JP5588363B2 - 癌抗原nyeso−1由来の新規mhcクラスii拘束t細胞エピトープ - Google Patents
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Description
本発明は、癌診断及び癌ワクチンを含む癌治療の領域に関する。より詳細には、本発明は、癌ペプチドNY−ESO−1由来の新規なヒトMHCクラスII拘束T細胞エピトープ及びそのアナログ並びにMHCIIクラスII拘束T細胞エピトープ又はその部分をコードするDNA配列の単離と精製に関する。特に、本発明は、NY−ESO−1由来のHLA−DR及びHLA−DP拘束T細胞エピトープに関する。本発明は更に、個体における癌及び前癌の検出、診断及び治療の方法に関する。
T細胞は、腫瘍増殖を制御し、腫瘍退行を媒介するのに重要な役割を果たす。T細胞媒介抗腫瘍免疫の分子的基盤を理解するために、CD8+T細胞によって認識される多くの腫瘍抗原が、メラノーマや他の種類の癌で同定されてきた(1〜3)。これらの研究は、分子的に明確な腫瘍抗原由来のペプチドを用いる幾つかの臨床試験に至った(4〜7)。gp100由来の修飾ペプチドを用いる臨床試験は、転移性メラノーマの患者の治療に対し治療的効力の幾分かの証拠をもたらしたが(4)、これらの研究は主にCD8+T細胞の使用に焦点をあてていた。ヒト及び動物研究の両方からの証拠の増大は、最適の癌ワクチンがCD4+及びCD8+T細胞の両方の参加を必要とすることを示した(8,9)。更に、腫瘍特異的CD4+T細胞は、MHCクラスII陰性腫瘍細胞に対する防御免疫を産生するのに必要とされる(10,11)。それ故、このような抗原の同定は、癌ワクチンの開発及びCD4+T細胞が宿主免疫応答を制御する機構を我々が理解するために重要である。
本発明の1つの目的は、CD4+Tリンパ球によってMHCクラスII拘束T細胞エピトープとして認識される新規ペプチド及びその部分を提供することである。本発明の抗原性癌ペプチドは、NY−ESO−1(本明細書ではCAG−3と交換可能に使用される用語)遺伝子(配列番号1)(Genbank登録番号 AF038567; 8:9)内もしくは部分によって、又はその変異体もしくはホモログ(例えば、LAGE遺伝子)(Genbank登録番号 AJ223040, AJ223041及びAJ223093)内もしくは部分によってコードされる。
本発明は、免疫系のMHCクラスII拘束CD4+Tリンパ球によって免疫学的に認識されるNY−ESO−1の癌エピトープ、その部分、誘導体又は変異体を包含する。本発明の癌エピトープは、免疫系のCD4+T細胞との相互作用によって、体液性媒介免疫応答を特異的に引き起こす。抗原性癌エピトープとCD4+T細胞とのこの相互作用は、ヒトを含む哺乳動物における癌の予防、除去、又は減少において、CD4+T細胞が抗原性癌エピトープに反応し、免疫系の他の細胞をリクルートすることを引き起こす。
APPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRL(配列番号7);
APPLPVPGVLLKEFTVS(配列番号8);
APPLPVPGVLLKEFTV(配列番号9);
LPVPGVLLKEFTVSG(配列番号10);
PVPGVLLKEFTVSG(配列番号11);
VPGVLLKEFTVSG(配列番号12);
PGVLLKEFTVSG(配列番号13);
GVLLKEFTVSG(配列番号14);
LLKEFTVSGNILTIR(配列番号15);
LKEFTVSGNILTIRL(配列番号16);
KEFTVSGNILTIRL(配列番号17);
LPVPGVLLKEFTVSGNILTI(配列番号18);
又はそれらの変異体若しくは誘導体を含む。
DHRQLQLSIS SCLQQLS(配列番号29);
DHRQLQLSIS SCLQ(配列番号30);
QLQLSIS SCLQQL(配列番号31)
又はそれらの変異体及び誘導体を含む。
WITQCFLPVF LAQPPSGQRR(配列番号21)
その部分、変異体及び誘導体を含む。一実施態様では、配列番号21の部分は、アミノ酸配列:
QCFLPVF LAQPPSGQRR(配列番号32);
LPVF LAQPPSGQRR(配列番号33);
CFLPVF LAQPPSGQ(配列番号34);
又はそれらの変異体及び誘導体を含む。
Xaa1ITQXaa2FXaa3PXaa4(配列番号51)
(式中、Xaa1は、少なくとも1つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、Trp、Phe、Tyr、Met、Ile、Val、Ala及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa2は、少なくとも1つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、Cys、Ser、Val、Ala、Thr、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa3は、少なくとも1つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、Leu、Phe、Tyr、Met、Ile、Val、Ala、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa4は、少なくとも1つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、Val、Tyr、Ile、Ala、Leu、Pro、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸である)の一般的なアミノ酸モチーフを含む、NY−ESO−1のHLA−DP拘束T細胞エピトープである。
151-SCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSG-177(配列番号53);
SLLMWITQCFLPVF(配列番号54);
LLMWITQCFLPVFL(配列番号55);
LMWITWCFLPVFLA(配列番号56);
MWITQCFLPVFLAQ(配列番号57);
WITQCFLPVFLAQP(配列番号58);
ITQCFLPVFLAQPP(配列番号59);
QQLSLLMWITQCFL(配列番号60);
QLSLLMWITQCFLP(配列番号61);
LSLLMWITQCFLPV(配列番号62);及び
それらの誘導体を含む。
Xaa1Xaa2Xaa3GPGGGAPXaa4(配列番号22)
(式中、Xaa1は、アミノ酸ではないか、又は1乃至約20個の天然のアミノ酸、好ましくは1乃至5個のアミノ酸であり;
Xaa2は、Ala、Thr、Val、Leu、又はArgであり;
Xaa3は、Ser、又はAla、Val、Ile、Leu、Thrなどの保存的置換であり;
Xaa4は、Arg、Lys、好ましくはArg)並びにそれらのフラグメント及び誘導体によって表される癌ペプチドが挙げられるがそれらに限定されない。一実施態様では、医薬組成物で使用されるMHCクラスI拘束NY−ESO−1癌ペプチドとしては、アミノ酸配列:ASGPGGGAPR(配列番号23)が挙げられる。
CAG GAT GCC CCA CCG CTT CCC GTG
CCA GGG GTG CTT CTG AAG GAG TTC
ACT GTG TCC GGC AAC ATA CTG ACT
ATC CGA CTC(配列番号24)又はその機能性部分又は変異体
を含む。
AGA CCA CCG CCA ACT GCA GCT
CTC CAT CAG CTC CTG TCT CCA GCA
GCT TTC CCT GTT GAT(配列番号25)又はその機能性部分又は変異体を含む。
TGG ATC ACG CAG TGC TTT CTG CCC
GTG TTT TTG GCT CAG CCT CCC
TCA GGG CAG AGG CGC(配列番号26)又はその機能性部分又は変異体を含む。
19:816-823に開示のように、カチオン性脂質が好ましく、例えば、中性リン脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)と複合した、ポリカチオン性脂質であるジミリスチルオキシプロピル−3−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム(DMRIE)が好ましい。
材料および方法
組換えNY−ESO−1タンパク質の生成および解析:完全長NY−ESO−1遺伝子をコードする細菌発現ベクターを構築するために、本発明者らは一対のプライマー、NdeI部位を含むESO−5p(5’GCTCCGGACATATGCAGGCCG AAGGCCGGGG)(配列番号35)およびXhoI部位を含むESO−3p(5’AAGGGGCTCGAGGCT GGGCTTAGCGCCTCT)(配列番号36)を用いて、PCRフラグメントを作製した。PCR産物の制限酵素による消化およびゲル精製の後、NY−ESO−1をコードするDNAフラグメントをポリヒスチジンペプチドをコードするDNAとpET−28(+)(Novagen,マジソン,WI)内でインフレームに融合させた。同様のストラテジーを、最初の74のアミノ酸残基のみを含むトランケートNY−ESO−1であるESO1−74の発現ベクターを構築するのにも使用した。正確なプラスミド構築物を保持するE.coli株BL21(DE3)を37℃で対数期まで増殖させ、次いで、イソプロピル−d−チオガラクトシド(IPTG)を終濃度0.5mMまで添加し3時間振盪することによってタンパク質産生を誘導した。細菌抽出物の可溶性画分を得た。またNY−ESO−1をNi2+アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製タンパク質のSDS−PAGE解析を先の報告(25)のように行った。精製タンパク質のN末端配列を自動Edman分解により決定した。
組換えNY−ESO−1タンパク質およびNY−ESO−1反応性抗体の検出
NY−ESO−1反応性抗体およびCTLは、癌の患者において報告されている(19〜22)。従って、NY−ESO−1特異的CD4+T細胞がNY−ESO−1抗原に対する抗体の発生およびCTLの調整に関与しているかもしれないようである。しかし、NY−ESO−1由来のCD4+T細胞エピトープはこれまで報告されていない。MHCクラスII拘束CD4+T細胞エピトープを同定するために、本発明者らは、細菌発現系からNY−ESO−1タンパク質を出発物質として精製することから始めた。NY−ESO−1発現およびタンパク質精製を促進するため、NY−ESO−1をコードするcDNAフラグメントを、pET28発現ベクターのN末端に位置するポリヒスチジンタグにインフレームで融合し、組換えタンパク質の高レベル産生を得た。数ミリグラムのNY−ESO−1タンパク質をNi2+荷電アフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して精製した。精製タンパク質はSDSポリアクリルアミドゲル上およそ26kDaの見かけの分子量を示した(図2A)。精製タンパク質の同定を確認するために、タンパク質のN末端マイクロシークエンシングを自動Edman分解により行った。Edman分解により得られた25アミノ酸残基すべては予測したアミノ酸配列と一致した(データ示さず)。最初の74アミノ酸残基を含む短い形のNY−ESO−1(ESO1−74)もまた同じアプローチにより精製した(図2A)。
HLA−DR4−トランスジェニックマウス由来の推定MHCクラスII拘束エピトープの同定
CD4+T細胞エピトープを同定するために、DR4トランスジェニックマウスをCFA中およそ50gの完全長NY−ESO−1タンパク質で、尾の付け根および後肢足蹠に免疫した。注射後11日目に、2匹の免疫したマウスの両後肢膝窩および鼠径部リンパ節から得た単一の細胞懸濁液を調製し、HLA−DR4分子の推定ペプチド結合能に基づくNY−ESO−1タンパク質由来合成ペプチドでのインビトロ感作に使用した(27)。
NY−ESO−1特異的なヒトCD4+T細胞の作製
NY−ESO−1に対する高力価の抗体を持っていた患者TE(図2C)由来のPBMCを、ESO p116−135ペプチドを用いたインビトロ刺激に使用した。インビトロ刺激の1週間後、患者TE由来のPBMCは著しい増殖を示した。IL−2を刺激の2週目に添加した。このように樹立した細胞株をTE4−1と命名し、これを20 CU/mlのIL−2の存在下、2週間超、増殖させ続けた。TE4−1 T細胞は、FACS解析に基づくと、90%CD4+T細胞であった。TE4−1はTh1型CD4+T細胞を含んでいた。というのは、それらがGM−CSF、IFN−およびTNFを分泌し、IL−10またはIL−4を分泌しなかったからである(データ示さず)。CD8+T細胞を数%減少させた後、CD4+T細胞の精製集団は依然その反応性を保持していた。TE4−1細胞株由来のT細胞クローンにもESO p116−135ペプチドを認識することを示すものもあった(データ示さず)。
TE4−1による腫瘍細胞の認識
ペプチド特異的CD4+およびCD8+T細胞活性は推定腫瘍抗原に対してしばしば生じ得たが、多くの場合には、腫瘍反応性は、T細胞の低親和性または腫瘍細胞表面上で天然にプロセシングされるペプチドの提示の失敗のいずれかに起因して示され得なかった(3)。TE4−1が腫瘍細胞により天然にプロセシングされ提示されるNY−ESO−1エピトープを認識することができたかどうかを試験するために、いくつかのメラノーマ株を標的として使用した。各株におけるNY−ESO−1の発現はRT−PCRにより決定し、HLA−DR対立遺伝子の発現はFACS解析により決定した(データ示さず)。図5に示されるように、TE4−1はNY−ESO−1/HLA−DR4陽性腫瘍(1359melおよびF049mel)を認識することができたが、腫瘍細胞株397melおよび624.38mel(NY−ESO−1+/HLA−DR-)、ならびに526mel(NY−ESO−1-/HLA−DR4+)は認識することができなかった。興味深いことに、TE4−1もまたF050mel(DR1+/NY−ESO−1+)を認識したが、DR1および低レベルのNY−ESO−1を発現する1300melは認識しなかった。1つの可能な説明は、CD4+T細胞が異なるDR分子により提示される同一のペプチドを認識するかもしれないということである。F049melの認識は、抗HLA−DR抗体の存在下特異的にブロックされ得るが、抗MHCクラスI抗体の存在下にはされない(データ示さず)。これらの研究は、TE4−1細胞株が腫瘍細胞表面で天然にプロセシングされたペプチドを認識することを示唆した。
TE4−1により認識されるNY−ESO−1エピトープの特徴付け
2つの反応性ペプチドが15アミノ酸(LPVPGVLLKEFTVSG)(配列番号10)を共有するので、ペプチドの最小長を一連のN−およびC−末端トランケートペプチドを試験することによって決定した。ペプチドをDR4+1088EBV B細胞にパルスし、TE4−1細胞を刺激するその能力を試験した。128位のバリン残基がT細胞認識に重要であることが見出された(図6A)。123位のロイシン残基までのN末端欠失を有するペプチドは、T細胞認識に影響を与えなかったが、さらに欠失を有するペプチドはT細胞を刺激するその能力を一部失った。P1、P4、P6およびP7残基がMHCクラスII分子へのペプチド結合に寄与したので、123位のロイシン残基はP1アンカー残基であり得る。さらなる欠失が、MHCクラスII分子に結合するための重要な残基を決定するために必要である。
本発明者らは、T4−1 CD4+T細胞株がDR4およびおそらくDR1にもまた関連してESO p116−135を認識することを示した。ここで、TE4−1がHLA−DR1に関連してペプチドだけでなくタンパク質も認識できることが示される。認識は抗DR抗体によりブロックされる(図7Aおよび7B)。この結果は、ESO p116−135が雑多なペプチドであり得、DR4およびDR1に結合できることを示す。従って、このペプチドワクチンの適用可能な集団は非常に大きい。
HLA−DP研究の材料および方法
研究に使用した細胞株、組織培養試薬、および抗体
293CIITAは、MHCクラスIIトランスアクチベーターをコードするレトロウイルスを有する293細胞の形質導入により作製した細胞株である(53)(このレトロウイルスプラスミドはthe University of South Florida, タンパ, FLのDr. George Blancの好意である)。すべてのメラノーマ株およびEBVB株を、10%ウシ胎仔血清(Biofluid, Inc.,ゲーサーズバーグ,MD)を補充したRPMI1640(Life Technologies,ロックビル,MD)中で作製し維持した。リンパ球の培養培地は、0.05mM β−メルカプトエタノール、50CU/ml IL−2+10%ヒト男性AB血清(Valley Biochemicals Inc.(ウィンチェスター,VA)により供給された)を含むRPMI1640であった。ブロッキングアッセイに使用した抗体は以下の供給源から得た:W6/32(HLAクラスI)およびL243(HLA DR)はLoftstrand Labs Lt.(ゲーサーズバーグ,MD)により精製されたハイブリドーマ上清であった;抗体クローンIVA12(HLAクラスII)、B7/21(HLA DP)、Genox3.53およびIVD12(両方ともHLA DQ)はBeckton Dickinson Immunocytometry Systems(サンノゼ,CA)から購入した。
pESOプラスミドは、先の記載(45)のようにCMVプロモーターにより駆動されるNY−ESO−1cDNAを含む発現ベクターであった。pIi−ESOプラスミドを、全NY−ESO−1cDNAのNheIおよびNotI消化PCR産物を同じ酵素で消化したpTi80ベクターに挿入することで構築した(54)。NY−ESO−1cDNAを、インバリアント鎖(Ii)リーダー配列の最初の80アミノ酸残基とそのN末端でインフレームに融合した。NY−ESO−1の増幅に使用したPCRプライマーは以下の通りであった:NheI部位を含むフォワードプライマー5’cattgctagcATG CAG GCC GAA GGC CGG GGC A3’(配列番号73)およびNotI部位を含むリバースプライマー5’aaggctacattGC GGC CGC TTA GCG CCT CTG CCC TGA G3’(配列番号74)。
本研究に使用した合成ペプチドは、National Cancer Institute,ベセズダ,MDの外科のペプチド合成機(Gilson Co. Inc.,ワージントン,OH)において、固相法を用いて作製した。脱保護後、各ペプチドの純度を、質量分析(Bio−synthesis, Inc.,ルイスヴィル,TX)により評価した。合成ペプチドを凍結乾燥し、20mg/mlでDMSO中再構築し、そして示した濃度まで希釈した。
タンパク質またはペプチドをパルスした標的を調製するために、ペプチドは終濃度20μg/mlで使用し、タンパク質は終濃度10μmg/mlで使用した。細胞を無血清RPMI培地で洗浄し、4時間血清の不在下37Cでパルスし、2回洗浄した。明記しない限り、およそ3×104標的細胞を同数のT細胞と少なくとも16時間インキュベートし、その後、サイトカイン放出アッセイを行った。サイトカイン分泌はGM−CSF ELISAキット(R&D Systems,ミネアポリス,MN)を用いて測定した。
トータルRNAをEBVB細胞、CD40リガンド刺激B細胞、CD4+T細胞、またはMHCクラスII陽性メラノーマ株からタイピングのために得た。トータルRNAはRNeasyキット(Qiagen,ドイツ)を使用して精製し、100ng〜1μgのRNAをオリゴdTプライム第一鎖cDNA合成に使用した。cDNA産物の1/10を使用し、Clontech(パロアルト,CA)のアドバンテージPCR系を用いてPCR増幅を行った。以下のプライマー対をHLA DP−AおよびDP BPCRに使用した:DPAフォワードプライマー5’ATG CGC CCT GAA GAC AGA ATG T 3’(配列番号75)、DPAリバースプライマー5’TCA CAG GGT CCC CTG GGC CCG GGG GA3’(配列番号76)、DPBフォワードプライマー5’ATG ATG GTT CTG CAG GTT TCT G3’(配列番号77)、およびDPBリバースプライマー5’TTA TGC AGA TCC TCG TTG AAC TTT C3’(配列番号78)。引き続いて、PCR産物を精製し、PCRを行うために使用した同一プライマーを用いてシークエンシングした。単一の配列がPCR産物から得られたので、多数の患者が非常に一般的なHLA DPB1*0401遺伝子産物にホモ接合性であると思われた。ヘテロ接合性の患者の場合、PCR産物をまずpCR4ベクター(Invitrogen,カールズバッド,CA)にクローニングし、ベクター配列に相補的な5’および3’プライマーを用いてシークエンシングした。最終配列をIMGT−HLAデータベースでサーチしてHLA DPであることを確認した(http://www3.ebi.ac.uk/Services/imgt/hla)。
NY−ESO−1に対するCD4+T細胞株TE4−2の作製
最初の研究をHLA DR4対立遺伝子により拘束されたNY−ESO−1エピトープを同定するために行った。予測される9マーのDR4結合モチーフを含む8つの20マーのペプチドを、NY−ESO−1組換えタンパク質で免疫しインビトロで刺激したHLA−DR4−IEトランスジェニックマウス由来のリンパ球による認識について試験した(50)。3つの20マーのペプチドがこれらの実験に陽性であることが分かった。これらのうちの一つはDRB1*0401とDRB1*0101との夾雑エピトープとして特徴付けされた(50)。他の2つのペプチド(ESO p161−180およびESO p141−160)をさらに特徴付けするために、本発明者らはそれらを使用して、高力価の抗体を有するDRB1*0401患者(TE)由来のPBMCならびにNY−ESO−1に対するCD4+およびCD8+T細胞を刺激した(50)。24ミクロ培養ウェル全体を各ペプチドについて使用した。弱い刺激を3回した後、24ウェルのうち15ウェルがESO p161−180で刺激されたPBMC由来の顕著な増殖を示した。試験した15ウェルの増殖が陽性であるウェルのうち9ウェルが、ペプチドパルスDRB1*0401発現1088EBVB細胞に対する特異的サイトカイン放出を示した(図8A)。特異的CD4+T細胞もまた、ESO p141−160で刺激したPBMCから作製したが、本研究では述べない(データ示さず)。
HLA DPB1*0401−0402に関連するTE4−2によるNY−ESO−1の認識
ESO p161−180、重複ペプチドであるESO p156−175、および完全長NY−ESO−1タンパク質それぞれでパルスしたDR4発現標的細胞に対する応答について、TE4−2 T細胞を試験した。DR1を発現するがDR4を発現しない586EBVB細胞もまたAPCとして使用した。無関係なペプチド、ESO p91−110、および精製トランケート組換えタンパク質(ESO1−74;アミノ酸1〜74を含む)(50)をコントロールとして使用した。TE4−2 T細胞は、完全長NY−ESO−1タンパク質でパルスした場合DR4+1088EBVB株を特異的に認識したが、トランケートESO1−74タンパク質でパルスした場合認識しなかった(図8B)。ESO p161−180およびp156−175の両方がTE4−2により認識され、これは最小ペプチドエピトープがアミノ酸161と175との間にあることを示している。対照的に、最初予測したDR4結合モチーフはアミノ酸167と175との間にある。予測しなかったことに、TE4−2 T細胞株は、586EBVB細胞にパルスしたペプチドおよびタンパク質(これらはDRB1*0101を発現するがDRB1*0401を発現しない)に同じくらい良好に応答するようであった。この結果は、類似のペプチドが複数のMHCクラスII拘束エレメントによって提示されたか、またはTE4−2 T細胞に対してペプチドを提示するMHCクラスII拘束エレメントを共有する1088および586EBVB細胞株によって提示されたかのいずれかであったことを示唆していた。これらの可能性を試験するために、公知のHLA DRおよびDQ型を含む多数の他のEBVB細胞もまた、TE4−2 T細胞により利用される拘束エレメントを同定するためにAPCとして使用した。試験したEBVB細胞株のうち一つを除く全てがTE4−2に対してESO p161−180ペプチドを提示することができた(図8C)。
腫瘍細胞上の天然にプロセシングされたNY−ESO−1エピトープのTE4−2による認識
TE4−2により認識されるT細胞エピトープが腫瘍細胞の表面で天然にプロセシングされ提示されるかどうかを調べるために、NY−ESO−1およびDPB1*0401を発現した腫瘍株を標的として用いた。TE4−2 T細胞は、NY−ESO−1とDPB1*0401の両方を発現する複数の腫瘍株を認識したが、NY−ESO−1を発現するがHLA DPB1*0401および0402対立遺伝子のいずれも発現しない腫瘍株(1362mel)は認識しなかった(図10A)。さらに、TE4−2 T細胞はDPB1*0401陰性およびNY−ESO−1陰性の腫瘍(526mel)を認識しなかった。HLA DPB1*0401を発現するがNY−ESO−1を発現しない1つのメラノーマ株(1102mel)はまた、TE4−2 T細胞により認識された。RT−PCR解析の結果は、1102melがLAGE−1遺伝子(NY ESO−1に対しておよそ90%のアミノ酸類似性を有する癌/精巣抗原)を発現したことを示していた(57)。ESO p161−175と同一の配列はまた、LAGE−1タンパク質にも存在した。これらの結果は、TE4−2により認識されるエピトープが腫瘍細胞表面に存在し、NY−ESO−1と、密接に関連した腫瘍抗原LAGE−1との間で共有されていることを示唆した。
HLA−A2拘束エピトープと重複するHLA DP4拘束エピトープ
2つの重複するペプチド(ESO p161−180およびp156−175)でパルスした標的細胞は、TE4−2 T細胞により同じように良好に認識された。これは、最小T細胞エピトープがアミノ酸161から175までの範囲の領域に位置していることを示していた(図8B)。
NY−ESO−1抗体産生とHLA DPB1*0401−0402との関連性
HLA DPB1*0401−0402は、白人の大部分(別の人種を含めた集団調査では43%〜70%)に存在する主要なMHCクラスII対立遺伝子である(52)。先の研究(48、50)は、正常ドナーおよびNY−ESO−1発現腫瘍を有さない癌患者がNY−ESO−1に対する抗体を生じないことを示している。対照的に、NY ESO−1発現腫瘍を有する患者の50%は、NY−ESO−1特異的Abを生じた。血清サンプルを試験した88人のメラノーマ患者のパネルのうち、11人の患者が高力価のNY−ESO−1抗体を有することが見出された(50)。多くの患者がDR4対立遺伝子を全く発現しなかったことから、先に同定したDR4拘束CD4+T細胞ペプチドは、NY−ESO−1特異的Abの産生を説明できなかった(表2)。NY−ESO−1特異的DP4拘束CD4+T細胞がこれらのメラノーマ患者におけるNY−ESO−1特異的Abの産生と関連しているかどうかをさらに調査するため、本発明者らはまずこれらのHLA DPサブタイプを解析した。NY−ESO−1抗体を有する11人の患者のうち10人がDPB1*0401および/または0402を発現したが、主要なDQまたはDR拘束エレメントはこの患者のグループでは同定できなかった(表2)。公知のNY−ESO−1発現腫瘍を有しているが検出可能な抗体を有さないこのパネルの3人の患者はDPB1*0401−0402対立遺伝子を発現しなかった。残りの74人の患者由来の腫瘍細胞株はこれらの患者由来のNY ESO−1発現を評価するためには入手できなかったので、そのHLA DP型を同定するためのさらなる研究は行わなかった。0.011のp値をフィッシャーの直接確率検定により得、これは抗体応答とHLA−DPB1*0401−0402発現との関係の重要さを示していた。NY−ESO−1は25〜30%の腫瘍細胞株で発現され、DP4は集団の43〜70%で発現されるので、NY−ESO−1とDP4の両方を発現し、かつ抗体応答を生じる可能性のある患者の割合は、10〜21%の範囲である。この仮説的予想はNY−ESO−1抗体を有する患者の観察された10〜13%の頻度と非常に近い。
野生型HLA DP4ペプチドの1つに改変を施した。この改変は、ペプチドをより可溶性にし90%超の均質性(これはペプチド臨床試験に関してFDAにより求められている)まで精製し得るようにするためのものであった。野生型および改変ペプチドは以下の通りである:
野生型ESOp157−167;SLLMWITQCFL (配列番号79);ESOp156R−169;RSLLMWITQCFLPV(配列番号63);および
ESOp157−170R;SLLMWITQCFLPVR(配列番号64)。
NY−ESO−1エピトープ特異的CD4 + Tリンパ球免疫療法
メラノーマ抗原に対して前感作したTリンパ球は、メラノーマに罹患した哺乳動物を治療処置するのに有効であり得る。Tリンパ球を末梢血またはメラノーマの腫瘍懸濁液から単離し、インビトロで培養する(Kawakami,Y.ら、1988,J.Exp.Med.168:2183−2191)。
転移性メラノーマを有する患者の処置
このプロトコルでは、進行メラノーマの患者を抗原性癌エピトープで免疫する。
NY−ESO−1は、体液性および細胞性両方の免疫応答を引き起こすので、重要な免疫標的である(19〜21)。その発現パターンはMAGE遺伝子ファミリーの抗原と類似しているが、NY−ESO−1はMAGEファミリーのいずれのものよりも乳癌、前立腺癌、肺癌で頻繁に発現される(19、20、23)。さらに興味深いことに、非常に低い割合の患者がMAGE抗原または分化抗原(例えば、チロシナーゼ、gp100、TRP−1およびTRP−2)に対する高力価の抗体を生じた(データ示さず、(22))にもかかわらず、高力価のNY−ESO−1反応性抗体は、癌の患者においてしばしば検出された(図2Bおよび2C)。これらの研究は、NY−ESO−1反応性CD4+T細胞が抗体産生およびCTL増殖に関わっているかもしれないことを示唆する。本研究で、本発明者らは、HLA−DR4トランスジェニックマウスおよび候補ペプチドを用いたヒトPBMCのインビトロ刺激を使用して、NY−ESO−1由来のHLA−DR4拘束T細胞エピトープを同定した。我々の知る限りでは、これは、NY−ESO−1由来T細胞エピトープがCD4+T細胞に対してMHCクラスII分子により提示されることを示した最初の証明である。NY−ESO−1特異的抗体およびCTLは異なるHLA遺伝子型を持つ患者において検出されたので、HLA−DR4以外のHLAクラスII分子により提示される他のCD4+T細胞エピトープは本発明において同定された。
Claims (47)
- 配列番号54〜58及び60〜64からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、HLA−DP拘束CD4+Tリンパ球によって免疫学的に認識される、癌ペプチド。
- LLMWITQCFLPVFL(配列番号55)、LMWITQCFLPVFLA(配列番号56)、MWITQCFLPVFLAQ(配列番号57)、又はWITQCFLPVFLAQP(配列番号58)からなる、請求項1に記載の癌ペプチド。
- SLLMWITQCFLPVF(配列番号54)からなる、請求項1に記載の癌ペプチド。
- 配列番号63又は64からなる、請求項1に記載の癌ペプチド。
- HLA−DPB1*0401−0402拘束CD4+Tリンパ球によって免疫学的に認識される、請求項1又は3に記載のペプチド。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチドをコードする単離された核酸。
- 更に、NY−ESO−1の少なくとも1つのMHCクラスI拘束T細胞エピトープをコードする核酸を含む、請求項6に記載の単離された核酸。
- 請求項6又は7に記載の核酸に相補的な核酸からなるオリゴヌクレオチド。
- 請求項6又は7に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
- 少なくとも1つのNY−ESO−1 HLA−DR拘束T細胞癌ペプチドをコードする核酸を更に含み、任意で、該NY−ESO−1 HLA−DR拘束T細胞癌ペプチドが、以下:
LPVPGVLLKEFTVSG(配列番号10);
VLLKEFTVSGNILTIRLT(配列番号65);
AADHRQLQLSISSCLQQL(配列番号66);及び
それらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の組換え発現ベクター。 - 少なくとも1つの単離されたNY−ESO−1 HLA−クラスI拘束T細胞癌ペプチドをコードする核酸を更に含み、任意で、該NY−ESO−1 HLA−クラスI拘束T細胞癌ペプチドが、以下:
Xaa1Xaa2Xaa3GPGGGAPXaa4(配列番号22)
(式中、Xaa1は、アミノ酸ではないか、又は1乃至20個の天然に存在するアミノ酸であり;
Xaa2は、Ale、Thr、Val、Leu又はArgであり;
Xaa3は、Ser又は保存的置換であり;
Xaa4は、Arg又はLysである)
及びそれらの誘導体を含む、請求項10に記載の組換え発現ベクター。 - 核酸が、ASGPGGGAPR(配列番号23)をコードする、請求項11に記載の組換え発現ベクター。
- (a)請求項9〜12のいずれか1項に記載のベクター、又は
(b)請求項6又は7に記載の核酸
を含む組換えウイルス。 - ワクシニア、鶏痘、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、アンカラウイルス、及びレプリカーゼ−ベース−アルファウイルスからなる群から選択される、請求項13に記載の組換えウイルス。
- (a)HLA−DP分子をコードする核酸、又は
(b)免疫刺激分子、任意で、HLAクラスII分子をコードする少なくとも1つの遺伝子
を更に含む、請求項13又は14に記載の組換えウイルス。 - (a)請求項9〜12のいずれか1項に記載のベクター、又は
(b)請求項13〜15のいずれか1項に記載のウイルス
によって形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチドと結合する、単離された抗体又はその抗原結合部分。
- (a)請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド;
(b)請求項9〜12のいずれか1項に記載の組換え発現ベクター;
(c)請求項13〜15のいずれか1項に記載の組換えウイルス;
(d)請求項6又は7に記載の核酸;又は
(e)請求項17に記載の抗体;及び
医薬として許容できる担体を含む医薬組成物。 - 免疫刺激分子を更に含む、請求項18に記載の医薬組成物。
- 免疫刺激分子が、B7.1、B7.2、ICAM−1、ICAM−2、LFA−1、LFA−3、サイトカイン又はそれらの組み合わせである、請求項19に記載の医薬組成物。
- (i)HLA−クラスII分子又はHLA−クラスII分子を発現している細胞、及び/又は
(ii)少なくとも1つのNY−ESO−1 HLA−DR拘束T細胞癌ペプチド、及び/又は
(iii)少なくとも1つの単離されたNY−ESO−1 HLAクラスI拘束T細胞癌ペプチド
を更に含む、請求項18〜20のいずれか1項に記載の医薬組成物。 - NY−ESO−1 HLA−DR拘束T細胞癌ペプチドが、以下:
LPVPGVLLKEFTVSG(配列番号10);
VLLKEFTVSGNILTIRLT(配列番号65);
AADHRQLQLSISSCLQQL(配列番号66);及び
それらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項21に記載の医薬組成物。 - NY−ESO−1 HLA−クラスI拘束T細胞癌ペプチドが、以下:
Xaa1Xaa2Xaa3GPGGGAPXaa4(配列番号22)
(式中、Xaa1は、アミノ酸ではないか、又は1乃至20個の天然に存在するアミノ酸であり;
Xaa2は、Ala、Thr、Val、Leu又はArgであり;
Xaa3は、Ser又は保存的置換であり;
Xaa4は、Arg又はLysである)及びそれらの誘導体を含む、請求項21に記載の医薬組成物。 - NY−ESO−1 HLAクラスI拘束T細胞癌ペプチドは、ASGPGGGAPR(配列番号23)を含む、請求項23に記載の医薬組成物。
- NY−ESO−1 HLA−DP拘束CD4+Tリンパ球を誘発する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の癌ペプチドを含む免疫原。
- 更に、NY−ESO−1のMHCクラスI拘束T細胞エピトープを含む、請求項25に記載の免疫原。
- MHCクラスII拘束癌ペプチドとMHCクラスI拘束T細胞エピトープがペプチド結合により一緒に結合している、請求項26に記載の免疫原。
- 抗NY−ESO−1抗体を誘発する、請求項25に記載の免疫原。
- イムノアッセイ試薬を必要に応じて更に含む、請求項17に記載の抗体を含むキット。
- NY−ESO−1の組換え癌ペプチドの製造方法であって、以下:
(a)請求項6又は7に記載の核酸を、発現ベクターに挿入すること;
(b)発現ベクターを宿主細胞に移すこと;
(c)癌ペプチドの発現のために適切な条件下で宿主細胞を培養すること;及び
(d)組換え癌ペプチドを取得すること;
を含む、方法。 - 工程(a)において、HLAクラスII分子又はその部分をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入することを更に含む、請求項30に記載の方法。
- 癌ペプチドを発現するベクターの製造方法であって、プロモーターと機能可能に連結した、請求項6又は7に記載の単離された核酸を組み込むことを含む、方法。
- 哺乳動物における癌又は前癌の存在の検出方法であって、以下:
(a)請求項6又は7に記載の核酸と、哺乳動物から採取したmRNAの試験用生物学的サンプルとを、該配列と該mRNAとの間で複合体が形成される条件下で接触させること;
(b)複合体を検出すること;及び
(c)試験用サンプル中のmRNA量を、既知の正常な生物学的サンプルからのmRNA量と比較することであって、試験用サンプルからのmRNA量の増大が癌又は前癌の指標となること;
を含む、方法。 - 哺乳動物における癌又は前癌の存在の検出方法であって、以下:
(a)請求項1〜5のいずれか1項に記載の癌ペプチドを、該哺乳動物から得たリンパ球の試験用生物学的サンプルと接触させること;
(b)該癌ペプチドと免疫応答性のCD4+Tリンパ球を検出することであって、陰性コントロールサンプルと比較した、該癌ペプチドと免疫反応性のCD4+Tリンパ球の数の増大が癌又は前癌の指標となること;
を含む方法。 - 生物学的サンプルにおけるMHCクラスII拘束癌ペプチドの検出方法であって、以下:
(a)サンプルを、請求項17に記載の抗体又はその抗原結合部分と、該抗体と該ペプチドとの間で免疫複合体が形成される条件下で接触させること;及び
(b)免疫複合体の存在を検出することであって、その存在が、生物学的サンプルにおけるペプチドの指標となること;
を含む、方法。 - 癌がメラノーマである、請求項33又は34に記載の方法。
- 哺乳動物における癌の予防、治療又は阻害における使用の為の、
(a)単独の、又はHLA−DP分子と組み合わせた、請求項1〜5のいずれか1項に記載の癌ペプチド、
あるいは
(b)単独の、又は外因性の免疫刺激分子と組み合わせた、請求項13〜15のいずれか1項に記載の組換えウイルス。 - NY−ESO−1の少なくとも1つのMHCクラスI拘束T細胞エピトープの使用を更に含む、請求項37に記載のペプチド。
- NY−ESO−1のMHCクラスI拘束T細胞エピトープをコードする核酸を更に含む、請求項13〜15のいずれか1項に記載の組換えウイルス。
- NY−ESO−1を発現している腫瘍の増殖の阻害における使用の為の、
(a)請求項1〜5のいずれか1項に記載の癌ペプチド、又は
(b)請求項6又は7に記載の核酸。 - インビトロで、請求項1〜5のいずれか1項に記載の癌ペプチドに単独で、あるいはHLA−DP分子と組み合わせて、NY−ESO−1 HLA−DP拘束Tリンパ球を誘発する十分な時間、曝された、
哺乳動物におけるメラノーマを治療、阻害又は予防する為に使用される、Tリンパ球。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載の癌ペプチドと免疫応答性である癌抗原特異的ヒトCD4+Tリンパ球。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の癌ペプチドと結合した標的抗原又はその標的エピトープを含む、標的抗原−癌ペプチドキャリア結合体。
- 標的抗原が、TRP2、GP−100、TRP1、HIV抗原、gp120、マラリア抗原及びそれらのエピトープからなる群から選択される、請求項43に記載の標的抗原−癌ペプチドキャリア結合体。
- 請求項43又は44に記載の標的抗原−癌ペプチドキャリア結合体をコードする核酸ワクチン構築物。
- NY−ESO−1を発現している細胞の増殖の阻害における使用の為の、請求項13〜15のいずれか1項に記載の組換えウイルス、又は請求項6又は7に記載の核酸。
- NY−ESO−1を発現している腫瘍細胞の増殖の阻害における使用の為の、請求項6又は7に記載の核酸、又は請求項13〜15のいずれか1項に記載の組換えウイルス。
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