JP2023522799A - 特異的結合性分子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生殖細胞系列癌抗原MAGEA1からのHLA-A*02制限ペプチドKVLEYVIKV(配列番号１)に結合する特異的結合性分子(例えばＴ細胞レセプター(TCR))に関する。本特異的結合性分子は、天然型MAGEA1 TCRと比較して、α及び/又はβ可変ドメイン内に非天然の変異を含んでいてもよい。本発明の特異的結合性分子は、悪性疾患治療用の新規免疫療法剤としての使用に特に好適である。【選択図】図１
Description
本発明は、生殖細胞系列癌抗原MAGEA1由来のHLA-A*02制限ペプチドKVLEYVIKV(配列番号1)に結合する特異的結合性分子(Ｔ細胞レセプター(TCR))に関する。前記特異的結合性分子は、天然型MAGEA1 TCRと比較して、α及び/又はβ可変ドメイン内に非天然変異を含み得る。本発明の特異的結合性分子は、悪性疾患の治療用の新規免疫療法剤として使用に特に適する。
発明の背景
Ｔ細胞レセプター(TCR)は、CD4+及びCD8+ Ｔ細胞により天然に発現される。TCRは、主要組織適合性複合体(MHC)分子(ヒトでは、MHC分子はヒト白血球抗原又はHLAとしても知られる)と複合体化して抗原提示細胞の表面にディスプレイされる短いペプチド抗原を認識するように設計される(Davisら，Annu Rev Immunol. 1998；16：523-44)。CD8+Ｔ細胞(これは細胞傷害性Ｔ細胞とも呼ばれる)は、MHCクラスＩ分子に結合したペプチドを特異的に認識するTCRを有する。CD8+ Ｔ細胞は、一般に、罹患細胞(ガン性細胞及びウイルス感染細胞を含む)の発見及び破壊の媒介を担っている。天然レパートリ中のガン特異的TCRの、対応する抗原に関する親和性は、代表的には、胸腺選択の結果として低く、このことは、ガン性細胞はしばしば検出及び破壊を免れることを意味する。Ｔ細胞によるガン認識の促進を目的とする新規免疫療法アプローチは、有効な抗ガン治療の開発のために非常に有望な戦略を提供する。
Ｔ細胞レセプター(TCR)は、CD4+及びCD8+ Ｔ細胞により天然に発現される。TCRは、主要組織適合性複合体(MHC)分子(ヒトでは、MHC分子はヒト白血球抗原又はHLAとしても知られる)と複合体化して抗原提示細胞の表面にディスプレイされる短いペプチド抗原を認識するように設計される(Davisら，Annu Rev Immunol. 1998；16：523-44)。CD8+Ｔ細胞(これは細胞傷害性Ｔ細胞とも呼ばれる)は、MHCクラスＩ分子に結合したペプチドを特異的に認識するTCRを有する。CD8+ Ｔ細胞は、一般に、罹患細胞(ガン性細胞及びウイルス感染細胞を含む)の発見及び破壊の媒介を担っている。天然レパートリ中のガン特異的TCRの、対応する抗原に関する親和性は、代表的には、胸腺選択の結果として低く、このことは、ガン性細胞はしばしば検出及び破壊を免れることを意味する。Ｔ細胞によるガン認識の促進を目的とする新規免疫療法アプローチは、有効な抗ガン治療の開発のために非常に有望な戦略を提供する。
MAGEA1(メラノーマ関連抗原１)は、ガン精巣抗原として知られる、生殖細胞系列にコードされる抗原ファミリーのメンバーである。ガン精巣抗原は、代表的には成人の正常組織では限定的であるか又は発現しないため、免疫療法的介入の魅力的な標的である。MAGEA1は、Uniprotアクセッション番号P43355を有し、MAGE-1抗原、ガン/精巣抗原1.1、CT1.1又は抗原MZ2-Eとしても知られる。MAGEA1は、幾つかの充実性腫瘍並びに白血病及びリンパ腫において発現する(参考文献)。本発明のMAGEA1を標的とする免疫療法は、肺癌(NSCLC及びSCLC)、乳癌(トリプルネガティブを含む)、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、膀胱癌及び頭頸部癌を含むがこれらに限定されない癌の治療に特に適切であり得る。
ペプチドKVLEYVIKV(配列番号１)は、全長MAGEA1タンパク質のアミノ酸278～286に対応し、HLA-A*02と複合体化して細胞表面に提示される。このペプチド－HLA複合体は、TCRベースの免疫療法的介入に有用な標的を提供する。
ペプチドKVLEYVIKV(配列番号１)は、全長MAGEA1タンパク質のアミノ酸278～286に対応し、HLA-A*02と複合体化して細胞表面に提示される。このペプチド－HLA複合体は、TCRベースの免疫療法的介入に有用な標的を提供する。
KVLEYVIKV(配列番号１)－HLA-A*02複合体に高親和性及び高特異性で結合する特定のTCR配列の同定は、新規免疫療法の開発に有利である。治療用TCRは、例えば、腫瘍部位に細胞毒性薬剤を送達するか又は腫瘍細胞に対する免疫エフェクター機能を活性化する目的の可溶性ターゲティング剤として使用し得(Lissinら，「High-Affinity Monocloncal T-cell receptor (mTCR) Fusions」 in Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals:Applications and Challenges. 2013. S. R. Schmidt, Wiley；Boulterら，Protein Eng. 2003 Sep;16(9):707-11；Liddyら，Nat Med.2012 Jun;18(6):980-7)、或いは、養子療法用にＴ細胞を操作するために使用し得る。
HLA-A*02と複合体化したKVLEYVIKV(配列番号１)に結合するTCRは、以前に報告されている(WO2014118236、CN106749620、WO2018104438、WO2018170338)。しかし、これらTCRは、天然TCRと比較して、増大した親和性/超生理的親和性で標的抗原に結合するよう設計(変異)されていない。下記で更に説明するように、超生理的抗原親和性は、治療用TCRに望ましい特徴であるが、その製造は、特異性などの他の望ましい特徴と均衡させる場合には特に、簡単ではない。
HLA-A*02と複合体化したKVLEYVIKV(配列番号１)に結合するTCRは、以前に報告されている(WO2014118236、CN106749620、WO2018104438、WO2018170338)。しかし、これらTCRは、天然TCRと比較して、増大した親和性/超生理的親和性で標的抗原に結合するよう設計(変異)されていない。下記で更に説明するように、超生理的抗原親和性は、治療用TCRに望ましい特徴であるが、その製造は、特異性などの他の望ましい特徴と均衡させる場合には特に、簡単ではない。
本明細書に規定するTCR配列は、TCR分野の当業者に広く知られアクセス可能であるIMGT命名法を参照して記載される。例えば、LeFranc and LeFranc(2001)，「T cell Receptor Factsbook」，Academic Press；Lefranc(2011)，Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603；Lefranc(2001)，Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 100；及びLefranc(2003)，Leukemia 17(1): 260-266を参照。簡潔には、αβTCRは２つのジスルフィド連結鎖からなる。各鎖(α及びβ)は、一般に、２つのドメイン、すなわち可変ドメイン及び定常ドメインを有すると考えられる。短い連結領域が可変ドメインと定常ドメインとを連結し、これは、代表的には、α可変領域の一部とみなされる。加えて、β鎖は、通常、連結領域の次の短い多様性領域を含有する。この領域も、代表的には、β可変領域の一部とみなされる。
各鎖の可変ドメインはＮ末端側に位置し、フレームワーク配列(FR)に埋め込まれた３つの相補性決定領域(CDR)を含んでなる。CDRはペプチド－MHCへの結合のための認識部位を含む。α鎖可変(Vα)領域をコードする幾つかの遺伝子及びβ鎖可変(Vβ)領域をコードする幾つかの遺伝子が存在し、これらは、フレームワーク配列、CDR1配列及びCDR2配列並びに部分的に規定されるCDR3配列により区別される。Vα及びVβ遺伝子は、IMGT命名法では、それぞれ接頭語「TRAV」及び「TRBV」を用いて称呼される(Folch and Lefranc(2000)、Exp Clin Immunogenet 17(1)：42-54；Scaviner and Lefranc(2000)、Exp Clin Immunogenet 17(2)：83-96；LeFranc and LeFranc(2001)、「T cell Receptor Factsbook」，Academic Press)。同様に、α鎖及びβ鎖について、それぞれ「TRAJ」又は「TRBJ」と呼ばれる幾つかの連結又はＪ遺伝子が存在し、β鎖については「TRBD」と呼ばれる多様性又はＤ遺伝子が存在する(Folch and Lefranc(2000)，Exp Clin Immunogenet 17(2)：107-114；Scaviner and Lefranc(2000)，Exp Clin Immunogenet 17(2)：97-106；LeFranc and LeFranc(2001)，「T cell Receptor Factsbook」，Academic Press)。Ｔ細胞レセプター鎖の非常に大きな多様性は、種々のＶ、Ｊ及びＤ遺伝子(対立遺伝子バリアントを含む)の間での再配置の組合せ、更には連結多様性に起因する(Arstilaら(1999)，Science 286(5441)：958-961；Robinsら(2009)，Blood 114(19)：4099-4107)。TCR α及びβ鎖の定常又はＣ領域は、それぞれ「TRAC」及び「TRBC」と呼ばれる(Lefranc(2001)，Curr Protoc Immunol Appendix 1：Appendix 10)。
本願発明者らは、驚くべきことに、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体に高親和性及び高特異性で結合することができる新規TCRを見出した。本発明の特定の特異的結合性分子は、幾つかの変異が導入された適切な足場配列から操作されたものである。本発明の特異的結合性分子は、治療用途に特に適したプロフィールを有する。一般に、このようなTCRの同定は簡単ではなく、代表的には高い損耗率を有するため、特定の標的に適した特異的結合性分子(例えばTCR)の同定に成功することは期待できない。
先ず第一に、当業者は、適切な出発配列又は足場配列を同定する必要がある。代表的には、このような配列は、天然供給源から、例えば、ドナー血液から抽出された抗原応答性Ｔ細胞から得られる。天然レパートリ中でガン特異的Ｔ細胞が稀であることを考慮すると、多くの場合で、反応性Ｔ細胞が見つかるまで、多くのドナー(例えば20人以上)をスクリーニングする必要がある。スクリーニングプロセスは数週間から数ヶ月を要し得るし、反応性Ｔ細胞を見出しても、免疫療法用途には適さない可能性もある。例えば、反応が弱すぎることもあり得、及び/又は標的抗原に特異的でないこともあり得る。或いは、正確なTCR鎖配列を同定するために十分な材料を作製するために、クローンＴ細胞集団を創出することも、所与のＴ細胞株を拡大又は維持することも可能でないこともあり得る。出発配列又は足場配列として適するTCR配列は、次の特性の１又は２以上を有するべきである：標的ペプチド－HLA複合体に関する良好な親和性(例えば200μM以上)；高レベルの標的特異性(例えば代替ペプチド－HLA複合体への結合が比較的弱いか又は結合しない)；ファージディスプレイなどのディスプレイライブラリに使用可能であること；及び、リフォールドでき、高収率で精製できること。TCR認識の縮重的性質を考慮すると、当業者でさえ、特定の足場TCR配列が、治療用途に向けた操作に相応しい特異性プロフィールを有するかを決定することは例外的に難しい(Wooldridgeら，J Biol Chem. 2012 Jan 6; 287(2): 1168-77)。
次の課題は、TCRを、特異性及び収率などの所望の特性を維持しながら、標的抗原に対してより高い親和性を有するように操作することである。天然に存在するTCRは、抗体と比較して、標的抗原に関して弱い親和性(低マイクロモル範囲)を有し、ガン抗原に対するTCRは、代表的には、ウイルス特異的TCRより弱い抗原認識を有する(Aleksicら，Eur J Immunol. 2012 Dec; 42(12): 3174-9).この弱い親和性は、ガン細胞でのHLAダウンレギュレーションと一緒になって、ガン免疫療法のための治療用TCRには、代表的には、標的抗原に関する親和性を増大させ、より強力な応答を生じるさせる操作が必要であることを意味する。このような親和性増大は、可溶性TCRベース薬剤に不可欠である。このような場合、ナノモル～ピコモル範囲の抗原結合親和性及び数時間の結合半減期が望ましい。低エピトープ数で高親和性抗原認識により生じる効力向上は、Liddyらの図1e及び図1fに例示されている(Liddyら，Nat Med. 2012 Jun; 18(6): 980-7)。親和性成熟プロセスには、代表的には、当業者が、抗原認識強度を増大させるために、出発TCR配列に対して、特定の変異及び/又は変異の組合せ(置換、挿入及び/又は欠失を含むがこれに限定されない)を設計しなければならないことが含まれる。所与のTCRに対して親和性増強変異を設計する方法は、当該分野において公知であり、例えば、ディスプレイライブラリの使用である(Liら，Nat Biotechnol. 2005 Mar; 23(3): 349-54；Hollerら，Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 May 9; 97(10): 5387-92)。しかし、所与の標的に対する所与のTCRの親和性を顕著に増大させるために、当業者は、変異の組合せを、可能な選択肢の大きなプールから設計する必要があり得る。親和性の顕著な増大をもたらす特定の変異及び/又は変異の組合せは予測可能ではなく、損耗率が高い。多くの場合、所与の出発TCR配列を用いて親和性の顕著な増大を達成することは不可能であり得る。
親和性成熟プロセスは、TCRの抗原特異性を維持する必要性も考慮しなければならない。標的抗原に関するTCRの親和性の増大は、TCR抗原認識の本来的縮重の結果として、その他の意図しない標的との交差反応性が明らかになる実質的リスクをもたらす(Wooldridgeら，J Biol Chem.2012 Jan 6; 287(2): 1168-77；Wilsonら，Mol Immunol. 2004 Feb; 40(14-15): 1047-55；Zhaoら，J Immunol. 2007 Nov 1; 179(9): 5845-54)。天然レベルの親和性では、交差反応性抗原の認識は、応答を生じるには低すぎることがあり得る。交差反応性抗原が通常の健常細胞にディスプレイされる場合には、インビボでオフターゲット結合し、臨床的毒性が顕現する可能性が高くなる。よって、抗原結合強度の増大に加えて、当業者は、TCRに標的抗原に対する高い特異性を保持させる変異及び/又は変異の組合せを設計し、前臨床試験において良好な安全性プロフィールを実証しなければならない。繰り返すが、適切な変異及び/又は変異の組合せは予測できない。この段階での損耗率は更に高く、多くの場合で、所与の出発TCR配列からは全く達成不能であり得る。
上記の困難にもかかわらず、本発明者らは、特に適切な親和性及び特異性を有する変異TCRを同定した。前記TCRは、Ｔ細胞再指向化部位に融合した可溶性薬剤として作製したとき、抗原陽性ガン細胞の強力で特異的な殺傷を証明する。
発明の説明
第１の観点において、本発明は、HLA-A*02と複合体化したKVLEYVIKV(配列番号１)に対する結合性を有し、各々がFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(FRはフレームワーク領域であり、CDRは相補性決定領域である)を含むTCR α鎖可変ドメイン及び/又はTCR β鎖可変ドメインを含んでなる特異結合性分子であって、
(a)α鎖CDRは次の配列：
CDR1 - 配列SSVPPY(配列番号15)、又はSSVPPY(配列番号15)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR2 - 配列YTSAATLV(配列番号16)、又はYTSAATLV(配列番号16)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR3 - 配列AARPSSSNTGKLI(配列番号17)、又はAARPSSSNTGKLI(配列番号17)において１若しくは２以上の変異を有する配列
を有し、及び/又は
(b)β鎖CDRは次の配列：
CDR1 - 配列PRHDT(配列番号18)、又はPRHDT(配列番号18)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR2 - 配列FYEKMQ(配列番号19)、又はFYEKMQ(配列番号19)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR3 - 配列ASSFTGFDEQF(配列番号20)、又はASSFTGFDEQF(配列番号20)において１若しくは２以上の変異を有する配列
を有する、特異的結合性分子を提供する。
第１の観点において、本発明は、HLA-A*02と複合体化したKVLEYVIKV(配列番号１)に対する結合性を有し、各々がFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(FRはフレームワーク領域であり、CDRは相補性決定領域である)を含むTCR α鎖可変ドメイン及び/又はTCR β鎖可変ドメインを含んでなる特異結合性分子であって、
(a)α鎖CDRは次の配列：
CDR1 - 配列SSVPPY(配列番号15)、又はSSVPPY(配列番号15)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR2 - 配列YTSAATLV(配列番号16)、又はYTSAATLV(配列番号16)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR3 - 配列AARPSSSNTGKLI(配列番号17)、又はAARPSSSNTGKLI(配列番号17)において１若しくは２以上の変異を有する配列
を有し、及び/又は
(b)β鎖CDRは次の配列：
CDR1 - 配列PRHDT(配列番号18)、又はPRHDT(配列番号18)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR2 - 配列FYEKMQ(配列番号19)、又はFYEKMQ(配列番号19)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR3 - 配列ASSFTGFDEQF(配列番号20)、又はASSFTGFDEQF(配列番号20)において１若しくは２以上の変異を有する配列
を有する、特異的結合性分子を提供する。
本発明は、KVLEYVIKV－HLA複合体に結合する、CDR及び可変ドメインを含む特異的結合性分子を提供する。特異的結合性分子又はその結合性フラグメントは、TCR可変ドメインを含み、このTCR可変ドメインは天然型TCRのものに対応してもよいし、より好ましくは、TCR可変ドメインは、操作されている/非天然のものであり得る。天然型TCR可変ドメインは、野生型の、天然の、親の、非変異の又は足場のドメインとも呼ばれ得る。特異的結合性分子又は結合性フラグメントは、理想的な治療剤特性(例えば、標的に関する超生理的親和性、長い結合半減期、標的に対する高特異性及び良好な安定性)を有する分子を製造するために用いることができる。本発明はまた、特異的結合性分子又はその結合性フラグメント及びＴ細胞再指向化部位が組み込まれた二重特異性又は二機能性又は融合分子を包含する。このような分子は、Ｔ細胞を再指向化し活性化することにより、抗原陽性標的細胞に対する強力で特異的な応答を媒介することができる。或いは、特異的結合性分子又は結合性フラグメントは、養子療法用の操作されたＴ細胞に組み込まれ得る。
第１の観点の特異的結合性分子において、α鎖可変ドメインフレームワーク領域は、次のフレームワーク配列：
FR1 - 配列番号２のアミノ酸１～26
FR2 - 配列番号２のアミノ酸33～49
FR3 - 配列番号２のアミノ酸58～91
FR4 - 配列番号２のアミノ酸105～115
又は、前記配列のそれぞれに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含んでなり得、及び/又は
β鎖可変ドメインフレームワーク領域は、次の配列：
FR1 - 配列番号３のアミノ酸１～26
FR2 - 配列番号３のアミノ酸32～48
FR3 - 配列番号３のアミノ酸55～91
FR4 - 配列番号３のアミノ酸103～112
又は、前記配列のそれぞれに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含んでなり得る。
FR1 - 配列番号２のアミノ酸１～26
FR2 - 配列番号２のアミノ酸33～49
FR3 - 配列番号２のアミノ酸58～91
FR4 - 配列番号２のアミノ酸105～115
又は、前記配列のそれぞれに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含んでなり得、及び/又は
β鎖可変ドメインフレームワーク領域は、次の配列：
FR1 - 配列番号３のアミノ酸１～26
FR2 - 配列番号３のアミノ酸32～48
FR3 - 配列番号３のアミノ酸55～91
FR4 - 配列番号３のアミノ酸103～112
又は、前記配列のそれぞれに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含んでなり得る。
α鎖フレームワーク領域は、TRAV8-4*01鎖に対応するアミノ酸配列を含み得、及び/又はβ鎖フレームワーク領域は、TRBV13*01鎖のものに対応するアミノ酸配列を含み得る。フレームワーク領域は、TRAV8-4*01鎖又はTRBV13*01鎖に対して、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有し得る。
本明細書で用いる場合、用語「特異的結合性分子」とは、標的抗原に結合することができる分子をいう。このような分子は、本明細書に記載する幾つかの異なる形式を採用し得る。一例はTCRであり、別の例はTCR CDRを含むダイアボディであり、これはTCR可変領域の形態であり得る。さらに、本発明の特異的結合性分子のフラグメントもまた想定される。フラグメントとは、標的抗原への結合を保持する、特異的結合性分子の部分をいう。
用語「変異」は置換、挿入及び欠失を包含する。天然型特異的結合性分子(親の、天然の、非変異の、野生型の又は足場の特異的結合性分子とも呼ばれる)に対する変異としては、KVLEYVIKV-HLA-A*02複合体に関する特異的結合性分子の結合親和性(kD及び/又は結合半減期)を増大させるものが挙げられ得る。
用語「変異」は置換、挿入及び欠失を包含する。天然型特異的結合性分子(親の、天然の、非変異の、野生型の又は足場の特異的結合性分子とも呼ばれる)に対する変異としては、KVLEYVIKV-HLA-A*02複合体に関する特異的結合性分子の結合親和性(kD及び/又は結合半減期)を増大させるものが挙げられ得る。
α鎖CDR及び/又はフレームワーク領域は、天然型CDR及び/又はフレームワークに対する少なくとも１つの変異を含有し得る。α鎖のCDR及び/又はフレームワークには、１つ、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、10以下、又は11以上の変異が存在し得る。α鎖CDR及び/又はフレームワークは、置換及び挿入を含有し得る。α鎖は、配列番号２の番号付けを参照して、次のCDR変異：
・ 26位の後に４アミノ酸(例えば、ARWG)の挿入
・ S27D
・ S28G
・ S52G
・ A53G
・ A54D
・ T55L
・ I56V
・ S97D
・ S98A
を含有し得る。
・ 26位の後に４アミノ酸(例えば、ARWG)の挿入
・ S27D
・ S28G
・ S52G
・ A53G
・ A54D
・ T55L
・ I56V
・ S97D
・ S98A
を含有し得る。
β鎖CDR及び/又はフレームワーク領域は、天然型CDR及び/又はフレームワークに対する少なくとも１つの変異を含有し得る。β鎖のCDR及び/又はフレームワークには、１つ、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、又は９以上の変異が存在し得る。β鎖CDR及び/又はフレームワークは、置換及び挿入を含有し得る。
β鎖は、配列番号３の番号付けを参照して、次のCDR変異：
・ Y50F
・ K52T
・ M53K
・ Q54F
・ F95V
・ T96W
・ G97D
・ F98W/Y
を含有し得る。
よって、α鎖及びβ鎖CDRには、列挙した変異のいずれか又は全てが、任意に他の変異との組合せで存在し得る。CDR及び/又はフレームワーク領域には、その他の変異が存在し得る。
・ Y50F
・ K52T
・ M53K
・ Q54F
・ F95V
・ T96W
・ G97D
・ F98W/Y
を含有し得る。
よって、α鎖及びβ鎖CDRには、列挙した変異のいずれか又は全てが、任意に他の変異との組合せで存在し得る。CDR及び/又はフレームワーク領域には、その他の変異が存在し得る。
α鎖CDR1は、次の配列：
SSVPPY(配列番号15)、又は
ARWGDGVPPY(配列番号21)
を含み得る。
α鎖CDR2は、次の配列：
YTSAATLV(配列番号16)、又は
YTGGDLVV(配列番号22)
を含み得る。
α鎖CDR3は、次の配列：
AARPSSSNTGKLI(配列番号17)、
AARPSDSNTGKLI(配列番号23)、又は
AARPSSANTGKLI(配列番号24)
を含み得る。
SSVPPY(配列番号15)、又は
ARWGDGVPPY(配列番号21)
を含み得る。
α鎖CDR2は、次の配列：
YTSAATLV(配列番号16)、又は
YTGGDLVV(配列番号22)
を含み得る。
α鎖CDR3は、次の配列：
AARPSSSNTGKLI(配列番号17)、
AARPSDSNTGKLI(配列番号23)、又は
AARPSSANTGKLI(配列番号24)
を含み得る。
β鎖CDR1は、次の配列：
PRHDT(配列番号18)
を含み得る。
β鎖CDR2は、次の配列：
FYEKMQ(配列番号19)、
FFETMF(配列番号25)、又は
FFETKF(配列番号26)
を含み得る。
β鎖CDR3は、次の配列：
ASSFTGFDEQF(配列番号20)、
ASSVWDWDEQF(配列番号27)、又は
ASSVWDYDEQF(配列番号28)
を含み得る。
PRHDT(配列番号18)
を含み得る。
β鎖CDR2は、次の配列：
FYEKMQ(配列番号19)、
FFETMF(配列番号25)、又は
FFETKF(配列番号26)
を含み得る。
β鎖CDR3は、次の配列：
ASSFTGFDEQF(配列番号20)、
ASSVWDWDEQF(配列番号27)、又は
ASSVWDYDEQF(配列番号28)
を含み得る。
α鎖及びβ鎖CDRの好ましい組合せを下表に示す。
特に好ましい組合せを下表に示す：
別の特に好ましい別の組合せを下表に示す：
CDR内の変異は、好ましくは、KVLEYVIKV-HLA-A*02複合体への特異的結合性分子の結合親和性を改善するが、追加的又は代替的に、他の利点、例えば単離形態での安定性の改善及び特異性の改善を付与し得る。１又は２以上の位置での変異は、追加的に又は代替的に、例えば相互作用のためのより好ましい角度を提供することにより、隣接する位置の同族pMHC複合体との相互作用に影響を及ぼし得る。変異は、非特異的結合の量を低減させることができるもの、すなわちKVLEYVIKV-HLA-A*02への結合と比較して代替の抗原への結合を低減させることができるものを含んでいてもよい。変異は、フォールディング及び/又は製造の効力を増大させるものを含んでいてもよい。これら特性の各々に寄与し得る変異もあれば、例えば、親和性に寄与し得るが特異性には寄与し得ない変異や、特異性に寄与し得るが親和性には寄与し得ない変異などもあり得る。
代表的には、合計で少なくとも５、少なくとも10、少なくとも15又はそれ以上のCDR変異が、標的抗原に関してpMの親和性を有する特異的結合性分子を得るために必要とされる。標的抗原に関してpMの親和性を有する特異的結合性分子は、可溶性治療剤に特に適切である。養子療法適用に用いる特異的結合性分子は、標的抗原に関してより低い親和性を有していてもよく、よってより少ないCDR変異、例えば合計で１まで、２まで、５まで又は６以上のCDR変異を有していてもよい。幾つかの場合では、特異的結合性分子は、標的抗原に関して十分に高い親和性を有していてもよく、よって変異の必要はない。
変異は、追加的に又は代替的に、CDRの外側にフレームワーク領域内でなされ得る；このような変異は、特異的結合性分子の結合及び/又は特異性及び/又は安定性及び/又は精製可溶形態の収率を改善し得る。例えば、α鎖及び/又はβ鎖のＮ末端は、E. coliにおける製造の間のＮ末端メチオニン切断の効率を改善するように改変し得る。不十分な切断は、不均一なタンパク質産物をもたらし得、及び/又は開始メチオニンの存在はヒトにおいて免疫原性であり得るために、治療剤に関しては有害であり得る。
好ましくは、本発明の特異的結合性分子のα鎖可変ドメインは、配列番号２のフレームワークアミノ酸残基１～26、33～49、58～91、105～115のそれぞれに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するフレームワークアミノ酸配列を含んでなり得る。本発明の特異的結合性分子のβ鎖可変ドメインは、配列番号３のフレームワークアミノ酸残基１～26、32～48、55～91、103～112のそれぞれに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するフレームワークアミノ酸配列を含んでなり得る。或いは、言及したパーセンテージ同一性は、全体としてのフレームワーク配列にわたるものであってもよい。
α鎖可変ドメインは、配列番号４、５及び６のアミノ酸配列の任意の１つ又は該配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含んでなり得、β鎖可変ドメインは、配列番号７、８及び９のアミノ酸配列の任意の１つ又は該配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含んでなり得る。
例えば、特異的結合性分子は、次のα鎖及びβ鎖可変ドメインの対：
を含んでなり得る。
好ましい対は、配列番号４及び配列番号８である。別の好ましい対は、配列番号４及び配列番号７である。
例えば、特異的結合性分子は、次のα鎖及びβ鎖可変ドメインの対：
を含んでなり得る。
好ましい対は、配列番号４及び配列番号８である。別の好ましい対は、配列番号４及び配列番号７である。
本明細書に開示するいずれの本発明の特異的結合性分子の表現型上サイレントなバリアントも、本発明の範囲内である。本明細書で用いる場合、用語「表現型上サイレントなバリアント」は、上記の変異に加えて、１又は２以上の更なるアミノ酸変化(置換、挿入及び欠失を含む)が組み込まれたTCR可変ドメインを有する特異的結合性分子をいうと理解され、ここで、前記TCRは当該変化を有しない対応のTCRに類似する表現型を有する。本願の目的のためには、TCRの表現型は、結合親和性(KD及び/又は結合半減期)及び特異性を含む。好ましくは、免疫エフェクターと結合した可溶性特異的結合性分子の表現型は、結合親和性及び特異性に加えて、免疫活性化の効力及び精製収率を含む。表現型上サイレントなバリアントは、同一条件下で(例えば25℃にて及び/又は同じSPRチップ上で)測定されたとき、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体に関して、前記変化を有しない対応のTCRで測定されたKD及び/又は結合半減期の50％以内、より好ましくは30％以内、より好ましくは25％以内、より好ましくは20％以内のKD及び/又は結合半減期を有していてもよい。適切な条件は実施例２で更に説明する。当業者に公知であるように、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体との相互作用の親和性及び/又は他の機能的特性を変更することなく、可変ドメインに、上記のものからの変化が組み込まれた特異的結合性分子を製造することは可能であり得る。具体的には、このようなサイレント変異は、抗原結合に直接関与しないことが知られている配列の部分(例えば、抗原と接触しないフレームワーク領域及び/又はCDRの部分)に組み込まれてもよい。このようなバリアントも本発明の範囲に含まれる。
表現型上サイレントなバリアントは、１若しくは２以上の保存的置換及び/又は１若しくは２以上の寛容される置換を含んでいてもよい。寛容される置換は、下記に示される保存的置換の定義に該当しないにもかかわらず、表現型上サイレントである置換を意味する。当業者は、種々のアミノ酸が類似する特性を有し、よって「保存的」であることを理解する。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのそのような１又は２以上のアミノ酸は、該タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの所望の活性を消失させないで１又は２以上の他のそのようなアミノ酸で置換し得る場合が多い。
よって、アミノ酸 グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン(脂肪族側鎖を有するアミノ酸)は、互いに置換され得る場合が多い。これら可能な置換のうち、(相対的に短い側鎖を有するので)グリシン及びアラニンを互いに置換するために用い、(疎水性である、より長い脂肪族側鎖を有するので)バリン、ロイシン及びイソロイシンを互いに置換するために用いることが好ましい。互いに置換され得る場合が多い他のアミノ酸として：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン(芳香族側鎖を有するアミノ酸)；リジン、アルギニン及びヒスチジン(塩基性側鎖を有するアミノ酸)；アスパラギン酸及びグルタミン酸(酸性側鎖を有するアミノ酸)；アスパラギン及びグルタミン(アミド側鎖を有するアミノ酸)；並びにシステイン及びメチオニン(イオウ含有側鎖を有するアミノ酸)が挙げられる。本発明の範囲内のアミノ酸置換は、天然に存在するアミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸を用いて行い得ることを理解すべきである。例えば、本明細書では、アラニンのメチル基はエチル基で置換されてもよく及び/又は軽微な変化がペプチド骨格になされてもよいことが企図されている。天然又は合成のアミノ酸が用いられているか否かにかかわらず、L-アミノ酸のみが存在することが好ましい。
この性質の置換は、「保存的」又は「半保存的」アミノ酸置換と呼ばれる場合が多い。したがって、本発明は、上記アミノ酸配列のいずれかにおいて１若しくは２以上の保存的置換及び/又は１若しくは２以上の寛容される置換を有するアミノ酸配列を含んでなる特異的結合性分子であって、可変ドメインのアミノ酸配列が、配列番号４、５若しくは６及び/又は配列番号７若しくは８若しくは９に提供される可変ドメインに対して少なくとも90％の同一性、例えば少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％の同一性を有する特異的結合性分子の使用にまで拡張される。
「同一性」は、当該分野において公知のように、配列比較により決定される、２若しくは３以上のポリペプチド配列間又は２若しくは３以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、同一性はまた、妥当な場合、ポリペプチド配列間又はポリヌクレオチド配列間の、配列の並びの一致性によって決定される配列関連性の程度を意味する。２つのポリペプチド配列間又は２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定する方法は幾つか存在するが、同一性の決定に一般に用いられる方法は、コンピュータプログラム化されている。２つの配列間の同一性を決定する好適なコンピュータプログラムとしては、GCGプログラムパッケージ(Devereuxら，Nucleic Acids Research，12, 387(1984))、BLASTP、BLASTN及びFASTA(Atschulら，J. Molec. Biol. 215, 403(1990))が挙げられるが、これに限定されない。
CLUSTALプログラムのようなプログラムを用いてアミノ酸配列を比較することができる。このプログラムはアミノ酸配列を比較し、必要な場合にはいずれかの配列にスペースを挿入して最適な整列(アラインメント)を見出す。最適な整列についてアミノ酸の同一性又は類似性(同一性＋アミノ酸タイプの保存)を算出することができる。BLASTxのようなプログラムは、類似する配列を最も長く整列させ、その適合度に対して値を割り当てる。よって、各々が異なるスコアを有する幾つかの類似領域を見出す比較を得ることができる。両タイプの同一性分析が本発明において企図されている。
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性は、最適比較を目的として配列を整列させ(例えば、最良整列のために第１の配列にギャップを導入することができる)、対応する位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することにより決定される。「最良整列」は、最も高いパーセント同一性をもたらす２つの配列の整列である。パーセント同一性は、比較する配列中の同一アミノ酸残基又はヌクレオチドの数により決定される(すなわち、％同一性 = 同一位置の数/位置の総数×100)。
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性は、最適比較を目的として配列を整列させ(例えば、最良整列のために第１の配列にギャップを導入することができる)、対応する位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することにより決定される。「最良整列」は、最も高いパーセント同一性をもたらす２つの配列の整列である。パーセント同一性は、比較する配列中の同一アミノ酸残基又はヌクレオチドの数により決定される(すなわち、％同一性 = 同一位置の数/位置の総数×100)。
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列を比較する数学的アルゴリズムの例は、Karlin及びAltschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されるように改変されたKarlin及びAltschul(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムである。Altschulら(1990)，J. Mol. Biol. 215:403-410のBLASTn及びBLASTpプログラムには、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性の決定は、BLASTnプログラムを用いて行うことができる。２つのタンパク質配列間のパーセント同一性の決定は、BLASTpプログラムを用いて行うことができる。比較目的でギャップを有する整列を得るためには、Altschulら(1997)，Nucleic acid Res. 25:3389-3402に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。或いは、PSI-Blastを用いて、分子間の遠い関連性を検出する累次サーチを行うことができる(前出)。BLAST、Gapped BLAST及びPSI-Blastプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム(例えば、BLASTp及びBLASTp)のデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。デフォルトの一般的パラメータとしては、例えば、Word Size = 3、Expect Threshold = 10を挙げ得る。パラメータは短い入力配列について自動的に調節されるように選択され得る。配列比較に利用される数学的アルゴリズムの別の例は、Myers及びMiller，CABIOS(1989)のアルゴリズムである。CGC配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)には、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。当該分野において公知の他の配列分析アルゴリズムとしては、Torellis及びRobotti(1994)，Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5に記載されるADVANCE及びADAM；並びにPearson及びLipman(1988)，Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8に記載されるFASTAが挙げられる。FASTAにおいて、ktupは、サーチの感度及び速度を設定するコントロールオプションである。本開示においてパーセント同一性を評価する目的には、デフォルトパラメータを用いるBLASTpを比較法として使用する。加えて、記載したパーセント同一性がアミノ酸について非整数値である場合、得られた値は小数点以下を切り捨てて整数とする(すなわち、25アミノ酸の配列が90％配列同一性を有すると「22.5」となるが、「22」とする)。したがって、前記例では、25アミノ酸のうち22がマッチする配列は、90％以内の配列同一性である。
当業者に自明であるように、Ｃ末端及び/又はＮ末端に提供される配列は、特異的結合性分子の機能的特性に実質的に影響を及ぼすことなく、１、２、３、４、５又は６以上の残基を短縮化又は延長することができ得る。このようなバリアントの全てが本発明に包含される。
任意の適切な方法を用いることを条件に、変異(保存的及び寛容される置換、挿入及び欠失を含む)を配列に導入してもよい。このような方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースにする方法、制限酵素ベースのクローニング又はライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順が挙げられるが、これらに限定されない。これら方法は、多くの標準的な分子生物学の教科書に詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び制限酵素ベースのクローニングに関する更なる詳細については、Sambrook及びRussell(2001)，Molecular Cloning - A Laboratory Manual(第３版) CSHL Pressを参照。ライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順についての更なる情報は、Rashtchian(1995)，Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6に見出すことができる。本発明により提供されるTCR配列は、固相合成又は当該分野において公知の任意の他の適切な方法から得てもよい。
任意の適切な方法を用いることを条件に、変異(保存的及び寛容される置換、挿入及び欠失を含む)を配列に導入してもよい。このような方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースにする方法、制限酵素ベースのクローニング又はライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順が挙げられるが、これらに限定されない。これら方法は、多くの標準的な分子生物学の教科書に詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び制限酵素ベースのクローニングに関する更なる詳細については、Sambrook及びRussell(2001)，Molecular Cloning - A Laboratory Manual(第３版) CSHL Pressを参照。ライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順についての更なる情報は、Rashtchian(1995)，Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6に見出すことができる。本発明により提供されるTCR配列は、固相合成又は当該分野において公知の任意の他の適切な方法から得てもよい。
本発明の特異的結合性分子は、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体への結合性を有する。本発明の特異的結合性分子は、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体に関して高度の特異性が証明されており、よって治療用途に特に適切である。本発明の特異的結合性分子に関して、特異性は、抗原陽性であるHLA-A*02標的細胞を認識できる一方で、抗原陰性であるHLA-A*02標的細胞を認識する能力が極めて小さいことに関する。
当業者に公知であるように、HLA-A*02対立遺伝子群には幾つかのサブタイプが含まれる。このようなサブタイプの全てが本発明の範囲に含まれる。好ましいサブタイプの例はHLA-A*0201である。
当業者に公知であるように、HLA-A*02対立遺伝子群には幾つかのサブタイプが含まれる。このようなサブタイプの全てが本発明の範囲に含まれる。好ましいサブタイプの例はHLA-A*0201である。
特異性は、インビトロで、例えば細胞アッセイ(例えば、実施例３及び４に記載されるもの)において測定することができる。特異性を試験するため、特異的結合性分子(例えばTCR)は可溶形態で、免疫エフェクターと結合されていてもよく、及び/又は細胞(例えばＴ細胞)の表面に発現されていてもよい。特異性は、抗原陽性標的細胞及び抗原陰性標的細胞の存在下でのＴ細胞活性化レベルを測定することによって決定してもよい。抗原陰性標的細胞の極めて小さい認識は、同一条件下で治療上妥当な特異的結合性分子濃度にて測定したとき、抗原陽性標的細胞の存在下で生じるＴ細胞活性化レベルの20％未満、好ましくは10％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満のレベルとして規定される。免疫エフェクターと結合した可溶性TCRについて、治療上妥当な濃度は、10-9Ｍ以下のTCR濃度及び/又は対応するEC50値より100倍まで、好ましくは1000倍まで大きい濃度と規定されてもよい。好ましくは、免疫エフェクターと組み合わせた可溶性TCRについて、抗原陰性細胞に対するＴ細胞活性化に要する濃度に比する抗原陽性細胞に対するＴ細胞活性化に要する濃度に少なくとも100倍の差が存在する。抗原陽性細胞は、ガン細胞に匹敵するレベルの抗原提示を得るために適切なペプチド濃度を用いるペプチド-パルスにより得られてもよく(例えば、Bossiら(2013)，Oncoimmunol. 1;2(11):e26840に記載されているように10-9Ｍペプチド)、又は当該ペプチドを天然に提示するものであってもよい。好ましくは、抗原陽性細胞及び抗原陰性細胞は共にヒト細胞である。好ましくは、抗原陽性細胞はヒトガン細胞である。抗原陰性細胞は、好ましくは、健常ヒト組織に由来するものを含む。
特異性は、追加的に又は代替的に、KVLEYVIKV(配列番号１)－HLA-A*02複合体に結合し、代替ペプチド－HLA複合体のパネルに結合しない特異的結合性分子の能力に関してもよい。これは、例えば、実施例３のBiacore法により決定されてもよい。前記パネルは、少なくとも５、好ましくは少なくとも10の代替ペプチド－HLA-A*02複合体を含んでいてもよい。代替ペプチドは、配列番号１と低レベルの配列同一性を有していてもよく、天然に提示されるものであってもよい。代替ペプチドは、好ましくは、健常ヒト組織で発現するタンパク質に由来する。KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体への特異的結合性分子の結合は、他の天然に提示されるペプチド－HLA複合体への結合より少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも10倍又は少なくとも50倍又は少なくとも100倍、なおより好ましくは少なくとも400倍大きくてもよい。
特異的結合性分子の特異性を決定する代替又は追加のアプローチは、シーケンシャル変異誘発(例えば、アラニンスキャニング)を用いてペプチド認識モチーフを同定することであり得る。結合モチーフの部分を形成する残基は、置換が許容されない残基である。非許容置換は、特異的結合性分子の結合親和性が、非変異ペプチドに関する結合親和性に比して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも80％減少するペプチド位置として定義され得る。このようなアプローチは、Cameronら(2013)，Sci Transl Med. 2013 Aug 7; 5(197):197ra103及びWO2014096803に更に記載されている。この場合の特異性は、代替モチーフ含有ペプチド、特にヒトプロテオーム中の代替モチーフ含有ペプチドを同定し、これらペプチドを特異的結合性分子に対する結合に関して試験することにより決定されてもよい。１又は２以上の代替ペプチドに対する特異的結合性分の結合は特異性の欠如を示し得る。この場合、細胞アッセイによる特異性の更なる試験が必要とされ得る。ペプチドの中央部分における(アラニン)置換に関する低い許容性は、特異的結合性分子が高い特異性を有し、したがって代替ペプチドとの交差反応性のリスクが低いことを示す。
本発明の特異的結合性分子は、治療用薬剤としての使用に関して理想的な安全性プロフィールを有し得る。この場合、特異的結合性分子は可溶性形態であり得、好ましくは免疫エフェクターに融合されていてもよい。適切な免疫エフェクターとしては、サイトカイン(例えばIL-2及びIFN-γ)；スーパー抗原及びその変異体；ケモカイン(例えばIL-8、血小板因子４、メラノーマ増殖刺激タンパク質；免疫細胞(例えばＴ細胞又はNK細胞)上の抗原に結合する抗体(例えば抗CD3、抗CD28又は抗CD16)(そのフラグメント、誘導体及びバリアントを含む)；及び補体アクチベータが挙げられるが、これらに限定されない。理想的な安全性プロフィールは、本発明の特異的結合性分子が、良好な特異性を証明されていることに加えて、更なる前臨床安全性試験に合格し得ることを意味する。このような試験の例としては、全血存在下でのサイトカイン放出が少ない(よって、インビボで可能性のあるサイトカイン放出症候群を引き起こすリスクが低い)ことを確証する全血アッセイ、及び代替のHLAタイプを認識する可能性が低いことを確証するアロ反応性試験が挙げられる。
本発明の特異的結合性分子は、高収率精製が可能であり得る。収率は、精製プロセス中に保持された物質の量(すなわち、リフォールディング前に得られた可溶化物質の量に対する、精製プロセス終時に得られるフォールディングした物質の量)に基づいて決定されてもよいし、又は、元の培養体積に対する、精製プロセス終時に得られる正確にフォールディングした物質の量に基づいて決定されてもよい。高収率は、１％以上、より好ましくは５％以上の収率を意味する。高収量は、代表的には、１mg/ml以上、より好ましくは３mg/ml以上若しくは５mg/ml以上、又はより高い収量を意味する。
本発明の特異的結合性分子は、好ましくは、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体に関して、非変異の又は足場のTCRより大きい(すなわち、より強い)KD、例えば１pM～50μMの範囲内のKDを有する。１つの観点では、本発明の特異的結合性分子は、該複合体に関して約１pM～約400nM、約１pM～約1000pM、約100pM～約800pMのKDを有する(ここで、約は±10％を意味する)。前記特異的結合性分子は、追加的又は代替的に、約１分～約60時間、約20分～約50時間又は約１時間～約６時間の範囲内の該複合体に対する結合半減期(T1/2)を有していてもよい。好ましくは、本発明の特異的結合性分子は、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体に関して、約200pM～約800pMのKD及び/又は約１時間～約６時間の結合半減期を有する。このような高親和性は、治療薬剤及び/又は検出可能な標識と組み合わせた特異的結合性分子に関して好ましい。
別の１つの観点では、本発明の特異的結合性分子は、該複合体に関して約50nM～約200μM若しくは約100nM～約１μMのKD及び/又は該複合体に関して約３秒～約12分の結合半減期を有し得る。このような特異的結合性分子は、養子療法適用に好ましくあり得る。
結合親和性(平衡定数KDに反比例する)及び結合半減期(T1/2と表される)を決定する方法は当業者に公知である。好適な実施形態において、結合親和性及び結合半減期は、(例えばそれぞれBIAcore装置又はOctet装置を使用する)表面プラズモン共鳴(SPR)又はBio-Layer Interferometry(BLI)を用いて測定する。好適な方法は実施例３に提供される。特異的結合性分子の親和性が２倍になればKDは1/2になることが理解される。T1/2はln2/解離速度(koff)として算出する。よって、T1/2が２倍になればkoffは1/2になる。TCRのKD値及びkoff値は、通常、可溶形態のTCR、すなわち細胞質及び膜貫通ドメイン残基を除去するように短縮された形態のTCRについて測定する。個々の測定値間の変動、特に20時間を超える解離時間を有する相互作用についての変動を説明するため、所与の特異的結合性分子の結合親和性及び/又は結合半減期は、数回、例えば３回又は４回以上、同じアッセイプロトコルを用いて測定して、結果の平均をとり得る。２つのサンプル(すなわち、２つの異なる特異的結合性分子及び/又は同じ特異的結合性分子の２つの調製物)間の結合データを比較するため、測定値は同じアッセイ条件(例えば温度)、例えば実施例２に記載の条件を用いて測定することが好ましい。
結合親和性(平衡定数KDに反比例する)及び結合半減期(T1/2と表される)を決定する方法は当業者に公知である。好適な実施形態において、結合親和性及び結合半減期は、(例えばそれぞれBIAcore装置又はOctet装置を使用する)表面プラズモン共鳴(SPR)又はBio-Layer Interferometry(BLI)を用いて測定する。好適な方法は実施例３に提供される。特異的結合性分子の親和性が２倍になればKDは1/2になることが理解される。T1/2はln2/解離速度(koff)として算出する。よって、T1/2が２倍になればkoffは1/2になる。TCRのKD値及びkoff値は、通常、可溶形態のTCR、すなわち細胞質及び膜貫通ドメイン残基を除去するように短縮された形態のTCRについて測定する。個々の測定値間の変動、特に20時間を超える解離時間を有する相互作用についての変動を説明するため、所与の特異的結合性分子の結合親和性及び/又は結合半減期は、数回、例えば３回又は４回以上、同じアッセイプロトコルを用いて測定して、結果の平均をとり得る。２つのサンプル(すなわち、２つの異なる特異的結合性分子及び/又は同じ特異的結合性分子の２つの調製物)間の結合データを比較するため、測定値は同じアッセイ条件(例えば温度)、例えば実施例２に記載の条件を用いて測定することが好ましい。
本発明の特定の好適な特異的結合性分子は、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体に関して、天然型TCRのものより実質的に高い結合親和性及び/又は結合半減期を有する。天然型TCRの結合親和性を増大させると、そのペプチド－MHCリガンドに関する当該TCRの特異性は低下することが多く、このことは、Zhaoら(2007)，J.Immunol, 179:9, 5845-5854において証明されている。しかし、本発明の特異的結合性分子は、天然型TCRより実質的に高い結合親和性を有するにもかかわらず、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体に関して特異的なままである。
特定の好適な特異的結合性分子は、抗原陽性細胞、具体的には、ガン細胞に代表的である、低レベルの抗原(すなわち、細胞あたり、５～100のオーダー、例えば50抗原)を提示する細胞に対して、インビトロで高度に強力なＴ細胞応答を生じることができる(Bossiら(2013)，Oncoimmunol. 1; 2(11): e26840；Purbhooら(2006)，J Immunol 176(12): 7308-7316))。このような特異的結合性分子は、免疫エフェクター(例えば、抗CD3抗体)に連結されていてもよい。測定されるＴ細胞応答は、Ｔ細胞活性化マーカー(例えば、インターフェロンγ又はグランザイムＢ)の放出若しくは標的細胞殺傷又は他のＴ細胞活性化の尺度(例えばＴ細胞増殖)であってもよい。好ましくは、高度に強力な応答は、pM範囲のEC50値、例えば200pM以下のEC50値を有するものである。
特定の好適な特異的結合性分子は、抗原陽性細胞、具体的には、ガン細胞に代表的である、低レベルの抗原(すなわち、細胞あたり、５～100のオーダー、例えば50抗原)を提示する細胞に対して、インビトロで高度に強力なＴ細胞応答を生じることができる(Bossiら(2013)，Oncoimmunol. 1; 2(11): e26840；Purbhooら(2006)，J Immunol 176(12): 7308-7316))。このような特異的結合性分子は、免疫エフェクター(例えば、抗CD3抗体)に連結されていてもよい。測定されるＴ細胞応答は、Ｔ細胞活性化マーカー(例えば、インターフェロンγ又はグランザイムＢ)の放出若しくは標的細胞殺傷又は他のＴ細胞活性化の尺度(例えばＴ細胞増殖)であってもよい。好ましくは、高度に強力な応答は、pM範囲のEC50値、例えば200pM以下のEC50値を有するものである。
本発明の特異的結合性分子は、αβヘテロ二量体であり得るTCR可変ドメインを含んでいてもよい。特定の場合には、本発明の特異的結合性分子は、γδヘテロ二量体であり得るTCR可変ドメインを含んでいてもよい。他の場合には、本発明の特異的結合性分子は、αα又はββホモ二量体(又はγγ若しくはδδホモ二量体)であり得るTCR可変ドメインを含んでいてもよい。本発明の特異的結合性分子のα-βヘテロ二量体は、α鎖TRAC定常ドメイン配列及び/又はβ鎖TRBC1若しくはTRBC2定常ドメイン配列を含んでなり得る。定常ドメインは、完全長(これは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが存在することを意味する)であってもよく、又は可溶形式(すなわち、膜貫通ドメインも細胞質ドメインも有しない形式)であり得る。一方又は両方の定常ドメインは、天然型TRAC及び/又はTRBC1/2配列に関して変異、置換又は欠失を含有し得る。用語TRAC及びTRBC1/2はまた、天然の多形バリアント、例えばTRACの４位でのＮ→Ｋを包含する(Bragadoら，International immunology. 1994 Feb; 6(2): 223-30)。加えて、TRACのＮ末端アミノ酸は、最も一般的には、Ｎであるが、幾らかの場合には、Ｄ又は別のアミノ酸であり得る。好ましい残基はＤである。
α及びβ鎖定常ドメイン配列は、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失させるように短縮化又は置換により改変されていてもよい。α及び/又はβ鎖定常ドメイン配列は、例えばWO 03/020763に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基同士間に導入されたジスルフィド結合を有していてもよい。１つの好適な実施形態において、α及びβ定常ドメインは、TRACのThr 48の位置及びTRBC1又はTRBC2のSer 57の位置でのシステイン残基の置換により改変され、該システイン同士が当該TCRのα定常ドメインとβ定常ドメインとの間のジスルフィド結合を形成していてもよい。TRBC1又はTRBC2は、追加的に、定常ドメインの75位でのシステイン→アラニン変異及び定常ドメイン89位でのアスパラギン→アスパラギン酸変異を含んでいてもよい。本発明のαβヘテロ二量体に存在する細胞外定常ドメインの一方又は両方は、一方又は両方のＣ末端で、例えば15まで又は10まで又は８まで又は７以下のアミノ酸が欠失されていてもよい(すなわち短縮化されていてもよい)。本発明のαβヘテロ二量体に存在する細胞外定常ドメインの一方又は両方は、一方又は両方のＣ末端で、例えば15まで又は10まで又は８までのアミノ酸が欠失されていてもよい(すなわち短縮化されていてもよい)。α鎖細胞外定常ドメインのＣ末端は、８アミノ酸までが欠失されていてもよい(すなわち短縮化されていてもよい)。α及びβ定常ドメイン配列の好適な例は、配列番号10及び11により提供される。
或いは、完全長又は短縮型の定常ドメインではなく、TCR定常ドメインが存在しなくてもよい。したがって、本発明の特異的結合性分子は、TCR α及びβ鎖の可変ドメインと、任意に、上記の追加のドメインとから構成されてもよい。追加のドメインとしては、免疫エフェクタードメイン(例えば、抗体ドメイン)、Fcドメイン又はアルブミン結合性ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の特異的結合性分子は単鎖形式であってもよい。単鎖形式としては、Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ又はVα-Cα-L-Vβ-Cβタイプ(ここで、Vα及びVβはそれぞれTCR α及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCR α及びβ定常領域であり、Lはリンカー配列である)のαβTCRポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない(Weidanzら(1998)，J Immunol Methods. Dec 1; 221(1-2): 59-76；Epelら(2002)，Cancer Immunol Immunother. Nov; 51(10): 565-73；WO 2004/033685；WO9918129)。リンカー配列は、通常、可撓性を限定する虞れがある嵩高い側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及びセリンから主に作られている点で、可撓性である。或いは、より大きい剛性を有するリンカーが望ましくあり得る。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は、約12アミノ酸長以下、例えば10アミノ酸長以下又は２～10アミノ酸長である。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸長であり得る。本発明の複数ドメイン結合性分子に用い得る適切なリンカーの例として、GGGGS(配列番号29)、GGGSG(配列番号30)、GGSGG(配列番号31)、GSGGG(配列番号32)、GSGGGP(配列番号33)、GGEPS(配列番号34)、GGEGGGP(配列番号35)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号36)(WO2010/133828に記載)並びにGGGSGGGG(配列番号37)が挙げられるが、これらに限定されない。追加のリンカーは、次の配列モチーフ：GGGS(配列番号38)、GGGGS(配列番号39)、TVLRT(配列番号40)、TVSSAS(配列番号41)及びTVLSSAS(配列番号42)の１又は２以上を有する配列を含み得る。存在する場合、一方又は両方の定常ドメインは完全長であり得、又は上記のとおり、短縮化され及び/又は変異を含有し得る。好ましくは、単鎖TCRは可溶性である。本発明の特定の単鎖TCRは、WO 2004/033685に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有してもよい。単鎖TCRは、WO2004/033685；WO98/39482；WO01/62908；Weidanzら(1998)，J Immunol Methods 221(1-2): 59-76；Hooら(1992)，Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763；Schodin(1996)，Mol Immunol 33(9): 819-829)に更に記載されている。TCR可変ドメインは、ダイアボディ形式で配置されていてもよい。
本発明はまた、本発明の特異的結合性分子をディスプレイする粒子を含み、粒子は粒子ライブラリに含まれていてもよい。このような粒子は、ファージ、酵母細胞、リボソーム又は哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない。このような粒子及びライブラリを製造する方法は当該分野において公知である(例えば、WO2004/044004；WO01/48145；Chervinら(2008)，J. Immuno. Methods 339.2:175-184を参照)。
本発明の特異的結合性分子は、抗原提示細胞及び抗原提示細胞を含有する組織への検出可能な標識又は治療薬剤の送達に有用である。したがって、これらは、(特異的結合性分子を用いて同族抗原を提示する細胞の存在を検出する診断目的のための)検出可能な標識；及び/又は治療薬剤；及び/又は薬物動態(PK)改変成分と(共有結合又はその他の様式で)結合していてもよい。
本発明の特異的結合性分子は、抗原提示細胞及び抗原提示細胞を含有する組織への検出可能な標識又は治療薬剤の送達に有用である。したがって、これらは、(特異的結合性分子を用いて同族抗原を提示する細胞の存在を検出する診断目的のための)検出可能な標識；及び/又は治療薬剤；及び/又は薬物動態(PK)改変成分と(共有結合又はその他の様式で)結合していてもよい。
PK改変成分の例としては、PEG(Dozierら(2015)，Int J Mol Sci. Oct 28;16(10):25831-64及びJevsevarら(2010)，Biotechnol J. Jan;5(1):113-28)、PAS化(Schlapschyら(2013)，Protein Eng Des Sel. Aug;26(8):489-501)、アルブミン及びアルブミン結合性ドメイン(Dennisら(2002)，J Biol Chem. Sep 20;277(38):35035-43)及び/又は非構造化ポリペプチド(Schellenbergerら(2009)，Nat Biotechnol. Dec;27(12):1186-90)が挙げられるが、これらに限定されない。更なるPK改変成分として、抗体Fcフラグメントが挙げられる。PK改変成分はインビボ半減期を延長するために働き得る。
免疫グロブリンFcドメインは、PK改変部分として用いられる場合、任意の抗体Fc領域であり得る。Fc領域は、細胞表面のFcレセプター及び補体系の幾つかのタンパク質と相互作用する抗体テイル領域である。Fc領域は、代表的には、共に２つ又は３つの重鎖定常ドメイン(CH2、CH3及びCH4と呼ぶ)及びヒンジ領域を有する２つのポリペプチド鎖を含んでなる。この２つの鎖はヒンジ領域内でのジスルフィド結合により連結されている。免疫グロブリンサブクラスIgG1、IgG2及びIgG4のFcドメインは、FcRnに結合して、FcRn媒介リサイクリングを受け、長い循環半減期(３～４週間)を提供する。IgGとFcRnとの相互作用は、CH2及びCH3ドメインの部分をカバーするFc領域に局在化されている。本発明における使用に好適な免疫グロブリンFcは、IgG1又はIgG4のFcドメインを含むがこれらに限定されない。好ましくは、Fcドメインはヒト配列に由来する。Fc領域はまた、好ましくは、二量体化を容易にするKiH変異を含んでいてもよいし、活性化しているレセプターとの相互作用を防止する変異を含んでいてもよい(すなわち、機能的にサイレントな分子であってもよい)。免疫グロブリンFcドメインは、その他のドメイン(すなわち、TCRの可変ドメイン又は免疫エフェクター)のＣ又はＮ末端に、任意の適切な順序又は形態で融合されていてもよい。免疫グロブリンFcは、その他のドメイン(すなわち、TCRの可変ドメイン又は免疫エフェクター)にリンカーを介して融合されていてもよい。リンカー配列は、通常、可撓性を限定する虞れがある嵩高い側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及びセリンから主に作られている点で、可撓性である。或いは、より大きい剛性を有するリンカーが望ましくあり得る。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は、約12アミノ酸長以下、例えば10アミノ酸長以下又は２～10アミノ酸長である。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸長であり得る。本発明の複数ドメイン結合性分子に用い得る適切なリンカーの例として、GGGGS(配列番号29)、GGGSG(配列番号30)、GGSGG(配列番号31)、GSGGG(配列番号32)、GSGGGP(配列番号33)、GGEPS(配列番号34)、GGEGGGP(配列番号35)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号36)(WO2010/133828に記載)並びにGGGSGGGG(配列番号37)が挙げられるが、これらに限定されない。追加のリンカーは、次の配列モチーフ：GGGS(配列番号38)、GGGGS(配列番号39)、TVLRT(配列番号40)、TVSSAS(配列番号41)及びTVLSSAS(配列番号42)の１又は２以上を有する配列を含み得る。免疫グロブリンFcは、TCRに融合される場合、α又はβ鎖のいずれかに、リンカー有り又は無しで融合され得る。更に、Fcの個々の鎖がTCRの個々の鎖に融合され得る。
好ましくは、Fc領域はIgG1又はIgG4サブクラスに由来し得る。２つの鎖は、CH2及びCH3定常ドメインとヒンジ領域の全て又は一部とを含んでなってもよい。ヒンジ領域は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のヒンジ領域に実質的に又は部分的に相当してもよい。ヒンジは、コアヒンジドメインの全て又は一部及び低位ヒンジ領域の全て又は一部を含んでなってもよい。好ましくは、ヒンジ領域は、２つの鎖を連結する少なくとも１つのジスルフィド結合を含有する。
Fc領域は、WT配列に関して変異を含んでいてもよい。変異には、置換、挿入及び欠失が含まれる。このような変異は、望ましい治療特性の導入を目的としてなされたものであってもよい。例えば、ヘテロ二量体化を容易にするために、ノブ・インツー・ホール(KiH)変異がCH3ドメイン中に工学的操作により導入されていてもよい。この場合、一方の鎖が嵩高い突出残基(すなわち、ノブ)、例えばＹを含有するように操作され、他方の鎖が相補ポケット(すなわち、ホール)を含有するように操作されている。KiH変異の適切な位置は当該分野において公知である。追加的又は代替的に、Fcyレセプターへの結合を消失させるか若しくは低減させ、及び/又はFcRnへの結合を増大させ、及び/又はFabアーム交換を防止し、又はプロテアーゼ部位を除去する変異が導入されていてもよい。
PK改変成分はまた、アルブミン結合性ドメイン(これもまた、半減期を延長するように作用し得る)であり得る。当該分野において公知であるように、アルブミンは、(腎閾値を超える)そのサイズに一部起因し、その特異的相互作用及びFcRnを介するリサイクリングにより、19日の長い循環半減期を有する。アルブミンへの付着は、インビボで治療分子の循環半減期を向上させる周知のストラテジである。アルブミンは、特異的アルブミン結合性ドメインの使用により非共有結合的に、又は接合若しくは直接遺伝子融合により共有結合的に付着されてもよい。半減期を向上させるために、アルブミンへの付着が利用されている治療分子の例は、Sleepら，Biochim Biophys Acta. 2013 Dec;1830(12):5526-34に見出される。
アルブミン結合性ドメインは、アルブミンに結合することができる任意の部分(任意の既知のアルブミン結合性部分を含む)であり得る。アルブミン結合性ドメインは、アルブミンに特異的に結合する内因性又は外因性リガンド、小さな有機分子、脂肪酸、ペプチド及びタンパク質から選択され得る。好適なアルブミン結合性ドメインの例としては、短いペプチド、例えばDennisら，J Biol Chem. 2002 Sep 20;277(38):35035-43に記載のもの(例えば、ペプチドQRLMEDICLPRWGCLWEDDF)；アルブミンに結合するよう操作されたタンパク質、例えば抗体、抗体フラグメント及び抗体様足場、例えばGSKが販売するAlbudab(登録商標)(O'Connor-Semmesら，Clin Pharmacol Ther. 2014 Dec;96(6):704-12)及びAblynxが販売するナノボディ(登録商標)(Van Royら，Arthritis Res Ther. 2015 May 20;17:135)；及び天然に見出されるアルブミン結合性ドメインをベースにするタンパク質、例えばStreptococcalタンパク質であるＧタンパク質(Storkら，Eng Des Sel. 2007 Nov;20(11):569-76)、例えばAffibodyが販売するAlbumod(登録商標)が挙げられる。好ましくは、アルブミンはヒト血清アルブミン(HSA)である。アルブミン結合性ドメインのヒトアルブミンに関する親和性は、ピコモル～マイクロモルの範囲内であり得る。ヒト血清におけるアルブミンの極端に高い濃度(35～50mg/ml、約0.6mM)を考慮すれば、アルブミン結合性ドメインの実質的に全てがインビボでアルブミンに結合すると計算される。
アルブミン結合性部分は、その他のドメイン(すなわち、TCR可変ドメイン又は免疫エフェクター)のＣ又はＮ末端に、任意の適切な順序又は形態で連結されていてもよい。アルブミン結合性部分は、その他のドメイン(すなわち、TCR可変ドメイン又は免疫エフェクター)にリンカーを介して連結されていてもよい。リンカー配列は、通常、可撓性を限定する虞れがある嵩高い側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及びセリンから主に作られている点で、可撓性である。或いは、より大きい剛性を有するリンカーが望ましくあり得る。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は、約12アミノ酸長以下、例えば10アミノ酸長以下又は２～10アミノ酸長である。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸長であり得る。本発明の複数ドメイン結合性分子に用い得る適切なリンカーの例として、GGGGS(配列番号29)、GGGSG(配列番号30)、GGSGG(配列番号31)、GSGGG(配列番号32)、GSGGGP(配列番号33)、GGEPS(配列番号34)、GGEGGGP(配列番号35)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号36)(WO2010/133828に記載)並びにGGGSGGGG(配列番号37)が挙げられるが、これらに限定されない。追加のリンカーは、次の配列モチーフ：GGGS(配列番号38)、GGGGS(配列番号39)、TVLRT(配列番号40)、TVSSAS(配列番号41)及びTVLSSAS(配列番号42)の１又は２以上を有する配列を含み得る。アルブミン結合部位は、TCRに連結される場合、α又はβ鎖のいずれかに、リンカー有り又は無しで連結され得る。
診断目的の検出可能な標識には、例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素、核酸プローブ及び造影剤が含まれる。
幾つかの目的のために、本発明の特異的結合性分子は、幾つかの特異的結合性分子を含んでなる複合体に凝集して、多価複合体を形成していてもよい。多価複合体の製造に使用し得る多量体化ドメインを含むヒトタンパク質が存在する。例えば、p53の四量体化ドメインは、単量体scFvフラグメントと比較して増大した血清残留性及び顕著に低減した解離速度を示す四量体のscFv抗体フラグメントを作製するために利用されている(Willudaら(2001) J. Biol. Chem. 276(17) 14385-14392)。ヘモグロビンもまた、この種の適用に使用することができる四量体化ドメインを有する。本発明の多価複合体は、非多量体複合体と比較して、前記複合体に関する結合能力が増強されていてもよい。よって、多価複合体もまた本発明に含まれる。このような多価複合体は、インビトロ又はインビボにおける、特定の抗原を提示する細胞の追跡又は標的化に特に有用である。
本発明の特異的結合性分子と組み合わされ得る治療薬剤としては、免疫モジュレーター及びエフェクター、放射性化合物、酵素(例えば、パーフォリン)又は化学療法剤(例えば、シスプラチン)が挙げられる。毒性効果が確実に所望の位置で発揮されるために、毒物は、緩徐に放出されるように特異的結合性分子に連結されたリポソームの内部に存在し得る。このことにより、体内輸送の間の損傷効果が防止され、該当する抗原提示細胞への特異的結合性分子の結合後に、毒物が最大効果を有することが保証される。
幾つかの目的のために、本発明の特異的結合性分子は、幾つかの特異的結合性分子を含んでなる複合体に凝集して、多価複合体を形成していてもよい。多価複合体の製造に使用し得る多量体化ドメインを含むヒトタンパク質が存在する。例えば、p53の四量体化ドメインは、単量体scFvフラグメントと比較して増大した血清残留性及び顕著に低減した解離速度を示す四量体のscFv抗体フラグメントを作製するために利用されている(Willudaら(2001) J. Biol. Chem. 276(17) 14385-14392)。ヘモグロビンもまた、この種の適用に使用することができる四量体化ドメインを有する。本発明の多価複合体は、非多量体複合体と比較して、前記複合体に関する結合能力が増強されていてもよい。よって、多価複合体もまた本発明に含まれる。このような多価複合体は、インビトロ又はインビボにおける、特定の抗原を提示する細胞の追跡又は標的化に特に有用である。
本発明の特異的結合性分子と組み合わされ得る治療薬剤としては、免疫モジュレーター及びエフェクター、放射性化合物、酵素(例えば、パーフォリン)又は化学療法剤(例えば、シスプラチン)が挙げられる。毒性効果が確実に所望の位置で発揮されるために、毒物は、緩徐に放出されるように特異的結合性分子に連結されたリポソームの内部に存在し得る。このことにより、体内輸送の間の損傷効果が防止され、該当する抗原提示細胞への特異的結合性分子の結合後に、毒物が最大効果を有することが保証される。
適切な治療薬剤の例として、次のものが挙げられるがそれらに限定されない：
・ 小分子細胞傷害性物質、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有する分子量700ダルトン未満の化合物。このような化合物はまた、細胞傷害性効果を有することができる毒性金属を含有し得る。さらに、これら小分子細胞傷害性物質にはまた、プロドラッグ、すなわち、生理学的条件下で崩壊又は変換して細胞傷害性物質を放出する化合物が含まれると理解される。このような物質の例として、シスプラチン、メイタンシン(maytansine)誘導体、ラケルマイシン(rachelmycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリンII(sorfimer sodiumphotofrin II)、テモゾロマイド(temozolmide)、トポテカン、トリメトレキサート(trimetreate)、アルブーレート(arbourlate)、オーリスタチンＥ(auristatin E)、ビンクリスチン及びドキソルビシンが挙げられる；
・ ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有するタンパク質又はそのフラグメント。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、DNAアーゼ及びRNAアーゼ；
・ 小分子細胞傷害性物質、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有する分子量700ダルトン未満の化合物。このような化合物はまた、細胞傷害性効果を有することができる毒性金属を含有し得る。さらに、これら小分子細胞傷害性物質にはまた、プロドラッグ、すなわち、生理学的条件下で崩壊又は変換して細胞傷害性物質を放出する化合物が含まれると理解される。このような物質の例として、シスプラチン、メイタンシン(maytansine)誘導体、ラケルマイシン(rachelmycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリンII(sorfimer sodiumphotofrin II)、テモゾロマイド(temozolmide)、トポテカン、トリメトレキサート(trimetreate)、アルブーレート(arbourlate)、オーリスタチンＥ(auristatin E)、ビンクリスチン及びドキソルビシンが挙げられる；
・ ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有するタンパク質又はそのフラグメント。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、DNAアーゼ及びRNAアーゼ；
・ 放射性核種、すなわち、１又は２以上のα粒子若しくはβ粒子又はγ線の同時放射を伴って崩壊する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素131、レニウム186、インジウム111、イットリウム90、ビスマス210及び213、アクチニウム225及びアスタチン213；高親和性TCR又はその多量体へのこれら放射性核種の結合を容易にするために、キレート化剤が使用されてもよい；
・ 免疫刺激物質、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、サイトカイン(例えばIL-2及びIFN-γ)、
・ スーパー抗原及びその変異体；
・ TCR-HLA融合体、例えば、ペプチドが一般的なヒト病原体、例えばエプスタインバーウイルス(EBV)に由来するペプチド－HLA複合体との融合体；
・ ケモカイン、例えばIL-8、血小板第４因子、メラノーマ増殖刺激タンパク質など；
・ 抗体又はそのフラグメント。抗Ｔ細胞又はNK細胞決定基抗体(例えば、抗CD3、抗CD28又は抗CD16)が挙げられる；
・ 抗体様結合性を有するオルターナティブタンパク質足場
・ 補体活性化物質；
・ 異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性ペプチド。
・ 免疫刺激物質、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、サイトカイン(例えばIL-2及びIFN-γ)、
・ スーパー抗原及びその変異体；
・ TCR-HLA融合体、例えば、ペプチドが一般的なヒト病原体、例えばエプスタインバーウイルス(EBV)に由来するペプチド－HLA複合体との融合体；
・ ケモカイン、例えばIL-8、血小板第４因子、メラノーマ増殖刺激タンパク質など；
・ 抗体又はそのフラグメント。抗Ｔ細胞又はNK細胞決定基抗体(例えば、抗CD3、抗CD28又は抗CD16)が挙げられる；
・ 抗体様結合性を有するオルターナティブタンパク質足場
・ 補体活性化物質；
・ 異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性ペプチド。
１つの好適な観点において、特異的結合性分子は免疫エフェクターを含んでなる(通常、該特異的結合性分子のα鎖若しくはβ鎖又は両方のＮ末端又はＣ末端への、任意の適切な形態での免疫エフェクターとの融合による)。特に好適な免疫エフェクターは、抗CD3抗体又は該抗CD3抗体の機能的フラグメント若しくはバリアントである。本明細書で用いる場合、用語「抗体」は前記のようなフラグメント及びバリアントを包含する。抗CD3抗体の例としては、OKT3、UCHT-1、BMA-031及び12F6が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の組成物及び方法における使用に適切な抗体フラグメント及びバリアント/アナログとしては、数例挙げるとすれば、ミニボディ、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、dsFv及びscFvフラグメント、ナノボディTM(Ablynx(ベルギー)から市販され、ラクダ科動物(例えば、ラクダ又はラマ)抗体に由来する合成の単鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含む構築物)及びドメイン抗体(Domantis(ベルギー)；これは、親和性成熟単鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメイン又は免疫グロブリン可変軽鎖ドメインを含む)又は抗体様結合性を示す代替のタンパク質足場、例えばアフィボディ(Affibody(スウェーデン)；工学的に操作されたプロテインＡ足場を含む)若しくはアンチカリン(Anticalins)(Pieris(ドイツ))；工学的に操作されたアンチカリンを含む)が挙げられる。好適な実施形態において、抗CD3は、配列番号12～14に相当するscFvフラグメントである。
別の１つの好適な形式において、特異的結合性分子の可変ドメイン及び免疫エフェクタードメインは、二量体化が導かれるように、別々のポリペプチド鎖上で互い違いに配置されてもよい。このような形式はWO2019012138に記載されている。簡潔には、第１のポリペプチド鎖は、(Ｎ末端からＣ末端へ)第１の抗体可変ドメイン、続いてTCR可変ドメイン、必要に応じて、続くFcドメインを含み得る。第２の鎖は、(Ｎ末端からＣ末端へ)TCR可変ドメイン、続いて第２の抗体可変ドメイン、必要に応じて、続くFcドメインを含み得る。適切な長さのリンカーがあれば、これら鎖は二量体化して、必要に応じてFcドメインを含む多重特異性分子を形成する。このように複数のドメインが異なる鎖に位置する分子は、ダイアボディとも呼ばれ得、これもまた本明細書中で企図されている。追加の鎖及びドメインが付加されて、例えばトリアボディが形成されてもよい。
したがって、本明細書には、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含んでなる分子からなる群より選択される特異的結合性分子であって、
第１のポリペプチド鎖は、
ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の可変ドメインの第１の結合領域(VD1)と、
MHC結合ペプチドエピトープに特異的に結合するTCRの可変ドメインの第１の結合領域(VR1)と、
前記両ドメインを接続する第１のリンカー(LINK1)と
を含んでなり、
第２のポリペプチド鎖は、
MHC結合ペプチドエピトープに特異的に結合するTCRの可変ドメインの第２の結合領域(VR2)と、
ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の可変ドメインの第２の結合領域(VD2)と、
前記両ドメインを接続する第２のリンカー(LINK2)と
を含んでなり、
ここで、
第１の結合領域(VD1)及び第２の結合領域(VD2)は会合して、ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に結合する第１の結合性部位(VD1)(VD2)を形成し、
第１の結合領域(VR1)及び第２の結合領域(VR2)は会合して、MHC結合ペプチドエピトープに結合する第２の結合性部位(VR1)(VR2)を形成し、
ここで、
前記２つのポリペプチド鎖は、ヒトIgGヒンジドメイン及び/又はヒトIgG Fcドメイン若しくはその二量体化部分と融合されおり、
前記２つのポリペプチド鎖は、前記ヒンジドメイン及び/又はFcドメイン間の共有及び/又は非共有結合により接続されており、
前記二重特異性ポリペプチド分子は、前記細胞表面分子及び前記MHC結合ペプチドエピトープに同時に結合することができ、２つのポリペプチド鎖中の結合性領域の順序がVD1-VR1及びVR2-VD2、又はVD1-VR2及びVR1-VD2、又はVD2-VR1及びVR2-VD1、又はVD2-VR2及びVR1-VD1から選択され、ドメイン間はLINK1又はLINK2のいずれかにより接続され、MHC結合ペプチドエピトープはKVLEYVIKVであり、MHCはHLA-A*02である
特異的結合性分子もまた提供される。
第１のポリペプチド鎖は、
ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の可変ドメインの第１の結合領域(VD1)と、
MHC結合ペプチドエピトープに特異的に結合するTCRの可変ドメインの第１の結合領域(VR1)と、
前記両ドメインを接続する第１のリンカー(LINK1)と
を含んでなり、
第２のポリペプチド鎖は、
MHC結合ペプチドエピトープに特異的に結合するTCRの可変ドメインの第２の結合領域(VR2)と、
ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の可変ドメインの第２の結合領域(VD2)と、
前記両ドメインを接続する第２のリンカー(LINK2)と
を含んでなり、
ここで、
第１の結合領域(VD1)及び第２の結合領域(VD2)は会合して、ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に結合する第１の結合性部位(VD1)(VD2)を形成し、
第１の結合領域(VR1)及び第２の結合領域(VR2)は会合して、MHC結合ペプチドエピトープに結合する第２の結合性部位(VR1)(VR2)を形成し、
ここで、
前記２つのポリペプチド鎖は、ヒトIgGヒンジドメイン及び/又はヒトIgG Fcドメイン若しくはその二量体化部分と融合されおり、
前記２つのポリペプチド鎖は、前記ヒンジドメイン及び/又はFcドメイン間の共有及び/又は非共有結合により接続されており、
前記二重特異性ポリペプチド分子は、前記細胞表面分子及び前記MHC結合ペプチドエピトープに同時に結合することができ、２つのポリペプチド鎖中の結合性領域の順序がVD1-VR1及びVR2-VD2、又はVD1-VR2及びVR1-VD2、又はVD2-VR1及びVR2-VD1、又はVD2-VR2及びVR1-VD1から選択され、ドメイン間はLINK1又はLINK2のいずれかにより接続され、MHC結合ペプチドエピトープはKVLEYVIKVであり、MHCはHLA-A*02である
特異的結合性分子もまた提供される。
TCRと抗CD3抗体との連結は、共有結合によってもよいし、非共有結合によってもよい。共有結合は直接であってもよいし、リンカー配列を介する間接的であってもよい。リンカー配列は、通常、可撓性を限定する虞れがある嵩高い側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及びセリンから主に作られている点で、可撓性である。或いは、より大きい剛性を有するリンカーが望ましくあり得る。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は、約12アミノ酸長以下、例えば10アミノ酸長以下又は２～10アミノ酸長である。本発明のTCRに用い得る適切なリンカーの例として、GGGGS(配列番号29)、GGGSG(配列番号30)、GGSGG(配列番号31)、GSGGG(配列番号32)、GSGGGP(配列番号33)、GGEPS(配列番号34)、GGEGGGP(配列番号35)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号36)(WO2010/133828に記載)並びにGGGSGGGG(配列番号37)が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の好適な特異的結合性分子－抗CD3融合構築物には、α鎖可変ドメインが配列番号４～６のいずれかのアミノ酸配列若しくは該配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、及び/又はβ鎖可変ドメインが配列番号７～９のいずれかのアミノ酸配列若しくは該配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む構築物が含まれる。前記α鎖及びβ鎖は、非天然型ジスルフィド結合を含むα及びβ細胞外定常領域を更に含んでいてもよい。α鎖の定常ドメインは、８アミノ酸までが欠失(短縮化)されていてもよい。α及びβ細胞外定常領域は、それぞれ配列番号10及び11により提供され得る。配列番号12～14から選択される抗CD3 scFv抗体フラグメントは、(配列番号29～32から選択され得る)リンカーを介してβ鎖のＮ末端に融合されていてもよい。
本発明の抗CD3－TCR融合構築物の特に好適な配列は、以下：
α可変ドメイン配列番号４及び定常ドメイン配列番号10と、
β可変ドメイン配列番号８及び定常ドメイン配列番号11と、
β鎖のＮ末端に、配列番号29のリンカーを介して融合した配列番号12の抗CD3 scFv抗体フラグメント、
又は
α可変ドメイン配列番号４及び定常ドメイン配列番号10と、
β可変ドメイン配列番号８及び定常ドメイン配列番号11と、
β鎖のＮ末端に、配列番号29のリンカーを介して融合した配列番号14の抗CD3 scFv抗体フラグメント
により提供される。
α可変ドメイン配列番号４及び定常ドメイン配列番号10と、
β可変ドメイン配列番号８及び定常ドメイン配列番号11と、
β鎖のＮ末端に、配列番号29のリンカーを介して融合した配列番号12の抗CD3 scFv抗体フラグメント、
又は
α可変ドメイン配列番号４及び定常ドメイン配列番号10と、
β可変ドメイン配列番号８及び定常ドメイン配列番号11と、
β鎖のＮ末端に、配列番号29のリンカーを介して融合した配列番号14の抗CD3 scFv抗体フラグメント
により提供される。
前記抗CD3－TCR融合構築物の機能的バリアントもまた、本発明の範囲に含まれる。機能的バリアントは、好ましくは、上記配列に対して、少なくとも90％の同一性、例えば少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％の同一性を有するが、機能的に等価である。
１つの更なる観点では、本発明は、本発明の特異的結合性分子又は特異的結合性分子－抗CD3融合体のα鎖及び/又はβ鎖をコードする核酸を提供する。幾つかの実施形態では、核酸はcDNAである。幾つかの実施形態では、核酸はmRNAであり得る。幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の特異的結合性分子のα鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の特異的結合性分子のβ鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。核酸は、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は操作されたものであり得る。核酸配列は、用いる発現系に応じてコドン最適化されていてもよい。当業者に公知であるように、発現系は、細菌細胞、例えばE. coli又は酵母細胞又は哺乳動物細胞又は昆虫細胞を含み得、或いは、発現系は細胞フリー発現系であり得る。
別の１つの観点では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、ベクターはTCR発現ベクターである。適切なTCR発現ベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクター、より好ましくはレンチウイルスベクターを含む。更なる詳細は、Zhang(2012)及びその引用文献中に見出すことができる(Zhangら，Adv Drug Deliv Rev. 2012 Jun 1；64(8)：756-762)。
本発明はまた、本発明のベクター、好ましくはTCR発現ベクターを有する細胞を提供する。適切な細胞として、哺乳動物細胞、好ましくは免疫細胞、尚より好ましくはＴ細胞が挙げられる。ベクターは、α鎖及びβ鎖を単一オープンリーディングフレームにコードするか、又は２つの別個のオープンリーディングフレームにそれぞれをコードする本発明の核酸を含んでなってもよい。別の１つの観点は、本発明の特異的結合性分子のα鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター及び本発明の特異的結合性分子のβ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクターを有する細胞を提供する。この細胞は養子療法に特に有用である。本発明の細胞は、単離され及び/又は組み換えられ及び/又は天然に存在しない及び/又は工学的に操作されていてもよい。
本発明の特異的結合性分子は養子療法に有用であるので、本発明は、本発明の特異的結合性分子を提示する、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は工学的に操作された細胞、特にＴ細胞を包含する。本発明はまた、本発明の特異的結合性分子(例えばTCR)を提示するＴ細胞の拡大された集団を提供する。本発明の特異的結合性分子をコードする核酸(例えば、DNA、cDNA又はRNA)でのＴ細胞のトランスフェクションに適切な幾つかの方法が存在する(例えば、Robbinsら(2008) J Immunol. 180:6116-6131を参照)。本発明の特異的結合性分子を発現するＴ細胞は、養子療法ベースのガン治療における使用に適切である。当業者に公知であるように、養子療法の実施を可能にする適切な幾つかの方法が存在する(例えば、Rosenbergら(2008)，Nat Rev Cancer 8(4):299-308を参照)。
当該分野において周知であるように、TCRは翻訳後修飾に付されていてもよい。グリコシル化はそのような修飾の１つであり、TCR鎖中の規定されたアミノ酸へのオリゴ糖部分の共有結合的付加を含む。例えば、アスパラギン残基又はセリン/スレオニン残基は、周知のオリゴ糖付加位置である。特定のタンパク質のグリコシル化状況は、タンパク質配列、タンパク質コンホメーション及び特定の酵素の利用可能性を含む幾つかの因子に依存する。更に、グリコシル化状況(すなわち、オリゴ糖タイプ、共有結合及び付加の総数)は、タンパク質の機能に影響することがある。したがって、組換えタンパク質を製造するときには、グリコシル化の制御が望ましい場合が多い。制御されたグリコシル化は、抗体ベースの治療薬を改善するために用いられている(Jefferisら(2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226-34)。本発明の可溶性特異的結合性分子について、グリコシル化は、例えば特定の細胞株(哺乳動物細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はヒト胎児腎(HEK)細胞を含むが、これらに限定されない)を用いることにより、又は化学的修飾により制御されてもよい。このような修飾は、グリコシル化が薬物動態を改善し、免疫原性を低減させ及び天然型ヒトタンパク質をより厳密に模擬することができるので、望ましくあり得る(Sinclair及びElliott(2005)，Pharm Sci.Aug; 94(8):1626-35)。
患者への投与のために、本発明の特異的結合性分子(好ましくは、検出可能な標識若しくは治療薬剤と結合しているか、又はトランスフェクトされたＴ細胞に発現しているもの)、又は本発明の特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、発現ベクター又は細胞は、滅菌医薬組成物の一部として、１又は２以上の薬学的に許容され得るキャリア又は賦形剤と共に提供されてもよい。この医薬組成物は、(患者への望ましい投与方法に依存して)任意の適切な形態であり得る。医薬組成物は、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封容器内で提供され、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、(必須ではないが)通常、使用指示書を含む。キットは複数の単位剤形を含み得る。
医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば非経口経路(皮下、筋内、髄腔内又は静脈内経路を含む)、経腸(経口又は直腸経路を含む)、吸入又は鼻内経路による投与に適合していてもよい。このような組成物は、薬学分野において公知の任意の方法により、例えば活性成分をキャリア又は賦形剤と滅菌条件下で混合することにより、製造されてもよい。
医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば非経口経路(皮下、筋内、髄腔内又は静脈内経路を含む)、経腸(経口又は直腸経路を含む)、吸入又は鼻内経路による投与に適合していてもよい。このような組成物は、薬学分野において公知の任意の方法により、例えば活性成分をキャリア又は賦形剤と滅菌条件下で混合することにより、製造されてもよい。
本発明の物質の投薬量は、治療すべき疾患又は異常、治療すべき個体の年齢及び状態などに依存して広範に変化し得る。TCR－抗CD3融合分子に適切な用量範囲は、25ng/kg～50μg/kg又は１μg～１gであり得る。医師が、使用すべき適切な投薬量を最終的には決定する。
本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、医薬組成物、ベクター、核酸及び細胞は、実質的に純粋な形態、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％純粋で提供されてもよい。
本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、医薬組成物、ベクター、核酸及び細胞は、実質的に純粋な形態、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％純粋で提供されてもよい。
本発明はまた、次のものを提供する：
・ 医薬における使用のため、好ましくはガン又は腫瘍の治療法における使用のための、本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞；
・ ガン又は腫瘍の治療用医薬の製造における、本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞の使用；
・ 本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞を患者に投与することを含んでなる、患者におけるガン又は腫瘍の治療法；
・ 本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞を含む、ヒト対象に投与するための注射製剤。
・ 医薬における使用のため、好ましくはガン又は腫瘍の治療法における使用のための、本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞；
・ ガン又は腫瘍の治療用医薬の製造における、本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞の使用；
・ 本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞を患者に投与することを含んでなる、患者におけるガン又は腫瘍の治療法；
・ 本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞を含む、ヒト対象に投与するための注射製剤。
ガンは充実(固形)腫瘍又は液性腫瘍であり得る。好ましくは、腫瘍はMAGEA1を発現する。MAGEA1発現腫瘍の例として、肝臓ガン(HCC)；肺ガン(NSCLC及びSCLC)；膀胱ガン、頭頸部ガン、胃ガン、食道ガン、乳ガン、皮膚黒色腫、卵巣ガン、子宮頸ガン、子宮内膜腫及び多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞は、注射により、例えば静脈内、皮下又は直接腫瘍内注射により投与され得る。ヒト対象はHLA-A*02サブタイプであり得る。
治療方法は、追加の抗新生物剤を別々に、組み合わせて、又は逐次に投与することを更に含んでもよい。このような薬剤の例は当技術分野で公知であり、免疫活性化剤及び/又はＴ細胞調節剤を含み得る。
治療方法は、追加の抗新生物剤を別々に、組み合わせて、又は逐次に投与することを更に含んでもよい。このような薬剤の例は当技術分野で公知であり、免疫活性化剤及び/又はＴ細胞調節剤を含み得る。
本発明はまた、本発明の特異的結合性分子又は本発明の特異的結合性分子－抗CD3融合分子を製造する方法であって、a)本発明による細胞を特異的結合性分子鎖の発現に最適な条件下に維持し、b)特異的結合性分子鎖を単離することを含む方法を提供する。
本発明の各々の観点の好適な特徴は、他の観点の各々についても同様である(ただし、必要な変更は加える)。本明細書において言及した先行技術文献は、法が許容する最大範囲まで組み込まれる。
図面の説明
本発明の各々の観点の好適な特徴は、他の観点の各々についても同様である(ただし、必要な変更は加える)。本明細書において言及した先行技術文献は、法が許容する最大範囲まで組み込まれる。
図面の説明
本発明を、下記の非限定的な実施例において更に説明する。
実施例
実施例１－可溶性のTCR及びTCR－抗CD3融合タンパク質の発現、リフォールディング及び精製
方法
可溶性のTCR又はTCR－抗CD3融合タンパク質のα及びβ細胞外領域をコードするDNA配列を、(Sambrookら，Molecular cloning. Vol. 2.(1989) New York:Cold spring harbour laboratory pressに記載のような)標準的な方法を用いて、別々にpGMT7ベースの発現プラスミドにクローニングした。この発現プラスミドを別々にE. coli株Rosetta(BL21pLysS)に形質転換した。発現のために、細胞を、１％グリセロール(＋アンピシリン100μg/ml及び34μg/mlクロラムフェニコール)を補充した自己誘導培地中230rpmで37℃にて２時間、その後温度を30℃に低下させて一晩増殖させた。その後、細胞を遠心分離により採集した。BugBusterタンパク質抽出試薬(Merck Millipore)を製造業者の指示に従って用いて細胞ペレットを溶解させた。封入体ペレットを遠心分離により回収した。ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.1、0.5％ Triton-X100、100mM NaCl、10mM NaEDTA)中で２回洗浄し、最後に界面活性剤フリーの緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM NaEDTA)中に再懸濁した。６Ｍグアニジン-HClで可溶化し、OD280を測定することによって、封入体タンパク質の収量を定量した。次いで、消光係数を用いてタンパク質濃度を算出した。８Ｍ尿素で可溶化し、約２μgを還元条件下の４～20％SDS-PAGEにロードして封入体の純度を測定した。次いで、デンシトメトリーソフトウェア(Chemidoc, Biorad)を用いて純度を推定又は算出した。封入体を、短期保存については＋４℃にて、長期保存については－20℃又は－70℃にて保存した。
実施例１－可溶性のTCR及びTCR－抗CD3融合タンパク質の発現、リフォールディング及び精製
方法
可溶性のTCR又はTCR－抗CD3融合タンパク質のα及びβ細胞外領域をコードするDNA配列を、(Sambrookら，Molecular cloning. Vol. 2.(1989) New York:Cold spring harbour laboratory pressに記載のような)標準的な方法を用いて、別々にpGMT7ベースの発現プラスミドにクローニングした。この発現プラスミドを別々にE. coli株Rosetta(BL21pLysS)に形質転換した。発現のために、細胞を、１％グリセロール(＋アンピシリン100μg/ml及び34μg/mlクロラムフェニコール)を補充した自己誘導培地中230rpmで37℃にて２時間、その後温度を30℃に低下させて一晩増殖させた。その後、細胞を遠心分離により採集した。BugBusterタンパク質抽出試薬(Merck Millipore)を製造業者の指示に従って用いて細胞ペレットを溶解させた。封入体ペレットを遠心分離により回収した。ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.1、0.5％ Triton-X100、100mM NaCl、10mM NaEDTA)中で２回洗浄し、最後に界面活性剤フリーの緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM NaEDTA)中に再懸濁した。６Ｍグアニジン-HClで可溶化し、OD280を測定することによって、封入体タンパク質の収量を定量した。次いで、消光係数を用いてタンパク質濃度を算出した。８Ｍ尿素で可溶化し、約２μgを還元条件下の４～20％SDS-PAGEにロードして封入体の純度を測定した。次いで、デンシトメトリーソフトウェア(Chemidoc, Biorad)を用いて純度を推定又は算出した。封入体を、短期保存については＋４℃にて、長期保存については－20℃又は－70℃にて保存した。
可溶性TCRのリフォールディングについては、α鎖含有封入体及びβ鎖含有封入体を先ず混合し、可溶化/変性緩衝液(６Ｍグアニジン-塩酸、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、20mM DTT)中に希釈し、続いて30分間37℃にてインキュベートした。次いで、リフォールド緩衝液(100mM Tris pH8.1、800又は400mM L-アルギニンHCL、２mM EDTA、４Ｍ尿素、6.5mMシステアミン塩酸及び1.9mMシスタミン二塩酸)中に更に希釈し、溶液を十分に混合することによりリフォールディングを開始した。リフォールドした混合物を、１Ｌあたり10ＬのH2Oに対して18～20時間５℃±３℃にて透析した。その後、透析緩衝液を10mM Tris pH8.1(10Ｌ)と２回交換し、透析を更に15時間継続した。次いで、リフォールド混合物を0.45μmセルロースフィルターで濾過した。TCR－抗CD3融合分子の製造は、リフォールディング工程における酸化還元試薬の濃度が１mMシスタミン二塩酸、10mMシステアミン塩酸であったこと以外は、記載したとおりに実施した。
透析したリフォールド物をPOROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラムに適用し、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を用いて６カラム容量にわたり20mM Tris pH8.1中０～500mM NaClのグラジエントで結合タンパク質を溶出させることにより可溶性TCRの精製を開始した。ピークTCR画分をSDS PAGEにより同定した後、プールし、濃縮した。次いで、濃縮サンプルを、ダルベッコPBS緩衝液で予め平衡化させたSuperdex(登録商標)200 Increase 10/300 GLゲル濾過カラム(GE Healthcare)に適用した。ピークTCR画分をプールし、濃縮し、精製物質の最終収量を算出した。TCR－抗CD3融合分子については、カチオン交換工程を、アニオン交換工程後に付加した。この場合、アニオン交換のピーク画分を40mM MES中に20倍希釈し、POROS(登録商標) 50HSカチオン交換カラムに適用した。結合タンパク質を、40mM MES中０～500mM NaClのグラジエントを用いて溶出させた。ピーク画分をプールし、200mM Tris pH8.1に調整後、濃縮し、記載した通りのゲル濾過マトリクスに直接適用した。
実施例２－結合特性決定
ペプチド－HLA複合体に対する精製済み可溶性TCR及びTCR－抗CD3融合分子の結合分析を、BIAcore 8K、BIAcore 3000又はBIAcore T200装置のいずれかを用いる表面プラズモン共鳴により行った。当業者に公知の方法を用いて、ビオチン化クラスＩ HLA-A*02分子を目的のペプチドと共にリフォールドさせて精製した(O'Callaghanら(1999)，Anal Biochem 266(1):9-15；Garbocziら(1992)，Proc Natl Acad Sci USA 89(8):3429-3433)。全ての測定は、0.005％ P20を補充したダルベッコPBS緩衝液中で25℃にて行った。
ペプチド－HLA複合体に対する精製済み可溶性TCR及びTCR－抗CD3融合分子の結合分析を、BIAcore 8K、BIAcore 3000又はBIAcore T200装置のいずれかを用いる表面プラズモン共鳴により行った。当業者に公知の方法を用いて、ビオチン化クラスＩ HLA-A*02分子を目的のペプチドと共にリフォールドさせて精製した(O'Callaghanら(1999)，Anal Biochem 266(1):9-15；Garbocziら(1992)，Proc Natl Acad Sci USA 89(8):3429-3433)。全ての測定は、0.005％ P20を補充したダルベッコPBS緩衝液中で25℃にて行った。
BIAcore法
ビオチン化ペプチド－HLAモノマーをビオチン捕捉センサチップのストレプトアビジン結合CM-5に固定した。平衡結合定数は、約500応答単位(RU)のペプチド－HLA-A*02複合体を被覆したフローセル上に10～30μl/分の定流量で注入した可溶性TCR又は融合分子の系列希釈物を用いて決定した。平衡応答は、各TCR濃度について、ペプチド－HLAを含まないコントロールフローセルでのバルク緩衝液応答を減算して規格化した。KD値は、Prismソフトウェア及びLangmuir結合等温式 結合 = Ｃ×Max/(Ｃ+KD)(式中、「結合」は注入したTCRの濃度Ｃでの平衡結合(RU)であり、Maxは最大結合である)を用いる非線形曲線フィッティングにより得た。
ビオチン化ペプチド－HLAモノマーをビオチン捕捉センサチップのストレプトアビジン結合CM-5に固定した。平衡結合定数は、約500応答単位(RU)のペプチド－HLA-A*02複合体を被覆したフローセル上に10～30μl/分の定流量で注入した可溶性TCR又は融合分子の系列希釈物を用いて決定した。平衡応答は、各TCR濃度について、ペプチド－HLAを含まないコントロールフローセルでのバルク緩衝液応答を減算して規格化した。KD値は、Prismソフトウェア及びLangmuir結合等温式 結合 = Ｃ×Max/(Ｃ+KD)(式中、「結合」は注入したTCRの濃度Ｃでの平衡結合(RU)であり、Maxは最大結合である)を用いる非線形曲線フィッティングにより得た。
高親和性相互作用については、結合パラメータは、単一サイクル速度論分析により決定した。５つの異なる濃度の可溶性TCR又は融合体タンパク質を、約50～200RUのペプチド－HLA複合体を被覆したフローセル上に50～60μl/分の流速で注入した。代表的には、60～200μlの可溶性TCR又は融合分子を２～100nMの最高濃度で注入し、他の４つの注入については２倍系列希釈物を用いた。最低濃度を先ず注入した。解離相を測定するため、≧10％の解離が生じるまで、代表的には１～３時間後まで、緩衝液を注入した。速度論パラメータは製造業者のソフトウェアを用いて算出した。半減期の算出を可能とするため、解離相を一次指数関数的減衰式にフィッティングした。平衡定数KDはkoff/konから算出した。
結果
可溶性WT TCRの結合特性決定
図１に提供されるα及びβ可変ドメインと、図３に提供されるα及びβ細胞外定常ドメインとを含む可溶性WT TCRは、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体に、21.6μM±３μMのKDで結合することが示された(n=2)。
同じ可溶性TCRを、24の無関係ペプチド－HLA-A*02複合体のパネルに対する結合について評価した。無関係pHLAを３群に分割し、３つのフローセルの１つにロードした。可溶性野生型TCRを117及び21.6μMの濃度で全てのフローセルに注入した。いずれの濃度でも有意な結合は検出されなかった。このことは可溶性WT TCRがHLA-A*02複合体に特異的であることを示す。
追加の特異性評価を、KVLEYVIKVペプチドの各残基を逐次にアラニンで置換したペプチドのパネルを用いて行った。アラニン置換ペプチドの各々に対する相対的結合を決定した。ペプチドの中央部分でのアラニン置換はTCR結合の喪失をもたらすことが示された(E4位、Y5位、V6位)。これらデータは、TCRが治療用薬剤の開発に特に適していることを示す。
可溶性WT TCRの結合特性決定
図１に提供されるα及びβ可変ドメインと、図３に提供されるα及びβ細胞外定常ドメインとを含む可溶性WT TCRは、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体に、21.6μM±３μMのKDで結合することが示された(n=2)。
同じ可溶性TCRを、24の無関係ペプチド－HLA-A*02複合体のパネルに対する結合について評価した。無関係pHLAを３群に分割し、３つのフローセルの１つにロードした。可溶性野生型TCRを117及び21.6μMの濃度で全てのフローセルに注入した。いずれの濃度でも有意な結合は検出されなかった。このことは可溶性WT TCRがHLA-A*02複合体に特異的であることを示す。
追加の特異性評価を、KVLEYVIKVペプチドの各残基を逐次にアラニンで置換したペプチドのパネルを用いて行った。アラニン置換ペプチドの各々に対する相対的結合を決定した。ペプチドの中央部分でのアラニン置換はTCR結合の喪失をもたらすことが示された(E4位、Y5位、V6位)。これらデータは、TCRが治療用薬剤の開発に特に適していることを示す。
TCR－抗CD3融合タンパク質の結合特性決定
図２に提供する変異可変ドメインと、図３に提供する細胞外定常ドメインと、図４に提供する抗CD3 scFv配列とを含むTCR－抗CD3融合タンパク質を製造した。この例では、抗CD3を、各場合で、β可変ドメインのＮ末端に融合させた。KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体に対する種々の融合体の結合パラメータを下表に示す。
図２に提供する変異可変ドメインと、図３に提供する細胞外定常ドメインと、図４に提供する抗CD3 scFv配列とを含むTCR－抗CD3融合タンパク質を製造した。この例では、抗CD3を、各場合で、β可変ドメインのＮ末端に融合させた。KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体に対する種々の融合体の結合パラメータを下表に示す。
実施例３－抗原陽性標的細胞に対する強力で特異的なＴ細胞活性化
Ｔ細胞活性化
TCR－抗CD3融合タンパク質を、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体を提示する細胞に対してCD3+ Ｔ細胞の強力で特異的な活性化を媒介する能力について評価した。インターフェロン-γ(IFN-γ)放出をＴ細胞活性化の読取値として用いた。
Ｔ細胞活性化
TCR－抗CD3融合タンパク質を、KVLEYVIKV－HLA-A*02複合体を提示する細胞に対してCD3+ Ｔ細胞の強力で特異的な活性化を媒介する能力について評価した。インターフェロン-γ(IFN-γ)放出をＴ細胞活性化の読取値として用いた。
方法
ヒトIFN-γ ELISPOTキット(BD Biosciences)を製造業者の指示に従って用いてアッセイを行った。簡潔には、ELISpotプレートを、IFNγ抗体で１～７日前にコートした。アッセイ当日、ELISPOTプレートを100ulのアッセイ培地(R10)でブロックした。ブロックの除去後、標的細胞を50ul中で50,000/ウェルにてプレートした。融合タンパク質を滴定して、５、１、0.5、0.3、0.2、0.1、0.05、0.03、0.02、0.01nMの最終濃度(予期される臨床的に妥当な範囲にわたる濃度)として、ウェルに50μlの体積で加えた。エフェクター(PBMC)を液体窒素から解凍して計数し、50ul中に20～80,000細胞/ウェルでプレートした(各実験に用いる正確な細胞数は、ドナー依存性であり、当該アッセイに適切な範囲内の応答を生じるように調整され得る)。各ウェルの最終体積をR10で200ulにした。プレート/細胞を一晩培養し、翌日にプレートを発色させ、室温で少なくとも２時間乾燥させた後、Immunospotソフトウェア(Cellular Technology Limited)を備えるCTL分析装置を用いてスポットを計数した。PRISMを用いて応答曲線をプロットし、Ec50値を算出した。
本実施例では、次のヒトガン細胞株を標的細胞として用いた：
・ NCI-H1703(抗原陽性)肺
・ NCI-H2023(抗原陽性)肺
・ U-2-OS(抗原陽性)骨
・ Mel624(抗原陰性)メラノーマ
ヒトIFN-γ ELISPOTキット(BD Biosciences)を製造業者の指示に従って用いてアッセイを行った。簡潔には、ELISpotプレートを、IFNγ抗体で１～７日前にコートした。アッセイ当日、ELISPOTプレートを100ulのアッセイ培地(R10)でブロックした。ブロックの除去後、標的細胞を50ul中で50,000/ウェルにてプレートした。融合タンパク質を滴定して、５、１、0.5、0.3、0.2、0.1、0.05、0.03、0.02、0.01nMの最終濃度(予期される臨床的に妥当な範囲にわたる濃度)として、ウェルに50μlの体積で加えた。エフェクター(PBMC)を液体窒素から解凍して計数し、50ul中に20～80,000細胞/ウェルでプレートした(各実験に用いる正確な細胞数は、ドナー依存性であり、当該アッセイに適切な範囲内の応答を生じるように調整され得る)。各ウェルの最終体積をR10で200ulにした。プレート/細胞を一晩培養し、翌日にプレートを発色させ、室温で少なくとも２時間乾燥させた後、Immunospotソフトウェア(Cellular Technology Limited)を備えるCTL分析装置を用いてスポットを計数した。PRISMを用いて応答曲線をプロットし、Ec50値を算出した。
本実施例では、次のヒトガン細胞株を標的細胞として用いた：
・ NCI-H1703(抗原陽性)肺
・ NCI-H2023(抗原陽性)肺
・ U-2-OS(抗原陽性)骨
・ Mel624(抗原陰性)メラノーマ
結果
図５は、本発明のTCR－抗CD3融合タンパク質を用いて作成した応答曲線を示す。各場合において、Ec50値は、抗原陽性細胞に対して、低pM領域(＜200pM)であった。治療上妥当な範囲(≦１nM)内で、抗原陰性細胞に対して、最小限の活性化しか観察されず、オンターゲット刺激とオフターゲット刺激との間に幅広い安全性の窓がもたらされた。
図５は、本発明のTCR－抗CD3融合タンパク質を用いて作成した応答曲線を示す。各場合において、Ec50値は、抗原陽性細胞に対して、低pM領域(＜200pM)であった。治療上妥当な範囲(≦１nM)内で、抗原陰性細胞に対して、最小限の活性化しか観察されず、オンターゲット刺激とオフターゲット刺激との間に幅広い安全性の窓がもたらされた。
正常組織の最小限の認識
TCR－抗CD3融合タンパク質の特異性を更に証明するため、健常ヒト組織由来の正常細胞のパネルを標的として、上記と同じELISPOT法を用いて更なる試験を実施した。ガン細胞株NCI-H1703及びNCI-H2087をそれぞれ抗原陽性コントロール及び抗原陰性コントロールとして用いた。融合タンパク質を滴定して、２、１、0.5及び0.2nMの最終濃度を得た。
結果
図６は、本発明のTCR－抗CD3融合タンパク質が、治療上妥当な範囲(≦１nM)内で、２つの異なる組織由来の正常細胞に対して、最小限のＴ細胞活性化しか生じないことを示す。
TCR－抗CD3融合タンパク質の特異性を更に証明するため、健常ヒト組織由来の正常細胞のパネルを標的として、上記と同じELISPOT法を用いて更なる試験を実施した。ガン細胞株NCI-H1703及びNCI-H2087をそれぞれ抗原陽性コントロール及び抗原陰性コントロールとして用いた。融合タンパク質を滴定して、２、１、0.5及び0.2nMの最終濃度を得た。
結果
図６は、本発明のTCR－抗CD3融合タンパク質が、治療上妥当な範囲(≦１nM)内で、２つの異なる組織由来の正常細胞に対して、最小限のＴ細胞活性化しか生じないことを示す。
実施例４－腫瘍細胞の強力な殺傷
TCR－抗CD3融合分子が抗原陽性腫瘍細胞の強力なＴ細胞媒介殺傷を媒介する能力を、xCELLigenceアッセイ(Acea Biosciences)を製造者の指示に従って用いて調べた。簡潔には、50μlのR10をxCELLigence E-プレートの全てのウェルに加え、１時間程度放置して平衡化させ、バックグラウンドを読み取った。標的細胞を計数し、500pM～５nMの最終濃度にて50μl中にプレートした。プレートを30分間放置して平衡化させた後、インキュベーター内に配置した。掃引(sweeps)は30分ごとに設定した。エフェクター(PBMC)を採取し、フラスコ内で37℃にて一晩放置して単球を取り出した。翌日、ペプチドを添加するウェルから50μlのR10を除去した。50μlのImmTAC(4倍希釈)と50μlのエフェクターを、5：1のE：T比となるように添加した。50μlのペプチド(４倍希釈)を、10μMのペプチド最終濃度及び１nMのImmTACが得られるように添加した。各ウェル中の体積をR10で200ulにして、掃引を２時間ごとの198時間に設定した(100掃引)。細胞溶解率を各濃度にて24時間後及び48時間後に算出し、PRISMで応答曲線をプロットした。
結果
図７は、本発明のTCR－抗CD3融合タンパク質を用いて作成した応答曲線を示す。各場合において、Ec50値は各時点で低pM領域(＜50pM)であり、抗原陽性ガン細胞の強力な殺傷が証明された。
TCR－抗CD3融合分子が抗原陽性腫瘍細胞の強力なＴ細胞媒介殺傷を媒介する能力を、xCELLigenceアッセイ(Acea Biosciences)を製造者の指示に従って用いて調べた。簡潔には、50μlのR10をxCELLigence E-プレートの全てのウェルに加え、１時間程度放置して平衡化させ、バックグラウンドを読み取った。標的細胞を計数し、500pM～５nMの最終濃度にて50μl中にプレートした。プレートを30分間放置して平衡化させた後、インキュベーター内に配置した。掃引(sweeps)は30分ごとに設定した。エフェクター(PBMC)を採取し、フラスコ内で37℃にて一晩放置して単球を取り出した。翌日、ペプチドを添加するウェルから50μlのR10を除去した。50μlのImmTAC(4倍希釈)と50μlのエフェクターを、5：1のE：T比となるように添加した。50μlのペプチド(４倍希釈)を、10μMのペプチド最終濃度及び１nMのImmTACが得られるように添加した。各ウェル中の体積をR10で200ulにして、掃引を２時間ごとの198時間に設定した(100掃引)。細胞溶解率を各濃度にて24時間後及び48時間後に算出し、PRISMで応答曲線をプロットした。
結果
図７は、本発明のTCR－抗CD3融合タンパク質を用いて作成した応答曲線を示す。各場合において、Ec50値は各時点で低pM領域(＜50pM)であり、抗原陽性ガン細胞の強力な殺傷が証明された。
Claims (27)
- KVLEYVIKV(配列番号１)－HLA-A*02複合体及び/又はKVLEYVIKV(配列番号17)－HLA-A*02複合体に対する結合性を有し、各々がFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(FRはフレームワーク領域であり、CDRは相補性決定領域である)を含むTCR α鎖可変ドメイン及び/又はTCR β鎖可変ドメインを含んでなる特異的結合性分子であって、
(a)α鎖CDRは次の配列：
CDR1 - 配列SSVPPY(配列番号15)、又はSSVPPY(配列番号15)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR2 - 配列YTSAATLV(配列番号16)、又はYTSAATLV(配列番号16)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR3 - 配列AARPSSSNTGKLI(配列番号17)、又はAARPSSSNTGKLI(配列番号17)において１若しくは２以上の変異を有する配列
を有し、及び/又は
(b)β鎖CDRは次の配列：
CDR1 - 配列PRHDT(配列番号18)、又はPRHDT(配列番号18)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR2 - 配列FYEKMQ(配列番号19)、又はFYEKMQ(配列番号19)において１若しくは２以上の変異を有する配列
CDR3 - 配列ASSFTGFDEQF(配列番号20)、又はASSFTGFDEQF(配列番号20)において１若しくは２以上の変異を有する配列
を有する、特異的結合性分子。 - α鎖可変ドメインフレームワーク領域は次の配列：
FR1 - 配列番号２のアミノ酸１～26
FR2 - 配列番号２のアミノ酸33～49
FR3 - 配列番号２のアミノ酸58～91
FR4 - 配列番号２のアミノ酸105～115
又は、前記配列のそれぞれに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含み、及び/又は
β鎖可変ドメインフレームワーク領域は次の配列：
FR1 - 配列番号３のアミノ酸１～26
FR2 - 配列番号３のアミノ酸32～48
FR3 - 配列番号３のアミノ酸55～91
FR4 - 配列番号３のアミノ酸103～112
又は、前記配列のそれぞれに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の同一性を有する配列を含む、
請求項１に記載の特異的結合性分子。 - α鎖CDR中の変異の１又は２以上が、下記(配列番号２の番号付けを参照して)：
・ 26位の後に４アミノ酸(ARWG)の挿入
・ S27D
・ S28G
・ S52G
・ A53G
・ A54D
・ T55L
・ I56V
・ S97D
・ S98A
から選択される、請求項１又は２に記載の特異的結合性分子。 - α鎖CDR1が次の配列：SSVPPY(配列番号15)又はARWGDGVPPY(配列番号21)を含み；
α鎖CDR2が次の配列：YTSAATLV(配列番号16)又はYTGGDLVV(配列番号22)を含み；及び/又は
α鎖CDR3が次の配列：AARPSSSNTGKLI(配列番号17)、AARPSDSNTGKLI(配列番号23)又はAARPSSANTGKLI(配列番号24)を含む、
請求項３に記載の特異的結合性分子。 - β鎖CDR中の変異の１又は２以上が、下記(配列番号３の番号付けを参照して)：
・ Y50F
・ K52T
・ M53K
・ Q54F
・ F95V
・ T96W
・ G97D
・ F98W/Y
から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。 - β鎖CDR1が次の配列：PRHDT(配列番号18)を含み；
β鎖CDR2が次の配列：FYEKMQ(配列番号19)、FFETMF(配列番号25)又はFFETKF(配列番号26)を含み；及び/又は
β鎖CDR3が次の配列：ASSFTGFDEQF(配列番号20)、ASSVWDWDEQF(配列番号27)又はASSVWDYDEQF(配列番号28)を含む、
請求項５に記載の特異的結合性分子。 - 次のαCDR及びβCDRの組合せ：
の１つを有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。 - α鎖可変ドメインが配列番号４～６のアミノ酸配列のいずれか１つ又は該配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、β鎖可変ドメインが配列番号７～９のアミノ酸配列のいずれか１つ又は該配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。
- 下記のα鎖及びβ鎖の可変ドメイン対：
の１つを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。 - α-βヘテロダイマーであり、α鎖TRAC定常ドメイン配列とβ鎖TRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列とを有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。
- α鎖及びβ鎖定常ドメイン配列が、TRACのエクソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエクソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失するように短縮化又は置換により改変されている、請求項１０に記載の特異的結合性分子。
- α鎖及び/又はβ鎖定常ドメイン配列が、TRACのThr 48及びTRBC1又はTRBC2のSer 57からシステイン残基への置換により改変されており、前記システイン同士が当該TCRのα及びβ定常ドメイン間の非天然型ジスルフィド結合を形成している、請求項１０又は１１に記載の特定結合性分子。
- Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ型(式中、Vα及びVβはそれぞれTCR α及びβの可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCR α及びβの定常領域であり、Lはリンカー配列である)の単鎖形式である請求項１～１２のいずれか１項に記載の特定結合性分子。
- リンカー配列が、GGGGS(配列番号29)、GGGSG(配列番号30)、GGSGG(配列番号31)、GSGGG(配列番号32)、GSGGGP(配列番号33)、GGEPS(配列番号34)、GGEGGGP(配列番号35)、GGEGGGSEGGGS(配列番号36)、GGGSGGGG(配列番号37)、GGGS(配列番号38)、GGGGS(配列番号39)、TVLRT(配列番号40)、TVSSAS(配列番号41)及びTVLSSAS(配列番号42)からなる群より選択される、請求項１３に記載の特異的結合性分子。
- 検出可能な標識、治療薬及び/又はPK改変部分に結合した請求項１～１４のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。
- 抗CD3抗体が、任意にリンカー配列を介して、当該特異的結合性分子のα鎖又はβ鎖のＣ末端又はＮ末端に共有結合している、請求項１５に記載の特異的結合性分子。
- 配列番号４～６から選択されるアミノ酸配列又は該配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含むα鎖可変ドメインと、
配列番号７～９から選択されるアミノ酸配列又は該配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含むβ鎖可変ドメインと、
任意にリンカー配列を介して、β鎖のＮ末端又はＣ末端に共有結合した抗CD3抗体であって、配列番号12～14から選択されるアミノ酸配列を含んでいてもよい抗CD3抗体と
を含んでなる特異的結合性分子－抗CD3融合分子。 - 配列番号４の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有するα鎖可変ドメイン及び配列番号10の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有するα鎖定常ドメインと、配列番号８の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有するβ鎖可変ドメイン及び配列番号11の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有するβ鎖定常ドメインと、β鎖のＮ末端に、配列番号29の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有するリンカーを介して融合した、配列番号12の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有する抗CD3 scFv抗体フラグメントとを含んでなるか、又は
配列番号４の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有するα鎖可変ドメイン及び配列番号10の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有するα鎖定常ドメインと、配列番号８の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有するβ鎖可変ドメイン及び配列番号11の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有するβ鎖定常ドメインと、β鎖のＮ末端に、配列番号29の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有するリンカーを介して融合した、配列番号14の配列又は該配列に対して少なくとも90％同一の配列を有する抗CD3 scFv抗体フラグメントとを含んでなる、請求項１７に記載の融合分子。 - 請求項１～１８のいずれか１項に記載のα鎖及び/又はβ鎖をコードする核酸。
- 請求項１９に記載の核酸を含む発現ベクター。
- (a)請求項１～１８のいずれか１項に記載のα及びβ可変鎖を単一のオープンリーディングフレーム又は異なる２つのオープンリーディングフレームにコードする請求項２０に記載の発現ベクター、又は
(b)請求項１～１８のいずれか１項に記載の特異的結合性分子のα可変鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター及び請求項１～１８のいずれか１項に記載の特異的結合性分子のβ可変鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を有する細胞。 - 請求項１～１６のいずれか１項に記載の特異的結合性分子を提示する天然に存在しないか及び/又は精製されたか及び/又は操作された細胞、特にＴ細胞。
- 請求項１～１６のいずれか１項に記載の特異的結合性分子、請求項１７若しくは１８に記載の特異的結合性分子－抗CD3融合分子、請求項１９に記載の核酸及び/又は請求項２１若しくは２２に記載の細胞を、１又は２以上の薬学的に受容可能な担体又は賦形剤と共に含む医薬組成物。
- 医学、好ましくはヒト対象における医学に用いるための、請求項１～１６のいずれか１項に記載の特異的結合性分子、請求項１７若しくは１８に記載の特異的結合性分子－抗CD3融合分子、請求項１９に記載の核酸、請求項２１若しくは２２に記載の細胞及び/又は請求項２３に記載の医薬組成物。
- 癌又は腫瘍を治療する方法、好ましくはヒト対象における癌又は腫瘍を治療する方法に用いるための、請求項１～１６のいずれか１項に記載の特異的結合性分子、請求項１７若しくは１８に記載の特異的結合性分子－抗CD3融合分子、請求項１９に記載の核酸、請求項２１若しくは２２に記載の細胞及び/又は請求項２３に記載の医薬組成物。
- 必要とするヒト対象に、請求項２３に記載の医薬組成物の薬学的有効量を投与することを含む、癌又は腫瘍を有するヒト対象を治療する方法。
- a)請求項２１又は２２に記載の細胞を、特異的結合性分子鎖の発現に最適な条件下に維持すること、及びb)特異的結合性分子鎖を単離することを含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の特異的結合性分子又は請求項１７若しくは１８に記載の特異的結合性分子－抗CD3融合分子を製造する方法。
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