WO2015002134A1 - 細胞性免疫誘導ワクチン - Google Patents

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epitope
region
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伊藤　正紀
芝　清隆
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公益財団法人がん研究会
学校法人慈恵大学
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine capable of effectively inducing cellular immunity.
  • Epitope peptide vaccines are administered by suspending an epitope peptide in an oil emulsion such as montanide.
  • an oil emulsion such as montanide.
  • a large amount of epitope peptide binds to empty MHC molecules of antigen-presenting cells, or peptide substitution occurs due to competition with peptides already bound to MHC molecules, so that the function is demonstrated. This is considered (Non-Patent Documents 1 to 4).
  • this method does not go through the original antigen processing process by dendritic cells and the like, and there is a possibility that the antigen is not efficiently presented.
  • Non-patent Document 5 Non-patent Document 5
  • antigens administered as vaccines are recognized as foreign antigens in the body, taken up by antigen-presenting cells, presented to MHC class II molecules, and tend to induce humoral immunity.
  • Induction of cellular immunity is important for diseases such as AIDS, malaria, and malignant tumors.
  • the specific antigen is not expressed on the cell surface recognized by the antibody, so humoral immunity cannot cope with these diseases.
  • Antigens specific to these diseases are processed in cells as endogenous antigens and presented to MHC class I molecules, and therefore cannot be effective unless they are cellular immunity. Therefore, for immunotherapy for such diseases, development of a system capable of inducing cellular immunity rather than humoral immunity when a protein is used as an antigen is expected.
  • an object of the present invention is to provide a novel vaccine capable of inducing sufficiently high cellular immunity.
  • a peptide vaccine that can induce cross-presentation is considered more preferable.
  • the inventors of the present application can overcome the disadvantages of conventional immunization methods using short polypeptides such as epitope peptides and large polypeptides such as full-length proteins, by using artificial proteins with improved higher-order structures of peptide vaccines. I thought it was possible. Therefore, as a result of earnest research using artificial protein creation technology using the MolCraft method developed by Kiyotaka Shiba et al., We succeeded in identifying an important structure for an artificial protein antigen capable of strongly inducing cellular immunity. Was completed.
  • the present invention provides a polypeptide comprising a tandem repeat structure in which an MHC class I epitope region derived from an antigen protein and a spacer sequence of any one of (1) and (2) below are alternately linked at least three times: Or a vaccine containing a polynucleotide encoding the polypeptide and containing a recombinant vector capable of expressing the polypeptide in vivo as an active ingredient.
  • the MHC class I epitope region, the MHC class II epitope region derived from the same or different antigen protein as the antigen protein, and at least one higher-order structure stabilization region have different readings of a single base sequence.
  • a sequence that occurs as an amino acid sequence inevitably encoded by a base sequence when the base sequence is designed to be encoded by a frame.
  • the present invention also provides a polypeptide comprising a tandem repeat structure in which an MHC class I epitope region derived from an antigen protein and a spacer sequence of any one of (1) and (2) below are alternately linked at least three times: Or a vaccine containing a polynucleotide encoding the polypeptide and containing a recombinant vector capable of expressing the polypeptide in vivo as an active ingredient.
  • the MHC class II epitope derived from the same or different antigen protein as the antigen protein and the higher-order structure stabilization region are encoded in different reading frames of a single base sequence, and in the remaining reading frames.
  • a sequence that occurs as an amino acid sequence that the base sequence necessarily encodes in the remaining reading frame when the base sequence is designed so that no stop codon is generated.
  • a peptide vaccine excellent in the ability to induce cellular immunity is provided.
  • the peptide vaccine of the present invention has an MHC class I and MHC class II cross-presentation ability and a sufficiently high immunity induction ability. Even if the amount of oil adjuvant used is reduced or not used, cellular immunity can be induced far stronger than the original antigen protein, for example, 100 times or more stronger.
  • the technique of the present invention it is possible to provide a vaccine having a high immunity induction ability even when a peptide epitope having weak immunogenicity is used. Induction of cellular immunity is required for the treatment and prevention of diseases such as malaria, AIDS, and tumors. According to the present invention, it is possible to provide a vaccine effective for the treatment and prevention of such diseases. It becomes.
  • the schematic diagram of the structure of F37A and C131B is shown.
  • A antigen-presenting cells DC2.4 cells were treated with no inhibitor or treated with cytochalasin B (phagocytosis inhibitor), DMA (pinocytosis inhibitor) or Poly-I (scavenger receptor A inhibitor). After that, an antigen (F37A, C131B, or OVA) was added and cultured. Each cell after culture was used as a sample, and the amount of antigen incorporated into antigen-presenting cells was measured by Western blotting using anti-His-tag antibody and anti-OVA antibody (lane 1: untreated control, lane 2: cytochalasin). B processing, lane 3: DMA processing, lane 4: Poly-I processing).
  • Spider antigen-presenting cells DC2.4 cells were treated with no inhibitor or treated with cytochalasin B, DMA, or Poly-I, and added with the antigen (F37A, C131B, or OVA) and cultured. Thereafter, OVA-specific T cell hybridoma cells (RF33.70 cells) were added and co-cultured. By measuring the amount of IL-2 produced in the culture supernatant, the ability to present OVA-specific antigen was evaluated.
  • the polypeptide used as an active ingredient in the present invention is an artificial protein that does not exist in nature.
  • This active ingredient polypeptide includes a tandem repeat structure in which an MHC class I epitope region derived from an antigen protein and a spacer sequence as defined in this specification are linked alternately and at least three times.
  • an MHC class I epitope region derived from an antigen protein and a spacer sequence as defined in this specification are linked alternately and at least three times.
  • cellular immunity against the target antigen protein can be strongly induced.
  • peptide vaccines comprising a polypeptide as an active ingredient, it is usually essential to use a certain amount of aluminum adjuvant or oil adjuvant in order to induce sufficient immunity in the living body. Side effects can be reduced by reducing the amount of oil adjuvant used, or a sufficiently high immunity induction ability can be exhibited without using such an adjuvant.
  • MHC class I epitopes derived from antigenic proteins and “MHC class II epitopes derived from antigenic proteins” include not only the same amino acid sequences of the epitopes found in natural antigenic proteins, but also natural epitopes. Also encompassed are epitopes consisting of sequences with modifications to a few residues of the sequence. It is known that by modifying the sequence of a natural MHC class I epitope or class II epitope, the function of the epitope such as binding to MHC class I or class II molecules can be enhanced.
  • MHC class I epitope CMTWNQMNL of the tumor antigen WT1 is replaced with Y to enhance the binding to MHC class I molecules (Cancer Immunol Immunother (2002) 51: 614-620).
  • modified MHC class I and class II epitopes are also encompassed in “MHC class I epitopes derived from antigenic proteins” and “MHC class II epitopes derived from antigenic proteins”.
  • the tandem repeat structure is a structure in which one unit is a structure composed of an MHC class I epitope region and a spacer sequence, and at least 3 units are linked.
  • the upper limit of the number of repetitions is not particularly limited, but the size of the active ingredient polypeptide is preferably about 500 residues or less from the viewpoint of vaccine production costs and the like, and the active ingredient poly- mer is obtained by polymerizing the microgene by the MPR method described later.
  • the tandem repeat structure The number of iterations is usually approximately 10 or less.
  • a few motifs preferably no more than 5, and more preferably no more than 3 residues may be inserted in some motif linkage sites, or some motif linkage sites Less than, preferably less than 5, more preferably less than 3, residues may be deleted.
  • Such a mismatch of residues at the motif linking site is inevitably caused by the nature of the technique called MPR.
  • the MHC class I epitope region may contain a small number of adjacent residues derived from the original antigen protein at the end of the minimal epitope sequence, but it is sufficient that the minimal epitope sequence is maintained within the tandem repeat structure. Therefore, residues other than the minimum epitope sequence that can be included in the class I epitope region may be deleted in some repeat units.
  • tandem repeat structure all spacer sequence motifs do not have to be completely matched, and spacer sequence motifs that differ within several, preferably within six, are part of the tandem repeat structure. May be included.
  • an active ingredient polypeptide was obtained from an artificial protein library prepared by polymerizing microgenes by the MPR method, the reading frame was randomly shifted during the polymerization reaction, and the microgenes were originally defined. Often, motif sequences that do not match the motif sequence are generated.
  • the spacer sequence in the present invention consists of a sequence that differs in part (preferably within 6 residues) from the spacer sequence found in other repeat units. May be.
  • the spacer sequence used in the present invention consists of an MHC class I epitope region derived from an antigen protein, an MHC class II epitope region derived from the same or different antigen protein as the antigen protein, and at least one higher-order structure stabilization region.
  • the amino acid sequence inevitably encoded by the nucleotide sequence is preferably a class I epitope region within the same reading frame as the class I epitope region.
  • the spacer sequence used in the present invention has a sequence in which a region consisting of several amino acid residues is substituted in the amino acid sequence determined automatically. More specifically, the spacer sequence is an amino acid sequence in which a region consisting of several amino acid residues is derived from a part of an MHC class II epitope region or a higher-order structure stabilization region encoded by another reading frame. The sequence may be replaced with When a polypeptide is prepared from a microgene polymer prepared by the MPR method, base insertions and deletions are randomly generated due to the exonuclease activity of polymerase at the ligation site of the microgene, resulting in a partial motif sequence.
  • a motif sequence is frequently substituted by an amino acid sequence derived from a motif sequence of another reading frame.
  • such partially substituted spacer sequences are mixed in the tandem repeat structure of the artificial protein F182A.
  • the ability of the polypeptide to induce cellular immunity is higher when all the spacer sequences in the tandem repeat structure are sequences in which such substitution has not occurred.
  • the MHC class I epitope and the MHC class II epitope may be derived from the same antigen protein or may be derived from different antigen proteins. Typically, the MHC class I epitope and the MHC class II epitope can be derived from the same antigen.
  • Epitope sequences that can bind to multiple MHC class II molecules are known (for example, pan HLA-DR binding epitopes called PADRE epitopes, etc. Hum Immunol. 2012 January; 73 (1): 1-10., And Molecular Therapy vol. 15 no. 6, 1211-1219 june 2007 etc.), and when using class I and class II epitopes derived from different antigenic proteins, epitopes that can bind to multiple such MHC class II molecules May be used.
  • the sequences shown in SEQ ID NOs: 61 and 62 in the sequence listing are specific examples of active ingredient polypeptides using PADRE epitopes (see Table 1-2 below).
  • the multifunctional base sequence may be designed so that a total of six motifs are encoded without including a stop codon in the three reading frames (see FIG. 2). Of the six motifs, one is an MHC class I epitope region, one is an MHC class II epitope region, and two are conformational stabilization regions. In such a case, normally, after designing the multifunctional base sequence (I) encoding the MHC class I epitope region and the multifunctional base sequence (II) encoding the MHC class II epitope region, respectively, two multifunctional functions are designed.
  • one multifunctional base sequence encoded by a different reading frame (micro-class I epitope, class II epitope, and at least one higher-order structure stabilization region (micro Gene) is designed.
  • micro-class I epitope, class II epitope, and at least one higher-order structure stabilization region (micro Gene) is designed.
  • the amino acid sequence of two reading frames is determined in a multifunctional base sequence and the design is such that no stop codon occurs in the remaining reading frames, the amino acid sequence encoded in the remaining reading frames is automatically determined.
  • automatically determined sequence motifs are obtained, one for class I epitopes in multifunctional gene (I) and one for class II epitopes in multifunctional gene (II).
  • the two conformational stabilization region motifs may be in the same reading frame or in different reading frames, but the class I and class II epitopes are the same. Since it is designed not to come into the reading frame, sequence motifs that are automatically determined are not encoded in the same reading frame. Of the motifs of the sequence determined or inevitably generated thus obtained, these occur for class II epitopes, and on the microgene, class I epitopes within the same reading frame as class I epitopes. A sequence motif generated adjacent to the region is used as a spacer sequence of a tandem repeat structure.
  • “Higher-order structure stabilization region” means that when a polypeptide is expressed from a nucleic acid polymer obtained by polymerizing a multifunctional base sequence, the polypeptide can take a stable higher-order structure. A region having an array. The higher order structure of the polypeptide is stabilized by ⁇ -helix structure, ⁇ -sheet structure, formation of intramolecular hydrophobic bond, and the like. Specific examples of higher-order structure stabilization regions include ⁇ -helix forming regions (amino acid sequence regions that are likely to form ⁇ -helix structures), ⁇ -sheet forming regions (amino acid sequence regions that are likely to form ⁇ -sheet structures).
  • Hydrophobic bond-forming regions regions rich in amino acid residues having hydrophobic side chains and easily forming intramolecular hydrophobic bonds. It is known that the higher-order structure of the protein is stabilized by taking these structures.
  • the higher-order structure stabilizing region is at least one selected from an ⁇ helix forming region and a ⁇ sheet forming region, and more preferably an ⁇ helix forming region.
  • amino acid residues include residues that are likely to form ⁇ -helices and residues that are likely to form ⁇ -sheets, and these residues form ⁇ -helix-forming regions and ⁇ -sheets. Sex regions can be constructed.
  • an MHC class I epitope region is encoded in one of the three reading frames, an MHC class II epitope region is encoded in the other reading frame, and at least one in another reading frame.
  • a multifunctional base sequence (microgene) is designed so that one ⁇ -helix forming region is encoded.
  • the spacer sequence is an amino acid sequence motif that occurs adjacent to the MHC class I epitope region within the reading frame encoding the MHC class I epitope region.
  • the MHC class I epitope region is in the first frame
  • the MHC class II epitope region is in the second frame (the frame whose reading frame is shifted by 1 in the 3 ′ direction from the first frame)
  • the third frame from the first frame.
  • One or two ⁇ -helix forming regions are encoded in a frame in which the reading frame is shifted by 2 in the 3 ′ direction, and the amino acid sequence generated in the first frame can be used as a spacer sequence.
  • the MHC class I epitope of an antigen protein is about 5 to 12 residues, typically about 8 to 10 residues.
  • the length is not so limited, but it is about 13 to 30 residues in size, and the class II epitope region motif in the present invention is 13 to 23 residues.
  • a class II epitope having a basic size can be preferably used.
  • a multifunctional base sequence The size of is usually about 30 to 90 bp, and the size of the obtained spacer sequence is about 10 to 30 residues.
  • MHC class I epitope region in addition to the minimum unit of MHC class I epitope derived from an antigen protein, several amino acids adjacent to the epitope in the amino acid sequence of the original antigen protein (for example, 1 1 to 3) residues may also be included. Usually, amino acid residues derived from the amino acid sequence of the original antigen protein are added at least 2 residues at the N-terminus and at least 1 residue at the C-terminus of the minimum MHC class I epitope sequence, and this is added to the MHC class I epitope region motif. It is preferable to use as.
  • MHC class I and class II epitopes have been identified and known for various antigen proteins. Also, since algorithms for predicting epitopes from amino acid sequence information are known (for example, SYFPEITHI algorithm software (www.syfpeithi.de)), epitopes that bind to MHC molecules using such algorithms for any antigen protein May be predicted and used as MHC class I and class II epitopes. In addition, as described above, it is also known that by partially modifying the sequence of natural MHC class I and class II epitopes, the function of the epitope (for example, binding to MHC class I molecules or class II molecules) can be enhanced. In the present invention, such modified epitope sequences can also be used.
  • the spacer sequences obtained for certain MHC class I and class II epitopes are hydrophilic amino acids (R, N, D, E, Q, G, H, K, P, S, T, Y) and the like, and may have hydrophilic characteristics. Whether the spacer sequence is hydrophilic or not can be examined by a Hydropathy (Kite-Doolittle) analysis using Strider 1.4f7 software.
  • amphiphilicity of the tandem repeat structure part can be 0.0 to 0.4.
  • Amphipathic analysis can be performed using Strider 1.4f7 software.
  • the polypeptide containing the above-mentioned tandem repeat structure used as an active ingredient may contain an MHC class II epitope region derived from the same antigen protein in at least one of the N-terminal region and the C-terminal region. . Thereby, the cellular immunity induction ability of a vaccine can further be improved.
  • the active ingredient polypeptide may contain a higher-order structure stabilization region as defined above.
  • a region that stabilizes a higher order structure such as an ⁇ helix structure or a ⁇ sheet structure, the stability of the polypeptide is increased, and the production efficiency in host cells such as E. coli can be improved.
  • the active ingredient polypeptide may contain a tag sequence such as a histidine tag for the convenience of production of the polypeptide.
  • the active ingredient polypeptide may have an isoelectric point (pI) of 6.0 to 8.6.
  • a sequence such as DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKL (triple FLAG tag sequence) or DEDEDED may be appropriately introduced into the active ingredient polypeptide as necessary.
  • Specific examples of active ingredient polypeptides into which such sequences have been introduced are described in SEQ ID NOs: 57 to 60 in the Sequence Listing (see Table 1-1 below).
  • the method for designing a multifunctional base sequence is known.
  • CyberGene software described in K. Shiba, Journal Molecular Catalysis B: Enzymatic 28 (2004) 145-153 can be used. More specifically, it can be designed by a design method described in Japanese Patent Nos. 4007477, 4911857, and 4989600. Any method may be used in the present invention.
  • Patent No. 4007477 sets a given peptide sequence having the first function (in this application, MHC class I epitope peptide sequence and class II epitope peptide sequence) as an initial value, and based on the genetic code table
  • the base sequence is back-translated into base sequences one by one, and all base sequences capable of encoding the peptide sequence are generated in the computer, and then the first peptide sequence encoded by all the generated base sequences
  • the peptide sequence group in a different reading frame is written in the computer, and finally, a peptide having the second and third functions is selected from the peptide sequence group, and the design process is performed.
  • the protein encoded by the multifunctional base sequence is analyzed as a ligation product of 20 amino acids.
  • the design method described in Japanese Patent Nos. 4911857 and 4989600 is an improved method of the design method described in Japanese Patent No. 4007477.
  • analysis is performed by regarding a protein encoded by a multifunctional base sequence as an overlapping ligation product of a very short peptide sequence of about 2 to 8 residues, not as a ligation product of 20 amino acids.
  • the base sequence encoding the dipeptide is 6 bases, and the 6 bases already contain information on the translation products of the second and third reading frames. Therefore, by performing analysis and calculation as a duplicated ligation product of short peptide sequences of about 2 to 8 residues, calculation processing is performed by excluding in advance the base sequence that contains a stop codon in the second and third frames. Can be executed. Thereby, compared with the method of analyzing as a connection product of 20 types of amino acids, it is possible to greatly reduce the calculation time and the memory size.
  • a multifunctional base sequence (microgene) is designed using CyberGene software, and a known microgene polymerization method (microgenepolymerization reaction; MPR, Kiyotaka Shiba et al., PNAS vol.94, pp.3805-3810, 1997) ), A group of microgene polymers (artificial protein genes) is constructed, and proteins are expressed from these polymers to obtain proteins with high antigen presenting ability (FIGS. 1 and 2).
  • MPR microgenepolymerization reaction
  • FIG. 1 and 2 A group of microgene polymers (artificial protein genes) is constructed, and proteins are expressed from these polymers to obtain proteins with high antigen presenting ability (FIGS. 1 and 2).
  • Such a technique is known as the MolCraft (registered trademark) method (K. Shiba, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 28 (2004) 145-153), and various artificial proteins are synthesized by this method.
  • MolCraft registered trademark
  • CMTWNQMNL (residues 303 to 311 of SEQ ID NO: 23) and RMFPNAPYL (residues 194 to 202 of SEQ ID NO: 23), and modified sequences thereof as MHC class I epitopes (For example, a sequence in which the second M of CMTWNQMNL is replaced with Y, Cancer Immunol Immunother (2002) 51: 614-620) can be used.
  • RMFPNAPYL is used.
  • RMFPNAPYL adds several amino acid residues that are adjacent to each other in the original WT1 protein (for example, QA adjacent to the N-terminal side and P adjacent to the C-terminal side are added to each terminal). It will be used for the design of functional base sequences.
  • PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (residues 396 to 417 of SEQ ID NO: 23) can be used. The procedure is roughly described. First, a multifunctional base sequence encoding a class I epitope and a multifunctional base sequence encoding a class II epitope are designed separately, and the two multifunctional base sequences obtained are obtained. After designing a microgene by fusing, an MPR primer is designed based on the sequence of the microgene, and a microgene polymerization reaction by the MPR method is performed.
  • QARMFPNAPYLP and PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG are set as initial values (first sequence), respectively, and from there, they are back-translated into the base sequence one by one based on the genetic code table, and the peptide sequence is encoded. All base sequences that can be generated are generated in the computer.
  • a sequence encoding a higher-order structure stabilizing region is selected in another reading frame (second sequence).
  • the MHC class of WT1 Microgene sequences are obtained that encode I epitopes, class II epitopes, and at least one conformational stabilization region in different reading frames.
  • a sequence that does not produce a stop codon even if it is bound by shifting the frame is selected from the candidate sequences, and the sequence is adjusted.
  • the binding site is appropriately adjusted so that the MHC class I motif QARMFPNAPYLP and the MHC class II motif PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG do not fall within the same reading frame.
  • the automatically determined third sequence without function is generated for the class I motif QARMFPNAPYLP and the class II motif PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG, respectively.
  • the third sequence generated for the class II motif is: It will be in the same reading frame as the MHC class I motif.
  • the spacer sequence in the present invention is such that the MHC class II epitope region (epitope derived from the same antigen as the class I epitope adopted for the polypeptide) and the conformation stabilizing region are encoded in different reading frames. It can also be understood as a sequence that occurs as an amino acid sequence encoded by one remaining reading frame when a multifunctional base sequence is designed.
  • a polypeptide spacer sequence used as an active ingredient in the present invention can be obtained.
  • This spacer sequence may be linked to the MHC class I motif QARMFPNAPYLP to construct a tandem repeat structure and to design an active ingredient polypeptide.
  • the microgene is polymerized while randomly generating frame shifts by the MPR method, the protein is expressed from the obtained polymer (artificial protein gene), and the class I epitope and the spacer sequence are linked in tandem three times or more.
  • a protein containing a structure may be selected to confirm the ability to induce cellular immunity.
  • the MPR primer used in the MPR method is designed so that the sense primer and the antisense primer form complementary base pairs of several bases (usually around 8 bases) in the 3 'end region of each other. However, a mismatch is provided at one base at the 3 'end.
  • the primer anneals at a part of each 3'-side region, so that a complementary strand is synthesized for the single-stranded portion by the polymerase reaction.
  • the primer itself also serves as a template.
  • the concentration of each MPR primer used may be about 40 nM to 2000 nM.
  • a microgene polymer in which the microgene is bound to tandem is synthesized.
  • the polymerase a DNA polymerase having 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity is used.
  • fluctuations occur at the junctions between the microgenes, and base deletions and insertions occur randomly.
  • the reading frame is shifted, so that a library of artificial genes in which various numbers of encoded polypeptide sequences appear in various combinations is created.
  • the obtained gene is incorporated into an appropriate protein expression vector by a well-known conventional method, and the protein is expressed to obtain an artificial protein library. What is necessary is just to introduce
  • Evaluation of antigen presenting ability and evaluation of cellular immunity induction ability for artificial proteins expressed from artificial genes can be performed by conventional methods. Select an artificial gene that encodes an artificial protein having a structure in which a class I epitope motif and a spacer sequence obtained by designing a multifunctional base sequence are linked in tandem three or more times, and evaluate antigen presentation ability and immune induction ability You can do it.
  • the obtained artificial protein is added to the antigen presenting cell, and the target epitope is presented on the MHC class I molecule or class II molecule.
  • the target epitope is presented on the MHC class I molecule or class II molecule.
  • CD8 + T cells having class I epitope-specific T cell receptors (TCR) and antigen-presenting cells to which artificial proteins are added are co-cultured.
  • TCR T cell receptors
  • an artificial protein is taken in, processed, and presented with an epitope on an MHC class I molecule
  • CD8 + T cells recognize this via TCR and produce IL-2 in an antigen-specific manner.
  • By selecting an artificial protein having a high IL-2 production amount it is possible to screen an artificial protein presenting an antigen through cross-presentation.
  • Artificial proteins with high ability to induce CD8 + cytotoxic T cells (inducibility of cellular immunity) in vivo can be selected by conventional methods, taking into consideration the antigen presenting ability of In vitro and the amount of protein purification .
  • the candidate artificial protein and 20 ⁇ g of adjuvant MPL (monophosphoryl lipid A) at least once, preferably at intervals of 2 weeks, intradermally, subcutaneously or peritoneally in animals such as mice (except humans) Administer about 3 times to immunize the animal.
  • spleen cells are removed, and tetramer assay is performed by flow cytometry using tetramer reagent to detect CD8 + T cells with epitope-specific TCR, and the inducibility of CD8 + cytotoxic T cells is evaluated. That's fine.
  • E.G7 cells expressing an antigen protein can be inoculated into an immunized animal, and an artificial protein capable of suppressing tumor growth can be selected.
  • the PolyCraft method is carried out according to the procedure as described above, and contains a tandem repeat structure in which an MHC class I epitope derived from any antigen protein and a spacer sequence according to the present invention are linked three times or more, and is used as an active ingredient of a vaccine.
  • Preferred examples of peptides can be obtained.
  • the polypeptide can be produced by a conventional method well known in the art.
  • the polynucleotide may be incorporated into an appropriate expression vector and expressed in a host cell such as Escherichia coli or insect cell, and the polypeptide may be recovered and purified.
  • the polynucleotide itself can be obtained by PCR amplification using the artificial gene obtained in the MPR process in the MolCraft method as a template, or the polynucleotide whose sequence has been specified can be prepared by chemical synthesis. is there.
  • a polypeptide expressed in E. coli cells can be used as an active ingredient of a medicine if endotoxin is removed by a technique such as Triton X-114 method.
  • a polypeptide whose sequence is specified can be chemically synthesized by a conventional method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • the polypeptide obtained by chemical synthesis can be used as it is or after enzymatically binding to a long-chain polypeptide and refolded to have a higher-order structure required by the present invention. .
  • the vaccine of the present invention can be produced against various antigenic proteins.
  • Vaccines against tumor antigens and cancer stem cell antigens can be provided as anti-cancer vaccines (cancer treatment or prevention agents), and vaccines against pathogens and parasite antigens can be provided as vaccines for prevention or treatment of infectious diseases.
  • the present invention can be preferably applied to diseases in which cellular immunity plays an important role in prevention and treatment.
  • Specific examples of tumor antigens include, for example, WT1, Survivin, Survivin-B2, MAGE-A3, MEGE-A4, Tyrosinase, gp100, Melan-A, TRP-2, SNRPD1, CDK4, NY-ESO-1, HER2, MUC-1, CD20, p53 and the like can be mentioned.
  • cancer stem cell antigens examples include CD44, CD133, LGR5, and Dclk1.
  • viral antigen examples include viral constituent proteins such as hepatitis virus (HBV, HCV, etc.), human papilloma virus, and human immunodeficiency virus.
  • Parasite antigens include malaria parasite proteins and the like.
  • the vaccine of the present invention can be designed and manufactured using MHC class I epitope and class II epitope of these antigens as motifs.
  • the administration route to the living body of the vaccine of the present invention may be oral administration or parenteral administration, but parenteral administration such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration and intraarterial administration is preferable.
  • the dosage is appropriately selected according to the disease state, symptoms, age of the subject animal, body weight, etc., but usually 0.1 ⁇ g to 500 mg as an effective daily dose for the subject animal, For example, it can be 1 ⁇ g to 100 mg. It can be administered once or divided into several times. For example, it can be divided into several times and administered every several days to several months.
  • the dosage form of the vaccine is not particularly limited, and may consist of only the polypeptide, or may be appropriately mixed with additives such as pharmaceutically acceptable carriers, diluents, excipients, and the like suitable for each administration route. May be formulated. Formulation methods and additives that can be used are well known in the field of pharmaceutical formulations. Specific examples of the dosage form include oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, and syrups, and parenteral preparations such as inhalants, injections, suppositories, and liquids.
  • oil adjuvant or aluminum adjuvant in conventional peptide vaccines, it is essential to administer a certain amount of oil adjuvant or aluminum adjuvant in combination in order to induce sufficient immunity in vivo.
  • These adjuvants currently used in clinical practice include Alum (aluminum salt), MF59 (oil emulsion), Montanide (Montanide ISA 51VG, oil emulsion) and the like. Oil adjuvants and aluminum adjuvants are thought to assist immunity through suppression of antigen degradation, induction of inflammatory cells by tissue destruction, maturation of antigen-presenting cells, and the like.
  • the vaccine of the present invention can reduce side effects by reducing the amount of oil adjuvant and aluminum adjuvant having such problems, or can strongly induce cellular immunity without using such an adjuvant.
  • the artificial protein prepared using OVA in the following examples does not enhance the expression of costimulatory molecules (CD80, CD86, etc.) due to TLR (Toll-like Receptor) pathway stimulation,
  • adjuvants that stimulate the TLR pathway such as TLR ligands may be used in combination.
  • “Use in combination” means that the vaccine and adjuvant are administered to the subject simultaneously or sequentially to the subject. When administered at the same time, the vaccine may be formulated to further contain an adjuvant.
  • peptide sequences that mimic the ligand function of TLR have been partially identified. For example, APPHALS, QEINSSY, etc. are known as peptide sequences that mimic the ligand function of TLR-4 (PLoS ONE, February 2012, Volume 7, Issue 2, e30839). By introducing such a peptide sequence into the sequence of the active ingredient polypeptide, the polypeptide may have an adjuvant function.
  • an embodiment in which a peptide sequence having an adjuvant function is introduced into an active ingredient polypeptide is also included in an embodiment in which an adjuvant is used in combination.
  • An example of an adjuvant that stimulates the TLR pathway that is in clinical use is MPL.
  • the vaccine of the present invention may be a vaccine containing a polynucleotide encoding the above-described artificial polypeptide and having a recombinant vector capable of expressing the polypeptide in vivo as an active ingredient.
  • This form of vaccine is also called a genetic vaccine.
  • the polynucleotide may be DNA or RNA, but is preferably DNA.
  • the vector used for producing the gene vaccine is not particularly limited as long as it can be expressed in the target animal cell (preferably in the mammalian cell), and may be a plasmid vector or a virus vector, and is known in the field of gene vaccines. Any of these vectors may be used.
  • a polynucleotide such as DNA or RNA encoding the above artificial polypeptide can be easily prepared by a conventional method.
  • the polynucleotide can be incorporated into a vector by a method well known to those skilled in the art.
  • the administration route of the gene vaccine is preferably a parenteral administration route such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration or intraarterial administration, and the dosage can be appropriately selected according to the type of antigen and the like.
  • the weight of the gene vaccine is about 0.1 ⁇ g to 100 mg, for example, about 1 ⁇ g to 10 mg per kg body weight.
  • the in vivo method which introduces a gene vaccine directly into the body
  • the ex vivo method which collects certain cells from the target animal, introduces the gene into the cells outside the body, and returns it to the body.
  • the in vivo method is more preferred.
  • the in vivo method When administered by the in vivo method, it can be administered by an appropriate administration route according to the disease, symptoms, etc. for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneous, intramuscularly. When administered by the in vivo method, for example, it can be in the form of a preparation such as a liquid, but is generally an injection containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention, which is an active ingredient, and is necessary. Depending on the case, conventional carriers may be added.
  • the liposome or membrane-fused liposome containing the DNA can be in the form of a liposome preparation such as a suspending agent, a freezing agent, or a centrifugal concentrated freezing agent.
  • the vaccine of the present invention can be used in combination with other pharmaceutical products.
  • the vaccine of the present invention designed against a tumor antigen can be used in combination with other anticancer agents.
  • immune checkpoint inhibitors are attracting attention in tumor immunotherapy (Nature Reviewers, Cancer 12, 252-264 (April 2012)).
  • a living body has a system for suppressing and controlling an excessive immune reaction.
  • molecules expressed in antigen-presenting cells (APC) and molecules expressed in T cells such as PD-L1 and PD-1, CD80 and CTLA4, MHC class I or MHC class II and KIR or LAG3, GLA9 TIM3 and the like have been identified, and their interaction transmits a negative signal to T cells and inhibits T cell responses. This mechanism is called immune checkpoint.
  • APC antigen-presenting cells
  • T cells such as PD-L1 and PD-1, CD80 and CTLA4, MHC class I or MHC class II and KIR or LAG3, GLA9 TIM3 and the like have been identified, and their interaction transmits a negative signal to T cells and inhibits T cell responses. This mechanism is called immune checkpoint.
  • a patient with cancer is in a state of being braked to suppress tumor immunity.
  • Administration of an immune checkpoint inhibitor leads to releasing the brake against tumor immunity, and the tumor immunity that attacks the cancer cells originally possessed by the patient will function, and the antitumor effect will be exerted. Conceivable.
  • tumor immunotherapy is likely to undergo major changes in the future.
  • Immune checkpoint inhibitors include antigens that are overexpressed in cancer, driver mutations (mutations that contribute to cancer cell growth, amino acid substitutions that accumulate in cancer cells, gene fusions, deletions, insertions, etc. Rather than exerting immunity against the so-called cancer antigen that caused the mutation, a mutation that causes amino acid substitution called passenger mutation has occurred, but it does not affect the function of the protein It is assumed that immunity is exhibited against mutant proteins that do not necessarily accumulate in cancer cells. That is, it is considered that the antigen that is a target of tumor immunity induced by an immune checkpoint inhibitor varies greatly from individual to individual. Immune checkpoint inhibitors induce potent anti-tumor immunity but are not effective in all patients, and differences by cancer type have been reported.
  • an immune checkpoint inhibitor induces immunity against tumor antigens with the artificial protein vaccine according to the present invention while controlling the immunosuppressed state of cancer-bearing patients, that is, an immune checkpoint inhibitor And the artificial protein vaccine according to the present invention are used in combination, leading to a strong tumor immunity induction, suggesting the possibility of obtaining an even stronger antitumor effect.
  • OVA-I OVA MHC class I epitope, OVA258-265, SIINFEKL
  • OVA-II OVA MHC class II Epitope, OVA324-340, ISQAVHAAHAEINEAGR
  • the design process is shown in Fig. 2 1) to 5).
  • the two amino acids adjacent to the N-terminus of the MHC class I epitope (SIINFEKL) in the natural antigen OVA are known to affect degradation by aminopeptidase in the cell.
  • Antigen-derived 2-amino acid LE was added.
  • one amino acid at the N-terminal was also selected in a conserved form of T from OVA full-length antigen (LESIINFEKLT) and used as a motif for microgene design.
  • the multifunctional base sequence (I) encoding the OVA-I motif LESIINFEKLT and the multifunctional base sequence (II) encoding the OVA-II motif ISQAVHAAHAEINEAGR were designed separately using CyberGene.
  • codons that can be back-translated from OVA-I and OVA-II motifs are written, there are 248,832 and 169,869,312 combinations of DNA sequences, respectively, but CyberGene stops codons in any reading frame. The DNA sequence etc. that cause was excluded. If you specify the OVA-I motif and OVA-II motif as the first sequence, and specify the amino acid sequence that easily takes ⁇ -helix structure or ⁇ -sheet structure as the second sequence, each gene sequence is specified in hundreds or more. The top sequences with high stability of each structure were selected.
  • An example of the multifunctional base sequences (I) and (II) obtained as a result is shown in 4) of FIG.
  • the resulting multifunctional base sequences (I) and (II) were combined to design microgenes # 2101 (SEQ ID NO: 11) and # 6101 (SEQ ID NO: 15).
  • the amino acid sequences encoded by # 2101 in three reading frames are shown in SEQ ID NOs: 12-14.
  • the first frame (SEQ ID NO: 12) encodes an MHC class I epitope
  • the second frame (SEQ ID NO: 13) encodes an MHC class II epitope
  • the third frame (SEQ ID NO: 14) encodes two ⁇ -helix motifs. Has been.
  • amino acid sequences encoded by # 6101 in three reading frames are shown in SEQ ID NOs: 16-18.
  • the first frame contains an MHC class I epitope
  • the second frame contains an MHC class II epitope and ⁇ sheet motif
  • the third frame contains an ⁇ helix motif. Is coded.
  • 2101-S primer CTCGAGAGTATCATCAACTTCGAGAAGCTTACCGATTTCTCAGGCT, SEQ ID NO: 19
  • 2101-AS primer GCGGCCAGCCTCGTTGATCTCTGCATGAGCTGCATGAACTGCCTGAGAT, SEQ ID NO: 20
  • Polymerization reaction solution is 2.6 ⁇ L of Vent DNA polymerases (2 units / ⁇ L, NEW ENGLAND BioLabs) having 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity, 10 ⁇ ThermoPol Reaction Buffer (NEW ENGLAND BioLabs, 1 ⁇ ThermoPol Reaction Buffer: Tris HCl pH 8.8, 10 mM potassium chloride, 10 mM ammonium sulfate, 2 mM magnesium sulfate, 0.1% Triton X-100) was prepared in a composition of 5 ⁇ L, 350 ⁇ M dNTP, MPR primer S, AS 400 ⁇ m each (use 20 ⁇ pmol each) in a total volume of 50 ⁇ L.
  • the conditions for the polymerization reaction using the thermal cycler were 94 ° C. for 10 minutes ⁇ 60 ° C. for 10 minutes ⁇ (94 ° C. for 10 seconds ⁇ 60 ° C. for 1 minute for 30 cycles) ⁇ 60 ° C. for 7 minutes ⁇ 4 ° C. ⁇ .
  • sequence common to the artificial proteins that showed antigen presentation whose characteristic sequence pattern of F37A functions antigen presentation ability was prepared by substituting the OVA-I sequence ( ⁇ ) of WT1 (Wilms tumor 1) with the MHC class I epitope sequence (RMFPNAPYL, residues 194 to 202 of SEQ ID NO: 23) one by one (Fig. 5c). .
  • the sequence of W ⁇ is shown in SEQ ID NO: 25.
  • the amino acid sequence of the artificial protein is shown in FIG. 6 and SEQ ID NOs: 44 to 52.
  • F37AE2 is an artificial protein in which the C-terminal 3 amino acids of F37A are simply changed to 5 different amino acids, and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ was included as it is, but this is due to the concentration dependence of the antigen. The production capacity of was increased.
  • the artificial protein with stronger antigen-presenting ability than the natural OVA protein functions through the characteristic ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sequence, and it is a foreign antigen, but the epitope peptide is highly expressed in the MHC class. It became clear that it could be presented to I molecules.
  • F37A has a stable and high protein-producing ability in E. coli and has the highest antigen-presenting ability among the three, the following experiment was performed using F37A.
  • F182A, F37C, and F36C which showed antigenicity, show a common characteristic graph pattern, which is clearly different from the graph pattern shown by natural OVA protein, but is thought to have at least an ⁇ -helical structure It became clear that a secondary structure was formed. It was suggested that such secondary structure has an effect on antigenicity.
  • Table 3 summarizes the biochemical characteristics of the artificial proteins used in the experiment, OVA-I: ⁇ and OVA-II: ⁇ number of epitope sequences, and presence or absence of antigenicity in vitro.
  • G142A (SEQ ID NO: 35) has 4 MHC class I epitopes and 2 MHC class II epitopes, but showed no antigenicity. This suggested that a large number of MHC class I epitopes in the protein does not necessarily contribute to the induction of antigenicity.
  • the sequence of ⁇ uses CyberGene software developed by Kiyotaka Shiba et al., When the MHC class II sequence is defined as the first sequence and the sequence having the ⁇ helix structure is defined as the second sequence. The resulting third sequence is the sequence proposed by the CyberGene software algorithm.
  • the isoelectric point of the protein showing antigenicity was 6.0 to 8.6, and it was found that all have isoelectric points near neutrality. This suggests that it is important for the antigenicity that the isoelectric point of the artificial protein is neutral.
  • F37A artificial protein is an antigenic protein that presents antigen via cross-presentation.
  • the proteasome involved in cross-presentation Treatment with inhibitors Piroximicin and MG132 evaluated the ability to induce cellular immunity. As a result, the cellular immunity induction ability of F182A and F37A was suppressed (FIG. 5d). Furthermore, treatment with a lysosome inhibitor (Chloroquin), which has the effect of promoting cross-presentation, enhanced the ability of F182A and F37A to induce cellular immunity.
  • a lysosome inhibitor Chloroquin
  • F182A and F37A are incorporated into antigen-presenting cells as foreign antigens, undergo degradation by the proteasome, and present the antigen via a so-called cross-presentation that presents peptide epitopes on MHC class I molecules. It was confirmed.
  • F37A expresses co-stimulatory molecules (CD80 and CD86) in order to induce immunity by antigen-presenting cells that do not exhibit antigen-presenting ability through dendritic cell maturation That is, it is known that maturation of antigen-presenting cells is necessary. Therefore, F37A was added to BMDC bone marrow-derived dendritic cells derived from mouse bone marrow monocytic cells using GM-CSF, and expression of CD80 and CD86, which are maturation markers, was examined.
  • co-stimulatory molecules CD80 and CD86
  • F37A did not affect the expression of CD80 or CD86. Therefore, it was suggested that F37A does not show antigen presentation by affecting maturation of antigen-presenting cells.
  • LPS derived from E. coli and environment was removed using triton X-114, and the LPS concentration in the sample was confirmed to be 0.5 EU / mg or less. .
  • F37A engineered protein strongly induces cellular immunity in vivo.
  • 100 ⁇ g / mouse was administered into the skin of C57B1 / 6 mice three times at two-week intervals for immunization.
  • an OVA-I peptide group OVA MHC class I epitope, OVA257-264, SIINFEKL was administered
  • a natural OVA protein group OVA257-264, SIINFEKL was administered
  • a natural OVA protein group a natural OVA protein group
  • F37A artificial protein group were set.
  • immunization was performed using MPL (monophosphoryl lipid A) and Freund's adjuvant CFA (complete adjuvant (added with Mycobacterium tuberculosis killed) once, incomplete adjuvant twice).
  • EG7-OVA cells tumor cells expressing OVA
  • IL-2ng 10 ng / ml
  • 100 GyX rays were mixed and cultured in vitro.
  • EL-4 cells not expressing OVA, E.G7-OVA parent cells
  • EG7-OVA cells cells expressing OVA.
  • Cromium51 releasing assay cytotoxicity assay
  • FIG. 11a The results of the cytotoxicity assay are shown in FIG. 11a. Without an adjuvant, OVA-specific cytotoxic T cell CTLs were not detected in any of the OVA-I peptide, natural OVA protein, F37A immunization group (FIG. 11a, upper panel).
  • F37A can induce both cellular immunity and humoral immunity, but tends to induce cellular immunity more strongly than humoral immunity.
  • MHC class II epitope of F37A is not essential for OVA-specific CTL induction, and MHC class I epitope is functioning for cellular immunity induction
  • MHC class II epitope sequence OVA-II is involved in the induction of OVA-specific CTL of F37A
  • Mice were immunized with an F36C artificial protein that does not have an MHC class II epitope.
  • the MT825 artificial protein in which all three OVA-Is are replaced with WT1 MHC class I epitopes. was used to immunize mice. Immunization was administered intraperitoneally three times at 2-week intervals simultaneously with adjuvant MPL (20 ⁇ g / mouse) using 100 ⁇ g of antigen (FIG. 12 a).
  • F37C which has the same characteristic sequence pattern as F37A ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ) and does not have MHC class II epitope sequence, can induce CTL.
  • CTL assay of immunized mice CTL was significantly induced compared to the group and the OVA immunized group (FIG. 12b).
  • MT825 without any OVA-I did not induce CTL at all.
  • OVA-I CTL induction of F37A does not have the ability to induce CTL in MT825, where the OVA-I sequence functions. Therefore, OVA-I of F37A (OVA MHC class I epitope, SIINFEKL) It became clear that the sequence was essential.
  • F37A strongly induces OVA-specific CTL (tetramer assay)
  • OVA-I peptide SIINFEKL
  • the tetramer reagent is a tetramer in which the epitope peptide OVA-I is bound to an MHC class I molecule, and it is possible to quantify cells expressing T cell OVA-I specific T cell receptor (TCR). .
  • FIG. 12c The result of the tetramer assay is shown in FIG. 12c.
  • F37A significantly induced tetramer positive cells compared with MT825 immunized group.
  • OVA and F36C also tended to induce tetramers.
  • the CTLs that damage the OVA tumor cells shown above are tetrameric positive CD8 cells specific to the F37A OVA-I sequence.
  • mice immunized as described above with F37A and F36C capable of inhibiting tumor growth were inoculated with EG7-OVA (2 ⁇ 10 6 mice), and the tumor diameter of the tumor was measured. At 3 weeks after tumor inoculation, suppression of tumor growth was significantly observed in the F37A and F36C immunized groups (FIG. 12d). The tumor growth of individual mice is shown in Fig. 12e. In the OVA immunized group, a tendency to suppress tumor growth was also observed.
  • F37A can suppress tumor growth more strongly in vivo than the natural OVA protein.
  • F37A with MHC class II sequence has a stronger tumor suppression ability, so in the induction phase (induction of CTL) Does not necessarily require MHC class II sequences, but antigens with both MHC class I and MHC class II sequences are more potent in the effector phase (when immunity functions and attacks the tumor) It has been suggested.
  • F37A having a structure in which an MHC class I sequence and a spacer sequence defined by CyberGene are combined in tandem three times and has an MHC class II epitope at the N-terminus and C-terminus is expressed in vitro and in vivo.
  • F37A is thought to present us with a characteristic structure that functions as an antigen of a vaccine that strongly induces cellular immunity because it strongly induced cellular immunity and suppressed tumor growth.
  • F37A (SEQ ID NO: 44) showing antigen presenting ability includes a tandem repeat structure including three MHC class I epitopes and two class II epitopes, and a class II epitope and a spacer sequence alternately and repeatedly linked three times.
  • C131B (SEQ ID NO: 64) contains 3 MHC class I epitopes and 3 class II epitopes, but differs from F37A in molecular context (combination of the sequence order of epitopes, etc.) and does not contain the above tandem repeat structure. Does not show antigen presenting ability (FIG. 13A).
  • Macropinocytosis, nonspecific phagocytosis, receptor-mediated phagocytosis, etc. have been reported for antigen uptake in cross presentation.
  • the natural antigen OVA is taken up through the mannose receptor of antigen-presenting cells (Burgdorf S, Kautz A, Bohnert V, Knolle PA, Kurts C (2007) Distinct pathways of antigenuptake and intracellular routing in CD4 and CD8 activation. Science 316: 612-616.).
  • F37A is made in E. coli and is not sugar-modified. Therefore, unlike the natural antigen OVA, it is considered that the antigen-presenting cell is taken up by a mechanism other than the pathway through the mannose receptor.
  • Antigen-presenting cells DC2.4 cells were treated with cytochalasin B (phagocytosis inhibitor), 5- (N, N-dimethyl) amylolide (DMA, pinocytosis inhibitor), Poly-I (class A scavenger receptor (SRA). ) Inhibitor) in advance, each treated cell and untreated cell was added with an antigen (F37A, C131B, or OVA) and cultured, and antigen uptake and antigen presentation ability were evaluated in vitro.
  • cytochalasin B phagocytosis inhibitor
  • DMA N, N-dimethyl amylolide
  • SRA class A scavenger receptor
  • SRA is a cell membrane receptor expressed in macrophages, dendritic cells, etc., and takes in and processes oxidized LDL. It is also known that HSP (heat shock protein) and antigen-binding protein are taken into antigen-presenting cells via SRA and induce cellular immunity via cross-presentation (Murshid A, Gong J, Calderwood SK (2012) The role of heat shock proteins in antigen cross presentation. Front Immunol 3: 63.). Considering these facts, it was suggested that S37-mediated uptake of F37A into antigen-presenting cells due to the difference in molecular context between F37A and C131B leads to the strong antigen-presenting ability of F37A.
  • HSP heat shock protein

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Abstract

　十分に高い細胞性免疫を誘導できる新規なワクチンが開示されている。本発明のワクチンは、抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域とスペーサー配列が少なくとも３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分とする。スペーサー配列は、例えば、前記抗原タンパク質由来のMHCクラスIエピトープ領域と、前記抗原タンパク質由来のMHCクラスIIエピトープ領域と、少なくとも１つの高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされるように塩基配列を設計した時に、該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として生じる配列である。

Description

細胞性免疫誘導ワクチン
　本発明は、細胞性免疫を効果的に誘導できるワクチンに関する。
　近年、エピトープペプチド（MHCクラスI、クラスII分子に提示される最小ペプチド配列）を用いた腫瘍免疫療法が注目されている。エピトープペプチドワクチンは、エピトープペプチドをモンタナイドなどのオイルエマルジョンに懸濁し投与される。この免疫方法では、大量のエピトープペプチドが抗原提示細胞の空のMHC分子へ結合するか、あるいは、MHC分子に既に結合しているペプチドとの競合によりペプチドの置換が起こることで、その機能を発揮すると考えられている（非特許文献１～４）。しかし、この方法は、樹状細胞などによる本来の抗原処理過程を経ておらず、効率よく抗原提示されていない可能性がある。さらに、最近、エピトープペプチドワクチンに必須なオイルアジュバントが、ワクチン接種部位におこる炎症のため、腫瘍を攻撃するはずの細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、腫瘍部位ではなく、ワクチン接種部位に局在されるようになり、抗腫瘍効果を効率的に発揮できないとの報告がなされた（非特許文献５）。従って、ひとつには、オイルアジュバントを用いることなく安定的に免疫原性を発揮できるペプチドワクチンの開発が期待されている。
　一方、全長タンパク質を免疫源に用いると、樹状細胞などの抗原提示細胞に処理されるが、タンパク質分子あたりの抗原エピトープ数は少なくなり、MHC分子に提示されるペプチドも、エピトープペプチド免疫よりも少なくなると考えられる。
　また、ワクチンとして投与される抗原は、体内では、外来抗原として認識され、抗原提示細胞に取り込まれ、MHCクラスII分子に提示され、液性免疫を誘導する傾向がある。エイズ、マラリア、悪性腫瘍などの疾患に対しては、細胞性免疫の誘導が重要である。これらの疾患では、その特異抗原が抗体で認識される細胞表面に発現するわけではないので、液性免疫ではこれらの疾患に対応できない。これらの疾患に特異的な抗原は、内因性抗原として細胞内でプロセシングを受け、MHCクラスI分子に提示されるため、細胞性免疫でないと効果を発揮することができない。従って、この様な疾患に対する免疫療法に対しては、タンパク質を抗原にする場合に、液性免疫よりも細胞性免疫を誘導できるシステムの開発が期待されている。
　樹状細胞のようなプロフェッショナル抗原提示細胞には、外来抗原に対しても細胞性免疫を誘導できるメカニズムがあることが知られている。これはクロスプレゼンテーションと呼ばれるシステムで、外来抗原として抗原提示細胞に取りこまれた抗原が、プロテアソームにより分解を受け、MHCクラスI分子に提示される現象である。しかし、どのような抗原がクロスプレゼンテーションを受けやすいのか、また、その詳細なメカニズムも未だ不明である。
Yamada A, et al.Cancer Sci. 2013 Jan;104(1):15-21. doi: 10.1111/cas.12050. Epub 2012 Dec 4.Next-generation peptide vaccines for advanced cancer. Khazaie K, et al. Curr Opin Oncol. 2009 Nov;21(6):524-30. doi: 10.1097/CCO.0b013e328331a78e.Current developments with peptide-based human tumor vaccines. Perez SA, et al. Cancer. 2010 May 1;116(9):2071-80. doi: 10.1002/cncr.24988.A new era in anticancer peptide vaccines. Slingluff CL Jr.Cancer J. 2011 Sep-Oct;17(5):343-50. doi: 10.1097/PPO.0b013e318233e5b2.The present and future of peptide vaccines for cancer: single or multiple, long or short, alone or in combination? Hailemichael Y, et al. Nat Med. 2013 Apr;19(4):465-72. doi: 10.1038/nm.3105. Epub 2013 Mar 3.Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8+ T cell sequestration, dysfunction and deletion.
　従って、本発明は、十分に高い細胞性免疫を誘導できる新規なワクチンを提供することを目的とする。
　ワクチンによる高い治療効果を期待するならば、クロスプレゼンテーションを誘導できるペプチドワクチンがより好ましいと考えられる。本願発明者らは、ペプチドワクチンの高次構造を改良した人工タンパク質を用いれば、エピトープペプチド等の短いポリペプチドや全長タンパク質等のサイズの大きいポリペプチドを用いる従来の免疫法の欠点を解消することができると考えた。そこで、芝清隆らが開発したMolCraft法を用いた人工タンパク質創製技術を用いて鋭意研究の結果、細胞性免疫を強力に誘導できる人工タンパク質抗原に重要な構造を特定することに成功し、本願発明を完成した。
　すなわち、本発明は、抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域と、下記(1)及び(2)のいずれかであるスペーサー配列とが少なくとも３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含有するワクチンを提供する。
(1)　前記MHCクラスIエピトープ領域と、前記抗原タンパク質と同一又は異なる抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープ領域と、少なくとも１つの高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされるように塩基配列を設計した時に、該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として生じる配列。
(2)　(1)のアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換した配列。
　また、本発明は、抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域と、下記(1)及び(2)のいずれかであるスペーサー配列とが少なくとも３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含有するワクチンを提供する。
(1)　前記抗原タンパク質と同一又は異なる抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープと、高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされ、かつ、残りの読み枠で終止コドンが生じないように塩基配列を設計した時に、当該残りの読み枠で該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として生じる配列。
(2)　(1)のアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換した配列。
　本発明により、細胞性免疫の誘導能に優れたペプチドワクチンが提供される。本発明のペプチドワクチンは、MHCクラスIとMHCクラスIIのクロスプレゼンテーション能を有して十分に高い免疫誘導能を有する。また、オイルアジュバントの使用量を低減ないしは不使用としても、もとの抗原タンパク質よりも遥かに強く、例えば１００倍以上強く細胞性免疫を誘導することができる。本発明の技術によれば、免疫原性の弱いペプチドエピトープを用いた場合でも、高い免疫誘導能を有するワクチンを提供可能になる。マラリア、エイズ、腫瘍等の疾患の治療及び予防には細胞性免疫の誘導が必要とされるが、本発明によれば、そのような疾患の治療及び予防に有効なワクチンを提供することが可能となる。
マイクロ遺伝子及び人工タンパク質の構築について説明した図である。(a)天然抗原オボアルブミン（OVA)のアミノ酸配列である。(b)実施例でデザインしたマイクロ遺伝子である。(c)人工タンパク質構築のスキームと、様々なモチーフ及び人工タンパク質の模式図である。(d)各人工タンパク質及びOVAのin vitroの抗原提示能を比較した結果である。人工タンパク質のSDS-PAGE像も図中に示した。 マイクロ遺伝子#2101の設計から人工タンパク質遺伝子の構築までの流れを説明した図である。 人工タンパク質のアミノ酸配列である。 人工タンパク質のアミノ酸配列である。 人工タンパク質F37Aについて、抗原提示能を解析した結果である。(a)F37Aのアミノ酸配列と、他の人工タンパク質の配列を模式的に示した図である。(b)抗原提示能をin vitroでのIL-2生産量により評価した結果である。(c)F37Aに含まれるOVAのMHCクラスIエピトープモチーフをWT1のMHCクラスIエピトープモチーフで置き換えて作製した変異体の構造を説明する図（左）、及び各変異体の抗原提示能をIL-2生産量により評価した結果のグラフ（右）である。(d)クロスプレゼンテーションアッセイの結果である。 人工タンパク質及びWT1のMHCクラスIエピトープモチーフで置き換えた変異体のアミノ酸配列である。 円偏光二色性解析（CD）により人工タンパク質の二次構造を調べた結果である。 Strider 1.4f7ソフトを使用して人工タンパク質のHydropathy(Kite-Doolittle)疎水性解析を行なった結果である。 Strider 1.4f7ソフトを使用して両親媒性(Amphipathicity)解析を行なった結果である。 F37Aで２０時間刺激した後のCD11c＋生細胞表面におけるCD80及びCD86の発現量をフローサイトメトリーにより測定した結果である。 F37Aで免疫したマウス体内での抗原特異的CTL誘導を調べた結果である。(a)免疫したマウスから採取した脾臓細胞を用いて細胞障害性アッセイを行なった結果である。(b)免疫したマウスに腫瘍細胞を移植し、腫瘍の増殖を観察した結果である。(c)免疫したマウス体内で抗OVA抗体が生じているか否かを調べた結果である。 F37Aの抗原性について、クラスIエピトープ及びクラスIIエピトープの関与を検討した結果である。(a)F37A、F36C及びMT825のアミノ酸配列である。(b)MPLアジュバントと共にマウスを免疫し、51Cr放出アッセイによりCTL活性を調べた結果である。(c)テトラマーアッセイの結果である。(d)免疫したマウスに腫瘍細胞を移植し、腫瘍の増殖を観察した結果である。(e)腫瘍細胞を移植した免疫マウスの各個体における腫瘍増殖を示したグラフである。 F37AとC131Bの構造の模式図を示す。(A) 抗原提示細胞DC2.4細胞を、阻害剤無処理で、又はcytochalasin B(ファゴサイトーシス阻害剤)、DMA（ピノサイトーシス阻害剤）若しくはPoly-I（スカベンジャーレセプターA阻害剤）で処理した後、抗原（F37A、C131B、又はOVA）を添加して培養した。培養後の各細胞をサンプルとし、抗His-tag抗体および抗OVA抗体を用いたウエスタンブロットにより、抗原提示細胞への抗原の取込量を測定した（レーン１：無処理コントロール、レーン２：cytochalasin B処理、レーン３：DMA処理、レーン４：Poly-I処理）。細胞に取り込まれた抗原のバンド強度をデンシトメトリーで測定し、βアクチンを基準にして定量してグラフ化した。(B) 抗原提示細胞DC2.4細胞を、阻害剤無処理で、又はcytochalasin B、DMA若しくはPoly-Iで処理し、抗原（F37A、C131B、又はOVA）を添加して培養した。その後、OVA特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞（RF33.70細胞）を添加し、共培養した。培養上清中のIL-2産生量を測定する事により、OVA特異的抗原提示能を評価した。 (A) 既知量（100ng, 50ng, 10ng, 5ng）のF37A抗原及びC131B抗原をそれぞれ電気泳動し、抗His-tag抗体を用いたWB（ウエスタンブロット）を行い、オートラジオグラフィーで抗原を検出した結果である。デンシトメトリーでバンド強度を測定し、抗原濃度とバンド強度から、検量線を作製した（検量線図は省略）。(B) 抗原提示細胞DC2.4細胞に抗原（F37A又はC131B）を添加して培養した。抗His-tag抗体および抗OVA抗体を用いたウエスタンブロットにより、抗原提示細胞への抗原の取込量を測定した。Ａで求めた検量線から、抗原提示細胞へのF37A抗原及びC131B抗原の取込量を半定量した。F37AとC131Bの取込実験は２サンプルずつ行なった。F37Aの取込量は6ngと5ngであった。C131Bの取込量は29ngと22ngであった。
　本発明で有効成分として用いるポリペプチドは、天然には存在しない人工のタンパク質である。この有効成分ポリペプチドは、抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域と、本明細書において定義される通りのスペーサー配列とが、少なくとも３回交互に繰り返して連結されたタンデムリピート構造を含むことを特徴とする。クラスIエピトープ領域とスペーサー配列とが少なくとも３回反復した構造を有することで、対象とする抗原タンパク質に対する細胞性免疫を強く誘導することができる。ポリペプチドを有効成分とするペプチドワクチンでは、通常、生体に十分な免疫を誘導するために一定量のアルミニウムアジュバントやオイルアジュバントの使用が必須的であるが、本発明のペプチドワクチンは、アルミニウムアジュバントやオイルアジュバントの使用量を低減化して副作用を軽減し、あるいはこのようなアジュバントを使用することなく、十分に高い免疫誘導能を発揮することができる。
　「抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ」及び「抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープ」には、天然の抗原タンパク質中に見出される当該エピトープのアミノ酸配列と同一のもののみならず、天然のエピトープ配列の少数の残基に改変を加えた配列からなるエピトープも包含される。天然のMHCクラスIエピトープやクラスIIエピトープの配列を改変することで、MHCクラスI又はクラスII分子への結合性などのエピトープの機能を高めることができることが知られている。例えば、腫瘍抗原WT1のMHCクラスIエピトープCMTWNQMNLの２つ目のMをYに置換することで、MHCクラスI分子への結合性が高まることが知られている（Cancer Immunol Immunother (2002) 51: 614-620）。このような改変されたMHCクラスI及びクラスIIエピトープも「抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ」及び「抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープ」に包含される。
　タンデムリピート構造は、MHCクラスIエピトープ領域及びスペーサー配列からなる構造を１単位とし、これが少なくとも３単位連結した構造である。反復回数の上限は特に限定されないが、ワクチンの製造コスト等の観点から有効成分ポリペプチドのサイズは５００残基程度以下が好ましく、また、後述するMPR法によりマイクロ遺伝子の重合を行なって有効成分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得る場合には、MPR法におけるマイクロ遺伝子重合体のサイズの一般的な上限より、コードされるポリペプチドのサイズが通常３００残基程度以下となるため、タンデムリピート構造の反復回数は通常概ね１０回以下である。
　タンデムリピート構造内では、一部のモチーフ連結部位に数個以内、好ましくは５個以内、より好ましくは３個以内の残基が挿入されていてもよく、あるいは、一部のモチーフ連結部位で数個以内、好ましくは５個以内、より好ましくは３個以内の残基が欠失していてもよい。このようなモチーフ連結部位における残基の不一致は、MPRという手法の性質上必然的に生じることである。MHCクラスIエピトープ領域は、後述の通り、最小エピトープ配列の末端にもとの抗原タンパク質に由来する少数の隣接残基を含み得るが、タンデムリピート構造内では最小エピトープ配列が維持されていればよいので、クラスIエピトープ領域に含まれ得る最小エピトープ配列以外の残基は、一部のリピート単位において欠失していても差し支えない。
　また、タンデムリピート構造内では、全てのスペーサー配列モチーフが完全に一致していなくてもよく、数個以内、好ましくは６個以内の残基が相違するスペーサー配列モチーフがタンデムリピート構造内の一部に含まれていてよい。MPR法によりマイクロ遺伝子を重合して調製した人工タンパク質ライブラリーから有効成分ポリペプチドを取得する場合には、重合反応の過程でランダムに読み枠がずれて重合され、マイクロ遺伝子がそもそも規定していたモチーフ配列とは一致しないモチーフ配列が生じることがしばしばある。本発明におけるスペーサー配列は、そのようにして生じた、他のリピート単位中に見られるスペーサー配列とは一部の残基（好ましくは６個以内の残基）が相違する配列からなるものであってもよい。
　本発明で用いるスペーサー配列は、抗原タンパク質由来のMHCクラスIエピトープ領域と、上記抗原タンパク質と同一又は異なる抗原タンパク質由来のMHCクラスIIエピトープ領域と、少なくとも１つの高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされるように塩基配列を設計した時に、該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として、好ましくはクラスIエピトープ領域と同じ読み枠内でクラスIエピトープ領域に隣接して生じる配列である。このような、読み枠を異にして複数のモチーフをコードし、いずれの読み枠にも終止コドンが生じないように設計された塩基配列は、多機能塩基配列ないしはマイクロ遺伝子と呼ばれることがある。３つの読み枠のうちの２つの枠でコードされるアミノ酸配列が決定した場合、残る１枠のアミノ酸配列は自動的に定まる。
　あるいは、本発明で用いるスペーサー配列は、上記した自動的に定まるアミノ酸配列において、数個のアミノ酸残基からなる領域が置換した配列を有する。より具体的には、該スペーサー配列は、数個のアミノ酸残基からなる領域が、他の読み枠でコードされるMHCクラスIIエピトープ領域又は高次構造安定化領域の一部に由来するアミノ酸配列に置換した配列であり得る。MPR法により調製したマイクロ遺伝子重合体からポリペプチドを調製する場合、マイクロ遺伝子の連結部位においてポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性により塩基の挿入及び欠失がランダムに生じ、その結果、ある１つのモチーフ配列が部分的に別の読み枠のモチーフ配列に由来するアミノ酸配列に置換したモチーフ配列が生じることがしばしばある。下記実施例では、人工タンパク質F182Aのタンデムリピート構造中にそのような部分的に置換したスペーサー配列が混在している。もっとも、タンデムリピート構造中のスペーサー配列の全てがそのような置換が生じていない配列である方が、ポリペプチドの細胞性免疫の誘導能が高い場合がある。
　MHCクラスIエピトープとMHCクラスIIエピトープは、同一の抗原タンパク質に由来するものでもよいし、異なる抗原タンパク質に由来するものでもよい。典型的には、MHCクラスIエピトープ及びMHCクラスIIエピトープは、同一抗原由来であり得る。複数のMHCクラスII分子に結合できるエピトープ配列が公知であり（例えば、PADREエピトープと呼ばれるパンHLA-DR結合性エピトープ等。Hum Immunol. 2012 January ; 73(1): 1-10.、及びMolecular Therapy vol. 15 no. 6, 1211-1219 june 2007等を参照。）、異なる抗原タンパク質に由来するクラスIエピトープ及びクラスIIエピトープを用いる場合には、そのような複数のMHCクラスII分子に結合できるエピトープを使用してもよい。配列表の配列番号６１、６２に示す配列は、PADREエピトープを用いた有効成分ポリペプチドの具体例である（下記表１－２参照）。
　本発明においては、３つの読み枠に終止コドンが含まれることなく合計６つのモチーフがコードされるように多機能塩基配列をデザインすればよい（図２参照）。６つのモチーフのうち、１つがMHCクラスIエピトープ領域であり、１つがMHCクラスIIエピトープ領域であり、２つが高次構造安定化領域である。このような場合、通常は、MHCクラスIエピトープ領域をコードする多機能塩基配列(I)、及びMHCクラスIIエピトープ領域をコードする多機能塩基配列(II)をそれぞれ設計した後、２つの多機能塩基配列を読み枠を調整しながら連結することにより、クラスIエピトープと、クラスIIエピトープと、少なくとも１つの高次構造安定化領域とが異なる読み枠でコードされる１つの多機能塩基配列（マイクロ遺伝子）が設計される。多機能塩基配列において、2つの読み枠のアミノ酸配列が定められ、残りの読み枠で終止コドンが生じないように設計した場合、当該残りの読み枠でコードされるアミノ酸配列は自動的に決定される。従って、多機能遺伝子(I)においてクラスIエピトープに対し１つの、そして多機能遺伝子(II)においてクラスIIエピトープに対し１つの、自動的に決定される配列モチーフが得られる。結合後のマイクロ遺伝子配列において、２つの高次構造安定化領域モチーフは、同一の読み枠にくることもあるし、別々の読み枠にくることもあるが、クラスIエピトープとクラスIIエピトープが同じ読み枠にこないように設計するため、自動的に決定される配列モチーフが同一の読み枠にコードされることはない。このようにして得られた、自動的に決定されるないしは必然的に生じる配列のモチーフのうち、クラスIIエピトープに対して生じ、マイクロ遺伝子上ではクラスIエピトープと同一の読み枠内でクラスIエピトープ領域に隣接して生じる配列モチーフが、タンデムリピート構造のスペーサー配列として用いられる。
　「高次構造安定化領域」とは、多機能塩基配列を重合させて得られた核酸重合体からポリペプチドを発現させたとき、該ポリペプチドが安定した高次構造をとることを可能にする配列を有する領域である。ポリペプチドの高次構造は、αへリックス構造、βシート構造、分子内疎水結合の形成等により安定化する。高次構造安定化領域の具体例としては、αへリックス形成性領域（αへリックス構造を形成しやすいアミノ酸配列の領域）、βシート形成性領域（βシート構造を形成しやすいアミノ酸配列の領域）、疎水結合形成性領域（疎水性側鎖を有するアミノ酸残基に富み、分子内疎水結合を形成しやすい領域）等を挙げることができる。これらの構造をとることでタンパク質の高次構造が安定化することが知られている。好ましくは、高次構造安定化領域は、αへリックス形成性領域及びβシート形成性領域から選択される少なくとも１つであり、より好ましくはαへリックス形成性領域である。アミノ酸残基には、αへリックスを形成しやすい残基や、βシートを形成しやすい残基があることが知られており、そのような残基によってαへリックス形成性領域やβシート形成性領域を構成することができる。
　好ましくは、３つの読み枠のうちの１つの読み枠にMHCクラスIエピトープ領域がコードされ、他の１つの読み枠にMHCクラスIIエピトープ領域がコードされ、さらに他の１つの読み枠に少なくとも１つのαへリックス形成性領域がコードされるように多機能塩基配列（マイクロ遺伝子）が設計される。上述した通り、スペーサー配列は、MHCクラスIエピトープ領域をコードする読み枠内でMHCクラスIエピトープ領域に隣接して生じるアミノ酸配列モチーフである。例えば、第１枠にMHCクラスIエピトープ領域が、第２枠（第１枠から読み枠が３’方向に１つシフトした枠）にMHCクラスIIエピトープ領域が、第３枠（第１枠から読み枠が３’方向に２つシフトした枠）に１つ又は２つのαへリックス形成性領域がコードされ、第１枠に生じるアミノ酸配列をスペーサー配列として用いることができる。
　一般に、抗原タンパク質が有するMHCクラスIエピトープは５～１２残基程度、典型的には８～１０残基程度のサイズである。MHCクラスIIエピトープに関しては、長さがあまり限定されていないことが知られているが、概ね１３～３０残基程度のサイズであり、本発明におけるクラスIIエピトープ領域モチーフとしては、１３～２３残基程度のサイズのクラスIIエピトープを好ましく用いることができる。従って、例えば第１読み枠にクラスIエピトープを、第２読み枠にクラスIIエピトープを、第３読み枠に少なくとも１つの高次構造安定化領域をコードするように設計する場合、多機能塩基配列のサイズは通常30bp～90bp程度となり、得られるスペーサー配列のサイズは概ね10～30残基程度となる。
　「MHCクラスIエピトープ領域」には、抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープの最小単位の他、もとの抗原タンパク質のアミノ酸配列中で当該エピトープの前後に隣接している各数個（例えば１個～３個）の残基も含まれ得る。通常、もとの抗原タンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸残基を、MHCクラスIエピトープ最小配列のN末に少なくとも２残基、C末に少なくとも１残基付け加え、これをMHCクラスIエピトープ領域モチーフとして用いることが好ましい。具体的には、例えば・・・abcdXXXXXXXXefgh・・・という抗原タンパク質配列において、クラスIエピトープがXXXXXXXXである場合、Ｎ末側cdとC末側eを付け加えたcdXXXXXXXXeをMHCクラスIエピトープ領域モチーフとして用いることができる。エピトープのC末側はプロテアソームで切断され、比較的配列特異性がない一方、N末側の切断は配列特異的なアミノペプチダーゼにより行なわれることが知られている。上記のようにして、もとの抗原タンパク質におけるエピトープ前後の構造も有効成分ポリペプチド分子内で維持させることにより、抗原提示をより効率よく生じさせ、細胞性免疫の誘導能をさらに高めることができる。MHCクラスIIエピトープ領域についても同様である。
　様々な抗原タンパク質について、MHCクラスIエピトープ及びクラスIIエピトープの配列が同定され、公知となっている。また、アミノ酸配列情報からエピトープを予測するアルゴリズムが公知であるので（例えば、SYFPEITHI algorithm software (www.syfpeithi.de)など）、任意の抗原タンパク質についてそのようなアルゴリズムを用いてMHC分子に結合するエピトープを予測し、MHCクラスI及びクラスIIエピトープとして用いてもよい。また、上述した通り、天然のMHCクラスI及びクラスIIエピトープの配列を一部改変することで当該エピトープの機能（例えばMHCクラスI分子又はクラスII分子への結合性）を高めることができることも知られており、本発明ではそのような改変型のエピトープ配列を用いることもできる。
　上記のようにして、あるMHCクラスIエピトープ及びクラスIIエピトープに対して得られるスペーサー配列は、親水性アミノ酸（R、N、D、E、Q、G、H、K、P、S、T、Yなど）を多く含み、親水性の特徴を有したものであり得る。スペーサー配列として親水性であるか否かは、Strider 1.4f7ソフトを用いたHydropathy(Kite-Doolittle)解析により調べることができる。
　また、タンデムリピート構造部分の両親媒性は、0.0～0.4であり得る。両親媒性解析は、Strider 1.4f7ソフトを使用して実施することができる。
　有効成分として用いる、上記したタンデムリピート構造を含むポリペプチドは、N末端側領域及びC末端側領域の少なくともいずれか一方に、同じ抗原タンパク質由来のMHCクラスIIエピトープ領域を含んだものであってよい。これにより、ワクチンの細胞性免疫誘導能をさらに高めることができる。
　また、有効成分ポリペプチドには、上記定義の通りの高次構造安定化領域が含まれていてよい。αへリックス構造やβシート構造などの高次構造を安定化する領域を含んでいることで、ポリペプチドの安定性が増し、大腸菌等の宿主細胞内での生産効率が向上し得る。
　さらにまた、有効成分ポリペプチドは、ポリペプチドの製造の便宜等のため、ヒスチジンタグ等のタグ配列を含んでいてよい。
　有効成分ポリペプチドは、等電点(pI)が6.0～8.6であり得る。ポリペプチドの等電点をこのような中性付近に調整するため、有効成分ポリペプチドには、必要に応じて適宜DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKL（triple FLAG tag配列）やDEDEDED等の配列を導入してよい。このような配列が導入された有効成分ポリペプチドの具体例が配列表の配列番号５７～６０に記載されている（下記表１－１参照）。
　多機能塩基配列を設計する方法は公知である。例えば、K. Shiba, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 28 (2004) 145-153に記載されているCyberGeneソフトウェアを用いることができる。より具体的には、特許第4007477号、第4911857号及び第4989600号等に記載されている設計方法で設計することができる。本発明ではいずれの方法を用いてもよい。
　特許第4007477号は、第１の機能をもつ与えられたペプチド配列（本願でいえばMHCクラスIエピトープペプチド配列及びクラスIIエピトープペプチド配列）を初期値として設定し、そこから遺伝暗号表をもとに１塩基ずつ塩基配列に逆翻訳して、そのペプチド配列をコードすることが可能な全ての塩基配列を計算機内に生成し、次にこの生成した全ての塩基配列がコードする第１のペプチド配列とは別の読み枠でのペプチド配列集団を計算機内に書き出し、最後にこのペプチド配列集団の中から第２、第３の機能をもつペプチドを選び出す、といったプロセスを経てデザインする方法である。この方法では、多機能塩基配列にコードさせるタンパク質を２０種のアミノ酸の連結産物として分析を行なう。
　第4911857号及び第4989600号に記載されている設計方法は、特許第4007477号に記載の設計方法の改良法である。この方法では、多機能塩基配列にコードさせるタンパク質を、２０種のアミノ酸の連結産物としてではなく、２～８残基程度のごく短いペプチド配列の重複連結産物と捉えて分析を行なう。ジペプチドをコードする塩基配列は６塩基であるが、この６塩基には既に第２、第３の読み枠の翻訳産物の情報が内包されている。従って、２～８残基程度の短いペプチド配列の重複連結産物として分析・計算を行なうことにより、第２枠、第３枠で途中に終止コドンが入ってしまう塩基配列を予め除外して計算処理を実行することができる。これにより、２０種のアミノ酸の連結産物として分析を行なう方法と比較して、計算時間の大幅な短縮とメモリサイズの大幅な軽減が可能となる。
　下記実施例では、CyberGeneソフトウェアを用いて多機能塩基配列（マイクロ遺伝子）を設計し、公知のマイクロ遺伝子重合法（microgenepolymerization reaction; MPR、芝清隆ら、PNAS vol.94, pp.3805-3810, 1997）によりマイクロ遺伝子重合体（人工タンパク質遺伝子）の集団を構築し、これらの重合体からタンパク質を発現させて抗原提示能が高いタンパク質を取得している（図１、２）。このような手法は、MolCraft（登録商標）法として知られており（K. Shiba, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 28 (2004) 145-153）、同手法により様々な人工タンパク質が合成されている（例えば、Saito et al., Chemistry & Biology, Vol. 11, 765-773, 2004; Saito et al., Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 6, e38; Kokubun et al., Biomacromolecules 2008, 9, 3098-3105等）。MolCraft（登録商標）法を用いれば、様々な抗原タンパク質を対象に、本発明のワクチンに用いるポリペプチド配列を取得することができる。
　WT1タンパク質由来のMHCクラスI及びクラスIIエピトープ配列を用いて本発明による抗がんワクチンを製造する方法を以下に説明する。
　WT1タンパク質（配列番号２３）では、MHCクラスIエピトープとして、CMTWNQMNL（配列番号２３の303番～311番残基）及びRMFPNAPYL（配列番号２３の194番～202番残基）、並びにこれらの改変配列（例えばCMTWNQMNLの２つ目のMをYに置換した配列、Cancer Immunol Immunother (2002) 51: 614-620）を使用することができる。ここではRMFPNAPYLを用いるものとして説明する。RMFPNAPYLは、もとのWT1タンパク質において前後に隣接するアミノ酸残基をいくつか付加して（例えば、N末側に隣接するQA、及びC末側に隣接するPを各末端に付加して）多機能塩基配列の設計に用いることとする。MHCクラスIIエピトープとしては、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG（配列番号２３の396番～417番残基）を使用することができる。手順を大まかに説明すると、まず、クラスIエピトープをコードする多機能塩基配列と、クラスIIエピトープをコードする多機能塩基配列とを、それぞれ別々に設計し、得られた２つの多機能塩基配列を融合させてマイクロ遺伝子を設計した上で、このマイクロ遺伝子の配列に基づいてMPRプライマーを設計し、MPR法によるマイクロ遺伝子重合反応を実施する。
　まず、計算機内で、QARMFPNAPYLP及びPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGを初期値（第１配列）としてそれぞれ設定し、そこから遺伝暗号表をもとに１残基ずつ塩基配列に逆翻訳して、そのペプチド配列をコードすることが可能な全ての塩基配列を計算機内に生成する。次いで、QARMFPNAPYLPをコードする塩基配列及びPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGをコードする塩基配列の中から、別の読み枠に高次構造安定化領域をコードする配列をそれぞれ選び出す（第２配列）。CyberGeneソフトウェアを用いる場合、第１配列としてQARMFPNAPYLP及びPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGを入力すると、それぞれに対して、αへリックス構造やβシート構造を取りやすい配列候補が多数記述されるので、安定した構造を取りやすい配列を第２配列として選びだせばよい。第１配列のモチーフを単純に逆翻訳すると、そのDNA配列の組み合わせはそれぞれ膨大な数になるが、CyberGeneプログラムは、複数の読み枠に同一のモチーフ配列が生じるケースやいずれかの読み枠内に終止コドンが生じるケースが排除されるように設計されているので、入力したモチーフ配列から得られる多機能塩基配列候補は理論上の組み合わせ数よりも遥かに少ない数となる。第１配列及び第２配列を指定することにより、第３配列は自動的に決定される。１つの読み枠にエピトープモチーフを、他の読み枠のいずれかに高次構造安定化モチーフをコードする多機能塩基配列が数百以上出力されるが、各々の構造の形成しやすさでランク付けされるので、上位１０種程度の配列を選別する。
　以上のようにして得られた、QARMFPNAPYLPを第１枠にコードする多機能塩基配列(I)及びPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGを第１枠にコードする多機能塩基配列(II)を結合することにより、WT1のMHCクラスIエピトープ、クラスIIエピトープ、及び少なくとも１つの高次構造安定化領域を異なる読み枠にコードするマイクロ遺伝子配列が得られる。フレームをずらして結合しても終止コドンが生じないような配列を候補の配列の中から選択し、配列を調整する。この際、MHCクラスIモチーフQARMFPNAPYLPとMHCクラスIIモチーフPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGが同一の読み枠にこないように、結合部位を適宜調節する。自動的に決定された、機能が付与されていない第３配列は、クラスIモチーフQARMFPNAPYLP及びクラスIIモチーフPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGに対してそれぞれ発生する。MHCクラスIモチーフとMHCクラスIIモチーフが同一の読み枠にこないように調整して多機能塩基配列(I)及び(II)を結合した結果、クラスIIモチーフに対して発生した第３配列は、MHCクラスIモチーフと同一の読み枠内にくることになる。従って、本発明におけるスペーサー配列とは、MHCクラスIIエピトープ領域（ポリペプチドに採用するクラスIエピトープと同じ抗原に由来するエピトープ）と高次構造安定化領域とが異なる読み枠でコードされるように多機能塩基配列を設計したときに、残る１つの読み枠でコードされるアミノ酸配列として生じる配列と理解することもできる。
　以上の工程により、本発明で有効成分として用いるポリペプチドのスペーサー配列を得ることができる。このスペーサー配列をMHCクラスIモチーフQARMFPNAPYLPと連結させて、タンデムリピート構造を構築し、有効成分ポリペプチドを設計してもよい。あるいは、MPR法によりフレームシフトをランダムに生じさせつつマイクロ遺伝子を重合させ、得られた重合体（人工タンパク質遺伝子）からタンパク質を発現させて、クラスIエピトープとスペーサー配列がタンデムに３回以上連結した構造を含むタンパク質を選び出し、細胞性免疫の誘導能を確認してもよい。
　MPR法において用いるMPRプライマーは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーが互いの３’末端領域で数塩基（通常は８塩基前後）の相補的な塩基対を形成するようにデザインする。ただし、３’末端部の一塩基にはミスマッチを設ける。このMPRプライマーを用いた重合反応では、プライマーが各々の３’側領域の一部でアニールすることで、ポリメラーゼ反応により一本鎖部分に対して相補鎖が合成される。MPR法においては、プライマー自体がテンプレートも兼ねている。各MPRプライマーの使用濃度は40 nM～2000 nM程度でよい。サーマルサイクラーを用いて２ステップの反応サイクルを実施することにより、マイクロ遺伝子がタンデムに結合したマイクロ遺伝子重合体が合成される。ポリメラーゼは、3'→5'エクソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いる。重合反応の過程で、マイクロ遺伝子同士の結合部分には揺らぎが生じ、塩基の欠失や挿入がランダムに起こる。これにより読み枠のずれが生じるので、コードされるポリペプチド配列が様々な数、様々な組み合わせで出現する人工遺伝子のライブラリーが創製されることになる。
　得られた遺伝子は、周知の常法により適当なタンパク質発現ベクターに組み込み、タンパク質を発現させることで、人工タンパク質ライブラリーが得られる。Hisタグ付きタンパク質発現ベクターを用いて、大腸菌や昆虫細胞等の適当な宿主細胞に導入し、Hisタグを利用して常法により発現タンパク質を精製すればよい。宿主細胞内での発現効率には人工遺伝子毎にばらつきがあるので、タンパク質精製量も評価して人工タンパク質ライブラリーを作製する。
　人工遺伝子から発現した人工タンパク質についての抗原提示能の評価や細胞性免疫の誘導能の評価は、常法により実施することができる。クラスIエピトープモチーフと、多機能塩基配列の設計により得られたスペーサー配列とがタンデムに３回以上連結した構造を有する人工タンパク質をコードする人工遺伝子を選び出し、抗原提示能や免疫誘導能の評価を行なってよい。
　抗原提示能の評価では、例えば、得られた人工タンパク質を抗原提示細胞に添加し、目的のエピトープがMHCクラスI分子やクラスII分子に提示されることを、エピトープ特異的CD8+Ｔ細胞等を用いてin vitroで測定すればよい。エピトープ特異的CD8+Ｔ細胞を用いてクラスIエピトープの提示能を評価する方法では、クラスIエピトープ特異的なT細胞レセプター（TCR）を持つCD8+Ｔ細胞と、人工タンパク質を添加した抗原提示細胞を共培養する。人工タンパク質が取り込まれ、プロセシングを受け、MHCクラスI分子にエピトープが提示されると、CD8+Ｔ細胞がTCRを介してこれを認識し、抗原特異的にIL-2を産生する。このIL-2の産生量が高い人工タンパク質を選別することで、クロスプレゼンテーションを介して抗原提示する人工タンパク質をスクリーニングすることができる。
　In vitroの抗原提示能、タンパク質精製量などを考慮しながら、in vivoでのCD8+細胞障害性T細胞の誘導能（細胞性免疫の誘導能）の高い人工タンパク質を常法により選別することができる。例えば、候補の人工タンパク質を100μg程度ずつ、アジュバントMPL（monophosphoryl lipid A）20μgとともに、マウス等の動物（ヒトを除く）の皮内、皮下または腹腔などに、少なくとも１回、望ましくは２週間隔で３回程度投与し、動物を免疫する。免疫後、脾臓細胞を取り出し、エピトープ特異的TCRを持つCD8+T細胞を検出するためのテトラマー試薬を用いて、フローサイトメトリーによりテトラマーアッセイを行ない、CD8+細胞障害性Ｔ細胞の誘導能を評価すればよい。また、抗原タンパク質を発現するように組み換えられた腫瘍細胞E.G7と、その親株であるEL-4細胞を用いた機能的細胞障害性アッセイを行い、細胞障害性の強い人工タンパク質を選別することもできる。さらにまた、抗原タンパク質を発現するE.G7細胞を免疫動物に接種し、腫瘍増殖が抑制される人工タンパク質を選別することも可能である。
　上記の通りの手順でMolCraft法を実施し、任意の抗原タンパク質由来のMHCクラスIエピトープと本発明の定義に従うスペーサー配列とが３回以上連結したタンデムリピート構造を含む、ワクチンの有効成分として用いるポリペプチドの好ましい例を得ることができる。一旦、ポリペプチドのアミノ酸配列及びこれをコードするポリヌクレオチド（人工遺伝子）の塩基配列が特定されれば、当該分野で周知の常法によりポリペプチドを製造することができる。例えば、適当な発現ベクターにポリヌクレオチドを組み込んで大腸菌や昆虫細胞等の宿主細胞内で発現させ、ポリペプチドを回収、精製すればよい。ポリヌクレオチド自体は、MolCraft法におけるMPR工程で得られた人工遺伝子を鋳型としてPCRにより増幅して得ることができるし、あるいは、配列が特定されたポリヌクレオチドは、化学合成により調製することも可能である。大腸菌細胞内で発現させたポリペプチドは、Triton X-114法などの手法によりエンドトキシンを除去すれば、医薬の有効成分として使用することができる。あるいはまた、配列が特定されたポリペプチド自体も、例えばFmoc法やtBoc法等の常法により化学合成が可能である。化学合成で得られたポリぺプチドは、そのままあるいは酵素学的に結合して長鎖のポリぺプチドにしたうえ、リフォールディングさせて本発明の求める高次構造を有する形態にして用いることができる。
　本発明のワクチンは、様々な抗原タンパク質に対して製造することができる。腫瘍抗原及びがん幹細胞抗原に対するワクチンは抗がんワクチン（がんの治療又は予防剤）として、病原体や寄生虫の抗原に対するワクチンは感染症の予防又は治療用のワクチンとして提供できる。予防及び治療に細胞性免疫が重要な役割を担う疾患に対して本発明を好ましく適用することができる。腫瘍抗原の具体例としては、例えば、WT1、サバイビン、サバイビン-B2、MAGE-A3、MEGE-A4、チロシナーゼ、gp100、Melan-A、TRP-2、SNRPD1、CDK4、NY-ESO-1、HER2、MUC-1、CD20、p53などを挙げることができる。がん幹細胞抗原としては、CD44, CD133、LGR5, Dclk1などを挙げることができる。ウイルス抗原としては、肝炎ウイルス（HBV、HCV等）、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等のウイルスの構成タンパク質を挙げることができる。寄生虫抗原としては、マラリア原虫タンパク質等を挙げることができる。これらの抗原のMHCクラスIエピトープ及びクラスIIエピトープをモチーフとして用いて、本発明のワクチンを設計、製造することができる。
　本発明のワクチンペプチドの具体例として、腫瘍抗原タンパク質に対して設計したポリペプチドのアミノ酸配列の一例を下記表１－１～表１－３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明のワクチンの生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。投与量は、対象とする疾患の状態、症状、投与対象となる動物の年齢、体重等に応じて適宜選択されるが、通常、対象の動物に対し１日当りの有効量として0.1μg～500mg、例えば1μg～100mgであり得る。１回又は数回に分けて投与することができ、例えば、数回に分け、数日ないし数月おきに投与してもよい。
　ワクチンの剤形は特に限定されず、ポリペプチドのみからなっていてもよいし、各投与経路に適した、薬剤的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤してもよい。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知である。製剤形態の具体例を挙げると、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、並びに吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。
　従来のペプチドワクチンでは、生体内で十分な免疫を誘導するため、一定量のオイルアジュバントやアルミニウムアジュバントを組み合わせて投与することが必須的である。これらのアジュバントで現在臨床で利用されているものとして、Alum（アルミニウム塩）、MF59（オイルエマルジョン）、モンタナイド（Montanide ISA 51VGなど、オイルエマルジョン）等がある。オイルアジュバント及びアルミニウムアジュバントは、抗原の分解抑制、組織破壊による炎症性細胞の誘導、抗原提示細胞の成熟化などを介して免疫を補助すると考えられている。しかしながら、これらのアジュバントにより皮膚の炎症反応（しこり）が生じることが問題となっており、さらに、誘導されたCTLがアジュバント接種部位に集積してしまい、腫瘍の増殖抑制が効果的に生じないという問題も指摘されている。本発明のワクチンは、このような問題を有するオイルアジュバントやアルミニウムアジュバントの使用量を低減化して副作用を軽減し、あるいはそのようなアジュバントを用いることなく、細胞性免疫を強く誘導することができる。なお、下記実施例でOVAを用いて調製した人工タンパク質は、TLR（Toll-like Receptor; トール様受容体）経路刺激による副刺激分子（CD80、CD86等）の発現を増強しないので、そのような場合にはTLRリガンド等のTLR経路を刺激するアジュバントを組み合わせて用いてもよい。「組み合わせて用いる」とは、ワクチンとアジュバントが同時に対象に投与されるか、又は連続的に対象に投与されることをいう。同時に投与される場合、ワクチンは、アジュバントをさらに含有するように製剤されていてもよい。また、TLRのリガンド機能を模倣するペプチド配列が一部同定されており、例えば、TLR-4のリガンド機能を模倣するペプチド配列として、APPHALS、QEINSSY等が知られている（PLoS ONE, February 2012, Volume 7, Issue 2, e30839）。そのようなペプチド配列を有効成分ポリペプチドの配列に導入することによって、ポリペプチドにアジュバント機能を併せ持たせてもよい。このように、アジュバント機能を有するペプチド配列を有効成分ポリペプチドに導入した態様も、アジュバントを「組み合わせて用いる」態様に包含される。TLR経路を刺激するアジュバントで臨床使用されているものとして、MPLを挙げることができる。
　本発明のワクチンは、上記した人工のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で当該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分とするワクチンであってもよい。このような形態のワクチンは遺伝子ワクチンとも呼ばれる。ポリヌクレオチドは、DNAでもRNAでもよいが、好ましくはDNAである。遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記した人工のポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
　遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で0.1μg～100mg程度、例えば1μg～10mg程度である。
　遺伝子ワクチンの使用方法として、遺伝子ワクチンを直接体内に導入するin vivo法と、対象動物からある種の細胞を採取し、体外で遺伝子を該細胞に導入して再度体内に戻すex vivo法が知られている（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０－４５；月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３－４８；実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号など）。in vivo方法がより好ましい。
　in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができる。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）－リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
　本発明のワクチンは、他の医薬品と組み合わせて用いることができる。例えば、腫瘍抗原に対して設計された本発明のワクチンは、他の抗がん剤と組み合わせて用いることができる。
　現在、腫瘍免疫療法において、免疫チェックポイント阻害剤(immune checkpoint inhibitor)が注目されている（Nature Reviews Cancer 12, 252-264 (April 2012)）。生体には、過剰な免疫反応を抑制制御するためのシステムが存在する。これまでに、抗原提示細胞(APC)に発現する分子とT細胞に発現する分子、例えば、PD-L1とPD-1、CD80とCTLA4、MHC class IあるいはMHC class II とKIRあるいはLAG3、GLA9とTIM3などが同定されており、その相互作用により、T細胞に負のシグナルを伝え、T細胞反応を阻害する。このメカニズムは免疫チェックポイントと呼ばれている。
　免疫チェックポイントの阻害機能を持つ、ヒト化抗CTAL-4抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体（免疫チェックポイント阻害剤）の投与は、メラノーマや肺がんで、劇的な治療効果を示す（Clin Cancer Res. 2013 Oct 1;19(19):5300-9.）。また、同時に、自己に対する免疫トレランスが破綻する事から、重度の自己免疫疾患になる事も報告されている。この事実は、がん患者には、本来、がん細胞を攻撃する腫瘍免疫が成立している事を示しており、がん細胞によるPD-L1の発現や、様々なサイトカインの産生による、免疫チェックポイントの負の制御により、腫瘍免疫が抑制されるシステムが働いており、その結果、腫瘍細胞の増殖を押さえ込めなくなり、がんが進行する事を示唆している。即ち、担がん状態の患者は、腫瘍免疫を抑制するようなブレーキがかかっている状態にある。免疫チェックポイント阻害剤の投与は、この腫瘍免疫に対するブレーキを外してやる事に繋がり、本来、患者が有する、がん細胞を攻撃する腫瘍免疫が機能するようになり、抗腫瘍効果が発揮されると考えられる。これまでに、担がん患者に本来備わっている腫瘍免疫が、がんの発生防御に機能している実際的な根拠が得られていなかったが、免疫チェックポイントの科学的理解と、特異的阻害剤の劇的な治療効果により、今後、腫瘍免疫療法は大きく変貌を遂げると思われる。
　免疫チェックポイント阻害剤は、がんで過剰発現している抗原や、driver mutation（がん細胞の増殖に寄与する変異で、がん細胞に蓄積するようなアミノ酸置換、遺伝子融合、欠失、挿入等の変異）を起こした、いわゆるがん抗原に対して免疫を発揮するよりも、むしろ、passenger mutationと言われるアミノ酸置換をおこすような変異が起きているが、タンパク質の機能に影響を与えないため、必ずしもがん細胞に蓄積しないような変異タンパク質に対して免疫を発揮するという事が想定される。即ち、免疫チェックポイント阻害剤により誘導される、腫瘍免疫の標的となる抗原は、個人により大きく異なると考えられる。免疫チェックポイント阻害剤は、強力な抗腫瘍免疫を誘導するが、すべての患者に有効であるわけでなく、また、がん種による差も報告されている。
　これらの事を考え合わせると、免疫チェックポイント阻害剤で、担がん患者の免疫抑制状態を制御しつつ、本発明による人工タンパク質ワクチンで腫瘍抗原に対する免疫を誘導する、すなわち、免疫チェックポイント阻害剤と本発明による人工タンパク質ワクチンを組み合わせて使用する事によって、強力な腫瘍免疫誘導に繋がり、より一層強力な抗腫瘍効果を得ることができる可能性が示唆される。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．人工タンパク質を創製するためのマイクロ遺伝子の設計
　天然抗原OVA（配列番号２４）から、OVA-I：●(OVA MHCクラスIエピトープ, OVA258-265, SIINFEKL)とOVA-II：■(OVA MHCクラスIIエピトープ, OVA324-340, ISQAVHAAHAEINEAGR) を選択した（図１a）。
　第一配列にMHCクラスIエピトープOVA-I、第二配列にMHCクラスIIエピトープOVA-IIがコードされるマイクロ遺伝子#2101及び#6101を、芝清隆らが開発したCyberGeneソフトウェア（K. Shiba, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 28 (2004) 145-153）を用いて設計した（図１b）。この設計の工程を図２の1)～5)に示した。天然抗原OVAにおいてMHCクラスIエピトープ（SIINFEKL）のN末に隣接する２アミノ酸は、細胞内でのアミノペプチダーゼによる分解に影響を与えることが知られているので、OVA-IのN末にOVA全長抗原由来の２アミノ酸LEを付加した。さらに、N末の1アミノ酸も、OVA全長抗原由来のTを保存した形（LESIINFEKLT）で選択し、マイクロ遺伝子設計のためのモチーフとして使用した。
　まず、OVA-IモチーフLESIINFEKLTをコードする多機能塩基配列(I)と、OVA-IIモチーフISQAVHAAHAEINEAGRをコードする多機能塩基配列(II)とをCyberGeneを用いて別々に設計した。OVA-Iモチーフ及びOVA-IIモチーフから、逆翻訳して可能なコドンを書きだすと、DNA配列の組み合わせはそれぞれ248,832通り及び169,869,312通りであるが、CyberGeneにより、いずれかの読み枠内で終止コドンが生じるDNA配列等は排除された。第一配列としてOVA-Iモチーフ及びOVA-IIモチーフを指定し、第２配列にαへリックス構造やβシート構造をとりやすいアミノ酸配列を指定すると、それぞれ遺伝子配列が数百以上指定されるので、各々の構造の安定性が高い上位の配列を選別した。その結果得られた多機能塩基配列(I)及び(II)の一例を図２の4)に示す。
　得られた多機能塩基配列(I)及び(II)を結合し、マイクロ遺伝子#2101（配列番号１１）及び#6101（配列番号１５）を設計した。#2101が３つの読み枠でコードするアミノ酸配列を配列番号１２～１４に示す。第１枠（配列番号１２）にはMHCクラスIエピトープが、第２枠（配列番号１３）にはMHCクラスIIエピトープが、第３枠（配列番号１４）には２つのαへリックスモチーフがコードされている。また、#6101が３つの読み枠でコードするアミノ酸配列を配列番号１６～１８に示す。第１枠（配列番号１６）にはMHCクラスIエピトープが、第２枠（配列番号１７）にはMHCクラスIIエピトープ及びβシートモチーフが、第３枠（配列番号１８）にはαへリックスモチーフがコードされている。
２．MolCraft法を用いた人工タンパク質ライブラリーの創製
　芝清隆らが開発したMolCraft法（K. Shiba, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 28 (2004) 145-153）を用い、OVAのMHCクラスI、クラスIIエピトープ、αヘリックスなどのタンパク質安定化配列、CyberGeneにより自動的に定められた配列などのペプチドモチーフ配列（表２）が組み合わせ的に結合した人工タンパク質遺伝子を合成した。#2101のMPR法（芝清隆ら、PNAS vol.94, pp.3805-3810, 1997）による人工タンパク質遺伝子の合成工程の概略を図２の6)～9)に示す。
　#2101の重合反応には2101-Sプライマー（CTCGAGAGTATCATCAACTTCGAGAAGCTTACCGATTTCTCAGGCT、配列番号１９）及び2101-ASプライマー（GCGGCCAGCCTCGTTGATCTCTGCATGAGCTGCATGAACTGCCTGAGAT、配列番号２０）を、#6101の重合反応には6101-Sプライマー（CTCGAAAGTATTATCAATTTCGAAAAACTCACCGATTTCTCAGGCT、配列番号２１）及び6101-ASプライマー（2101-ASと配列同一）を用いた。重合反応液は、3'→5'エクソヌクレアーゼ活性を有するVent DNA polymerases（2 units／μL、NEW ENGLAND BioLabs）を2.6μL、10×ThermoPol Reaction Buffer (NEW ENGLAND BioLabs, 1×ThermoPol Reaction Buffer：トリス塩酸pH8.8、10mM 塩化カリウム、10mM 硫酸アンモニウム、2mM 硫酸マグネシウム、0.1％トライトンX-100)を5μL、350μMdNTP、MPRプライマーS、AS各400 nM（各20 pmol使用）の組成で全量50μLで調製した。サーマルサイクラーを用いた重合反応の条件は、９４℃１０分→６０℃１０分→（９４℃１０秒→６０℃１分を３０サイクル）→６０℃７分→４℃∞とした。
　上記の通りにして人工タンパク質遺伝子１３４種類を合成し、それぞれ発現ベクターにクローニングした。６２種類の遺伝子に関して、大腸菌でのタンパク質発現をチェックした結果、４０種類の遺伝子でタンパク質の発現を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
３．In vitro抗原提示機能アッセイ
　これらの人工タンパク質ライブラリーの中から、始めに８種類の人工タンパク質（図１c中に示したF138A, G142A, G142C, F182A, F58B, F58C, F112A, F112C）を選択し、in vitro抗原提示能アッセイを行った。人工タンパク質のアミノ酸配列を図３、４及び配列番号２６～４３に示した。
　人工タンパク質を抗原提示細胞（DC2.4樹状細胞株）に添加し、OVA特異的エピトープを認識するT細胞(RF33.70)と共培養し、IL-2産生能を測定し、抗原提示能を評価した。
　その結果、10μg/mlの濃度でクローンF182A（配列番号２６）のみがIL-2を産生し、抗原提示能を示した（図１d）。タンパク質の大きさと純度はＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認した（図１d）。天然OVAでは、10μg/ml濃度では抗原提示能は認められなかった。また、骨髄由来の樹状細胞を用いた実験においても同様な結果が得られ、８種類の人工タンパク質のうちF182AのみがIL-2を産生し、抗原提示能を示した（データ省略）。このことから、F182A人工タンパク質は細胞性免疫を誘導する能力があることがわかった。
４．抗原提示能を示す人工抗原とその特徴的アミノ酸配列
４－１．F37A人工タンパク質は天然OVAよりも１００倍強力に抗原提示する
　次に、ライブラリーの中から、F182Aと似た構造を持つ人工タンパク質を含め、さらに8種類の人工タンパク質を選択し、in vitroで抗原提示能を評価した。10μg/mlの抗原濃度で、F182Aに加えて、F37A（配列番号４４）とF36C（配列番号３１）が抗原提示能を示した。抗原提示能を示したF182A、F37A、F36Cはいずれも共通の配列パターンを持っていた。即ち、●▽●▽●▽（▽は一部又は全部が(▽/▼)でもよい）の配列である。これは、LESIINFEKLTDFSGSSCSSCRDQRGWP（●▽、配列番号２２）又はLESIINFEKLTDLRQFTCRDQRGWP（●(▽/▼)、配列番号５３）の配列が３回タンデムに結合している構造である。以下、▽の一部又は全部が(▽/▼)であるものも含めて「●▽●▽●▽」と表現する。
　天然のOVAは1000μg/mlまで濃度を上げないと抗原提示能を示さなかった。このことから、F182A、F37A、F36Cは、OVAよりも１００倍高い抗原提示能を持つ事が明らかとなった。
４－２．F37Aの特徴的な配列パターンが抗原提示能に機能する
　抗原提示を示した人工タンパク質に共通の配列●▽●▽●▽が、抗原提示に重要であることを明らかにするために、F37Aの配列のOVA-I配列（●）をWT1（Wilms tumor 1）のMHCクラスIエピトープ配列（RMFPNAPYL、配列番号２３の194番～202番残基）に、ひとつひとつ置換した変異体を作製した（図５c）。W▽の配列を配列番号２５に示す。人工タンパク質のアミノ酸配列を図６及び配列番号４４～５２に示した。
　これらの抗原提示能を調べたが、ひとつでもOVA-I配列がWT1配列に置き換わることで、OVA特異的エピトープを認識するT細胞(RF33.70)と共培養した抗原提示細胞における人工タンパク質の抗原提示能は消失した。F37AE2は、F37AのＣ末の３アミノ酸が異なる５アミノ酸に変更されただけの人工タンパク質であり、●▽●▽●▽はそのまま含んでいたが、これは、抗原の濃度依存性にIL-2の産生能が増加していた。これらの結果から、天然OVAタンパク質よりも強い抗原提示能を持つ人工タンパク質は、特徴的な●▽●▽●▽の配列を介して機能し、外来抗原でありながら高率にエピトープペプチドをMHCクラスI分子に提示できることが明らかとなった。
　F37Aは大腸菌内でのタンパク質産生能が安定的に高いこと、また、抗原提示能が３つの中で最も高いことから、以下の実験はF37Aを用いて行った。
４－３．円偏光二色性解析（CD）（図７）
　天然OVAやαヘリックス構造を多く含む人工タンパク質(F182C,F37C,F36B)は典型的なαヘリックス構造を示すグラフパターンを示した。一方、F36AやF182Bはランダムコイルを特徴とするグラフパターンを示した。
　抗原性を示した、F182A, F37C, F36Cは、共通の特徴的なグラフパターンを示し、天然のOVAタンパク質が示すグラフパターンとは明らかに異なるが、少なくともαヘリックス構造を有していると考えられる二次構造を形成していることが明らかとなった。このような二次構造が抗原性の発揮に影響していることが示唆された。
　表３に、実験に使用した人工タンパク質の生化学的特徴、OVA-I：●とOVA-II：■エピトープ配列の保有数、in vitroの抗原性の有り無しをまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　G142A（配列番号３５）はMHCクラスIエピトープを4個、MHCクラスIIエピトープを2個持つが、抗原性を示さなかった。このことから、必ずしも、タンパク質中のMHCクラスIエピトープの数が多いことが抗原性の誘導に寄与しているのではないということが示唆された。
　F138AやG142Aのように、●▽の配列が2回繰り返しているタンパク質は抗原性を示さなかった。抗原性を示したタンパク質は、すべて、特徴的な●▽●▽●▽を含んでいた。従って、特徴的な●▽●▽●▽に見られる●▽の配列が3回以上繰り返す構造が抗原性の誘導に重要であることが示唆された。
　▽の配列（DFSGSSCSSCRDQRGWP、配列番号８）は、芝清隆らに開発されたCyberGeneソフトウェアを使用し、MHCクラスII配列を第１配列に、αヘリックス構造をとる配列を第２配列に規定した場合に得られる、第３配列としてCyberGeneソフトウェアのアルゴリズムにより提案される配列である。
　また、抗原性を示したタンパク質の等電点は6.0以上から8.6以下で、いずれも中性付近に等電点を持つことがわかった。このことから、抗原性には、人工タンパク質の等電点が中性であることが重要であることが示唆された。
　さらに、Strider 1.4f7ソフトを使用し、windowを９として、Hydropathy(Kite-Doolittle)疎水性解析を行った。その結果、MHCクラスI配列の下流にくる▽の配列（DFSGSSCSSCRDQRGWP、配列番号８）が親水性アミノ酸（R、N、D、E、Q、G、H、K、P、S、T、Yなど）を多く含み、親水性の特徴を示していることが示された（図８）。このことから、MHCクラスIが3回繰り返すMHCクラスI配列の下流にくる配列は親水性を示すことが重要であることが示唆された。
　さらに、Strider 1.4f7ソフトを使用し、windowを９として、タンパク質の両親媒性(Amphipathicity)解析を行った。その結果、特徴的な●▽●▽●▽配列の領域は、両親媒性が0.0から0.4の数値の間にあった（図９）。このような両親媒性が極端に逸脱しない構造が抗原性を示すうえで重要な特徴であることが示唆された。
５．F37A人工タンパク質はクロスプレゼンテーションを介して抗原提示する
　人工タンパク質が、抗原提示細胞に取り込まれ、クロスプレゼンテーションを介して、エピトープを抗原提示していることを確認するために、クロスプレゼンテーションに関与するプロテアソームの阻害剤、PiroximicinとMG132で処理して、細胞性免疫誘導能を評価した。その結果、F182AとF37Aの細胞性免疫誘導能が抑制された（図５d）。さらに、クロスプレゼンテーションを促進する効果のあるリソソーム阻害剤(Chloroquin)で処理したところ、F182AとF37Aの細胞性免疫誘導能が増強した。
　これらの知見から、F182AとF37Aは、外来抗原として、抗原提示細胞に取り込まれ、プロテアソームによる分解を受け、MHCクラスI分子にペプチドエピトープを提示する、いわゆるクロスプレゼンテーションを介して、抗原提示していることが確認された。
６．F37Aは樹状細胞の成熟を介して抗原提示能を発揮していない
　抗原提示細胞が免疫を誘導するためには、MHC分子への抗原提示に加えて、補助刺激分子（CD80やCD86）の発現、即ち、抗原提示細胞の成熟化が必要であることが知られている。そこで、マウス骨髄単球細胞からGM-CSFを用いて誘導したBMDC骨髄由来樹状細胞にF37Aを添加し、成熟マーカーであるCD80とCD86の発現を調べた。
　結果を図１０に示す。F37AはCD80やCD86の発現に影響を与えなかった。従って、F37Aは、抗原提示細胞の成熟に影響を与えて抗原提示を示しているのではないことが示唆された。なお、人工タンパク質及びOVAからは、triton X-114を用いて、大腸菌由来や環境由来のLPSは除去しており、サンプル中のLPSの濃度は0.5 EU/mg以下であることを確認している。
７．F37A人工タンパク質はIn vivoで細胞性免疫を強力に誘導する
　次に、抗原をC57Bl/6マウスの皮内に100μg/匹、２週間間隔で３回投与し、免疫した。検討群として、OVA-Iペプチド群 (OVA MHCクラスIエピトープ, OVA257-264, SIINFEKLを投与)、天然OVAタンパク質群、F37A人工タンパク質群を設定した。また、アジュバントとして、MPL(monophosphoryl lipid A)とフロイントアジュバントCFA（コンプリートアジュバント(結核菌死菌添加)１回、インコンプリートアジュバント２回）を用いて免疫を行った。
　免疫マウスから脾臓細胞を取り出し、IL-2 (10ng/ml)と100GyＸ線照射し不活化したEG7-OVA細胞(OVAを発現する腫瘍細胞)を混合培養し、in vitro stimulationを行った。その後、機能的OVA特異的Ｔ細胞を検出するため、EL-4（OVAを発現していない細胞、E.G7-OVAの親細胞）とEG7-OVA細胞（OVAを発現する細胞）を標的としCromium51 releasing assay（細胞障害性アッセイ）を行った。
　細胞障害性アッセイの結果を図１１aに示す。アジュバントを使用しないと、OVA-Iペプチド、天然OVAタンパク質、F37A、いずれの免疫群でもOVA特異的細胞障害性Ｔ細胞CTLは検出されなかった（図１１a、上段）。
　アジュバントとして、MPLと抗原を同時に投与すると、F37A群で、OVA-Iペプチド群及びOVA群よりも有意に強いＣＴＬ誘導が認められた（図１１a、中段）。このように、F37Aは、フロイントのオイルアジュバントを用いないでも、細胞性免疫を誘導できることが確認された。
　また、CFAをアジュバントとして用いると、OVA-Iペプチド群及びOVA群でもCTL誘導が認められた。また、F37A群のCTL誘導能は、OVA-Iペプチド群及びOAV群よりも高い傾向が見られた（図１１a、下段）。
　これらの結果は、in vivoにおいても、F37Aが天然OVAタンパク質よりも強力にCTLを誘導できることを示している。
８．F37Aの腫瘍増殖抑制効果
　次に、OVA発現腫瘍に対する腫瘍抑制効果を検証した。マウスを上記と同じように免疫し、腫瘍細胞EG7-OVA(2x106個)をマウスの背中に皮下投与した。その後、１週間ごとに腫瘍径を測定した。その結果、アジュバントを用いない群で、腫瘍細胞接種後３週の腫瘍径に群間で差は認められなかった。しかし、MPLをアジュバントとして用いると、OVA免疫群とF37A免疫群で有意な腫瘍の増殖抑制効果が認められた（図１１b）。F37Aは、フロイントのオイルアジュバントを用いないでも、細胞性免疫を誘導し、その細胞性免疫が機能できることが確認された。
　さらに、CFAアジュバント使用群では、F37A免疫群で有意な腫瘍の増殖抑制が認められた。
　これらの結果は、F37A免疫により誘導されるCTLが、OVAを発現する腫瘍細胞を障害できる機能的なCTLであることを示している。
９．F37Aは細胞性免疫誘導能だけでなく、液性免疫誘導も発揮する
　免疫マウスから血清を採取し、抗OVA抗体ができているか否かを、OVAを抗原としたELISA法により調べた（図１１c）。
　OVA-Iペプチドで免疫した群は、アジュバントの有無に関わらず、抗OVA抗体の産生は認められなかった。
　一方、F37A免疫群では、アジュバントMPLおよびCFAの使用で、抗OVA抗体の産生が認められた。しかし、その産生量は、OVAタンパク質免疫群よりも明らかに低かった。
　CTL誘導能、抗体産生能の結果から、天然OVAタンパク質は、細胞性免疫と液性免疫の両方を誘導する能力があるが、液性免疫が誘導されやすい傾向にあることがわかった。
　一方、F37Aは、細胞性免疫と液性免疫の両方を誘導できるが、液性免疫よりも細胞性免疫を強く誘導する傾向にあることが明らかとなった。
１０．F37AのMHCクラスIIエピトープはOVA特異的CTL誘導に必須ではなく、細胞性免疫誘導にはMHCクラスIエピトープが機能している
　F37AのOVA特異的CTL誘導にMHCクラスIIエピトープ配列OVA-IIが関与しているかどうか調べるために、MHCクラスIIエピトープを持たないF36C人工タンパク質でマウスを免疫した。また、F37Aに存在するMHCクラスIエピトープ配列OVA-Iが細胞性免疫誘導に機能していることを明らかにするために、３つのOVA-IをすべてWT1 MHCクラスIエピトープに置換したMT825人工タンパク質を用いてマウスを免疫した。免疫は、抗原100μgを用い、アジュバントMPL(20μg/匹)と同時に２週間隔で３回腹腔内に投与した（図１２a）。
１１．F37Aと同じ特徴的な配列パターン(●▽●▽●▽)を持ち、MHCクラスIIエピトープ配列を持たないF36CはCTLを誘導できる
　免疫したマウスのCTLアッセイの結果、F37Aの免疫群は、MT825免疫群およびOVA免疫群に比べて有意にCTLを誘導した（図１２b）。また、F37Aと同じ特徴的な配列パターン(●▽●▽●▽)を持ち、MHCクラスIIエピトープ配列を持たないF36CにもCTLを誘導する傾向が見られた。OVA-Iを一つも持たないMT825は全くCTLを誘導することはなかった。これらの結果から、OVA特異的CTLの誘導には、必ずしもMHCクラスIIエピトープ配列は必要ではないことが示唆された。
１２．F37AのOVA特異的CTL誘導にはOVA-I配列が機能する
　MT825にCTL誘導能が見られないことから、OVA特異的CTL誘導には、F37AのOVA-I (OVA MHCクラスIエピトープ, SIINFEKL)配列が必須であることが明らかになった。
１３．F37AはOVA特異的CTLを強力に誘導する（テトラマーアッセイ）
　免疫したマウスに、OVA-Iペプチド（SIINFEKL）特異的なCD8陽性Ｔ細胞が存在することを、OVA-I配列特異的なテトラマー試薬を用いて測定した。テトラマー試薬は、MHCクラスI分子にエピトープペプチドOVA-Iが結合した4量体であり、Ｔ細胞のOVA-I特異的なT細胞レセプター（TCR）を発現する細胞を定量することが可能である。
　テトラマーアッセイの結果を図１２cに示す。F37AはMT825免疫群に比べて有意にテトラマー陽性細胞を誘導した。また、OVAとF36Cもテトラマーを誘導する傾向があった。
　これらの結果から、先に示したOVA腫瘍細胞を障害するCTLは、F37AのOVA-I配列特異的なテトラマー陽性CD8細胞であることが示唆された。
１４．F37AとF36Cには腫瘍の増殖を抑制する能力がある
　上記の通り免疫したマウスに、EG7-OVA(2x106個)接種し、腫瘍の腫瘍径を測定した。腫瘍接種後３週では、F37AとF36C免疫群で有意に腫瘍増殖の抑制が認められた（図１２d）。個々のマウスの腫瘍増殖は図１２eに示した。OVA免疫群でも腫瘍増殖の抑制傾向が見られた。
　マウスの生存曲線を比較した結果、OVA免疫群、F37A免疫群、F36C免疫群で生存の延長が見られた。その中でも、F37Aが最も生存延長効果が強かった（図１２d、下段右端）。
　これらの結果から、F37Aは、in vivoにおいて、腫瘍の増殖を天然OVAタンパク質よりも強く抑制できることが明らかとなった。
　MHCクラスII配列をもたないF36Cにおいても腫瘍増殖抑制が認められるが、MHCクラスII配列をもつF37Aの方が腫瘍抑制能が強いことが示されたことから、インダクションフェーズ（ＣＴＬの誘導）には必ずしもMHCクラスII配列は必要はないが、エフェクターフェーズ（免疫が機能し、腫瘍を攻撃する際）にはMHCクラスIとMHCクラスII配列の両方をもつ抗原の方がより強い効果を発揮することが示唆された。
　MHCクラスI配列とCyberGeneに規定されるスペーサー配列が結合した配列が3回タンデムに結合し、かつ、N末とC末にMHCクラスIIエピトープを持つ構造を有するF37Aが、in vitroおよびin vivoにおいて最も強く細胞性免疫を誘導し、腫瘍の増殖を抑制したことから、F37Aは細胞性免疫を強力に誘導するワクチンの抗原として機能する特徴的な構造を我々に提示していると考えられる。
１５．F37Aの抗原提示メカニズムの解析
　外来抗原が抗原提示細胞に取りこまれ、MHC class I分子に抗原エピトープを提示するクロスプレゼンテーションの細胞内経路は、未だ不明な点が多い。クロスプレゼンテーションを介して強力に細胞性免疫を誘導できるF37Aがどのようなメカニズムで抗原提示するかを調べた。
　抗原提示能を示すF37A（配列番号４４）は、MHC class Iエピトープ3個とclass IIエピトープ２個を含み、class Iエピトープとスペーサー配列が３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含む。一方、C131B（配列番号６４）は、MHC class Iエピトープ3個とclass IIエピトープ3個を含むが、F37Aと分子コンテクスト（エピトープの配列順序の組み合わせ等）が異なり、上記のタンデムリピート構造を含まず、抗原提示能を示さない(図１３Ａ)。
　まず、F37AとC131Bの、抗原提示細胞への取込を調べた。その結果、F37Aは、C131Bよりも抗原提示細胞への取込量が低かった（図１４A、１４B）。C131Bの取込量は、F37Aよりも多い傾向が見られたが、図１３で示すように、C131Bは全く抗原提示能を示さなかった。以上より、F37Aの抗原提示細胞への取込量は、F37Aの抗原提示機能に関与していない事が示唆された。
　次に、F37Aの抗原提示細胞への取込方式が抗原提示能の増強に関与している事を調べた。
　クロスプレゼンテーションにおける抗原の取込には、マクロピノサイトーシス、非特異的ファゴサイトーシス、レセプター介したファゴサイトーシスなどが報告されている。天然抗原であるOVAは、抗原提示細胞のマンノースレセプターを介して取りこまれる（Burgdorf S, Kautz A, Bohnert V, Knolle PA, Kurts C (2007) Distinct pathways of antigenuptake and intracellular routing in CD4 and CD8 T cell activation. Science 316: 612-616.）。
　F37Aは大腸菌で作製しており、糖修飾されていない。従って、天然抗原OVAとは異なり、マンノースレセプターを介するパスウェイ以外のメカニズムで抗原提示細胞に取りこまれていると考えられる。
　抗原提示細胞（DC2.4細胞）をcytochalasin B（ファゴサイトーシス阻害剤）、5-(N,N-ジメチル)アミロリド（DMA、ピノサイトーシス阻害剤）、Poly-I（class Aスカベンジャーレセプター（SRA）阻害剤）であらかじめ処理した後、各処理細胞及び無処理細胞に抗原（F37A、C131B、又はOVA）を添加して培養し、抗原の取込と抗原提示能をin vitroで評価した。
　その結果、F37Aの抗原提示細胞への取込は、Poly-Iにより抑制される傾向を示した。一方、そのメカニズムは不明であるが、C131BやOVAの取込は、poly-Iより増強された(図１３Ａ)。F37Aの抗原提示能は、cytochalasin B、DMA、及びPoly-Iで抑制された。その中でも、Poly-Iにより抗原提示は強力に抑制された(図１３Ｂ)。また、F37AとＣ末の5アミノ酸のみ異なるF37AE2抗原（配列番号４５）において、SRA阻害剤であるfucoidanにより、その抗原提示が抑制された（図１４C）。
　SRAは、マクロファージや樹状細胞などに発現する細胞膜レセプターで、酸化LDLなどを取込み処理する。また、HSP(heat shock protein)と抗原を結合したタンパク質が、SRAを介して抗原提示細胞に取りこまれ、クロスプレゼンテーションを介して細胞性免疫を誘導する事が知られている（Murshid A, Gong J, Calderwood SK (2012) The role of heat shock proteins in antigen cross presentation. Front Immunol 3: 63.）。これらの事実を考え合わせると、F37AとC131Bの分子コンテクストの違いによる、SRAを介したF37Aの抗原提示細胞への取り込みが、F37Aの強力な抗原提示能の発揮につながる事が示唆された。

Claims (11)

  1. 　抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域と、下記(1)及び(2)のいずれかであるスペーサー配列とが少なくとも３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含有するワクチン。
    (1)　前記MHCクラスIエピトープ領域と、前記抗原タンパク質と同一又は異なる抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープ領域と、少なくとも１つの高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされるように塩基配列を設計した時に、該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として生じる配列。
    (2)　(1)のアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換した配列。
  2. 　抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域と、下記(1)及び(2)のいずれかであるスペーサー配列とが少なくとも３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含有するワクチン。
    (1)　前記抗原タンパク質と同一又は異なる抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープと、高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされ、かつ、残りの読み枠で終止コドンが生じないように塩基配列を設計した時に、当該残りの読み枠で該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として生じる配列。
    (2)　(1)のアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換した配列。
  3. 　前記MHCクラスIエピトープ領域と前記MHCクラスIIエピトープ領域が同一の抗原タンパク質に由来する、請求項１又は２記載のワクチン。
  4. 　前記(2)の配列は、(1)のアミノ酸配列のうちの数個の残基からなる領域が、MHCクラスIIエピトープ領域又は高次構造安定化領域の一部に由来するアミノ酸配列に置換した配列である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のワクチン。
  5. 　前記高次構造安定化領域が、αへリックス形成性領域及びβシート形成性領域から選択される少なくとも１つである、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のワクチン。
  6. 　前記(1)の配列は、１つの読み枠に前記MHCクラスIエピトープ領域がコードされ、他の１つの読み枠に前記MHCクラスIIエピトープ領域がコードされ、さらに他の１つの読み枠に少なくとも１つのαへリックス形成性領域がコードされるように前記塩基配列を設計した時に、MHCクラスIエピトープ領域をコードする読み枠内でMHCクラスIエピトープ領域に隣接して生じるアミノ酸配列である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のワクチン。
  7. 　前記ポリペプチドは、N末端側領域及びC末端側領域の少なくともいずれか一方に前記MHCクラスIIエピトープ領域を含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のワクチン。
  8. 　前記抗原タンパク質が、腫瘍抗原、がん幹細胞抗原、ウイルス抗原、又は寄生虫抗原である請求項１ないし７のいずれか１項に記載のワクチン。
  9. 　前記抗原タンパク質が、WT1、サバイビン、サバイビン-B2、MAGE-A3、MEGE-A4、チロシナーゼ、gp100、Melan-A、TRP-2、SNRPD1、CDK4、NY-ESO-1、HER2、MUC-1、CD20、又はp53である請求項１ないし７のいずれか１項に記載のワクチン。
  10. 　前記ポリペプチドの等電点が6.0～8.6である請求項１ないし９のいずれか１項に記載のワクチン。
  11. 　トール様受容体経路を活性化するアジュバントと組み合わせて用いられる請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のワクチン。
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