JP2008509654A - C型肝炎ウイルスに対するctlおよび/またはhtl応答を誘導するためのペプチド - Google Patents
C型肝炎ウイルスに対するctlおよび/またはhtl応答を誘導するためのペプチド Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、C型肝炎ウイルス(HCV)から誘導されるペプチド、およびそれらをコードする核酸に関する。ペプチドは、宿主においてCTLおよび/またはHTL応答を誘発するペプチドである。本発明はまた、HCV感染の防止および処置のための組成物ならびにワクチンならびに患者におけるHCV暴露の検出のための診断方法に関する。
Description
本発明は、C型肝炎ウイルス(HCV)から誘導されるペプチドまたはそれらをコードする核酸に関する。ペプチドは、宿主において細胞障害性および/またはヘルパーTリンパ球応答を誘発するペプチドである。本発明はまた、HCV感染の防止および処置のためのワクチンならびに患者におけるHCV暴露の検出のための診断方法に関する。
HCVウイルスの約9.6kb一本鎖RNAゲノムは、5’−および3’−非コーディング領域(NCR)、ならびにこれらのNCRの間に、約3000アミノ酸のHCVポリタンパク質をコードする約9kbの単一の長いオープンリーディングフレームを含んでなる。
HCVポリペプチドは、オープンリーディングフレームからの翻訳および同時翻訳タンパク質分解プロセシングによって産生される。構造タンパク質は、コーディング領域のアミノ末端側の4分の1から誘導され、カプシドまたはCoreタンパク質(約21kDa)、E1エンベロープ糖タンパク質(約35kDa)およびE2エンベロープ糖タンパク質(約70kDa、以前はNS1と呼ばれる)、ならびにP7(約7kDa)を含む。E2タンパク質は、p7タンパク質のC末端融合を伴うまたは伴わずに生じ得る(非特許文献1)。最近、F(フレームシフト)タンパク質と呼ばれる約17kDのタンパク質をコードおよび発現しているCore領域における代替的オープンリーディングフレームが見出された(非特許文献2;ウーおよびクー(Ou&Xu)による特許文献1)。同じ領域において、他の14〜17kDa ARFP(代替リーディングフレームタンパク質)のためのORF、A1〜A4が発見され、少なくともA1、A2およびA3に対する抗体が慢性感染患者において検出された(非特許文献3)。HCVコーディング領域の残りの部分から、NS2(約23kDa)、NS3(約70kDa)、NS4A(約8kDa)、NS4B(約27kDa)、NS5A(約58kDa)およびNS5B(約68kDa)を含む非構造HCVタンパク質が誘導される(非特許文献4)
HCVは、世界中に広まった非A非B型肝炎の主な原因である。HCVによる急性感染(すべての急性肝炎感染の20%)は、しばしば、慢性肝炎(すべての慢性肝炎の症例の70%)および末期の肝硬変をもたらす。20%までのHCVの慢性キャリアが約20年の期間の間に肝硬変を発症し、肝硬変を伴うキャリアのうち1〜4%/年の間は肝臓癌腫を発症する危険性がある(非特許文献5、非特許文献6)と推測される。HCVにより生じる末期の肝臓疾患の寿命を増加する選択肢は、肝移植である(世界中のすべての肝移植の30%がHCV感染による)。
ウイルス特異的ヒト白血球抗原(HLA)クラスI拘束性細胞障害性Tリンパ球(CTL)は、ウイルス感染のインビボでの防止および除去において主な役割を果たすことが公知である(非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10;非特許文献11;非特許文献12)。
MHC分子は、クラスIまたはクラスIIのいずれか一方に分類される。クラスI MHC分子は、事実上すべての有核細胞上で発現される。クラスI MHC分子に関連して提示されるペプチドフラグメントは、CD8+Tリンパ球(細胞障害性Tリンパ球またはCTL)によって認識される。CD8+Tリンパ球は、しばしば、刺激抗原を有する細胞を溶解することができる細胞障害性エフェクターに成熟する。CTLは、腫瘍細胞を排除し、ウイルス感染に抵抗するのに特に有効である。
クラスII MHC分子は、活性化されたリンパ球および抗原提示細胞において主に発現される。CD4+Tリンパ球(ヘルパーTリンパ球またはHTL)は、マクロファージまたは樹状細胞のような抗原提示細胞において通常見出されるクラスII MHC分子によって提示される独特なペプチドフラグメントの認識によって活性化される。CD4+Tリンパ球は、増殖して、IL−4およびIL−10の産生を介して抗体仲介応答を支持するか、またはIL−2およびIFN−Γの産生を介して細胞仲介応答を支持するサイトカインを分泌する。
Tリンパ球は、無傷な(intact)外来性抗原自体ではなく、むしろ、MHCクラスIまたはクラスII分子に結合したペプチドフラグメントの形態の抗原を認識する。MHCクラスI分子によって提示される抗原は、典型的に、細胞によって内因的に合成されるもの(例えば、細胞内病原体)である。得られる細胞質抗原は、通常、プロテアソームによって、細胞質において小さなフラグメントに分解される(非特許文献13)。MHCクラスII分子によって提示される抗原は、通常、食作用、飲作用、または受容体仲介エンドサイトーシスを介して抗原提示細胞に進入する可溶性抗原である。一旦、細胞内に存在すると、抗原は、エンドソームの酸性プロテアーゼによって部分的に分解される(非特許文献14;非特許文献15)。
機能的HLAは、内在性ならびに外来性の潜在的な抗原ペプチドが結合する深い結合溝によって特徴付けられる。溝は、良好に規定される形状および物理化学的特性によってさらに特徴付けられる。HLAクラスI結合部位が閉じられ、ここで、ペプチドの末端は溝の端部に枢着される。それらはまた、水素結合と保存されたHLA残基とのネットワークに関与する(非特許文献16)。これらの拘束性を考慮すると、結合ペプチドの長さは8〜10残基に制限される。しかし、12アミノ酸残基までのペプチドもまた、HLAクラスIに結合することが可能であることが、非特許文献17によって実証されている。異なるHLA複合体の構造の重ねあわせによって、結合の一般的態様が確認されたが、ここで、ペプチドは、相対的に線状の伸長された立体配座を採用する。
同時に、異なるペプチドの立体配座の有意な変動性も観察された。この変動性は、些細な構造的差異から顕著に異なる結合態様にまで範囲が及ぶ。クラスI分子が、長さ(8〜12残基)およびアミノ酸配列においてばらつきがある数千種の異なるペプチドに結合することができるという事実を考慮すると、そのような変動は予想されない。異なるクラスIアロタイプは、特定の位置における1または2つの保存されたアミノ酸残基を共有するペプチドに結合する。これらの残基は、アンカー残基と称され、相補的ポケットに収容される(非特許文献18)。第1のアンカーの他に、より浅いポケットにおいて占有される第2のアンカー残基もまた存在する(非特許文献19)。全体では、A〜Fと呼ばれる6つのアリル特異的ポケットが特徴付けられている(非特許文献20;非特許文献21)。これらのポケットの構成は、クラスI分子の多型に従って変動し、高い程度の特異性(制限された交差反応性)を生じる一方、同時に広範な結合能を保存する。
HLAクラスI結合部位とは対照的に、クラスII部位は両端部において開いている。このため、ペプチドは、実際の結合領域から延在することが可能であり、それによって、両端部から「突き出して」いる(非特許文献22)。従って、クラスII HLAは、9〜25アミノ酸残基を超える範囲の多様な長さのペプチドリガンドに結合することができる。HLAクラスIと同様に、クラスIIリガンドの親和性は、「定常」および「可変」成分によって決定される。定常部もまた、HLAクラスIIの溝における保存された残基と結合されたペプチドの主鎖との間で形成される水素結合のネットワークから生じる。しかし、この水素結合のパターンは、ペプチドのN末端およびC末端残基に制限されないが、鎖の全体に分布する。それは、複合されたペプチドの立体配座を厳密な線状態様の結合に制限するため、後者は重要である。これは、すべてのクラスIIアロタイプに共通である。ペプチドの結合親和性を決定する第2の成分は、クラスII結合部位内の多型の所定の位置によって変動する。異なるアロタイプは溝内において異なる相補的ポケットを形成し、それによって、ペプチド、または特異性のサブタイプ依存的選択を担う。重要なことに、クラスIIポケット内に保持されるアミノ酸残基に対する制約は、一般に、クラスIに対するものより「柔軟」である。異なるHLAクラスIIアロタイプ間には、ペプチドのさらに多くの交差反応性が存在する。クラスIとは異なり、クラスIIアロタイプと相関関係があるペプチドリガンドにおける高度に保存された残基パターン(いわゆるモチーフ)を同定することはこれまで不可能であった。
いくつかのMHC複合体に結合するペプチドは、酸溶出(acid elusion)方法(非特許文献23)、クロマトグラフィー方法(非特許文献24および非特許文献18)、ならびに質量分析方法(非特許文献25)によって同定されている。MHCクラスI分子に結合する天然にプロセスされるペプチドのレビューについては、非特許文献26に記載されている。
複雑な外来性病原体によってコードされる数千種の可能なペプチドのうち、小さな画分のみが、最終的にMHCクラスIまたはクラスII抗原に結合することが可能なペプチド形態になり、従って、一致するT細胞受容体を含有する場合、T細胞に認識され得る。この現象は、免疫優性として公知である(非特許文献27)。さらに簡単に説明すると、免疫優性は、免疫化または生来の抗原全体への暴露によって、生来の抗原が含有するすべてのエピトープよりむしろ抗原の1つもしくは若干の「優性」エピトープに対する免疫応答を生じる現象を説明する。免疫優性は、MHCペプチド親和性、抗原プロセシングおよびT細胞受容体認識を含む様々な因子の影響を受ける。
HCV感染によって観察される異種免疫応答を考慮すると、複数のHCVエピトープに対して同時に指向される多特異的細胞免疫応答の誘導は、HCVに対する有効なワクチンの開発に重要であるようである。しかし、HCV感染を除去する患者において認められる応答に対応する免疫応答を誘発するワクチン実施形態を確立する必要がある。
HLA多型は、ワクチン開発のためのエピトープに基づくアプローチによって考慮するのに、かなりの程度で重要な因子である。この因子に取り組むために、エピトープ選択は、高度もしくは中程度の親和性で複数のHLA分子に結合することが可能なペプチドの同定または最も優勢なHLAタイプに結合するペプチドの選択を含むことができる。HCVワクチン開発において考慮すべきもう1つの重要な因子は、異なるHCV遺伝子型およびサブタイプの存在である。従って、HCV遺伝子型またはサブタイプ特異的免疫原性エピトープは、すべての考慮される遺伝子型またはサブタイプについて同定する必要がある。しかし、2つ以上のHCV遺伝子型またはサブタイプを含むエピトープを同定することが好適である。
クラスIおよびクラスII MHC分子の異なる特徴は、潜在的T細胞エピトープの推定に関連する特定の問題を担う。先に考察したように、クラスI分子は、良好に規定された残基タイプパターンを示す短いペプチドに結合する。
これは、ペプチドの特定の位置における特定の残基タイプについての実験的に決定された統計的採択に基づく多様な推定方法をもたらしている。
これらの方法が相対的に良好に作用しても、保存されていない位置に関連する不定部分はそれらの確度を制限する。
MHC/ペプチド結合推定のための方法は、大まかに2つのカテゴリー:実験的に得られる親和性データによって推進される「統計的方法」およびMHC分子の入手可能な3D構造の情報に基づく「構造に関連する方法」にサブ分類することができる。あるいは、分子動力学シミュレーションは、時々、MHC結合溝内のペプチドをモデル化するために実施される(非特許文献28)。もう1つのアプローチは、ループモデリングとシミュレートされたアニーリングとを組み合わせることである(非特許文献29)。ほとんどの研究グループは、親和性推定工程において使用されるスコアリング機能の重要性を強調している。
いくらかのMHC結合性HCVペプチドについては、既に、例えば、特許文献2(Imperial College Innovations Ltd)、特許文献3および特許文献4(Epimmune)、特許文献5(Intercell)、特許文献6(The Scripps Research Institute)、特許文献7(Government of The usa,Department Of Health and Human Services)、特許文献8(Chiron)、特許文献9(immusystems Gmbh)、特許文献10(Innogenetics N.V)および特許文献11(Cytel Corp)において開示されている。
主要組織適合性(MHC)クラスIまたはクラスII分子についてペプチドの親和性を推定する方法の構造推定および親和性評価の両方の工程を実施的に改善する必要がある。この分野において遭遇する主な問題は、実験的に決定されるデータ(結合および構造の情報の両方)が乏しいMHCアリルに関する推定アルゴリズムの不良な性能である。これは、例えば、HLA−Cについての場合である。
従って、いくつかのMHC結合性ペプチドが同定されている一方、当該分野においては、それらが起源とするHCVに対する免疫応答を生じさせるために利用することができるHCVから新規のMHC結合性ペプチドを同定する必要性が存在する。また、合理的な親和性で結合する(および結合していること)が推定されるペプチドは、免疫原性であるために、遅い解離速度を必用とする(非特許文献30;非特許文献31;非特許文献32)。
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本発明は、C型肝炎ウイルス(HCV)のCore、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4(NS4AおよびNS4B)ならびにNS5(NS5AおよびNS5B)タンパク質から誘導されるペプチドまたはエピトープに関する。ペプチドは、免疫された宿主においてHLAクラスIおよび/またはクラスII拘束性Tリンパ球応答を誘発するペプチドである。より具体的には、本発明のHLAクラスI拘束性ペプチドは、次のHLAクラスIグループ:HLA−A*01、HLA−A*02、HLA−A*03、HLA−A*11、HLA−A*24、HLA−B*07、HLA−B*08、HLA−B*35、HLA−B*40、HLA−B*44、HLA−Cw03、HLA−Cw04、HLA−Cw06またはHLA−Cw07の少なくとも1つのHLA分子に結合する。好適なペプチドを表13にまとめて示す。本発明のHLAクラスII拘束性ペプチドは、次のHLAクラスIIグループ:HLA−DRB1、−DRB2、−DRB3、−DRB4、−DRB5、−DRB6、−DRB7、−DRB8または−DRB9の少なくとも1つのHLA分子に結合する。前記HLAクラスIIグループは、時々、HLA−DRB1−9としてまとめられる。好適なクラスII拘束性ペプチドを表14に示す。
本発明のHLAクラスIおよびII結合性ペプチドは、国際公開第03/105058号パンフレット−Algonomicsにおいて記載の方法、国際公開第01/21189号パンフレットにおいてEpimmuneにより記載の方法および/または3つの公的なデータベース推定サーバー、それぞれ、Syfpeithi、BimasおよびnHLAPredによって同定されている。それぞれのペプチド自体(表に列挙されている)は本発明の一部である。さらに、各ペプチドが、複数の反復として同じペプチド、あるいはさらなるリンカーを伴うかもしくは伴わずに他の任意のペプチドまたはエピトープとの組み合わせで使用され得ることもまた、本出願の発明態様である。従って、本発明はまた、組成物、より具体的には、ポリエピトープペプチドに関する。
さらなる実施形態において、本発明は、表13において開示されるHLA−Bおよび/またはHLA−C結合性ペプチドから選択される少なくとも3つのペプチドを含んでなるポリエピトープペプチドに関する。
さらなる実施形態において、本発明は、HCVタンパク質から誘導され、HLAクラスIおよび/またはクラスII拘束性Tリンパ球応答を誘導することが可能な少なくとも2つのペプチドを含んでなるポリエピトープペプチドであって、ここで、少なくとも1つのペプチドはHLA−C結合性ペプチドである、ポリエピトープペプチドに関する。
さらなる実施形態において、本発明は、表14において開示されるペプチドから選択される少なくとも2つのHLAクラスII結合性ペプチドを含んでなるポリエピトープペプチドに関する。
本発明の特定の実施形態において、ペプチドは、遺伝子型1a、1bおよび/または3aのHCVコンセンサス配列に存在することを特徴とする。
さらに、本発明は、本明細書に記載のペプチドをコードする核酸に関する。より詳細には、本発明は、本明細書に記載のポリエピトープペプチドをコードする「ミニ遺伝子」またはポリヌクレオチドに関する。
本発明はまた、本明細書に記載の核酸またはミニ遺伝子を含んでなるベクター、プラスミド、組換え体ウイルスおよび宿主細胞に関する。
本発明のペプチド、対応する核酸ならびに組成物は、CTLおよび/またはHTL応答の産生を刺激することによって、HCVに対する免疫応答を刺激するのに有用である。生来のHCVアミノ酸配列から誘導される本発明のペプチドエピトープは、HLA分子に結合し、HCVに対する免疫応答を誘導または刺激することが可能であるように選択されている。特定の実施形態において、本発明は「ネステッドエピトープ」を提供する。本発明はまた、ネステッドエピトープを含んでなるポリエピトープペプチドに関する。
さらなる実施形態において、本発明は、先行のワクチンよりも広範な集団適用範囲を提供するために、エピトープが、多様な遺伝子アリルによってコードされるHLA分子と直接的または間接的に相互作用することが可能であるエピトープに基づくワクチンを可能にするポリエピトープペプチド、ポリヌクレオチド、組成物およびそれらの組み合わせを提供する。
好適な実施形態において、本発明は、HCV特異的CTLエピトープ、HCV特異的HTLエピトープまたはそれらの組み合わせを含んでなる組成物に関する。前記組成物は、1つもしくはそれ以上のCTLエピトープ、1つもしくはそれ以上のHTLエピトープ、またはそれらの組み合わせを含んでなるミニ遺伝子の形態であり得る。
さらなる実施形態において、本発明のペプチド、またはそれらをコードする核酸は、処置レジメンの決定、HCV感染の結果の決定、免疫応答の評価もしくはワクチンの効力の評価のような診断方法において使用される。
本発明は、C型肝炎ウイルス(HCV)のCore、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4(NS4AおよびNS4B)またはNS5(NS5AおよびNS5B)タンパク質から誘導されるペプチドに関する。ペプチドは、免疫された宿主においてHLAクラスIおよび/またはクラスII拘束性Tリンパ球応答を誘発するペプチドである。
より具体的には、本発明のHLAクラスI拘束性ペプチド(CTLエピトープ)は、次のHLAクラスIグループ:HLA−A*01、HLA−A*02、HLA−A*03、HLA−A*11、HLA−A*24、HLA−B*07、HLA−B*08、HLA−B*35、HLA−B*40、HLA−B*44、HLA−Cw03、HLA−Cw04、HLA−Cw06またはHLA−Cw07の少なくとも1つのHLA分子に結合する。好適なペプチドを表13にまとめて示す。本発明のHLAクラスII拘束性ペプチド(HTLエピトープ)は、次のHLAクラスIIグループ:HLA−DRB1、−DRB2、−DRB3、−DRB4、−DRB5、−DRB6、−DRB7、−DRB8または−DRB9の少なくとも1つのHLA分子に結合する。前記HLAクラスIIグループは、時々、HLA−DRB1−9としてまとめられる。好適なHTLエピトープを表14に示す。
それぞれのHLAクラスIおよびクラスIIペプチド自体(表に列挙されている)は本発明の一部である。さらに、各エピトープが他の任意のエピトープとの組み合わせで使用され得ることは本発明の態様である。
ペプチドの同定
数百種の既知のHCV遺伝子型およびサブタイプ(配列あたり少なくとも3000アミノ酸)に基づき、本明細書に記載の方法に従って、数千種の理論的CTLおよび/またはHTLエピトープが推定される。前記の大多数から開始して、推定される結合親和性に基づいて、エピトープの第1選択が行われている。
数百種の既知のHCV遺伝子型およびサブタイプ(配列あたり少なくとも3000アミノ酸)に基づき、本明細書に記載の方法に従って、数千種の理論的CTLおよび/またはHTLエピトープが推定される。前記の大多数から開始して、推定される結合親和性に基づいて、エピトープの第1選択が行われている。
本発明のHLAクラスIおよびII結合性ペプチドは、国際公開第03/105058号パンフレット−Algonomicsにおいて記載の方法、国際公開第01/21189号パンフレットにおいてEpimmuneにより記載の方法および/または3つの公的なエピトープ推定サーバー、それぞれ、Syfpeithi、BIMASおよびnHLAPredによって同定されている。
CTLペプチドの第1の組は、Algonomics N.V.,Zwijnaarde、白国により国際公開第03/105058号パンフレット(本明細書において参照により援用される)において記載の方法によって誘導される。前記方法は、主要組織適合性(MHC)受容体についての潜在的抗原ペプチドの親和性の構造に基づく推定に関する。
はじめに、HCVコンセンサス配列が設計される。これを行うために、「LOS ALAMOS」データベースに存在するHCV 1b型由来のHCV配列の選択をクラスター化し、整列する。Los Alamos Nationalラボラトリー由来のHCV Sequenceデータベースは:http://hcv.lanl.gov/content/hcv−db/HelpDocs/cluster−help.htmlにおいて見出すことができる。
作製された複数の配列アラインメントは、CTLエピトープ推定のために、HCVタンパク質における興味深い(即ち保存された)領域を同定するために使用されている。
図1は、本発明における9マーCTLエピトープ推定に使用されるHCVコンセンサス配列を開示する。表1〜11において認められる9マーについてのアミノ酸番号付けは、前記配列に基づく。
図2は、本発明における10マーCTLエピトープ推定に使用されるHCVコンセンサス配列を開示する。表1〜11において認められる10マーについてのアミノ酸番号付けは、前記配列に基づく。
推定は、HLA−A0101、HLA−A0201、HLA−A0301、HLA−A2402、HLA−B0702、HLA−B0801、HLA−B3501、HLA−B4403、HLA−Cw0401、HLA−Cw0602およびHLA−Cw0702について行った。
表1〜11は、上記のアルゴリズムによって誘導される本発明のHLA−A、HLA−BおよびHLA−C結合性ペプチドについて開示する。分類は、Kdpred<0.1μMの強いバインダー(S)、Kdpred0.1〜1ΜMの中等度のバインダー(M)およびKdpred1〜10μMの弱いバインダー(W)の間で行われる。Kdpredは、アルゴリズムによって推定される親和性(解離定数)である。
さらなる選択は、最も優勢な遺伝子型におけるエピトープの存在に基づいて行われる。従って、以下において存在するそれらのペプチド
・少なくとも遺伝子型3a、または
・少なくとも遺伝子型1b、または
・少なくとも遺伝子型1aおよび1b、または
・少なくとも遺伝子型1a、1bおよび3a、
がさらなる試験のために保持される。これらのペプチドを表13にまとめて示す。
・少なくとも遺伝子型3a、または
・少なくとも遺伝子型1b、または
・少なくとも遺伝子型1aおよび1b、または
・少なくとも遺伝子型1a、1bおよび3a、
がさらなる試験のために保持される。これらのペプチドを表13にまとめて示す。
さらに、他のHCV遺伝子型(例えば、遺伝子型4a)が、優勢および/または重要性を考慮して保持され得る。
ペプチドの第2の組は、Epimmune Inc.、カリフォルニア州、米国による国際公開第01/21189号パンフレット(本明細書において参照により援用される)において記載の方法によって同定される。ウイルス、細菌、寄生体もしくは腫瘍関連抗原のゲノムまたはプロテオミック配列データから潜在的エピトープを迅速に同定するために、専用のコンピュータアルゴリズムが使用される。プログラムを使用して、免疫応答を増強または抑制するためにエピトープ(アナログ)を修飾することもできる。
アルゴリズムは、係数に基づくスコアのKD(IC50)推定(PICスコア)への変換に基づき、異なるペプチドサイズまたはアリルに関与する組み合わされた探索を容易にする。倍率と指数べき乗補正(exponential power correction)を組み合わせて使用すると、計算上および実際のIC50値の間に良好な適合度がもたらされる。アルゴリズムは何らかの親和性を伴って結合するエピトープを推定するため、HLAタイプに係わらず、最高スコアのエピトープのみを選択するより厳密な候補選択手順を利用することができる。
57のHCV単離体由来のタンパク質配列データを、指定されたスーパーモチーフまたはモチーフの存在について評価した。57の株には、COLONEL−ACC−AF290978、H77−ACC−NC、HEC278830−ACC−AJ278830、LTD1−2−XF222−ACC−AF511948、LTD6−2−XF224−ACC−AF511950、JP.HC−J1−ACC−D10749、US.HCV−H−ACC−M67463、US.HCV−PT−ACC−M62321、D89815−ACC−D89815、HC−J4−ACC−AF054250、HCR6−ACC−AY045702、HCV−CG1B−ACC−AF333324、HCV−JS−ACC−D85516、HCV−K1−R1−ACC−D50480、HCV−S1−ACC−AF356827、HCVT050−ACC−AB049087、HPCHCPO−ACC−D45172、M1LE−ACC−AB080299、MD11−ACC−AF207752、SOURCE−ACC−AF313916、TMORF−ACC−D89872、AU.HCV−A−ACC−AJ000009、CN.HC−C2−ACC−D10934、CN.HEBEI−ACC−L02836、DE.HCV−AD78−ACC−AJ132996、DE.HD−1−ACC−U45476、DE.NC1−ACC−AJ238800、JP.HCV−BK−ACC−M58335、JP.HCV−J−ACC−D90208、JP.HCV−N−ACC−AF139594、JP.J33−ACC−D14484、JP.JK1−FULL−ACC−X61596、JP.JT−ACC−D11355、JP.MD1−1−ACC−AF165045、KR.HCU16362−ACC−U16362、KR.HCV−L2−ACC−U01214、RU.274933RU−ACC−AF176573、TR.HCV−TR1−ACC−AF483269、TW.HCU89019−ACC−U89019、TW.HPCGENANTI−ACC−M84754、G2AK1−ACC−AF169003、HC−J6CH−ACC−AF177036、MD2A−1−ACC−AF238481、NDM228−ACC−AF169002、JP.JCH−1−ACC−AB047640、JP.JFH−1−ACC−AB047639、JP.TD−6−ACC−D00944、JPUT971017−ACC−AB030907、MD2B−1−ACC−AF238486、JP.HC−J8−ACC−D10988、BEBE1−ACC−D50409、CB−ACC−AF046866、K3A−ACC−D28917、NZL1−ACC−D17763、DE.HCVCENS1−ACC−X76918、JP.HCV−TR−ACC−D49374およびEG.ED43−ACC−Y11604が含まれる。
推定は、HLA−A0101、HLA−A0201、HLA−A1101、HLA−A2402、HLA−B0702、HLA−B−0801およびHLA−B4002について行われる。B0801については、PICアルゴリズムを利用することができないため、モチーフポジティブ配列を選択した。
表1、2、3、4、5、6および8は、上記のアルゴリズムによって誘導されるPICスコア<100を生じる本発明のHLA−AおよびHLA−Bペプチドを開示する。
さらなる選択は、最も優勢な遺伝子型におけるエピトープの存在に基づいて行われる。従って、以下において存在するそれらのペプチド
・少なくとも遺伝子型3a、または
・少なくとも遺伝子型1b、または
・少なくとも遺伝子型1aおよび1b、または
・少なくとも遺伝子型1a、1bおよび3a、
がさらなる試験のために保持される。これらのペプチドを表13にまとめて示す。
・少なくとも遺伝子型3a、または
・少なくとも遺伝子型1b、または
・少なくとも遺伝子型1aおよび1b、または
・少なくとも遺伝子型1a、1bおよび3a、
がさらなる試験のために保持される。これらのペプチドを表13にまとめて示す。
さらに、他のHCV遺伝子型(例えば、遺伝子型4a)が、優勢および/または重要性を考慮して保持され得る。
ペプチドの第3の組は、3つの公的に利用可能なアルゴリズムによって同定される。
はじめに、HCV 1bコンセンサス配列が設計される。80のHCV 1b型配列由来のHCV配列を、Division of Microbiology and Infectious Diseases of the National INstitute of Allergies and Infectious Diseases(NIAID)のHCV配列データベースhttp://hcv.lanl.gov/content/hcv−db/indexから検索した。
作製された複数の配列アラインメントは、CTLエピトープ推定のために、HCVタンパク質における興味深い領域を同定するために使用される。図2は、CTLエピトープ推定のために使用されるHCVコンセンサス配列を開示する。本明細書におけるアミノ酸の番号付けは、前記配列に基づく。
前記コンセンサス配列に基づいて、CTLエピトープ推定のために、3種の異なる推定アルゴリズムを使用した:
A)Syfpeithi:
Hans−georg Rammensee,Jutta Bachmann,Niels Nikolaus emmerich,Oskar Alexander Bachor,Stefan Stevanovic:SYFPEITHI:database for MHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics(1999年)50:213−219; www.syfpeithi.de)
A)Syfpeithi:
Hans−georg Rammensee,Jutta Bachmann,Niels Nikolaus emmerich,Oskar Alexander Bachor,Stefan Stevanovic:SYFPEITHI:database for MHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics(1999年)50:213−219; www.syfpeithi.de)
推定は、公開されたモチーフ(プール配列決定、天然のリガンド)に基づき、アンカーおよび補助アンカー位置におけるアミノ酸、ならびに他の頻出アミノ酸を考慮する。スコアリングシステムは、所定のペプチド内のすべてのアミノ酸を評価する。個々のアミノ酸には、それぞれの位置についてごく僅かに好適であるアミノ酸については任意値1が付与され得、至適アンカー残基には値15が付与され;これらの2つの間のいずれかの値が可能である。所定の配列位置においてペプチドの結合能に対して不利であるアミノ酸に対しては、マイナスの値も可能である。値の配置は、天然のリガンド、T細胞エピトープ、または結合性ペプチドにおけるそれぞれのアミノ酸の頻度に基づく。最大スコアは、異なるMHCアリルの間で変動する。大量のデータが利用可能であるそれらのMHCクラスIアリルのみがSYFPEITHIの「エピトープ推定」セクションに含まれる。SYFPEITHIは、HLA−Cアリルについての推定は行わない。
推定は、HLA−A01、A0201、A03、A2402、B0702、B08およびB44について行われる。それぞれのクラスについて、9および10マーの両方が推定され、但しB08については、8および9マーが推定され、10マーは推定されなかった。
B)BIMAS:
このアルゴリズムは、使用者が、HLAクラスI分子に対するペプチド結合性モチーフを含有する8マー、9マー、または10マーペプチドを局在化し、ランク付けすることを可能にする。前記ランク付けは、National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID)at the National Institutes of Health(NIH)、Bethesda、メリーランド州のケニス パーカー(Kenneth Parker)博士による文献から推察されるアミノ酸/位置係数テーブルを用いる。ウェブサイト(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)は、パーカー(Parker)博士の協力で、Bioinformatics and MOlecular Analysis Section (BIMAS),Computational Bioscience and Engineering Laboratory (CBEL),Division of Computer Research&Technology (CIT),National Institutes of Healthのローランド テイラー(Ronald Taylor)により作成された。
このアルゴリズムは、使用者が、HLAクラスI分子に対するペプチド結合性モチーフを含有する8マー、9マー、または10マーペプチドを局在化し、ランク付けすることを可能にする。前記ランク付けは、National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID)at the National Institutes of Health(NIH)、Bethesda、メリーランド州のケニス パーカー(Kenneth Parker)博士による文献から推察されるアミノ酸/位置係数テーブルを用いる。ウェブサイト(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)は、パーカー(Parker)博士の協力で、Bioinformatics and MOlecular Analysis Section (BIMAS),Computational Bioscience and Engineering Laboratory (CBEL),Division of Computer Research&Technology (CIT),National Institutes of Healthのローランド テイラー(Ronald Taylor)により作成された。
初期(ランニング)スコアは1.0に設定されている。各残基の位置について、プログラムは、どのアミノ酸が当該位置に出現するかについて試験する。次いで、ランニングスコアに、選択されたHLA分子について、当該位置における該アミノ酸タイプの係数を掛ける。これらの係数は、HLA係数ファイルのコレクションとしての個別のディレクトリにおけるスコアリングアルゴリズムによる使用のために、予め算出され、格納されている。これらのテーブルの背後にある考えは、第1の近似に対して、ペプチドにおける各アミノ酸は、独立して、クラスI分子への結合に寄与するという仮定である。結合に極めて好ましい優勢なアンカー残基は、テーブル中に1と有意に異なる係数を有する。高度に有利なアミノ酸は、実質的に2以上の係数を有し、好ましくないアミノ酸は1未満の正の係数を有する。補助アンカー残基は、1とは異なるが、優勢なアンカー残基よりも大きさが小さい。9マーを使用する場合、9回の掛け算が実施される。10マーを使用する場合も、配列の5位に存在する残基が無視されるため、9回の掛け算が実施される。得られるランニングスコアに最後の定数を掛けて、解離の半減期の推測値が得られる。最後の掛け算から、アプトプットにおいて法広告されるスコアが得られる。
推定は、HLA−A01、A0201、A03、A24、B07、B08、B3501、B4403、Cw0301、Cw0401、Cw0602およびCw0702について行われる。それぞれのクラスについて、9および10マーの両方が推定され、但しB08については、8、9および10マーが推定された。
C)nHLAPred
nHLAPredは、多数のクラスI MHCアリルについての高度に正確なMHCバインダーの推定方法である。(GPS ラグハバ(GPS RAGHAVA)、コーディネーター、Bioinformatics Centre,Institute of Microbial Technology,Sector 39A,Chandigarh,India;http://imtech.rs.in/raghava)。アルゴリズムは、2つの部分ComPredおよびANNpredに区分される。ComPred部分では、推定は、定量マトリックスと人工神経ネットワークとのハイブリッドアプローチに基づく。ANNPredでは、推定は、人工神経ネットワークにのみ基づく。
nHLAPredは、多数のクラスI MHCアリルについての高度に正確なMHCバインダーの推定方法である。(GPS ラグハバ(GPS RAGHAVA)、コーディネーター、Bioinformatics Centre,Institute of Microbial Technology,Sector 39A,Chandigarh,India;http://imtech.rs.in/raghava)。アルゴリズムは、2つの部分ComPredおよびANNpredに区分される。ComPred部分では、推定は、定量マトリックスと人工神経ネットワークとのハイブリッドアプローチに基づく。ANNPredでは、推定は、人工神経ネットワークにのみ基づく。
Compred:アルゴリズムのこの部分は、67のMHCアリルについてMHC結合性ペプチドを推定することができる。方法は、以下のとおり体系的に開発されている:
最初に、定量マトリックス(QM)に基づく方法が、MHCBNデータベースにおいて利用可能な最大15のバインダーを有する47のMHCクラスIアリルについて開発された。
最初に、定量マトリックス(QM)に基づく方法が、MHCBNデータベースにおいて利用可能な最大15のバインダーを有する47のMHCクラスIアリルについて開発された。
定量マトリックスにより、線形モデルは性能を実行し易くなる。マトリックスアプローチを使用することのもう1つの利点は、それが結合ポテンシャルを伴う広範なペプチドを対象範囲として含むこと、およびそれが各ペプチドに定量スコアを付与することである。
さらに、人工神経ネットワーク(ANN)に基づく方法が、40もしくはそれ以上のバインダーを有するこれらの47のMHCアリルのうち30について開発された。ANNは、提出されたデータに存在するパターンを抽出および保持し、続いて、これまで認められていなかった入力においてそれらを認識することが可能であるセルフトレーニングシステムである。ANNは、MHCバインダーと非バインダーとを、他と比較して正確に分類することが可能である。ANNは、データをきわめて良好に一般化することが可能である。神経に基づく推定の主な制約は、それが、トレーニングのための大きなデータを必要とすることである。
さらに、本方法は、文献において報告される定量マトリックスを使用する20より多いMHCアリルに対するバインダーの推定を可能にする。
推定は、HLA−A01、A0201、A0301、A24、B0702、B08、B3501、B4403、Cw0301、Cw0401、Cw0602およびCw0702について行われる。nHLAPredは、9マーのみを推定することができる。
推定アルゴリズム、タンパク質およびHLAアリルのそれぞれの組み合わせについて、最高のランク付けペプチド(=最高の親和性を有すると推定される)のリストが検索される。
リストは、すべてのHLAアリルに対するすべてのペプチドで、親和性の高い順に作成した(示さず)。このリストでは、異なるHCV遺伝子型(1b、1aおよび/または3aコンセンサス配列)における発生およびHLAアリル間での交差反応に従って、ペプチドに印を付した。各HLAクラスについて、異なる推定サーバーによって推定されるすべてのペプチドは、カラムあたりの推定サーバーのそれぞれについてのランク番号と、1テーブルにおいて組み合わされる(示さず)。各ペプチドについて、ランク番号60または100まで割り当てられた推定サーバーの数が計数される。
2〜4のアルゴリズムによって推定され、60または100個の最良内にあるそれらのペプチドが最終的に選択される。結合解析(以下を参照のこと)時に、ごく少数の高親和性結合性ペプチドが同定される場合、(例えば、Epimmuneアルゴリズムによって推定され、PICスコア<1000を生じるペプチドから)さらなる選択を行うことができる。すべてのこれらのペプチドを表13に示す。
例として、B07ペプチドの選択が実施例2に開示されている。Epimmuneアルゴリズムおよび3つの公的アルゴリズムによって推定される他のHLA結合性ペプチドについての同種の手順が続いて行われた。
表13は、所定のHLAに結合することが推定され、上記の手順によって誘導される本発明のHLA−A、HLA−BおよびHLA−Cペプチドの選択を開示する。本発明のペプチドおよび対応する核酸組成物は、CTL応答の産生を刺激することによって、HCVに対する免疫応答を誘導または刺激するのに有用である。
本発明のHLAクラスII結合性ペプチドは、Epimmune Inc.、カリフォルニア州、米国による国際公開第01/21189A1号パンフレット(本明細書において参照により援用される)において記載の方法によって同定されている。57のHCV単離体由来の(CTL推定に関する)タンパク質配列データを、指定されたスーパーモチーフまたはモチーフの存在について評価した。推定は、HLA−DRB1*0401、DRB1*0101およびDRB1*0701に結合するペプチドに対するHLA DR−1−4−7スーパーモチーフを使用して、およびDRB1*0301に結合するペプチドに対するHLA DR3モチーフを使用して、行った。
推定されるHTLペプチドを表12に示す。
さらなる選択は、最も優勢な遺伝子型におけるクラスIIエピトープのコアの存在に基づいて行われる。「コア」は、全エピトープ配列のセントラル9(奇数量の全アミノ酸)または10(偶数量の全アミノ酸)アミノ酸として規定される。例えば、次のエピトープ(15aa−奇数)のコア(9aa)は、太字/下線で示される:ADLMGYIPLVGAPLG。
従って、以下において存在するコアを有するそれらのペプチド
・少なくとも遺伝子型3a、または
・少なくとも遺伝子型1b、または
・少なくとも遺伝子型1aおよび1b、または
・少なくとも遺伝子型1a、1bおよび3a、
がさらなる試験のために保持される。これらのペプチドを表14にまとめて示す。
・少なくとも遺伝子型3a、または
・少なくとも遺伝子型1b、または
・少なくとも遺伝子型1aおよび1b、または
・少なくとも遺伝子型1a、1bおよび3a、
がさらなる試験のために保持される。これらのペプチドを表14にまとめて示す。
さらに、他のHCV遺伝子型(例えば、遺伝子型4a)が、優勢および/または重要性を考慮して保持され得る。
HLAクラスIおよびII分子に対する結合親和性と、結合抗原(HLA分子)に対する個別のペプチドまたはエピトープの免疫原性との間の関係は、異なる2つの実験アプローチ(例えば、セッテ(Sette)ら、1994年を参照のこと)において分析することができる。例えば、HLA−A0201について、第1のアプローチでは、HLA結合性親和性において10.000倍の範囲を超える範囲の潜在的エピトープの免疫原性を、HLA−A0201トランスジェニックマウスにおいて分析することができる。第2のアプローチでは、異なる約100種のB型肝炎ウイルス(HBV)由来潜在的エピトープ(すべて、A0201結合性モチーフを短持する)の抗原性を、急性肝炎患者由来のPBLを使用して評価した。これらのアプローチに従って、約500NM(好ましくは、50NMもしくはそれ以下)の親和性閾値が、CTL応答を誘発するペプチドエピトープの能力を決定することが決定された。前記値は、他のHLAクラスIアリルではまだ利用することができない。
これらのデータは、天然にプロセスされたペプチドおよび合成されたT細胞エピトープに対するクラスI結合親和性の測定については正しい。
HLAクラスII DR分子に関して免疫原性に関連する親和性閾値もまた示されている(例えば、サウスウッド(Southwood)ら、1998年を参照のこと)。DR結合親和性の生物学的に有意な閾値を規定するために、それらの拘束する側のエレメント(即ち、モチーフに結合するHLA分子)に対する32のDR拘束性エピトープの結合親和性のデータベースを編集した。この場合、1000nMは、DR分子に関する免疫原性に関連する親和性閾値として規定することができる。
本発明のペプチドの推定される結合親和性(スコア)を、表1〜11に示す。HLA分子に対するペプチドの実験的に決定される結合親和性または阻害定数(Ki)は、実施例3に記載のように決定することができる。阻害定数(Ki)は、標識された参照ペプチドによる競合実験において決定されるペプチドの親和性である。Kiは、以下の式に従って、実験的に決定されるIC50値から算出される:
それぞれのHLAクラスIおよびIIアリルに対する本発明のペプチドの結合親和性(KiまたはIC50)を、表13および14に示す。
「IC50」は、参照ペプチドの結合の50%阻害が観察される結合アッセイにおけるペプチドの濃度である。明細書全体を通して、「結合データ」の結果は、しばしば、IC50の用語で表現される。アッセイが稼動する条件(即ち、HLAタンパク質および標識ペプチド濃度を制限する)が与えられる場合、これらの値はKi値とほぼ同じである。これらの値は使用されるペプチド/MHC調製物の量/精製度および結合データを解析するために使用される非線形回帰のタイプに依存するため、算出されたKi値は表示値であって、それ自体は絶対的な値ではないこともまた留意すべきである。
結合は、以下を使用するものを含むアッセイシステムを使用して、決定され得る:
生細胞(例えば、ケッペリニ(Ceppellini)ら、1989年;クリストニック(Christnick)ら、1991年;ブッシュ(Busch)ら、1990年;ヒル(Hill)ら、1991年;デルグエルシオ(del Guercio)ら、1995年)、界面活性剤溶解物を使用する無細胞系(例えば、セルンドロ(CerundolO)ら、1991年)、固定化された精製されたMHC(例えば、ヒル(Hill)ら、1994年;マーシャル(Marshall)ら、1994年)、ELISAシステム(例えば、レアイ(Reay)ら、1992年)、表面プラズモン共鳴(例えば、キルコ(Khilko)ら、1993年);高流動性可溶性相アッセイ(ハマー(Hammer)ら、1994年)、およびクラスI MHC安定化または集成の測定(例えば、リュンッグレン(Ljunggren)ら、1990年;シューマッハー(Schumacher)ら、1990年;タウンゼント(Townsend)ら、1990年;パーカー(Parker)ら、1992年)。本発明において使用される結合アッセイを、実施例3および4において実証する。表13および14において示される結果は、個々の実験の結果または多くの実験の平均のいずれかである。
生細胞(例えば、ケッペリニ(Ceppellini)ら、1989年;クリストニック(Christnick)ら、1991年;ブッシュ(Busch)ら、1990年;ヒル(Hill)ら、1991年;デルグエルシオ(del Guercio)ら、1995年)、界面活性剤溶解物を使用する無細胞系(例えば、セルンドロ(CerundolO)ら、1991年)、固定化された精製されたMHC(例えば、ヒル(Hill)ら、1994年;マーシャル(Marshall)ら、1994年)、ELISAシステム(例えば、レアイ(Reay)ら、1992年)、表面プラズモン共鳴(例えば、キルコ(Khilko)ら、1993年);高流動性可溶性相アッセイ(ハマー(Hammer)ら、1994年)、およびクラスI MHC安定化または集成の測定(例えば、リュンッグレン(Ljunggren)ら、1990年;シューマッハー(Schumacher)ら、1990年;タウンゼント(Townsend)ら、1990年;パーカー(Parker)ら、1992年)。本発明において使用される結合アッセイを、実施例3および4において実証する。表13および14において示される結果は、個々の実験の結果または多くの実験の平均のいずれかである。
HLAクラスIおよびII分子について本明細書において使用される「高い親和性」あるいは「強いバインダー」は、100nMもしくはそれ以下のKiまたはIC50値を伴う結合として規定され;「中等度の親和性」あるいは「中間のバインダー」は、約100〜約1000nMの間のKiまたはIC50値を伴う結合として規定される。
本明細書において使用される「閾値親和性」は、ペプチドが、ヒトおよび/または動物において高い確実性を伴う免疫原性を確実にする所定のHLAタイプを表示するのに必要とする最小の親和性である。閾値親和性は、異なるHLAタイプについて異なり得るが、異なってはならない。
結合実験から誘導されるデータに基づいて、候補エピトープのさらなる選択が行われる。より高いHLA結合親和性は、典型的に、より高い免疫原性と相関関係がある。免疫原性は、いくらかの異なる方法で表すことができる。免疫原性は、免疫応答が果たして誘発されるかどうか、および任意の特定の応答の活力、ならびに応答が誘発される集団の程度に対応する。例えば、ペプチドは、多様なアレイの集団において免疫応答を誘発し得るが、活発な応答を生じる例はまだ認められていない。これらの原理に従えば、中等度の親和性で約50%が結合するペプチドとは対照的に、高い親和性の結合性ペプチドは90%付近が免疫原性であることが見出されている(セッテ(Sette)ら、1994年;アレクサンダー(Alexander)ら、2003年)。さらに、より高い結合親和性ペプチドは、より活発な免疫応答(immunogenic response)をもたらす。結果として、高い親和性の結合性ペプチドが使用される場合、類似の生物学的効果を誘発させるためのペプチドはほとんど必要ない。従って、本発明の好適な実施形態では、高い親和性の結合性ペプチド(強いバインダー)および中間の親和性ペプチド(中間のバインダー)が特に有用である。
免疫原性を評価するために、以下を含む多様なストラテジーを利用することができる:
1)正常個体由来の初代T細胞培養の評価(例えば、ウェントワース(Wentworth)ら、1995年;セリース(Celis)ら、1994年;ツァイ(Tsai)ら、1997年;カワシマ(Kawashima)ら、1998年を参照のこと)。この手順は、数週間の期間にわたるインビトロでの抗原提示細胞の存在下における試験ペプチドによる正常被験体由来の末梢血リンパ球(PBL)の刺激を必要とする。ペプチドに特異的なT細胞は、この期間に活性化され、例えば、ペプチド感作標的細胞を必要とする51CR放出アッセイを使用して、検出される。
2)HLAトランスジェニックマウス(例えば、ウェントワース(Wentworth)ら、1996年;ウェントワース(Wentworth)ら、1996年;アレクサンダー(Alexander)ら、1997年を参照のこと)または代理母マウスの免疫化。この方法では、ペプチド(例えば、不完全フロイントアジュバントにおいて処方される)が、HLAトランスジェニックマウスまたは代理母マウスの皮下に投与される。免疫化の数週間後、脾臓細胞を取り出し、試験ペプチドの存在下で約1週間、インビトロで培養する。例えば、ペプチド感作標的細胞および内因的に作製された抗原を発現する標的細胞を必要とする51Cr放出アッセイを使用して、ペプチド特異的T細胞を検出する。
3)効果的にワクチン接種されている、感染から回復している免疫個体、および/または慢性感染患者由来のリコールT細胞応答の実証(例えば、レーエルマン(Rehermann)ら、1995年;ドゥーラン(Doolan)ら、1997年;バートニ(Bertoni)ら、1997年;トレルケルド(Threlkeld)ら、1997年;ディェポルダー(Diepolder)ら、1997年を参照のこと)。このストラテジーを適用する際、リコール応答は、例えば、感染を介して抗原に天然に暴露されており、従って、「天然に」免疫応答を生じている被験体、または目的のペプチドを含んでなるワクチンをワクチン接種された患者由来のPBLを培養することによって、検出される。被験体由来のPBLを、インビトロで、1〜2週間、試験ペプチド+抗原提示細胞(APC)の存在下で培養し、「生来の」T細胞に比べて、「メモリー」T細胞の活性化を可能にする。培養期間の終了時に、ペプチド感作標的、T細胞増殖、またはリンフォカイン放出を必要とする51Cr遊離を含むT細胞活性のためのアッセイを使用して、T細胞活性を検出する。
1)正常個体由来の初代T細胞培養の評価(例えば、ウェントワース(Wentworth)ら、1995年;セリース(Celis)ら、1994年;ツァイ(Tsai)ら、1997年;カワシマ(Kawashima)ら、1998年を参照のこと)。この手順は、数週間の期間にわたるインビトロでの抗原提示細胞の存在下における試験ペプチドによる正常被験体由来の末梢血リンパ球(PBL)の刺激を必要とする。ペプチドに特異的なT細胞は、この期間に活性化され、例えば、ペプチド感作標的細胞を必要とする51CR放出アッセイを使用して、検出される。
2)HLAトランスジェニックマウス(例えば、ウェントワース(Wentworth)ら、1996年;ウェントワース(Wentworth)ら、1996年;アレクサンダー(Alexander)ら、1997年を参照のこと)または代理母マウスの免疫化。この方法では、ペプチド(例えば、不完全フロイントアジュバントにおいて処方される)が、HLAトランスジェニックマウスまたは代理母マウスの皮下に投与される。免疫化の数週間後、脾臓細胞を取り出し、試験ペプチドの存在下で約1週間、インビトロで培養する。例えば、ペプチド感作標的細胞および内因的に作製された抗原を発現する標的細胞を必要とする51Cr放出アッセイを使用して、ペプチド特異的T細胞を検出する。
3)効果的にワクチン接種されている、感染から回復している免疫個体、および/または慢性感染患者由来のリコールT細胞応答の実証(例えば、レーエルマン(Rehermann)ら、1995年;ドゥーラン(Doolan)ら、1997年;バートニ(Bertoni)ら、1997年;トレルケルド(Threlkeld)ら、1997年;ディェポルダー(Diepolder)ら、1997年を参照のこと)。このストラテジーを適用する際、リコール応答は、例えば、感染を介して抗原に天然に暴露されており、従って、「天然に」免疫応答を生じている被験体、または目的のペプチドを含んでなるワクチンをワクチン接種された患者由来のPBLを培養することによって、検出される。被験体由来のPBLを、インビトロで、1〜2週間、試験ペプチド+抗原提示細胞(APC)の存在下で培養し、「生来の」T細胞に比べて、「メモリー」T細胞の活性化を可能にする。培養期間の終了時に、ペプチド感作標的、T細胞増殖、またはリンフォカイン放出を必要とする51Cr遊離を含むT細胞活性のためのアッセイを使用して、T細胞活性を検出する。
T細胞反応性が該ペプチドで感作された標的に対して示され得る場合、所定のエピトープは免疫原性であるといえる。所定のエピトープに対する免疫原性については、実施例5〜8に記載のように、該特定のエピトープに対してT細胞反応性を示す、HLAが一致するように感染もしくはワクチン接種した被験体(例えば、ヒト、トランスジェニックマウス、代理母マウス)のグループにおける個体の数、または例えば、ELISPOTアッセイにおいて検出されるスポットの数によって、さらに説明することができる。
これらの実験の1つから誘導されるデータに基づいて、それらの免疫原性に従って、候補エピトープのさらなる選択が行われる。本発明のペプチドに対する免疫原性を、表13および14に示す。「+」は、少なくとも1つの被験体におけるT細胞反応性を示す。
広範な適用範囲の現存のHCV遺伝子型またはサブタイプを有するワクチンが好適である。
遺伝子型1b、1aおよび3aは、(HCV感染個体の中で)最も優勢なHCV遺伝子型であり、従って、考慮することが重要である。他の遺伝子型(例えば、遺伝子型4a)が、それらの優勢および/または重要性を考慮して保持され得る。本発明は、免疫原性が示されており、遺伝子型1b、1aおよび/または遺伝子型3aのコンセンサス配列に存在するすべての選択されたCTLならびにHTLエピトープを含有する。前記コンセンサス配列を図2、5および6に示す。従って、本発明のペプチドは、以下のコンセンサス配列に存在する:
・少なくとも遺伝子型1a、
・少なくとも遺伝子型1b、
・少なくとも遺伝子型3a、
・少なくとも遺伝子型1aおよび1b、
・少なくとも遺伝子型1aおよび3a、
・少なくとも遺伝子型1bおよび3a、または
・少なくとも遺伝子型1a、1bおよび3a。
・少なくとも遺伝子型1a、
・少なくとも遺伝子型1b、
・少なくとも遺伝子型3a、
・少なくとも遺伝子型1aおよび1b、
・少なくとも遺伝子型1aおよび3a、
・少なくとも遺伝子型1bおよび3a、または
・少なくとも遺伝子型1a、1bおよび3a。
本明細書において記載の方法によって得られるエピトープは、異なるHCV株または遺伝子型の間および/または内のそれらの管理に基づいて、さらに評価することができる。
本発明のさらなる工程において、エピトープのアレイは、ワクチンにおける使用のためのポリエピトープ組成物における封入のためか、あるいはワクチンに封入すべきおよび/またはミニ遺伝子のような核酸によってコードされるべき個別のエピトープを選択するために、選択される。該選択を行うために、以下の原理のそれぞれについて、取捨選択することが好ましい:
1)HCVの生来のエピトープまたはアナログのエピトープ(analoged epitope)のいずれかの選択。
2)最も優勢および/または重要なHCV遺伝子型もしくはサブタイプに存在する生来のHCVエピトープの選択。
3)免疫原性との相関関係を確立するのに必要な結合親和性:HLAクラスIについて1000nMもしくはそれ以下のIC50またはKi、あるいはHLAクラスIIについて1000nMもしくはそれ以下のIC50またはKiを有するエピトープを選択する。
4)投与時に、T細胞応答(CTLおよび/またはHTL)を誘導するエピトープを選択する。
5)広範な集団適用範囲を付与するために、十分なスーパーモチーフを所有するペプチドおよび/または十分なアレイのアリル特異的ペプチドを選択する。特定の配列を伴う所定の病原体について、完全なHLA遺伝子座およびその結果として完全な集団を対象範囲として含むような十分な免疫原性エピトープを見出すことはかなり困難である。従って、2もしくは3つのHLAクラスI遺伝子座、即ち、HLA−A、−Bおよび/または−Cについての免疫原性ペプチドを考慮することにより、所定の病原体に対する集団適用範囲が有意に増加する。
6)「ネステッドエピトープ」と称されるエピトープも関連する。ネステッドエピトープは、少なくとも2つのエピトープが、所定のペプチド配列において、部分的または完全に重複する箇所に生じる。ネステッドペプチド配列は、HLAクラスIおよびHLAクラスIIエピトープの両方、2もしくはそれ以上のHLAクラスIエピトープまたは2もしくはそれ以上のHLAクラスIIエピトープを含んでなり得る。
7)例えば、自己抗体を誘導することによって、エピトープ配列が、処置される被験体において病理学的または他の有害な生物学的特性を有さないことを確実にするために、エピトープ配列をスクリーニングする(例えば、哺乳動物のゲノム配列と比較する)ことが重要である。
8)ポリエピトープ組成物において使用する場合、スペーサーアミノ酸残基を導入して、接合部のエピトープ(標的抗原には存在しない免疫系によって認識され、エピトープの人工的並列によってのみ作製されるエピトープ)を回避するか、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによって、エピトープ提示を増強することができる。レシピエントは、生来ではないエピトープに対して免疫応答を生じ得るため、接合部のエピトープは一般に回避される。「優性エピトープ」である接合部エピトープは特に重要である。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減弱または抑制されるような強い応答をもたらし得る。
1)HCVの生来のエピトープまたはアナログのエピトープ(analoged epitope)のいずれかの選択。
2)最も優勢および/または重要なHCV遺伝子型もしくはサブタイプに存在する生来のHCVエピトープの選択。
3)免疫原性との相関関係を確立するのに必要な結合親和性:HLAクラスIについて1000nMもしくはそれ以下のIC50またはKi、あるいはHLAクラスIIについて1000nMもしくはそれ以下のIC50またはKiを有するエピトープを選択する。
4)投与時に、T細胞応答(CTLおよび/またはHTL)を誘導するエピトープを選択する。
5)広範な集団適用範囲を付与するために、十分なスーパーモチーフを所有するペプチドおよび/または十分なアレイのアリル特異的ペプチドを選択する。特定の配列を伴う所定の病原体について、完全なHLA遺伝子座およびその結果として完全な集団を対象範囲として含むような十分な免疫原性エピトープを見出すことはかなり困難である。従って、2もしくは3つのHLAクラスI遺伝子座、即ち、HLA−A、−Bおよび/または−Cについての免疫原性ペプチドを考慮することにより、所定の病原体に対する集団適用範囲が有意に増加する。
6)「ネステッドエピトープ」と称されるエピトープも関連する。ネステッドエピトープは、少なくとも2つのエピトープが、所定のペプチド配列において、部分的または完全に重複する箇所に生じる。ネステッドペプチド配列は、HLAクラスIおよびHLAクラスIIエピトープの両方、2もしくはそれ以上のHLAクラスIエピトープまたは2もしくはそれ以上のHLAクラスIIエピトープを含んでなり得る。
7)例えば、自己抗体を誘導することによって、エピトープ配列が、処置される被験体において病理学的または他の有害な生物学的特性を有さないことを確実にするために、エピトープ配列をスクリーニングする(例えば、哺乳動物のゲノム配列と比較する)ことが重要である。
8)ポリエピトープ組成物において使用する場合、スペーサーアミノ酸残基を導入して、接合部のエピトープ(標的抗原には存在しない免疫系によって認識され、エピトープの人工的並列によってのみ作製されるエピトープ)を回避するか、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによって、エピトープ提示を増強することができる。レシピエントは、生来ではないエピトープに対して免疫応答を生じ得るため、接合部のエピトープは一般に回避される。「優性エピトープ」である接合部エピトープは特に重要である。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減弱または抑制されるような強い応答をもたらし得る。
用語「ペプチド」は、「オリゴペプチド」および「ポリペプチド」と交換可能に使用され、典型的に、隣接するアミノ酸のアミノおよびカルボキシル基の間のペプチド結合によって、一方と他方が接続される一連のアミノ酸を示す。本発明の好適なCTL誘導性ペプチドは、13残基長もしくはそれ以下であり、通常、8、9、10、11または12残基、好ましくは9または10残基からなる。好適なHLAクラスII結合性ペプチドは、50残基長未満であり、通常、6〜30残基の間、より通常は12〜25の間、しばしば、15〜20残基の間からなる。より好適には、HLAクラスII結合性ペプチドは、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25もしくはそれ以上のアミノ酸残基からなる。
本発明のペプチドは、古典的な化学合成によって調製することができる。「合成ペプチド」は、化学合成または組換えDNA技術のような方法を使用して人工的に作製されるペプチドを指す。合成は、均質な溶液または固相において行うことができる。例えば、使用することができる均質な溶液における合成技術は、ホーベンウェイル(Houbenweyl)、書籍の表題「Methode der organischen chemie」(Method of organic chemistry)、編者E.ウンシュ(E.Wunsh)、15−IおよびII巻.THIEME,Stuttgart、1974年によって記載の合成技術である。本発明のポリペプチドはまた、アサトン(Atherton)およびシェパード(Shepard)、彼らの書籍の表題「Solid phase peptide synthesis」(IRL Press,Oxford,1989年)により記載の方法に従って、固相において調製することができる。本発明に従うポリペプチドはまた、以下に記載の組換えDNA技術によって調製することもできる。
保存的置換は、本発明に従うこれらのHCVポリペプチドにおいて導入することができる。本明細書において使用される用語「保存的置換」は、1つのアミノ酸残基が、別の生物学的に類似の残基によって置き換えられていることを表す。保存的置換を有するペプチドは、本来のペプチドに類似の親和性でHLA分子に結合し、本来のペプチドに対して作製されるかあるいは該ペプチドを認識するCTLおよび/またはHTLは、改変されたペプチドを提示する細胞の存在下で活性化される(および/またはその逆)。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンのような1つの疎水性残基の別の残基に対する置換、またはアルギニンおよびリジンの間、グルタミン酸およびアスパラギン酸の間もしくはグルタミンおよびアスパラギンの間などのような1つの極性残基の別の残基に対する置換が挙げられる。前記1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含有するペプチドがなお免疫原性である限り、他の置換を導入することができる。これは、実施例5および6に記載のELISPOTアッセイにおいて分析することができる。従って、本発明はまた、表13および14において開示されるペプチドのアミノ酸配列に少なくとも70、75、80、85もしくは90%同一であるアミノ酸配列からなるペプチドに関し、ここで、前記ペプチドはなおHLAクラスIおよび/またはクラスII拘束性Tリンパ球応答を本来のペプチドを提示する細胞に導入することが可能である。
異なるHLAタイプ間または所定のスーパーモチーフもしくはアリル内のペプチドの交差反応性を改善するためのストラテジーは、ペプチド内に存在する1つもしくはそれ以上の有害な残基を欠失し、ペプチドのT細胞認識に影響を及ぼしてはならないAlaのような小さな「中性の」残基を置換することである。そのような改善されたペプチドは、時々、アナログのペプチド(Analoged peptide)と称される。
ペプチドは、それらの天然(非荷電)形態あるいは塩である形態であり得、グリコシル化、側鎖酸化、もしくはリン酸化のような修飾がないかまたはこれらの修飾を含有するかのいずれかである。グリコシル単位のようなアミノ酸側鎖、脂質、またはリン酸のような無機イオンに付着したさらなる置換基によって修飾されたペプチド、ならびにスルフヒドリル基の酸化のような鎖の化学的変換に関する修飾もまた定義に含まれる。従って、「ポリペプチド」またはその等価な用語は、言及される適切なアミノ酸配列を含むことを意図し、その機能性が破壊されない限り、上記の修飾のそれらに供され得る。
特にアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識、あるいはT細胞に関して、T細胞受容体タンパク質および/または主要組織適合性複合体(MHC)分子による認識に必要なそれらの残基に関与するアミノ酸残基の組である。免疫系の設定では、インビボまたはインビトロ、エピトープは、一次、二次および三次ペプチド構造、ならびに電荷のような分子の集合的特徴であって、共に、免疫グロブリン、T細胞受容体またはHLA分子によって認識される部位を形成する。本明細書全体を通して、「エピトープ」および「ペプチド」は、交換可能に使用される。
語句「単離された」または「生物学的に純粋な」は、それがその生来の状態において見出される場合、通常、材料に伴う成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。従って、本発明の単離されたペプチドは、好ましくは、それらのインサイチュでの環境において、通常、ペプチドに関連する材料を含有しない。「単離された」エピトープは、エピトープが誘導された抗原またはポリペプチドの配列全体を含まないエピトープを指す。
本発明のエピトープならびにさらなるアミノ酸を含んでなるタンパク質またはペプチド分子もなお、本発明の範囲内にあることを理解すべきである。
「免疫原性ペプチド」は、ペプチドがHLA分子に結合し、CTLおよび/またはHTL応答を誘導するように、表13および/または14において開示される配列、あるいはアリル特異的モチーフもしくはスーパーモチーフを含んでなるペプチドを含んでなるペプチドである。本発明の免疫原性ペプチドは、適切なHLA分子に結合することが可能なペプチドを含んでなり、免疫原性ペプチドは、免疫原性ペプチドが誘導される抗原に対するHLA拘束性細胞障害性および/またはヘルパーT細胞応答を誘導することができる。CTL応答は、MHC−Iに関して免疫原性ペプチドを提示する細胞によって活性化されるT細胞の異なる生物学的応答の組であり、細胞の細胞障害性、IFN−ガンマ産生および増殖を含むが、これらに限定されない。HTL応答は、MHC−IIに関して免疫原性ペプチドを提示するAPCによって活性化されるT細胞の異なる生物学的応答の組であり、(IFN−ガンマまたはIL−4のような)サイトカイン産生および増殖を含むが、これらに限定されない。本発明の好適な実施形態では、免疫原性ペプチドは、50未満のアミノ酸残基からなる。さらにより詳細には、免疫原性ペプチドは、45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10または9未満のアミノ酸残基からなる。
セッテ(Sette)およびシドニー(Sidney)(1999年)(本明細書において参照により援用される)は、ワクチン開発のためのエピトープアプローチについて記載しており、それぞれが、いくらかの異なるHLAアリルに結合するペプチドリガンドの能力に対応するいくらかのHLAスーパーモチーフを同定した。特定のHLAスーパーモチーフを所有するペプチドに結合するHLAアリル変異体は、集合的にHLAスーパータイプと称される。
「スーパーモチーフ」は、2つもしくはそれ以上のHLAアリルによってコードされるHLA分子により共有される特異性に結合するペプチドである。好ましくは、スーパーモチーフを所有するペプチドは、2つもしくはそれ以上のHLA抗原によって、(本明細書に規定されるような)高いまたは中等度の親和性で認識される。用語「モチーフ」は、規定の長さのペプチド、通常、クラスI HLAモチーフに対する8、9、10、11、12もしくは13アミノ酸のペプチドおよびクラスII HLAモチーフに対する約6〜約50アミノ酸、またはより具体的には、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、24、25、30、35、40もしくは50アミノ酸のペプチドにおける残基のパターンを指し、特定のHLA分子によって認識される。
ALスーパーモチーフに結合するHLA分子のファミリー(即ち、HLA−ALスーパータイプ)は、少なくともA0101、A2601、A2602、A2501およびA3201を含む。A2スーパーモチーフに結合するHLA分子のファミリー(即ち、HLA−A2スーパータイプ)は、少なくとも:A0201、A0202、A0203、A0204、A0205、A0206、A0207、A0209、A0214、A6802およびA6901からなる。
A3スーパーモチーフに結合するHLA分子のファミリー(HLA−A3スーパータイプ)のメンバーは、少なくともA0301、A1101、A3101、A3301およびA6801を含む。A24スーパーモチーフに結合するHLA分子のファミリー(即ち、A24スーパータイプ)は、少なくともA2402、A3001およびA2301を含む。B7スーパーモチーフに結合するHLA分子のファミリー(即ち、HLA−B7スーパータイプ)は:B0702、B0703、B0704、B0705、B1508、B3501、B3502、B3503、B3504、B3505、B3506、B3507、B3508、B5101、B5102、B5103、B5104、B5105、B5301、B5401、B5501、B5502、B5601、B5602、B6701およびB7801を含む少なくとも26種のHLA−Bタンパク質からなる。B44スーパーモチーフに結合するHLA分子のファミリー(即ち、B44スーパータイプ)のメンバーは、少なくとも:B1801、B1802、B3701、B4001、B4002、B4006、B4402、B4403およびB4006を含む(国際公開第01/21189号パンフレット)。
好適な実施形態に従えば、本発明の免疫原性ペプチドは、50未満、25未満、20未満または15未満のアミノ酸である。ペプチドモチーフは、典型的に、各ヒトHLAアリルによってコードされるタンパク質ごとに異なり、一次および二次アンカー残基のパターンが異なる。
「交差反応結合性」は、ペプチドが、2以上のHLAアリル群または遺伝子座から誘導される2以上のHLA分子によって結合されることを示し;同義語は縮重結合性である。
「ヒト白血球抗原」または「HLA」はヒトクラスIまたはクラスII主要組織適合性複合体である(例えば、スティッテス(Stites)ら、IMMUNOLOGY、第8版、Lange Publishing,Los Altos、カリフォルニア州(1994年)を参照のこと)。「主要組織適合性複合体」または「MHC」は、生理学的免疫応答を担う細胞相互作用の制御において役割を果たす遺伝子のクラスターである。ヒトでは、MHC複合体もまた、HLA複合体として公知である。MHCおよびHLA複合体の詳細な説明については、ポール(Paul)、FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY,PDED,Raven Press、ニューヨーク、1993年を参照のこと。本明細書において使用したHLAの命名法は、一般に、当該分野において公知であり、例えば、「The HLA Factsbook、マーシュ(Marsh)ら編、Academic Press、2000年」に記載されている。
また、HLA配列に関する情報および現在使用されている命名法については、http://www.anthonynolan.org.uk/HIG/において見出すことができる。
ポリエピトープペプチド
本発明はまた、HCV免疫原性組成物の調製のための本明細書に記載のペプチドの使用、より具体的には、おそらく、1つもしくはそれ以上の同じまたは他のペプチドあるいはエピトープと組み合わされた表13〜14において提供される少なくとも1つのペプチドを含んでなる組成物に関する。本発明のペプチドは、ポリマー(マルチマー)を形成するために連結を介して組み合わせることができるか、または混合物として、連結を伴わずに、組成物において処方することができる。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、ポリエピトープペプチドとして、連結され得る。ポリエピトープペプチドにおける異なるペプチドの連結ため、全体のアミノ酸配列は、天然に存在する配列とは異なる。しかし、本発明のポリエピトープペプチド配列は、天然には存在しない配列である。従って、本発明は、表13および14において開示されるペプチドから選択される少なくとも1つのペプチドを含んでなる組成物またはポリエピトープペプチドに関する。KiまたはIC50<1000nMを伴うペプチドは特に興味深い。より好ましくは、目的のペプチドは、本明細書に記載のストラテジーによる評価後、ポジティブな免疫原性を有するこれらのペプチドである。以下によって同定されるHLAクラスI結合性ペプチドが特に好適である:
・HLA−Aについて:配列番号557、1241、1456、1478、1833、1887、67、922、66、361、1070、1072、1151、71、1233、1269、75、73、1396、5、87、91、238、265、1661、1753、76、81、92、1933、1934、69、2043、2047、74、63、2053、83、56、155、156、1205、1206、167、1350、47、146、1609、144、3、39、158、16、122、1034、1095、1096、1150、246、1406、23、1483、1512、87、93、1625、1626、59、1710、250、81、1885、1916、1938、2048、271、2083、1、877、17、7、1086、1087、1468、1700および1894;
・HLA−Bについて:配列番号402、836、381、371、853、370、387、307、1237、1289、1343、1418、1419、375、1430、380、450、1582、390、1677、1687、121、386、372、95、443、396、455、1441、436、1719、92、394、1969、287、1237、1289、375、1430、1444、582、1117および59;
・HLA−Cについて:配列番号1048、1095、1730、349、475、111、2066、1511、1454、1100および907。
本発明はまた、HCV免疫原性組成物の調製のための本明細書に記載のペプチドの使用、より具体的には、おそらく、1つもしくはそれ以上の同じまたは他のペプチドあるいはエピトープと組み合わされた表13〜14において提供される少なくとも1つのペプチドを含んでなる組成物に関する。本発明のペプチドは、ポリマー(マルチマー)を形成するために連結を介して組み合わせることができるか、または混合物として、連結を伴わずに、組成物において処方することができる。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、ポリエピトープペプチドとして、連結され得る。ポリエピトープペプチドにおける異なるペプチドの連結ため、全体のアミノ酸配列は、天然に存在する配列とは異なる。しかし、本発明のポリエピトープペプチド配列は、天然には存在しない配列である。従って、本発明は、表13および14において開示されるペプチドから選択される少なくとも1つのペプチドを含んでなる組成物またはポリエピトープペプチドに関する。KiまたはIC50<1000nMを伴うペプチドは特に興味深い。より好ましくは、目的のペプチドは、本明細書に記載のストラテジーによる評価後、ポジティブな免疫原性を有するこれらのペプチドである。以下によって同定されるHLAクラスI結合性ペプチドが特に好適である:
・HLA−Aについて:配列番号557、1241、1456、1478、1833、1887、67、922、66、361、1070、1072、1151、71、1233、1269、75、73、1396、5、87、91、238、265、1661、1753、76、81、92、1933、1934、69、2043、2047、74、63、2053、83、56、155、156、1205、1206、167、1350、47、146、1609、144、3、39、158、16、122、1034、1095、1096、1150、246、1406、23、1483、1512、87、93、1625、1626、59、1710、250、81、1885、1916、1938、2048、271、2083、1、877、17、7、1086、1087、1468、1700および1894;
・HLA−Bについて:配列番号402、836、381、371、853、370、387、307、1237、1289、1343、1418、1419、375、1430、380、450、1582、390、1677、1687、121、386、372、95、443、396、455、1441、436、1719、92、394、1969、287、1237、1289、375、1430、1444、582、1117および59;
・HLA−Cについて:配列番号1048、1095、1730、349、475、111、2066、1511、1454、1100および907。
好適なHLAクラスII結合性ペプチドは、配列番号2142、2213、2157、2245、2162、2164、2235、2113、2182、2111、2180、2236、2112、2132、2192、2107、2137、2125、2229、2166、2136、2177、2153、2110、2156、2241、2228、2219、2187、2249、2194、2207および2237によって同定されるIC50<500nMを伴うペプチドである。
特に好適なHLAクラスIIペプチドは、配列番号2235、2164、2162、2113、2182、2180、2236、2149、2112、2201、2249、2158、2108、2107、2229、2194、2156、2228、2207および2232によって同定される。
より好ましくは、組成物またはポリエピトープペプチドは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60またはそれ以上のペプチドを含んでなる。好ましくは、ペプチドは、表13および14から選択される。任意の組み合わせのペプチドが可能であり、例えば、組成物は、少なくとも1つのHLA−A結合性ペプチドおよび少なくとも1つのHLA−BまたはHLA−C結合性ペプチドを含んでなることができる。さらに、組成物はまた、少なくとも1つのHLA−B結合性ペプチドおよび少なくとも1つのHLA−C結合性ペプチドを含んでなることができる。より具体的には、組成物は、少なくとも1つのHLA−A、少なくとも1つのHLA−Bおよび少なくとも1つのHLA−C結合性ペプチドを含んでなる。好適な実施形態において、ポリエピトープペプチドまたは組成物は、HCVタンパク質から誘導され、HLAクラスIおよび/またはクラスII拘束性Tリンパ球応答を誘導することが可能な少なくとも2つのペプチドを含んでなり、ここで、少なくとも1つのペプチドはHLA−C結合性ペプチドである。さらなる実施形態において、組成物は、好ましくは表14から選択される少なくとも2つのHLA−DRB結合性ペプチドを含んでなる。
「HLA−A結合性ペプチド」は、HLA−A遺伝子座の少なくとも1つの分子に結合することが可能なペプチドとして規定される。前記規定は、他の遺伝子座、即ち、HLA−B、HLA−C、HLA−DRB1−9などにも当てはめることができる。
特に、本発明のエピトープは、HLA群拘束性ポリエピトープと組み合わせることができる。用語「HLA群拘束性ポリエピトープ」は、同じHLAグループのアリルまたは分子に結合する少なくとも2つのエピトープを含んでなるポリエピトープペプチドを指す。本明細書において使用したHLAの命名法は、一般に、当該分野において公知であり、例えば、「The HLA Factsbook、マーシュ(Marsh)ら編、ACademic press,2000年」に記載されている。好適な実施形態では、HLA群拘束性ポリエピトープは、HLA−A01拘束性ポリエピトープ、HLA−A02拘束性ポリエピトープ、HLA−A03拘束性ポリエピトープ、HLA−A11拘束性ポリエピトープ、HLA−A24拘束性ポリエピトープ、HLA−B07拘束性ポリエピトープ、HLA−B08拘束性ポリエピトープ、HLA−B35拘束性ポリエピトープ、HLA−B40拘束性ポリエピトープ、HLA−B44拘束性ポリエピトープ、HLA−Cw03拘束性ポリエピトープ、HLA−Cw04拘束性ポリエピトープ、HLA−Cw06拘束性ポリエピトープ、HLA−Cw07拘束性ポリエピトープ、HLA−DRB1*01拘束性ポリエピトープ、HLA−DRB1*03拘束性ポリエピトープまたはHLA−DRB1*04拘束性ポリエピトープである。
HLA群拘束性ポリエピトープにおけるエピトープの数に制限はなく、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25もしくはそれ以上であり得る。HLA群拘束性ポリエピトープは、構築物におけるエピトープのサブセットの免疫原性を確立する第1の相において使用することができる。そのようなHLA群拘束性ポリエピトープを使用する利点は、かなりの数のHLA拘束性エピトープを、1つおよび同じ構築物において評価することができることである。さらに、処置を所望にあわせて変更するために、2以上のHLA群拘束性ポリエピトープの特定の選択を行うことができる。具体的には、選択は、所定のHLA遺伝子座(または2、3もしくはそれ以上のHLA遺伝子座を含む)内の2以上のHLA群拘束性ポリエピトープを含んでなることができる。
より詳細には、本明細書に記載の組成物は、連続であるか、あるいはリンカーまたはスペーサーアミノ酸もしくはスペーサーペプチドによって分離されている連結されたペプチドを含んでなる。これは、ポリエピトープまたはマルチエピトープペプチドと称される。
「連結」または「接合」は、ペプチドを(直接またはリンカーを介して)機能的に接続するための当該分野において公知の任意の方法を指し、組換え融合、共有結合、非共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、高分子化、環化、静電的結合および中央リンカーまたはキャリアを介する接続を含むがこれらに限定されない。高分子化は、例えば、日常的な方法論を使用して、グルタルアルデヒドとリジン残基の−NH2基との間の反応によって、達成することができる。ペプチドはまた、中央キャリア、例えば、ポリリジンコア樹脂への直接的な所望されるペプチドの合成を介して、分岐した構造として連結させてもよい。
このより大きな、好ましくは、ポリもしくはマルチエピトープペプチドを、合成的、組換え的、または生来の供給源由来の切断を介して、作製することができる。
ポリエピトープペプチドは、複数コピーの同じペプチドを含んでなるホモポリマー、または多様なペプチドのヘテロポリマーとして存在することができる。ポリマーは、免疫反応の増加、ならびに、ポリマーを作製するために異なるペプチドエピトープを使用する場合、免疫応答について標的化される病原性生物体の異なる抗原決定基と反応する抗体、HTLおよび/またはCTLを誘導するさらなる能力の利点を有する。多エピトープ構築物は、例えば、イシオカ(Ishioka)ら、1999年;フェルダース(Velders)ら、2001年;または国際公開第04/031210号パンフレット−Epimmuneに記載の方法に従って、調製することができる。ポリエピトープペプチドは、1つのタンパク質として、発現させることができる。細菌、真核細胞(酵母を含む)またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)、Vero細胞、RK13、COS1、BHK、およびMDCK細胞のような培養された脊椎動物宿主、もしくは昆虫細胞のような無脊椎宿主においてポリエピトープペプチドの発現を行うために、以下の工程が行われる:
・組換えベクター、またはアデノウイルス、インフルエンザウイルス、BCG、および他の任意の生体キャリアシステムによる適切な細胞宿主の形質転換であって、ここで、本発明のポリペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列は、適切な調節エレメント、特に、細胞宿主もしくは生体キャリアシステムのポリメラーゼによって認識されるプロモーター、および真核宿主の場合、前記ヌクレオチド配列の前記細胞宿主において発現を可能にする適切なリボゾーム結合部位(RBS)の制御下で挿入される。
・前記挿入物の発現を可能にする条件下での前記形質転換された細胞宿主の培養。
・組換えベクター、またはアデノウイルス、インフルエンザウイルス、BCG、および他の任意の生体キャリアシステムによる適切な細胞宿主の形質転換であって、ここで、本発明のポリペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列は、適切な調節エレメント、特に、細胞宿主もしくは生体キャリアシステムのポリメラーゼによって認識されるプロモーター、および真核宿主の場合、前記ヌクレオチド配列の前記細胞宿主において発現を可能にする適切なリボゾーム結合部位(RBS)の制御下で挿入される。
・前記挿入物の発現を可能にする条件下での前記形質転換された細胞宿主の培養。
ポリエピトープペプチドは、当業者に周知の方法によって精製することができる。
広範な集団適用範囲を有するワクチンは、より商業的に存続可能であり、最も多くの人々に適用可能であるため、好適である。広範な集団適用範囲は、総合的に考慮する場合、集団の最も多くの個体において存在するHLAアリルに結合するペプチドを選択することを介して、得ることができる。A2−、A3−、およびB7スーパータイプは、5つの主要な民族群、即ち、白人、北アメリカ黒人、日本人、中国人およびヒスパニック人のそれぞれにおいて、40%を超える平均で、それぞれ存在する。80%を超える適用範囲は、これらのスーパーモチーフの組み合わせによって達成される。B44−、AL−、およびA24−スーパータイプは、これらの主要民族集団において、平均で25%〜40%の範囲で存在する。HLA群Cw04、Cw03、Cw06およびCw07は、これらの主要民族集団において、平均で13%〜54%の範囲で存在する。従って、最も頻度の高いHLA−A、−Bおよび/または−Cアリル由来のエピトープを含むことによって、90〜99%の平均集団適用範囲が、5つの主要な民族群について得られる。特に、HLA−Cの領域では、HCVエピトープについての実験的に決定されたデータ(結合性および免疫原性の両方)が乏しい。従って、本発明は、HCVタンパク質から誘導され、HLAクラスIおよび/またはクラスII拘束性Tリンパ球応答を誘導することが可能な少なくとも2つのペプチドを含んでなる組成物またはポリエピトープペプチドであって、ここで、少なくとも1つのペプチドはHLA−C結合性ペプチドである、上記組成物またはポリエピトープペプチドに関する。より好適には、前記組成物またはポリエピトープペプチドは、少なくとも2、3、4、5もしくはそれ以上のHLA−C結合性ペプチドを含んでなる。より詳細には、1つもしくはそれ以上のHLA−C結合性ペプチドは、次のHCV領域:Core、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bの少なくとも1つから誘導される。HLA−C結合性ペプチドは、遺伝子型1a、1bおよび/または3AのHCVコンセンサス配列に存在することをさらに特徴とすることがさらにより好適である。場合により、組成物またはポリエピトープペプチドは、少なくとも1、2、3、4もしくはそれ以上のHLA−B結合性ペプチドおよび/または少なくとも1、2、3、4もしくはそれ以上のHLA−A結合性ペプチドおよび/または少なくとも1、2、3、4もしくはそれ以上のHLA−DRB1−9結合性ペプチドをさらに含んでなることができる。より好適には、本発明の組成物またはポリエピトープペプチドは、場合により、HLAクラスII結合性ペプチドと組み合わせて、少なくとも1、2、3、4もしくはそれ以上のHLA−A結合性ペプチド、少なくとも1、2、3、4もしくはそれ以上のHLA−B結合性ペプチドおよび少なくとも1、2、3、4もしくはそれ以上のHLA−C結合性ペプチドを含んでなる。特定の実施形態において、ペプチドは、表13または14から選択される。
さらに、本発明は、表13および14から選択される少なくとも1つのペプチドならびに少なくとも1つの他のHLAクラスI結合性ペプチド、HLAクラスII結合性ペプチドまたはHCV由来のペプチドを含んでなる組成物に関する。本発明のペプチドと組み合わせて使用すべき前記「他の」HLAクラスI結合性ペプチドおよび前記HLAクラスII結合性ペプチドは、HCVまたは外来性抗原もしくは生物体(非HCV)から誘導され得る。前記他のペプチドには長さに制限はなく、これらは、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30もしくはそれ以上のアミノ酸の長さを有することができる。「少なくとも1つ」は、例えば、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100もしくはそれ以上のペプチドを含むことができる。好ましくは、前記HLAクラスI結合性ペプチドは、1つもしくはそれ以上のHLAクラスIアレルに結合することが可能なペプチドである。より具体的には、前記ペプチドは、次のHLA群:HLA−A1、HLA−A2、HLA−A3、HLA−A11、HLA−A24、HLA−B7、HLA−B8、HLA−B27、HLA−B35、HLA−B40、HLA−B44、HLA−B58、HLA−B62、HLA−Cw03、HLA−Cw04、HLA−Cw06および/またはHLA−Cw07の分子に結合するペプチドからなる群から選択される。
HLAクラスIIについて、HTLエピトープとも呼ばれるペプチドはまた、好ましくは、HLA遺伝子座HLA−DR、HLA−DQおよび/またはHLA−DPの分子に結合するペプチド、あるいは例えば、国際公開第95/27733号パンフレット、国際公開第02/26785号パンフレット、国際公開第01/21189号パンフレット、国際公開第02/23770号パンフレット、国際公開第03/084988号パンフレット、国際公開第04/024182号パンフレット、ホフマン(Hoffmann)ら、1995年、ディェポルダー(Diepolder)ら、1997年、ヴェルハイマー(Werheimer)ら、2003年ならびにラモナカ(Lamonaca)ら、1999年(本明細書において参照により援用される)に記載のペプチドからなる群から選択される。好適なHLAクラスII結合性ペプチドは、約50残基長未満であり、通常、約6〜約30残基の間、より通常は約12〜25の間、しばしば、約15〜20残基の間からなる。例えば、HLAクラスII結合性ペプチドは、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25もしくはそれ以上のアミノ酸残基からなる。ワクチンにおける使用のため、あるいはワクチンに封入すべきおよび/またはミニ遺伝子のような核酸によってコードされるべき個別のエピトープを選択するためのポリエピトープ構築物に封入するための候補HTLエピトープのさらなるかつ好適な例を、表14に開示する。
「CTL誘導性ペプチド」は、CTL応答を誘導することが可能なHLAクラスI結合性ペプチドである。「HTL誘導性ペプチド」は、HTL応答を誘導することが可能なHLAクラスII結合性ペプチドである。
特定の実施形態において、本発明は、表13から選択される少なくとも2つのHLAクラスI結合性ペプチドもしくは表14から選択される少なくとも2つのHLAクラスII結合性ペプチドを含んでなる組成物またはポリエピトープペプチドに関する。任意の組み合わせが可能である。より好適には、同じまたは異なるHLA遺伝子座、即ち、HLA−A、−B、−CもしくはDRB1から誘導されるHLA分子に結合するための少なくとも2つのペプチドが選択される。あるいは、同じまたは異なるHLA群から誘導されるHLA分子に結合するための少なくとも2つのペプチドが選択される。好適なHLA群は:HLA−A01、A02、A03、A11、A24、B07、B08、B35、B40、B44、Cw03、Cw04、Cw06、Cw07、DRB1*01、DRB1*03およびDRB1*04である。
より好適な実施形態において、本発明は、表13から選択される少なくとも3つのHLAクラスI結合性ペプチドを含んでなる組成物またはポリエピトープペプチドに関する。例えば、以下のような任意の組み合わせが可能である:
・少なくとも3つのHLA−A結合性ペプチド、
・少なくとも3つのHLA−B結合性ペプチド、
・少なくとも3つのHLA−C結合性ペプチド、
・少なくとも2つのHLA−A結合性ペプチドおよび少なくとも1つのHLA−BもしくはHLA−C結合性ペプチド、
・少なくとも2つのHLA−B結合性ペプチドおよび少なくとも1つのHLA−AもしくはHLA−C結合性ペプチド、
・少なくとも2つのHLA−C結合性ペプチドおよび少なくとも1つのHLA−AもしくはHLA−B結合性ペプチド、または
・少なくとも1つのHLA−A、少なくとも1つのHLA−Bおよび少なくとも1つのHLA−C結合性ペプチド。
・少なくとも3つのHLA−A結合性ペプチド、
・少なくとも3つのHLA−B結合性ペプチド、
・少なくとも3つのHLA−C結合性ペプチド、
・少なくとも2つのHLA−A結合性ペプチドおよび少なくとも1つのHLA−BもしくはHLA−C結合性ペプチド、
・少なくとも2つのHLA−B結合性ペプチドおよび少なくとも1つのHLA−AもしくはHLA−C結合性ペプチド、
・少なくとも2つのHLA−C結合性ペプチドおよび少なくとも1つのHLA−AもしくはHLA−B結合性ペプチド、または
・少なくとも1つのHLA−A、少なくとも1つのHLA−Bおよび少なくとも1つのHLA−C結合性ペプチド。
より好適には、各組み合わせについて、同じまたは異なるHLA群から誘導されるHLA分子に結合するための少なくとも3つのペプチドが選択される。好適なHLA群は:HLA−A01、A02、A03、A11、A24、B07、B08、B35、B40、B44、Cw03、Cw04、Cw06およびCw07である。
より具体的には、組成物またはポリエピトープペプチドは、表13から選択される少なくとも3つのペプチドを含んでなり、前記少なくとも3つのペプチドは以下のとおりである:
・結合性ペプチドであるHLA−A01、A02、A3、A11もしくはA24から選択される少なくとも1つのHLA−A結合性ペプチド、
・結合性ペプチドであるHLA−B07、B08、B35、B40もしくはB44から選択される少なくとも1つのHLA−B結合性ペプチド、および/または
・結合性ペプチドであるHLA−Cw03、Cw04、Cw06またはCw07から選択される少なくとも1つのHLA−C結合性ペプチド。
・結合性ペプチドであるHLA−A01、A02、A3、A11もしくはA24から選択される少なくとも1つのHLA−A結合性ペプチド、
・結合性ペプチドであるHLA−B07、B08、B35、B40もしくはB44から選択される少なくとも1つのHLA−B結合性ペプチド、および/または
・結合性ペプチドであるHLA−Cw03、Cw04、Cw06またはCw07から選択される少なくとも1つのHLA−C結合性ペプチド。
HLA−A01結合性ペプチドは、HLA−01型の少なくとも1つの分子に結合することが可能なペプチドとして規定される。前記規定は、他のアレル群、即ち、A02、A03、A11、A24、B07、B08、B35、B40、B44、Cw03、Cw04、Cw06、Cw07などにも当てはめることができる。
本発明のHLAクラスI結合性ペプチドを、HLAクラスII結合性ペプチドと混合し、連結させ、細胞障害性Tリンパ球およびヘルパーTリンパ球の両方の活性化を容易にすることができる。従って、本発明の組成物またはポリエピトープペプチドは、少なくとも1つのHLAクラスII結合性ペプチドをさらに含んでなる。従って、本発明の組成物またはポリエピトープペプチドは、少なくとも1つのHLAクラスII結合性ペプチドを含んでなる。より具体的には、前記HLAクラスII結合性ペプチドは、表14から選択される。HTLエピトープの量は制限されず、即ち、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25もしくはそれ以上である。HTLエピトープは、本発明の組成物またはポリエピトープペプチドを含み得る。特定の実施形態において、組成物またはポリエピトープペプチドは、表13から選択される少なくとも3つのCTLペプチドおよび表14から選択される少なくとも1つのHTLペプチドを含んでなる。
さらなる実施形態において、組成物またはポリエピトープペプチドもまた、PADRE(登録商標)(Epimmune,San Diego;例えば、米国特許第5736142号明細書または国際公開第95/07707号パンフレット(本明細書において参照により援用される)に記載されている)と呼ばれる普遍的T細胞エピトープを含んでなることができる。「PanDR結合性ペプチドまたはPADRE(登録商標)ペプチド」は、2以上のHLAクラスII DR分子に結合する分子のファミリーのメンバーである。PADRE(登録商標)ファミリーの分子を規定するパターンは、HLAクラスIIスーパーモチーフとみなすことができる。PADRE(登録商標)は、ほとんどのHLA−DR分子に結合し、インビトロおよびインビボでヒトヘルパーTリンパ球(HTL)応答を刺激する。あるいは、Tヘルプエピトープ(T−help epitope)は、破傷風トキソイド(tetanos toxoid)のような普遍的に使用されるワクチンであり得る。
さらなる実施形態において、組成物またはポリエピトープペプチドにおけるペプチドは、HCVタンパク質、より具体的には、次のCore、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bからなる群から選択されるHCV領域の少なくとも1つから誘導されることを特徴とする。ペプチドは、遺伝子型1a、1bおよび/または3aのHCVコンセンサス配列に存在することを特徴とすることがさらにより好適である。
さらなる実施形態において、ポリエピトープペプチドにおける2つもしくはそれ以上のエピトープは、個別のHCVアミノ酸配列(個別のエピトープ)またはネステッドHCVアミノ酸配列(ネステッドエピトープ)からなる。「ネステッドエピトープ」は特に好適である。ネステッドエピトープは、少なくとも2つの個体または個別のエピトープが、所定のペプチド配列において、部分的または完全に重複する箇所に生じる。ネステッドエピトープは、HLAクラスIおよびHLAクラスIIエピトープの両方、2つもしくはそれ以上のHLAクラスIエピトープ(ここで、エピトープは、クラスI遺伝子座、スーパータイプまたは群の2つもしくはそれ以上のアリルに結合する)、あるいは2つもしくはそれ以上のHLAクラスIIエピトープ(ここで、エピトープは、クラスII遺伝子座、スーパータイプまたは群の2つもしくはそれ以上のアリルに結合する)を含んでなることができる。ネステッドエピトープは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25もしくはそれ以上の個々のエピトープを含んでなることができる。ネステッドエピトープは、それらが制限された数のアミノ酸によって、多数のエピトープを提供するため、広範な集団適用範囲を伴うエピトープに基づくワクチンを可能にする。ワクチンのエピトープの数は、製造、処方および製品安定性から生じる制約によって制限されるため、このことは特に有利である。ネステッドエピトープの長さは、含まれる個々のエピトープの量に従って変動する。通常、ネステッドエピトープは9〜35アミノ酸からなる。好ましくは、ネステッドエピトープは、35アミノ酸もしくはそれ以下、即ち、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10または9アミノ酸からなる。より好適には、ネステッドエピトープは、9〜30アミノ酸、9〜25アミノ酸、10〜30アミノ酸または10〜25アミノ酸からなる。
本発明において同定される3もしくはそれ以上の個々のエピトープに基づき、ここで、個々のエピトープは、所定のHLAに対し、1000nM未満の結合親和性を有するネステッドエピトープの例を、表Aに示す。前記個々のエピトープは、少なくとも3アミノ酸の重複を有する。
従って、本発明は、9〜35アミノ酸よりなり、表13および14から選択される少なくとも2つのエピトープを含んでなるネステッドエピトープを包含する。より具体的には、ネステッドエピトープは、表Aに示される2つもしくはそれ以上の個々のエピトープを含んでなる。より好適には、ネステッドエピトープは、表13および14から選択される3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25もしくはそれ以上のエピトープを含んでなる。そのようなネステッドエピトープの例を、表Aに示す。従って、本発明は、9〜35アミノ酸よりなり、配列番号2254〜2278、もしくはその一部からなる群から選択されるネステッドエピトープに関し、ネステッドエピトープあるいはその一部は、少なくとも2つの個々のCTLおよび/またはHTLエピトープを含んでなることを特徴とする。より好適には、前記ネステッドエピトープまたはその一部は、少なくとも表Aにおいて提示される3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25もしくはそれ以上の個々のCTLおよび/またはHTLエピトープを含んでなる。
本発明におけるネステッドエピトープの適用、即ち、可能な組み合わせ、修飾、組成物、キット、治療および診断的用途は、本発明の(ポリエピトープ)ペプチドについて記載のものと同じである。
好適な実施形態では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも1つのネステッドエピトープまたはそのフラグメントを含んでなるポリエピトープペプチドに関する。
ペプチドまたはポリペプチドまたはポリエピトープペプチドは、場合により、脂質化(例えば、脂質に接合されたペプチド)、標的化または他の配列の付加などによって、修飾することができる。
本明細書に記載のHCVペプチドにおいて、前記ペプチドに含まれる1つのシステイン残基、または2もしくはそれ以上のシステイン残基を、「可逆的あるいは不可逆的にブロック」してもよい。
「不可逆的にブロックされたシステイン」は、システインチオール基が化学的手段によって不可逆的に保護されるシステインである。特に、化学的手段による「不可逆的保護」または「不可逆的ブロッキング」は、アルキル化、好ましくは、例えば、活性ハロゲン、エチレンイミン(ethylenimine)もしくはN−(ヨードエチル)トリフルオロ−アセトアミドのようなアルキル化剤によるタンパク質におけるシステインのアルキル化を指す。これに関して、システインチオール基のアルキル化は、(CH2)NR[式中、nは0、1、2、3もしくは4であり、R=H、COOH、NH2、CONH2、フェニル、またはそれらの任意の誘導体である]によるチオール−水素の置き換えを指すことを理解すべきである。アルキル化は、例えば、活性ハロゲン(X(CH2)NR[式中、Xは、I、Br、ClまたはFのようなハロゲンである]のような当該分野において公知の任意の方法によって、実施することができる。活性ハロゲンの例には、ヨウ化メチル、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、および2−ブロモエチルアミンがある。
「可逆的にブロックされたシステイン」は、システインチオール基が可逆的に保護されるシステインである。特に、本明細書において使用される用語「可逆的保護」または「可逆的ブロッキング」は、システインチオール基への修飾剤の共有結合、ならびにシステインチオール基の還元状態を保持する(遮蔽)ようなタンパク質環境を操作することを考慮する。システインチオール基の可逆的保護は、化学的または酵素的に行うことができる。本明細書において使用する用語「酵素的手段による可逆的保護」は、例えば、アシルトランスフェラーゼ、例えば、パルミトイルアシルトランスフェラーゼのようなチオエステル化を触媒することに関与するアシルトランスフェラーゼのような酵素によって仲介される可逆的保護を考慮する。本明細書において使用する用語「化学的手段による可逆的保護」は、以下による可逆的保護を考慮する:
1.例えば、スルフォン化およびチオエステル化などによってシステイニルを修飾する修飾剤によって;
2.例えば、重金属、特にZN2+、CD2+、モノ−、ジチオ−ならびにジスルフィド−化合物(例えば、アリール−およびアルキルメタンチオスルホネート、ジチオピリジン、ジチオモルホリン、ジヒドロリポアミド、Ellmann試薬、aldrothioltM(アルドリッチ)(レイン(Rein)ら1996年)、ジチオカルバメート)、またはチオール化剤(例えば、グルタチオン(gluthathion)、N−アセチルシステイン、システインアミン)によるような本発明のシステイニルを可逆的に修飾する修飾剤によって。ジチオカルバメートは、R1R2NC(S)SR3官能基を所有する広範なクラスの分子を含んでなり、それらに、スルフヒドリル(sulphydryl)基と反応する能力を付与する。チオール含有化合物は、好ましくは、0.1〜50mMの濃度、より好ましくは、1〜50mMの濃度、さらにより好ましくは、10〜50mMの濃度で使用される;
3.チオールの状態を保存する(安定化する)修飾剤、特に、10μM〜10mMの濃度範囲、より好ましくは、1〜10mMの濃度での例えば、DTT、ジヒドロアスコルビン酸(dihydroascorbate)、ビタミンおよび誘導体、マンニトール、アミノ酸、ペプチドおよび誘導体(例えば、ヒスチジン、エルゴチオネイン、カルノシン、メチオニン)、没食子酸、ヒドロキシアニソール、ヒドロキシトルエン、ヒドロキノン、ヒドロキシメチルフェノールおよびそれらの誘導体のような抗酸化剤(antioxidantia)の存在によって;
4.例えば、(I)金属イオン(ZN2+、MG2+)、ATPとしての補因子、(II)PHの制御(例えば、タンパク質では、ほとんどの場合、PH約5またはPHは、好ましくは、チオールのPKa−2;例えば、PH約2で逆相クロマトグラフィーによって精製されるペプチドについて)のようなチオール安定化条件によって。
1.例えば、スルフォン化およびチオエステル化などによってシステイニルを修飾する修飾剤によって;
2.例えば、重金属、特にZN2+、CD2+、モノ−、ジチオ−ならびにジスルフィド−化合物(例えば、アリール−およびアルキルメタンチオスルホネート、ジチオピリジン、ジチオモルホリン、ジヒドロリポアミド、Ellmann試薬、aldrothioltM(アルドリッチ)(レイン(Rein)ら1996年)、ジチオカルバメート)、またはチオール化剤(例えば、グルタチオン(gluthathion)、N−アセチルシステイン、システインアミン)によるような本発明のシステイニルを可逆的に修飾する修飾剤によって。ジチオカルバメートは、R1R2NC(S)SR3官能基を所有する広範なクラスの分子を含んでなり、それらに、スルフヒドリル(sulphydryl)基と反応する能力を付与する。チオール含有化合物は、好ましくは、0.1〜50mMの濃度、より好ましくは、1〜50mMの濃度、さらにより好ましくは、10〜50mMの濃度で使用される;
3.チオールの状態を保存する(安定化する)修飾剤、特に、10μM〜10mMの濃度範囲、より好ましくは、1〜10mMの濃度での例えば、DTT、ジヒドロアスコルビン酸(dihydroascorbate)、ビタミンおよび誘導体、マンニトール、アミノ酸、ペプチドおよび誘導体(例えば、ヒスチジン、エルゴチオネイン、カルノシン、メチオニン)、没食子酸、ヒドロキシアニソール、ヒドロキシトルエン、ヒドロキノン、ヒドロキシメチルフェノールおよびそれらの誘導体のような抗酸化剤(antioxidantia)の存在によって;
4.例えば、(I)金属イオン(ZN2+、MG2+)、ATPとしての補因子、(II)PHの制御(例えば、タンパク質では、ほとんどの場合、PH約5またはPHは、好ましくは、チオールのPKa−2;例えば、PH約2で逆相クロマトグラフィーによって精製されるペプチドについて)のようなチオール安定化条件によって。
(1)、(2)、(3)および(4)に記載のような可逆的保護の組み合わせを適用してもよい。
可逆的保護およびチオール安定化化合物は、モノマー、ポリマーまたはリポソームの形態下で提示することができる。
システイン残基の可逆的保護状態の除去は、化学的または酵素的に、例えば、以下によって達成することができる:
・還元剤、特に、1〜200mMの濃度、より好ましくは、50〜200mMの濃度の特に、DTT、DTE、2−メルカプトエタノール、亜ジチオン酸、SnCl2、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドロキシルアミン、TCEP;
・例えば、PHの増加によるチオール安定化条件または薬剤の除去;
・酵素、特に、0.01〜5μMの濃度、さらにより特に0.1〜5μMの濃度範囲の特に、チオエステラーゼ、グルタルレドキシン(glutaredoxine)、チオレドキシン(thioredoxine);
・上記の化学的および/または酵素的条件の組み合わせ。
・還元剤、特に、1〜200mMの濃度、より好ましくは、50〜200mMの濃度の特に、DTT、DTE、2−メルカプトエタノール、亜ジチオン酸、SnCl2、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドロキシルアミン、TCEP;
・例えば、PHの増加によるチオール安定化条件または薬剤の除去;
・酵素、特に、0.01〜5μMの濃度、さらにより特に0.1〜5μMの濃度範囲の特に、チオエステラーゼ、グルタルレドキシン(glutaredoxine)、チオレドキシン(thioredoxine);
・上記の化学的および/または酵素的条件の組み合わせ。
システイン残基の可逆的保護状態の除去は、例えば、細胞または個体において、インビトロもしくはインビボで、行うことができる。
あるいは、本明細書において記載のHCVペプチドに含まれる1つのシステイン残基、または2もしくはそれ以上のシステイン残基は、天然アミノ酸、好ましくは、メチオニン、グルタミン酸、グルタミンまたはリジンに変異され得る。
本発明のペプチドは、ポリマー(マルチマー:ホモポリマーもしくはヘテロポリマー)を形成するために連結またはスペーサーアミノ酸を介して組み合わせることができるか、あるいは混合物として、連結を伴わずに、組成物において処方することができる。「スペーサーアミノ酸」または「スペーサーペプチド」は、典型的に、生理学的条件下で実質的に荷電していないアミノ酸またはアミノ酸擬似物のような1つもしくはそれ以上の比較的小さな、天然の分子からなる。スペーサーは、典型的に、例えば、Ala、Gly、Leu、Ile、または非極性アミノ酸もしくは中性の極性アミノ酸の他の中性のスペーサーから選択される。任意の本スペーサーは同じ残基からなる必要はなく、従って、ヘテロまたはホモオリゴマーであってもよいことが理解されよう。存在する場合、スペーサーは、少なくとも1残基、さらに通常は、2、3、4、5もしくは6残基、またはさらに7、8、9、10、15、20、30、もしくは50残基までである。スペーサーアミノ酸残基を導入して、接合部のエピトープ(免疫系によって認識され、標的抗原には存在しせず、エピトープの人工的並列によってのみ作製されるエピトープ)を回避するか、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによって、エピトープ提示を増強することができる。特に、3残基より長いスペーサー配列では、Glu、Gln、Ser、His、およびAsnのような極性残基も存在し得るが、一般に、スペーサー配列は非極性アミノ酸を含む。各スペーサー配列の全体の長さおよび性質に関する唯一の限界は、合成、タンパク質分解プロセシング、およびポリペプチドの操作のし易さを検討することで導かれる。
さらに、本発明はまた、上記で規定されるいずれかのペプチドの複数の反復もしくは上記で規定されるいずれかのペプチドの組み合わせを含んでなるかまたはそれらからなるポリペプチドを考慮する。
ミニ遺伝子
本発明のさらなる実施形態は、表13および14から選択されるペプチドをコードする核酸に関する。前記核酸は、「単離された」または「合成」のものである。用語「単離された」は、材料が天然に存在する環境において見出される材料に通常伴う成分を実質的に含まない材料を指す。しかし、本発明の単離された核酸は、異種細胞成分または標識などを含んでなり得ることを明確にすべきである。用語「核酸」または「ポリ核酸」は、本出願を通して交換可能に使用され、一本鎖もしくは二本鎖の形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、天然のヌクレオチドの既知のアナログを包含し得る。
本発明のさらなる実施形態は、表13および14から選択されるペプチドをコードする核酸に関する。前記核酸は、「単離された」または「合成」のものである。用語「単離された」は、材料が天然に存在する環境において見出される材料に通常伴う成分を実質的に含まない材料を指す。しかし、本発明の単離された核酸は、異種細胞成分または標識などを含んでなり得ることを明確にすべきである。用語「核酸」または「ポリ核酸」は、本出願を通して交換可能に使用され、一本鎖もしくは二本鎖の形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、天然のヌクレオチドの既知のアナログを包含し得る。
より詳細には、本発明は、本明細書に記載のポリエピトープペプチドをコードする「ミニ遺伝子」またはポリヌクレオチドに関する。用語「マルチエピトープ構築物」は、核酸を指す場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ミニ遺伝子」および「マルチエピトープ核酸ワクチン」ならびに他の等価な語句と交換可能に使用することができ、免疫系において機能する分子、好ましくは、HLAクラスIおよびT細胞受容体またはHLAクラスIIおよびT細胞受容体に結合することができる任意の長さのペプチドエピトープをコードする複数のエピトープ核酸を含んでなる。マルチエピトープ構築物におけるエピトープ核酸は、HLAクラスIエピトープ、HLAクラスIIエピトープ、HLAクラスIおよびクラスIIエピトープの組み合わせまたはネステッドエピトープをコードすることができる。HLAクラスIをコードするエピトープ核酸はCTLエピトープ核酸と称せられ、HLAクラスIIをコードするエピトープ核酸はHTLエピトープ核酸と称せられる。いくつかのマルチエピトープ構築物は、HLAクラスIエピトープをコードするマルチエピトープ核酸のサブセットおよびHLAクラスIIエピトープをコードするマルチエピトープ核酸の別のサブセットを有することができる。マルチエピトープ構築物は、1つもしくはそれ以上のスペーサー核酸を有してもよい。スペーサー核酸は、構築物において各エピトープ核酸に隣接し得る。スペーサー核酸は、1つもしくはそれ以上のアミノ酸(スペーサーアミノ酸)をコードし得る。あるいは、ミニ遺伝子は、ツィ−リャーング カイ(Qi−Liang Cai)ら、2004年により記載の技術を使用して、構築することができる。
従って、本発明は、表13および14から選択される少なくとも1つのペプチドを含んでなるかもしくは表Aから選択される少なくとも1つのネステッドエピトープを含んでなるポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはミニ遺伝子に関する。
さらに、本発明はまた、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60もしくはそれ以上のペプチドを含んでなるポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはミニ遺伝子を包含する。好ましくは、ペプチドは、表13および14から選択される。ペプチドの任意の組み合わせは、ポリエピトープペプチドについて記載のとおり、可能である。従って、ポリヌクレオチドまたはミニ遺伝子は、例えば、表Aにおいて示されるような1つもしくはそれ以上のネステッドエピトープ、もしくはそのフラグメントをコードすることができる。
より詳細には、本発明の核酸は、HLA群拘束性構築物に組み入れることができる。前記「HLA群拘束性構築物」は、同じHLA群のアレルまたは分子に結合するペプチドをコードする少なくとも2つの核酸エピトープを含んでなる。HLA型拘束性構築物におけるエピトープの数に制限はなく、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25もしくはそれ以上であり得る。HLA群拘束性ポリエピトープペプチドについて記載のように、同じ組み合わせが可能である。
好適な実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるポリエピトープペプチドは、少なくとも1つのHLAクラスI結合性ペプチド、HLAクラスII結合性ペプチドまたはHCV由来のペプチドをさらに含んでなる。前記HLAクラスI結合性ペプチドおよび前記HLAクラスII結合性ペプチドは、外来性の抗原または生物体(非HCV)から誘導することができる。前記ペプチドには長さに制限はなく、これは、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30もしくはそれ以上のアミノ酸の長さを有することができる。
さらなる実施形態において、本明細書において記載のポリヌクレオチドまたはミニ遺伝子は、1つもしくはそれ以上のスペーサー核酸、即ち、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくはそれ以上をさらに含んでなることができる。特定の実施形態において、ミニ遺伝子は、1つもしくはそれ以上の調節配列および/または1つもしくはそれ以上のシグナル配列および/または1つもしくはそれ以上のプロモーター配列をさらに含んでなる。
市販されていないポリヌクレオチドまたは核酸については、ボーケージ(Beaucage)およびカラザーズ(Caruthers)、1981年によって最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従い、バンデバンター(Van Devanter)ら、1984年において記載の自動化シンセサイザーを使用して、化学的に合成することができる。ポリヌクレオチドの精製は、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動またはピアソン(Pearson)およびリーニアー(Reanier)、1983年において記載のような陰イオン交換HPLCのいずれかによる。他の精製方法は、逆相分離およびハイドロキシアパタイトであり、当業者に周知である。化学的に合成および精製されたポリヌクレオチドは、PCRに基づく方法(ステマー(Stemmer)ら、1995年;クリーグラー(Kriegler)ら、1991年)によって、より長いポリヌクレオチドに集成することができる。
マルチエピトープ構築物のエピトープは、典型的に、転写を指令するプロモーターならびにエンハンサーおよびポリアデニル化部位のような他の調節配列を含有する発現ベクターにサブクローニングされる。ベクターのさらなるエレメントは、宿主細胞におけるマルチエピトープ構築物の発現に必要な例えば、シグナルまたは標的配列、転写開始および終結配列、5’および3’非翻訳領域ならびにイントロンである。
治療または予防的免疫化の目的のために、本明細書において既に記載のように、本発明の(ポリエピトープ)ペプチドを、プラスミドベクターならびにウイルスまたは細菌ベクターによって、発現させることができる。用語「ベクター」は、プラスミド、コスミド、原核生物体、ファージ、あるいは真核生物体、例えば、ウイルス、動物もしくはヒト細胞または酵母細胞を含んでなり得る。発現ベクターは、典型的に、宿主細胞におけるマルチエピトープ構築物の発現に必要なすべてのさらなるエレメントを含有する転写単位または発現カセットを含有する。従って、典型的な発現カセットは、マルチエピトープ構築物に作動可能に連結されたプロモーターおよび転写の十分なポリアデニル化に必要なシグナルを含有する。カセットのさらなるエレメントは、エンハンサーならびに機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位を伴うイントロンを含んでもよい。
適切なプロモーターは当該分野において周知であり、例えば、サンブルック(Sambrook)ら、Molecular cloning,A Laboratory Manual(第2版、1989年)およびオースベル(Ausubel)ら、Current Protocols in Molecular Biology(1994年)に記載されている。哺乳動物細胞のための真核細胞発現系は当該分野において周知であり、市販されている。そのようなプロモーターエレメントとして、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、ラウス肉腫ウイルス長末端反復(RSV LTR)およびシミアンウイルス40(SV40)が挙げられる。他の適切なプロモーター配列については、例えば、米国特許第5,580,859号明細書および同第5,589,466号明細書を参照のこと。
プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、構造遺伝子の下流に、十分な集結を提供するための転写終結領域を含有することができる。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なる遺伝子から得ることができる。
医学的使用
さらなる実施形態において、本発明はまた、医薬品としての使用のための本発明の(ポリエピトープ)ペプチド、ネステッドエピトープ、核酸、ミニ遺伝子または組成物に関する。好ましくは、前記医薬品はワクチンである。特定の実施形態において、本発明はまた、医薬品としての使用のための本明細書に記載の核酸もしくはミニ遺伝子を含んでなるベクター、プラスミド、組換え体ウイルスまたは宿主細胞に関する。より具体的には、本発明は、HCV感染を防止もしくは処置するための医薬品の製造のための表13および14から選択される少なくとも1つのペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸配列の使用に関する。特定の実施形態において、本発明はまた、HCV感染を防止もしくは処置するための医薬品の製造のための本明細書に記載の核酸またはミニ遺伝子を含んでなるベクター、プラスミド、組換え体ウイルスあるいは宿主細胞に関する。
さらなる実施形態において、本発明はまた、医薬品としての使用のための本発明の(ポリエピトープ)ペプチド、ネステッドエピトープ、核酸、ミニ遺伝子または組成物に関する。好ましくは、前記医薬品はワクチンである。特定の実施形態において、本発明はまた、医薬品としての使用のための本明細書に記載の核酸もしくはミニ遺伝子を含んでなるベクター、プラスミド、組換え体ウイルスまたは宿主細胞に関する。より具体的には、本発明は、HCV感染を防止もしくは処置するための医薬品の製造のための表13および14から選択される少なくとも1つのペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸配列の使用に関する。特定の実施形態において、本発明はまた、HCV感染を防止もしくは処置するための医薬品の製造のための本明細書に記載の核酸またはミニ遺伝子を含んでなるベクター、プラスミド、組換え体ウイルスあるいは宿主細胞に関する。
ワクチンおよびワクチン組成物
本発明はさらに、本明細書に記載のHCV(ポリエピトープ)ペプチドまたは対応する核酸のうち任意のいずれかを含んでなる組成物に関する。特定の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルのうち少なくとも1つをさらに含んでなる。用語「組成物」、「免疫学的組成物」および「医薬組成物」は、「ワクチン組成物」または「ワクチン」と交換可能に使用される。1つもしくはそれ以上のペプチドのカクテル、ポリエピトープペプチドにおいて含まれる本発明の1つもしくはそれ以上のエピトープ、および/またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸、例えば、ポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子によるような本発明に従うワクチンの多数の実施形態が存在する。ワクチンはまた、ペプチドをパルスした抗原提示細胞を含んでなることができ、例えば、エピトープは、樹状細胞上のHLA分子に結合され得る。より詳細には、前記免疫原性組成物はワクチン組成物である。さらにより詳細には、前記ワクチン組成物は、予防用ワクチン組成物である。あるいは、前記ワクチン組成物はまた、治療用ワクチン組成物であってもよい。予防用ワクチン組成物は、HCV感染を防止することを目的とし、まだHCVに感染していない健康なヒトに投与すべきワクチン組成物を指す。治療用ワクチン組成物は、HCV感染の処置を目的とし、HCVに感染している患者に投与すべきワクチン組成物を指す。
本発明はさらに、本明細書に記載のHCV(ポリエピトープ)ペプチドまたは対応する核酸のうち任意のいずれかを含んでなる組成物に関する。特定の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルのうち少なくとも1つをさらに含んでなる。用語「組成物」、「免疫学的組成物」および「医薬組成物」は、「ワクチン組成物」または「ワクチン」と交換可能に使用される。1つもしくはそれ以上のペプチドのカクテル、ポリエピトープペプチドにおいて含まれる本発明の1つもしくはそれ以上のエピトープ、および/またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸、例えば、ポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子によるような本発明に従うワクチンの多数の実施形態が存在する。ワクチンはまた、ペプチドをパルスした抗原提示細胞を含んでなることができ、例えば、エピトープは、樹状細胞上のHLA分子に結合され得る。より詳細には、前記免疫原性組成物はワクチン組成物である。さらにより詳細には、前記ワクチン組成物は、予防用ワクチン組成物である。あるいは、前記ワクチン組成物はまた、治療用ワクチン組成物であってもよい。予防用ワクチン組成物は、HCV感染を防止することを目的とし、まだHCVに感染していない健康なヒトに投与すべきワクチン組成物を指す。治療用ワクチン組成物は、HCV感染の処置を目的とし、HCVに感染している患者に投与すべきワクチン組成物を指す。
ワクチンまたはワクチン組成物は、以下の少なくとも1つもしくは両方を引き起こすのに十分に広範かつ活発な免疫応答を誘発することが可能な免疫原性組成物である:
・宿主に既に存在し、ワクチン組成物が標的にする病原体の増殖に対する安定化効果。ワクチン組成物はまた、病原体に既に感染している宿主において免疫応答を誘導し得、該病原体に対して、免疫応答は疾患の安定化、退行または回復をもたらす;および
・前記病原体を標的とするワクチン組成物による免疫化後、宿主において新たに誘導される病原体が、前記宿主から回復する速度の増加。
・宿主に既に存在し、ワクチン組成物が標的にする病原体の増殖に対する安定化効果。ワクチン組成物はまた、病原体に既に感染している宿主において免疫応答を誘導し得、該病原体に対して、免疫応答は疾患の安定化、退行または回復をもたらす;および
・前記病原体を標的とするワクチン組成物による免疫化後、宿主において新たに誘導される病原体が、前記宿主から回復する速度の増加。
ワクチン組成物はまた、宿主に既に存在する病原体の生存に対してネガティブな効果を発揮するのに広範かつ強力な、または免疫された宿主が、新たに誘導される病原体によって生じる疾患の徴候を発達することを防止するのに十分な広範かつ強力な免疫応答を生じ得る。特に、本発明のワクチン組成物は、HCVワクチン組成物である。特に、ワクチンまたはワクチン組成物は、本発明の有効量のペプチドもしくは核酸を含んでなる。特定の実施形態において、前記ワクチン組成物は、本発明の核酸もしくはミニ遺伝子を含んでなるベクター、プラスミド、組換え体ウイルスまたは宿主細胞を含んでなる。前記ワクチン組成物は、1つもしくはそれ以上のさらなる活性物質および/または少なくとも1つの薬学的に許容可能なキャリア、アジュバントもしくはビヒクルをさらに含んでもよい。
ワクチンまたはワクチン組成物における「有効量」のペプチドもしくは核酸は、免疫応答を誘発するのに必要かつ十分な量と称される。ワクチン組成物により予想される効果を引き起こすのに十分広範かつ活発な免疫応答には、ワクチン接種のスキームまたはワクチンス接種のスケジュールの一部として、ワクチン組成物による(時間的に)連続した免疫化が必用であることは、当業者に明白である。「有効量」は、処置しようとする個体の健康および身体的状態、処置しようとする個体の年齢(例えば、小児の用量は成人より低くあり得る)、処置しようとする個体の分類学的グループ(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、霊長類など)、個体の免疫系が有効な免疫応答を実装する能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、処置する医師の評価、感染している病原体の株および他の関連要因に依存して変動し得る。ワクチン組成物の有効量は、日常的な治験を介して決定することができる比較的広範な範囲、即ち、0.01〜50mg/用量;より好ましくは、0.1〜5mg/用量の間にあると予想される。通常、量は、0.01〜1000μg/用量、より詳細には、0.1〜100μg/用量で変動する。投与処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールがあり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤との併用で投与してもよい。用量、投与経路、および投与スケジュールは、当該分野において公知の方法論に従って調整される。
組成物またはワクチン組成物は、2以上のペプチドまたは核酸、即ち、それらのものの複数、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34もしくはそれ以上、例えば、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50もしくはそれ以上までの個別のペプチドまたは核酸を含んでもよい。
キャリア、アジュバントおよびビヒクル−送達
一旦、適切な免疫原性ペプチド、またはそれらをコードする核酸が規定されたら、本明細書において「組成物」、「ワクチン組成物」または「医薬組成物」と称される多様な手段によって、それらを貯蔵および送達することができる。本発明のペプチドならびに本発明の薬学的およびワクチン組成物は、HCV感染を処置および/または防止するための哺乳動物、特にヒトへの投与に有用である。本発明のペプチド、またはそれらをコードするDNAを含有するワクチン組成物は、HCV抗原に対する免疫応答を誘発し、従って、患者自身の免疫応答能を増強するために、HCV感染患者またはHCV感染に掛かり易いか、もしくはそうでなければHCV感染の危険性がある個体に投与される。
一旦、適切な免疫原性ペプチド、またはそれらをコードする核酸が規定されたら、本明細書において「組成物」、「ワクチン組成物」または「医薬組成物」と称される多様な手段によって、それらを貯蔵および送達することができる。本発明のペプチドならびに本発明の薬学的およびワクチン組成物は、HCV感染を処置および/または防止するための哺乳動物、特にヒトへの投与に有用である。本発明のペプチド、またはそれらをコードするDNAを含有するワクチン組成物は、HCV抗原に対する免疫応答を誘発し、従って、患者自身の免疫応答能を増強するために、HCV感染患者またはHCV感染に掛かり易いか、もしくはそうでなければHCV感染の危険性がある個体に投与される。
多様な分野において認識されている送達システムを使用して、ペプチド、ポリエピトープポリペプチド、またはペプチドもしくはポリエピトープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切な細胞に送達することができる。それらをコードするペプチドおよび核酸は、薬学的に許容可能なキャリアにおいて、あるいは希釈剤を伴うもしくは伴わずに、コロイド懸濁液、または散剤として、送達することができる。それらは、「裸の状態(naked)」であるかまたは送達ビヒクルに関連し、当該分野において公知の送達システムを使用して、送達し得る。
「薬学的に許容可能なキャリア」または「薬学的に許容可能なアジュバント」は、任意の適切な賦形剤、希釈剤、キャリアおよび/またはアジュバントであり、それら自体では、組成物を服用する個体に有害な抗体の産生を誘導せず、それらは保護を誘発しない。好ましくは、薬学的に許容可能なキャリアまたはアジュバントは、抗原によって誘発される免疫応答を増強する。適切なキャリアまたはアジュバントは、典型的に、以下の非網羅的リストに含まれる1つもしくはそれ以上の化合物を含んでなる:
大きな緩徐に代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子;水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム(国際公開第93/24148号パンフレットを参照のこと)、ミョウバン(KAl(SO4)2・12H2O)、または3−O−脱アシル化モノホスホリル脂質Aと組み合わされたこれらのうちの1つ(国際公開第93/19780号パンフレットを参照のこと);N−アセチル−ムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(米国特許第4,606,918号明細書を参照のこと)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミル−L−アラニン2−(1’,2’−ジパルミトイル−SN−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミン;2%スクアレン/Tween80エマルジョン中のモノホスホリル脂質A(即ち、無毒化エンドトキシン)を含有するRIBI(IMMunochem Research Inc.,Hamilton、モンタナ州、米国)、トレハロース−6,6−ジミコレート、および細胞壁骨格(MPL+TDM+CWS)。3つの成分MPL、TDMまたはCWSのいずれもまた、単独で使用してもよく、または2つずつ組み合わせてもよい;アジュバント、例えば、Stimulon(Cambridge Bioscience, Worcester、マサチューセッツ州、米国)、SAF−1(Syntex);アジュバント、例えば、水中油型エマルジョンでさらに補充され得るQS21と3−O−脱アシル化モノホスホリル脂質Aとの間の組み合わせ(国際公開第94/00153号パンフレットを参照のこと)(例えば、国際公開第95/17210号パンフレット、同第97/01640号パンフレットおよび同第9856414号パンフレットを参照のこと)、ここで、水中油型エマルジョンは、代謝可能な油脂およびサポニン、もしくは代謝可能な油脂、サポニン、およびステロールを含んでなるか、またはサイトカインでさらに補充され得る(国際公開第98/57659号パンフレットを参照のこと);アジュバント、例えば、MF−59(Chiron)、またはポリ[ジ(カルボキシラートフェノキシ)ホスファゼン]に基づくアジュバント(Virus Research Institute);ブロックコポリマーに基づくアジュバント、例えば、Optivax(Vaxcel,Cytrx)またはインスリンに基づくアジュバント、例えば、ALgammulin and Gammainulin(Anutech);完全または不完全フロイントアジュバント(それぞれ、CFAもしくはIFA)あるいはGerbu調製物(Gerbu Biotechnik);サポニン、例えばQuila、精製されたサポニン、例えば、QS21、QS7またはQS17、Β−エスシンまたはジギトニン;非メチル化CpGジヌクレオチド、例えば、[プリン−プリン−CG−ピリミジン−ピリミジン]オリゴヌクレオチドを含んでなる免疫刺激性オリゴヌクレオチド。これらの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、CpGクラスA、B、およびC分子(Coley Pharmaceuticals)、ISS(Dynavax)、Immunomers(Hybridon)を含む。免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、例えば、リーデル(Riedl)ら(2002年)により記載のカチオン性ペプチド;サポニン、例えば、Quil A(ISCOMS)を含んでなる免疫性激性複合体;本来的に非毒性および非治療的である賦形剤および希釈剤、例えば、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤または乳化剤、PH緩衝物質、保存剤など;生分解性および/または生体適合性油脂、例えば、1〜10%または2.5〜5%の濃度のスクアラン、スクアレン、エイコサン、テトラテトラコンタン、グリセロール、ピーナツ油、植物油;ビタミン、例えば、ビタミンC(アスコルビン酸またはその塩もしくはエステル)、ビタミンE(トコフェロール)、あるいはビタミンA;カロテノイド、または天然または合成フラボノイド;微量元素、例えば、セレン;バートン(Barton)およびメドズヒトフ(Medzhitov)(2002年)においてレビューされている任意のトール(Toll)様受容体リガンドと組み合わせてもよい。
大きな緩徐に代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子;水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム(国際公開第93/24148号パンフレットを参照のこと)、ミョウバン(KAl(SO4)2・12H2O)、または3−O−脱アシル化モノホスホリル脂質Aと組み合わされたこれらのうちの1つ(国際公開第93/19780号パンフレットを参照のこと);N−アセチル−ムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(米国特許第4,606,918号明細書を参照のこと)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミル−L−アラニン2−(1’,2’−ジパルミトイル−SN−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミン;2%スクアレン/Tween80エマルジョン中のモノホスホリル脂質A(即ち、無毒化エンドトキシン)を含有するRIBI(IMMunochem Research Inc.,Hamilton、モンタナ州、米国)、トレハロース−6,6−ジミコレート、および細胞壁骨格(MPL+TDM+CWS)。3つの成分MPL、TDMまたはCWSのいずれもまた、単独で使用してもよく、または2つずつ組み合わせてもよい;アジュバント、例えば、Stimulon(Cambridge Bioscience, Worcester、マサチューセッツ州、米国)、SAF−1(Syntex);アジュバント、例えば、水中油型エマルジョンでさらに補充され得るQS21と3−O−脱アシル化モノホスホリル脂質Aとの間の組み合わせ(国際公開第94/00153号パンフレットを参照のこと)(例えば、国際公開第95/17210号パンフレット、同第97/01640号パンフレットおよび同第9856414号パンフレットを参照のこと)、ここで、水中油型エマルジョンは、代謝可能な油脂およびサポニン、もしくは代謝可能な油脂、サポニン、およびステロールを含んでなるか、またはサイトカインでさらに補充され得る(国際公開第98/57659号パンフレットを参照のこと);アジュバント、例えば、MF−59(Chiron)、またはポリ[ジ(カルボキシラートフェノキシ)ホスファゼン]に基づくアジュバント(Virus Research Institute);ブロックコポリマーに基づくアジュバント、例えば、Optivax(Vaxcel,Cytrx)またはインスリンに基づくアジュバント、例えば、ALgammulin and Gammainulin(Anutech);完全または不完全フロイントアジュバント(それぞれ、CFAもしくはIFA)あるいはGerbu調製物(Gerbu Biotechnik);サポニン、例えばQuila、精製されたサポニン、例えば、QS21、QS7またはQS17、Β−エスシンまたはジギトニン;非メチル化CpGジヌクレオチド、例えば、[プリン−プリン−CG−ピリミジン−ピリミジン]オリゴヌクレオチドを含んでなる免疫刺激性オリゴヌクレオチド。これらの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、CpGクラスA、B、およびC分子(Coley Pharmaceuticals)、ISS(Dynavax)、Immunomers(Hybridon)を含む。免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、例えば、リーデル(Riedl)ら(2002年)により記載のカチオン性ペプチド;サポニン、例えば、Quil A(ISCOMS)を含んでなる免疫性激性複合体;本来的に非毒性および非治療的である賦形剤および希釈剤、例えば、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤または乳化剤、PH緩衝物質、保存剤など;生分解性および/または生体適合性油脂、例えば、1〜10%または2.5〜5%の濃度のスクアラン、スクアレン、エイコサン、テトラテトラコンタン、グリセロール、ピーナツ油、植物油;ビタミン、例えば、ビタミンC(アスコルビン酸またはその塩もしくはエステル)、ビタミンE(トコフェロール)、あるいはビタミンA;カロテノイド、または天然または合成フラボノイド;微量元素、例えば、セレン;バートン(Barton)およびメドズヒトフ(Medzhitov)(2002年)においてレビューされている任意のトール(Toll)様受容体リガンドと組み合わせてもよい。
上記の任意のアジュバントは3−O−脱アシル化モノホスホリル脂質A含んでなり、前記3−O−脱アシル化モノホスホリル脂質Aは、小さな粒子を形成し得る(国際公開第94/21292号パンフレットを参照のこと)。
上記の任意のアジュバントにおいて、MPLまたは3−O−脱アシル化モノホスホリル脂質Aは、RC−529と称される合成アナログまたは他の任意のアミノ−アルキルグルコサミド4−リン酸により置き換えることができる(ジョンソン(Johnson)ら、1999年、ペルシング(Persing)ら、2002年)。あるいは、それは、OM−197のような他の脂質Aアナログにより置き換えることができる(ブイリ(Byl)ら、2003年)。
「薬学的に許容可能なビヒクル」は、水、食塩水、生理的食塩水溶液、グリセロール、エタノールなどのようなビヒクルを含む。湿潤または乳化剤、PH緩衝物質、保存剤のような補助物質もそのようなビヒクルに含まれ得る。当該分野において公知の送達システムは、例えば、リポペプチド、ポリ−DL−ラクチド−コ−グリコリド(「PLG」)においてカプセル化されたペプチド組成物、マイクロスフェア、免疫刺激性複合体(ISCOMS)に含有されるペプチド組成物、複数の抗原ペプチドシステム(MAP)、ウイルス送達ベクター、ウイルスまたは合成起源の粒子、アジュバント、リポソーム、脂質、微粒子またはマイクロカプセル、金粒子、ナノ粒子、ポリマー、縮合剤、多糖、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、QS21、吸着増強材料、脂肪酸、あるいは、裸のもしくは粒子吸収されたCDNAである。
典型的に、ワクチンまたはワクチン組成物は、注入用として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製される。注入は、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、髄腔内、皮内、表皮内、または「遺伝子銃」によってであり得る。他のタイプの投与は、エレクトロポレーション、インプラント、坐剤、経口摂取、腸適用、吸入、エアロゾル化または鼻スプレーまたは点鼻を含んでなる。注入前の液体ビヒクルに対する溶解、または懸濁に適切な固体形態を調製することもできる。調節物はまた、アジュバント効果を増強するために、リポソーム内に乳化またはカプセル化してもよい。
液体処方は、油脂、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、または充填剤を含むことができる。好ましくは、炭水化物は、糖または糖アルコール、例えば、モノ−、ジ−、もしくは多糖類、または水溶性グルカンを含む。糖類またはグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、ΑおよびΒシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン(Hydroxethyl Starch)ならびにカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合物を含むことができる。スクロースは最も好適である。「糖アルコール」は、−OH基を有するC4〜C8炭化水素として規定され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを含む。マンニトールは最も好適である。上記のこれらの糖または糖アルコールは、個々にまたは組み合わせて使用してもよい。糖または糖アルコールが水性調製物に可溶性である限り、使用する量に一定の限界値は存在しない。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は、1.0%(w/v)〜7.0%(w/v)の間、より好ましくは、2.0〜6.0%(w/v)の間である。好ましくは、アミノ酸は、左旋(L)型のカルニチン、アルギニン、およびベタインを含む;しかし、他のアミノ酸を添加してもよい。好適なポリマーは、2,000〜3,000の間の平均分子量を伴うポリビニルピロリドン(PVP)、または3,000〜5,000の間の平均分子量を伴うポリエチレングリコール(PEG)を含む。また、凍結乾燥前または再構成後に、溶液におけるpH変化を最小限にするために、組成物において緩衝液を使用することも好ましい。いずれの生理学的緩衝液を使用してもよいが、クエン酸、リン酸、コハク酸、およびグルタミン酸緩衝液またはそれらの混合物が好適である。クエン酸緩衝液が最も好適である。好ましくは、濃度は、0.01〜0.3モルである。処方に添加することができる界面活性剤については、EP特許出願第EP0270799号明細書および同第EP0268110号明細書に示されている。
さらに、ポリマーへの共有結合によって、ポリペプチドを化学的に修飾し、例えば、それらの循環半減期を増加することができる。好適なポリマー、およびそれらをペプチドに付着させる方法は、米国特許第4,766,106号明細書;同第4,179,337号明細書;同第4,495,285号明細書;および同第4,609,546号明細書に示されている。好適なポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール(PEG)である。PEGは室温で水に可溶であり、一般式:R(OCH2CH2)NO−R[式中、Rは、水素、またはアルキルもしくはアルカノール基のような保護基であり得る]を有する。好ましくは、保護基は1〜8の間の炭素を有し、より好ましくは、それはメチルである。記号Nは正の整数であり、好ましくは、1〜1,000の間、より好ましくは、2〜500の間である。PEGは、1000〜40,000の間、より好ましくは、2000〜20,000の間、最も好ましくは、3,000〜12,000の間の好適な平均分子量を有する。好ましくは、PEGは、少なくとも1つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは、末端のヒドロキシ基である。このヒドロキシ基こそが好適に活性化される。しかし、反応性基のタイプおよび量は、本発明の共有結合されたPEG/ポリペプチドを活性化するために変動され得ることが理解される。
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた、本発明において有用である。それらは、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール(POG)などを含む。POGが好適である。ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格は、例えば、動物およびヒトにおいてモノ−、ジ−、トリグリセリドの天然に存在するのと同じ骨格であるため、1つの反応が存在する。従って、この分岐は、必ずしも身体において外来性因子として認められるわけではない。POGは、PEGと同じ範囲の好適な分子量を有する。POGの構造は、クナウフ(Knauf)ら、1988年に示されており、POG/IL2コンジュゲートの考察は、米国特許第4,766,106号明細書に見出される。
循環半減期を増加するためのもう1つの薬物送達システムは、リポソームである。本発明のペプチドおよび核酸はまた、リンパ組織のような特定の組織を標的化するか、または選択的に感染細胞を標的化し、ならびにペプチドおよび核酸組成物の半減期を増加する役割を果たすリポソームを介して投与してもよい。リポソームは、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層などを含む。これらの調製物では、送達しようとするペプチドあるいは核酸は、リポソームの一部として組み入れられるか、あるいは単独で、またはCD45抗原に結合するモノクローナル抗体のようなリンパ系細胞の間で優勢な受容体に結合する分子との、または他の治療的もしくは免疫原性組成物との併用で包埋される。従って、本発明の所望されるペプチドまたは核酸で充填されるか、もしくは装飾されるリポソームは、リンパ系細胞の部位に指向させることができ、ここで、リポソームは、次いで、ペプチドおよび核酸組成物を送達する。本発明に従う使用のためのリポソームは、標準的な小胞を形成する脂質から形成され、一般に、中性および負に荷電したリン脂質ならびにコレステロールのようなステロールを含む。脂質の選択は、一般に、例えば、リポソームのサイズ、酸不安定性および血流におけるリポソームの安定性を考慮することによって、誘導される。例えば、ゾーカ(Szoka)ら、1980年、ならびに米国特許第4,235,871号明細書、同第4,501,728号明細書、同第4,837,028号明細書、および同第5,019,369号明細書において記載のように、様々な方法が、リポソームを調製するために利用することが可能である。
免疫系の細胞を標的化するために、リポソームに組み入れようとするリガンドは、例えば、所望される免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントを含むことができる。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、静脈内、局部的、局所的などに、とりわけ、投与様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の段階に従って変動する用量で、投与することができる。例えば、免疫原性エピトープをコードする免疫原性ポリペプチドまたは核酸のいずれかを担持するリポソームは、インビボでCTL応答を誘発することが公知である(レディ(Reddy)ら、1992年;コリンズ(Collins)ら、1992年;フライズ(Fries)ら、1992年;ネイブル(Nabel)ら、1992年)。
液体の医薬組成物を調製した後、それは、分解を防止し、無菌状態を保つために、好ましくは、凍結乾燥される。液体組成物を凍結乾燥するための方法は、当業者に公知である。使用直前に、組成物を、さらなる成分を含み得る無菌の希釈剤(例えば、リンゲル液、蒸留水、または滅菌食塩水)で再構成してもよい。再構成時に、組成物は、好ましくは、当業者に公知のそれらの方法を使用して、被験体に投与される。
「裸のDNA」として公知のアプローチは、臨床治験における筋肉内(IM)投与のために現在使用されている。ミニ遺伝子DNAワクチンの免疫治療効果を最大にするために、精製されたプラスミドDNAを処方するための代替的方法が所望であり得る。様々な方法が記載されており、新規の技術が利用可能であり得る。カチオン性脂質もまた、処方に使用することができる(例えば、国際公開第93/24640号パンフレット;マンニノ(Mannino)およびグールド−フォーゲリテー(Gould−Fogerite)1988年;米国特許第5,279,833号明細書;国際公開第91/06309号パンフレット;ならびにフェルグナー(Felgner)ら、1987年により記載を参照のこと)。さらに、保護、相互活性、非縮合化合物として集合的に称される糖脂質、膜融合リポソーム、ペプチドおよび化合物もまた、精製されたプラスミドDNAと複合され、安定性、筋肉内分散、または特定の器官または細胞タイプへの輸送(trafficking)のような可変因子に影響を及ぼし得る。
DNAに基づく送達技術のさらなる例は、容易にされた(ブピビカイン(bupivicaine)、ポリマー、ペプチド仲介)送達、カチオン性脂質複合体、粒子仲介(「遺伝子銃」)または圧仲介送達(例えば、米国特許第5,922,687号明細書を参照のこと)、荷電または非荷電脂質で処方されたDNA、リポソームにおいて処方されたDNA、乳化されたDNA、ウイルスベクターに含まれるDNA、トランスフェクションを容易にするタンパク質もしくはポリペプチドと共に処方されたDNA、標的化するタンパク質またはポリペプチドと共に処方されたDNA、カルシウム沈殿剤で処方されたDNA、挿入キャリア分子に結合されたDNA、およびアジュバントと共に処方されたDNAを含む。これに関して、従来のワクチン処方におけるアジュバントの使用に関する事実上すべての考慮が、DNAワクチンの処方にも当てはまることが認められる。
組換え体ウイルスまたは生体キャリアベクターはまた、ヒトにおける生ワクチンとして直接使用してもよい。従って、本発明はまた、表13および14において開示されるペプチドの少なくとも1つをコードする核酸を含んでなる組換え体ウイルス、発現ベクターまたはプラスミド、ならびに宿主細胞に関する。
本発明の好適な実施形態では、核酸またはミニ遺伝子はベクターの形態で導入され、ここで、発現は、ウイルスプロモーターの制御下にある。従って、本発明のさらなる実施形態は、本明細書において記載のペプチドの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、それぞれのペプチドを発現することが可能である発現ベクター、発現ベクターを含んでなる宿主細胞ならびに本明細書に記載のペプチドを産生させ、精製する方法、本明細書に記載のペプチドならびに薬学的に許容可能なキャリアおよび/またはアジュバントを含んでなる医薬組成物である。「本明細書に記載のペプチド」は、表13および14において開示されるペプチドを指す。
核酸ワクチンの処方および使用に関する詳細な開示内容は、例えば、ドネリー J.J.(Donnelly J.J.)ら、1997年および1997Aにより利用可能である。発現ベクターの例には、ワクシニア(vaccinia)または鶏痘(fowlpox)のような弱毒ウイルス宿主が含まれる。本アプローチの例として、ワクシニアウイルスは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして使用される。宿主への導入時に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって、宿主CTLおよび/またはHTL応答を誘発する。ワクシニア(vaccinia)ベクター、例えば、Modified Vaccinia Ankara(MVA)、および免疫化プロトコルにおいて有用な方法は、例えば、米国特許第4,722,848号明細書に記載されている。もう1つのベクターは、BCG(カルメット・ゲラン桿菌(Bacille Calmette Guerin))である。BCGベクターについては、ストウバー(Stover)ら、1991年に記載されている。さらなる例は:アルファウイルス属(Alphaviruses)(セムリキ森林ウイルス(Semliki Forest Virus)、シンドビスウイルス(Sindbis Vrius)、ベネズエラ馬脳炎ウイルス(Venezuelan Equine Encephalitis Virus)(VEE))、導入遺伝子単純ヘルペスウイルス(HERPES SIMPLEX VIRUS)(HSV)、アデノウイルス(Adenovirus)(ヒトまたはサル)の複製欠損株、SV40ベクター、CMVベクター、パピローマウイルス(papilloma virus)ベクター、およびエプスタイン・バール(Epstein Barr)ウイルス由来のベクターである。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化に有用な広範な多様性の他のベクター、例えば、レトロウイルスベクター、チフス菌(Salmonella Typhi)ベクター、無毒化された炭素菌毒素ベクターなどは、本明細書の記載から当業者に明らかである。
さらなるベクター修飾は、ミニ遺伝子発現および免疫原性を至適にするために所望され得る。場合により、イントロンには、効率的な遺伝子発現が要求され、1つもしくはそれ以上の合成または天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写された領域に組み入れられ得る。mRNA安定化配列および哺乳動物細胞における複製のための配列の封入はまた、ミニ遺伝子発現の増加のために考慮され得る。
さらに、免疫刺激性配列(ISSまたはCpG)は、核酸ワクチンの免疫原性において役割を果たすようである。免疫原性を増強することが所望であれば、ミニ遺伝子コーディング配列以外に、これらの配列をベクターに含めることができる。
いくつかの実施形態では、ミニ遺伝子によってコードされるエピトープおよび第2のタンパク質(免疫原性を増加または減少するために含められる)の両方の産生を可能にするバイシストロニックな発現ベクターを使用することができる。同時発現される場合、免疫応答を有益に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例として、サイトカイン(例えば、IL−2、IL−12、GM−CSF)、サイトカイン誘導性分子(例えば、LeIF)、同時刺激分子、またはHTL応答については、pan−DR結合性タンパク質(Padre(登録商標)、Epimmune、San Diego、カリフォルニア州)が挙げられる。
ヘルパー(HTL)エピトープは、細胞内標的化シグナルに接合させ、発現されるCTLエピトープとは個別に発現させることができる;これは、CTLエピトープとは異なる細胞コパートメントへのHTLエピトープの指向性を可能にする。必用であれば、これは、HTLエピトープのHLAクラスII経路へのより効率的な侵入を容易にし得、それによって、HTL導入が改善される。HTLまたはCTL導入とは対照的に、免疫抑制分子(例えば、TGF−P)の同時発現によって免疫応答を特異的に減少することは、所定の疾患において有益であり得る。
マルチエピトープミニ遺伝子の使用については、例えば、米国特許第6,534,482号明細書;アン(AN)およびホイットン(Whitton)、1997年;トムソン(Thomson)ら、1996年;ホイットン(Whitton)ら、1993年;ハンケ(Hanke)ら、1998年に記載されている。例えば、HCVポリタンパク質配列の複数の領域から誘導されるスーパーモチーフおよび/またはモチーフを所有するHCVエピトープをコードするマルチエピトープDNAプラスミド、PADRE(登録商標)普遍的ヘルパーT細胞エピトープ(またはHCV由来の複数のHTLエピトープ)、ならびに小胞体転移性シグナル配列を操作することができる。
ペプチドもしくはポリエピトープポリペプチドをコードする核酸またはミニ遺伝子、あるいはペプチドまたはポリエピトープペプチド自体を、単独でまたは当該分野において公知の他の治療を組み合わせて、投与することができる。さらに、本発明のポリペプチドおよび核酸は、例えば、アジュバントまたはサイトカイン(もしくはサイトカインをコードする核酸)との同時投与によって、免疫応答を増強するように設計された他の処置との組み合わせで投与することができ、これは、は当該分野において周知である。従って、本発明のペプチドまたは核酸あるいはワクチン組成物はまた、インターフェロンのような抗ウイルス薬、もしくはウイルス感染他の処置と組み合わせて使用することができる。
タンパク質または(ポリ)ペプチドに基づく医薬組成物に関するアジュバントの使用に関する本明細書におけるすべての開示内容は、必要な変更を加えて核酸ワクチン化技術におけるそれらの使用に当てはめられる。同じことが、処方および態様および投与経路に関する他の考慮についても言え、従って、従来の医薬組成物と組み合わせて本明細書において考察されるこれらの考慮もまた、核酸ワクチン化技術におけるそれらの使用に準用する。
さらなる実施形態において、本発明は、HCVに対して免疫を誘導する本明細書に記載のペプチドおよび/または核酸の使用に関し、前記ペプチドおよび/または核酸は、時間および化合物の系列の部分として使用されることを特徴とする。これに関して、用語「時間および化合物の系列」は、免疫応答を誘発するのに使用される化合物を時間間隔で個体に投与することを指すことを理解すべきである。後者の化合物は、次の成分:ペプチドもしくはポリエピトープペプチド、核酸もしくはミニ遺伝子またはベクターのいずれかを含んでなり得る。
これに関して、系列は、以下のいずれかを投与することを含んでなる:
(i)ペプチドもしくはポリエピトープペプチド、あるいは
(ii)核酸、ミニ遺伝子またはベクター、ここで、前記核酸、ミニ遺伝子またはベクターは、同時、もしくは交互の時間間隔を含む異なる時間間隔で、投与することができる、あるいは
(iii)核酸、ミニ遺伝子もしくはベクターと組み合わされたペプチドまたはポリエピトープペプチド、ここで、前記ペプチドまたはポリエピトープペプチドおよび前記核酸、ミニ遺伝子またはベクターは、同時、もしくは交互の時間間隔を含む異なる時間間隔で、投与することができる、あるいは
(iv)時間間隔で、おそらく、他のペプチドもしくは核酸もしくはベクターと組合された(i)または(ii)のいずれか一方。
(i)ペプチドもしくはポリエピトープペプチド、あるいは
(ii)核酸、ミニ遺伝子またはベクター、ここで、前記核酸、ミニ遺伝子またはベクターは、同時、もしくは交互の時間間隔を含む異なる時間間隔で、投与することができる、あるいは
(iii)核酸、ミニ遺伝子もしくはベクターと組み合わされたペプチドまたはポリエピトープペプチド、ここで、前記ペプチドまたはポリエピトープペプチドおよび前記核酸、ミニ遺伝子またはベクターは、同時、もしくは交互の時間間隔を含む異なる時間間隔で、投与することができる、あるいは
(iv)時間間隔で、おそらく、他のペプチドもしくは核酸もしくはベクターと組合された(i)または(ii)のいずれか一方。
本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与についての指示書を伴うキットの形態で提供され得る。典型的に、キットは、容器、好ましくは、単位剤形における所望されるペプチド組成物および投与のための指示書を含む。代替的キットは、投与のための指示書と共に、容器、好ましくは、単位剤形における本発明の所望される核酸を伴うミニ遺伝子構築物を含む。IL−2またはIL−12のようなリンフォカインもまた、キットに含まれ得る。所望され得る他のキット成分は、例えば、滅菌シリンジ、追加投与、および他の所望される賦形剤を含む。
免疫応答を評価するためのペプチドの使用
ペプチドはまた、診断試薬としての用途を見出し得る。例えば、本発明のペプチドは、ペプチド、関連するペプチドまたは他の任意のHCVワクチンを用いる処置レジメンに対する特定の個体の感受性を決定するために使用され得、従って、現存の処置プロトコルを修飾するかまたは罹患個体の予後を決定するのに有益であり得る。さらに、ペプチドはまた、どの個体が慢性HCV感染を発達する実質的な危険性にあるかを推定するために使用され得る。
ペプチドはまた、診断試薬としての用途を見出し得る。例えば、本発明のペプチドは、ペプチド、関連するペプチドまたは他の任意のHCVワクチンを用いる処置レジメンに対する特定の個体の感受性を決定するために使用され得、従って、現存の処置プロトコルを修飾するかまたは罹患個体の予後を決定するのに有益であり得る。さらに、ペプチドはまた、どの個体が慢性HCV感染を発達する実質的な危険性にあるかを推定するために使用され得る。
従って、本発明は、HCVに暴露された被験体の結果を決定する方法であって、被験体が表13および14から選択される1つもしくはそれ以上のペプチドに対して免疫応答を有するかどうかを決定する工程を含んでなる、方法に関する。
本発明の好適な実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、免疫応答を評価するための試薬として使用することができる。評価しようとする免疫応答は、自然感染によってまたは試薬として用いられるべきペプチドを認識し、結合する抗原特異的CTLもしくはHTLの産生を生じ得る任意の因子を免疫原として使用することによって、誘導させることができる。ペプチド試薬は、免疫原として使用する必要はない。そのような解析に使用することができるアッセイシステムは、細胞内リンフォカインおよびインターフェロン遊離アッセイ、またはELISPOTアッセイついて染色するテトラマーのような比較的最近の技術的発展を含む。
例えば、本発明のペプチドは、抗原または免疫原への暴露後の抗原特異的CTLの存在について末梢血液の単核球を評価するためのテトラマー染色アッセイにおいて使用することができる。HLA−テトラマー複合体は、抗原特異的CTLSを直接可視化し(例えば、アグ(OGG)ら、1998年;およびアルトマン(Altman)ら、1996年を参照のこと)、末梢血液の単核球のサンプルにおける抗原特異的CTL集団の頻度を決定するために使用される。本発明のペプチドを使用するテトラマー試薬は、以下のとおりに作製され得る:HLA分子に結合するペプチドを、対応するHLA重鎖およびΒ2−ミクログロブリンの存在下で再フォールディングさせ、三分子複合体を作製する。複合体を、予めタンパク質に操作された部位における重鎖のカルボキシル末端で、ビオチン化する。次いで、ストレプトアビジンの添加によって、テトラマー形成を誘導する。蛍光標識されたストレプトアビジンによって、テトラマーを使用して、抗原−特異的細胞を染色することができる。次いで、例えば、フローサイトメトリーによって、細胞を同定することができる。そのような解析は、診断または予後の目的で使用してもよい。手順によって同定される細胞はまた、治療目的のためにも使用することができる。また、テトラマーの代替物として、ペンタマーまたはダイマーを使用することもできる(Current Protocols in Immunology(2000年)単元17.2、補遺35)。
本発明のペプチドはまた、免疫リコール応答を評価するための試薬として使用してもよい。(例えば、バートニ(Bertoni)ら、1997年およびパーマ(Perma)ら、1991年を参照のこと)。例えば、特異的ペプチドを使用して、HCV感染を伴う個体由来の患者PBMCサンプルを、抗原特異的CTLまたはHTLの存在について、解析することができる。単核球細胞を含有する血液サンプルを、PBMCを培養し、本発明のペプチドを伴う細胞を刺激することによって、評価することができる。適切な培養期間後、例えば、細胞障害性活性(CTL)またはHTL活性について、拡大培養した細胞集団を解析することができる。
ペプチドはまた、ワクチンの効力を評価するための試薬として使用してもよい。
例えば、上記の方法のいずれかを使用して、免疫原をワクチン接種した患者から得られるPBMCを、解析することができる。患者をHLA型で分類し、該患者に存在するアレル特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬を、解析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、PBMCサンプルにおけるエピトープ特異的CTLおよび/またはHTLの存在によって示される。
本発明のペプチドはまた、当該分野において周知の技術を使用して、抗体を作製するために使用することができる(例えば、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,Wiley/Greene、ニューヨーク州;およびAntibodies A Laboratory Manual,Harlow and Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989年を参照のこと)。そのような抗体は、HLA分子に関するペプチドを認識する抗体、即ち、ペプチドMHC複合体に結合する抗体を含む。
表
本発明のペプチドを、表1〜14に示す。
本発明のペプチドを、表1〜14に示す。
本明細書において使用されるように、「CS_fr」および「CS_to」は、図1または2において開示されるHCVコンセンサス配列の残基番号に対するコンセンサス配列の「〜から」および「〜まで」を意味する。
S:強、Kdpred<0.1μM;M:中間、Kdpred0.1〜1μM;W:弱、Kdpred1〜10μM
S:強、Kdpred<0.1μM;M:中間、Kdpred0.1〜1μM;W:弱、Kdpred1〜10μM
実施例1:Algonomicsアルゴリズムを使用するCTL特異的HCVペプチドペプチドの同定
標的化すべきHLAクラスIタンパク質サブクラスを次のように規定する:HLA−A01、02、03および24;HLA−B07、08、35および44;HLA−Cw04、−Cw06およびCw07。
標的化すべきHLAクラスIタンパク質サブクラスを次のように規定する:HLA−A01、02、03および24;HLA−B07、08、35および44;HLA−Cw04、−Cw06およびCw07。
これらのHLA−クラスIサブクラスを、既知のホモログ構造に基づいてモデル化する。
X線データに基づいて、前記HLAクラスIに結合した異なるペプチドについての所定のHLAクラスIサブクラスにおける主鎖の立体配座の変更について徹底的分析を行う。この解析により、骨格多様性が生じる場合に適用される規則が得られる。
一連のエピトープに基づき、Algonomicsフレキシブル・ペプチド・ドッキング・ツール(Algonomics flexible peptide docking tools)を使用して、HLA−クラスIサブクラスのそれぞれについて平均で8〜10の異なるHLAクラスIペプチド複合体が構成される(ここで、ペプチドの主鎖および側鎖はフレキシビリティ、ならびにHLA分子の側鎖とみなされる)。これは、合計で88〜110種の異なる3次元モデルを生じる。
主鎖のフレキシビリティについての上記の規則を使用することによって、および/または分子動力学技術もしくは主鎖の擾乱/弛緩アプローチを使用することによって、上記のモデルの結合ペプチドの付近の主鎖の立体配座が異なる約5つの異なるバージョンを誘導する。従って、HLA−クラスIペプチド複合体の約500の異なる3次元モデルが作成される。
HLA−クラスIペプチドモデルのそれぞれについて、HLA分子の周囲に関するペプチド部分の配列多様性の推定を行う:ペプチド骨格に沿って、すべての既知のHCV遺伝子型についての目的のすべてのHCVタンパク質配列を挿通し、各「挿通した」ペプチドについて、それが、基礎になるHLA−クラスIを伴う安定な複合体を形成し得る可能性を評価する。
これは、Extended Dead−End Eliminationフレームワーク内で開発されているAlgonomicsアドバンスト・インバース・フォールディング・ツール(Algonomics’ advanced inverse folding tools)を使用して行う。この解析の終了点は、11のHLAクラスIサブクラスのそれぞれについての結合性ペプチドのリストである。
実施例2:4つの異なるアルゴリズムを使用するCTL特異的B07拘束性ペプチドの同定
HLA B07については、最も良好なスコアのペプチドの選択は、HCVコンセンサス配列1bを使用する3つのオンライン推定サーバー(BIMAS、SyfpeithiおよびnHLAPred)、ならびに57のHCV配列を使用するEPIMMUNEにより記載のPICアルゴリズムから検索される。これらのペプチドは、8マー、9マー、10マー、および場合により、11マーのいずれかであり得る。400のペプチドを、BIMASから、250のペプチドをSyfpeithiから、100をnHLAPredから、および58をEpimmune由来のPICアルゴリズムから検索した。前記ペプチドを表15に示す。
HLA B07については、最も良好なスコアのペプチドの選択は、HCVコンセンサス配列1bを使用する3つのオンライン推定サーバー(BIMAS、SyfpeithiおよびnHLAPred)、ならびに57のHCV配列を使用するEPIMMUNEにより記載のPICアルゴリズムから検索される。これらのペプチドは、8マー、9マー、10マー、および場合により、11マーのいずれかであり得る。400のペプチドを、BIMASから、250のペプチドをSyfpeithiから、100をnHLAPredから、および58をEpimmune由来のPICアルゴリズムから検索した。前記ペプチドを表15に示す。
遺伝子型1aおよび1bの少なくともコンセンサス配列に存在するそれらのペプチドが選択される。表15は、それらのスコアを伴うこれらのすべてのペプチド、および個別のカラムにおける推定サーバーのそれぞれの指定された格付け番号、および異なる遺伝子型におけるそれらの発生を含有する。
遺伝子型および格付け番号に従う選択により、232の異なるペプチド配列がもたらされる、即ち、150+113+45+28=336。表16は、4つの推定サーバーのうち最小で2つがランク=<100を示すペプチドの選択を含有する。これは、40の異なる配列を表す。前記ペプチドを表13に最終的に組み入れる。
潜在的HLA B07ペプチドバインダーの選択を以下にまとめる:
BIMAS(B7):
出力推定サーバー:200 9マー
200 10マー
BIMASの結果:9マー+10マーをペーストし、BIMASスコアに対して分類する
→400のペプチド、9および10マーについての個別の格付け番号(2×1〜200)
→同じスコアが知られていないペプチドについてのBIMASランク付け
BIMAS選択:遺伝子型に対する選択(少なくとも1B+1Aコンセンサスにおいて):
→150ペプチド
BIMAS(B7):
出力推定サーバー:200 9マー
200 10マー
BIMASの結果:9マー+10マーをペーストし、BIMASスコアに対して分類する
→400のペプチド、9および10マーについての個別の格付け番号(2×1〜200)
→同じスコアが知られていないペプチドについてのBIMASランク付け
BIMAS選択:遺伝子型に対する選択(少なくとも1B+1Aコンセンサスにおいて):
→150ペプチド
Syfpeithi(B0702):
出力推定サーバー:3002 9マー
3001 10マー
Syfpeithiの結果:9マー+10マーをペーストし、Syfpeithiスコアに対して分類する
→250のペプチドを選択し、1格付け1〜250(126 9マー+124 10マー)
→同じスコアが知られていないペプチドについてのSyfpeithiランク付け
Syfpeithi選択:遺伝子型に対する選択(少なくとも1b+1aコンセンサスにおいて):
→113ペプチド
出力推定サーバー:3002 9マー
3001 10マー
Syfpeithiの結果:9マー+10マーをペーストし、Syfpeithiスコアに対して分類する
→250のペプチドを選択し、1格付け1〜250(126 9マー+124 10マー)
→同じスコアが知られていないペプチドについてのSyfpeithiランク付け
Syfpeithi選択:遺伝子型に対する選択(少なくとも1b+1aコンセンサスにおいて):
→113ペプチド
nHLAPred(B0702):
出力推定サーバー:200 9マー
なし 10マー
nHLAPredの結果:→100ペプチドを選択し、格付け1〜100
→同じスコアが知られていないペプチドについてのnHLAPredランク付け
nHLAPred選択:遺伝子型に対する選択(少なくとも1b+1aコンセンサスにおいて):
→45ペプチド
出力推定サーバー:200 9マー
なし 10マー
nHLAPredの結果:→100ペプチドを選択し、格付け1〜100
→同じスコアが知られていないペプチドについてのnHLAPredランク付け
nHLAPred選択:遺伝子型に対する選択(少なくとも1b+1aコンセンサスにおいて):
→45ペプチド
EPMN(B07):
EPMNの結果:モチーフを伴う85ペプチド(38 9マー+47 10マー) OK
0.17〜633519の間のPIC;PIC=<100を伴う64
EPMN選択:→遺伝子型に対する選択:少なくとも1/32において存在する58ペプチドを選択する
推定に用いられる1b配列EPMN
EPMN第2の選択:遺伝子型に対する選択(少なくとも1b+1aコンセンサスにおいて):
→28ペプチド(PIC=<100を伴う16)
EPMNの結果:モチーフを伴う85ペプチド(38 9マー+47 10マー) OK
0.17〜633519の間のPIC;PIC=<100を伴う64
EPMN選択:→遺伝子型に対する選択:少なくとも1/32において存在する58ペプチドを選択する
推定に用いられる1b配列EPMN
EPMN第2の選択:遺伝子型に対する選択(少なくとも1b+1aコンセンサスにおいて):
→28ペプチド(PIC=<100を伴う16)
実施例3:HLAクラスI競合細胞に基づく結合アッセイ
ペプチドとHLA分子の結合溝との相互作用について、ケスラー(KESSLER)ら(2003年)による記載の競合に基づく細胞ペプチド結合アッセイを使用して、研究する。簡単に説明すると、目的のクラスIアレルを発現するエプスタイン・バール(Epstein−Barr)ウイルス(EBV)形質転換B細胞系統(B−LCL)を使用する。EBV形質転換は、標準的手順(Current Protocols in Immunology,1991年、Wiley Interscience)に従って行う。天然の結合型クラスIペプチドを、酸処置により、B−LCLから溶出させ、遊離のクラスI分子を得る。続いて、B−LCLを、フルオレセイン(Fl)標識参照ペプチド、および滴定量の競合する試験ペプチドの混合物と共にインキュベートする。参照ペプチドは、HLA分子について既知の高い親和性を有するべきである。細胞結合型の蛍光をフローサイトメトリーによって決定する。Fl標識参照ペプチドの結合の阻害を決定し、IC50値を算出する(IC50=HLA分子の50%を占有し得る競合するペプチドの濃度)。参照ペプチドの親和性(Kd)を、個別の実験において決定し、該実験では、異なる濃度の参照ペプチドの直接結合をモニターし、1部位結合相互作用についてのモデルを使用して、データを解析する。競合するペプチドの阻害定数(Ki)(それらの親和性を反映する)を、以下のとおり算出する:
[FL−pep]:競合実験において使用されるFl標識ペプチドの濃度
ペプチドとHLA分子の結合溝との相互作用について、ケスラー(KESSLER)ら(2003年)による記載の競合に基づく細胞ペプチド結合アッセイを使用して、研究する。簡単に説明すると、目的のクラスIアレルを発現するエプスタイン・バール(Epstein−Barr)ウイルス(EBV)形質転換B細胞系統(B−LCL)を使用する。EBV形質転換は、標準的手順(Current Protocols in Immunology,1991年、Wiley Interscience)に従って行う。天然の結合型クラスIペプチドを、酸処置により、B−LCLから溶出させ、遊離のクラスI分子を得る。続いて、B−LCLを、フルオレセイン(Fl)標識参照ペプチド、および滴定量の競合する試験ペプチドの混合物と共にインキュベートする。参照ペプチドは、HLA分子について既知の高い親和性を有するべきである。細胞結合型の蛍光をフローサイトメトリーによって決定する。Fl標識参照ペプチドの結合の阻害を決定し、IC50値を算出する(IC50=HLA分子の50%を占有し得る競合するペプチドの濃度)。参照ペプチドの親和性(Kd)を、個別の実験において決定し、該実験では、異なる濃度の参照ペプチドの直接結合をモニターし、1部位結合相互作用についてのモデルを使用して、データを解析する。競合するペプチドの阻害定数(Ki)(それらの親和性を反映する)を、以下のとおり算出する:
推定されるペプチドを、標準的な技術を使用して合成し、対応するHLAアレルによるB−LCLへの結合について試験した。Fl標識参照ペプチドは、Cys誘導体として合成され、標識は、pH8.3(50mM重炭酸/1mM EDTA緩衝液)において、5−(ヨードアセトアミド)フルオレセインにより実施する。標識されたペプチドを脱塩し、C18RP−HPLCにより精製した。標識したペプチドを、質量分析により分析した。
例として、推定された強い結合性ペプチドとHLA−A02との相互作用を示す。HLA−A02ポジティブB−LCL(JY,ケスラー(JY,KESSLER)ら、2003年)は、Fl参照ペプチドFLPSDC(Fl)FPSVおよび推定されるペプチド(配列番号62〜配列番号93)の競合を解析するのに使用される。参照ペプチドのHLA A02への結合を図3に示す。1部位結合モデルに従ってデータを解析すると、約10nMの参照ペプチドの親和性を示す。典型的な競合実験を図4に示す。この特定の設定を、すべてのクラスC結合性ペプチドならびにHLA A24結合性ペプチドの一部に使用した。表13は、算出された阻害定数(Ki)を含有する。
実施例4:可溶性HLAを使用するHLAクラスIおよびII競合結合アッセイ
可溶性HLA分子に結合するペプチドの以下の例は、HLAクラスIおよびクラスIIペプチドの結合親和性の定量化を実証する。
可溶性HLA分子に結合するペプチドの以下の例は、HLAクラスIおよびクラスIIペプチドの結合親和性の定量化を実証する。
エプスタイン・バール(Epstein−Barr)ウイルス(EBV)形質転換ホモ接合細胞系統、線維芽細胞または形質転換体を、HLAクラスI分子の供給源として使用した。細胞溶解物を調製し、HLA分子を、開示されたプロトコル(シドニー(Sidney)ら、1998年;シドニー(Sidney)ら、1995年;セッテ(Sette)ら、1994年)に従って精製した。
HLA分子を、アフィニティークロマトグラフィーにより溶解物から精製した。溶解物を、適切な抗体を結合させたSepharose CL−4Bビーズのカラム上を通過させた。
細胞溶解物からのHLAの抽出に使用される抗体は、W6/32(HLA−A、−Bおよび−Cの場合)、B123.2(HLA−Bおよび−Cの場合)ならびにLB3.1(HLA−DRの場合)である。
次いで、抗HLAカラムを、1%NP−40中10mM Tris−HCL、pH8、PBS、0.4%n−オクチルグルコシドを含有するPBSで洗浄し、HLA分子を、0.4%N−オクチルグルコシドを含有する0.15M NaCl中50mMジエチルアミン、pH11.5で溶出させた。1/25容積の2M Tris、pH6.8を溶出物に添加して、pHを±pH8に低下させた。次いで、溶出物を、Centriprep30濃縮器(Amicon,Beverly、マサチューセッツ州)における遠心分離により、濃縮した。タンパク質含有量を、BCAタンパク質アッセイ(Pierce Chemical Co.,Rockford、イリノイ州)によって評価し、SDS−PAGEにより確認した。
ペプチドのクラスIおよびクラスII MHCへの結合を測定するのに利用されるプロトコルの詳細な説明については、(セッテ(Sette)ら、1994年;シドニー(Sidney)ら、1998年)により公開されている。簡単に説明すると、精製されたMHC分子(5〜500nM)を、多様な非標識ペプチドインヒビターおよび1〜10nM125I放射性標識プローブペプチドと共に、48時間、プロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下、0.05%Nonidet P−40(NP40)を含有するPBSにおいて、インキュベートした。すべてのアッセイは、pH7においてであったが、但し、DRB1*0301については、pH4.5で実施し、DRB1*1601(DR2w21 l)およびDRB4*0101(DRw53)については、pH5で実施した。
インキュベーション後、MHCペプチド複合体を、7.8mm×15cm TSK200カラム(TosoHaas 16215,Montgomeryville、ペンシルバニア州)上でのゲルろ過によって、遊離のペプチドから分離した。TSKカラムからの溶出物を、Beckman170放射性同位元素検出器に通過させ、放射能をプロットし、Hewlett−Packard3396A積分器を使用して積算し、結合したペプチドの画分を決定した。あるいは、MHCペプチド複合体を、抗HLA抗体で被覆したELISAプレート上で捕獲することによって、遊離のペプチドから分離した。遊離のペプチドを洗浄除去した後、上記と同じ方法を使用して、残留する反応性を測定した。
クロラミンT法を使用して、放射性標識ペプチドを、ヨウ素化した。
典型的に、予備実験では、各MHC調製物を、固定された量の放射性標識ペプチドの存在下で滴定し、全放射能のうち10〜20%に結合するのに必要なHLA分子の濃度を決定した。その後のすべての阻害および直接結合アッセイは、これらのHLA濃度を使用して、実施した。
これらの条件[label]<[HLA]およびIC50≧[HLA]下のため、測定されるIC50値は、真のKD値の合理的な近似値である。ペプチドインヒビターは、典型的に、120μg/ml〜1.2ng/mlの範囲の濃度で試験され、2〜4回の完全に独立した実験で試験される。異なる実験において得られるデータの比較を可能にするために、阻害に対するポジティブコントロールのIC50を、各試験されたペプチド(典型的に、放射性標識プローブペプチドの非標識のバージョン)のIC50で割ることによって、各ペプチドについての相対的結合値を算出する。データベース、および実験の相互比較の目的のために、相対的結合値を編集する。続いて、これらの値は、阻害に対するポジティブコントロールのIC50nMを、目的のペプチドの相対的結合で割ることによって、IC50nM値に変換して戻すことができる。このようなデータ編集の方法は、異なる日、または異なるロットの精製されたMHCで試験されているペプチドを比較するのに最も正確かつ一貫していることが証明されている。
この特定の設定値を、すべてのクラスAおよびB結合性ペプチドに使用した(但し、いくつかのHLA A24結合性ペプチドについては、細胞に基づく結合アッセイを使用した)。表13はIC50値を含有する。
HLA−DR精製に使用される抗体(LB3.1)はΑ鎖特異的であるため、βL分子は、β3(および/またはβ4およびβ5)分子から分離されない。結合アッセイのβ1特異性は、DRB1*0101(DR1)、DRB1*0802(DR8w2)、およびDRB1*0803(DR8w3)の場合において明白であり、ここで、β3は発現されない。それはまた、DRB1*0301(DR3)およびDRB3*0101(DR52a)、DRB1*0401(DR4w4)、DRB1*0404(DR4w14)、DRB1*0405(DR4w15)、DRB1*1101(DR5)、DRB1*1201(DR5w12)、DRB1*1302(DR6wl9)およびDRB1*0701(DR7)についても実証されている。DRB1*1501(DR2w2beta−1)、DRB5*0101(DR2w2beta−2)、DRBl*1601(DR2w21beta−1)、DRB5*0201(DR51Dw21)、およびDRB4*0101(DRw53)アッセイについてのβ鎖特異性の問題は、線維芽細胞の使用によって回避される。DRβ分子特異性に関するアッセイの開発およびバリデーションについては、先に記載されている(例えば、サウスウッド(Southwood)ら、1998年を参照のこと)。表14は、IC50値を含有する。
実施例5:CD8エピトープに対するヒトリコール応答を評価するためのペプチドの使用
本発明のペプチドエピトープは、患者における急性またはリコール応答のようなT細胞応答を評価するための試薬として使用される。そのような解析は、感染から回復しているか、HCVの慢性感染であるか、またはHCVワクチンをワクチン接種されている患者において実施することができる。
本発明のペプチドエピトープは、患者における急性またはリコール応答のようなT細胞応答を評価するための試薬として使用される。そのような解析は、感染から回復しているか、HCVの慢性感染であるか、またはHCVワクチンをワクチン接種されている患者において実施することができる。
例えば、PBMCは、感染から回復した患者から回収され、HLA型分類される。強いまたは中等度の親和性を伴う好適に結合している(より好ましくは、閾値未満の親和性)本発明の適切なペプチドエピトープは、次いで、該HLA型を所有する患者から誘導されるサンプルの解析に使用される。
これらの患者由来のPBMCは密度勾配において分離され、プレート化される。PBMCは、異なる時点でペプチドで刺激される。続いて、培養物は、細胞障害活性について試験される。
細胞障害性アッセイは、以下の様式で実施される。標的細胞(ヒト志願者または患者から確立される自家移植または同種のEBV形質転換B−LCLのいずれか;Current Protocols in Immunology,1991年)は、1晩、合成ペプチドエピトープと共にインキュベートされ、51Cr(Amersham Corp.,Arlington Heights、イリノイ州)で標識され、その後、それらは、洗浄され、放射能が計数される。細胞障害性パーセントは、次の式から決定される:100×[(実験的遊離−自発的遊離)/最大遊離−自発的遊離)]。最大の遊離は、標的の溶解によって決定される。
そのような解析の結果は、HLA拘束性CTL集団が、HCVまたはHCVワクチンへの先の暴露によって刺激されている程度を示す。
あるいは、HLA拘束性HCV特異的CTLエピトープに対する慢性および回復したHCV患者におけるヒトインビトロCTLリコール応答は、ヒトIFNγELISPOTアッセイにおいて評価され得る。例として、選択された組のHLA−A02拘束性ペプチドに対するHLA−A02ドナー(ホモ接合またはヘテロ接合)由来の細胞のインビトロリコール応答について記載する。基本的に、ヒトPBMCとHLA拘束性ペプチドとの1晩のインキュベーション後、インビトロCTLリコール応答は、IFN−γELISPOTアッセイにおいて可視化される。
同じことが、HLA−A*01、HLA−B*08およびHLA−Cw04、Cw06およびCw07についても行われている。
材料および方法
ヒトPBMC
それぞれ個々のペプチドに対するカットオフ値を決定するために使用される健康なドナー由来のPBMCは、標準的な手順に従って、単離される。
ヒトPBMC
それぞれ個々のペプチドに対するカットオフ値を決定するために使用される健康なドナー由来のPBMCは、標準的な手順に従って、単離される。
慢性HCV感染および(治療により)回復したHCV患者由来のPBMCは、HCV特異的応答を決定するために使用される。すべてのドナーは、HLA−A02ポジティブである。
IFNγELISPOTアッセイにおける使用のために、PBMCを、標準的な手順に従って、融解し、10%不活性化ウシ胎児血清(iFCS)を補充したRPMI培地で2回洗浄し、Buerker Counting Chambreにおいてトリパンブルー(Trypan Blue)で被覆する。細胞を、10%iFCSを補充した完全RPMI培地(=RPMI培地+NEAA+NaPy+ゲンタマイシン+βMeOH)に再懸濁し、適切な細胞密度にした。
HLA−A02拘束性CTLペプチド
HLA−A02拘束性HCVペプチドの選択を、それらの親和性(IC50)に基づいて行った。試験されるペプチドを表Bに示す。GILGFVFTLは、コントロールペプチドとして使用されるHLA−A02拘束性免疫優性インフルエンザ特異的エピトープである。すべてのペプチドは、100%DMSOにおいて5または10mg/mlで溶解され、水溶液中−20℃で貯蔵される。
HLA−A02拘束性HCVペプチドの選択を、それらの親和性(IC50)に基づいて行った。試験されるペプチドを表Bに示す。GILGFVFTLは、コントロールペプチドとして使用されるHLA−A02拘束性免疫優性インフルエンザ特異的エピトープである。すべてのペプチドは、100%DMSOにおいて5または10mg/mlで溶解され、水溶液中−20℃で貯蔵される。
使用直前、ペプチドを、10%iFCSを補充した完全RPMI培地でさらに希釈し、10μg/mlの最終濃度のIFNγELISPOTアッセイに使用する。
サイトカイン
凍結乾燥されたヒトIL−7(R&D207−IL)およびヒトIL−15(R&D215−IL)を、10%iFCSを補充したRPMI培地に5μg/mlで再構成し、水溶液中−70℃で貯蔵される。
凍結乾燥されたヒトIL−7(R&D207−IL)およびヒトIL−15(R&D215−IL)を、10%iFCSを補充したRPMI培地に5μg/mlで再構成し、水溶液中−70℃で貯蔵される。
両方のサイトカインは、IFNγELISPOTアッセイにおいて、サイトカインあたり0.5ng/mlの最終濃度で使用される。
ヒトIFNγELISPOT
ELISPOTプレートのメンブランを予め湿潤させるために、50μlのエタノール99%p.a.を各ウェルに添加する。室温で10分間後、エタノールを、すべてのウェルを、精製水で2回、PBSで1回洗浄することによって、取り出す。
ELISPOTプレートのメンブランを予め湿潤させるために、50μlのエタノール99%p.a.を各ウェルに添加する。室温で10分間後、エタノールを、すべてのウェルを、精製水で2回、PBSで1回洗浄することによって、取り出す。
予め湿潤させた96ウェルELISPOTプレートを、1晩、抗ヒトIFNγ抗体(Mabtech Mab−1−D1K)で被覆し、2時間、10%iFCSを補充したRPMI培地でブロックする。
PBMCを、10%iFCSを補充した完全RPMI培地に再懸濁し、3×105細胞/ウェル〜4×105細胞/ウェルの間の要求される細胞密度で、被覆されたELISPOTプレートにおいて3連で播種する。細胞を、10μgのペプチド/mlでHLA−A02拘束性(CTL)ペプチドと共に、またはポジティブコントロールとして2μg/mlで多クローン刺激フィトヘムアグルチニン(pHA)と共に、サイトカインを伴うかまたは伴わずに、インキュベートする。
23時間のインキュベーション後、すべての細胞を溶解し、洗浄除去し、プレートを、ビオチン化抗ヒトIFNγ抗体(Mabtech Mab7−B6−1−bio)およびストレプトアビジン−HRP(BD557630)でさらに展開する。スポットを、基質としてAEC(BD551951)を使用して、可視化する。プレートを流水(tap water)で濯ぎ、着色反応を停止する。プレートを乾燥した後、A.EL.VIS ELISPOTリーダーを使用して、スポット/ウェルの数を決定する。すべてのスポットは、IFNγ産生CD8+細胞である。
データ解析のための方法
少なくとも一人の患者がペプチドに対して活性な応答(=カットオフレベルP80を超える応答)を示し、ここで、この活性な応答がサイトカインカクテル(IL−7+IL−15)の添加を伴うおよび伴わないの両方で認められる場合、該ペプチドはヒトリコールにおいてポジティブとみなされる。
少なくとも一人の患者がペプチドに対して活性な応答(=カットオフレベルP80を超える応答)を示し、ここで、この活性な応答がサイトカインカクテル(IL−7+IL−15)の添加を伴うおよび伴わないの両方で認められる場合、該ペプチドはヒトリコールにおいてポジティブとみなされる。
カットオフ値は、健康な個体(n=20)における免疫応答を測定することによって決定され、統計的にp80およびp90値に基づく(=それぞれ個々のペプチドについてのバックグランドの免疫応答の格付け後、バックグランドの免疫応答のそれぞれ80%、90%がこのカットオフ値未満である)。全体として、サイトカインの添加後、より高いカットオフが測定される。
結果
表Bは、1組のHLA−A02結合性ペプチドの結果を含有する。結果「+」もまた、表13に示される。
表Bは、1組のHLA−A02結合性ペプチドの結果を含有する。結果「+」もまた、表13に示される。
クラスII拘束性HTL応答もまた、同等の方法で解析することができる。
実施例6:トランスジェニック(Tg)または代理母マウスにおけるCTLエピトープの活性
本実験は、1つもしくはそれ以上のHCV CTLエピトープの使用によるトランスジェニックマウスにおけるCTLの誘導を例示する。エピトープ組成物は、本発明に記載およびより具体的には、表13において示されるCTLエピトープの任意の組み合わせを含んでなることができる。
本実験は、1つもしくはそれ以上のHCV CTLエピトープの使用によるトランスジェニックマウスにおけるCTLの誘導を例示する。エピトープ組成物は、本発明に記載およびより具体的には、表13において示されるCTLエピトープの任意の組み合わせを含んでなることができる。
同様に、代理母マウスは、トランスジェニック動物が得られない場合に使用することができる。
代理母マウスは、特定のヒトHLA分子に似たMHC分子を発現する非トランスジェニック動物であり、それ自体ヒトCTLおよび/またはHTLエピトープの評価に有用である。代理母マウスの例には:HLA−A24についてはCB6F1、HLA−B44についてはCBA、HLA−A01についてはPLJおよびHLA−DRについてはBalb/Cがある。
HLA−B07およびB35エピトープ
この特定の実施例について、実験は、表13、セクションB07およびB35において開示されるKi<1000nMを伴うペプチドの免疫原性を評価するために実施される。
この特定の実施例について、実験は、表13、セクションB07およびB35において開示されるKi<1000nMを伴うペプチドの免疫原性を評価するために実施される。
HLA−B7 Tgマウス(F1、Balb/cと交配)におけるIFAにおいて乳化されたB7またはB35に結合するペプチドによって誘導されるHLA−B7拘束性CTL応答が評価される。比較として、生来のマウスのグループを含めた。免疫化HLA−B7/KbトランスジェニックマウスにおけるHLA−B7および−B35拘束性エピトープに対するCTL応答の大きさが生来の動物の応答と比較される。
実験設定
HLA−B7/Kbトランスジェニックマウス(BALB/c×HLA−B7/Kb.C57BL/6F1マウス;H2bxd)、(雄性および雌性の両方)を利用した。マウスは、8〜14週齢の間で使用した。各グループは、3匹のマウスおよび4匹のマウスからなる生来の群よりなった。各設定は2つの独立した実験で反復した。
HLA−B7/Kbトランスジェニックマウス(BALB/c×HLA−B7/Kb.C57BL/6F1マウス;H2bxd)、(雄性および雌性の両方)を利用した。マウスは、8〜14週齢の間で使用した。各グループは、3匹のマウスおよび4匹のマウスからなる生来の群よりなった。各設定は2つの独立した実験で反復した。
免疫化および試験スキームを表17に示す。一般に、HLA−B7/Kbマウスを、不完全フロイントアジュバント(IFA)において乳化されたB7拘束性CTLペプチドのプールで免疫化した。25μg/ペプチドの用量で類似の結合親和性の9つのペプチドプール(それぞれが4〜6CTLペプチドからなる)、および120μgのHTLエピトープ、HBV Core128(TPPAYRPPNAPIL)(動物において既知のHTLエピトープ)を試験した。各実験は3つのプールを試験し、各プールは、2つの独立した実験で試験された。生来の(naive)動物(非免疫化HLA−B7/Kbトランスジェニックマウス)は、コントロール群として各実験に含めた。マウスの尾の付け根の皮下に100μlのエマルジョンで、免疫化した。免疫化の11〜14日後、マウスを安楽死させ、脾臓を取り出した。
膵臓を、15−ml組織グラインダーで破砕し、得られる単細胞懸濁液をDNASE溶液(PBS中30mg/ml DNAseの10μl/膵臓)で処置し、2%FCSを伴うRPMI−1640において洗浄し、計数した。次いで、脾臓細胞を、4℃、15〜20分間、300μl MACS緩衝液(0.5%BSAおよび2MM EDTAを伴うPBS)中、35μlのMACS CD8a(Ly−2)マイクロビーズ/108細胞と共に、製造者の仕様書に従って、インキュベートした。次いで、細胞を、MACSカラム(Milltenyi)に適用し、4回洗浄した。10%FBSを補充したHEPESを伴うRPMI1640培地(Gibco Life Technologies)、4mM L−グルタミン、50μM2−ME, 0.5mMピルビン酸ナトリウム、100μg/mlストレプトマイシンおよび100U/mLペニシリン(RPMI−10)からなる培養培地においてカラムから細胞を取り出し、洗浄し、再度計数した。
IFN−γELISPOTアッセイを使用して、CTLエピトープに対する応答を評価した。簡単に説明すると、IPメンブランに基づく96ウェルプレート(MILLIPORE、BEDFORD、マサチューセッツ州)を、1晩、4℃、Α−マウスIFN−γモノクローナル抗体(Mabtech MabAN18)で、PBS中10μg/mlの濃度で被覆した。PBSで3回洗浄後、RPMI−10を各ウェルに添加し、プレートを37℃で1時間、インキュベートし、プレートをブロックした。精製されたCD8+細胞を、ブロックされたメンブランプレートに、4×105細胞/ウェルの細胞濃度で適用した。
ペプチドをRPMI−10に溶解し(最終ペプチド濃度10μg/ml)、標的細胞(105HLA−B7/Kb形質転換Jurkat細胞/ウェル)と混合した。培地のみおよびCONA(10μg/ml)のコントロールもまた利用した。標的細胞/ペプチド混合物を、メンブランプレートにおいてエフェクター細胞上に重層し、20時間、37℃、5%CO2でインキュベートした。
次いで、培地および細胞を、PBS+0.05%Tween−20で洗浄してELISPOTプレートから離し、プレートをαマウスビオチン化α−IFN−γ抗体(Mabtech MabR4−6A2−ビオチン)と共に、1μg/mlの最終濃度で4時間、37℃でインキュベートした。洗浄後、プレートを、製造者の指示に従って調製したアビジン−ペルオキシダーゼ複合体(VECTASTAIN)と共にインキュベートし、室温で1時間、インキュベートした。最後に、プレートを、AEC(1錠の3−アミノ−9−エチルカルバゾールを2.5mlジメチルホルムアミドに溶解し、酢酸緩衝液で50mlに調節した;25μlの30%H2O2をAEC溶液に添加した)で展開し、洗浄し、乾燥した。スポットを、AIDプレートリーダーを使用して計数した。
データ解析
各ペプチドを、免疫化したグループおよび生来のグループの両方において、認識について試験した。各実験条件について、データを3連で回収した。
各ペプチドを、免疫化したグループおよび生来のグループの両方において、認識について試験した。各実験条件について、データを3連で回収した。
培地コントロールに対する生データを、各グループ(生来および免疫化の両方)について平均化した。正味のスポットを、グループ内の生データから各グループの平均培地コントロールを差し引くことによって、算出した。次いで、平均および標準誤差を各ペプチドについて算出し、平均および標準誤差を、(2.5の因子を掛けることによって)106細胞に正規化した。最後に、タイプ1、片側T検定を実施して、免疫化したグループのデータを、生来のコントロールのデータと比較した。データをペプチド特異的IFNγ産生細胞/106CD8+細胞の数として報告する。
2つの再現実験由来のデータを比較する。不一致のデータを伴うペプチド(即ち、一方の実験ではポジティブおよび他方の実験ではネガティブ)は、第3の実験において反復する。2つもしくはそれ以上の実験由来のデータは、上記のように平均することができる。
B7およびB35拘束性ペプチドのペプチド免疫原性結果
データを表18(B7)および19(B35)に示し、2〜4回の独立した実験における応答を提示する。生来のマウスの応答と比較した場合、26のペプチドがポジティブの応答を示した(p≦0.1)。
データを表18(B7)および19(B35)に示し、2〜4回の独立した実験における応答を提示する。生来のマウスの応答と比較した場合、26のペプチドがポジティブの応答を示した(p≦0.1)。
試験したペプチドのうち10が、B7およびB35の両方(6ペプチド)またはB35のみ(4ペプチド)に結合した。B7およびB35の両方に結合した6ペプチドのうち、4は、HLA−B7/Kbトランスジェニックマウスにおいて免疫原性であった(表2)。B35のみに結合した4ペプチドは、B7トランスジェニックマウスにおいてすべてネガティブであった。
HLA−A01、A02、A03/A11、A24およびB44エピトープ
それぞれのTGまたは代理母動物における同等の実験を、表13において開示されるKi<1000nMを伴うすべてのペプチドにおいて実施した。結果を表20〜25に示す。
それぞれのTGまたは代理母動物における同等の実験を、表13において開示されるKi<1000nMを伴うすべてのペプチドにおいて実施した。結果を表20〜25に示す。
HLA−A24エピトープ
本実験では、ペプチド応答の解析が個々のマウスにおいて実施されるHLA−A24結合性エピトープの免疫原性の評価について、僅かに異なるアプローチを使用する。ELISPOTの結果は、マウスあたり百万個の(CD8選択性)脾臓細胞あたりのペプチド特異的IFN−γ産生細胞の数として報告し、反応する動物における応答の3連の(刺激を伴わないネガティブコントロール条件を差し引くことによる)平均のΔ値を算出する。少なくとも1つ動物が該ペプチドに対して有意なポジティブな応答を示す場合、ペプチドは、マウスモデルにおいて免疫原性であるとみなされる。
本実験では、ペプチド応答の解析が個々のマウスにおいて実施されるHLA−A24結合性エピトープの免疫原性の評価について、僅かに異なるアプローチを使用する。ELISPOTの結果は、マウスあたり百万個の(CD8選択性)脾臓細胞あたりのペプチド特異的IFN−γ産生細胞の数として報告し、反応する動物における応答の3連の(刺激を伴わないネガティブコントロール条件を差し引くことによる)平均のΔ値を算出する。少なくとも1つ動物が該ペプチドに対して有意なポジティブな応答を示す場合、ペプチドは、マウスモデルにおいて免疫原性であるとみなされる。
実施例7:トランスジェニック(Tg)および代理母マウスにおけるHTLエピトープの活性
HLA−DRペプチドの免疫原性を試験するための実験は、完全フロイントがアジュバントとして使用される点で、実施例6と若干異なる。ペプチドは、DRB1*0401−Tgマウスまたは代理母マウス(例えば、Balb/cおよびCBA)のいずれかにおいて試験される。この特定の実施例では、HLA拘束性ペプチド応答は、プールされたサンプルにおいて解析される。
HLA−DRペプチドの免疫原性を試験するための実験は、完全フロイントがアジュバントとして使用される点で、実施例6と若干異なる。ペプチドは、DRB1*0401−Tgマウスまたは代理母マウス(例えば、Balb/cおよびCBA)のいずれかにおいて試験される。この特定の実施例では、HLA拘束性ペプチド応答は、プールされたサンプルにおいて解析される。
DR4トランスジェニックマウスのデータを表26に示し、2つの独立した実験における応答を提示する。17のペプチドが、これらのマウスにおいて、ポジティブの応答を付与した(>10SFC/106CD4+細胞およびp≦0.05として規定される)。
H2bxdバックグランド(Balb/c)のデータを表27に示し、2つの独立した実験における応答を提示する。7のペプチドが、これらのマウスにおいて、ポジティブの応答を付与する(>10SFC/106CD4+細胞およびp≦0.05として規定される)。
CBAマウス(H2k)のデータを表28に示し、2つの独立した実験における応答を提示する。12のペプチドが、これらのマウスにおいて、ポジティブの応答を付与する(>10SFC/106CD4+細胞およびp≦0.05として規定される)。
図7に示されるように、結合性と免疫原性との間には緊密な関係が検出される。
500nM未満の結合親和性を伴うすべてのペプチドが免疫原性であると結論付けることができる。従って、DRB1の閾値親和性は500nMである。
実施例8:ネステッドエピトープにおいて包埋されるCTLエピトープの免疫原性
本実施例は、感受性マウスに注入される場合のネステッドエピトープにおいて包埋されるエピトープの選択に対するCTL応答の誘導を例示する。同様の実験を、ネステッドエピトープにおいて包埋されるエピトープに対するHTL応答の誘導を例示するために実施することができる。
本実施例は、感受性マウスに注入される場合のネステッドエピトープにおいて包埋されるエピトープの選択に対するCTL応答の誘導を例示する。同様の実験を、ネステッドエピトープにおいて包埋されるエピトープに対するHTL応答の誘導を例示するために実施することができる。
本実施例については、A24拘束性エピトープを含有するネステッドエピトープを注入されたHLA A24 TgマウスにおけるA24特異的T細胞応答が測定される。個々のHLA−A24拘束性エピトープに対するCTL応答の大きさが決定され、緩衝液/アジュバント(CFA)コントロールで免疫化されるマウス由来の細胞におけるこれらのエピトープに対して測定される応答と比較される。500nM未満の親和性(KI)を伴うすべてのHLA−A24エピトープ結合性を試験した。
これらのネステッドエピトープにおいて包埋され、他のHLA−クラスI型に対して拘束性であるエピトープの免疫原性は、感受性マウスにおいて同等の方法で評価することができる。
インビボ実験設定
5匹のマウス(8〜10週齢、無作為化された雌性および雄性)の2つのグループが含まれ、各グループの動物は、CFAに乳化されたネステッドエピトープかまたはネガティブコントロールとして、ペプチドを伴わずにCFAにおいて乳化された緩衝液のいずれか一方の単回注入を受ける。すべての注入は、尾の付け根の皮下において実施した。本特定の実験では、ネステッドエピトープFWAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA(配列番号2278)を評価した(表29)。
5匹のマウス(8〜10週齢、無作為化された雌性および雄性)の2つのグループが含まれ、各グループの動物は、CFAに乳化されたネステッドエピトープかまたはネガティブコントロールとして、ペプチドを伴わずにCFAにおいて乳化された緩衝液のいずれか一方の単回注入を受ける。すべての注入は、尾の付け根の皮下において実施した。本特定の実験では、ネステッドエピトープFWAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA(配列番号2278)を評価した(表29)。
インビトロ実験設定
すべての個々の動物由来の脾臓細胞を、注入の11〜14日後に単離する。直接的エクスビボIFN−γELISPOTアッセイを、代理母CTLのリードアウトとして使用する。このため、それぞれの個々のマウス由来のCD8脾臓細胞は、脾臓細胞(の一部)に対してポジティブな磁気ビーズの分離によって精製される。
・グループ05 040/3では、それぞれの個々のマウス由来の精製されたCD8脾臓細胞(2.105細胞/ウェル)における応答を、HLA−A24/Kb分子を提示する抗原提示細胞(104細胞/ウェル)およびγ−照射同系膵臓細胞(2.105細胞/ウェル)に対してHLA−A24−特異的ペプチド(10μg/ml)を提示することによって、評価する。充填後、洗浄により過剰のペプチドを取り出す。
・グループ05 040/5では、各マウス由来の脾臓細胞を、CD8精製前にプールする。上記と同じ条件を使用するIFN−γELISPOTを実施して、試験するすべてのペプチドに対して基準となる応答を決定する。
すべての個々の動物由来の脾臓細胞を、注入の11〜14日後に単離する。直接的エクスビボIFN−γELISPOTアッセイを、代理母CTLのリードアウトとして使用する。このため、それぞれの個々のマウス由来のCD8脾臓細胞は、脾臓細胞(の一部)に対してポジティブな磁気ビーズの分離によって精製される。
・グループ05 040/3では、それぞれの個々のマウス由来の精製されたCD8脾臓細胞(2.105細胞/ウェル)における応答を、HLA−A24/Kb分子を提示する抗原提示細胞(104細胞/ウェル)およびγ−照射同系膵臓細胞(2.105細胞/ウェル)に対してHLA−A24−特異的ペプチド(10μg/ml)を提示することによって、評価する。充填後、洗浄により過剰のペプチドを取り出す。
・グループ05 040/5では、各マウス由来の脾臓細胞を、CD8精製前にプールする。上記と同じ条件を使用するIFN−γELISPOTを実施して、試験するすべてのペプチドに対して基準となる応答を決定する。
データ解析のための方法
ELISPOTの結果を、マウスまたはプールしたグループあたり百万個の(CD8/CD4選択性)脾臓細胞あたりのペプチド特異的IFN−γ産生細胞の数として報告する。(刺激を伴わないネガティブコントロールを差し引くことによる)3回反復の平均/メジアンデルタ値に基づいて、試験する各エピトープの異なるグループ/実験設定値間の記述的比較を行う。
ELISPOTの結果を、マウスまたはプールしたグループあたり百万個の(CD8/CD4選択性)脾臓細胞あたりのペプチド特異的IFN−γ産生細胞の数として報告する。(刺激を伴わないネガティブコントロールを差し引くことによる)3回反復の平均/メジアンデルタ値に基づいて、試験する各エピトープの異なるグループ/実験設定値間の記述的比較を行う。
さらに、コントロールの非免疫化マウスにおける非特異的なバックグランド応答をさらなるネガティブコントロールとして使用し、個々のエピトープの免疫原性を決定する。
承認基準
実験のインビボ部分では、研究の開始時および終了時に、すべてのマウスを評価し(一般的な健康状態に関する文書)、秤量する。
実験のインビボ部分では、研究の開始時および終了時に、すべてのマウスを評価し(一般的な健康状態に関する文書)、秤量する。
インビトロで行われる実験の結果の受容は、細胞の多クローン刺激後の良好に立証されている生存能およびポジティブな応答に基づく。個々のマウスにおいて試験した4つのHLA−A24エピトープの結果を示す。
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Claims (63)
- HCVタンパク質から誘導され、HLAクラスIおよび/またはクラスII拘束性Tリンパ球応答を誘導することが可能な少なくとも2つのペプチドを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、少なくとも1つのペプチドがHLA−C結合性ペプチドであることを特徴とする、単離されたポリエピトープペプチド。
- 前記少なくとも2つのペプチドが、遺伝子型1a、1bおよび/または3aのHCVコンセンサス配列に存在することをさらに特徴とする、請求項1に記載のポリエピトープペプチド。
- 少なくとも1つのHLA−C結合性ペプチドが、HLA分子に結合し、前記分子は、HLA−CグループHLA−Cw03、Cw04、Cw06またはCw07から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載のポリエピトープペプチド。
- 少なくとも2つのペプチドが、HLA−C結合性ペプチドならびに、
・HLA分子に結合し、前記分子は、HLA−AグループHLA−A01、−A02、−A03、−A11または−A24から選択されることを特徴とするHLA−A結合性ペプチド、
・HLA分子に結合し、前記分子は、HLA−BグループHLA−B07、−B08、−B35、−B40または−B44から選択されることを特徴とするHLA−B結合性ペプチド、
・HLA分子に結合し、前記分子は、HLA−CグループHLA−Cw03、Cw04、Cw06またはCw07から選択されることを特徴とするHLA−C結合性ペプチド、および
・HLA分子に結合し、前記分子は、HLA−DRB1グループHLA−DRB1*01、−DRB1*03または−DRB1*04から選択されることを特徴とするHLA−DRB1結合性ペプチド、
からなる群から選択されるペプチドからなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。 - 少なくとも2つのペプチドが表13および/または14から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
- 少なくとも1つのHLA−C結合性ペプチドが、配列番号1048、1095、1730、349、475、111、2066、1511、1454、1100および907からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
- 配列番号557、1241、1456、1478、1833、1887、67、922、66、361、1070、1072、1151、71、1233、1269、75、73、1396、5、87、91、238、265、1661、1753、76、81、92、1933、1934、69、2043、2047、74、63、2053、83、56、155、156、1205、1206、167、1350、47、146、1609、144、3、39、158、16、122、1034、1095、1096、1150、246、1406、23、1483、1512、87、93、1625、1626、59、1710、250、81、1885、1916、1938、2048、271、2083、1、877、17、7、1086、1087、1468、1700、1894、402、836、381、371、853、370、387、307、1237、1289、1343、1418、1419、375、1430、380、450、1582、390、1677、1687、121、386、372、95、443、396、455、1441、436、1719、92、394、1969、287、1237、1289、375、1430、1444、582、1117および59からなる群から選択されるペプチドをさらに含んでなる、請求項6に記載のポリエピトープペプチド。
- 配列番号557、1241、1456、1478、1833、1887、67、922、66、361、1070、1072、1151、71、1233、1269、75、73、1396、5、87、91、238、265、1661、1753、76、81、92、1933、1934、69、2043、2047、74、63、2053、83、56、155、156、1205、1206、167、1350、47、146、1609、144、3、39、158、16、122、1034、1095、1096、1150、246、1406、23、1483、1512、87、93、1625、1626、59、1710、250、81、1885、1916、1938、2048、271、2083、1、877、17、7、1086、1087、1468、1700および1894からなる群から選択されるHLA−A結合性ペプチドから選択される少なくとも3つのペプチドを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、
そのことによって、前記ペプチドは、CTL応答を誘導することが可能であることを特徴とする、単離されたポリエピトープペプチド。 - 配列番号402、836、381、371、853、370、387、307、1237、1289、1343、1418、1419、375、1430、380、450、1582、390、1677、1687、121、386、372、95、443、396、455、1441、436、1719、92、394、1969、287、1237、1289、375、1430、1444、582、1117および59
からなる群から選択されるHLA−B結合性ペプチドから選択される少なくとも3つのペプチドを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、
そのことによって、前記ペプチドは、CTL応答を誘導することが可能であることを特徴とする、単離されたポリエピトープペプチド。 - 配列番号1048、1095、1730、349、475、111、2066、1511、1454、1100および907からなる群から選択されるHLA−C結合性ペプチドから選択される少なくとも3つのペプチドを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、
そのことによって、前記ペプチドは、CTL応答を誘導することが可能であることを特徴とする、単離されたポリエピトープペプチド。 - 配列番号2142、2213、2157、2245、2162、2164、2235、2113、2182、2111、2180、2236、2112、2132、2192、2107、2137、2125、2229、2166、2136、2177、2153、2110、2156、2241、2228、2219、2187、2249、2194、2207、2237、2149、2201、2158、2108および2232からなる群から選択されるHLA−DRB1結合性ペプチドから選択される少なくとも3つのペプチドを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、
そのことによって、前記ペプチドは、HTL応答を誘導することが可能であることを特徴とする、単離されたポリエピトープペプチド。 - 配列番号2142、2213、2157、2245、2162、2164、2235、2113、2182、2111、2180、2236、2112、2132、2192、2107、2137、2125、2229、2166、2136、2177、2153、2110、2156、2241、2228、2219、2187、2249、2194、2207、2237、2149、2201、2158、2108および2232からなる群から選択される少なくとも1つのHLA−DRB1結合性ペプチドをさらに含んでなる請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
- 前記少なくとも3つのペプチドが、遺伝子型1a、1bおよび/または3aのHCVコンセンサス配列に存在することをさらに特徴とする、請求項8〜12のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
- 前記ペプチドの少なくとも1つが、異なるHLAグループまたは遺伝子座から誘導されるHLA分子に対する交差結合活性を有することを特徴とする、請求項1〜13のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
- HLA−A結合性ペプチドがHLA分子に結合し、前記分子が、HLA−AグループHLA−A01、−A02、−A03、−A11または−A24から選択されることを特徴とする、請求項8に記載のポリエピトープペプチド。
- HLA−B結合性ペプチドがHLA分子に結合し、前記分子が、HLA−BグループHLA−B07、−B08、−B35、−B40または−B44から選択されることを特徴とする、請求項9に記載のポリエピトープペプチド。
- HLA−C結合性ペプチドがHLA分子に結合し、前記分子が、HLA−CグループHLA−Cw03、Cw04、Cw06またはCw07から選択されることを特徴とする、請求項10に記載のポリエピトープペプチド。
- HLA−DRB1結合性ペプチドがHLA分子に結合し、前記分子が、HLA−DRB1グループHLA−DRB1*01、−DRB1*03または−DRB1*04から選択されることを特徴とする、請求項11または12に記載のポリエピトープペプチド。
- 少なくとも2つのペプチドが、異なるHLA遺伝子座から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
- 配列番号557、1241、1456、1478、1833、1887、67、922、66、361、1070、1072、1151、71、1233、1269、75、73、1396、5、87、91、238、265、1661、1753、76、81、92、1933、1934、69、2043、2047、74、63、2053、83、56、155、156、1205、1206、167、1350、47、146、1609、144、3、39、158、16、122、1034、1095、1096、1150、246、1406、23、1483、1512、87、93、1625、1626、59、1710、250、81、1885、1916、1938、2048、271、2083、1、877、17、7、1086、1087、1468、1700、1894、402、836、381、371、853、370、387、307、1237、1289、1343、1418、1419、375、1430、380、450、1582、390、1677、1687、121、386、372、95、443、396、455、1441、436、1719、92、394、1969、287、1237、1289、375、1430、1444、582、1117、59、1048、1095、1730、349、475、111、2066、1511、1454、1100、907、2142、2213、2157、2245、2162、2164、2235、2113、2182、2111、2180、2236、2112、2132、2192、2107、2137、2125、2229、2166、2136、2177、2153、2110、2156、2241、2228、2219、2187、2249、2194、2207、2237、2149、2201、2158、2108および2232からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド。
- 50アミノ酸残基未満の免疫原性ペプチドに含まれる請求項20に記載のペプチド。
- 前記ペプチドはHLAクラスIおよび/またはクラスII拘束性Tリンパ球応答を誘導することが可能である、請求項20または21に記載のペプチド。
- 請求項20に記載のペプチドのアミノ酸配列に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列からなる単離されたペプチドであって、HLAクラスIおよび/またはクラスII拘束性Tリンパ球応答を誘導することが可能である、単離されたペプチド。
- 表13および14から選択される2つもしくはそれ以上のエピトープを含んでなる単離されたネステッドエピトープ。
- 2つもしくはそれ以上のエピトープは表Aから選択される、請求項24に記載のネステッドエピトープ。
- 配列番号2254〜2278によって同定されるアミノ酸配列、またはその一部からなる、請求項24または25に記載のネステッドエピトープ。
- 9〜35アミノ酸からなる請求項24〜26のいずれか一項に記載のネステッドエピトープ。
- 請求項20〜27のいずれか一項に記載の少なくとも1つのペプチドまたはネステッドエピトープを含んでなる、単離されたポリエピトープペプチド。
- 請求項20〜27のいずれか一項に記載の少なくとも2つのペプチドまたはネステッドエピトープを含んでなる、単離されたポリエピトープペプチド。
- 請求項20〜27のいずれか一項に記載の少なくとも3つのペプチドまたはネステッドエピトープを含んでなる、単離されたポリエピトープペプチド。
- 少なくとも3つのペプチドが、少なくとも2つのHLA−B結合性ペプチドを少なくとも1つのHLA−A結合性ペプチドまたは少なくとも1つのHLA−C結合性ペプチドと組み合わせたものである、請求項30に記載のポリエピトープペプチド。
- 少なくとも2つのHLA−B結合性ペプチドがHLA−B遺伝子座内の異なるHLAグループから選択される、請求項31に記載のポリエピトープペプチド。
- 少なくとも1つのHLA−A結合性ペプチド、少なくとも1つのHLA−B結合性ペプチドおよび少なくとも1つのHLA−C結合性ペプチドを含んでなる、請求項30に記載のポリエピトープペプチド。
- 前記少なくとも2つもしくは3つのペプチドが、遺伝子型1a、1bおよび/または3aのHCVコンセンサス配列に存在することを特徴とする、請求項29〜33のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
- HTLエピトープをさらに含んでなる、請求項28〜34のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
- HTLエピトープが表14から選択される、請求項35に記載のポリエピトープペプチド。
- HTLエピトープがPANDR結合性ペプチドである、請求項35に記載のポリエピトープペプチド。
- 少なくとも1つのHLAクラスI結合性ペプチド、少なくとも1つのHLAクラスII結合性ペプチドまたは少なくとも1つのHCV由来ペプチドをさらに含んでなる、請求項1〜19および28〜37のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
- ペプチドが連続であるか、あるいはリンカーまたはスペーサーアミノ酸もしくはスペーサーペプチドによって分離されるかのいずれか一方である、請求項1〜19および28〜37のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
- ペプチドがホモポリマーおよび/またはヘテロポリマーとして存在する、請求項1〜19および28〜37のいずれか一項に記載のポリエピトープペプチド。
- 請求項1〜40のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープまたはポリエピトープペプチドをコードする、単離された核酸またはポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つのスペーサー核酸をさらに含んでなる、請求項41に記載の単離された核酸またはポリヌクレオチド。
- シグナル配列および/またはプロモーター配列をさらに含んでなる、請求項41または42に記載の単離された核酸またはポリヌクレオチド。
- 請求項41〜43のいずれか一項に記載の核酸またはポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
- プラスミドである、請求項44に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項44に記載のベクター。
- 請求項44〜46のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
- 請求項41〜43のいずれか一項に記載の核酸またはポリヌクレオチドをベクターに導入することを含んでなる、請求項44〜46のいずれか一項に記載のベクターを生成するための方法。
- 請求項1〜40のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープもしくはポリエピトープペプチド、または請求項41〜43のいずれか一項に記載の核酸もしくはポリヌクレオチド、または請求項44〜46のいずれか一項に記載のベクター、あるいはそれらの組み合わせを含んでなる、組成物。
- ペプチドまたは核酸が混合物として存在する、請求項49に記載の組成物。
- 医薬組成物である、請求項49または50に記載の組成物。
- 薬学的に許容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルのうち少なくとも1つをさらに含んでなる、請求項51に記載の組成物。
- ワクチン組成物である、請求項51または52に記載の組成物。
- 医薬品としての使用のための請求項1〜40のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープもしくはポリエピトープペプチド、または請求項41〜43のいずれか一項に記載の核酸もしくはポリヌクレオチド、請求項44〜46のいずれか一項に記載のベクター、または請求項49〜53のいずれか一項に記載の組成物、あるいはそれらの組み合わせ。
- 請求項1〜40のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープもしくはポリエピトープペプチド、または請求項41〜43のいずれか一項に記載の核酸もしくはポリヌクレオチド、請求項44〜46のいずれか一項に記載のベクター、または請求項49〜53のいずれか一項に記載の組成物、あるいはそれらの組み合わせの投与を含んでなる、被験体においてHCVに対する免疫応答を誘導するための方法。
- HCVを伴うかまたはその危険性のある被験体の処置のための医薬品の製造のための請求項1〜40のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープもしくはポリエピトープペプチド、または請求項41〜43のいずれか一項に記載の核酸もしくはポリヌクレオチド、請求項44〜46のいずれか一項に記載のベクター、または請求項49〜53のいずれか一項に記載の組成物、あるいはそれらの組み合わせの使用。
- 合成もしくは組換え的製造工程を含んでなる、請求項1〜40のいずれか一項に記載のペプチド、ネステッドエピトープまたはポリエピトープペプチドを生成するための方法。
- 合成的製造工程を含んでなる、請求項41〜43のいずれか一項に記載の核酸またはポリヌクレオチドを生成するための方法。
- 被験体が、請求項1〜43のいずれか一項に記載の1つもしくはそれ以上のペプチド、またはそれらをコードする核酸に対して免疫応答を有するかどうかを決定する工程を含んでなる、HCVに暴露された被験体について感染の結果を決定する方法。
- 免疫応答を評価するための請求項1〜43のいずれか一項に記載のペプチド、またはそれらをコードする核酸の使用。
- 免疫リコール応答を評価するための請求項1〜43のいずれか一項に記載のペプチド、またはそれらをコードする核酸の使用。
- ワクチンの効力を評価するための請求項1〜43のいずれか一項に記載のペプチド、またはそれらをコードする核酸の使用。
- HCVワクチンの治療効果の結果を評価もしくは推定するための請求項1〜43のいずれか一項に記載のペプチド、またはそれらをコードする核酸の使用。
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