰＢＳＴ中１％ドライミルクで希釈した二次抗体（西洋ワサビペル
オキシダーゼを結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ，ＳｉｇｍａＣｏ．，セントルイス
，ＭＯ）をロードした。プレートを０．５時間インキュベーションした後発色さ
せ、４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，シャンテ
ィイー，ＶＡ）を用いて読み取った。陽性反応を、１：２５と１：２５０の両方
の血清希釈で、正常ドナーの平均Ｏ．Ｄ．値＋標準偏差の３倍を超えるＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１に対するＯ．Ｄ．値として定義した。ウエスタンブロットを（２４）の
記載のように行い、いくつかの代表的血清サンプルにおける抗体の特異性を確認
した。

【０１１９】細胞株および抗体：メラノーマ株Ｆ０４９およびＦ０５０は、ＮＣＩの外科の
ＡｄａｍＲｉｋｅｒから提供された細針状アスパレート（ａｓｐａｒａｔｅ）
サンプルの初期培養物であった。他の全てのメラノーマ株およびＥＢＶＢ株は
１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｆｌｕｉｄ，Ｉｎｃ．，ゲーサーズバーグ，ＭＤ）
を補充したＲＰＭＩ１６４０（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ロックヴ
ィル，ＭＤ）で作製し維持した。２９３ＩＭＤＲ１および２９３ＩＭＤＲ４をヒ
トインバリアント鎖であるＤＭＡ、ＤＭＢおよびＤＲ分子を発現するよう遺伝子
組換えし、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０で培養した（１５）
。マウスリンパ球の培養培地は、ＨｙｃｌｏｎｅＩｎｃ．（ローガン，ＵＴ）
より供給される、０．０５ｍＭメルカプトエタノール、５ＣＵ／ｍｌＩＬ−２
および１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０だった。ヒトＴ細胞培養に用
いた培地は、ＳｉｇｍａＣｏ．（セントルイス，ＭＯ）により供給される、０
．０５ｍＭメルカプトエタノール、５０ＣＵ／ｍｌＩＬ−２および１０％ヒト
ＡＢ血清を含むＲＰＭＩ１６４０だった。抗体ブロッキング実験を先の記載（１
５）のように行った。ハイブリドーマＨＢ５５およびＨＢ９５はＡｍｅｒｉｃａ
ｎＴｙｐｅｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ，マナッサス，ＶＡ
）から得た。コントロール抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＩｎｔ．（サンディエ
ゴ，ＣＡ）から購入した。

【０１２０】トランスジェニック動物および免疫手順：ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニック
（ＤＲ４−Ｔｇ）マウスはマウスクラスＩＩ欠損であり、ＨＬＡ−ＤＲ−ＩＥ−
およびＨＬＡ−ＤＲ１^*０４０１−ＩＥ−キメラ分子を発現した（２６）。初代
マウスはＣａｓｅＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙの
ＰａｕｌＬｅｈｍａｎｎを通じて得た。マウスは近交系であり、Ｂｉｏｃｏｎ
Ｉｎｃ．（ロックビル，ＭＤ）で維持された。６〜１０週齢の雌性マウスを完
全長組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質で免疫した。精製タンパク質（約５０μ
ｇ）を完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中に懸濁し、均等に分け、後肢足
蹠および尾の付け根に皮下注射して各マウスに投与した。注射１１日後、マウス
を屠殺し、そして両方の後肢膝窩および鼠径部リンパ節を採取した。単一の細胞
懸濁液を２匹の免疫動物のリンパ節から得、インビトロ刺激を行った。

【０１２１】ペプチド合成：本研究で使用した合成ペプチドはＮＣＩの外科のペプチド合成
機（ＧｉｌｓｏｎＣｏ．Ｉｎｃ．，ワージントン，ＯＨ）で固相法を用いて
作製した。各ペプチドの純度は質量分析（Ｂｉｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎ
ｃ．，ルイスヴィル，ＴＸ）により評価した。

【０１２２】インビトロ感作（ＩＶＳ）手順およびサイトカイン放出アッセイ：サイトカイ
ン放出アッセイを行う前１週間、終濃度１０Ｍのペプチドを２．５×１０⁵マウ
スリンパ球と混合した。ヒトＰＢＭＣのＩＶＳのために、２．５×１０⁵細胞を
１０Ｍ濃度のペプチドでパルスし、平底９６ウェルプレートの各ウェル中でイン
キュベートした。２回のインビトロ刺激の後、細胞を様々な標的に対して試験し
、上清をサイトカイン放出アッセイのために収集した。ヒトＴ細胞の急速な増殖
およびクローニングは記載（２０）のように行った。

【０１２３】終濃度１０Ｍのペプチドまたは終濃度５ｇ／ｍｌのタンパク質を標的細胞にパ
ルスした。４時間のインキュベーション後、細胞を無血清ＲＰＭＩ培地中で洗浄
し、およそ３×１０⁴の標的細胞を同数のＴＥ４−１細胞とともに終夜インキュ
ベーションし、サイトカイン放出をヒトについてはＧＭ−ＣＳＦＥＬＩＳＡキ
ット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス，ＭＮ）、またはマウスについて
はＩＦＮキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．ウォバーン，ＭＡ）を用いて測
定した。ヒトＩＦＮ−，ＩＬ−１０，ＴＮＦ−，およびＩＬ−４等の他のサイト
カインは、製造業者の説明書に従って、ＥｎｄｏｇｅｎＩｎｃ．またはＲ＆Ｄ
ＳｙｓｔｅｍｓのＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。

【０１２４】実施例２組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質およびＮＹ−ＥＳＯ−１反応性抗体の検出ＮＹ−ＥＳＯ−１反応性抗体およびＣＴＬは、癌の患者において報告されてい
る（１９〜２２）。従って、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞がＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１抗原に対する抗体の発生およびＣＴＬの調整に関与しているかもしれな
いようである。しかし、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープはこ
れまで報告されていない。ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープを同
定するために、本発明者らは、細菌発現系からＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を出
発物質として精製することから始めた。ＮＹ−ＥＳＯ−１発現およびタンパク質
精製を促進するため、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするｃＤＮＡフラグメントを、
ｐＥＴ２８発現ベクターのＮ末端に位置するポリヒスチジンタグにインフレーム
で融合し、組換えタンパク質の高レベル産生を得た。数ミリグラムのＮＹ−ＥＳ
Ｏ−１タンパク質をＮｉ²⁺荷電アフィニティークロマトグラフィーカラムを使用
して精製した。精製タンパク質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル上およそ２６ｋ
Ｄａの見かけの分子量を示した（図２Ａ）。精製タンパク質の同定を確認するた
めに、タンパク質のＮ末端マイクロシークエンシングを自動Ｅｄｍａｎ分解によ
り行った。Ｅｄｍａｎ分解により得られた２５アミノ酸残基すべては予測したア
ミノ酸配列と一致した（データ示さず）。最初の７４アミノ酸残基を含む短い形
のＮＹ−ＥＳＯ−１（ＥＳＯ１−７４）もまた同じアプローチにより精製した（
図２Ａ）。

【０１２５】メラノーマ患者がＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質に対する抗体を生じたかどうか
を決定するために、ＮＣＩの外科において癌ワクチン治療プロトコルに登録され
た８８人の転移性メラノーマ患者由来の血清をスクリーニングした。８人の正常
ドナー由来の血清をスクリーニングのコントロールとして使用した。８８人の患
者のうち１１人（１３％）が、高力価のＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体を持って
いることが分かった（図２Ｃ）。このデータは他の群により得られた結果と一致
した（２２）。患者の血清が精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質に存在するわずか
な夾雑物と反応する可能性を除去するため、代表的な血清サンプルを用いてウエ
スタンブロットを行った。図２Ｂは、患者由来のＮＹ−ＥＳＯ−１反応性の血清
が、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現細菌の細胞溶解物および精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパ
ク質だけと反応し、コントロールベクターを含む細菌由来の抽出物とは反応しな
かったことを示した。非反応性の血清サンプルもまた試験した（図２Ｂ、レーン
４，５，６）。

【０１２６】実施例３ＨＬＡ−ＤＲ４−トランスジェニックマウス由来の推定ＭＨＣクラスＩＩ拘束エ
ピトープの同定ＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープを同定するために、ＤＲ４トランスジェニックマウ
スをＣＦＡ中およそ５０ｇの完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質で、尾の付け根
および後肢足蹠に免疫した。注射後１１日目に、２匹の免疫したマウスの両後肢
膝窩および鼠径部リンパ節から得た単一の細胞懸濁液を調製し、ＨＬＡ−ＤＲ４
分子の推定ペプチド結合能に基づくＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質由来合成ペプチ
ドでのインビトロ感作に使用した（２７）。

【０１２７】ＨＬＡ−ＤＲ４に結合することが予測されるアミノ酸配列セグメントを含む８
つの高結合ペプチドをインビトロ感作実験に使用した。最初のインビトロ感作後
６日目に、マウスリンパ球を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４陽性１３５９ＥＢＶＢ細胞
のみおよび刺激に使用した対応するペプチドでパルスした１３５９ＥＢＶＢに
対するサイトカイン放出について試験した。３つのペプチドは、Ｔ細胞からのサ
イトカイン分泌に基づきマウスＴ細胞により認識されたが、他の５つのペプチド
は認識を示さなかった（図３）。ＥＳＯｐ１１６−１３５は陽性ペプチドのう
ちで最も強い活性を示した。これは、このペプチドが、Ｔ細胞認識のためにＨＬ
Ａ−ＤＲ４分子により提示されるエピトープを含んでいるかもしれないことを示
唆している。従って、このペプチドをさらなる解析のために選択した。

【０１２８】実施例４ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的なヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞の作製ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する高力価の抗体を持っていた患者ＴＥ（図２Ｃ）由来
のＰＢＭＣを、ＥＳＯｐ１１６−１３５ペプチドを用いたインビトロ刺激に使
用した。インビトロ刺激の１週間後、患者ＴＥ由来のＰＢＭＣは著しい増殖を示
した。ＩＬ−２を刺激の２週目に添加した。このように樹立した細胞株をＴＥ４
−１と命名し、これを２０ＣＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、２週間超、増殖さ
せ続けた。ＴＥ４−１Ｔ細胞は、ＦＡＣＳ解析に基づくと、９０％ＣＤ４⁺Ｔ
細胞であった。ＴＥ４−１はＴｈ１型ＣＤ４⁺Ｔ細胞を含んでいた。というのは
、それらがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−およびＴＮＦを分泌し、ＩＬ−１０またはＩ
Ｌ−４を分泌しなかったからである（データ示さず）。ＣＤ８⁺Ｔ細胞を数％減
少させた後、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の精製集団は依然その反応性を保持していた。ＴＥ
４−１細胞株由来のＴ細胞クローンにもＥＳＯｐ１１６−１３５ペプチドを認
識することを示すものもあった（データ示さず）。

【０１２９】ＴＥ４−１は、ＨＬＡ−ＤＲ４との関連で完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質
およびＥＳＯｐ１１６−１３５ペプチドでパルスしたＥＢＶＢ細胞は認識し
たが、最初の７４アミノ酸を含むトランケートＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質でパ
ルスしたＥＢＶＢ細胞を認識しなかった（図４Ａ）。ＴＥ４−１細胞株もまた
ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするアデノウイルスに感染させたＤＲ４陽性樹状細胞
とは特異的に反応性であったが、緑色蛍光タンパク質をコードするアデノウイル
スに感染させたＤＲ４陽性樹状細胞とは特異的に反応性ではなかった（データ示
さず）。

【０１３０】ＴＥ４−１により認識されるＴ細胞がＨＬＡ−ＤＲ４により拘束されるかどう
かを試験するため、２つの重複するペプチド（ＥＳＯｐ１１６−１３５および
ＥＳＯｐ１１１−１３０）ならびにコントロールペプチド（ＥＳＯｐ９１−
１１０）を無血清培地中２９３ＩＭＤＲ１および２９３ＩＭＤＲ４細胞にパルス
した。細胞を洗浄し続いてＴＥ４−１細胞と終夜インキュベートした。図４Ｂに
示されるように、ペプチド１１６−１３５およびペプチド１１１−１３０の両方
がＨＬＡ−ＤＲ４との関連でＴＥ４−１により認識された。興味深いことに、ペ
プチド１１６−１３５もまた、２９３ＩＭＤＲ１細胞にパルスしたとき、Ｔ細胞
からのサイトカイン分泌を刺激することができた。コントロールＥＳＯｐ９１
−１１０ペプチドでパルスした２９３ＩＭＤＲ４では活性は検出されなかった（
図４Ｂ）。ＥＳＯ−ｐ１１６−１３５パルス２９３ＩＭＤＲ４の認識は抗ＨＬＡ
−ＤＲ抗体（ＨＢ５５）により完全に阻害されたが、コントロールおよび抗ＨＬ
ＡクラスＩ抗体（ＨＢ９５）では阻害されなかった（図４Ｃ）。ｇｐ１００特異
的ＣＤ８⁺Ｔ細胞株（ＣＴＬ−Ｃ３Ｇ１）およびＨＬＡ−ＤＲ１拘束ＣＤ４⁺Ｔ細
胞株（Ｔ３−８０）を抗体ブロッキングの特異性コントロールとして使用した。

【０１３１】実施例５ＴＥ４−１による腫瘍細胞の認識ペプチド特異的ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞活性は推定腫瘍抗原に対してしば
しば生じ得たが、多くの場合には、腫瘍反応性は、Ｔ細胞の低親和性または腫瘍
細胞表面上で天然にプロセシングされるペプチドの提示の失敗のいずれかに起因
して示され得なかった（３）。ＴＥ４−１が腫瘍細胞により天然にプロセシング
され提示されるＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープを認識することができたかどうかを
試験するために、いくつかのメラノーマ株を標的として使用した。各株における
ＮＹ−ＥＳＯ−１の発現はＲＴ−ＰＣＲにより決定し、ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子
の発現はＦＡＣＳ解析により決定した（データ示さず）。図５に示されるように
、ＴＥ４−１はＮＹ−ＥＳＯ−１／ＨＬＡ−ＤＲ４陽性腫瘍（１３５９ｍｅｌお
よびＦ０４９ｍｅｌ）を認識することができたが、腫瘍細胞株３９７ｍｅｌおよ
び６２４．３８ｍｅｌ（ＮＹ−ＥＳＯ−１⁺／ＨＬＡ−ＤＲ^-）、ならびに５２６
ｍｅｌ（ＮＹ−ＥＳＯ−１^-／ＨＬＡ−ＤＲ４⁺）は認識することができなかった
。興味深いことに、ＴＥ４−１もまたＦ０５０ｍｅｌ（ＤＲ１⁺／ＮＹ−ＥＳＯ
−１⁺）を認識したが、ＤＲ１および低レベルのＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する１
３００ｍｅｌは認識しなかった。１つの可能な説明は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞が異なる
ＤＲ分子により提示される同一のペプチドを認識するかもしれないということで
ある。Ｆ０４９ｍｅｌの認識は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の存在下特異的にブロック
され得るが、抗ＭＨＣクラスＩ抗体の存在下にはされない（データ示さず）。こ
れらの研究は、ＴＥ４−１細胞株が腫瘍細胞表面で天然にプロセシングされたペ
プチドを認識することを示唆した。

【０１３２】実施例６ＴＥ４−１により認識されるＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープの特徴付け２つの反応性ペプチドが１５アミノ酸（ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ）（
配列番号１０）を共有するので、ペプチドの最小長を一連のＮ−およびＣ−末端
トランケートペプチドを試験することによって決定した。ペプチドをＤＲ４⁺１
０８８ＥＢＶＢ細胞にパルスし、ＴＥ４−１細胞を刺激するその能力を試験し
た。１２８位のバリン残基がＴ細胞認識に重要であることが見出された（図６Ａ
）。１２３位のロイシン残基までのＮ末端欠失を有するペプチドは、Ｔ細胞認識
に影響を与えなかったが、さらに欠失を有するペプチドはＴ細胞を刺激するその
能力を一部失った。Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６およびＰ７残基がＭＨＣクラスＩＩ分子へ
のペプチド結合に寄与したので、１２３位のロイシン残基はＰ１アンカー残基で
あり得る。さらなる欠失が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するための重要な残基
を決定するために必要である。

【０１３３】欠失実験に基づいて本発明者らは、短い形のペプチドＥＳＯｐ１１９−１３
０を用いて、ＴＥ４−１により認識されるペプチドの結合親和性を決定した。異
なるペプチド濃度で標的として１０８８ＥＢＶＢ細胞（ＨＬＡ−ＤＲ４⁺）に
ペプチドをパルスした。図５Ｂに示されるように、３３ｎＭ以下のＥＳＯｐ１
１９−１３０ペプチド濃度では全くまたはほとんどＴ細胞活性は観察されず、０
．３３Ｍのペプチド濃度で高い活性が検出され、Ｔ細胞活性は３３Ｍのペプチド
濃度でプラトーに達しなかった。コントロールペプチドは３３Ｍのペプチド濃度
でさえＴＥ４−１により認識されなかった。

【０１３４】実施例７本発明者らは、Ｔ４−１ＣＤ４＋Ｔ細胞株がＤＲ４およびおそらくＤＲ１に
もまた関連してＥＳＯｐ１１６−１３５を認識することを示した。ここで、Ｔ
Ｅ４−１がＨＬＡ−ＤＲ１に関連してペプチドだけでなくタンパク質も認識でき
ることが示される。認識は抗ＤＲ抗体によりブロックされる（図７Ａおよび７Ｂ
）。この結果は、ＥＳＯｐ１１６−１３５が雑多なペプチドであり得、ＤＲ４
およびＤＲ１に結合できることを示す。従って、このペプチドワクチンの適用可
能な集団は非常に大きい。

【０１３５】実施例８ＨＬＡ−ＤＰ研究の材料および方法研究に使用した細胞株、組織培養試薬、および抗体２９３ＣＩＩＴＡは、ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーターをコードする
レトロウイルスを有する２９３細胞の形質導入により作製した細胞株である（５
３）（このレトロウイルスプラスミドはｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
ＳｏｕｔｈＦｌｏｒｉｄａ，タンパ，ＦＬのＤｒ．ＧｅｏｒｇｅＢｌ
ａｎｃの好意である）。すべてのメラノーマ株およびＥＢＶＢ株を、１０％ウシ
胎仔血清（Ｂｉｏｆｌｕｉｄ，Ｉｎｃ．，ゲーサーズバーグ，ＭＤ）を補充し
たＲＰＭＩ１６４０（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ロックビル，ＭＤ
）中で作製し維持した。リンパ球の培養培地は、０．０５ｍＭ β−メルカプト
エタノール、５０ＣＵ／ｍｌＩＬ−２＋１０％ヒト男性ＡＢ血清（Ｖａｌｌｅ
ｙＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｃ．（ウィンチェスター，ＶＡ）により供
給された）を含むＲＰＭＩ１６４０であった。ブロッキングアッセイに使用した
抗体は以下の供給源から得た：Ｗ６／３２（ＨＬＡクラスＩ）およびＬ２４３（
ＨＬＡＤＲ）はＬｏｆｔｓｔｒａｎｄＬａｂｓＬｔ．（ゲーサーズバーグ
，ＭＤ）により精製されたハイブリドーマ上清であった；抗体クローンＩＶＡ１
２（ＨＬＡクラスＩＩ）、Ｂ７／２１（ＨＬＡＤＰ）、Ｇｅｎｏｘ３．５３お
よびＩＶＤ１２（両方ともＨＬＡＤＱ）はＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏ
ｎＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（サンノゼ，ＣＡ）から
購入した。

【０１３６】プラスミドの構築ｐＥＳＯプラスミドは、先の記載（４５）のようにＣＭＶプロモーターにより
駆動されるＮＹ−ＥＳＯ−１ｃＤＮＡを含む発現ベクターであった。ｐＩｉ−Ｅ
ＳＯプラスミドを、全ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃＤＮＡのＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ消化
ＰＣＲ産物を同じ酵素で消化したｐＴｉ８０ベクターに挿入することで構築した
（５４）。ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃＤＮＡを、インバリアント鎖（Ｉｉ）リーダー配
列の最初の８０アミノ酸残基とそのＮ末端でインフレームに融合した。ＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１の増幅に使用したＰＣＲプライマーは以下の通りであった：ＮｈｅＩ部
位を含むフォワードプライマー５’ｃａｔｔｇｃｔａｇｃＡＴＧＣＡＧＧＣ
ＣＧＡＡＧＧＣＣＧＧＧＧＣＡ３’（配列番号７３）およびＮｏｔＩ
部位を含むリバースプライマー５’ａａｇｇｃｔａｃａｔｔＧＣＧＧＣＣＧ
ＣＴＴＡＧＣＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧ３’（配列番号７４
）。

【０１３７】ペプチドおよびＣＤ４⁺Ｔ細胞の産生本研究に使用した合成ペプチドは、ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ，ベセズダ，ＭＤの外科のペプチド合成機（ＧｉｌｓｏｎＣｏ．
Ｉｎｃ．，ワージントン，ＯＨ）において、固相法を用いて作製した。脱保護
後、各ペプチドの純度を、質量分析（Ｂｉｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．
，ルイスヴィル，ＴＸ）により評価した。合成ペプチドを凍結乾燥し、２０ｍｇ
／ｍｌでＤＭＳＯ中再構築し、そして示した濃度まで希釈した。

【０１３８】インビトロ感作手順を先の記載（５０）のように行った。簡潔にいうと、およ
そ２．５×１０⁵ＰＢＭＣを２０μｇ／ｍｌのペプチド存在下９６ウェル平底プ
レートにプレートした。７日目と１４日目に、１×１０⁵非照射ＰＢＭＣを２０
μｇ／ｍｌのペプチドでパルスし、２回洗浄し、各ウェルに加え、そして２０Ｃ
Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を８日目、１１日目、１５日目、１８日目に加えた。２１日
目、細胞を回収し、標的細胞と終夜インキュベートし、その後、上清をサイトカ
イン放出アッセイのために採取した。

【０１３９】特異的活性を有するウェル由来のＴ細胞をプールし、ＯＫＴ−３急速増殖法（
ＯＫＴ−３ｒａｐ１ｄｅｘｐａｎｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）を用いて増殖さ
せた（５５）。増殖後、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を磁気ビーズ選択（ＤｙｎａｌＩｎｃ
，レイクサクセス，ＮＹ）により培養物から枯渇させ、引き続いて細胞株をＣＤ
４⁺およびＣＤ８⁺発現に関してフローサイトメトリーにより解析した。

【０１４０】サイトカイン放出アッセイタンパク質またはペプチドをパルスした標的を調製するために、ペプチドは終
濃度２０μｇ／ｍｌで使用し、タンパク質は終濃度１０μｍｇ／ｍｌで使用した
。細胞を無血清ＲＰＭＩ培地で洗浄し、４時間血清の不在下３７Ｃでパルスし、
２回洗浄した。明記しない限り、およそ３×１０⁴標的細胞を同数のＴ細胞と少
なくとも１６時間インキュベートし、その後、サイトカイン放出アッセイを行っ
た。サイトカイン分泌はＧＭ−ＣＳＦＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅ
ｍｓ，ミネアポリス，ＭＮ）を用いて測定した。

【０１４１】ヒトＩＬ−４、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−βレベルの定量をＲ＆ＤＳｙｓｔ
ｅｍｓから得たサイトカインキットを使用して行い、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキッ
トをＥｎｄｏｇｅｎＩｎｃ（ウォバーン，ＭＡ）から購入した。アッセイは製
造業者の説明書に従って行った。

【０１４２】ＨＬＡＤＰ分子の分子タイピングトータルＲＮＡをＥＢＶＢ細胞、ＣＤ４０リガンド刺激Ｂ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細
胞、またはＭＨＣクラスＩＩ陽性メラノーマ株からタイピングのために得た。ト
ータルＲＮＡはＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）を使用して精製し
、１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡをオリゴｄＴプライム第一鎖ｃＤＮＡ合成に使用
した。ｃＤＮＡ産物の１／１０を使用し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト，ＣＡ
）のアドバンテージＰＣＲ系を用いてＰＣＲ増幅を行った。以下のプライマー対
をＨＬＡＤＰ−ＡおよびＤＰＢＰＣＲに使用した：ＤＰＡフォワードプライ
マー５’ＡＴＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＴＧＴ３’
（配列番号７５）、ＤＰＡリバースプライマー５’ＴＣＡＣＡＧＧＧＴＣ
ＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧＡ３’（配列番号７６）、ＤＰＢフ
ォワードプライマー５’ＡＴＧＡＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴ
ＣＴＧ３’（配列番号７７）、およびＤＰＢリバースプライマー５’ＴＴＡ
ＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＧＴＴＧＡＡＣＴＴＴＣ３’（配列番号
７８）。引き続いて、ＰＣＲ産物を精製し、ＰＣＲを行うために使用した同一プ
ライマーを用いてシークエンシングした。単一の配列がＰＣＲ産物から得られた
ので、多数の患者が非常に一般的なＨＬＡＤＰＢ１^*０４０１遺伝子産物にホ
モ接合性であると思われた。ヘテロ接合性の患者の場合、ＰＣＲ産物をまずｐＣ
Ｒ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）にクローニング
し、ベクター配列に相補的な５’および３’プライマーを用いてシークエンシン
グした。最終配列をＩＭＧＴ−ＨＬＡデータベースでサーチしてＨＬＡＤＰで
あることを確認した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｅｒｖ
ｉｃｅｓ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ）。

【０１４３】実施例９ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＣＤ４⁺Ｔ細胞株ＴＥ４−２の作製最初の研究をＨＬＡＤＲ４対立遺伝子により拘束されたＮＹ−ＥＳＯ−１エ
ピトープを同定するために行った。予測される９マーのＤＲ４結合モチーフを含
む８つの２０マーのペプチドを、ＮＹ−ＥＳＯ−１組換えタンパク質で免疫しイ
ンビトロで刺激したＨＬＡ−ＤＲ４−ＩＥトランスジェニックマウス由来のリン
パ球による認識について試験した（５０）。３つの２０マーのペプチドがこれら
の実験に陽性であることが分かった。これらのうちの一つはＤＲＢ１^*０４０１
とＤＲＢ１^*０１０１との夾雑エピトープとして特徴付けされた（５０）。他の
２つのペプチド（ＥＳＯｐ１６１−１８０およびＥＳＯｐ１４１−１６０）
をさらに特徴付けするために、本発明者らはそれらを使用して、高力価の抗体を
有するＤＲＢ１^*０４０１患者（ＴＥ）由来のＰＢＭＣならびにＮＹ−ＥＳＯ−
１に対するＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞を刺激した（５０）。２４ミクロ培養ウ
ェル全体を各ペプチドについて使用した。弱い刺激を３回した後、２４ウェルの
うち１５ウェルがＥＳＯｐ１６１−１８０で刺激されたＰＢＭＣ由来の顕著な
増殖を示した。試験した１５ウェルの増殖が陽性であるウェルのうち９ウェルが
、ペプチドパルスＤＲＢ１^*０４０１発現１０８８ＥＢＶＢ細胞に対する特異的
サイトカイン放出を示した（図８Ａ）。特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞もまた、ＥＳＯ
ｐ１４１−１６０で刺激したＰＢＭＣから作製したが、本研究では述べない（デ
ータ示さず）。

【０１４４】次いで、ＥＳＯｐ１６１−１８０ペプチド刺激に特異的に応答した培養物由
来のＴ細胞を合わせ、先の記載（５５）のプロトコルを使用して増殖させた。Ｃ
Ｄ８⁺Ｔ細胞の枯渇後、この培養物（ＴＥ４−２と命名する）は、ＦＡＣＳ解析
により評価したところ、９５％を超えるＣＤ４⁺Ｔ細胞を含んだ（データ示さず
）。

【０１４５】ＴＥ４−２のサイトカイン分泌プロファイルの分析によりこのＴ細胞株がペプ
チドパルス標的に応答してＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳ
Ｆを分泌しＴＧＦ−βを分泌しなかったことが示された（データ示さず）。従っ
て、ＣＤ４⁺Ｔ細胞のＴｈ１およびＴｈ２型の両方がこの細胞株に存在するかも
しれない。あるいは、Ｔｈ０表現型の細胞がこの培養物に存在するかもしれない
。

【０１４６】実施例１０ＨＬＡＤＰＢ１^*０４０１−０４０２に関連するＴＥ４−２によるＮＹ−ＥＳ
Ｏ−１の認識ＥＳＯｐ１６１−１８０、重複ペプチドであるＥＳＯｐ１５６−１７５、
および完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質それぞれでパルスしたＤＲ４発現標的
細胞に対する応答について、ＴＥ４−２Ｔ細胞を試験した。ＤＲ１を発現する
がＤＲ４を発現しない５８６ＥＢＶＢ細胞もまたＡＰＣとして使用した。無関係
なペプチド、ＥＳＯｐ９１−１１０、および精製トランケート組換えタンパク
質（ＥＳＯ１−７４；アミノ酸１〜７４を含む）（５０）をコントロールとして
使用した。ＴＥ４−２Ｔ細胞は、完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質でパルス
した場合ＤＲ４⁺１０８８ＥＢＶＢ株を特異的に認識したが、トランケートＥＳ
Ｏ１−７４タンパク質でパルスした場合認識しなかった（図８Ｂ）。ＥＳＯｐ
１６１−１８０およびｐ１５６−１７５の両方がＴＥ４−２により認識され、こ
れは最小ペプチドエピトープがアミノ酸１６１と１７５との間にあることを示し
ている。対照的に、最初予測したＤＲ４結合モチーフはアミノ酸１６７と１７５
との間にある。予測しなかったことに、ＴＥ４−２Ｔ細胞株は、５８６ＥＢＶ
Ｂ細胞にパルスしたペプチドおよびタンパク質（これらはＤＲＢ１^*０１０１を
発現するがＤＲＢ１^*０４０１を発現しない）に同じくらい良好に応答するよう
であった。この結果は、類似のペプチドが複数のＭＨＣクラスＩＩ拘束エレメン
トによって提示されたか、またはＴＥ４−２Ｔ細胞に対してペプチドを提示す
るＭＨＣクラスＩＩ拘束エレメントを共有する１０８８および５８６ＥＢＶＢ細
胞株によって提示されたかのいずれかであったことを示唆していた。これらの可
能性を試験するために、公知のＨＬＡＤＲおよびＤＱ型を含む多数の他のＥＢ
ＶＢ細胞もまた、ＴＥ４−２Ｔ細胞により利用される拘束エレメントを同定す
るためにＡＰＣとして使用した。試験したＥＢＶＢ細胞株のうち一つを除く全て
がＴＥ４−２に対してＥＳＯｐ１６１−１８０ペプチドを提示することができ
た（図８Ｃ）。

【０１４７】次いで、ペプチドのＴ細胞認識を、異なるＭＨＣ拘束エレメントによって拘束
されたペプチドの認識をブロックする特異的抗体の存在下で行った。図９Ａ〜９
Ｃの結果は、すべてのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（ＩＶＡ１２）をブロックす
る抗体および全てのＨＬＡＤＰ対立遺伝子（Ｂ４／２１）をブロックする特異
性を有する抗体が、ＴＥ４−２Ｔ細胞がＥＳＯｐ１６１−１８０を認識する
能力を無効としたことを示した。ＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＣ対立遺伝子（Ｗ６／３
２）に対する抗体ならびにＭＨＣクラスＩＩＤＲ（Ｌ２４３）およびＤＱ（Ｇｅ
ｎｏｘ３．５３およびＩＶＤ１２のミックス）対立遺伝子に対する抗体は、ＴＥ
４−２Ｔ細胞の刺激に対してほとんどまたは全く影響しない。従って、これら
の結果は、ＴＥ４−２Ｔ細胞が本研究で使用したＥＢＶＢ細胞株により共有さ
れる非常に一般的なＨＬＡＤＰ対立遺伝子に関してＥＳＯｐ１６１−１８０
を認識したことを示唆していた。

【０１４８】次いで、ＨＬＡ−ＤＰ対立遺伝子を分子的にクローニングし、図８Ｃで使用し
た細胞株に対してシークエンシングした。これらの研究は、１０８８および５８
６ＥＢＶＢ株がともに、ＨＬＡＤＰＢ１^*０４０１遺伝子産物、患者ＴＥが発
現したＤＰＢ１^*０４０１ならびに未知のＤＰ対立遺伝子にホモ接合性であった
ことを示していた（表２）。Ｌ０２３ＥＢＶＢ細胞株（これはＴＥ４−２に対し
てＥＳＯｐ１６１−１８０ペプチを提示しなかった）はＨＬＡＤＰ対立遺伝
子（これはＤＰＢ１^*０４０１および０４０２とは異なる）にホモ接合性として
型を決められた。

【０１４９】１３６３、１０８８、８３６およびＬ００７ＥＢＶＢ細胞株はすべてＤＰＢ
１^*０４０１を発現したが、Ｌ０４１ＥＢＶＢ細胞株はＤＰＢ１^*０４０２（８４
位と８５位の２つのアミノ酸残基がＤＰＢ１^*０４０１分子と異なる）を発現し
た。従って、ＤＰＢ１^*０４０１とＤＰＢ１^*０４０２の両方がＴＥ４−２ＣＤ
４⁺Ｔ細胞に対するＥＳＯｐ１６１−１８０エピトープを提示することができ
るようであった。

【０１５０】

【表２】

【０１５１】特異的ＤＰＡ鎖がＴＥ４−２Ｔ細胞に対するエピトープを提示するのに必要
であるかどうかを決定するために、ＤＰＢ１^*０４０１−０４０２を発現するＥ
ＢＶＢ細胞中のＨＬＡＤＰＡ分子もまた解析した。図８Ｃで使用したＤＰＢ１ ^* ０４０１−０４０２を発現するＥＢＶＢ細胞は１タイプ超のＨＬＡＤＰＡ分
子（データ示さず）を持っていたが、すべてがＴＥ４−２Ｔ細胞にＮＹ−ＥＳ
Ｏ−１エピトープを同じように良好に提示することが可能であった。

【０１５２】実施例１１腫瘍細胞上の天然にプロセシングされたＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープのＴＥ４−
２による認識ＴＥ４−２により認識されるＴ細胞エピトープが腫瘍細胞の表面で天然にプロ
セシングされ提示されるかどうかを調べるために、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＤＰ
Ｂ１^*０４０１を発現した腫瘍株を標的として用いた。ＴＥ４−２Ｔ細胞は、
ＮＹ−ＥＳＯ−１とＤＰＢ１^*０４０１の両方を発現する複数の腫瘍株を認識し
たが、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するがＨＬＡＤＰＢ１^*０４０１および０４０
２対立遺伝子のいずれも発現しない腫瘍株（１３６２ｍｅｌ）は認識しなかった
（図１０Ａ）。さらに、ＴＥ４−２Ｔ細胞はＤＰＢ１^*０４０１陰性およびＮ
Ｙ−ＥＳＯ−１陰性の腫瘍（５２６ｍｅｌ）を認識しなかった。ＨＬＡＤＰＢ
１^*０４０１を発現するがＮＹ−ＥＳＯ−１を発現しない１つのメラノーマ株（
１１０２ｍｅｌ）はまた、ＴＥ４−２Ｔ細胞により認識された。ＲＴ−ＰＣＲ
解析の結果は、１１０２ｍｅｌがＬＡＧＥ−１遺伝子（ＮＹＥＳＯ−１に対し
ておよそ９０％のアミノ酸類似性を有する癌／精巣抗原）を発現したことを示し
ていた（５７）。ＥＳＯｐ１６１−１７５と同一の配列はまた、ＬＡＧＥ−１
タンパク質にも存在した。これらの結果は、ＴＥ４−２により認識されるエピト
ープが腫瘍細胞表面に存在し、ＮＹ−ＥＳＯ−１と、密接に関連した腫瘍抗原Ｌ
ＡＧＥ−１との間で共有されていることを示唆した。

【０１５３】ＮＹ−ＥＳＯ−１発現メラノーマ株に加えて、ＴＥ４−２Ｔ細胞もまた、Ｎ
Ｙ−ＥＳＯ−１トランスフェクト２９３ＣＩＩＴＡ細胞の認識について試験した
。２９３細胞にＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーター遺伝子（ＣＩＩＴＡ）
を発現するレトロウイルスを用いて形質導入し、２９３ＣＩＩＴＡ細胞株を作製
した（５３）。ＲＴ−ＰＣＲにより決定されたように、２９３ＣＩＩＴＡ細胞は
ホモ接合性のＨＬＡＤＰＢ１^*０４０１分子を発現したが、親の２９３細胞は
発現しなかった（データ示さず）。ＴＥ４−２Ｔ細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ト
ランスフェクト２９３ＣＩＩＴＡ細胞と特異的に反応した（図１０Ｂ）。対照的
に、ＴＥ４−２Ｔ細胞はｐＧＦＰプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｃ
ＩＩＴＡ細胞またはＩｉ−ＮＹ−ＥＳＯ−１をトランスフェクトした親の２９３
細胞のいずれも認識しなかった。Ｉｉターゲッテイング配列はＮＹ−ＥＳＯ−１
のプロセシングおよび認識に必要ではなかったが、Ｔ細胞認識をわずかに増強し
た（図１０Ｂ）。これらの結果はＴＥ４−２Ｔ細胞が天然にプロセシングされ
たＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープを認識したことをさらに示していた。

【０１５４】実施例１２ＨＬＡ−Ａ２拘束エピトープと重複するＨＬＡＤＰ４拘束エピトープ２つの重複するペプチド（ＥＳＯｐ１６１−１８０およびｐ１５６−１７５
）でパルスした標的細胞は、ＴＥ４−２Ｔ細胞により同じように良好に認識さ
れた。これは、最小Ｔ細胞エピトープがアミノ酸１６１から１７５までの範囲の
領域に位置していることを示していた（図８Ｂ）。

【０１５５】アミノ酸１６１と１７５との間にあるアンカー残基を同定するために、重複１
３マーペプチドの１シリーズを１０８８ＥＢＶＢ細胞をパルスするのに使用し、
ＴＥ４−２Ｔ細胞を刺激するその能力を試験した。図１１Ａに示すように、１
６１位のＷ残基を除去したときに活性の部分的損失を観察し、１６２位のＩ残基
を除去したときに活性の完全な損失を観察した。１６７位のＣ末端Ｌ残基の欠失
もまた、ＴＥ４−２Ｔ細胞によるペプチド認識を取り除いた。さらに、１６９
位の残基Ｖも、この残基の欠失がペプチド刺激活性を２倍減少させたので、重要
であると思われた。これらの結果は、１６１位のＷ残基がＰ１アンカーであり得
、１６７位のＬ残基がＰ７アンカーの代表であることを示した。１６９位のＶ残
基もまた、ペプチドエピトープの刺激性能に寄与しているようであり、それがＰ
９アンカー残基を示し得ることを示している。これらの推定アンカー残基は先に
記載されたコンセンサスＨＬＡＤＰＢ１^*０４０１結合モチーフ（５７）に非
常に一致している。

【０１５６】３つすべてのアンカー残基を含むＥＳＯｐ１５７−１７０ペプチドを力価測
定実験に使用して、ペプチドに対する最小刺激濃度を決定した。その結果は、Ｅ
ＳＯｐ１５７−１７０が、３ｎＭと３３ｎＭとの間の最小濃度でＴＥ４−２
Ｔ細胞からの著しいサイトカイン放出を刺激することができることを示していた
（図１１Ｂ）。これらの結果は、ＴＥ４−２Ｔ細胞が高い親和性でＥＳＯｐ
１５７−１７０を認識することを示していた。この見かけの親和性は非変異ペプ
チド（例えば、ｇｐ１００（５８）、チロシナーゼ（５９）、およびＣＤＣ−２
７（５４）由来のもの）由来の最もよく知られた公知のＭＨＣクラスＩＩ結合エ
ピトープよりも優れている。同じ領域にわたる他のペプチド（例えば、ＥＳＯ
ｐ１６１−１８０およびｐ１５６−１７５）もまた、ＴＥ４−２Ｔ細胞に関し
て同様な最小刺激濃度を有した（データ示さず）。

【０１５７】興味深いことに、先に同定されたＨＬＡ−Ａ２エピトープ、ＥＳＯｐ１５７
−１６７（４７）は、ＤＰＢ１^*０４０１−０４０２エピトープ、ＥＳＯｐ１
５７−１７０内に含まれた。ＨＬＡ−ＤＰエピトープがＨＬＡ−Ａ２により提示
されＣＤ８⁺Ｔ細胞と交差反応し得るかどうかを判断するために、ＥＳＯｐ１
５７−１７０をＴＥ８−１による認識について試験した（ＣＤ８⁺Ｔ細胞株はＨ
ＬＡ−Ａ２エピトープＥＳＯｐ１５７−１６７を特異的に認識する）。Ｌ０２
３ＥＢＶＢ細胞（これは、ＨＬＡ−Ａ２を発現するがＤＰＢ１^*０４０１−０
４０２対立遺伝子を発現しない）にパルスした時、ＥＳＯｐ１５７−１７０は
ＴＥ８−１Ｔ細胞からの顕著なサイトカイン放出を刺激することができた（図
１１Ｃ）。この実験は、ＥＳＯｐ１５７−１７０エピトープがＭＨＣクラスＩ
およびクラスＩＩ２つの特異性を持っており、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を認
識するＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞両方を刺激することができることを示してい
た。従って、ＥＳＯｐ１５７−１７０は、腫瘍細胞を特異的に認識するＣＤ４ ⁺ およびＣＤ８⁺Ｔ細胞両方を誘発することを目的とする癌ワクチンの興味深い候
補物であり得た。

【０１５８】実施例１３ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体産生とＨＬＡＤＰＢ１^*０４０１−０４０２との関連性ＨＬＡＤＰＢ１^*０４０１−０４０２は、白人の大部分（別の人種を含めた
集団調査では４３％〜７０％）に存在する主要なＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子で
ある（５２）。先の研究（４８、５０）は、正常ドナーおよびＮＹ−ＥＳＯ−１
発現腫瘍を有さない癌患者がＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体を生じないことを示
している。対照的に、ＮＹＥＳＯ−１発現腫瘍を有する患者の５０％は、ＮＹ
−ＥＳＯ−１特異的Ａｂを生じた。血清サンプルを試験した８８人のメラノーマ
患者のパネルのうち、１１人の患者が高力価のＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有するこ
とが見出された（５０）。多くの患者がＤＲ４対立遺伝子を全く発現しなかった
ことから、先に同定したＤＲ４拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞ペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−
１特異的Ａｂの産生を説明できなかった（表２）。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＤＰ
４拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞がこれらのメラノーマ患者におけるＮＹ−ＥＳＯ−１特異
的Ａｂの産生と関連しているかどうかをさらに調査するため、本発明者らはまず
これらのＨＬＡＤＰサブタイプを解析した。ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有する１
１人の患者のうち１０人がＤＰＢ１^*０４０１および／または０４０２を発現し
たが、主要なＤＱまたはＤＲ拘束エレメントはこの患者のグループでは同定でき
なかった（表２）。公知のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を有しているが検出可能な
抗体を有さないこのパネルの３人の患者はＤＰＢ１^*０４０１−０４０２対立遺
伝子を発現しなかった。残りの７４人の患者由来の腫瘍細胞株はこれらの患者由
来のＮＹＥＳＯ−１発現を評価するためには入手できなかったので、そのＨＬ
ＡＤＰ型を同定するためのさらなる研究は行わなかった。０．０１１のｐ値を
フィッシャーの直接確率検定により得、これは抗体応答とＨＬＡ−ＤＰＢ１^*０
４０１−０４０２発現との関係の重要さを示していた。ＮＹ−ＥＳＯ−１は２５
〜３０％の腫瘍細胞株で発現され、ＤＰ４は集団の４３〜７０％で発現されるの
で、ＮＹ−ＥＳＯ−１とＤＰ４の両方を発現し、かつ抗体応答を生じる可能性の
ある患者の割合は、１０〜２１％の範囲である。この仮説的予想はＮＹ−ＥＳＯ
−１抗体を有する患者の観察された１０〜１３％の頻度と非常に近い。

【０１５９】ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体応答とＤＰＢ１^*０４０１−０４０２発現との関連に関
する更なる証拠を手に入れるため、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有する１１人の患者
のうち６人からのＰＢＭＣを、ＥＳＯｐ１６１−１８０ペプチドによるインビ
トロ刺激に用いた。インビトロ感作もまた検出可能なＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有
さない２人のＤＰＢＩ^*０４０１⁺患者からのＰＢＭＣを用いて行った。２または
３回のインビトロ刺激の後、ＥＳＯｐ１６１−１８０ペプチドでパルスした２
９３ＣＩＩＴＡ細胞に対するその応答について、Ｔ細胞を試験した。ＮＹ−ＥＳ
Ｏ−１抗体を有する６人の患者のうち５人（ＴＥを含む）由来のＴ細胞は、２９
３ＣＩＩＴＡ細胞により提示されるＥＳＯｐ１６１−１８０エピトープ（ＤＰ
４⁺およびＨＬＡ−Ａ２^-）の特異的認識を示した（表３）。患者ＣＴおよびＢＬ
由来の複数のウェルは、ペプチドをパルスした標的と反応するようであった。こ
れらの２人の患者由来の感作したＰＢＭＣもまた、ＣＤ４⁺Ｔ細胞のさらなる濃
縮なしにＤＰＢＩ^*０４０１⁺およびＮＹ−ＥＳＯ−ｌ⁺メラノーマ株の顕著な腫
瘍認識を示した（データ示さず）。対照的に、ＮＹ−ＥＳＯ−１反応性Ｔ細胞は
、３回の刺激後検出可能なＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有さない２人の患者（ＷＣお
よびＥＷ）由来のＰＢＭＣを用いて作製されなかった。これらの結果は、抗ＮＹ
−ＥＳＯ−１抗体を生じた患者もまた、比較的高い前駆体頻度のＤＰＢ１^*０４
０１拘束エピトープと反応性のＴ細胞を含んでいたことを示唆していた。これら
のＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞はＮＹ−ＥＳＯ−１癌／精巣抗原に対
する抗体応答の発生に寄与していたかもしれない。

【０１６０】

【表３】

【０１６１】実施例１４野生型ＨＬＡＤＰ４ペプチドの１つに改変を施した。この改変は、ペプチド
をより可溶性にし９０％超の均質性（これはペプチド臨床試験に関してＦＤＡに
より求められている）まで精製し得るようにするためのものであった。野生型お
よび改変ペプチドは以下の通りである：

【０１６２】野生型ＥＳＯｐ１５７−１７０；ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号５４
）；野生型ＥＳＯｐ１５７−１６７；ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列番号７９）；ＥＳＯｐ１５６Ｒ−１６９；ＲＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶ（配列番号６３）；
およびＥＳＯｐ１５７−１７０Ｒ；ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＲ（配列番号６４）。

【０１６３】これらの改変ペプチドがＴ細胞により同じように良好に認識されるかどうかを
試験するために実験を行った。ＥＳＯｐ１５７−１７０がＨＬＡ−Ａ２および
ＨＬＡ−ＤＰ４２つの結合特異性を示したので、ＴＥ４−２ＣＤ４＋Ｔ細胞
およびＴＥ８−１ＣＤ８＋Ｔ細胞それぞれによるＤＰ４（図１２Ａ）およびＡ
２（図１２Ｂ）両方の拘束様式における認識を測定した。

【０１６４】結果は、これらの改変ペプチドがＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞により
野生型として同じように良好に認識されたことを示していた。

【０１６５】実施例１５ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ特異的ＣＤ４⁺Ｔリンパ球免疫療法メラノーマ抗原に対して前感作したＴリンパ球は、メラノーマに罹患した哺乳
動物を治療処置するのに有効であり得る。Ｔリンパ球を末梢血またはメラノーマ
の腫瘍懸濁液から単離し、インビトロで培養する（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ら、
１９８８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３−２１９１）。

【０１６６】Ｔリンパ球をエピトープＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１９）またはエピト
ープＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号８０）に濃度１μｇ／ｍｌのみまたはＩＬ
−２の存在下で暴露し、前感作し、そして培養液中で増殖させる。エピトープに
暴露したＣＤ４⁺Ｔリンパ球を１哺乳動物あたり約１０⁹〜１０¹²リンパ球で哺乳
動物に投与する。このリンパ球を、静脈内、腹腔内、または病巣内のいずれかで
投与する。この処置は、サイトカイン、メラノーマ病変の外科的切除および化学
療法剤等の他の治療処置と同時に投与してもよい。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ
８⁺Ｔリンパ球はＣＤ４⁺Ｔリンパ球と同時に投与してもよい。

【０１６７】実施例１６転移性メラノーマを有する患者の処置このプロトコルでは、進行メラノーマの患者を抗原性癌エピトープで免疫する
。

【０１６８】試験にふさわしい患者は、標準的な有効治療が失敗した測定可能または評価可
能な転移性メラノーマの徴候を持っていなければならない。患者は、腫瘍細胞Ｒ
ＮＡのＰＣＲまたはノザンブロット解析により立証されるようなＮＹ−ＥＳＯ−
１抗原を発現する腫瘍を有さなければならない。

【０１６９】患者に、体重１ｋｇあたり１ｎｇ、１μｇ、１ｍｇまたは５００ｍｇいずれか
のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを、０日、７日、１４日に単独で、ま
たはＩＬ２および／または免疫刺激分子とともに、静脈内に投与する。患者を、
毒性、免疫効果および治療有効性について評価する。患者に、ＮＹ−ＥＳＯ−１
クラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープをさらに投与してもよい。

【０１７０】処置患者から採取したリンパ球を、ＮＹ−ＥＳＯ−１癌抗原またはＭＨＣクラ
スＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープに対する特異的応答について試験する。

【０１７１】完全な応答を、少なくとも４週間続く疾患の全臨床的徴候の消失と定義する。
部分的応答は、新たな病変またはいずれの病変における増加の出現なしに、少な
くとも４週間すべての測定可能な病変の垂直直径の積の合計における５０％以上
の減少である。軽微な応答は、新たな病変の出現およびいずれの病変における増
加なしに、すべての測定可能な病変の垂直直径の積の合計における２５〜４９％
の減少として定義する。部分応答未満のいずれの患者をも非応答者と考える。新
たな病変の出現あるいは部分的または完全な応答後の先の病変の垂直直径の積に
おける２５％超の増加を再発と考える。

【０１７２】考察ＮＹ−ＥＳＯ−１は、体液性および細胞性両方の免疫応答を引き起こすので、
重要な免疫標的である（１９〜２１）。その発現パターンはＭＡＧＥ遺伝子ファ
ミリーの抗原と類似しているが、ＮＹ−ＥＳＯ−１はＭＡＧＥファミリーのいず
れのものよりも乳癌、前立腺癌、肺癌で頻繁に発現される（１９、２０、２３）
。さらに興味深いことに、非常に低い割合の患者がＭＡＧＥ抗原または分化抗原
（例えば、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２）に対する
高力価の抗体を生じた（データ示さず、（２２））にもかかわらず、高力価のＮ
Ｙ−ＥＳＯ−１反応性抗体は、癌の患者においてしばしば検出された（図２Ｂお
よび２Ｃ）。これらの研究は、ＮＹ−ＥＳＯ−１反応性ＣＤ４⁺Ｔ細胞が抗体産
生およびＣＴＬ増殖に関わっているかもしれないことを示唆する。本研究で、本
発明者らは、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスおよび候補ペプチドを用
いたヒトＰＢＭＣのインビトロ刺激を使用して、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＨＬＡ
−ＤＲ４拘束Ｔ細胞エピトープを同定した。我々の知る限りでは、これは、ＮＹ
−ＥＳＯ−１由来Ｔ細胞エピトープがＣＤ４⁺Ｔ細胞に対してＭＨＣクラスＩＩ
分子により提示されることを示した最初の証明である。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的
抗体およびＣＴＬは異なるＨＬＡ遺伝子型を持つ患者において検出されたので、
ＨＬＡ−ＤＲ４以外のＨＬＡクラスＩＩ分子により提示される他のＣＤ４⁺Ｔ細
胞エピトープは本発明において同定された。

【０１７３】最近、２つのグループが、公知のＭＨＣクラスＩ拘束腫瘍抗原であるＭＡＧＥ
−３からのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの同定を報告した。精製ＭＡ
ＧＥ−３タンパク質でパルスされたＤＣで刺激されたＰＢＭＣから作製したＣＤ
４⁺Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡ−ＤＲ１３適合ＥＢＶＢ細胞にパルスされたペ
プチドまたはタンパク質を認識したが、ＭＡＧＥ−３⁺／ＤＲ１３⁺腫瘍細胞にパ
ルスされたものを認識しなかった（１４）。しかし、別の研究では、コンピュー
ターを使ったアルゴリズムによって予測されるペプチドで刺激したＰＭＢＣから
作製したＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＥＢＶＢ細胞およびＭＡＧＥ−３⁺／ＤＲ１１⁺腫
瘍細胞両方にパルスしたペプチドを認識することができた（１５）。ＮＹ−ＥＳ
Ｏ−１の場合、本発明者らはここに、ＣＤ４⁺Ｔ細胞がＤＲ４マッチＥＢＶＢ
細胞にパルスしたＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質またはペプチドおよびＮＹ−ＥＳ
Ｏ−１を発現する腫瘍細胞を認識できることを示している（図４および５）。Ｈ
ＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウスの利用は、免疫したトランスジェニックマ
ウスが特異的反応性Ｔ細胞の高い前駆体頻度をおそらく有しているので、推定ペ
プチドの同定において利点を有し得る。候補ペプチドを一旦同定すれば、ＣＤ４ ⁺ Ｔ細胞を合成候補ペプチドで刺激したＰＢＭＣから作製できる。従って、全タ
ンパク質で免疫し、コンピューターを使用したアルゴリズムにより予測したペプ
チドで刺激したトランスジェニックマウスの組み合わせ使用は、多数のペプチド
および複数回のインビトロ刺激でヒトＰＢＭＣを刺激する必要性を回避し得る。
さらに、免疫したトランスジェニックマウスにより同定される候補ペプチドは、
天然にプロセシングされ細胞表面上に提示されるペプチドであるようである。こ
れは、ペプチド特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞が腫瘍細胞も同様に認識することができる
可能性を上昇させ得る。最後に、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する高力価の抗体および
高前駆体頻度のＣＴＬを生じた患者（ＴＥ）由来のＰＢＭＣの使用は、抗体産生
およびＣＴＬの両方がＣＤ４⁺Ｔ細胞の助けを必要とするので、腫瘍特異的ＣＤ
４⁺Ｔ細胞を作製するのをより容易にし得る。このアプローチは、自己免疫疾患
に関与する公知の自己抗原から多数のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを
同定するのに使用されている（２８）。従って、本研究で使用するストラテジー
は多くの他の公知のＭＨＣクラスＩ拘束腫瘍抗原に適用可能であり得つつ、直接
遺伝子クローニングアプローチ等他のストラテジーが未知のＭＨＣクラスＩＩ拘
束腫瘍抗原の同定を容易にし得る。

【０１７４】ｇｐ１００等組織特異的分化抗原由来のペプチドを使用する臨床試験は、メラ
ノーマの患者の処置において治療有効性のいくらかの証拠を示した（４）。顕著
な毒性の副作用は改変ｇｐ１００ペプチドで処置した患者において観察されてい
ないが、白斑または色素脱失は、治療に反応を示した患者においてしばしば見ら
れた（２９）。このことは、自己抗原による免疫によって誘導された抗腫瘍免疫
が自己免疫を生じ得ることを示唆している。ＴＲＰ−１を免疫標的として使用し
た動物研究では、類似の結果（抗腫瘍免疫および毛の色素脱失）も得られた（３
０〜３２）。興味深いことに、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１に媒介される抗腫瘍免疫お
よび自己免疫はＣＤ４⁺Ｔ細胞および抗体を伴っているようであった（３３）。
ｍＴＲＰ−２（３５）ではなくｈＴＲＰ−２（３４）でのマウスの免疫は、自己
抗原ならびにＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方の関与を必要とする抗腫瘍免疫
に対する耐性を壊した（３３）。これらの研究は、抗腫瘍免疫が抗体またはＣＤ
８⁺Ｔ細胞のいずれかにより媒介され得るが、両方ともＣＤ４⁺Ｔ細胞の決定的な
助けを必要とし得ることを示唆していた（２４、３３）。

【０１７５】本研究で同定したＭＨＣクラスＩＩ拘束ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドは、ＮＹ−
ＥＳＯ−１に対するＣＴＬおよび抗体が癌の患者において検出されたので、臨床
用途に有用であり得る。ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ拘束ペプチドまたは精製ＮＹ
−ＥＳＯ−１タンパク質での免疫は、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺ Ｔ細胞および抗体を誘導し得る。あるいは、患者は、クラスＩおよびＩＩの両ペ
プチドをロードするかまたはＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子をコードする組換えウイル
スを感染させた樹状細胞で免疫され得る。精巣生殖細胞はＭＨＣクラスＩおよび
ＩＩの分子を発現しないので（３６）、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する免疫応答は腫
瘍細胞に特異的であるはずであり、従って、ほとんどまたは全く自己免疫応答を
生じない。ＭＡＧＥ−３のＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドまたは樹状細胞にパルス
したペプチドを使用した同様の研究は、抗腫瘍免疫（ＣＴＬ応答）および緩慢な
腫瘍の退行が示されたにもかかわらず、色素脱失／白斑または他の顕著な副作用
が観察されなかったことを示した（６、７）。抗腫瘍免疫は、腫瘍特異的ＣＤ４ ⁺ Ｔ細胞の助けを提供することによって向上され得る。

【０１７６】

【表４】

【０１７７】本発明のこれらの及び他の目的、性質及び付随の利点の多くは、以上の詳細な
説明を読む際に、添付された図面と関連づけて考えると、より良く理解されよう
。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＹ−ＥＳＯ−１のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。ＮＹ−ＥＳＯ−１の
ヌクレオチド配列の番号付けは、５’非翻訳領域の最初のヌクレオチドから始ま
る。

【図２】（２Ａ）Ｎｉ²⁺クロマトグラフィーカラムを用いる完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タ
ンパク質の精製。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルは、ｐＥＴ２８ベクター（レー
ン１）、ｐＮＹ−ＥＳＯ−１（レーン２）を担うＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ
３）からの粗抽出物、精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質（レーン３）、トランケ
ートＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする細菌抽出物（レーン４）、及び精製されたト
ランケートＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質であるＥＳＯ１−７４（レーン５）を示
した。（２Ｂ）ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体の特異性を確認するためのウエス
タンブロット。２人の代表的な患者からの１／２０００希釈の血清（１つは、Ｅ
ＬＩＳＡによって検出できるＮＹ−ＥＳＯ−１抗体をもつもの（レーン１、２及
び３）及び１つは、該抗体無しのもの（レーン４、５及び６））を、ベクターだ
けをコードする細菌抽出物（レーン１、４）、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする細
菌抽出物（レーン２、５）及び精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質（レーン３、６
）に対して用いた。（２Ｃ）患者ＴＥは、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質に対して
抗体を有するメラノーマ患者の1人であった。ＮＹ−ＥＳＯ−１（コントロール
タンパク質としてＢＳＡ）に対する抗体の存在について８８人の患者からの血清
を用いてＥＬＩＳＡを行った。血清希釈の１：２５、１：２５０、１：２５００
でのＯ．Ｄ．４５０の値をプロットした。正常ドナーからの血清をコントロール
として用いた。それらの平均ＯＤ値もプロットした（ＮＤ）。

【図３】ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質で免疫化したＨＬＡ−ＤＲ４−Ｔｇマウスを用い
る推定ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープの試験。ＨＬＡ−ＤＲ４に対する予測された
結合アフィニティに基づく８つのペプチドを、免疫化マウスからのリンパ球のイ
ンビトロ感作のために用いた。マウスリンパ球を、培地だけ、１３５９ＥＢＶ
Ｂ（ＨＬＡＤＲ４⁺）細胞だけ、又はインビトロ刺激のために使用されたペプ
チドでパルスした１３５９ＥＢＶＢ細胞に対しＩＦＮ産生について試験した。

【図４】ＴＥ４−１ＣＤ４⁺Ｔ細胞株の特徴付け。（４Ａ）ＴＥ４−１は、ＥＳＯｐ
１１６−１３５ペプチド又は精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質でパルスした１０
８８ＥＢＶＢ細胞（ＨＬＡ−ＤＲ⁺）を特異的に認識したが、推定エピトープ
を欠くＥＳＯ１−７４タンパク質を認識しなかった。（４Ｂ）ＨＬＡＤＲ拘束
は、ＴＥ４−１によるＮＹ−ＥＳＯ−１の認識のために必要であった。２９３Ｉ
ＭＤＲ細胞にパルスしたとき、２つの重複するペプチドＥＳＯｐ１１１−１３０
とｐ１１６−１３５は、認識された。ＧＭ−ＣＳＦ分泌を測定する前に、１×１
０⁵標的細胞を、４×１０⁴のＴＥ４−１細胞と一晩共培養した。（４Ｃ）ＥＳＯ
ｐ１１６−１３５ペプチドでパルスした２９３ＩＭＤＲの認識は、抗ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ抗体（ＨＢ５５）によって特異的に阻害されたが、抗クラスＩ抗体（ＨＢ９５
）によっては阻害されなかった。抗体の非存在下でＴＥ４−１によって分泌され
たＧＭ−ＣＳＦの量を参照として用い、この参照に対し、抗体存在下のＧＭ−Ｃ
ＳＦ放出のパーセントを計算した。コントロール（マウスＩｇＧ２ａ）と抗ＭＨ
Ｃ−クラスＩ抗体（ＨＢ９５）による阻害は殆ど効果を有しなかった。ＣＴＬＣ
３Ｇ１（Ｃ．Ｍａｃａｌｌｉの好意）は、６２４．３８ｍｅｌを認識するｇｐ１
００特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞株であり、ＨＢ９５の活性についてのコントロールと
して使用した（図４Ｄ）。Ｔ３−８０は、１３６２ｍｅｌを認識するＣＤ４⁺Ｔ
細胞株であり、ＨＢ５５の活性についてのコントロールとして使用した（図４Ｅ
）。

【図５】ＣＤ４⁺Ｔ細胞株ＴＥ４−１による腫瘍細胞の認識。ＴＥ４−１の標的として
使用した全てのメラノーマ株は、ＦＡＣＳとＲＴ−ＰＣＲによってそれぞれ、Ｈ
ＬＡ−ＤＲ４とＮＹ−ＥＳＯ−１の発現について分析された。ＴＥ４−１は、Ｈ
ＬＡ−ＤＲ４分子を構成的に発現しているＮＹ−ＥＳＯ−１⁺腫瘍株（１３５９
ｍｅｌ及びＦ０４９ｍｅｌ）を認識できた。ＤＲ１及びＮＹ−ＥＳＯ−１を発現
しているＦ０５０ｍｅｌもＴ細胞によって認識された。コントロール標的５２６
ｍｅｌ（ＤＲ４陽性及びＮＹ−ＥＳＯ−１陰性）、３９７ｍｅｌ、６２４．３８
ｍｅｌ（ＤＲ陰性及びＮＹ−ＥＳＯ−１陽性）、又は１３００ｍｅｌ（ＤＲ１陽
性及びＮＹ−ＥＳＯ−１弱陽性）のいずれに対しても反応性は無かった。

【図６】ＴＥ４−１によって認識されるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドエピトープの特徴付
け。（６Ａ）ＨＬＡＤＲ拘束ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープのアンカー位置の決
定。１０８８ＥＢＶＢ細胞を記載されたペプチド２０Ｍでパルスした。ＧＭ−
ＣＳＦを測定する前に、ＴＥ４−１細胞を一晩、標的細胞と共培養した。（６Ｂ
）ＥＳＯｐ１１９−１３０を用いるペプチド力価測定実験。ＥＳＯｐ１１９−１
３０は、図６Ａに示すように、その認識に基づいて選択された。記載された濃度
で希釈したＥＳＯｐ１１９−１３０を、１０８８ＥＢＶＢ細胞上にパルスした
。この１０８８ＥＢＶＢ細胞は、ＴＥ４−１による認識のための標的として用
いられた。コントロールペプチドＥＳＯｐ９１−１１０の認識は、３３Ｍの最高
濃度でのみ測定された。

【図７】（７Ａ）ＡＰＣとしてＤＲ１＋ＥＢＶＢを用いる、ＴＥ４−１によるＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１タンパク質とＥＳＯｐ１１６−１３５の認識。ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパ
ク質（５μｇ／ｍｌ）とペプチド（３３μＭ）を、５８６ＥＢＶＢ（ＤＲ１＋
）上にパルスし、２度洗浄した。次いで、ＧＭ−ＣＳＦをアッセイする前に、Ｔ
Ｅ４−１Ｔ細胞を加え、一晩共培養した。（７Ｂ）ＥＳＯｐ１１６−１３５（
３３μＭ）でパルスした５８６ＥＢＶＢを用いて、ブロッキング抗体の存在下
及び非存在下でＴＥ−４を刺激した。ＩＩＤ９５（抗クラスＩ抗体）、ＩＩＢ５
５（抗ＤＲ抗体）及びアイソタイプコントロール抗体を用いた。

【図８】合成ペプチドによるインビトロ刺激後のＰＢＭＣからのＣＤ４⁺Ｔ細胞の産生
。（図８Ａ）３回のインビトロ刺激後、特異的ペプチド反応性をマルチプルウェ
ルで検出した。９６ウェルプレートで各々２．５×１０⁵ＰＢＭＣを含む合計２
４ウェルを３週間弱く刺激した。２４ウェルの１５ウェルは、顕著な増殖を示し
、そして比活性について試験した。各ウェルからのＴ細胞を、１０８８ＥＢＶＢ
細胞、及びＥＳＯｐ１６１−１８０ペプチドでパルスした１０８８ＥＢＶＢ細胞
とそれぞれインキュベートした。ＧＭ−ＣＳＦ放出を上清から測定した。（図８
Ｂ）ＴＥ４−２Ｔ細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド及びタンパク質と特異的
に反応した。重複するペプチドＥＳＯｐ１６１−１８０とＥＳＯｐ１５６−１７
５を、２０μｇ／ｍｌで９０分間、１０８８（ＤＲ４⁺）と５８６ＥＢＶＢ（Ｄ
Ｒ１⁺）細胞にパルスした。ＥＳＯｐ９１−１１０をパルスについての無関係ペ
プチドとして用いた。精製ＮＹ−ＥＳＯ−１とＥＳＯ１−７５タンパク質を、同
じモル比を維持するために、それぞれ５μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌで一晩パルス
した。３度の洗浄後、ＴＥ４−２Ｔ細胞を加え、一晩インキュベートした。Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ放出を測定した。（図８Ｃ）ＥＳＯｐ１６１−１８０でパルスしたＥ
ＢＶＢ細胞のパネルを、ＴＥ４−２ＣＤ４⁺Ｔ細胞の標的として用いた。これ
らのＥＢＶＢ株は、異なるＨＬＡＤＲ及びＤＱ対立遺伝子を発現することが知
られていた。それらのＨＬＡＤＰ対立遺伝子を、本研究では分子的にタイプ分
けした（表２）。

【図９】抗ＤＰ抗体によるＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープのＴ細胞認識のブロッキング。
２０μｇ／ｍｌＥＳＯｐ１６１−１８０ペプチドでパルスした１０８８ＥＢＶ
Ｂ細胞を、異なるブロッキング抗体存在下、標的細胞として使用した。使用した
抗体の特異性は次のようであった：抗ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡＡ，Ｂ，Ｃ）抗
体（Ｗ６／３２）、抗ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡＤＰ，ＤＱ，ＤＲ）抗体（Ｉ
ＶＡ１２）、抗ＨＬＡＤＰ抗体（Ｂ４／２１）、抗ＨＬＡＤＲ抗体（Ｌ２４
３）及び抗ＨＬＡＤＱ抗体（Ｇｅｎｏｘ３．５３（抗ＤＱｗ１）及びＩＶＤ１
２（抗ＤＱｗ３）の混合物）。全ての抗体を、各々、最終濃度２０μｇ／ｍｌで
用いた。（図９Ａ）ＣＫ３Ｈ６Ｔ細胞は、ＨＬＡＡ２の状況においてｇｐ１
００ｐ２０９−２１８ペプチドを特異的に認識し、そして抗ＭＨＣクラスＩ抗体
のための特異性コントロールとして用いた（図９Ｂ）。ｇｐ１００ｐ２０９−２
１８ペプチドでパルスした１０８８ＥＢＶＢ（Ａ２⁺）を標的として用いた。Ｃ
Ｄ４⁺Ｔ細胞株（Ｔ３−８０）は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束様式で１３６２ｍｅｌを認
識し、そして抗ＭＨＣクラスＩＩ及び抗ＤＲ抗体のための特異性コントロールと
して用いた（図９Ｃ）。

【図１０】ＴＥ４−２ＣＤ４⁺Ｔ細胞による腫瘍細胞と２９３ＣＩＩＴＡ／ＮＹ−ＥＳ
Ｏ−１の認識。（図１０Ａ）ＴＥ４−２は、ＮＹ−ＥＳＯ−１とＤＰ４の両方を
発現しているメラノーマ株を認識した。公知のＮＹ−ＥＳＯ−１発現（ＲＴ−Ｐ
ＣＲによって）とＨＬＡＤＰタイプ（ＲＴ−ＰＣＲと配列決定によって決定）
をもつメラノーマ株を、標的として使用した。この実験で、ＭＨＣクラスＩＩ発
現をアップレギュレートするために、一晩のＩＦＮ−γ処理（５００ユニット／
ｍｌ）を、Ｆ０２６ｍｅｌ、５２６ｍｅｌ、及び３９７ｍｅｌについて行った。
サイトカイン放出を測定する前に、ＴＥ４−２Ｔ細胞を腫瘍細胞と一晩共培養
した。（図１０Ｂ）ＴＥ４−２ＣＤ４⁺Ｔ細胞株は、インバリアント鎖（Ｉｉ
）ターゲティング配列の存在下又は非存在下においてＮＹ−ＥＳＯ−１でトラン
スフェクトされた２９３ＣＩＩＴＡを認識した。親の２９３細胞と２９３ＣＩＩ
ＴＡ細胞を、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ｐＥＳＯ）、Ｉｉ−ＮＹ−ＥＳＯ−１（ｐＩｉ
−ＥＳＯ）、又はＧＦＰ（ｐＧＦＰ）をそれぞれコードするプラスミドでトラン
スフェクトした。サイトカイン放出をアッセイする前に、ＴＥ４−２Ｔ細胞を
、トランスフェクタントと共に一晩、共培養した。

【図１１】ＴＥ４−２によって認識されるＴ細胞エピトープの特徴付け。（図１１Ａ）Ｔ
細胞認識のためのＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープのアンカー残基と最小長さの決定
。Ｎ又はＣ末端にアミノ酸欠失を有する合成ペプチドを用いて、４０μｇ／ｍｌ
で１０８８ＥＢＶＢ細胞をパルスした。次いで、ＥＢＶＢ細胞を徹底的に洗浄し
、ＴＥ４−２Ｔ細胞を刺激するために、標的細胞として用いた。２つの別々の
実験を行い、この図の上のパネルと下のパネルとして示した。（図１１Ｂ）Ｔ細
胞認識に必要な最小ペプチド濃度の決定。ＥＳＯｐ１５７−１７０ペプチドを用
いて、種々の濃度で１０８８ＥＢＶＢ細胞をパルスした。次いで、ペプチドをパ
ルスされた細胞を洗浄し、ＴＥ４−２株を刺激するために、標的として用いた。
コントロールペプチドＥＳＯｐ９１−１１０を、最高濃度３３μＭでのみ用いた
。（図１１Ｃ）ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞によるＤＰＢ１^*０４０１
−拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープの認識。ＴＥ８−１細胞株を、ＥＳＯｐ１５７
−１６７ペプチドによるインビトロ刺激によって、親ＴＥのＰＢＭＣから作製し
た。Ｌ０２３ＥＢＶＢ細胞（ＨＬＡ−Ａ２⁺，ＤＰ４^-）を、無血清培地において
、ＤＰＢ１^*０４０１エピトープ領域をカバーするペプチドでパルスし、洗浄し
、ＴＥ８−１Ｔ細胞を刺激するために用いた。

【図１２】ＴＥ４−２ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＴＥ８−１ＣＤ８⁺Ｔ細胞による認識について
のペプチドの力価測定（図１２Ａ）５８６ＥＢＶＢ細胞（Ａ２−，ＤＰ４＋）を
抗原提示細胞として用い、種々の濃度で、記載されたペプチドでパルスした。細
胞を洗浄し、次いで、サイトカイン放出をアッセイする前に、ＴＥ４−２ＣＤ
４＋Ｔ細胞とインキュベートした。（図１２Ｂ）Ｌ０２３ＥＢＶＢ細胞（Ａ２＋
，ＤＰ４−）を抗原提示細胞として用い、種々の濃度で、記載されたペプチドで
パルスした。細胞を洗浄し、次いで、サイトカイン放出をアッセイする前に、Ｔ
Ｅ４−２ＣＤ４＋Ｔ細胞とインキュベートした。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年３月２７日（２００２．３．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/39 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ４Ｃ０８５ 39/395 45/00 ４Ｃ０８７ 48/00 ４Ｈ０４５ 45/00 Ａ６１Ｐ 35/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/82 Ａ６１Ｐ 35/00 16/32 Ｃ０７Ｋ 14/82 19/00 16/32 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 7/00 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/06 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｅ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ロウゼンバーグ、スティーヴンエイ．アメリカ合衆国、メリーランド州 20854、ポトマック、アイアンゲイトロウド 10104 (72)発明者ゼン、ガンアメリカ合衆国、メリーランド州 20874、ジャーマンタウン、イーグルスネストコートナンバーディー 12212 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA36 BA41 CA04 CA12 DA06 EA02 EA04 GA11 HA12 4B063 QA01 QQ03 QQ08 QQ53 QR32 QR48 QR55 QS34 4B064 AG27 AG31 CA01 CA02 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA45 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA19 BA01 BA17 BA44 CA53 DA01 DC50 MA02 NA14 ZB26 4C085 AA03 AA13 AA14 BB01 BB12 CC08 EE01 FF18 4C087 AA01 BC83 MA02 ZB26 4H045 AA11 AA20 AA30 BA15 BA16 BA17 BA18 BA41 BA71 BA72 CA40 DA75 DA76 DA86 EA29 EA51 FA73 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＮＹ−ＥＳＯ−１癌ペプチド、即ち配列番号１及びその変異
体からなる核酸配列内にコードされるＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ、
その機能性部分、変異体又は誘導体。
【請求項２】エピトープが、配列番号２、そのホモログ又は機能性部分か
らなる配列によってコードされる、請求項１に記載のＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣ
クラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ、その機能性部分又は誘導体。
【請求項３】ペプチドが、配列番号２７又はその部分からなる配列によっ
てコードされる、請求項１に記載のＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ
細胞エピトープ、その機能性部分又は誘導体。
【請求項４】配列番号４〜２１及び２９〜３４、それらの機能性部分、誘
導体又は組み合わせの少なくとも１つを含むＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩ
Ｉ拘束Ｔ細胞エピトープ。
【請求項５】配列番号５〜１８、それらの機能性部分、誘導体又は組み合
わせからなる群から選択される、請求項４に記載のＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣク
ラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ。
【請求項６】ＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１９）、その変異体又は誘
導体を含む、請求項４に記載のＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞
エピトープ。
【請求項７】ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔリンパ球によって免疫学的に認識される
、請求項１〜５又は６のいずれかに記載のＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ
拘束Ｔ細胞エピトープ。
【請求項８】Ｔリンパ球がＣＤ４⁺である、請求項１〜５又は６のいずれ
かに記載のＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ。
【請求項９】癌ペプチドが、非ホジキンリンパ腫、白血病、ホジキンリン
パ腫、肺癌、肝癌、転移、メラノーマ、頭部癌、頚部癌、神経芽腫、腺癌、胸腺
腫、結腸癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、膀胱癌、腎癌、膵癌
、及び肉腫からなる群から選択される癌由来である、請求項４に記載のＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ。
【請求項１０】ＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣ（配列
番号２８）を含む核酸配列によってコードされる、請求項４に記載のＮＹ−ＥＳ
Ｏ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ。
【請求項１１】請求項１〜９又は１０のいずれかに記載のＮＹ−ＥＳＯ−
１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ及び医薬として許
容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】更に、免疫刺激分子を含む、請求項１１に記載の医薬組成
物。
【請求項１３】免疫刺激分子が、ＨＬＡ−クラスＩＩ分子上、又はＨＬＡ
クラスＩＩ分子を発現している細胞上にある、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】更に、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２
、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、サイトカイン又はそれらの組み合わせを含む、請求
項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】更に、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラス
Ｉ拘束Ｔ細胞エピトープを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】ＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープが配列番号２２又は
配列番号２３を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】請求項１〜９又は１０のいずれかに記載のＮＹ−ＥＳＯ−
１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを単独で又は組み
合わせて含み、かつ必要に応じて、少なくとも１つの免疫刺激分子を含む免疫原
。
【請求項１８】免疫刺激分子がＨＬＡクラスＩＩ分子である、請求項１７
に記載の免疫原。
【請求項１９】更に、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピ
トープを含む、請求項１７に記載の免疫原。
【請求項２０】ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープとＭＨＣクラスＩ
拘束Ｔ細胞エピトープがペプチド結合により一緒に結合している、請求項１９に
記載の免疫原。
【請求項２１】少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ
をコードしている、配列番号２７、その機能性部分又はホモログを含む単離され
た核酸配列。
【請求項２２】配列番号２４、２５、２６、又はその部分又は変異体から
なる群から選択される、請求項２１に記載の単離された核酸配列。
【請求項２３】配列番号４〜２１、２９〜３４、それらの組み合わせ、機
能性部分又は誘導体のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ＮＹ−ＥＳＯ−１の
少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする単離され
た核酸配列。
【請求項２４】更に、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラス
Ｉ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする核酸配列を含む、請求項２３に記載の単離
された核酸配列。
【請求項２５】請求項２１、２２、２３又は２４のいずれかに記載の核酸
配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項２６】請求項２５に記載の組換え発現ベクターによって形質転換
又はトランスフェクトされた宿主生物。
【請求項２７】抗原提示細胞である、請求項２６に記載の宿主生物。
【請求項２８】請求項２１、２２又は２３のいずれかに記載の核酸配列に
相補的な核酸配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】請求項２１、２２、２３又は２４のいずれかに記載の核酸
配列を含む組換えウイルス。
【請求項３０】レトロウイルス、バキュロウイルス、アンカラウイルス、
鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、及びレ
プリカーゼ−ベース−アルファウイルスからなる群から選択される、請求項２９
に記載の組換えウイルス。
【請求項３１】免疫刺激分子をコードする少なくとも１つの遺伝子を更に
含む、請求項２９に記載の組換えウイルス。
【請求項３２】免疫刺激分子がＨＬＡクラスＩＩ分子である、請求項３１
に記載の組換えウイルス。
【請求項３３】請求項２９〜３１又は３２のいずれかに記載の組換えウイ
ルスで形質転換又はトランスフェクトされた宿主生物。
【請求項３４】請求項１〜５又は６のいずれかに記載のＮＹ−ＥＳＯ−１
のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープと結合する、単離された抗体又はその
抗原結合部分。
【請求項３５】ＮＹ−ＥＳＯ−１の組換えＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エ
ピトープの製造方法であって、以下：ａ．請求項２１、２２又は２３のいずれかに記載のヌクレオチド配列、その機
能性部分又は変異体を、発現ベクターに挿入すること；ｂ．該発現ベクターを宿主細胞に移入すること；ｃ．エピトープ又はその機能性部分の発現に適切な条件下、宿主細胞を培養す
ること；及びｄ．組換えエピトープ又はその機能性部分を取得すること；を含む、方法。
【請求項３６】工程（ａ）において、ＨＬＡクラスＩＩ分子又はその部分
をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入することを更に含む、請求
項３５に記載の方法。
【請求項３７】哺乳動物における癌又は前癌の存在の検出方法であって、
以下：ａ．請求項２１、２２又は２３のいずれかに記載の核酸配列、それらの機能性
部分又は変異体と、哺乳動物から採取したｍＲＮＡの試験用生物学的サンプルと
を、該配列と該ｍＲＮＡとの間で複合体が形成される条件下で接触させること；ｂ．複合体を検出すること；ｃ．試験用サンプル中のｍＲＮＡ量を、既知の正常な生物学的サンプルからの
ｍＲＮＡ量と比較することであって、試験用サンプルからのｍＲＮＡ量の増大が
癌又は前癌の指標となること；を含む、方法。
【請求項３８】癌又は前癌がメラノーマである、請求項３７に記載の方法
。
【請求項３９】生物学的サンプル中のＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩ
Ｉ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその部分の検出方法であって、以下：ａ．サンプルと、請求項３４に記載の該エピトープに特異的な抗体又はその抗
原結合部分とを、該抗体と該エピトープとの間で免疫複合体が形成される条件下
で接触させること；及びｂ．免疫複合体の存在を検出することであって、その存在が生物学的サンプル
中のエピトープの指標となること；を含む、方法。
【請求項４０】哺乳動物における癌の予防又は阻害の方法であって、請求
項１〜５又は６のいずれかに記載のＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣ
クラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその機能性部分の有効量を単独で、又はＨ
ＬＡクラスＩＩ分子と組み合わせて該哺乳動物に投与することを含み、該量が哺
乳動物における癌の予防又は阻害に有効である。方法。
【請求項４１】ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ拘束
Ｔ細胞エピトープを投与することを更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】哺乳動物におけるメラノーマの阻害方法であって、以下：ａ．インビトロでＴ細胞を、請求項１〜５又は６のいずれかに記載のＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその機
能性部分に単独で、又はＭＨＣクラスＩＩ分子と組み合わせて、ＭＨＣクラスＩ
Ｉ拘束Ｔリンパ球を誘発するのに十分な時間、曝すこと；ｂ．該ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔリンパ球を単独で、又はＮＹ−ＥＳＯ−１の少
なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ、その機能性部分又はネ
イティブＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質と組み合わせて、メラノーマを阻害するた
めに十分な量で哺乳動物に投与すること；を含む、方法。
【請求項４３】哺乳動物における癌の予防又は阻害の方法であって、有効
量の、請求項２９に記載の組換えウイルスを単独で、又は外因性の免疫刺激分子
と組み合わせて、哺乳動物に投与することを含み、該量が癌を予防又は阻害する
ために有効である、方法。
【請求項４４】哺乳動物がＨＬＡクラスＩＩＤＲ分子を発現している、請
求項４３に記載の方法。
【請求項４５】ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープ
をコードする組換えウイルスの投与を更に含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】請求項２９に記載の組換えウイルスを単独で、又は外因性
の免疫刺激分子、化学療法剤、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤又はそれらの
組み合わせと組み合わせて含み、かつ医薬として許容できる担体を含む医薬組成
物。
【請求項４７】少なくとも、配列番号２７のフラグメント、又はその機能
性部分又は変異体を含むＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ
拘束Ｔ細胞エピトープをコードする遺伝子を担持し、かつ発現するトランスジェ
ニック動物。
【請求項４８】請求項１〜５又は６のいずれかに記載のＮＹ−ＥＳＯ−１
のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープによって誘発される癌抗原特異的ヒト
ＣＤ４⁺Ｔリンパ球。
【請求項４９】ＨＬＡ−クラスＩＩ分子を認識する、請求項４８に記載の
癌抗原特異的ヒトＣＤ４⁺Ｔリンパ球。
【請求項５０】ＨＬＡ−ＤＲ分子を認識する、請求項４８に記載の癌抗原
特異的ヒトＣＤ４⁺Ｔリンパ球。
【請求項５１】ペプチドが、アミノ酸モチーフ：Ｘａａ₁ＩＴＱＸａａ₂ＦＸａａ₃ＰＸａａ₄（配列番号５１）及びそのホモログ
（式中、Ｘａａ₁、Ｘａａ₂、Ｘａａ₃、及びＸａａ₄は各々少なくとも１つのアミ
ノ酸である）を含み、該ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４⁺Ｔリンパ球によ
って免疫学的に認識される、請求項１に記載の癌ペプチド。
【請求項５２】Ｘａａ₁が、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、
Ｖａｌ、Ａｌａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５
１に記載の癌ペプチド。
【請求項５３】Ｘａａ₂が、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、
及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５１に記載の癌ペプ
チド。
【請求項５４】Ｘａａ₃が、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、
Ｖａｌ、Ａｌａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５
１に記載の癌ペプチド。
【請求項５５】Ｘａａ₄が、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、
Ｐｒｏ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５１に記載
の癌ペプチド。
【請求項５６】約９乃至約３０個のアミノ酸を含む、請求項５１に記載の
癌ペプチド。
【請求項５７】約１０乃至約２０個のアミノ酸を含む、請求項５１に記載
の癌ペプチド。
【請求項５８】約１０乃至約１５個のアミノ酸を含む、請求項５１に記載
の癌ペプチド。
【請求項５９】ホモログがＬＡＧＥ遺伝子由来である、請求項５１に記載
の癌ペプチド。
【請求項６０】アミノ酸配列：Ｘａａ₁ＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ−Ｘａａ₂（配列番号５２）及びその変異体（式中、Ｘａａ₁及びＸａａ₂は各々、アミノ酸ではないか、又は１個以上の天然
に存在するアミノ酸である）を含む、請求項５１に記載の癌ペプチド。
【請求項６１】約１０乃至約３０個のアミノ酸を含む、請求項６０に記載
の癌ペプチド。
【請求項６２】約１０乃至約２０個のアミノ酸を含む、請求項６０に記載
の癌ペプチド。
【請求項６３】約１０乃至約１５個のアミノ酸を含む、請求項６０に記載
の癌ペプチド。
【請求項６４】ＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号８０）からなる、請求項
６０に記載の癌ペプチド。
【請求項６５】ＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬ（配列番号５５）、ＬＭＷ
ＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡ（配列番号５６）、ＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱ（配
列番号５７）、及びＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰ（配列番号５８）を含む、請
求項１に記載の癌ペプチド。
【請求項６６】ＨＬＡ−ＤＰＢ１^*０４０１−０４０２拘束ＣＤ４⁺Ｔリン
パ球によって免疫学的に認識される、請求項５１に記載のペプチド。
【請求項６７】キャリアタンパク質に結合している、請求項５１に記載の
ペプチド。
【請求項６８】キャリアタンパク質が、ＫＬＨ、破傷風トキソイド及びア
ルブミンからなる群から選択される、請求項６７に記載のペプチド。
【請求項６９】請求項５１、６０、６４又は６５のいずれかに記載のペプ
チドをコードする単離された核酸配列。
【請求項７０】配列番号５３、５５〜６４のいずれか１つ、又はそれらの
組み合わせを含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープペプ
チドをコードする単離された核酸配列。
【請求項７１】ストリンジェント条件下、請求項６９又は７０に記載の核
酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７２】アミノ酸モチーフＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番
号５４）又はその変異体を有し、ＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４⁺Ｔリンパ球とＭＨＣ
クラスＩ拘束ＣＤ８⁺Ｔリンパ球の両方によって免疫学的に認識される癌ペプチ
ド。
【請求項７３】変異体が、アルギニン残基の付加をアミノ末端に有する、
請求項７２に記載の癌ペプチド。
【請求項７４】変異体が、フェニルアラニンの代わりに置換されたアルギ
ニンをカルボキシル末端に有する、請求項７２に記載の癌ペプチド。
【請求項７５】ＨＬＡ−ＤＰＢ１^*０４０１−０４０２拘束Ｔリンパ球及
びＨＬＡ−Ａ２拘束Ｔリンパ球によって免疫学的に認識される、請求項７２に記
載のペプチド。
【請求項７６】請求項７２に記載のペプチドをコードする単離された核酸
配列。
【請求項７７】配列番号５４のペプチドをコードする単離された核酸配列
。
【請求項７８】ストリンジェント条件下、請求項７６又は７７に記載の核
酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７９】請求項６９に記載の核酸配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項８０】請求項７０に記載の核酸配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項８１】請求項７６に記載の核酸配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項８２】請求項７７に記載の核酸配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項８３】少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ
細胞癌ペプチドをコードする核酸配列を更に含む、請求項７９〜８２のいずれか
１項に記載の組換え発現ベクター。
【請求項８４】ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞癌ペプチドが
、以下：ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１０）；ＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴ（配列番号６５）；ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ（配列番号６６）；及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８３
に記載の組換え発現ベクター。
【請求項８５】少なくとも１つの単離されたＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−
クラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプチドをコードする核酸配列を更に含む、請求項８３に
記載の組換え発現ベクター。
【請求項８６】ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−クラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプチ
ドが、以下：Ｘａａ₁Ｘａａ₂Ｘａａ₃ＧＰＧＧＧＡＰＸａａ₄（配列番号２２）（式中、Ｘａａ₁は、アミノ酸ではないか、又は１乃至約２０個の天然に存在す
るアミノ酸であり；Ｘａａ₂は、Ａｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ₃は、Ｓｅｒ又は保存的置換であり；Ｘａａ₄は、Ａｒｇ又はＬｙｓである）及びそれらの誘導体を含む、請求項８５に記載の組換え発現ベクター。
【請求項８７】核酸配列が、ＡＳＧＰＧＧＧＡＰＲ（配列番号２３）をコ
ードする、請求項８６に記載の組換え発現ベクター。
【請求項８８】請求項７９〜８７のいずれか１項に記載のベクターによっ
て形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞又は宿主生物。
【請求項８９】請求項５１、６０、６４、６５又は７２のいずれか１項に
記載の少なくとも１つの癌ペプチドをコードする組換えウイルス。
【請求項９０】請求項８９に記載の組換えウイルスによって形質転換され
た宿主細胞又は宿主生物。
【請求項９１】配列番号５１〜６４、８０のいずれか１つ又はそれらの組
み合わせを含む、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープペプ
チドをコードする単離された核酸配列を含む組換えウイルス。
【請求項９２】ワクシニア、鶏痘、アデノウイルス、レトロウイルス、レ
ンチウイルス、バキュロウイルス、アンカラウイルス、及びレプリカーゼ−ベー
ス−アルファウイルスからなる群から選択される、請求項９１に記載の組換えウ
イルス。
【請求項９３】ＨＬＡ−ＤＰ分子をコードする核酸配列を更に含む、請求
項９１に記載の組換えウイルス。
【請求項９４】少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ
細胞癌ペプチドをコードする核酸配列を更に含む、請求項９１に記載の組換えウ
イルス。
【請求項９５】ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞癌ペプチドが
、以下：ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１０）；ＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴ（配列番号６５）；ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ（配列番号６６）；それらの変異体及び組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項９４に記載の組換えウイルス。
【請求項９６】少なくとも１つの単離されたＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−
クラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプチドをコードする核酸配列を更に含む、請求項９１に
記載の組換えウイルス。
【請求項９７】ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−クラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプチ
ドが、以下：Ｘａａ₁Ｘａａ₂Ｘａａ₃ＧＰＧＧＧＡＰＸａａ₄（配列番号２２）（式中、Ｘａａ₁は、アミノ酸ではないか、又は１乃至約２０個の天然に存在す
るアミノ酸であり；Ｘａａ₂は、Ａｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ₃は、Ｓｅｒ又は保存的置換であり；Ｘａａ₄は、Ａｒｇ又はＬｙｓである）及びそれらの誘導体を含む、請求項９６に記載の組換えウイルス。
【請求項９８】核酸配列が、アミノ酸配列ＡＳＧＰＧＧＧＡＰＲ（配列番
号２３）を含むペプチドをコードする、請求項９７に記載の組換え発現ベクター
。
【請求項９９】請求項９１〜９８のいずれか１項に記載のウイルスによっ
て形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞又は宿主生物。
【請求項１００】ＨＬＡ−ＤＰ分子をコードする核酸配列を更に含む、請
求項９９に記載の宿主細胞又は宿主生物。
【請求項１０１】請求項５１、６０、６４又は６５のいずれか１項に記載
のペプチド及び医薬として許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１０２】請求項７２に記載のペプチド及び医薬として許容できる
担体を含む医薬組成物。
【請求項１０３】請求項７９〜８７のいずれか１項に記載の組換え発現ベ
クター及び医薬として許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１０４】請求項９１〜９５のいずれか１項に記載の組換えウイル
ス及び医薬として許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１０５】免疫刺激分子を更に含む、請求項１０１に記載の医薬組
成物。
【請求項１０６】免疫刺激分子が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、
ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、サイトカイン又はそれらの組み合わせ
である、請求項１０５に記載の医薬組成物。
【請求項１０７】ＨＬＡ−クラスＩＩ分子又はＨＬＡ−クラスＩＩ分子を
発現している細胞を更に含む、請求項１０１に記載の医薬組成物。
【請求項１０８】ＨＬＡ−クラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＰである、請求項
１０７に記載の医薬組成物。
【請求項１０９】ＨＬＡ−クラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＰＢ１^*０４０１
−０４０２である、請求項１０８に記載の医薬組成物。
【請求項１１０】少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＲ拘束
Ｔ細胞癌ペプチドを更に含む、請求項１０１に記載の医薬組成物。
【請求項１１１】ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞癌ペプチド
が、以下：ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１０）；ＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴ（配列番号６５）；ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ（配列番号６６）；及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１
０に記載の医薬組成物。
【請求項１１２】少なくとも１つの単離されたＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ
クラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプチドを更に含む、請求項１０１に記載の医薬組成物。
【請求項１１３】ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−クラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプ
チドが、以下：Ｘａａ₁Ｘａａ₂Ｘａａ₃ＧＰＧＧＧＡＰＸａａ₄（配列番号２２）（式中、Ｘａａ₁は、アミノ酸ではないか、又は１乃至約２０個の天然に存在す
るアミノ酸であり；Ｘａａ₂は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ₃は、Ｓｅｒ又は保存的置換であり；Ｘａａ₄は、Ａｒｇ又はＬｙｓである）及びそれらの誘導体を含む、請求項１
１２に記載の医薬組成物。
【請求項１１４】ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡクラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプチ
ドは、ＡＳＧＰＧＧＧＡＰＲ（配列番号２３）を含む、請求項１１３に記載の医
薬組成物。
【請求項１１５】請求項６９、７０、７６又は７７のいずれか１項に記載
の核酸配列及び医薬として許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１１６】ＮＹ−ＥＳＯ−１ＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４⁺Ｔリンパ
球を誘発する、請求項５１、６０、６４、６５又は７２のいずれか１項に記載の
癌ペプチドを含む免疫原。
【請求項１１７】抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を誘発する、請求項１１６に記
載の免疫原。
【請求項１１８】アジュバントを更に含む、請求項１１６に記載の免疫原
。
【請求項１１９】ペプチドがキャリアタンパク質に結合している、請求項
１１６に記載の免疫原。
【請求項１２０】請求項５１、６０、６４、６５又は７２のいずれか１項
に記載の癌ペプチドを含む癌ワクチン。
【請求項１２１】請求項５１、６０、６４、６５又は７２のいずれか１項
に記載のＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープと結合する単離
された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１２２】ポリクローナル抗体である、請求項１２１に記載の抗体
。
【請求項１２３】モノクローナル抗体である、請求項１２１に記載の抗体
。
【請求項１２４】検出可能標識で標識されている、請求項１２１に記載の
抗体。
【請求項１２５】検出可能標識が放射性同位体である、請求項１２１に記
載の抗体。
【請求項１２６】細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤の付加によって修飾され
ている、請求項１２１に記載の抗体。
【請求項１２７】請求項１２１に記載の抗体及び医薬として許容できる担
体を含む医薬組成物。
【請求項１２８】請求項１２１に記載の抗体を含むキット。
【請求項１２９】イムノアッセイ試薬を更に含む、請求項１２８に記載の
キット。
【請求項１３０】抗体が更に、ＨＬＡ−ＤＰ分子と結合する、請求項１２
１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１３１】ＮＹ−ＥＳＯ−１の組換えＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４⁺Ｔ
細胞エピトープの製造方法であって、以下：ａ．配列番号５１〜６４、８０又はその部分若しくは変異体の少なくとも１つ
をコードするヌクレオチド配列を、発現ベクターに挿入すること；ｂ．発現ベクターを宿主細胞に移すこと；ｃ．エピトープ又はその部分の発現のために適切な条件下で宿主細胞を培養す
ること；及びｄ．組換えエピトープ又はその部分を取得すること；を含む、方法。
【請求項１３２】工程（ａ）において、ＨＬＡクラスＩＩ分子又はその部
分をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入することを更に含む、請
求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】ＨＬＡクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＰである、請求項１
３２に記載の方法。
【請求項１３４】配列番号５１〜６４又は８０の少なくとも１つのアミノ
酸配列を含む癌ペプチドを発現するベクターの製造方法であって、プロモーター
と機能可能に連結した配列番号５１〜６４又は８０の少なくとも１つをコードす
る単離された核酸配列を組み込むことを含む、方法。
【請求項１３５】哺乳動物における癌又は前癌の存在の検出方法であって
、以下：ａ．配列番号５１〜６４若しくは８０又はその部分若しくは変異体の少なくと
も１つをコードする核酸配列と、哺乳動物から採取したｍＲＮＡの試験用生物学
的サンプルとを、該配列と該ｍＲＮＡとの間で複合体が形成される条件下で接触
させること；ｂ．複合体を検出すること；ｃ．試験用サンプル中のｍＲＮＡ量を、既知の正常な生物学的サンプルからの
ｍＲＮＡ量と比較することであって、試験用サンプルからのｍＲＮＡ量の増大が
癌又は前癌の指標となること；を含む、方法。
【請求項１３６】癌又は前癌がメラノーマである、請求項１３５に記載の
方法。
【請求項１３７】哺乳動物における癌又は前癌の存在の検出方法であって
、以下：ａ）請求項５１、６０、６４、６５又は７２のいずれかに記載の癌ペプチドを
、該哺乳動物から得たリンパ球の試験用生物学的サンプルと接触させること；ｂ）該癌ペプチドと免疫応答性のＣＤ４＋Ｔリンパ球を検出することであって
、陰性コントロールサンプルと比較した、該癌ペプチドと免疫反応性のＣＤ４＋
Ｔリンパ球の数の増大が癌又は前癌の指標となること；を含む方法。
【請求項１３８】生物学的サンプルにおけるＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−
ＤＰ拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ又はその部分の検出方法であって、以下：ａ．サンプルを、請求項１２１〜１２５のいずれかに記載の、該エピトープに
特異的な抗体又はその抗原結合部分と、該抗体と該エピトープとの間で免疫複合
体が形成される条件下で接触させること；及びｂ．免疫複合体の存在を検出することであって、その存在が、生物学的サンプ
ルにおけるエピトープの指標となること；を含む、方法。
【請求項１３９】哺乳動物における癌の予防又は阻害の方法であって、請求項５１、６０、６４、６９又は７２のいずれかに記載の、ＮＹ−ＥＳＯ−１
のＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその部分の有効量を単独で、又はＨＬ
Ａ−ＤＰ分子と組み合わせて哺乳動物に投与することを含み、該量が該哺乳動物
において癌の予防又は阻害に有効である、方法。
【請求項１４０】ＨＬＡ−ＤＰ分子がＨＬＡ−ＤＰＢ^*０４０１−０４０
２である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ
を単独で、又はＨＬＡ−ＤＲ分子と組み合わせて投与することを更に含む、請求
項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ
が配列番号１０、６５又は６６の少なくとも１つを含む、請求項１４１に記載の
方法。
【請求項１４３】ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトー
プを投与することを更に含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４４】ＨＬＡクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープが配列番号２２又
は２３を含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現している腫瘍の増殖の阻害方法
であって、請求項５１、６０、６４、６５又は７２のいずれか１項に記載の癌ペ
プチドのある量を投与することを含み、該量がＮＹ−ＥＳＯ−１を発現している
腫瘍の増殖の阻害に有効である、方法。
【請求項１４６】哺乳動物におけるメラノーマの阻害方法であって、以下
：ａ．インビトロでＴリンパ球を、請求項５１、６０、６４、６５又は７２のい
ずれか１項に記載のＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞癌ペプチド又は
その部分に単独で、又はＨＬＡ−ＤＰ分子と組み合わせて、ＮＹ−ＥＳＯ−１
ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔリンパ球を誘発する十分な時間、曝すこと；ｂ．メラノーマを阻害するために十分な量で、哺乳動物に該Ｔリンパ球を投与
すること；を含む、方法。
【請求項１４７】哺乳動物に癌ペプチド又はネイティブＮＹ−ＥＳＯ−１
タンパク質を投与することを更に含む、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】哺乳動物における癌の予防又は阻害の方法であって、請
求項９１に記載の組換えウイルスの有効量を単独で、又は外因性の免疫刺激分子
と組み合わせて、哺乳動物に投与することを含み、該量が癌の予防又は阻害に有
効である、方法。
【請求項１４９】哺乳動物はＨＬＡ−ＤＰ分子を発現している、請求項１
４８に記載の方法。
【請求項１５０】ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトー
プをコードする組換えウイルスを投与することを更に含む、請求項１４８に記載
の方法。
【請求項１５１】ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現している腫瘍の腫瘍増殖の阻害
方法であって、請求項６９、７０、７６又は７７のいずれか１項に記載の核酸の
ある量を投与することを含み、該量が腫瘍の増殖の阻害に有効である、方法。
【請求項１５２】請求項９１に記載の組換えウイルスを単独で、又は外因
性の免疫刺激分子、化学療法剤、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤又はそれら
の組み合わせと組み合わせて含み、かつ医薬として許容できる担体を含む医薬組
成物。
【請求項１５３】配列番号５１〜６４、８０、又はその機能性部分の少な
くとも１つを含むＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトー
プをコードする遺伝子を担持し、かつ発現するトランスジェニック動物。
【請求項１５４】請求項５１、６０、６４、６５又は７２のいずれかに記
載のＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープと免疫応答性である
癌抗原特異的ヒトＣＤ４⁺Ｔリンパ球。
【請求項１５５】ＨＬＡＤＰＢ１^*０４０１−０４０２分子を認識する、
請求項１５４に記載の癌抗原特異的ヒトＣＤ４⁺Ｔリンパ球。
【請求項１５６】配列番号５１〜６４又は８０の少なくとも１つを含む癌
ペプチドキャリアと結合した標的抗原又はその標的エピトープを含む、標的抗原
−癌ペプチドキャリア結合体。
【請求項１５７】標的抗原が、ＴＲＰ２、ＧＰ−１００、ＴＲＰ１、ＨＩ
Ｖ抗原、ｇｐ１２０、マラリア抗原及びそれらのエピトープからなる群から選択
される、請求項１５６に記載の標的抗原−癌ペプチドキャリア結合体。
【請求項１５８】配列番号５１〜６４又は８０の少なくとも１つを含む癌
ペプチドキャリアをコードする核酸配列、標的抗原又はその標的エピトープをコ
ードする少なくとも１つの核酸配列を含む核酸ワクチン構築物。
【請求項１５９】標的抗原又はその標的エピトープが、ＴＲＰ２、ＧＰ−
１００、ＴＲＰ１、ＨＩＶ抗原、ｇｐ１２０、マラリア抗原及びそれらのエピト
ープからなる群から選択される、請求項１５８に記載の核酸ワクチン構築物。
【請求項１６０】ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現している細胞の増殖の阻害方法
であって、請求項２９又は９１に記載の組換えウイルスのある量を投与すること
を含み、該量が細胞の増殖の阻害に有効である、方法。
【請求項１６１】ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現している細胞の増殖の阻害方法
であって、請求項２３、６９又は７７のいずれか１項に記載の核酸配列のある量
を投与することを含み、該量が細胞の増殖の阻害に有効である、方法。