JP2003510099A - ペプチドおよび核酸組成物を使用する、ヒト免疫不全ウイルス−１に対する細胞性免疫応答の誘導 - Google Patents

ペプチドおよび核酸組成物を使用する、ヒト免疫不全ウイルス−１に対する細胞性免疫応答の誘導

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エピトープを同定するため、および調製するため、ならびに、ＨＩＶに対して指向されたエピトープに基づくワクチンを開発するために、Ｔ細胞によって抗原が認識される機構に関する見識を使用する。より詳細には、本願は、ＨＩＶ感染の予防および処置において有益な薬学的組成物および方法に関する本発明者らの発見を伝達する。適切な技術の開発により、このエピトープに基づくワクチンの使用は、特に、ワクチン組成物における抗原全体の使用と比較した場合に、現在のワクチンを超えるいくつかの利点を有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願に対する相互参照） 本願は、１９９９年１０月５日付けで出願された米国特許出願番号０９／４１
２，８６３号（本明細書中で参考として援用される）に対する優先権を主張する
。
【０００２】 （連邦政府によって支援された研究および開発） 本発明は、国立衛生研究所による助成金のもとで、米国政府によって一部資金
提供された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】 （目次） Ｉ． 発明の背景 ＩＩ． 発明の要旨 ＩＩＩ．図面の簡単な説明 ＩＶ． 発明の詳細な説明 Ａ．定義 Ｂ．ＣＴＬおよびＨＴＬ応答の刺激 Ｃ．ＨＬＡ分子に対するペプチドエピトープの結合親和性 Ｄ．ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ １． ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ ２． ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ ３． ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ ４． ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ ５． ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ ６． ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ ７． ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ ８． ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ ９． ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ １０．ＨＬＡ−Ａ１モチーフ １１．ＨＬＡ−Ａ２．１モチーフ １２．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ １３．ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ １４．ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ １５．ＨＬＡ−ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ １６．ＨＬＡ−ＤＲ３モチーフ Ｅ．ワクチンの集団適用範囲の増強 Ｆ．免疫応答刺激ペプチドエピトープアナログ Ｇ．スーパーモチーフ含有エピトープまたはモチーフ含有エピトープに対する
疾患関連抗原由来のタンパク質配列のコンピュータースクリーニング Ｈ．ペプチドエピトープの調製 Ｉ．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ Ｊ．免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使用 Ｋ．ワクチン組成物 １．ミニ遺伝子ワクチン ２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組み合わせ Ｌ．治療目的または予防目的のためのワクチンの投与 Ｍ．キット Ｖ． 実施例 ＶＩ． 特許請求の範囲 ＶＩＩ．要約 （Ｉ．発明の背景） ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）による感染によって引き起こされる
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、主要な世界的保健衛生問題を提示する。
推定上、毎日、世界中で約１６，０００人の人々がＨＩＶに感染することが示さ
れている。
【０００４】 抗ウイルス薬物の開発は、ＨＩＶ感染患者におけるウイルス負荷（ｖｉｒａｌ
ｌｏａｄ）を減少するにおいて、大きく前進してきた。高度活性レトロウイル
ス療法（Ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ
）（ＨＡＡＲＴ）は、ほぼ検出不可能なレベルまで、ウイルス血症を減少させる
ことが示された。しかし、現在の薬物療法は、ＨＩＶ流行に対する長期の解決策
として実用的ではない。ＨＡＡＲＴ療法は、薬物に対する乏しい耐性および薬物
耐性ウイルスの出現に起因して、極めて制限される。さらに、複製能を有するＨ
ＩＶは、ＨＡＡＲＴに応答性の患者のリンパ組織中に持続し、従って、ウイルス
の貯蔵所として作用する。最後に、現在の抗レトロウイルス薬物療法は、世界的
な流行に対してほとんど影響を有さない：世界中のＨＩＶ感染集団のほぼ９０％
が、これらの薬物に対する財源を欠く国々に存在する。従って、ＨＩＶ感染を予
防および処置するという両方のために有効なワクチンについての必要性が存在す
る。
【０００５】 ウイルス特異的なヒトリンパ球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリン
パ球（ＣＴＬ）は、インビボにおけるウイルス感染の予防およびクリアランスに
おいて主要な役割を果たすことが公知である（Ｏｌｄｓｔｏｎｅら，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２１：２３９，１９８９；Ｊａｍｉｅｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１．
３９３０，１９８７；Ｙａｐら，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８，１９７８；Ｌ
ｕｋａｃｈｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：８１４，１９９４；ＭｃＭｉ
ｃｈａｅｌら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：１３，１９８３；Ｓｅｔｈ
ｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４４３，１９８３；Ｗａｔａｒｉら，Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：４５９，１９８７；Ｙａｓｕｋａｗａら，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４３：２０５１，１９８９；Ｔｉｇｇｅｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６６：１６２２，１９９３；Ｒｅｄｄｅｎｈａｓｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５５：
２６３，１９８５；Ｑｕｉｎｎａｎら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０７：６
，１９８２）。ＨＬＡクラスＩ分子は、ほぼすべての有核細胞の表面上に発現さ
れている。抗原の細胞内プロセシング後、抗原由来のエピトープは、このような
表面上のＨＬＡクラスＩ分子との複合体として提示される。ＣＴＬは、ペプチド
−ＨＬＡクラスＩ複合体を認識し、次いで、ＣＴＬによって直接的にか、および
／または、ウイルス複製を阻害する非破壊的機構（例えば、インターフェロンの
産生）の活性化を介して、ＨＬＡ−ペプチド複合体を保有する細胞の破壊を生じ
させる。
【０００６】 ＨＩＶ感染に対する防御的免疫の免疫相関は十分に規定されていないが、ＣＴ
ＬがＨＩＶ感染を制御するにおいて重要であることを示唆する、増大しつつある
一連の証拠が存在する。ＨＩＶ特異的ＣＴＬ応答は、感染初期に検出され得、そ
して応答の出現は、最初のウイルス血症が低減される、感染中の時点に対応する
（Ｐａｎｔａｌｅｏら，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：４６３，１９９４；Ｗａｌｋｅ
ｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：９５１４，１９８９）。
さらに、感染リンパ球中におけるＨＩＶ複製は、自己ＣＴＬとのインキュベーシ
ョンによって阻害され得る（例えば、Ｔｓｕｂｏｔａら，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１６９．１４２１，１９８９を参照のこと）。これらのデータは、ＣＴＬがＳＩ
Ｖ／アカゲザル動物モデルにおけるウイルス複製を制御するために必要とされる
という近年の研究によって支持され（Ｓｃｈｍｉｔｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８
３：８５７，１９９９）、そしてさらに、ＣＴＬがＨＩＶ集団に対して選択圧を
及ぼすということを実証する研究によって支持される。これは、ＣＴＬ応答が指
向されるウイルスのそれらの領域においてアミノ酸置換を有するウイルスが最終
的に優勢であることによって、証拠付けられる（例えば、Ｂｏｒｒｏｗら，Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：２０５−２１１，１９９７；Ｐｒｉｃｅら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２８９０−１８９５，１９９７；Ｋｏｅｎ
ｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：３３０−３３６，１９９５；およびＨａａ
ｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４２１２−４２２１，１９９６を参照のこ
と）。
【０００７】 ウイルス特異的Ｔヘルパーリンパ球もまた、慢性ウイルス感染において有効な
免疫を維持するために重要であることが公知である。歴史的に、ＨＴＬ応答は、
特定のＣＴＬおよびＢ細胞集団の増殖を主に支持するものと見られていた；しか
し、より近年のデータによって、ＨＴＬは、ウイルス複製の制御に直接的に寄与
し得ることが示されている。例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞における減少およびＨＴＬ
機能において対応する損失は、ＨＩＶによる感染を特徴付ける（Ｌａｎｅら，Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．３１３：７９，１９８５）。さらに、ＨＩＶ感染
患者における研究によって、ウイルス特異的ＨＴＬ応答とウイルス負荷との間に
逆比例関係が存在することもまた示された。これは、ＨＴＬが、ウイルス血症に
おいて役割を果たすことを示唆する（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２７８：１４４７，１９９７を参照のこと）。
【０００８】 有効なＨＩＶワクチンの開発における基礎的難題は、ＨＩＶにおいて観察され
る不均質性である。他のレトロウイルスと同様に、このウイルスは、複製の間に
急速に変異して、抗ウイルス療法および免疫認識をエスケープし得るウイルスの
生成を生じる（Ｂｏｒｒｏｗら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：２０５，１９９７
）。さらに、ＨＩＶは、顕著な配列分岐を示す種々のサブタイプに分類され得る
（例えば、Ｌｕｋａｓｈｏｖら，ＡＩＤＳ １２：Ｓ４３，１９９８を参照のこ
と）。ＨＩＶの不均質性質およびＨＩＶ感染で観察される不均質性免疫応答の点
から、複数のＨＩＶエピトープに対して同時に指向される多重特異性細胞性免疫
応答の誘導が、ＨＩＶに対して有効なワクチンの開発のために重要であるように
思われる。ＨＩＶ感染を予防および／または一掃するに十分な幅および力の免疫
応答を誘発するようなワクチン実施形態を確立する必要性が存在する。
【０００９】 本発明者らが記載するような、このエピトープアプローチは、このアプローチ
が、単一のワクチン組成物における、種々のタンパク質由来の種々の抗体エピト
ープ、ＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープの組み込みを可能にするという
点で、この問題の解決を提示し得る。このような組成物は、複数の優性および亜
優性エピトープを同時に標的し得、これによって、多様な集団において効果的な
免疫を達成するために使用され得る。
【００１０】 この節において提供される情報は、本出願の出願日時点での当時理解されてい
る技術状態を開示することが意図される。本出願の優先日後に得られた情報は、
この節に含まれる。従って、この節の情報は、いかようにも、本発明の優先日で
線引きすることが意図されない。
【００１１】 （ＩＩ．発明の要旨） 本発明は、例えば、ＨＩＶに対するエピトープに基づくワクチンを開発するた
めに、抗原がＴ細胞によって認識される機構についての本発明者らの知識を適用
する。より詳細には、この適用が、特異的エピトープの薬学的組成物ならびにＨ
ＩＶ感染の予防および処置における使用方法についての、本発明者らの発見を導
く。
【００１２】 適切な技術の開発により、このエピトープに基づくワクチンの使用は、特に、
ワクチン組成物における抗原全体の使用と比較した場合に、現在のワクチンを超
えるいくつかの利点を有する。抗原全体に対する免疫応答が、抗原の可変領域に
ほとんど指向され、このことが、変異に起因して免疫回避を可能にするという証
拠が存在する。エピトープに基づくワクチンに含めるためのエピトープは、ウイ
ルス抗原または腫瘍関連抗原の保存領域から選択され得、これによって、回避性
変異体の可能性を減少する。さらに、抗原全体において存在し得る免疫抑制エピ
トープは、このエピトープに基づくワクチンの使用によって避けられ得る。
【００１３】 エピトープベースワクチンのアプローチのさらなる利点は、選択されたエピト
ープ（ＣＴＬおよびＨＴＬ）を組み合わせる能力であり、さらに（例えば、増強
された免疫原性を達成する）これらのエピトープの組成を改変する能力である。
従って、免疫応答は、標的疾患について適切なように調節され得る。この応答の
類似の操作は、従来のアプローチでは可能でない。
【００１４】 エピトープに基づく免疫刺激ワクチンの別の主な利点は、その安全性である。
それ自体の内因性の生物学的活性を有し得る感染因子またはタンパク質抗原全体
によって引き起こされる、可能性のある病理学的副作用は、排除される。
【００１５】 エピトープに基づくワクチンはまた、同じ病原体由来の複数の選択された抗原
に対して免疫応答を指向する能力を提供する。従って、特定の病原体に対する免
疫応答における患者間の可変性は、ワクチン組成物に、この病原体由来の複数の
抗原由来のエピトープを含めることによって軽減される。ＨＩＶの場合、複数の
株由来のエピトープもまた含まれ得る。「病原体」とは、感染因子または腫瘍関
連分子であり得る。
【００１６】 しかし、広く効果的なエピトープに基づく免疫療法剤の開発に対する最も困難
な障壁の１つは、ＨＬＡ分子の極度な多型性であった。今日まで、効果的な非遺
伝子学的傾向にあった集団の適用範囲は、かなり複雑な課題であり；このような
適用範囲は、各々個々のＨＬＡ対立遺伝子に対応するＨＬＡ分子に特異的なエピ
トープを使用することを必要とした。従って、民族的に多様な集団をカバーする
ためには、実行不可能な多くの数のエピトープを使用しなければならなかった。
従って、エピトープに基づくワクチンにおける使用のための、複数のＨＬＡ抗原
分子が結合したペプチドエピトープの必要性が存在していた。結合するＨＬＡ抗
原分子数が多いほど、ワクチンによる集団の適用範囲の広さは大きくなる。
【００１７】 さらに、より詳細に本明細書中に記載されるように、ペプチド結合特性を調節
する（例えば、複数のＨＬＡ抗原に結合し得るペプチドが、免疫応答を刺激する
親和性で複数のＨＬＡ抗原に結合するように）必要性が存在していた。免疫原性
に相関する親和性で１より多いＨＬＡ対立遺伝子によって限定されるエピトープ
の同定が、十分な集団適用範囲を提供するため、そしてその集団の多様な部分に
おいて感染を予防または排除するに十分に強力な応答の誘発を可能にするために
、重要である。このような応答はまた、広範な多くのエピトープを標的し得る。
本明細書中に開示される技術は、このような好ましい免疫応答を提供する。
【００１８】 好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物に含むためのエピトープ
は、既知の抗原のタンパク質配列を、モチーフ保有エピトープまたはスーパーモ
チーフ保有エピトープの存在について評価するプロセスによって、選択される。
次いで、モチーフ保有エピトープまたはスーパーモチーフ保有エピトープに対応
するペプチドを合成し、そしてそれらのペプチドを、その選択されたモチーフを
認識するＨＬＡ分子に結合する能力について試験する。中程度の親和性または高
い親和性（すなわち、ＨＬＡクラスＩ分子ついては、５００ｎＭ未満のＩＣ50（
またはＫD値）、またはＨＬＡクラスＩＩ分子については、１０００ｎＭ未満の
ＩＣ50）で結合するこれらのペプチドを、ＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答を誘導す
るそれらの能力についてさらに評価する。免疫原性ペプチドエピトープを、ワク
チン組成物に含むために選択する。
【００１９】 スーパーモチーフ保有ペプチドを、ＨＬＡスーパータイプファミリー内の複数
の対立遺伝子に結合する能力について、さらに試験し得る。さらに、ペプチドエ
ピトープを、ＨＬＡスーパータイプ内の複数の対立遺伝子に対する結合親和性お
よび／または結合する能力を改変するために、アナログ化し得る。
【００２０】 本発明はまた、既知のＨＬＡ型を有する患者において、ＨＩＶに対する免疫応
答をモニターまたは評価するための方法を含む、実施形態を包含する。このよう
な方法は、患者由来のＴリンパ球サンプルを、ＨＩＶエピトープを含むペプチド
組成物と共にインキュベートする工程であって、このＨＩＶエピトープは、その
患者に存在する少なくとも１つのＨＬＡ対立遺伝子の産物を結合する、表ＶＩＩ
〜表ＸＸに記載のアミノ酸配列を有する、工程、および、このペプチドに結合す
るＴリンパ球の存在について検出する工程を包含する。ＣＴＬペプチドエピトー
プは、例えば、この型の分析のためのテトラマー複合体の成分として使用され得
る。
【００２１】 本発明に従うペプチドエピトープを規定するための代替的様式は、特定の対立
遺伝子特異的ＨＬＡ分子または対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子のグループへの結合
に相関される、物理的特性（例えば、長さ；一次構造；または電荷）を引用する
ことである。ペプチドエピトープを規定するためのさらなる様式は、ＨＬＡ結合
ポケットの物理的特性またはいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合ポケットに
共有される特性（例えば、ポケットの形状および電荷分布）を引用すること、お
よびこのペプチドエピトープがポケット（単数または複数）に適合しそして結合
することを引用することである。
【００２２】 以下の議論から明らかなように、他の方法および実施形態もまた意図される。
さらに、本明細書中の方法のいずれかによって生成された新規合成ペプチドもま
た、本発明の一部である。
【００２３】 （ＩＶ．発明の詳細な説明） 本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸組成物は、ＣＴＬ応答または
ＨＴＬ応答の生成を刺激することによって、ＨＩＶに対する免疫応答を刺激する
ために有用である。これらのペプチドエピトープは、ネイティブＨＩＶタンパク
質アミノ酸配列に直接的または間接的に由来し、ＨＬＡ分子に結合し得そしてＨ
ＩＶに対する免疫応答を刺激し得る。分析されるＨＩＶタンパク質の完全配列は
、Ｇｅｎｂａｎｋより入手され得る。以下に提供する開示から明らかなように、
ペプチドエピトープおよびそのアナログはまた、配列情報から容易に決定され得
、配列情報は、今後、以前に未知であったＨＩＶの改変体について発見されるか
もしれない。
【００２４】 本発明のペプチドエピトープは、以下で議論されるように、多くの方法で同定
された。特定のアミノ酸残基を改変して、変化した免疫原性を示すペプチドアナ
ログを作製することによって、アナログペプチドを誘導し、そしてＨＬＡ分子の
結合活性が調節されることもまた、より詳細に議論する。さらに、本発明は、種
々の対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子と相互作用し得るエピトープに
基づくワクチンに、先行技術のワクチンよりも広い集団適用範囲を提供させ得る
、組成物および組成物の組み合わせを提供する。
【００２５】 （ＩＶ．Ａ．定義） 本発明は、アルファベット順に列挙した、以下の定義を参照してより良好に理
解され得る。
【００２６】 「コンピューター」または「コンピューターシステム」は、一般に、以下を備
える：プロセッサー；少なくとも１つの情報記憶／検索装置（例えば、ハードド
ライブ、ディスクドライブまたはテープドライブなど）；少なくとも１つの入力
装置（例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、またはマイクロホンな
ど）；およびディスプレイ構造。さらに、コンピューターは、ネットワークと連
絡する通信チャネルを備える。このようなコンピューターは、多かれ少なかれ、
上記に列挙したものを備え得る。
【００２７】 本明細書中で使用される場合、「構築物」は、一般に、天然に存在しない組成
物を示す。構築物は、核酸またはアミノ酸についての合成技術（例えば、組換え
ＤＮＡの調製および発現）または化学合成技術によって、生成され得る。構築物
はまた、結果としてその形態が天然において見い出されないように、ある材料へ
の別の材料の付加または添加によって生成され得る。
【００２８】 「交差反応結合」とは、１より多いＨＬＡ分子がペプチドに結合することを示
し；同義語は、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）結合である。
【００２９】 「潜在エピトープ」は、単離されたペプチドとの免疫によって応答を誘導する
が、そのエピトープを含むインタクトなタンパク質全体が抗原として使用される
場合に、その応答は、インビトロで交差反応性でない。
【００３０】 「優性エピトープ」は、ネイティブ抗原全体での免疫に際して免疫応答を誘導
するエピトープである（例えば、Ｓｅｒｃａｒｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１１：７２９−７６６，１９９３を参照のこと）。このような応答は
、単離されたペプチドエピトープでは、インビトロで交差反応性である。
【００３１】 特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによ
る認識に関与するアミノ酸残基のセットであるか、またはＴ細胞の状況下では、
Ｔ細胞レセプタータンパク質および／または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ
）レセプターによる認識に必要な残基である。インビボまたはインビトロでの免
疫系の設定において、エピトープは、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたは
ＨＬＡ分子によって認識される部位を共に形成する、分子（例えば、一次ペプチ
ド構造、二次ペプチド構造および三次ペプチド構造のような）および電荷の集団
的特徴である。本開示を通して、エピトープおよびペプチドは、しばしば、交換
可能に使用される。しかし、本発明のエピトープより大きくかつ本発明のエピト
ープを含む単離または精製されたタンパク質またはペプチド分子が、なお本発明
の範囲内にあることが理解される。
【００３２】 本発明のエピトープおよびさらなるアミノ酸を含むタンパク質またはペプチド
分子が、なお本発明の範囲内にあることが理解される。特定の実施形態において
、さもなければ構築物ではない本発明のペプチドの長さに対して、制限が存在す
る。長さが制限される実施形態は、本発明のエピトープを含むタンパク質／ペプ
チドがネイティブ配列と１００％同一性を有する領域（すなわち、一連の連続す
るアミノ酸）を含む場合に、生じる。例えば、天然分子全体に対する読み枠由来
のエピトープの定義を回避するために、ネイティブペプチド配列との１００％同
一性を有する任意の領域の長さに対して制限が存在する。従って、本発明のエピ
トープおよびネイティブペプチド配列との１００％同一性を有する領域を含み、
そしてさもなければ構築物ではない、ペプチドについて、ネイティブ配列に対す
る１００％同一性を有するその領域は、一般に、６００アミノ酸以下、しばしば
、５００アミノ酸以下、しばしば、４００アミノ酸以下、しばしば、２５０アミ
ノ酸以下、しばしば、１００アミノ酸以下、しばしば、８５アミノ酸以下、しば
しば、７５アミノ酸以下、しばしば、６５アミノ酸以下、そしてしばしば、５０
アミノ酸以下を有する。特定の実施形態において、本発明の「エピトープ」は、
ネイティブペプチド配列に対して１００％同一性を有する５１アミノ酸未満（任
意の数（４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９
、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７
、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５
、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５）のアミノ酸から５アミ
ノ酸まで）の領域を有するペプチドに含まれる。
【００３３】 従って、６００アミノ酸より長いペプチドまたはタンパク質配列は、それらが
、構築物でない場合に、ネイティブペプチド配列との１００％同一性を有する６
００アミノ酸よりも大きいいかなる連続する配列を含まない限り、本発明の範囲
内にある。ネイティブ配列に対応する５以下連続する残基を有する任意のペプチ
ドについては、本発明の範囲内にあるための、そのペプチドの最大長さに対する
制限は存在しない。本発明において、ＣＴＬエピトープは、６００未満の任意の
残基長から８アミノ酸残基であることが好ましい。
【００３４】 「ヒトリンパ球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩまたはクラスＩＩの
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質（例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｌａｎｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ Ａ
ｌｔｏｓ，ＣＡ（１９９４）を参照のこと）である。
【００３５】 本明細書中で使用される場合、「ＨＬＡスーパータイプまたはＨＬＡファミリ
ー」とは、共有するペプチド結合特性に基づいてグループ化したＨＬＡ分子のセ
ットを記載する。特定のアミノ酸モチーフを保有するペプチドに対する幾分類似
の結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡスーパータイプにグルー
プ化される。用語ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリー
、ＨＬＡファミリーおよびＨＬＡ ｘｘ様分子（ここで、ｘｘは、特定のＨＬＡ
型を示す）は、同義である。
【００３６】 本開示を通して、結果を、用語「ＩＣ50」で表す。ＩＣ50は、参照ペプチドの
結合の５０％阻害が観察される、結合アッセイにおけるペプチドの濃度である。
アッセイを行う条件（すなわち、律速のＨＬＡタンパク質濃度および標識ペプチ
ド濃度）を考慮して、これらの値は、ＫD値と近似する。結合を測定するための
アッセイは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２
０５に、詳細に記載される。ＩＣ50値が、アッセイ条件が変化する場合に、そし
て使用する特定の試薬（例えば、ＨＬＡ調製物など）に依存して、（しばしば、
劇的に）変化し得ることに留意する。例えば、過剰濃度のＨＬＡ分子は、所定の
リガンドの見かけの測定されたＩＣ50を増加する。
【００３７】 あるいは、結合は、参照ペプチドと関連して表される。特定のアッセイが、よ
り高感度またはより低感度になるにつれて、試験するペプチドのＩＣ50は、幾分
変化し得るが、参照ペプチドに関連する結合は、有意に変化しない。例えば、参
照ペプチドのＩＣ50が１０倍増加するような条件下で行うアッセイにおいて、試
験ペプチドのＩＣ50もまた、約１０倍シフトする。従って、あいまい性を回避す
るために、ペプチドが良好な結合因子であるか、中程度の結合因子であるか、弱
い結合因子であるかまたはネガティブな結合因子であるかの評価は、一般に、標
準ペプチドのＩＣ50に対する、そのペプチドのＩＣ50に基づく。
【００３８】 結合はまた、以下を使用するアッセイ系を含む、他のアッセイ系を使用して測
定され得る：生細胞（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９
：３９２，１９８９；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６７、
１９９１；Ｂｕｓｃｈら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３、１９９９０；
Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１８９、１９９１；ｄｅｌ Ｇｕｅ
ｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５，１９９５）、界面活性剤溶
解物を使用する無細胞系（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．２１：２０６９，１９９１）、固定した精製ＭＨＣ（例えば、Ｈｉｌｌら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２８９０，１９９４；Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９４６，１９９４）、ＥＬＩＳＡ系（例えば、Ｒｅａ
ｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２８２９，１９９２）、表面プラスモン共鳴（例え
ば、Ｋｈｉｌｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５４２５，１９９３
）；高フラックス可溶相アッセイ（Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
０：２３５３，１９９４）、およびクラスＩ ＭＨＣの安定化またはアセンブリ
の測定（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４７６、１９
９０；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｃｅｌｌ ６２：５６３、１９９０；Ｔｏｗｎ
ｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ ６２：２８５、１９９０；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１４９；１８９６，１９９２）。
【００３９】 本明細書中で使用される場合、ＨＬＡクラスＩ分子に関する「高い親和性」と
は、５０ｎＭ未満のＩＣ50またはＫD値での結合として定義され；「中程度の親
和性」とは、約５０ｎＭと約５００ｎＭとの間のＩＣ50またはＫD値での結合で
ある。ＨＬＡクラスＩＩ分子に関する「高い親和性」とは、１００ｎＭ未満のＩ
Ｃ50またはＫD値での結合として定義され；「中程度の親和性」とは、約１００
ｎＭと約１０００ｎＭとの間のＩＣ50またはＫD値での結合である。
【００４０】 ２以上のペプチド配列の状況下で、用語「同一性」またはパーセント「同一性
」とは、配列比較アルゴリズムを使用してかまたは手動の整列化および目視検査
によって測定されるように、比較ウインドウにわたる最大対応について比較およ
び整列化した場合に、同じであるかまたは特定のパーセンテージの同じであるア
ミノ酸残基を有する、２以上の配列またはサブ配列をいう。
【００４１】 「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」とは、そのペプチドがＨ
ＬＡ分子を結合しそしてＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答を誘導するような
、対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドである。従
って、本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し得、そしてその
後、免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する、細胞傷害性Ｔ細胞応答またはヘ
ルパーＴ細胞応答を誘導し得る。
【００４２】 句「単離された」または「生物学的に純粋」とは、そのネイティブ状態におい
て見い出される場合に通常その材料に付随する成分を、実質的または本質的に含
まない材料をいう。従って、本発明に従う単離されたペプチドは、好ましくは、
そのインサイチュ環境下でそのペプチドに通常会合する物質を含まない。
【００４３】 「連結」または「結合」とは、ペプチドを機能的に接続するための当該分野で
公知の任意の方法をいい、これらには、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結
合、イオン結合、水素結合、および静電結合が挙げられるが、これらに限定され
ない。
【００４４】 「主要組織適合性複合体」または「ＭＨＣ」は、生理的免疫応答に応答可能な
細胞性相互作用の制御において役割を担う遺伝子のクラスターである。ヒトにお
いて、ＭＨＣ複合体はまた、ＨＬＡ複合体として既知である。ＭＨＣ複合体およ
びＨＬＡ複合体の詳細な記載については、Ｐａｕｌ、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ
ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第３版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
１９９３を参照のこと。
【００４５】 用語「モチーフ」は、規定された長さのペプチドにおける残基のパターンをい
う。一般に、クラスＩ ＨＬＡモチーフについて約８〜約１３アミノ酸およびク
ラスＩＩ ＨＬＡモチーフについて約６〜約２５アミノ酸のペプチドであり、こ
れは、特にＨＬＡ分子によって認識される。ペプチドモチーフは、代表的には、
各々のヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる各々のタンパク質について異
なり、そして一次アンカー残基および二次アンカー残基のパターンにおいて異な
る。
【００４６】 「陰性な結合残基」または「有害な残基」は、ペプチドエピトープにおける特
定の位置に存在する場合（代表的には一次アンカー位置ではない）、対応するＨ
ＬＡ分子に対するペプチドの結合親和性の減少を生じるアミノ酸である。
【００４７】 「非ネイティブ」な配列または「構築物」は、天然には見出されない（すなわ
ち、「非天然に存在する」）配列をいう。このような配列としては、例えば、脂
質化（ｌｉｐｉｄａｔｅ）されるかさもなくば改変されるペプチド、およびネイ
ティブなタンパク質配列中に連続しないエピトープを含むポリエピトープ性（ｐ
ｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）組成物が挙げられる。
【００４８】 用語「ペプチド」は、本明細書中において「オリゴペプチド」と相互変換可能
に使用され、（代表的には、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基
との間のペプチド結合によって）互いに連結される一連の残基（代表的にはＬ−
アミノ酸）を示す。本発明の好ましいＣＴＬ誘導ペプチドは、１３以下の残基長
であり、そして通常、約８残基と約１１残基との間（好ましくは９または１０残
基）からなる。好ましいＨＴＬ誘導オリゴペプチドは、約５０残基長未満であり
、そして通常、約６残基と約３０残基との間、より通常には、約１２残基と２５
残基との間、そしてしばしば約１５残基と２０残基との間からなる。
【００４９】 「薬学的に受容可能な」は、一般に、非毒性の、不活性な、および／または薬
理学的に適合性の組成物をいう。
【００５０】 「一次アンカー残基」は、免疫原性ペプチドとＨＬＡ分子との間の接触点を提
供することが理解されるペプチド配列の間で特定の位置におけるアミノ酸をいう
。規定された長さのペプチド内の１〜３（通常は２）の一次アンカー残基は、一
般に、免疫原性ペプチドについての「モチーフ」を規定する。これらの残基は、
結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）自身の特定のポケットにおいて埋められるこれらの側鎖
を有する、ＨＬＡ分子のペプチド結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）と密接に接触して適合
することが理解される。１つの実施形態において、例えば、一次アンカー残基は
、本発明に従って９残基ペプチドエピトープの位置２（アミノ末端位から）およ
びカルボキシル末端位に配置される。各々のモチーフおよびスーパーモチーフに
ついての一次アンカー位置は、表１に示される。例えば、アナログペプチドは、
これらの一次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更するこ
とによって作製され得る。このようなアナログを使用して、特定のモチーフまた
はスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を調節する。
【００５１】 「乱雑な認識」は、種々のＨＬＡ分子に関連して別々のペプチドが同一のＴ細
胞クローンによって認識されることである。乱雑な認識または結合は、交差反応
性結合と同義である。
【００５２】 「防御免疫応答」または「治療的免疫応答」は、感染性因子または腫瘍抗原由
来の抗原に対するＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答をいい、これは、疾患の
症状または進行を予防するかまたは少なくとも部分的に抑制する。免疫応答はま
た、ヘルパーＴ細胞の刺激によって容易にされた抗体応答を含み得る。
【００５３】 用語「残基」は、アミド結合またはアミド結合模倣物によってオリゴペプチド
に組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣物をいう。
【００５４】 「二次アンカー残基」は、ペプチドにおける一次アンカー位置以外の位置での
、ペプチド結合を影響し得るアミノ酸である。二次アンカー残基は、結合したペ
プチドの中で１つの位置でのアミノ酸の無秩序な分布によって期待されるより顕
著に高い頻度で生じる。二次アンカー残基は、「二次アンカー位置」で生じると
いわれる。二次アンカー残基は、高い親和性もしくは中程度の親和性で結合する
ペプチドの中でより高頻度で存在する残基、またはさもなくば高い親和性もしく
は中程度の親和性の結合と関連する残基として同定され得る。例えば、アナログ
ペプチドは、これらの二次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在
を変更することによって作製され得る。このようなアナログを使用して、特定の
モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を良好に調節する
。
【００５５】 「亜優性エピトープ」は、エピトープを含む抗原全体での免疫に対して応答を
ほとんど引き起こさないかまたは全く引き起こさないが、単離されたペプチドで
の免疫によって応答が得られ得るエピトープであり、そして（潜在エピトープの
場合とは異なり）この応答は、タンパク質全体を使用してインビトロまたはイン
ビボでの応答をリコール（ｒｅｃａｌｌ）する場合に、検出される。
【００５６】 「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる
ＨＬＡ分子によって共有されるペプチド結合特異性である。好ましくは、スーパ
ーモチーフ保有ペプチドは、２つ以上のＨＬＡ抗原によって高い親和性または中
程度の親和性（本明細書中に規定される場合）で認識される。
【００５７】 「合成ペプチド」は、化学合成または組換えＤＮＡ技術のような方法を使用し
てヒトが作製したペプチドをいう。
【００５８】 本明細書中で使用される場合、「ワクチン」は、本発明の１つ以上のペプチド
を含む組成物である。本発明に従うワクチンの実施形態（例えば、１つ以上のペ
プチドのカクテルによって；ポリエピトープ性のペプチドによって含まれる本発
明の１以上のエピトープ；または、このようなペプチドもしくはポリペプチドを
コードする核酸（例えば、ポリエピトープ性のペプチドをコードするミニ遺伝子
（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）））が多く存在する。「１つ以上のペプチド」は、１〜１
５０の単位整数全体のいずれか（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２
、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０
、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１
５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５もしくは１５０またはそ
れ以上）の本発明のペプチドを含み得る。これらのペプチドまたはポリペプチド
は、必要ならば、例えば、脂質化、標的化配列もしくは他の配列の付加によって
改変され得る。本発明のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球
およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を容易にするために、ＨＬＡクラスＩ
Ｉ結合ペプチドと混合され得るかまたは連結され得る。ワクチン接種はまた、ペ
プチドでパルスされた抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含む。
【００５９】 ペプチド化合物を記載するために使用される命名法は、慣用的な実践に従い、
ここで、アミノ基は各々のアミノ酸残基の左（Ｎ末端）そしてカルボキシル基は
右（Ｃ末端）に示される。アミノ酸残基位置がペプチドエピトープにおいていわ
れる場合、これらは、エピトープ、または一部分であり得るペプチドもしくはタ
ンパク質のアミノ末端に近接する位置である位置を有してアミノからカルボキシ
ルの方向において番号付けられる。本発明の選択された特定の実施形態を示す形
式において、特定には示されないが、さもなくば特定されない場合は、アミノ末
端基およびカルボキシル末端基は、生理学的ｐＨ値でとる形態である。アミノ酸
構造の形式において、各残基は、一般に、標準的な３文字表記または１文字表記
によって示される。Ｌ−型のアミノ酸残基は、大文字の１文字または３文字記号
の最初の文字の大文字によって示され、そしてＤ−型を有するこれらのアミノ酸
についてのＤ−型は、小文字の１文字または小文字の３文字記号によって示され
る。グリシンは、非対称の炭素原子を有さず、そして単に「Ｇｌｙ」またはＧと
していわれる。アミノ酸についての記号は、以下に示される。
【００６０】
【化５】
【００６１】 （ＩＶ．Ｂ．ＣＴＬおよびＨＴＬ応答の刺激） Ｔ細胞が抗原を認識する機構は、１０年前もの間描写されてきた。免疫系の本
発明者らの理解に基づいて、本発明者らは、広範な集団においてＨＩＶに対する
治療的免疫応答または予防的免疫応答を誘導し得る、効果的なペプチドエピトー
プワクチン組成物を開発した。特許請求された組成物の価値および効力の理解に
ついて、免疫関連技術の簡単な総説が提供される。
【００６２】 ＨＬＡ分子とペプチド抗原との複合体は、ＨＬＡ拘束されたＴ細胞によって認
識されるリガンドとして働く（Ｂｕｕｓ，Ｓら、Ｃｅｌｌ ４７：１０７１，１
９８６；Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：３５９，１９８
５；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．およびＢｏｄｍｅｒ，Ｈ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．７：６０１，１９８９；Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅ
ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４０３，１９９３）。単一アミノ酸置換された抗原
アナログの研究、および内因性に結合され、天然にプロセスされたペプチドの配
列決定を通じて、ＨＬＡ抗原分子に特異的に結合するために必要とされるモチー
フに対応する重要な残基は、同定されかつ本明細書中に記載され、そして表Ｉ、
ＩＩ、およびＩＩＩに示される（また、例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３，１９９８；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕ
ｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８，１９９５；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、ＳＹ
ＦＰＥＩＴＨＩ、（ｈｔｔｐ：／／１３４．２．９６．２２１／ｓｃｒｉｐｔｓ
．ｈｌａｓｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍでのｗｅｂを介してアクセス
する）；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１０：４７８，１９９８；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｖ．Ｈ．Ｃｕｒｒ
．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１３，１９９４；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＧ
ｒｅｙ，Ｈ．Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７９，１９９２；
Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．およびＨａｍｍｅｒ、Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６
：５２、１９９４；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９
９３；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２，１９
９５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１
９９６；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１
９９６；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、印刷中、１９９９を参照のこと）。
【００６３】 さらに、ＨＬＡペプチド複合体のＸ線結晶構造解析は、対立遺伝子特異的形態
でペプチドリガンドによって提示される残基を適応する、ＨＬＡ分子のペプチド
結合開裂内のポケットを示し；これらの残基が存在するペプチドのＨＬＡ結合能
を、これらの残基は順に決定する（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎｕ．
Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７，１９９５；Ｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎ
ｉｔｙ ４：２０３、１９９６；Ｆｒｅｍｏｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：３
０５，１９９８；Ｓｔｅｒｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：２４５，１９９４；
Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７５，１９９
７；Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３３，１９９３；Ｇｕｏ
，Ｈ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０５
３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６４，１９９２
；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６７，１９９２；Ｍａ
ｔｓｕｍｕｒａ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９２７，１９９２；Ｍａｄｄ
ｅｎら、Ｃｅｌｌ ７０：１０３５，１９９２；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｄ．Ｈ．ら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９１９，１９９２；Ｓａｐｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｂｊｏｒ
ｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．およびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９
：２７７，１９９１を参照のこと）。
【００６４】 従って、クラスＩおよびクラスＩＩの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフ、
またはクラスＩもしくはクラスＩＩのスーパーモチーフの規定は、特定のＨＬＡ
抗原を結合する可能性を有するタンパク質内の領域の同定を可能にする。
【００６５】 本発明者らは、本明細書中に記載される免疫原性との結合親和性の相関が、候
補ペプチドを評価する場合に考慮されるべき重要な因子であることを見出した。
従って、モチーフ探索とＨＬＡペプチド結合アッセイとの組合わせによって、エ
ピトープに基づくワクチンについての候補が、同定された。これらの結合親和性
を決定した後、さらなる確認の研究を実施して、これらのワクチン候補の中から
集団適用範囲、抗原性および免疫原性についての好ましい特徴を有するエピトー
プを選択し得る。
【００６６】 以下を含む種々の戦略が利用されて免疫原性を評価し得る： １）正常の個体由来のＴ細胞初代培養の評価（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，
Ｐ．Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３，１９９５；Ｃｅｌｉｓ，
Ｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１０５，１９
９４；Ｔｓａｉ，Ｖら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７９６，１９９７；Ｋ
ａｗａｓｈｉｍａ，Ｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１，１９９８を
参照のこと）；この手順は、抗原提示細胞の存在下で数週間にわたる正常被験体
由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の試験ペプチドでの、インビトロにおける刺激
を含む。ペプチドに特異的なＴ細胞は、この期間中活性化され、そして例えば、
ペプチド感受性標的細胞を含む51Ｃｒ放出アッセイを使用して検出される ２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，
Ｐ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７，１９９６；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ
，Ｐ．Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１，１９９６；Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３，１９９７を参照のこ
と）；この方法において、不完全フロインドアジュバント中のペプチドは、ＨＬ
Ａトランスジェニックマウスに皮下的に投与される。免疫の数週間後、脾細胞を
回収して、そして試験ペプチドの存在下で約１週間インビトロで培養する。ペプ
チド特異的Ｔ細胞は、例えば、ペプチド感受性標的細胞および内因性に作製され
た抗原を発現する標的細胞を含む51Ｃｒ放出アッセイを使用して検出される ３）効果的にワクチン接種されて感染から回復した免疫個体からの、および／
または慢性的に感染した患者からのリコール（ｒｅｃａｌｌ）Ｔ細胞応答の実証
（例えば、Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１０４
７，１９９５；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：９７，１９
９７；Ｂｅｒｔｏｎｉ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３
，１９９７；Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：
１６４８，１９９７；Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１
：６０１１，１９９７を参照のこと）；この戦略を適用する際に、リコール応答
は、抗原に対して天然に曝露され（例えば、感染を通じて）従って免疫応答を「
天然に」作製された被験体由来、または感染に対してワクチン接種された患者由
来のＰＢＬを培養することによって検出される。被験体由来のＰＢＬを、試験ペ
プチドに加えて抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下でインビトロで１〜２週間培養
し、「ナイーブ」Ｔ細胞に比べて「メモリー」Ｔ細胞の活性化を可能にする。培
養期間の最後に、Ｔ細胞活性化を、ペプチド感受性標的を含む51Ｃｒ放出、Ｔ細
胞増殖、またはリンホカイン放出を含むＴ細胞活性についてのアッセイを使用し
て検出する。
【００６７】 本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸を、以下に記載する。
【００６８】 （ＩＶ．Ｃ．ＨＬＡ分子に対するペプチドエピトープの結合親和性） 本明細書中に示されるように、かなりの程度のＨＬＡ多型は、ワクチン開発の
ためにエピトープに基づく手段を考慮されるべき重要な因子である。この因子を
扱うために、多様なＨＬＡ分子に対して高い親和性または中程度の親和性で結合
し得るペプチドの同定を含むエピトープ選択は、好ましくは利用され、最も好ま
しくは、これらのエピトープは、２以上の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に対して
高い親和性または中程度の親和性で結合する。
【００６９】 ワクチン組成物について目的のＣＴＬ誘導ペプチドは、好ましくは５００ｎＭ
またはそれよりよい（すなわち、値が≦５００ｎＭである）クラスＩ ＨＬＡ分
子に対するＩＣ50または結合親和性値を有するものを含む。ＨＴＬ誘導ペプチド
は、好ましくは、１０００ｎＭまたはそれよりよい（すなわち、値が≦１０００
ｎＭである）クラスＩＩ ＨＬＡ分子に対するＩＣ50または結合親和性値を有す
るものを含む。例えば、ペプチド結合は、インビトロで精製ＨＬＡ分子に結合す
る候補ペプチドの能力を試験することによって評価される。次いで、高い親和性
または中程度の親和性を示すペプチドは、さらなる分析について考慮される。選
択されるペプチドは、スーパータイプファミリーの他のメンバーに試験される。
好ましい実施形態において、交差反応性の結合を示すペプチドは、次いで、細胞
性スクリーニング分析またはワクチンにおいて使用される。
【００７０】 本明細書中に記載されるように、より高いＨＬＡ結合親和性は、より高い免疫
原性に相関する。より高い免疫原性は、いくつかの異なる方法において明示され
得る。免疫原性は、免疫応答が少しでも誘発されるか否か、および任意の特定の
応答の活力、ならびに応答が誘発される集団の範囲に相関する。例えば、ペプチ
ドは、多様なアレイの集団において免疫応答を誘発し得るが、活発な応答を産生
する例は未だない。これらの原理に従って、中程度の親和性で結合するペプチド
の約５０％と比較して、高度に結合するペプチドの９０％近くは、免疫原性であ
ることが見出されている。さらに、より高度な結合親和性のペプチドは、より活
発な免疫原性応答を導く。結果として、高い親和性で結合するペプチドが使用さ
れる場合、同様の生物学的効果を誘発することが必要とされるペプチドはほとん
どない。従って、本発明の好ましい実施形態において、高い親和性の結合エピト
ープは、特に有用である。
【００７１】 ＨＬＡクラスＩ分子の結合親和性と、結合した抗原上の別個のペプチドエピト
ープの免疫原性との間の関係は、本発明者らにより当該分野で初めて決定された
。結合親和性と免疫原性との間の相関を、２つの異なる実験的アプローチにおい
て分析した（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−
５５９２，１９９４を参照のこと）。第１のアプローチにおいて、１０，０００
倍の範囲を超えるＨＬＡ結合親和性に及ぶ潜在エピトープの免疫原性を、ＨＬＡ
−Ａ*０２０１トランスジェニックマウスにおいて分析した。第２のアプローチ
において、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の約１００の異なる潜在的エピトー
プ（全て、Ａ*０２０１結合モチーフを有する）の抗原性を、急性肝炎患者に由
来するＰＢＬを用いて評価した。これらのアプローチに続いて、約５００ｎＭ（
好ましくは、５０ｎＭ以下）の親和性閾値により、ペプチドエピトープがＣＴＬ
応答を誘起する能力が決定されることを決定した。これらのデータは、天然にプ
ロセシングされたペプチドについて、および合成Ｔ細胞エピトープについてのク
ラスＩ結合親和性測定値に該当する。これらのデータはまた、Ｔ細胞応答の方向
付け（ｓｈａｐｉｎｇ）における決定基選択の重要な役割を示す（例えば、Ｓｃ
ｈａｅｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４
６４９−４６５３，１９８９を参照のこと）。
【００７２】 ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲ分子の状況において免疫原性と関連した親和性閾値も
また記載されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ １６０：３３６３−３３７３，１９８９および９８年１月２１日出願の同時
係属中の米国特許出願第０９／００９，９５３号を参照のこと）。ＤＲ結合親和
性の生物学的に有意な閾値を規定するために、ＤＲ拘束エピトープの拘束エレメ
ント（すなわち、モチーフを結合するＨＬＡ分子）について、３２のＤＲ拘束エ
ピトープのの結合親和性のデータベースをコンパイルした。例の約半分（３２エ
ピトープのうち１５）において、ＤＲ拘束は、高い結合親和性（すなわち、１０
０ｎＭ以下の結合親和性値）と関連していた。例の他方の半分（３２のうち１６
）においては、ＤＲ拘束は、中間の親和性（１００〜１０００ｎＭ範囲の結合親
和性値）と関連していた。３２例のうちわずか１つにおいて、ＤＲ拘束は、１０
００ｎＭ以上のＩＣ50と関連していた。従って、１０００ｎＭがＤＲ分子の状況
において免疫原性と関連した親和性閾値であると規定され得る。
【００７３】 ＨＬＡ分子についてのペプチドの結合親和性は、以下の実施例１に記載のよう
に決定され得る。
【００７４】 （ＩＶ．Ｄ．ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ） １アミノ酸置換抗原アナログ、および内因的に結合した、天然にプロセシング
されたペプチドの配列決定の研究を通して、ＨＬＡ分子に対する対立遺伝子特異
的結合に必要な重要残基を同定した。これらの残基の存在は、ＨＬＡ分子の結合
親和性と相関する。高い親和性結合および中間の親和性結合と相関するモチーフ
および／またはスーパーモチーフの同定は、ワクチンに含ませるための免疫原性
ペプチドエピトープの同定に関して重要な論点である。Ｋａｓｔら（Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１２５：３９０４−３９１２，１９９４）は、モチーフ保有ペプチド
が、対立遺伝子特異的ＨＬＡクラスＩ分子に結合するエピトープの９０％を担う
ことを示した。この研究において、９アミノ酸長かつ８アミノ酸だけ重複する全
ての可能なペプチド（２４０ペプチド）（これらは、ヒトパピローマウイルス１
６型のＥ６およびＥ７タンパク質の配列全体を包含する）を、種々の人種群の中
で高い頻度で発現される、５つの対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に対する結合につ
いて評価した。このペプチドの偏りのないセットは、ＨＬＡクラスＩモチーフの
推定値の評価を可能にした。２４０ペプチドのセットから、２２ペプチドが、高
親和性または中間の親和性で対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に結合したことが同定
された。これらの２２ペプチドのうち、２０（すなわち、９１％）が、モチーフ
を保有していた。従って、この研究により、ワクチンに含ませるためのペプチド
エピトープを同定するためのモチーフの値が示される：モチーフに基づく同定技
術の適用により、標的抗原タンパク質配列における潜在的エピトープの約９０％
が同定される。
【００７５】 このようなペプチドエピトープを以下の表において同定する。
【００７６】 本発明のペプチドはまた、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ分子に結合するエピトープ
を含み得る。このペプチドのＮ末端およびＣ末端に対して、モチーフのサイズお
よび結合フレーム位置の両方におけるより大きな不均質性の程度がクラスＩＩペ
プチドリガンドに存在する。ＨＬＡクラスＩＩペプチドリガンドのこの増加した
不均質性は、ＨＬＡクラスＩ対応分子とは異なり、両方の末端で開いているＨＬ
ＡクラスＩＩ分子の結合溝の構造に起因する。ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲＢ*０１
０１ペプチド複合体の結晶解析により、主要な結合エネルギーはＤＲＢ*０１０
１分子上の相補性ポケットと複合体化したペプチド残基により与えられているこ
とが示された。重要なアンカー残基は、最も深いところにある疎水性ポケットに
結合し（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３：５８７，１９９５を参照のこと）、そして１位（Ｐ１）と呼ばれる。Ｐ１は
、クラスＩＩ結合ペプチドエピトープのＮ末端残基を表し得るが、より代表的に
は、１以上の残基だけＮ末端の方向に隣接している。他の研究によってもまた、
種々のＤＲ分子に対する結合のために、Ｐ１に対して、Ｃ末端の方向の６位のペ
プチド残基の重要な役割が指摘された。
【００７７】 過去数年間に、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子の大部分が比較的少ない
スーパータイプ（各々、大きく重複するペプチド結合レパートリーおよびお主要
なペプチド結合ポケットのコンセンサス構造により特徴付けられる）に分類され
得ることを実証する証拠が蓄積された。従って、本発明のペプチドは、いくつか
のＨＬＡ特異的アミノ酸モチーフのいずれか１つ（例えば、表Ｉ〜ＩＩＩを参照
のこと）、またはモチーフの存在がいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ抗原に結
合する能力に対応する場合はスーパーモチーフにより同定される。特定のアミノ
酸スーパーモチーフを有するペプチドに結合するＨＬＡ分子はまとめて、ＨＬＡ
「スーパータイプ」とよばれる。
【００７８】 以下に記載され、そして表Ｉ〜ＩＩＩにまとめたペプチドモチーフおよびスー
パーモチーフは、本発明に従ってペプチドエピトープの同定および使用について
の手引きを提供する。
【００７９】 それぞれのスーパーモチーフまたはモチーフを有するペプチドエピトープの例
を、以下の各モチーフまたはスーパーモチーフの説明に示されるように、表に含
める。この表は、ペプチドエピトープのいくつかを列挙する結合親和性比を含む
。この比は、以下の式を用いることによりＩＣ50に変換され得る：標準的ペプチ
ドのＩＣ50／比＝試験ペプチド（すなわち、ペプチドエピトープ）のＩＣ50。ク
ラスＩペプチドに対する結合親和性を決定するために用いた標準的ペプチドのＩ
Ｃ50値を、表ＩＶに示す。クラスＩＩペプチドに対する結合親和性を決定するた
めに用いた標準的ペプチドのＩＣ50値を、表Ｖに示す。本明細書中に記載の結合
アッセイについての標準物質として用いたペプチドは、標準物質の例である；代
わりの標準的ペプチドもまた、結合研究を行う場合に用いられ得る。
【００８０】 各表において列挙されたペプチドエピトープ配列を得るために、１９９９年Ｌ
ｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．
ｇｏｖ）に示されたＨＩＶ−１単離物の全てについてのタンパク質配列データを
、指定されたスーパーモチーフまたはモチーフの存在について評価した。株の表
を、表ＸＸＶＩに示す。９つのＨＩＶ−１構造タンパク質および調節タンパク質
（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ｒｅｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖ
ｐｕ）を、分析に含めた。ペプチドエピトープを、さらに、各ＨＩＶ抗原に対し
て利用可能なタンパク質配列の中で、それらの保存性（すなわち、分散量）に基
づいて評価した。表ＶＩＩ〜ＸＸに示されたペプチドを生成するために用いた保
存性の基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体が、特定のＨＩＶ抗原に
利用可能な配列の１５％で完全に保存されていることを必要とする。同様に、保
存性の基準は、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの９マーコア領域全体が、特定の
タンパク質について利用可能な配列の１５％で完全に保存されていることを必要
とする。選択されたペプチドエピトープの保存性％を、表に示す。頻度（すなわ
ち、完全に保存されたペプチド配列が同定されるＨＩＶタンパク質抗原の配列の
数）もまた示す。表中の「ｐｏｓ（位置）」列は、エピトープの最初のアミノ酸
残基に対応するＨＩＶタンパク質におけるアミノ酸位置を示す。「アミノ酸の数
」は、エピトープ配列中の残基の数を示す。
【００８１】 （ＣＴＬ誘導性ペプチドエピトープを示すＨＬＡクラスＩモチーフ） 以下に示したＨＬＡクラスＩペプチドエピトープのスーパーモチーフおよびモ
チーフの第１のアンカー残基を、表Ｉにまとめる。表Ｉ（ａ）に示されたＨＬＡ
クラスＩモチーフは、本願発明に最も詳細に関連するものである。一次および二
次アンカー位置を、表ＩＩにまとめる。ＨＬＡクラスＩスーパータイプファミリ
ーを含む対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに列挙する。いくつかの場合、
ペプチドエピトープをモチーフおよびスーパーモチーフ表の両方に列挙し得る。
特定のモチーフと代表的なスーパーモチーフとの関係は、個々のモチーフの説明
に示される。
【００８２】 （ＩＶ．Ｄ．１． ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフを、２位に小さな（ＴまたはＳ）または疎水性
（Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）の一次アンカー残基がペプチドリガンド中に存在し、そ
してエピトープのＣ末端位置に芳香族（Ｙ、ＦまたはＷ）の一次アンカー残基が
存在することにより特徴付けた。Ａ１スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の
対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ａ１スーパータイプ）は、少なくとも
Ａ*０１０１、Ａ*２６０１、Ａ*２６０２、Ａ*２５０１、およびＡ*３２０１を
含む（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５９３
０，１９９３；ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：６２０
，１９９４；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：２４
９，１９９７を参照のこと）。Ａ１スーパーファミリーのメンバーであると推定
された他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。個々のＨＬＡタンパ
ク質の各々に結合するペプチドを、第１および／または二次アンカー位置での置
換により、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択す
ることにより調節し得る。
【００８３】 Ａ１スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＶＩＩに示す
。
【００８４】 （ＩＶ．Ｄ．２．ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ） 対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する一次アンカーの特異性（例え
ば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６，１９９１；Ｈｕｎｔ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１５６１−１２６３，１９９２；Ｐａｒｋｅｒら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７，１９９２；Ｒｕｐｐｅｒ
ｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３）およびＨＬＡ−Ａ２および
ＨＬＡ−Ａ２８分子の間での交差反応性結合を示した（例えば、関連データの総
説については、Ｆｒｕｃｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１８７−１
９２，１９９３；Ｔａｎｉｇａｋｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９：１
５５−１６２，１９９４；Ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
５４：６８５−６９３，１９９５；Ｋａｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：
３９０４−３９１２，１９９４を参照のこと）。これらの一次アンカー残基は、
ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを規定し；ペプチドリガンド中の存在は、いくつ
かの種々のＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２８分子を結合する能力に対応する。
ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフは、２位に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、
Ｍ、Ａ、ＴまたはＱを有するペプチドリガンド、およびエピトープのＣ末端位置
に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを有するペプチドリガン
ドを含む。
【００８５】 ＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、これらのペプチドを結合するＨ
ＬＡ−Ａ２スーパータイプ）は、少なくとも以下を含む：Ａ*０２０１、Ａ*０２
０２、Ａ*０２０３、Ａ*０２０４、Ａ*０２０５、Ａ*０２０６、Ａ*０２０７、
Ａ*０２０９、Ａ*０２１４、Ａ*６８０２およびＡ*６９０１。Ａ２スーパーファ
ミリーのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表Ｖ
Ｉに示す。以下で詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子
の各々に対する結合を、一次および／または二次アンカー位置での置換により、
好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択することによ
り調節し得る。
【００８６】 Ａ２スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＶＩＩＩに示
す。２位に一次アンカー残基Ｖ、Ａ、ＴまたはＱを、Ｃ末端位置にＬ、Ｉ、Ｖ、
ＡまたはＴを含むモチーフは、本願発明に最も詳細に関連するものである。
【００８７】 （ＩＶ．Ｄ．３． ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフは、２位に一次アンカーとしてＡ、Ｌ、Ｉ、Ｖ
、Ｍ、ＳまたはＴがペプチドリガンド中に存在し、そしてエピトープのＣ末端位
置に（例えば、９マーの９位に）正に荷電した残基ＲまたはＫが存在することに
より特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５
：７９，１９９６を参照のこと）。Ａ３スーパーモチーフを結合するＨＬＡ分子
の対応するファミリー（ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ）の例示的メンバーとして
は、少なくとも以下が挙げられる：Ａ*０３０１、Ａ*１１０１、Ａ*３１０１、
Ａ*３３０１およびＡ*６８０１。Ａ３スーパータイプのメンバーであると推測さ
れる他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。以下で詳細に説明され
るように、個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡタンパク質の各々に結合するペプチド
を、ペプチドの一次および／または二次アンカー位置でのアミノ酸の置換により
、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択することに
より調節し得る。
【００８８】 Ａ３スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを表ＩＸに示す。
【００８９】 （ＩＶ．Ｄ．４． ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフは、２位に一次アンカーとして芳香族残基（
Ｆ、Ｗ、またはＹ）または疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、またはＴ）がペ
プチドリガンド中に存在し、そしてエピトープのＣ末端位置に一次アンカーとし
てＹ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、ＩまたはＭが存在することにより特徴付けられる（例えば、
ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（印刷中）１９
９９を参照のこと）。Ａ２４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応する
ファミリー（すなわち、Ａ２４スーパータイプ）としては、少なくともＡ*２４
０２、Ａ*３００１およびＡ*２３０１が挙げられる。Ａ２４スーパータイプのメ
ンバーであると推測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。
対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドを、一次および／または
二次アンカー位置での置換により、好ましくは、スーパーモチーフに特化された
それぞれの残基を選択することにより調節し得る。
【００９０】 Ａ２４スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを表Ｘに示す。
【００９１】 （ＩＶ．Ｄ．５． ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフは、２位に一次アンカーとしてプロリンを有す
るペプチド、およびエピトープのＣ末端位置に一次アンカーとして疎水性アミノ
酸または脂肪族アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆ、Ｗ、またはＹ）により特徴
付けられる。Ｂ７スーパーモチーフを結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー
（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ）は、少なくとも２６のＨＬＡ−Ｂタ
ンパク質を含み、これらとしては以下が挙げられる：Ｂ*０７０２、Ｂ*０７０３
、Ｂ*０７０４、Ｂ*０７０５、Ｂ*１５０８、Ｂ*３５０１、Ｂ*３５０２、Ｂ*３
５０３、Ｂ*３５０４、Ｂ*３５０５、Ｂ*３５０６、Ｂ*３５０７、Ｂ*３５０８
、Ｂ*５１０１、Ｂ*５１０２、Ｂ*５１０３、Ｂ*５１０４、Ｂ*５１０５、Ｂ*５
３０１、Ｂ*５４０１、Ｂ*５５０１、Ｂ*５５０２、Ｂ*５６０１、Ｂ*５６０２
、Ｂ*６７０１、およびＢ*７８０１（例えば、関連データの総説については、Ｓ
ｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７，１９９５；Ｂａｒｂｅｒ
ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１７９，１９９５；Ｈｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ
３６０：４３４，１９９２；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ４１：１７８，１９９５を参照のこと）。Ｂ７スーパータイプのメンバー
であると推測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。以下に
より詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡタンパク質の各々
に結合するペプチドを、ペプチドの一次および／または二次アンカー位置での置
換により、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択す
ることにより調節し得る。
【００９２】 Ｂ７スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを表ＸＩに示す。
【００９３】 （ＩＶ．Ｄ．６． ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフは、２位に一次アンカーとして正に荷電した
残基（Ｒ、Ｈ、またはＫ）がペプチドリガンド中に存在し、そしてエピトープの
Ｃ末端位置に一次アンカーとして疎水性残基（Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、Ａ、ま
たはＶ）が存在することにより特徴付けられる（例えば、ＳｉｄｎｅｙおよびＳ
ｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（印刷中）１９９９を参照のこと）。
Ｂ２７スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち
、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも以下
が挙げられる：Ｂ*１４０１、Ｂ*１４０２、Ｂ*１５０９、Ｂ*２７０２、Ｂ*２
７０３、Ｂ*２７０４、Ｂ*２７０５、Ｂ*２７０６、Ｂ*３８０１、Ｂ*３９０１
、Ｂ*３９０２、およびＢ*７３０１。Ｂ２７スーパータイプのメンバーであると
推測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。対立遺伝子特異
的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドを、一次および／または二次アンカー位
置での置換により、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基
を選択することにより調節し得る。
【００９４】 Ｂ２７スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを表ＸＩＩに示す
。
【００９５】 （ＩＶ．Ｄ．７． ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフは、２位に一次アンカーとして負に荷電した
残基（ＤまたはＥ）がペプチドリガンド中に存在し、そしてエピトープのＣ末端
位置に一次アンカーとして疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、またはＡ
）が存在することにより特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：２６１，１９９６参照のこと）。Ｂ４４スーパーモチ
ーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、Ｂ４４スーパータ
イプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*１８０
１、Ｂ*１８０２、Ｂ*３７０１、Ｂ*４００１、Ｂ*４００２、Ｂ*４００６、Ｂ* ４４０２、Ｂ*４４０３、およびＢ*４００６。対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各
々に結合するペプチドを、一次および／または二次アンカー位置での置換により
、好ましくは、スーパーモチーフに特化されたそれぞれの残基を選択することに
より調節し得る。
【００９６】 （ＩＶ．Ｄ．８． ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフは、ペプチドリガンドにおける、小さな脂肪
族残基（Ａ、Ｓ、またはＴ）の、エピトープの２位での一次アンカー残基として
の存在、および芳香族または疎水性の残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、また
はＡ）の、Ｃ末端位置での一次アンカー残基としての存在によって、特徴付けら
れる（例えば、関連するデータの概説についてはＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ
，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，印刷中、１９９９を参照のこと）。Ｂ５８ス
ーパーモチーフ（例えば、Ｂ５８スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応
するファミリーの例示的なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ * １５１６、Ｂ*１５１７、Ｂ*５７０１、Ｂ*５７０２、およびＢ*５８０１。Ｂ
５８スーパータイプのメンバーであると予測された他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ
分子を、表ＶＩに示す。対立遺伝子特異的ＬＨＡ分子の各々に結合するペプチド
は、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、
好ましくはこのスーパーモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、
調節され得る。
【００９７】 Ｂ５８スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＩＩＩに
示す。
【００９８】 （ＩＶ．Ｄ．９． ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ） ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフは、ペプチドリガンドにおける、極性脂肪族
残基Ｑまたは疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、またはＰ）の、エピトープの
２位での一次アンカーとしての存在、および疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、
Ｖ、Ｌ、またはＡ）の、Ｃ末端位置での一次アンカーとしての存在によって、特
徴付けられる（例えば、ＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ，印刷中、１９９９を参照のこと）。Ｂ６２スーパーモチーフ（例えば
、Ｂ６２スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーの例示的
なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*１５０１、Ｂ*１５０２
、Ｂ*１５１３、およびＢ５２０１。Ｂ６２スーパータイプのメンバーであると
予測された他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を、表ＶＩに示す。対立遺伝子特異
的ＬＨＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置および／または二
次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのスーパーモチーフに対し
て特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【００９９】 Ｂ６２スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＩＶに示
す。
【０１００】 （ＩＶ．Ｄ．１０． ＨＬＡ−Ａ１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ１モチーフは、ペプチドリガンドにおける、Ｔ、Ｓ、またはＭの、
２位での一次アンカー残基としての存在、およびＹの、エピトープのＣ末端位置
での一次アンカー残基としての存在によって、特徴付けられる。代替の対立遺伝
子特異的Ａ１モチーフは、２位よりむしろ３位における、一次アンカー残基によ
って特徴付けられる。このモチーフは、Ｄ、Ｅ、Ａ、またはＳの、一次アンカー
残基としての３位における存在、およびＹの、エピトープのＣ末端位置における
一次アンカー残基としての存在によって、特徴付けられる（例えば、関連するデ
ータの概説については、ＤｉＢｒｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：６
２０、１９９４；Ｋｏｎｄｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：２４９
、１９９７；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３、１９
９４を参照のこと）。ＨＬＡ Ａ１に結合するペプチドは、一次アンカー位置お
よび／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのモチーフ
に対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【０１０１】 いずれかのＡ１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＶに示す
。Ｔ、Ｓ、またはＭを２位に含み、そしてＹをＣ末端位置に含むエピトープもま
た、表ＶＩＩに列挙するＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ
の列挙に含まれる。なぜなら、これらの残基は、Ａ１スーパーモチーフ一次アン
カーのサブセットであるからである。
【０１０２】 （ＩＶ．Ｄ．１１ ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ２*０２０１モチーフは、ペプチドリガンドにおける、ＬまたはＭ
の、９残基ペプチドの２位での一次アンカー残基としての存在、およびＬまたは
Ｖの、Ｃ末端位置での一次アンカー残基としての存在によって特徴付けられるこ
とが決定され（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−２９６、
１９９１を参照のこと）、そしてさらに、９アミノ酸ペプチドの２位にＩを含み
、そしてＣ末端位置にＩまたはＡを含むことが、見出された（例えば、Ｈｕｎｔ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−１２６３、３月６日、１９９２；Ｐａ
ｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７、１９９２を参
照のこと）。Ａ*０２０１対立遺伝子特異的モチーフはまた、本発明者らによっ
て、さらにＶＡ、Ｔ、またはＱを、一次アンカー残基としてこのエピトープの２
位に含み、そしてＭまたはＴを、一次アンカー残基としてＣ末端位置に含むこと
が決定された（例えば、Ｋａｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−
３９１２、１９９４を参照のこと）。従って、ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフは
、２位における一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｔ、またはＱを有
し、そしてこのエピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としてＬ、Ｉ
、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴを有する、ペプチドリガンドを含む。ＨＬＡ−Ａ*０２
０１モチーフの一次アンカー位置を特徴付ける、好ましい許容される残基は、Ａ
２スーパーモチーフを記載する残基と同一である（関連するデータの概説に関し
ては、例えば、Ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８
５−６９３，１９９５；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７、
１９９３；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：２６１−２６
６、１９９６；ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１０：４７８−４８２、１９９８を参照のこと）。Ａ*０２０１モチー
フを特徴付ける二次アンカー残基は、さらに規定されている（例えば、Ｒｕｐｐ
ｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７、１９９３を参照のこと）。これら
を表ＩＩに示す。ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子に結合するペプチドは、一次アンカ
ー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこの
モチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【０１０３】 Ａ*０２０１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＶＩＩＩに示
す。一次アンカー残基Ｖ、Ａ、Ｔ、またはＱを２位に含み、そしてＬ、Ｉ、Ｖ、
Ａ、またはＴをＣ末端に含むＡ*０２０１モチーフは、本明細書中で特許請求さ
れる本発明に最も特に関連するモチーフである。
【０１０４】 （ＩＶ．Ｄ．１２．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ） ＨＬＡ−Ａ３モチーフは、ペプチドリガンドにおける、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、
Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、Ｇ、またはＤの、２位での一次アンカー残基としての存在、お
よびＫ、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、またはＡの、エピトープのＣ末端位置での一次アンカ
ー残基としての存在によって、特徴付けられる（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１５０８、１９９３；お
よびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４、１９９４
を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ３に結合するペプチドは、一次アンカー位置および
／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのモチーフに対
して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【０１０５】 Ａ３モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＶＩに示す。Ａ３ス
ーパーモチーフをも含むエピトープもまた、表ＩＸに列挙する。Ａ３スーパーモ
チーフ一次アンカー残基は、Ａ３およびＡ１１対立遺伝子特異的モチーフ一次ア
ンカー残基のサブセットを含む。
【０１０６】 （ＩＶ．Ｄ．１３． ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ） ＨＬＡ−Ａ１１モチーフは、ペプチドリガンドにおける、Ｖ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ
、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、またはＦの、２位での一次アンカー残基としての存
在、およびＫ、Ｒ、Ｙ、またはＨの、エピトープのＣ末端位置での一次アンカー
残基としての存在によって、特徴付けられる（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２２１７−２２２１、１９９３
；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４、１９
９４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ１１に結合するペプチドは、一次アンカー位置
および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのモチー
フに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され得る。
【０１０７】 Ａ１１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＶＩＩに示す；Ａ
３対立遺伝子特異的モチーフ含むペプチドエピトープもまた、この表に存在する
。なぜなら、Ａ３とＡ１１とのモチーフ間の一次アンカー特異性が広範に重なる
からである。さらに、Ａ３スーパーモチーフを含むペプチドエピトープはまた、
表ＩＸに列挙される。
【０１０８】 （ＩＶ．Ｄ．１４． ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ） ＨＬＡ−Ａ２４モチーフは、ペプチドリガンドにおける、Ｙ、Ｆ、Ｗ、または
Ｍの、２位での一次アンカー残基としての存在、およびＦ、Ｌ、Ｉ、またはＷの
、エピトープのＣ末端位置での一次アンカー残基としての存在によって、特徴付
けられる（例えば、Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４
３１２、１９９５；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３
−３９２４、１９９４を参照のこと）。ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチド
は、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によって、
好ましくはこのモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択して、調節され
得る。
【０１０９】 Ａ２４モチーフを含む代表的なペプチドエピトープを、表ＸＶＩＩＩに示す。
これらのエピトープはまた、ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ保有ペプチドエピ
トープを示す表Ｘに列挙される。なぜなら、Ａ２４対立遺伝子特異的モチーフを
特徴付ける一次アンカー残基は、Ａ２４スーパーモチーフ一次アンカー残基のサ
ブセットを含むからである。
【０１１０】 （クラスＩＩ ＨＴＬ誘導ペプチドエピトープを示すモチーフ） ＨＬＡクラスＩＩペプチドエピトープスーパーモチーフおよび以下に描写する
モチーフの一次および二次アンカー残基を、表ＩＩＩに要約する。
【０１１１】 （ＩＶ．Ｄ．１５． ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ） モチーフをまた、３つの共通のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子
（ＨＬＡ ＤＲＢ１*０４０１、ＤＲＢ１*０１０１、およびＤＲＢ１*０７０１
）に結合するペプチドに関して同定した（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄらによる
概説、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：３３６３−３３７３、１９９８を参
照のこと）。包括的に、これらのモチーフ由来の共通の残基は、ＨＬＡ ＤＲ−
１−４−７スーパーモチーフを描写する。これらのＤＲ分子に結合するペプチド
は、１位の一次アンカー残基としての大きな芳香族または疎水性の残基（Ｙ、Ｆ
、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ，またはＭ）、および９マーコア領域の６位の一次アンカー残
基としての小さな非荷電残基（Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ）に
よって特徴付けられる、スーパーモチーフを保有する。これらのＨＬＡ型の各々
に対する対立遺伝子特異的二次効果および二次アンカーもまた、同定された（Ｓ
ｏｕｔｈｗｏｏｄら、前出）。これらを表ＩＩＩに示す。ＨＬＡ−ＤＲＢ１*０
４０１、ＤＲＢ１*０１０１、および／またはＤＲＢ１*０７０１に結合するペプ
チドは、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における置換によっ
て、好ましくはこのスーパーモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を選択し
て、調節され得る。
【０１１２】 ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを含む保存された９マーコア領域（すなわ
ち、分析のために使用されるＨＩＶ抗原タンパク質配列の少なくとも１５％にお
いて１００％保存される配列）（ここで、このスーパーモチーフの１位は、９残
基コアの１位にある）を、表ＸＩＸａに示す。１５アミノ酸残基長の代表的な例
示的なペプチドエピトープ（これらの各々が、保存された９残基コアを含む）も
また、表の「ａ」部分に示される。例示的な１５残基のスーパーモチーフ保有ペ
プチドについての交差反応性結合データを、表ＸＩＸｂに示す。
【０１１３】 （ＩＶ．Ｄ．１６． ＨＬＡ ＤＲ３モチーフ） ２つの対立遺伝子モチーフ（すなわち、サブモチーフ）は、ＨＬＡ−ＤＲ３分
子に結合するペプチドエピトープを特徴付ける（例えば、Ｇｅｌｕｋら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２，１９９４を参照のこと）。第一のモチーフ（
サブモチーフＤＲ３Ａ）において、大きな疎水性の残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、
またはＹ）は、９マーコアのアンカーの１位に存在し、そしてＤは、このエピト
ープのカルボキシル末端に向かう４位のアンカーとして存在する。他のクラスＩ
Ｉモチーフにおいてと同様に、コアの１位は、ペプチドのＮ末端を占有しても占
有しなくてもよい。
【０１１４】 代替のＤＲ３スーパーモチーフは、このエピトープのカルボキシル末端に向け
て６位の正の電荷の存在によって、アンカーの１位における大きな疎水性の残基
の欠失、および／または負に荷電したかもしくはアミド様のアンカー残基の４位
における欠失を提供する。従って、代替の対立遺伝子特異的ＤＲ３のチーフ（サ
ブモチーフＤＲ３Ｂ）に関して：Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ａ、またはＹは、ア
ンカーの１位に存在し；Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｓ、またはＴは、アンカーの４位に存
在し；そしてＫ、Ｒ、またはＨは、アンカーの６位に存在する。ＨＬＡ−ＤＲ３
に結合するペプチドは、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置にお
ける置換によって、好ましくはこのモチーフに対して特異的なそれぞれの残基を
選択して、調節され得る。
【０１１５】 ＤＲ３Ａサブモチーフを含む９残基配列に対応する保存された９マーコア領域
（すなわち、分析のために使用されるＨＩＶ抗原タンパク質配列の少なくとも１
５％において１００％保存される配列）（ここで、このサブモチーフの１位は、
９残基コアの１位にある）を、表ＸＸａに示す。１５アミノ酸残基長の代表的な
例示的なペプチドエピトープ（これらの各々が、保存された９残基コアを含む）
もまた、表ＸＸａに示される。表ＸＸｂは、例示的なＤＲ３サブモチーフＡ保有
ペプチドの結合データを示す。
【０１１６】 ＤＲ３Ｂサブモチーフを含む保存された９マーコア領域（すなわち、分析のた
めに使用されるＨＩＶ抗原タンパク質配列の少なくとも１５％において１００％
保存される配列）、およびＤＲ３サブモチーフＢエピトープを含むそれぞれの例
示的な１５マーペプチドを、表ＸＸｃに示す。表ＸＸｄは、例示的なＤＲ３サブ
モチーフＢ保有ペプチドの結合データを示す。
【０１１７】 本明細書中の表に示される、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩのペプチドエピ
トープの各々は、別々に、本願発明の局面であるとみなされる。さらに、各ペプ
チドエピトープが他の任意のペプチドエピトープと組み合わせて使用され得るこ
ともまた、本願発明の局面である。
【０１１８】 （ＩＶ．Ｅ．ワクチンの集団適用範囲の増強） 広範な集団適用範囲を有するワクチンは、好ましい。なぜなら、これらは商業
的により価値があり、そして一般に、大部分の人々に対して適用可能であるから
である。広範な集団適用範囲は、全体で考慮した場合に集団の大部分に存在する
ＨＬＡ対立遺伝子に結合するペプチドエピトープを選択することによって、本発
明のペプチド（およびこのようなペプチドをコードする核酸組成物）を使用して
得られ得る。表ＸＸＩは、種々の民族性におけるＨＬＡクラスＩスーパータイプ
の全体的な頻度（表ＸＸＩａ）、ならびにＡ２、Ａ３、およびＢ７スーパータイ
プによって達成される組み合わせられた集団適用範囲（表ＸＸＩｂ）を列挙する
。Ａ２、Ａ３、およびＢ７スーパータイプは、各々が、これら５つの主要な民族
性群の各々において、平均４０％を超えて存在する。８０％を超える適用範囲は
、これらのスーパーモチーフの組み合わせによって達成される。これらの結果は
、効果的かつ民族的に変位していない集団適用範囲が、制限された数の交差反応
性ペプチドの使用の際に達成されることを示唆する。これら３つの主要なペプチ
ド特異性を用いて達成される集団適用範囲は高いが、適用範囲は、９５％以上の
集団適用範囲に達するよう拡張され得、そしてさらなるスーパーモチーフまたは
対立遺伝子特異的モチーフを保有するペプチドの使用によって、真に多重特異性
の応答をより容易に達成する。
【０１１９】 Ｂ４４、Ａ１、およびＡ２４スーパータイプは、平均して、これらの主要な民
族性集団において２５％〜４０％の範囲で各々存在する（表ＸＸＩａ）。全体と
してはさほど流行していないが、Ｂ２７、Ｂ５８、およびＢ６２スーパータイプ
は、各々が、少なくとも１つの主要な民族性群において、２５％より大きな頻度
で存在する（表ＸＸＩａ）。表ＸＸＩｂは、５つの主要な民族性群において同定
されたＨＬＡスーパータイプの組み合わせの推定された流行を要約する。Ａ１、
Ａ２４、およびＢ４４スーパータイプを、Ａ２、Ａ３、およびＢ７の適用範囲に
含めることによって得られる増加した適用範囲、ならびに本明細書中に記載され
る全てのスーパータイプを用いて得られる適用範囲を示す。
【０１２０】 本明細書中に提供されるデータは、Ａ２、Ａ３、およびＢ７スーパータイプの
以前の定義とともに、全ての抗原（Ａ２９、Ｂ８、およびＢ４６の例外が可能で
ある）が、合計で９のＨＬＡスーパータイプに分類され得ることを示す。６つの
最も頻繁なスーパータイプ由来のエピトープを含めることによって、平均９９％
の集団適用範囲が、５つの主要な民族性群に対して得られる。
【０１２１】 （ＩＶ．Ｆ．免疫応答刺激ペプチドアナログ） 一般に、ＣＴＬおよびＨＴＬの応答は、可能なエピトープ全てに指向されるわ
けではない。むしろ、これらは、少数の「免疫優性な」決定因子に制限される（
Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５１５９、１９７
９；Ｂｅｎｎｉｎｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１９３５−１９３９、１
９８８；Ｒａｗｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３９７７−３９８４、１
９９１）。免疫優性（Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７５：２７
３−２７９、１９７２）は、所定のエピトープが選択的に特定のＨＬＡタンパク
質を結合する能力（決定因子選択理論）（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１３１：１６３５、１９８３；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２
６７：１５６−１５８、１９７７）、または既存のＴＣＲ（Ｔ細胞レセプター）
特異性によって選択的に認識されること（レパートリー理論）（Ｋｌｅｉｎ，Ｊ
．，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＯＦ ＳＥＬＦＮＯＮＳ
ＥＬＦ ＤＩＳＣＲＩＭＩＮＡＴＩＯＮ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２７０−３１０頁、１９８２）のいずれかによって説明さ
れ得ることが、理解された。さらなる因子（大部分が先行する事象に連結する）
もまた、制限された免疫原性を超えて、多くの潜在決定因子のどれが免疫優性と
して提示されるかを決定する際に、主要な役割を果たし得ることが、実証された
（Ｓｅｒｃａｒｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７２９−７６
６、１９９３）。
【０１２２】 優性および亜優性の概念は、感染性疾患と癌との両方の免疫療法に関連する。
例えば、慢性ウイルス性疾患の経過において、亜優性エピトープの漸増は、優性
のＣＴＬまたはＨＴＬ特異性がウイルスの機能的許容、抑制、変異および他の機
構によって不活化された場合に特に、感染の首尾よいクリアランスのために重要
であり得る（Ｆｒａｎｃｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：５２
４−５３１，１９９５）。癌および腫瘍の抗原の場合には、最も高い結合親和性
のペプチドの少なくともいくらかを認識するＣＴＬは、機能的に不活化され得る
。より低い結合親和性のペプチドは、優先的に、これらの時点で認識され、従っ
て、治療用または予防用の抗癌ワクチンにおいて、好ましくあり得る。
【０１２３】 特に、公知の非ウイルス性腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来の有意な数のエピトー
プが、中程度の親和性（５０〜５００ｎＭの範囲のＩＣ50）でＨＬＡクラスＩを
結合することが、注目された。例えば、１５の公知のＴＡＡペプチドのうちの８
つが、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）によって認識されるかまたは５０〜５００
ｎＭの範囲でＣＴＬに結合されることが見出された。（これらのデータは、９０
％の既知のウイルス性抗原がＨＬＡクラスＩ分子によって５０ｎＭ以下のＩＣ50 で結合され、一方でほんの約１０％が５０〜５００ｎＭの範囲で結合されるとい
う推定と、対照的である（Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８
−５５９２、１９９４））。癌の硬化において、この現象は恐らく、Ｔ細胞許容
事象に恐らく起因する、最も結合が高いペプチドのいくつかを認識するＣＴＬの
排除または機能的阻害に起因する。
【０１２４】 理論に束縛されることを意図しないが、優性エピトープに対するＴ細胞は、ク
ローン的に除去され得、亜優性（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）なエピトープの選択
は、補強されるＴ細胞の存在を可能にし、これは次いで、治療的応答または予防
的応答を導くと考えられる。しかし、ＨＬＡ分子の亜優性エピトープに対する結
合は、しばしば、優性エピトープに対するより活発ではない。従って、１以上の
ＨＬＡ分子に対する特定の免疫原性エピトープの結合親和性を調節し得、それに
よって、例えば、より活発な応答を誘発するアナログペプチドを調製するために
、ペプチドによって誘発される免疫応答を調節する必要がある。この能力は、ペ
プチドエピトープに基づくワクチンおよび治療剤の有用性を非常に向上する。
【０１２５】 スーパーファミリーの全ての対立遺伝子間の適切な交差反応性を有するペプチ
ドは、上記のスクリーニング手順によって同定されるが、交差反応性は、必ずし
も可能な限り完全ではなく、特定の場合において、ペプチドの交差反応性を増加
するための手順は、有用であり得；さらに、このような手順はまた、結合親和性
またはペプチド安定性のようなペプチドの他の特性を改変するために使用され得
る。所与のモチーフまたはスーパーモチーフ内のＨＬＡ対立遺伝子についてのペ
プチドの交差反応性を支配する一般的法則が確立しているため、より広い（また
は別に改変された）ＨＬＡ結合能力を達成するための特定の目的のペプチドの構
造の改変（すなわち、アナログ化）が実施され得る。より具体的には、最も広い
交差反応性パターンを示すペプチドは、本明細書中の教示に従って産生され得る
。アナログ発生に関する本概念は、１／６／９９に出願した同時係属中Ｕ．Ｓ．
Ｓ．Ｎ．０９／２２６，７７５により詳細に記載される。
【０１２６】 簡略的には、使用されるストラテジーは、特定のＨＬＡ分子への結合に相関す
るモチーフまたはスーパーモチーフを利用する。このモチーフまたはスーパーモ
チーフは、一次アンカー、多くの場合は、二次アンカーを有することによって定
義される。アナログペプチドは、一次アンカー、二次アンカー、または一次およ
び二次アンカー位置において、アミノ酸残基を置換することによって形成され得
る。一般的に、アナログは、すでにモチーフまたはスーパーモチーフを有するペ
プチドに対して作製される。ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドおよびＨＬＡクラスＩ
Ｉ結合ペプチドについて規定されているスーパーモチーフおよびモチーフの好ま
しい二次アンカー残基は、それぞれ、表ＩＩおよびＩＩＩに示される。
【０１２７】 本発明に従う多くのモチーフまたはスーパーモチーフの場合、残基は、対立遺
伝子特異的ＨＬＡ分子または各モチーフまたはスーパーモチーフに結合するＨＬ
Ａスーパータイプのメンバーに対する結合に対して有毒であると定義される（表
ＩＩおよびＩＩＩ）。従って、結合に対して有害であるこのような残基の除去は
、本発明に従って実施され得る。例えば、Ａ３スーパータイプの場合、このよう
な有害残基を有する全てのペプチドが、分析に使用されるペプチドの集団から除
去される場合、交差反応性の発生率は、２２％から３７％まで増加した（例えば
、Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊら、Ｈｕ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９、１９９６を参照の
こと）。従って、所与のスーパーモチーフ内のペプチドの交差反応性を改善する
１つのストラテジーは、ペプチド内に存在する有害残基の１つ以上を除去し、そ
してＡｌａ（ペプチドのＴ細胞認識に影響を及ぼし得ない）のような小さな「中
性」残基を置換するのに簡単である。交差反応性の向上した見込みは、ペプチド
内の有害残基の排除とともに、対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子またはスーパーファ
ミリー内の複数ＨＬＡ分子に対する高親和性結合に関連した「好ましい」残基が
挿入される場合に期待される。
【０１２８】 アナログペプチドが、ワクチンとして使用される場合、実際にインビボで天然
エピトープに対するＣＴＬ応答を誘発する（または、クラスＩＩエピトープの場
合、野生型ペプチドと交差反応するヘルパーＴ細胞を誘発する）ことを確実にす
るため、このアナログペプチドは、適切なＨＬＡ対立遺伝子の個体からインビト
ロでＴ細胞を免疫するために使用され得る。従って、野生型ペプチド感作標的細
胞の溶解を誘導するための免疫した細胞の能力が評価される。抗原提示細胞とし
て、適切な遺伝子で感染またはトランスフェクトされた細胞、あるいは、クラス
ＩＩエピトープのみの場合、全タンパク質抗原でパルス化された細胞を使用する
ことが所望され、それによって、内生的に産生された抗原が関連Ｔ細胞によって
も認識されるかどうかを確実にする。
【０１２９】 本発明の別の実施形態は、弱い結合ペプチドのアナログを形成することであり
、それによって、適切な数の交差反応性細胞バインダーを確実にする。５００〜
５０００ｎＭの結合親和性を示し、そして１つまたは２つの位置において受容可
能であるが、部分最適な一次アンカー残基を保有する、クラスＩ結合ペプチドは
、それぞれのスーパータイプに従って、好ましいアンカー残基を置換することに
よって「固定」され得る。次いで、アナログペプチドは、交差結合活性について
試験され得る。
【０１３０】 有効なペプチドアナログを発生するための別の実施形態は、例えば、液体環境
におけるペプチド安定性または溶解性に悪影響を有する残基の置換を含む。この
置換は、ペプチドエピトープの任意の位置にて起こる。例えば、システイン（Ｃ
）は、α−アミノ酪酸を選択して置換され得る。その化学的性質のために、シス
テインは、ジスルフィド架橋を形成し、そして構造的に十分にペプチドを変更し
て、結合能力を低減する傾向を有する。Ｃの代わりにα−アミノ酪酸で置換する
ことは、この問題を緩和するのみならず、実際に、特定の場合における結合能力
および交差結合能力を改善する（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｉｎ：Ｐｅｒｓｉｓｔ
ｅｎｔ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ編、Ｒ．ＡｈｍｅｄおよびＩ．Ｃｈ
ｅｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ、１９９９による
総説を参照のこと）。システインのα−アミノ酪酸による置換は、ペプチドエピ
トープの任意の残基、すなわち、アンカー位置または非アンカー位置のいずれか
において生じ得る。
【０１３１】 （ＩＶ．Ｇ．スーパーモチーフ保有ペプチドまたはモチーフ保有ペプチドに対
する疾患関連抗原由来のタンパク質配列のコンピュータースクリーニング） 標的抗原内のスーパーモチーフまたはモチーフ保有エピトープを同定するため
に、天然タンパク質配列、例えば、腫瘍関連抗原、または感染生物由来の配列、
または移植のためのドナー組織は、計算するための手段（例えば、知的計算また
はコンピューター）を使用してスクリーンされ、この配列内のスーパーモチーフ
またはモチーフの存在を決定する。天然ペプチドの分析から得られた情報は、天
然ペプチドの状態を評価するために直接使用され得るか、またはペプチドエピト
ープを発生するために続いて利用され得る。
【０１３２】 アナログペプチドの発生を可能にするプログラムのように、本スーパーモチー
フまたはモチーフの発生のためのタンパク質配列の迅速なスクリーニングを可能
にするコンピュータープログラムは、本発明によって包含される。これらのプロ
グラムは、任意の同定されたアミノ酸配列を分析するか、または未知の配列に作
動して同時にその配列を決定し、そのモチーフ保有エピトープを同定するために
実施される；アナログは、同様に、同時に決定され得る。一般的に、同定された
配列は、病原性生物由来または腫瘍関連ペプチド由来である。例えば、本明細書
中で考慮される標的分子として、ＨＩＶのｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ｒ
ｅｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、およびｖｐｕタンパク質が挙げられるが、これ
らに限定されない。
【０１３３】 この同じ標的タンパク質の複合変異体の配列が利用可能である場合、潜在ペプ
チドエピトープもまた、それらの保存に基づいて選択され得る。例えば、保存に
ついての基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの全配列またはクラスＩＩ結合ペ
プチドの全９マーコアが、特異的なタンパク質抗原について評価された配列の示
されたパーセントで保存されることを規定し得る。
【０１３４】 ＨＩＶは迅速に変異し、それによって異なるアミノ酸配列を有するウイルス株
の発生を生じるため、ワクチン組成物中への封入のためのエピトープを選択する
代替の方法が、本明細書中で利用される。多くの異なる株で感染され得る広範な
集団を標的化するために、異なるＨＩＶ株由来のＨＩＶ抗原配列の代表であるエ
ピトープをワクチン組成物に含むことが好ましい。例えば、同じ領域から５エピ
トープを選択することによって、それらの各々は、ＨＩＶ株間で２０％保存され
、それらのエピトープの組み合わせは、その領域の１００％の範囲を達成する。
当業者によって理解されるように、より低いかまたはより高い程度の保存（例え
ば、表ＶＩＩ−ＸＸに設定されたエピトープの同定のために使用される１５％保
存）が、所与の抗原性標的に適切であるとして使用され得る。
【０１３５】 ペプチド結合の予測に利用される選択基準は、実際の結合と最も効率よく相関
するように、可能な限り正確であることが重要である。適切な一次アンカーの存
在に基づいて、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合するペプチドの予測は、約
３０％の割合で陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）である（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ
ら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９、１９９３を参照のこと）。しかし、本明細書中に
開示されるペプチド−ＨＬＡ結合データ、関連した特許出願のデータ、および当
該分野のデータを広範に分析することによって、本発明者らは、一次アンカー残
基単独の存在を基準に、同定についての予測的な値を劇的に増加する多数の対立
遺伝子特異的な多項式アルゴニズムを開発した。これらのアルゴニズムは、一次
アンカーの存在または非存在のみならず、（異なる位置の異なるアミノ酸の影響
を説明するために）二次アンカー残基の陽性または有害な存在を考慮する。この
アルゴニズムは、本質的に、ペプチド−ＨＬＡインターカレーションの全親和力
（またはΔＧ）が、以下：
【０１３６】
【化６】
【０１３７】 の型の線形多項式関数として近似され得るとの仮定に基づき、ここで、ａjiは、
ｎ個のアミノ酸のペプチドの配列に沿った所与の位置（ｉ）における所与のアミ
ノ酸（ｊ）の存在の影響を表す係数である。この方法の重要な仮定は、各位置に
おける影響が、本質的に互いに独立しているという点である。この仮定は、ペプ
チドがＨＬＡ分子に結合され、本質的に伸長したコンフォメーションでＴ細胞に
よって認識されることを証明した研究によって、妥当とされる。特定のアルゴニ
ズム係数の誘導は、例えば、Ｇｕｌｕｋｏｔａ，Ｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２６７：１２５８，１９９７に記載されている。
【０１３８】 好ましいペプチド配列を同定するさらなる方法（これはまた、特定のモチーフ
を使用する）は、中性ネットワークおよび分子モデリングプログラムの使用を含
む（例えば、Ｍｉｌｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６
：７５３、１９９８；Ａｌｔｕｖｉａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８：１、
１９９７；Ａｌｔｕｖｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２４４、１９９
５；Ｂｕｕｓ，Ｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２０９−２１
３、１９９９；Ｂｒｕｓｉｃ、Ｖら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：１
２１−１３０、１９９８；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６
３、１９９３；Ｍｅｉｓｔｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３：５８１、１９９５；
Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３３５，１９９４；Ｓｔｕｒ
ｎｉｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：５５５ １９９９
を参照のこと）。
【０１３９】 例えば、任意の有害な二次アンカー残基の存在を回避しながら、少なくとも１
個の好ましい二次アンカー残基を含むＡ*０２０１モチーフ保有ペプチドのセッ
トにおいて、ペプチドの６９％が５００ｎＭ未満のＩＣ50を有するＡ*０２０１
と結合することが示されている（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊら、Ｃｅｌｌ ７４：９２
９，１９９３）。これらのアルゴニズムはまた、カットオフが、所望される際に
、より高いまたはより低い予測された結合特性を有するペプチドの組を選択する
ために調節され得るという点で融通性がある。
【０１４０】 ペプチドエピトープを同定するためのコンピュータースクリーニングを使用す
る場合、タンパク質配列または翻訳された配列は、モチーフについて研究するた
めに開発されたソフトウエア（例えば、「ＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲ」プログラム（
Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５、
１９８４）またはＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ １．４ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏ
ｇｒａｍ（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を使用して分析され
、適切なＨＬＡ結合モチーフを含有する潜在ペプチド配列を同定し得る。この同
定されたペプチドは、カスタマイズされた多項式アルゴニズムを使用して記録さ
れ（ｓｃｏｒｅ）、特異的なＨＬＡクラスＩ対立遺伝子またはＨＬＡクラスＩＩ
対立遺伝子を結合する能力を予測し得る。当業者によって理解されるように、多
くのコンピュータープログラミングソフトウエアおよびハードウエアオプション
は、公知または未知のペプチド配列を評価するために（例えば、限定されないが
、エピトープを同定するために、単位ペプチド長あたりのエピトープ濃度を同定
するために、またはアナログを発生するために）、本発明のモチーフを実施する
ために使用され得る関連分野において利用可能である。
【０１４１】 上記の手順に従って、ＨＬＡスーパータイプ群または対立遺伝子特異的なＨＬ
Ａ分子と結合し得るＨＩＶペプチドエピトープおよびそれらのアナログが、同定
された（表ＶＩＩ−ＸＸ）。
【０１４２】 （ＩＶ．Ｈ．ペプチドエピトープの調製） 本発明に従うペプチドは、合成的に、組換えＤＮＡ技術または化学合成によっ
て、あるいは、天然腫瘍または病原性生物のような天然源から、調製され得る。
ペプチドエピトープは、個々にまたはポリエピトープペプチドとして、合成され
得る。ペプチドが好ましくは、幾つかの実施形態において、他の天然に存在する
宿主細胞タンパク質およびそれらのフラグメントを実質的に有しないが、これっ
らのペプチドは、天然フラグメントまたは粒子に合成的に複合体化され得る。
【０１４３】 本発明に従うペプチドは、種々の長さであり得、そしてそれらの中性（非電荷
）形態または塩である形態であり得る。本発明に従うペプチドは、グリコシル化
、側鎖酸化、またはリン酸化反応のような修飾を有しないか、またはそれらは修
飾が本明細書中に記載されるようなペプチドの生物学的活性を破壊しない条件に
供せられるこれらの修飾を含む。
【０１４４】 可能である場合、本発明のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドエピトープを約８〜約
１３アミノ酸残基の長さ、好ましくは９〜１０に最適化することが所望され得る
。ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドエピトープは、約６〜約３０のアミノ酸長、好
ましくは、約１３残基と約２０残基との間に最適化され得る。好ましくは、ペプ
チドエピトープは、関連ＨＬＡ分子に結合される内生的に処理された病原体誘導
ペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが釣り合っている。
【０１４５】 代替の実施形態において、本発明のエピトープは、ポリエピトープペプチドと
して、またはポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子として、連結され
得る。
【０１４６】 別の実施形態において、高濃度のクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩ
Ｉエピトープを含む天然ペプチド領域を同定することが好ましい。このような配
列は、一般的に、単位アミノ酸長あたり最大数のエピトープを含むことに基づい
て選択される。エピトープが、入れ子または重なり合った様式で存在し得、例え
ば、１０アミノ酸長のペプチドが、２個の９アミノ酸長のエピトープおよび１個
の１０アミノ酸長のエピトープを含み；細胞内処理の際に、各エピトープが、曝
露され得、そしてこのようなペプチドの投与の際にＨＬＡ分子によって結合され
得ることが理解される。このより長い、好ましくは、多重エピトープ性ペプチド
は、合成的に、組換え的に、または天然源からの切断を介して、発生され得る。
【０１４７】 本発明のペプチドは、広範な種々の様式で調製され得る。好ましい比較的短い
サイズの場合、このペプチドは、従来の技術に従って、溶液中でまたは固体支持
体上で合成され得る。種々の自動合成装置は、市販され、公知のプロトコールに
従って使用され得る。（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ
Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第二版、Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、１９８４）。さらに、個々のペプチドエピトープは
、化学連結を使用して接合され、本発明の範囲内にあるより大きなペプチドを産
生し得る。
【０１４８】 あるいは、組換えＤＮＡ技術が使用され得、ここで、目的の免疫原性ペプチド
をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクター内に挿入され、適切な宿主細胞
に形質転換またはトランスフェクトされ、そして発現に適切な条件下で培養され
る。これらの手順は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されるように、一般に当該分野で公知である。従
って、本発明の１個以上のペプチド配列を含む組換えポリペプチドは、適切なＴ
細胞エピトープを提示するために使用され得る。
【０１４９】 本明細書中で考慮された好ましい長さのペプチドエピトープについてのヌクレ
オチドコード配列は、化学的技術（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のホスホトリエステル法）に
よって合成され得る。ペプチドアナログは、天然ペプチド配列をコードする核酸
塩基を適切かつ所望の核酸塩基に置き換えることによって単純に作製され得る；
例示的な核酸置換は、本明細書中において、モチーフ／スーパーモチーフによっ
て規定されるアミノ酸をコードする置換である。次いで、コード配列は、適切な
リンカーが提供され得、そして当該分野で市販される発現ベクターに溶解され得
、そしてベクターは、所望の融合タンパク質を産生するために適切な宿主を形質
転換するために使用される。多くのこのようなベクターおよび適切な宿主系は、
ここで利用可能である。この融合タンパク質の発現のために、コード配列は、作
動可能に連結した開始コドンおよび終止コドン、プロモーターおよびターミネー
ター領域および通常、複製システムを備え、所望の細胞性宿主における発現のた
めの発現ベクターを提供する。例えば、細菌性宿主と適合したプロモーター配列
は、所望のコード配列の挿入のための好都合な制限部位を含むプラスミドに提供
される。得られる発現ベクターは、適切な細菌性宿主に形質転換される。当然の
ことながら、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞宿主もまた、適切なベクターおよ
びコントロール配列を利用して、使用され得る。
【０１５０】 （ＩＶ．Ｉ．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ） 一旦、ＨＬＡ結合ペプチドが同定されると、それらは、Ｔ細胞応答を誘発する
能力について試験され得る。モチーフ保有ペプチドの調製および評価は、ＰＣＴ
公報ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５に記載される。簡単に述
べると、特定の抗原由来のエピトープを含むペプチドが合成され、適切なＨＬＡ
タンパク質に結合するそれらの能力について試験される。これらのアッセイは、
放射ヨウ素標識した参照ペプチドの結合に関して、精製されたＨＬＡクラスＩ分
子への本発明のペプチドの結合を評価する工程を包含し得る。あるいは、空のク
ラスＩ分子を発現する細胞（すなわち、その中にペプチドを含まない）は、免疫
蛍光染色およびフロー微蛍光測定によってペプチド結合について評価され得る。
ペプチド結合を評価するために使用され得る他のアッセイは、ペプチド依存クラ
スＩアセンブリアッセイおよび／またはペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害を
含む。代表的に、５００ｎＭ以下の親和性でクラスＩ分子に結合するそれらのペ
プチドは、感染された個体または免疫された個体から誘導体化されたＣＴＬのた
めの標的として作用する能力について、および、疾患に付随した選択された標的
細胞と反応し得るＣＴＬ集団を誘発し得る一次インビトロＣＴＬ応答または一次
インビボＣＴＬ応答を誘発する能力について、さらに評価される。対応するアッ
セイは、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの評価のために使用される。代表的に、
１０００ｎＭ以下の親和性で結合することが示されるＨＬＡクラスＩＩモチーフ
保有ペプチドは、ＨＴＬ応答を刺激する能力についてさらに評価される。
【０１５１】 Ｔ細胞応答を検出するために使用される従来のアッセイとして、増殖アッセイ
、リンホカイン分泌アッセイ、直接細胞傷害性アッセイ、および制限希釈アッセ
イ（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）が挙げられる。例えば
、ペプチドを用いて培養された抗原提示細胞は、応答細胞集団（ｒｅｓｐｏｎｄ
ｅｒ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のＣＴＬ応答を誘発する能力について
アッセイされ得る。抗原提示細胞が、末梢血液単核細胞または樹状細胞のような
正常細胞であり得る。あるいは、内部的に処理されたペプチドを有するクラスＩ
分子を装填するそれらの能力に欠乏し、そして適切なヒトクラスＩ遺伝子でトラ
ンスフェクトされた変異体非ヒト哺乳動物細胞株が、ペプチドのインビトロで一
次ＣＴＬ応答を誘発する能力について試験するために使用され得る。
【０１５２】 末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＣＴＬ前躯体の応答細胞源として使用され
得る。適切な抗原提示細胞は、ペプチドと共にインキュベートされ、次いで、ペ
プチド装填した抗原提示細胞が、最適な培養条件下で応答細胞集団と共にインキ
ュベートされる。陽性ＣＴＬ活性化は、放射標識した標的細胞を殺傷するＣＴＬ
の存在について培養物をアッセイすることによって決定され得る。特定のペプチ
ドパルス化標的およびペプチド配列が誘導される抗原の内生的に処理された形態
を発現する標的細胞。
【０１５３】 より最近では、フルオレセイン標識したＨＬＡテトラマー複合体で染色するこ
とによって抗原特異的Ｔ細胞の直接的定量を可能にする方法が、考案された（Ａ
ｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
０：１９９３；Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４，１
９９６）。他の比較的最近の技術的開発として、細胞内リンホカインを染色する
工程、およびインターフェロン放出アッセイまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイが挙
げられる。テトラマー染色、細胞内リンホカイン染色およびＥＬＩＳＰＯＴアッ
セイは全て、より従来のアッセイより少なくとも１０倍より感度が高いようであ
る（Ｌａｌｖａｎｉ，Ａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９、１９９７；
Ｄｕｎｂａｒ、Ｐ．Ｒ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３、１９９８；Ｍｕ
ｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：１７７、１９９８
）。
【０１５４】 ＨＴＬの活性化はまた、当該分野で公知の技術（例えば、Ｔ細胞増殖およびリ
ンホカイン（例えば、ＩＬ−２）の分泌）を使用して評価され得る（例えば、Ａ
ｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１〜７６１、１９９４を参照
のこと）。
【０１５５】 あるいは、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫は、ペプチドエピトープの
免疫原性を決定するために使用され得る。いくつかのトランスジェニックマウス
モデル（ヒトＡ２．１、Ａ１１（これはＨＬＡ−Ａ３エピトープを分析するため
にさらに使用され得る）、およびＢ７対立遺伝子を有するマウスを含む）が特徴
付けられ、そして他のマウス（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４に対するトラ
ンスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ
３マウスモデルもまた開発されている。他のＨＬＡ対立遺伝子を有するさらなる
トランスジェニックマウスモデルが、必要に応じて作製され得る。マウスは、不
完全フロイトアジュバントに乳化したペプチドで免疫され得、そして得られるＴ
細胞は、ペプチドパルス化（ｐｕｌｓｅｄ）標的細胞を認識し、適切な遺伝子で
トランスフェクトされた細胞を標的化するそれらの能力について試験される。Ｃ
ＴＬ応答は、上記の細胞傷害性アッセイを使用して分析され得る。同様に、ＨＴ
Ｌ応答は、Ｔ細胞増殖またはリンホカインの分泌のようなアッセイを使用して分
析され得る。
【０１５６】 代表的な免疫原性ペプチドエピトープを、表ＸＸＩＩＩに記載する。
【０１５７】 （ＩＶ．Ｊ．診断薬としておよび免疫応答を評価するためのペプチドエピトー
プの使用） 本発明の一実施形態において、本明細書中に記載されるようなＨＬＡクラスＩ
およびクラスＩＩ結合ペプチドが、免疫応答を評価するための試薬として使用さ
れる。評価されるべき免疫応答は、免疫源として、試薬として用いられるペプチ
ドエピトープを認識しそしてこれに結合する抗原特異性ＣＴＬまたはＨＴＬを生
成し得る任意の物質を使用することによって、誘導され得る。ペプチド試薬は、
免疫原として使用される必要はない。このような分析のために使用され得るアッ
セイシステムとしては、比較的最近の技術開発（例えば、細胞内リンホカインお
よびインターフェロン放出アッセイのためのテトラマー染色、またはＥＬＩＳＰ
ＯＴアッセイ）が挙げられる。
【０１５８】 例えば、本発明のペプチドは、病原または免疫原に曝露された後の抗原特異性
ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価するために、テトラマー染色アッセ
イにおいて使用され得る。ＨＬＡテトラマー複合体を使用して、抗原特異性ＣＴ
Ｌを直接可視化し（例えば、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３〜２
１０６、１９９８；およびＡｌｔｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １７４：９４〜９
６、１９９６を参照のこと）、そして末梢血単核細胞のサンプル中の抗原特異性
ＣＴＬ集団の頻度を決定する。
【０１５９】 本発明のペプチドを使用するテトラマー試薬は、典型的に以下のように生成さ
れ得る：ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、三分子複合体を生成するために、対
応するＨＬＡ重鎖およびβ2−ミクログロブリンの存在下で再折り畳みされる。
この複合体は、先にタンパク質に操作された部位において重鎖のカルボキシル末
端でビオチン化される。テトラマー形成は、次いで、ストレプトアビジンの付加
によって誘導される。蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて、抗原特異性
細胞を染色するためにテトラマーが使用され得る。これらの細胞は、次いで、例
えば、フローサイトメトリーによって同定され得る。このような分析は、診断目
的または予後目的のために使用され得る。
【０１６０】 本発明のペプチドはまた、免疫リコール応答を評価するための試薬として使用
される（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５
０３〜５１３、１９９７、およびＰｅｎｎａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：
１５６５〜１５７０、１９９１を参照のこと）。例えば、ＨＩＶに罹患した個体
由来の患者のＰＢＭＣサンプルは、特定のペプチドを使用して、抗原特異性ＣＴ
ＬまたはＨＴＬの存在について分析され得る。単核細胞を含む血液サンプルは、
ＰＢＭＣを培養し、そして本発明のペプチドでその細胞を刺激することによって
評価され得る。適切な培養期間の後、拡大された細胞集団は、例えば、ＣＴＬま
たはＨＴＬ活性について分析される。
【０１６１】 ペプチドはまた、ワクチンの効力を評価するための試薬として使用される。免
疫原をワクチン接種された患者から得たＰＢＭＣは、例えば、上記の方法のいず
れかを使用して分析され得る。患者は、ＨＬＡタイプであり、そしてその患者に
存在する対立遺伝子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬は、分析のた
めに選択される。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣサンプル中のＨＩＶエピトー
プ特異性ＣＴＬおよび／またはＨＴＬの存在によって示される。
【０１６２】 本発明のペプチドはまた、当該分野で周知の技術を使用して、抗体を作製する
ために使用され（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭ
ＵＮＯＬＯＧＹ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｈａｒｌｏｗ、Ｈａｒｌｏｗ
ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと）、これはＨＩＶ感染を診断するため
の試薬として有用であり得る。このような抗体としては、ＨＬＡ分子の状況にお
いてペプチドを認識する抗体（すなわち、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗
体）が挙げられる。
【０１６３】 （ＩＶ．Ｋ．ワクチン組成物） ワクチン、および本明細書中で記載されるような免疫原性的に有効量の１つ以
上のペプチドを含むワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施形態であ
る。一旦適切な免疫原性ペプチドが規定されると、これらは様々な手段によって
識別されそして送達され得る（本明細書中で「ワクチン」組成物と称される）。
このようなワクチン組成物としては、例えば、リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉ
ｅｌｌｏ，Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、
ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）ミクロスフェアにカ
プセル化されたペプチド組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７〜２９４，１９９１：Ａｌｏｎｓｏら、Ｖａｃｃｉ
ｎｅ １２：２９９〜３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３
：６７５〜６８１，１９９５を参照のこと）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）
に含まれたペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３
４４：８７３〜８７５，１９９０；Ｈｕら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１１３：２３５〜２４３，１９９８）、多抗原ペプチドシステム（ＭＡＰ）（
例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８５：５４０９〜５４１３、１９８８；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１７〜３２，１９９６）、多価ペプチドして処
方されたペプチド；弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達システムで使用するため
のペプチド、典型的に結晶化されたペプチド、ウイルス送達ベクター（Ｐｅｒｋ
ｕｓ、Ｍ．Ｅ．ら、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ｓ．Ｈ．Ｅ．編、３７９頁、１９９６；Ｃｈａｋｒ
ａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３５，１９８６；Ｈｕ，Ｓ．
Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３７、１９８６；Ｋｉｅｎｙ，Ｍ．Ｐ．ら、
ＡＩＤＳ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：７９０、１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ
．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１４８，１９７１；Ｃｈａｎｄ
ａ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５：５３５，１９９０）、ウイルスま
たは合成起源の粒子（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ．１９２：２５，１９９６；Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｓｅ
ｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３；Ｆｏｌｏ，Ｌ．Ｄ．Ｊｒ．ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．７：６４９，１９９５）、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎ，
Ｈ．Ｓ．、Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．およびＣｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅ
ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９，１９８６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｖａｃ
ｃｉｎｅ １１：２９３，１９９３）、リポソーム（Ｒ４ｅｄｄｙ，Ｒ．ら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５、１９９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：１３１，１９９６）、または裸のまたは粒子吸収
性のｃＤＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５，
１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．、Ｈｕｎｔ，Ｌ．Ａ．、およびＷｅｂｓ
ｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １１：９５７、１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，
Ｊ．Ｗ．ら、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編、４２３頁、１９９６；Ｃｅａｓｅ，Ｋ
．Ｂ．およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ、Ｊ．Ａ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１２：９２３、１９９４およびＥｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｓｅｍ．Ｈ
ｅｍａｔｏｌ．３０：１６、１９９３）が挙げられ得る。Ａｖａｎｔ Ｉｍｍｕ
ｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ．Ｍａｓｓａｃｈｕ
ｓｅｔｔｓ）の技術のようなレセプター媒介性標的化として公知のトキシン標的
化送達技術もまた使用され得る。
【０１６４】 本発明のワクチン組成物は、核酸媒介様式を含む。本発明の１つ以上のペプチ
ドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡもまた、患者に投与され得る。このアプロー
チは、例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５（１９９０）
、ならびに米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第
５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号
；同第５，６７９，６４７号；ＷＯ ９８／０４７２０に記載され、そして以下
でより詳細に記載される。ＤＮＡに基づく送達技術の例としては、「裸のＤＮＡ
」、（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性の）促進化（ｆａｃｉｌｉｔａ
ｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）送達、カチオン性脂質複合体送達、および粒子媒介
性（「遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）」）または圧力媒介性送達（例えば、米国
特許第５，９２２，６８７号を参照のこと）が挙げられる。
【０１６５】 治療的または予防的免疫目的のため、本発明のペプチドは、ウイルス性ベクタ
ーまたは細菌性ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例としては、ワ
クチンまたは鶏痘のような弱毒化ウイルス宿主が挙げられる。このアプローチは
、例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクター
としてワクチンウイルスを使用することを包含する。急性または慢性的に感染さ
れた宿主あるいは非感染宿主へ導入されると、組換えワクチンウイルスは、免疫
原性ペプチドを発現し、それにより宿主ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発
する。免疫プロトコールにおいて有用なワクチンベクターおよび方法は、米国特
許第４，７２２，８４８号に記載される。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌ
ｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６〜４６０（１９９１）に記載される。本
発明のペプチドの治療的投与または免疫のために有用な広範な他のベクター（例
えば、アデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター、弱毒化炭疽毒素ベクターなど）は、
本明細書中の記載から当業者に明らかである。
【０１６６】 さらに、本発明に従うワクチンは、１つ以上の本発明のペプチドの組成物を含
む。ペプチドは、個々にワクチン中に存在し得る。あるいは、ペプチドは、同じ
ペプチドの複数のコピーを含むホモポリマーとして、または様々なペプチドのヘ
テロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、増加した免疫反応（ここで、異な
るペプチドエピトープはポリマーを作製するために使用される）の利点である、
免疫応答について標的化された病原体または腫瘍関連ペプチドの異なる抗原性決
定因子と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するさらなる能力を有する。
この組成物は、天然に存在する範囲の抗原であり得るか、または例えば、組換え
的にまたは化学合成によって調製され得る。
【０１６７】 本発明のワクチンと共に使用され得るキャリアは、当該分野で公知であり、そ
して例えば、サイクログロブリン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）
、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタ
ミン酸）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる
。このワクチンは、生理学的耐性の（すなわち、受容可能な）希釈剤（例えば、
水、または生理食塩水、好ましくは、リン酸緩衝生理食塩水）を含み得る。ワク
チンはまた、典型的にアジュバントを含む。アジュバント（例えば、非完全フロ
イトアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバン
）は、当該分野で周知の材料の例である。さらに、本明細書中に開示されるよう
に、ＣＴＬ応答は、脂質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイ
ンリセリル（ｇｌｙｃｅｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｌｙｓｅｒｙｌ）−セリン（Ｐ3
ＣＳＳ）に本発明のペプチドを結合することによってプライム化され得る。
【０１６８】 注射、エアロゾル、経口、経皮、筋内、胸内、くも膜下腔内、または他の適切
な経路を介して本発明に従うペプチド組成物で免疫すると、宿主の免疫系は、所
望の抗原に対して特異的な多量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを産生することに
よって、ワクチンに応答する。従って、この宿主は、少なくとも部分的に後の感
染に対して免疫があるか、または少なくとも部分的に進行中の慢性的な感染の発
症に対して耐性であるか、または抗原が腫瘍関連である場合、少なくともいくつ
かの治療的利点を誘導する。
【０１６９】 いくつかの実施形態において、クラスＩペプチド成分と、目的の標的抗原に対
する中和抗体および／またはヘルパーＴ細胞の応答を誘導または促進する成分と
を組み合わせることが所望され得る。このような組成物の好ましい実施形態は、
本発明に従うクラスＩおよびクラスＩＩｐエピトープを含む。このような組成物
の代替の実施形態は、本発明に従うクラスＩおよびクラスＩＩエピトープを、汎
（Ｐａｎ）ＤＲ分子（例えば、ＰＡＤＲＥTM）と共に含む（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；例えば、米国特許第５，７３６，１４２号に記載さ
れる）。
【０１７０】 本発明のワクチンはまた、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ）（例えば、樹状細
胞（ＤＣ））を本発明のペプチドを提示するためのベシクルとして含み得る。ワ
クチン組成物は、樹状細胞の可動化および収集に続いてインビトロで作製され得
、それにより、樹状細胞の負荷はインビトロで起こる。例えば、樹状細胞は、本
発明に従うミニ遺伝子でトランスフェクトされるか、またはペプチドでパルス化
される。次いで、樹状細胞は、インビボでの免疫応答を誘発するために患者に投
与され得る。
【０１７１】 ワクチン組成物（ＤＮＡに基づくかまたはペプチドに基づくかのいずれか）は
また、樹状細胞可動化と組み合わせてインビボで投与され得、これにより樹状細
胞の負荷はインビボで起こる。
【０１７２】 抗原性ペプチドは、同様に、エキソビボにおけるＣＴＬおよび／またはＨＴＬ
応答を誘導するために使用される。得られるＣＴＬまたはＨＴＬ細胞は、他の従
来の形態の治療に応答しないか、または本発明に従う治療的ワクチンペプチドま
たは核酸に応答しない患者における慢性感染または腫瘍を処置するために使用さ
れ得る。特定の抗原（感染または腫瘍関連の抗原）に対するエキソビボにおける
ＣＴＬまたはＨＴＬ応答は、組織培養において、患者の、すなわち遺伝的に適合
性のＣＴＬまたはＨＴＬ前駆細胞をＡＰＣの供給源（例えば、ＣＤ）および適切
な免疫原性ペプチドと共にインキュベートすることによって誘導される。適切な
インキュベート時間（典型的には、約７〜２８日）の後、この前駆細胞は活性化
され、そしてエフェクター細胞に拡大され、これらの細胞は患者に注入し戻され
、ここでこれらの細胞は特定の標的細胞（感染細胞または腫瘍細胞）を破壊する
かまたはその破壊を促進する。トランスフェクトされた樹状細胞はまた、抗原提
示細胞として使用され得る。
【０１７３】 本発明のワクチン組成物はまた、ＨＩＶ感染のために使用される他の処置薬と
共に使用され得、プロテアーゼインヒビターおよびＬＩ−２のような他の免疫ア
ジュバントを含む治療レジメンと組み合わせた使用を含む。
【０１７４】 好ましくは、以下の原理はワクチンにおいて使用するためのポリエピトープ組
成物に含有するためのエピトープのアレイを選択する場合、またはワクチンに含
有されるべき別個のエピトープおよび／またはミニ遺伝子のような核酸によって
コードされるべきエピトープを選択するために、使用される。ＨＩＶ感染を処置
または予防するためのワクチンにおいて使用され得る代表的な例示的なエピトー
プは、表ＸＸＸＶＩＩおよびＸＸＸＶＩＩＩに記載される。以下の原理の各々が
、選択を行うためにバランスを保たれることが好ましい。所定のワクチン組成物
に組み込まれる複数のエピトープは、エピトープが駆動されるネイティブの抗原
における配列で連続し得るが、これは必ずしもその必要はない。
【０１７５】 １）投与されると、ＨＩＶクリアランスに相関することが観察された免疫応答
を模倣するエピトープが選択される。ＨＬＡクラスＩについて、これはＨＩＶの
少なくとも１つの抗原に由来する３〜４個のエピトープを含む。ＨＬＡクラスＩ
Ｉに付いて、類似の原理が用いられる；また３〜４個のエピトープは、少なくと
も１つのＨＩＶ抗原から選択される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２７８：１４４７〜１４５０を参照のこと）。
【０１７６】 ２）免疫原性と相関することが確立された必須結合親和性を有するエピトープ
眼選択される：ＨＬＡクラスＩは、５００ｎＭ以下のＩＣ50を有し、クラスＩＩ
について、１０００ｎＭ以下のＩＣ50を有する。
【０１７７】 ３）十分なスーパーモチーフ保有ペプチドまたは対立遺伝子特異的モチーフ保
有ペプチドの十分なアレイは、広い集団適用範囲を与えるように選択される。例
えば、少なくとも８０％の集団適用範囲を有することが好ましい。Ｍｏｎｔｅ
Ｃａｒｌｏ分析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、集団適用範囲の広
さまたは重複性を評価し得る。
【０１７８】 ４）癌関連性抗原からエピトープを選択する場合、患者はネイティブのエピト
ープに対して発達した耐性を有し得るため、アナログを選択することがしばしば
有用である。感染疾患関連性抗原についてエピトープを選択する場合、ネイティ
ブのエピトープまたはアナログのエピトープのいずれかを選択することが好まし
い。
【０１７９】 ５）「入れ子状（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープ」と称されるエピトープは特定の
関連性を有する。少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列において重
複している入れ子状エピトープが生じる。入れ子状ペプチド配列は、ＨＬＡクラ
スＩおよびＨＬＡクラスＩＩエピトープの両方を含み得る。入れ子状エピトープ
を提供する場合、一般的な目的は、一配列あたりの最多数のエピトープを提供す
ることである。従って、１つの局面は、ペプチド中のアミノ末端エピトープのア
ミノ末端およびカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端より長いペプチ
ドを提供しないようにすることである。多重エピトープ性配列（例えば、入れ子
状エピトープを含む配列）を提供する場合、一般に、これが病理学的または他の
有害な生物学的特性を有さないことを保証するために、この配列をスクリーニン
グすることが重要である。
【０１８０】 ６）ポリエピトープタンパク質が作製される場合、またはミニ遺伝子を作製す
る場合、目的のエピトープを含む最小のペプチドを生成することが目的である。
入れ子状エピトープを含むペプチドを選択する場合に用いられるものと同じでは
ない場合、この原理は類似している。しかし、人工ポリエピトープペプチドを用
いて、サイズ最小化の目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープ間の任
意のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスを保たれる。スペーサー
アミノ酸残基は、例えば、接合部エピトープ（免疫系により認識されるエピトー
プであって、標的抗原には存在せず、そしてエピトープの人工並列によってのみ
作製される）を回避するため、またはエピトープ間の切断を促進し、それにより
エピトープ提示を増大するために導入され得る。接合部エピトープは一般的に回
避される。なぜなら、レシピエントは、非ネイティブのエピトープに対する免疫
応答を生成し得ないからである。「優性エピトープ」である接合部エピトープは
特に関心をもたれる。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減
少または抑制されるこのような強力な応答を導き得る。
【０１８１】 ７）同一の標的タンパク質の複数の改変体の配列が利用可能である場合、強力
なペプチドエピトープはまたそれらの保存性に基づいて選択され得る。例えば、
保存性についての基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体またはクラス
ＩＩ結合ペプチドの９マーコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価され
た配列の指定された割合で保存されることを定義する。
【０１８２】 （ＩＶ．Ｋ．１．ミニ遺伝子ワクチン） 複数のエピトープを同時に送達し得る多数の異なるアプローチが利用可能であ
る。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態である
。ミニ遺伝子に含まれるエピトープは、好ましくは、前の章に記載されるガイド
ラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ま
しい手段は、本発明の１つまたは複数のエピトープを含むペプチドをコードする
ミニ遺伝子構築物を使用する。
【０１８３】 多重エピトープ性ミニ遺伝子の使用は、以下に記載される（例えば、同時継続
中の出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ． ０９／３１１，７８４；Ｉｓｈｉｏｋａら，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ １６２：３９１５−３９２５，１９９９；Ａｎ，Ｌ．およびＷｈ
ｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１：２２９２，１９９７；Ｔｈｏｍ
ｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：８２２，；Ｗｈｉｔｔｏｎ
，Ｊ．Ｌ．ら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒら，
Ｖａｃｃｉｎｅ １６：４２６，１９９８）。例えば、９個の優性ＨＬＡ−Ａ*
０２０１−をコードする多重エピトープ性ＤＮＡプラスミド、ならびにポリメラ
ーゼ、エンベロープ、ならびにＨＢＶおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の
中心タンパク質、ＰＡＤＲＥTM汎用ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）エピトープ、なら
びに小胞体転座シグナル配列由来の全制限エピトープを遺伝子操作した。
【０１８４】 多重エピトープ性ミニ遺伝子の免疫原性をトランスジェニックマウスで試験し
て、この試験したエピトープに対するＣＴＬ誘導応答の大きさを評価し得る。さ
らに、インビボにおいてＤＮＡでコードされたエピトープの免疫応答を、ＤＮＡ
プラスミドで形質移入した標的細胞に対する特異的ＣＴＬ系統のインビトロ応答
と相関させ得る。従って、これらの実施例は、このミニ遺伝子が以下の両方に有
用であることを示し得る：１）ＣＴＬ応答を発生させること、および２）コード
されたエピトープを発現する誘導ＣＴＬ認識細胞。
【０１８５】 例えば、ヒトの細胞中での発現のために、選択したエピトープ（ミニ遺伝子）
をコードするＤＮＡ配列を産生するために、このエピトープのアミノ酸配列は、
逆転写され得る。ヒトコドン使用表を利用して、各アミノ酸配列に対するコドン
選択を誘導し得る。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列は、直接隣接さ
れてもよく、翻訳される場合、連続ポリペプチド配列を産生する。発現および／
または免疫原性を最適にするために、さらなるエレメントがミニ遺伝子の設計に
取り込まれ得る。逆転写され、そしてミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列
の例としては、以下が挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩ
Ｉエピトープ、ユビキチン結合シグナル配列、および／または小胞体標的シグナ
ル。さらに、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、合成（例えば、ポ
リ−アミン）または天然に存在する、ＣＴＬエピトープまたはＨＴＬエピトープ
に隣接する側方配列を含むことによって改良され得；エピトープ（単数または複
数）を含むこれらのより大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
【０１８６】 ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子の＋鎖および−鎖をコードするオリゴヌクレオ
チドを構築することによってＤＮＡに変換され得る。重複性オリゴヌクレオチド
（３０〜１００の塩基長）を、周知の技術を使用する適切な条件下で、合成、リ
ン酸化、精製およびアニールし得る。オリゴヌクレオチドの末端を、例えば、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼを使用して結合し得る。次いで、この合成ミニ遺伝子（エピ
トープポリペプチドをコードする）を、所望の発現ベクターにクローニングし得
る。
【０１８７】 当業者に周知の標準調節配列を、好ましくは、標的細胞での発現を確実にする
ためにベクター中に含まれる。いくつかのベクターエレメントが所望される；ミ
ニ遺伝子の挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；効果的な
転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点；およびＥ
．ｃｏｌｉ分泌標識（例えば、アンプリコンまたはカナマイシン耐性）。多数の
プロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター）
が、この目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列について、例
えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照
のこと。
【０１８８】 さらなるベクターの改変は、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するた
めに所望される。いくつかの場合において、イントロンは、効果的な遺伝子発現
のために必要とされ、そして１以上の合成イントロンまたは天然に存在するイン
トロンは、ミニ遺伝子の転写領域に取り込まれ得る。ミニ遺伝子の発現を増加さ
せるために、ｍＲＮＡ安定化配列および哺乳動物細胞中での複製のための配列の
封入が考慮され得る。
【０１８９】 一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポ
リリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドを、適切なＥ．ｃｏｌｉ
株に形質転換され、そしてＤＮＡが標準的な技術を使用して調製される。ミニ遺
伝子の起点およびＤＮＡ配列、ならびにベクター中に含まれる他の全エレメント
は、制限マップおよびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正確なプラスミド
を有する細菌細胞は、マスター細胞バンクおよび作業用細胞バンクとして保存さ
れ得る。
【０１９０】 さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性
の役割を果たすようである。これらの配列は、所望の場合、免疫原性を増強する
ために、ミニ遺伝子コード配列の外側のベクター中に含まれ得る。
【０１９１】 いくらかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープおよび第２タンパ
ク質の両方の産生を可能にするｂｉ−シストロン発現ベクター（免疫原性を増強
または減少させるために含まれる）を使用し得る。同時発現する場合、免疫応答
を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン
（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン−誘導分子（
例えば、ＬｅＩＦ）、同時刺激分子、またはＨＴＬ応答、汎ＤＲ結合タンパク質
（ＰＡＤＲＥTM、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる
。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを細胞内標的シグナルに結合し、そして発現し
たＣＴＬエピトープから別個に発現し得る。これにより、ＨＴＬエピトープをＣ
ＴＬエピトープと異なる細胞画分に指向することを可能にする。必要である場合
、これにより、ＨＴＬエピトープのＨＬＡクラスＩＩ経路へのより効果的な侵入
を可能にし、これによりＨＴＬ誘導を改良する。ＨＴＬまたはＣＴＬ誘導に対し
て、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答を特異的に
減少させることは、特定の疾患において有用であり得る。
【０１９２】 治療量のプラスミドＤＮＡを、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの発酵、続く精製により
産生され得る。作業用細胞バンクからのアリコートを、増殖培地を播種するため
に使用し、周知の技術に従って、振盪フラスコまたはバイオリアクター中で飽和
まで増殖させる。プラスミドＤＮＡを、標準的なバイオ分離技術（例えば、ＱＩ
ＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供給
される固相陰イオン交換樹脂）を使用して精製され得る。必要とされる場合、高
次コイルＤＮＡを、ゲル電気泳動または他の方法を使用する、開環形態および線
状形態から単離し得る。
【０１９３】 精製したプラスミドＤＮＡを、種々の処方物を使用する注入のために調製し得
る。これらの最も単純なものは、滅菌リン酸−緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の凍
結乾燥したＤＮＡの再構築物である。「裸のＤＮＡ」として公知のこのアプロー
チは、現在、臨床試験において筋内（ＩＭ）投与のために使用されている。ミニ
遺伝子のＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大にするために、精製したプラスミ
ドＤＮＡを処方するための代替方法が所望され得る。種々の方法が記載され、そ
して新規の技術が利用可能であり得る。カチオン性脂質、糖脂質、および融合誘
導リポソームがまた処方物中で使用され得る（例えば、ＷＯ９３／２４６４０；
Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｓｑ
ｕｅｓ６（７）：６８２（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ
９１／０６３０９号；およびＦｅｌｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３（１９８７）を参照のこと）。さらに、保護
的、相互作用的、非融合化合物（ＰＩＮＣ）として集合的に言及されるペプチド
および化合物はまた、精製されたプラスミドＤＮＡに複合体化され、安定性、筋
内分散、または特定の器官もしくは細胞型の輸送に影響を与える。
【０１９４】 標的細胞の感作は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡ
クラスＩ提示のための機能的アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミド
ＤＮＡを、標準的なＣＴＬのクロム放出アッセイに対する標的として適切である
、哺乳動物細胞株に導入される。使用される形質移入方法は、最終の処方物に依
存する。エレクトロポレーションが「裸の」ＤＮＡのために使用され、一方、カ
チオン性脂質は、インビトロでの形質移入に指向することを可能にする。プラス
ミド発現緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を同時形質移入して、蛍光活性化細胞分
類（ＦＡＣＳ）を使用する形質移入細胞の濃縮を可能にし得る。次いで、これら
の細胞は、エピトープ−特異的ＣＴＬ株のための標的細胞として標識および使用
されるクロミウム−５１（51Ｃｒ）であり；51Ｃｒ放出によって検出された細胞
溶解は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの産物およびミニ遺伝子コード化
ＣＴＬエピトープのＨＬＡ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴ
Ｌ活性を評価するためのアッセイを使用して、類似様式で評価され得る。
【０１９５】 インビボでの免疫原性は、ミニ遺伝子のＤＮＡ処方物の機能的試験についての
第２のアプローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェ
ニックマウスは、ＤＮＡ産物で免疫される。投与の用量および経路は、処方物に
依存する（例えば、ＰＢＳ中でのＤＮＡに対するＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡに対
する腹腔内（ＩＰ））。免疫の２１日後、球状赤血球を収集し、そして試験され
る各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間、再刺激した。その後、
ＣＴＬエフェクター細胞について、標準的な技術を使用してペプチド負荷した51 Ｃｒ標識でした標的細胞の細胞溶解についてアッセイを行った。ミニ遺伝子コー
ド化エピトープに対応する、ペプチドエピトープで負荷したＨＬＡによって感作
された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボでの誘導についてＤＮＡワクチン機
能を証明する。ＨＴＬエピトープの免疫原性を、アナログ様式でトランスジェニ
ックマウスにおいて評価する。
【０１９６】 あるいは、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるような弾道
送達を使用して、核酸を投与し得る。この技術を使用して、単独でＤＮＡを含む
粒子を投与する。さらなる代替の実施形態において、ＤＮＡは、粒子（例えば、
金粒子）に接着され得る。
【０１９７】 （ＩＶ．Ｋ．２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組み合わせ） 本発明のペプチドを含むワクチン組成物、またはそのアナログ（これは、免疫
刺激性活性を有する）を改変して、所望の属性（例えば、改良された血清の半減
期）を提供するか、または免疫原性を増強し得る。
【０１９８】 例えば、ＣＴＬ活性を誘導するためのペプチドの能力を、Ｔヘルパー細胞応答
を含み得る少なくとも１つのエピトープを含む配列にペプチドを連結することに
よって増強し得る。免疫原性を増強するために、ＣＴＬエピトープと組合せたＴ
ヘルパーエピトープの使用は、例えば、同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／８
２０，３６０号、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１９７，４８４号、およびＵ．Ｓ．Ｓ
．Ｎ．０８／４６４，２３４号に例示される。
【０１９９】 ＣＬＴペプチドをＴヘルパーペプチドに直接的に連結し得るが、しばしばＣＴ
Ｌエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体をスペーサー分子によって連結する。こ
のスペーサーは、代表的に、比較的小さな中性分子（例えば、アミノ酸またはア
ミノ酸模倣物）からなり、これは生理学的条件下で実質的に荷電されていない。
このスペーサーは、代表的に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸
もしくは中性の極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意に、本
スペーサーは、同一の残基を含む必要がなく、従ってヘテロ−オリゴマーまたは
ホモ−オリゴマーであり得ることが理解される。存在する場合、このスペーサー
は、通常、少なくとも１個または２個の残基、より通常、３〜６個の残基、そし
て時々、１０以上の残基である。ＣＴＬペプチドエピトープは、ＣＴＬペプチド
のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかのスペーサーを介して、または直
接的かのいずれかで、Ｔヘルパーペプチドエピトープに連結され得る。免疫原性
ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端をアシル化し得る。
【０２００】 特定の実施形態において、このＴヘルパーペプチドは、複数の集団中に存在す
るＴヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、多くの、ほとん
どの、または全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドを選択することに
よって達成され得る。これらは、「緩やかにＨＬＡで拘束された」または「乱雑
」Ｔヘルパー配列として公知である。乱雑であるアミノ酸配列の例としては、位
置８３０〜８４３（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ；配列番号５１４８４）の破
傷風トキソイド、位置３７８〜３９８（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ
ＶＮＳ；配列番号５１４８５）のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ（ＣＳ）タンパク質および位置１１６（Ｇ
ＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ；配列番号５１４８６）のＳｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ１８ｋＤタンパク質のような抗原由来の配列を含む。他の例としては、
ＤＲ１−４−７過剰モチーフ、またはＤＲ３モチーフのいずれかを有するペプチ
ドが挙げられる。
【０２０１】 あるいは、緩やかにＨＬＡで拘束された様式で、天然に存在しないアミノ酸配
列を使用して、Ｔヘルパーリンフォサイトを刺激し得る合成ペプチドを調製する
ことが可能である（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７７０７を参照のこと）。
汎ＤＲ−結合エピトープと呼ばれる合成化合物（例えば、ＰＡＤＲＥTM、Ｅｐｉ
ｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、最も好ましくは、ほと
んどのＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に結合するように設計される
。例えば、以下の式を有する汎ＤＲ−結合エピトープペプチド：ａＫＸＶＡＡＷ
ＴＬＫＡＡａ（ここで、「Ｘ」は、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン
、またはチロシンのいずれかであり、そしてａは、Ｄ−アラニンまたはＬ−アラ
ニンのいずれかである）は、ほとんどＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し、そして
ＨＬＡ型に関係なく、ほとんどの固体由来のＴヘルパーリンホカインの応答を刺
激することが見出された。汎ＤＲ結合エピトープの代替物は、全て「Ｌ」点検ア
ミノ酸を含み、そしてこのエピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
【０２０２】 ＨＴＬペプチドエピトープはまた、それらの生物学的特性を変えるように改変
され得る。例えば、このエピトープは、Ｄ−アミノ酸を有するように改変され得
、プロテアーゼに対する耐性を上げ、従って血清の半減期を伸ばすか、またはこ
のエピトープは、脂質、タンパク質、炭水化物などのような他の分子に結合され
、生物学的活性を上げ得る。例えば、Ｔヘルパーペプチドを、アミノ末端または
カルボキシル末端のいずれかで１以上のパルミチン酸鎖に結合させ得る。
【０２０３】 （ＩＩＩ．Ｋ．３．ＣＴＬペプチドとＴ細胞初回刺激剤との組合せ） いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物中に、細胞傷害Ｔリンフ
ォサイトを初回刺激する少なくとも１成分を含むことが所望され得る。脂質は、
ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを初回刺激し得る薬剤として同定された
。例えば、パルミチン酸残基は、リシン残基のε−およびα−アミノ基に結合さ
れ得、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなど
の１以上の連結残基を介して免疫原性ペプチドに連結される。次いで、この脂質
化ペプチドを、ミセルまたは粒子のいずれかで直接投与し、リポソームに組み込
まれるか、またはアジュバント（例えば、フロイント不完全アジュバント）に乳
化され得る。好ましい実施形態において、特に有効な免疫原性組成物は、Ｌｙｓ
のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合するプラスミン酸を含み、これは、例
えばＳｅｒ−Ｓｅｒの連結を介して、免疫原性ペプチドのアミノ末端に結合され
る。
【０２０４】 ＣＴＬ応答を初回刺激する脂質の別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質
（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ 3 ＣＳＳ））を使用して、適切なペプチドに共有結合する場合に、ウイルス特異
的ＣＴＬを初回刺激し得る（例えば、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：５
６１，１９８９を参照のこと）。例えば、本発明のペプチドをＰ3ＣＳＳに連結
して、そしてリポペプチドを、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的に初回刺激
するために、個体に投与され得る。さらに、抗体を中和する誘導は、Ｐ3ＣＳＳ
結合体化エピトープで初回刺激され得るので、これらの２種の組成物は、体液性
応答と細胞媒介応答との両方をより有効に惹起するように組み合わせられる。
【０２０５】 ＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドをまた、ペプチドの末端にアミノ酸を付
加することによって改変され得、キャリア支持体またはより大きなペプチドに連
結するため、ペプチドまたはオリゴペプチドの物理学的特性または化学的特性を
改変するためなどに、一方のペプチドを別のペプチドに連結する容易性を提供す
る。アミノ酸（チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギ
ン酸など）を、ペプチドまたはオリゴペプチド（特に、クラスＩペプチド）のＣ
末端またはＣ末端に誘導し得る。しかし、ＣＴＬエピトープのカルボキシル末端
の改変は、いくらかの場合、ペプチドの結合特性を変化させ得ることに注目すべ
きである。さらに、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端−ＮＨ2アシル
化（例えば、アルカノイル（Ｃ１−Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化、
カルボキシル末端のアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンなど））
によって改変することによって天然の配列とは異なり得る。いくつかの場合にお
いて、これらの改変体は、支持体または他の分子に連結するための部位を提供し
得る。
【０２０６】 （ＩＶ．Ｋ．４ ＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドでパルスされたＤＣを
含むワクチン組成物） 本発明に従うワクチン組成物の実施形態は、エピトープ含有ペプチドのカクテ
ルの、患者の血液からのＰＢＭＣまたはそこから単離されたＤＣへのエキソビボ
での投与を含む。ＤＣの収集を促進するための薬学的組成物（例えば，Ｐｒｏｇ
ｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎTM（Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）または
ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）が使用される。ＤＣをペプチドでパルスした後、およ
び患者への再灌流の前に、ＤＣを洗浄して、非結合ペプチドを除去する。この実
施形態において、パルス化ペプチドエピトープに存在する、ペプチドパルス化Ｄ
Ｃを含むワクチンを、それらの表面上でＨＬＡ分子と共に複合体化した。
【０２０７】 このＤＣを、ペプチドのカクテルと共にエキソビボでパルスし得、これらのい
くらかは、目的の１以上のＨＩＶ抗原に対するＣＴＬ応答を刺激する。必要に応
じて、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）ペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥファミリー分子
）を誘導して、ＣＴＬ応答を促進し得る。従って、本発明の従うワクチン（好ま
しくは、複数のＨＩＶ抗原由来のエピトープを含む）を使用して、ＨＩＶ感染を
処置する。
【０２０８】 （ＩＶ．Ｌ．治療目的または予防目的のためのワクチンの投与） 本発明のペプチドならびに本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、哺
乳動物（特に、ヒト）への投与のために有用であり、ＨＩＶ感染を処置および／
または予防する。本発明のペプチドを含むワクチン組成物は、ＨＩＶに感染した
患者あるいはＨＩＶに感染しやすい、または危険性がある患者に投与され、ＨＩ
Ｖ抗原に対する免疫応答を惹起し、従って患者自身の免疫応答能力を向上させる
。
【０２０９】 本明細書中に記載されるように、本発明のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピト
ープを含むペプチドは、ＨＬＡ分子によって提示される場合、およびペプチドに
よって含まれるエピトープに特異的なＣＴＬまたはＨＴＬと接触される場合に、
免疫応答を誘導する。このペプチド（またはこのペプチドをコードするＤＮＡ）
は、個々に、または１以上のペプチド配列の融合として投与され得る。このペプ
チドをＣＨＬまたはＨＴＬと接触させる様式は、本発明にとって重要ではない。
例えば、このペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかでＣＴＬまたは
ＨＴＬと接触され得る。インビボでこの接触が生じる場合、このペプチド自体は
、患者に投与され得るか、または他のベシクル（例えば、１以上のペプチドをコ
ードするＤＮＡベクター、このペプチドをコードするウイルスベクター、リポソ
ームなど）が、本明細書中に記載されるように使用され得る。
【０２１０】 ペプチドがインビトロで接触される場合、ワクチン接種剤は、集団の細胞（例
えば、ペプチドパルス樹状細胞、またはＨＩＶ特異的ＣＴＬ）を含み得、これは
、抗原提示細胞をインビトロでペプチドに適用することによってか、または抗原
提示細胞を本発明のミニ遺伝子でトランスフェクトすることによって導入されて
いる。続いて、このような細胞集団は、治療的有効用量で患者に投与される。
【０２１１】 治療的適用において、ペプチドおよび／または核酸組成物は、ウイルス抗原に
対する有効なＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を引き出し、そして症状および／
または合併症を治癒するかあるいは少なく部分的に阻止するかまたは遅くするの
に十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効
用量」として規定される。この使用に有効な量は、例えば、投与される特定の組
成物、投与の方法、処置される疾患の段階および重症度、患者の体重および健康
の一般的状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。
【０２１２】 本発明のワクチン組成物はまた、予防薬として純粋に使用され得る。一般的に
、最初の予防的免疫についての投薬量は、下限の値が約１、５、５０、５００、
または１０００μｇであり、そして上限の値が約１０，０００；２０，０００；
３０，０００；または５０，０００μｇである単位投薬範囲で一般に存在する。
ヒトについての投薬量の値は、典型的に、７０キログラムの患者あたり約５００
μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。これに続いて、ワクチンの最初の投与
の約４週間〜６ヶ月後に、規定された間隔で投与される約１．０μｇと約５０，
０００μｇの間のペプチドの投薬量をブーストする。ワクチンの免疫原性は、患
者の血液のサンプルから得られたＣＴＬおよびＨＴＬの特異的活性を測定するこ
とによって評価され得る。
【０２１３】 感受性の個体が感染の前に同定される場合、組成物は、彼らに対して標的化さ
れ得、従って、より大きな集団への投与の必要を最小化する。
【０２１４】 薬学的組成物について、本発明の免疫原性ペプチド、またはそれらをコードす
るＤＮＡは、一般的にＨＩＶですでに感染された個体に投与される。ペプチドま
たはそれらをコードするＤＮＡは、個々にまたは１つ以上のペプチドの配列の融
合物として投与され得る。ＨＩＶ感染患者は、免疫原性ペプチドを用いて別々に
または適切なように他の処置と組み合わせて処置され得る。治療的使用のために
、投与は、一般的に、ＨＩＶ感染の最初の診断において始まる。これに続いて、
少なくとも症状が実質的に弱めるまでそしてその後のある期間の間、用量をブー
ストする。患者に送達されるワクチン組成物の実施形態（すなわち、ペプチドカ
クテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、あるいはＨＩＶ抗原特異的
ＣＴＬまたはパルス樹状細胞のような実施形態を含むが、これらに限定されない
）は、疾患の段階または患者の健康状態に従って変化し得る。例えば、いくつか
の患者において、ＨＩＶ特異的ＣＴＬを含むワクチンは、ＨＩＶ感染細胞を殺傷
する際に、代替の実施形態よりも効果的であり得る。
【０２１５】 ＨＩＶ感染の処置または予防に使用されるペプチドまたは他の組成物は、例え
ば、疾患の症状を表していないが、疾患ベクターとして働くヒトにおいて使用さ
れ得る。この文脈において、細胞傷害性Ｔ細胞応答を効果的に刺激するのに十分
な投与の様式によって送達される量のペプチドエピトープを提供することが一般
的に重要である；ヘルパーＴ細胞応答を刺激する組成物はまた、本発明のこの実
施形態に従って与えられ得る。
【０２１６】 最初の治療的免疫のための投薬量は、一般的に、下限の値が約１、５、５０、
５００、または１０００μｇであり、そして上限の値が約１０，０００；２０，
０００；３０，０００；または５０，０００μｇである単位投薬範囲で存在する
。ヒトについての投薬量の値は、典型的に、７０キログラムの患者あたり約５０
０μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。数週間〜数ヶ月（例えば、４週間〜
６ヶ月）にわたってブースティングレジメンに従って約１．０μｇ〜約５０，０
００μｇのペプチドのブースティング投薬は、多分、個体を効果的に免疫するた
めの長期の時間の間、必要とされ得る。ブースティング用量は、患者の血液から
得られるＣＴＬおよびＨＴＬの特異的活性を測定することによって決定される患
者の応答および状態に依存して投与され得る。
【０２１７】 本発明のペプチドおよび組成物は、重症な疾患、すなわち、生命を危うくする
状況または潜在的に生命を危うくする状況で使用され得る。このような場合にお
いて、最小量の外来の物質および本発明の好ましい組成物におけるペプチドの比
較的非毒性の性質の結果として、これらの記述された投薬量に対して実質的に過
剰のこれらのペプチド組成物を投与することが、可能であり、そして処置する患
者によって望ましいと感じられ得る。
【０２１８】 少なくとも臨床的症状または実験的試験が、ウイルス感染が除去されたかまた
は実質的に弱まったことを示すまでそしてその後のある期間の間、投薬が続けら
れるべきである。投薬、投与の経路、および投薬スケジュールは、当該分野で公
知の方法論に従って調節される。
【０２１９】 治療的処置のための薬学的組成物は、非経口的投与、局所的投与、経口投与、
くも膜下投与、または局所投与に意図される。好ましくは、薬学的組成物は、非
経口的に、例えば、静脈内に、皮下に、皮内に、または筋内に投与される。従っ
て、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）に溶解される
かまたは懸濁される免疫原性ペプチドの溶液を含む非経口投与のための組成物を
提供する。種々の水性キャリアは、例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水
、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などが使用され得る。これらの組成物は、従
来の周知の滅菌化技術によって滅菌化され得るか、または滅菌濾過され得る。得
られる水溶液は、そのままでの使用のためにパッケージングされ得るか、または
凍結乾燥され得、この凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌溶液と組み合わ
せられる。この組成物は、およそ生理学的条件に必要とされる薬学的に受容可能
な補助物質、例えば、ｐＨ調節剤、緩衝化剤、張性調節剤、湿潤剤、保存剤など
（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、
塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン
など）を含み得る。
【０２２０】 薬学的処方物中の本発明のペプチドの濃度は、幅広く、すなわち、約０．１重
量％未満、通常、約２重量％または少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５
０重量％以上の多さまでで変化し得、主に、選択される投与の特定の様式に従っ
て、流体容積、粘度などによって選択される。
【０２２１】 ペプチド組成物のヒト単位用量形態は、代表的に、ヒト単位用量の受容可能な
キャリア（好ましくは、水性キャリア）を含む薬学的組成物中に含まれ、そして
このような組成物のヒトへの投与に使用されるための当業者によって公知の流体
の容積で投与される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７th Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、
Ｅｄｉｔｏｒ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅ
ｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８５）。
【０２２２】 本発明のペプチドはまた、リポソームを介して投与され得、リポソームは、ペ
プチドを特定の組織（例えば、リンパ組織）に標的化させるために、または感染
した細胞に選択的に標的化させるために、そしてペプチド組成物の半減期を増加
させるために役立つ。リポソームには、エマルジョン、泡状物、ミセル、不溶性
単層、液晶、リン脂質分散物、層状層などが挙げられる。この調製物において、
送達されるべきペプチドは、リポソームの一部として、単独であるいはリンパ系
細胞に広く行き渡るレセプターに結合する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合す
るモノクローナル抗体）とともに、または他の治療組成物もしくは免疫原性組成
物とともに組み込まれる。従って、本発明の所望のペプチドで負荷されるかまた
は装飾（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）されるかのいずれかのリポソームが、リンパ球の
部位に指向され、ここで、そのときリポソームがペプチド組成物を送達する。本
発明に従う使用のためのリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、こ
れには、一般的に、中性および陰性に荷電されたリン脂質およびステロール（例
えば、コレステロール）が挙げられる。脂質の選択は、一般的に、例えば、リポ
ソームサイズ、酸不安定性および血流中のリポソームの安定性を考慮してガイド
される。種々の方法が、リポソームを調製するために利用可能であり、例えば、
Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（
１９８０）および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号
、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載される。
【０２２３】 免疫系の細胞を標的化するために、リポソームに組み込まれるリガンドには、
例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメ
ントが挙げられ得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、静脈内、局所的（ｌ
ｏｃａｌｌｙ、ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）などで、特に投与の方法、送達されるペプ
チド、および処置される疾患の段階に従って変化する用量で投与され得る。
【０２２４】 固体組成物について、従来の非毒性固体キャリアが使用され得、これには、例
えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネ
シウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース
、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能な
非毒性組成物は、任意の通常使用される賦形剤（例えば、先に列挙されたもの）
および一般的に１０〜９５％の活性成分（すなわち、本発明の１つ以上のペプチ
ド）、より好ましくは、２５％〜７５％の濃度で組み込むことによって形成され
る。
【０２２５】 エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドは、好ましくは、界面活性剤およ
び噴霧剤とともに細かく分割された形態で供給される。ペプチドの代表的な割合
は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは、１重量％〜１０重量％である。
界面活性剤は、もちろん非毒性でなければならず、そして好ましくは噴霧剤に可
溶である。このような薬剤の代表は、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸のエス
テルまたは部分エステル、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パル
ミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓ
ｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸と、脂肪族多水酸基アルコールまたは
その環式無水物である。混合エステル（例えば、混合または中性グリセリド）が
使用され得る。界面活性剤は、組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは
、０．２５〜５重量％を構成し得る。組成物の残りは、通常、噴霧剤である。キ
ャリアはまた、望ましいならば、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンとともに
含まれ得る。
【０２２６】 （ＩＶ．Ｍ．キット） 本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与のための指示書とともに
キットの形態で提供され得る。代表的なキットは、容器内に、好ましくは、単位
用量形態の所望のペプチド組成物および投与のための指示書を含む。代替的なキ
ットは、投与のための指示書とともに、容器内に、好ましくは単位用量形態で、
本発明の所望の核酸を伴なうミニ遺伝子構築物を含む。ＩＬ−２またはＩＬ−１
２のようなリンホカインもまた、キットに含まれ得る。所望であり得る他のキッ
ト構成要素には、例えば、滅菌シリンジ、ブースター投薬、および他の所望の賦
形剤が挙げられる。
【０２２７】 （要旨） 本発明に従うエピトープは、免疫応答を誘導するために首尾良く使用された。
これらのエピトープを用いる免疫応答は、種々の形態においてエピトープを投与
することによって導入された。エピトープは、ペプチドとして、核酸として、そ
して本発明のエピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターとして投与さ
れた。ペプチドに基づくエピトープ形態の投与において、免疫応答は、エピトー
プを細胞で発現される空のＨＬＡ分子上に直接負荷することによって、そしてエ
ピトープのインターナリゼーションを介して、そしてＨＬＡ Ｉ型経路を介して
プロセスすることによって導入された；いずれの場合においても、エピトープを
発現するＨＬＡ分子は、次いで、相互作用し得、そしてＣＴＬ応答を誘導し得た
。ペプチドは、直接的に、またはリポソームのような薬剤を使用して送達され得
る。これらは、さらに、弾道的送達（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）
（ここで、ペプチドは、代表的には、結晶形態である）を使用して送達され得る
。ＤＮＡが免疫応答を誘導するために使用される場合、裸のＤＮＡとして（一般
的に、約１〜５ｍｇの投薬範囲）または銃式「遺伝子銃」送達を介して（代表的
に、約１０〜１００μｇの投薬範囲）のいずれかで投与される。ＤＮＡは、種々
のコンホメーション（例えば、線状、環状など）で送達され得る。種々のウイル
スベクターもまた、本発明に従ってエピトープをコードする核酸を含んで首尾良
く使用されている。
【０２２８】 従って、本発明に従う組成物は、いくつかの形態で存在する。本発明に従うこ
れらの組成物形態のそれぞれの実施形態は、免疫応答を誘導するために首尾良く
使用されている。
【０２２９】 本発明に従う１つの組成物は、複数のペプチドを含む。この複数またはカクテ
ルのペプチドは、一般的に、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と混合される
。ペプチドカクテルは、同じペプチドの複数のコピーを含み得るか、またはペプ
チドの混合物を含み得る。ペプチドは、天然のエピトープのアナログであり得る
。ペプチドは、人工のアミノ酸および／または化学的改変（例えば、脂質化；ア
セチル化、グリコシル化、ビオチニル化、リン酸化のような表面活性分子の添加
）を含み得る。ペプチドは、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープであり得る。好まし
い実施形態において、ペプチドカクテルは、複数の異なるＣＴＬエピトープおよ
び少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含む。ＨＴＬエピトープは、天然または
非天然（例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ．，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であり得る。本発明の実施形態における異なるエピトー
プの数は、一般的に、１〜１５０の整数（ｗｈｏｌｅ ｕｎｉｔ ｉｎｔｅｇｅ
ｒ）である（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４
、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６
、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８
、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０
、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２
、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４
、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６
、９７、９８、９９、１００、または１５０）。
【０２３０】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、ポリペプチド多重エピトープ性構
築物（すなわち、ポリエピトープペプチド）を含む。本発明に従うポリエピトー
プペプチドは、当該分野において周知の技術の使用によって調製される。これら
の公知の技術の使用によって、本発明に従うエピトープは、互いに接続される。
ポリエピトープペプチドは、線状または非線状（例えば、多価）であり得る。こ
れらのポリエピトープ構築物は、人工アミノ酸、スペーシングまたはスペーサー
アミノ酸、隣接アミノ酸、または隣接エピトープ間の化学改変を含み得る。ポリ
エピトープ構築物は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーであり得る。ポリエピ
トープ構築物は、一般的に、２〜１５０の間の任意の整数の量（例えば、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９
、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１
、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３
、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５
、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７
、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９
、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、ま
たは１５０）でエピトープを含む。ポリエピトープ構築物は、ＣＴＬおよび／ま
たはＨＴＬエピトープを含み得る。構築物中の１つ以上のエピトープは、例えば
、表面活性物質（例えば、脂質）の付加によって改変され得るか、または化学的
に改変され得る（例えば、アセチル化など）。さらに、多重エピトープ性構築物
における結合は、ペプチド結合以外（例えば、共有結合、エステルまたはエーテ
ル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合など）であり得る。
【０２３１】 あるいは、本発明に従う組成物は、ネイティブな配列に対する相同性を有する
（すなわち、対応するかまたは接触する）アミノ酸の系列、配列、ストレッチ（
ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む構築物を含む。このアミノ酸のストレッチは、より長い
系列のアミノ酸から切断されるかまたは単離される場合、本発明に従って、ＨＬ
Ａ Ｉ型エピトープまたはＨＬＡ ＩＩ型エピトープとして機能するアミノ酸の
少なくとも１つのサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。この実施形態に
おいて、ペプチド配列は、当該分野で公知であるかまたは提供される多数の技術
を使用することによって、本明細書中に規定されるような構築物になるように改
変される。ポリエピトープ構築物は、７０〜１００％（例えば、７０、７１、７
２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８
４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９
６、９７、９８、９９、または１００％）の任意の整数の増分でネイティブな配
列に対して相同性を含み得る。
【０２３２】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明に従う１つ以上のエピトー
プを含む抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、「専門的」抗原提示細胞（例え
ば、樹状細胞）であり得る。抗原提示細胞は、当該分野において公知の任意の手
段または当該分野において決定された任意の手段によって本発明のエピトープを
含み得る。このような手段には、樹状細胞を１つ以上の個々のエピトープまたは
複数のエピトープを含む１つ以上のペプチドで、銃式核酸送達のような核酸投与
によって、または核酸の投与について当該分野の他の技術（ベクターに基づく（
例えば、ウイルスベクター）核酸の送達を含む）によって適用することを含む。
【０２３３】 本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明の１つ以上のペプチドをコ
ードする核酸、または本発明に従うポリエピトープペプチドをコードする核酸を
含む。当業者によって理解されるように、種々の核酸組成物が、遺伝子コードの
重複性に起因して同じペプチドをコードする。これらの核酸組成物のそれぞれは
、本発明の範囲内に含まれる。本発明のこの実施形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡを
含み、特定の実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせを含む。本発
明に従うペプチドをコードする核酸を含む任意の組成物または本発明に従う任意
の他のペプチドに基づく組成物が、本発明の範囲内であることが理解される。
【０２３４】 本発明のペプチドに基づく形態（ならびに、これらをコードする核酸）が、当
該分野で既に公知であるかまたは公知になる原理を使用して作製される、本発明
のエピトープのアナログを含み得ることが理解される。アナログ化に関する原理
は、現在、当該分野において公知であり、本明細書中に開示される；さらに、ア
ナログ化原理（ヘテロクリティックアナログ化）が、１９９９年１月６日に出願
された同時係属出願シリアル番号Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第０９／２２６，７７５号に
開示される。一般的に、本発明の組成物は、単離されているかまたは精製されて
いる。
【０２３５】 本発明を、特定の実施例によってより詳細に記載する。以下の実施例は、例示
の目的のために提供され、そして任意の様式においても本発明を制限することを
意図しない。当業者は、本発明に従って代替の実施形態を得るために変化または
改変され得る重要でない種々のパラメータを容易に認識する。
【０２３６】 （Ｖ．実施例） 以下の実施例は、ワクチン組成物に含ませるための免疫原性クラスＩおよびク
ラスＩＩペプチドエピトープの同定、選択、および使用を例示する。
【０２３７】 （実施例１．ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合アッセイ） ＨＬＡに結合するペプチドの以下の例は、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩペ
プチドの結合親和性の定量化を示す。結合アッセイは、モチーフを保有するかま
たはモチーフを保有しないペプチドを用いて実施され得る。
【０２３８】 細胞溶解物を調製し、そしてＨＬＡ分子を開示されたプロトコールに従って精
製した（Ｓｉｄｎｅｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ １８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙ，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５４：２４７（１９９５）；Ｓｅｔｔｅ，ら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．３１：８１３（１９９４））。ＨＬＡ分子の供給源として使用される細胞株
（表ＸＸＩＶ）および細胞溶解物からのＨＬＡ分子の抽出のために使用される抗
体もまた、これらの刊行物に記載される。
【０２３９】 Ｅｐｓｔｅｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）−形質転換されたホモ接合性細部
株、線維芽細胞、ＣＩＲまたは７２１．２２１−形質転換体を、ＨＬＡクラスＩ
分子の供給源として使用した。これらの細胞を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩ
ＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、５０μＭ ２−ＭＥ、１００μｇ
／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１０％熱非働化ＦＣＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で
培養した。
【０２４０】 細胞溶解物を、以下のように調製した。簡潔には、細胞を、１％ Ｎｏｎｉｄ
ｅｔ Ｐ−４０（Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚ
ｅｒｌａｎｄ）、１５０ｍＭ ＮａＣＩ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および２ｍＭ Ｐ
ＭＳＦを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ ８．５中に、１０8細胞／ｍ
ｌの濃度で溶解した。溶解物は、壊死組織片および核を、１５，０００×ｇで３
０分間の遠心分離によって取り除かれた。
【０２４１】 ＨＬＡ分子をアフィニティクロマトグラフィーによって溶解物から精製した。
溶解物を不活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４−ＢおよびプロテインＡ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅの２つのプレカラムに通過させた。次いで、溶解物を、適切な抗体
に結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４−Ｂビーズのカラムに通過させた。抗Ｈ
ＬＡカラムを、１％ＮＰ−４０、ＰＢＳ、２−カラム容量のＰＢＳ、および２カ
ラム容量のＰＢＳ（０．４％ｎ−オクチルグルコシドを含む）中の１０カラム容
量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ ８．０で洗浄した。最後に、ＭＨＣ分
子を、０．４％ｎ−オクチルグルコシドを含む０．１５ｍＭ ＮａＣｌ中の５０
ｍＭジエチルアミン、ｐＨ １１．５で溶出した。１／２５容量の２．０Ｍ Ｔ
ｒｉｓ、ｐＨ ６．８を溶出液に添加し、ｐＨを約８．０に減少させた。次いで
、溶出液をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ
，ＭＡ）における２０００ｒｐｍでの遠心分離によって濃縮した。タンパク質含
量を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって評価し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確
認した。
【０２４２】 クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣへのペプチドの結合を測定するために使用
されるプロトコールの詳細な記述が公開されている（Ｓｅｔｔｅら，Ｍｏｌ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３，１９９４；Ｓｉｄｎｅｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，編，Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１８．３節，１９９８
）。簡潔には、精製されたＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）は、プロテアーゼイン
ヒビターカクテルの存在下で、種々の非標識ペプチドインヒビターおよび１〜１
０ｎＭ 125Ｉ放射標識プローブペプチドと共に、０．０５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ
Ｐ−４０（ＮＰ４０）（またはＨ−２ ＩＡアッセイのための２０％ ｗ／ｖ
ジギトニン）を含むＰＢＳにおいて４８時間インキュベートした。プロテアーゼ
インヒビター（各々は、ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡから得
た）の最終濃度は、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１．３ｎＭ １．１０フェナントロリン
、７３μＭペプスタチンＡ、８ｍＭ ＥＤＴＡ、６ｍＭＮ−エチルマレイミド（
クラスＩＩアッセイについて）、そして２００μＭ Ｎα−ｐ−トシル−Ｌ−リ
ジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）であった。全てのアッセイを、ＤＲＢ１*
０３０１（これは、ｐＨ ４．５で実施した）ならびにＤＲＢ１*１６０１（Ｄ
Ｒ２ｗ２１β1）およびＤＲＢ４*０１０１（ＤＲｗ５３）（これらは、ｐＨ ５
．０で実施した）を除いてｐＨ ７．０で実施した。ｐＨを、他に記載されるよ
うに調節した（Ｓｉｄｎｅｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１８．３節，１９９８を参照のこと）。
【０２４３】 インキュベーションに続いて、ＭＨＣ−ペプチド複合体を、遊離ペプチドから
、７．８ｍｍ×１５ｃｍ ＴＳＫ２００カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ １６２１５
，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）上でのゲル濾過によって分離し、そ
して０．５％ ＮＰ４０および０．１％ ＮａＮ3を含むＰＢＳ ｐＨ ６．５
を用いて、１．２ｍｌ／分で溶出した。ＤＲＢ１*１５０１（Ｄｒ２ｗ２β1）ア
ッセイに使用される大きなサイズの放射標識されたペプチドが未結合ピークから
の結合ピークの分離を、これらの条件下でより困難にしているので、全てのＤＲ
Ｂ１*１５０１（ＤＲ２ｗ２β1）アッセイを、０．６ｍｌ／分で溶出する７．８
ｍｍ×３０ｃｍ ＴＳＫ２０００カラムを使用して実施した。ＴＳＫカラムから
の溶出液を、Ｂｅｃｋｍａｎ １７０放射性同位体検出器を通過させ、そして放
射能を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ３３９６Ａ積分器を使用して、プロ
ットおよび積分し、そして結合したペプチドの画分を決定した。
【０２４４】 放射標識ペプチドを、クロラミン−Ｔ方法を使用しヨウ素化した。各アッセイ
において使用される代表的な放射標識プローブペプチド、およびそのアッセイ特
異的なＩＣ50 ｎＭを、表ＩＶおよびＶに要約する。代表的に、予備実験におい
て、各ＭＨＣ調製物を、全放射能の１０〜２０％を結合するに必要とされるＨＬ
Ａの濃度を決定するために、固定量の放射標識ペプチドの存在下で滴定した。全
ての引く続く阻害および直接結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃度を用いて実施
した。
【０２４５】 ［標識］＜［ＨＬＡ］およびＩＣ50≧［ＨＬＡ］のこれらの条件下で、測定さ
れたＩＣ50値は、真のＫD値の適切な近似である。ペプチドインヒビターは、代
表的に、１２０μｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験され、そして
２〜４の完全に独立した実験において試験される。異なる実験から得られてたデ
ータの比較を可能にするために、相対的な結合の数値が、各々の試験されたペプ
チド（代表的に、放射標識されたプローブペプチドの標識されていなバージョン
）についてのＩＣ50で、阻害についての陽性コントロールのＩＣ50を割ることに
よって、各ペプチドについて計算した。実験間比較のために、相対的な結合値を
編集する。これらの値は、続いて、目的の相対的な結合によって、阻害について
の陽性コントロールのＩＣ50 ｎＭを割ることによってＩＣ50ｎＭ値に変換し得
る。このデータの編集方法は、異なる日、または精製されたＭＨＣの異なるロッ
トで試験されたペプチドを比較するために、最も正確でかつ一貫していることが
証明された。
【０２４６】 ＨＬＡ−ＤＲ精製（ＬＢ３．１）のために使用される抗体は、α−鎖特異的で
あるために、β1分子は、β3（および／またはβ4およびβ5）分子から分離され
ない。結合アッセイのβ1特異性は、ＤＲＢ１*０１０１（ＤＲ１）、ＤＲＢ１*
０８０２（ＤＲ８ｗ２）およびＤＲＢ１*０８０３（ＤＲ８ｗ３）の場合に明ら
かであり、ここで、β3は、発現されない。これはまた、ＤＲＢ１*０３０１（Ｄ
Ｒ３）およびＤＲＢ３*０１０１（ＤＲ５２ａ）、ＤＲＢ１*０４０１（ＤＲ４ｗ
４）、ＤＲＢ１*０４０４（ＤＲ４ｗ１４）、ＤＲＢ１*０４０５（ＤＲ４ｗ１５
）、ＤＲＢ１*１１０１（ＤＲ５）、ＤＲＢ１*１２０１（ＤＲ５ｗ１２）、ＤＲ
Ｂ１*１３０２（ＤＲ６ｗｌ９）ならびにＤＲＢ１*０７０１（ＤＲ７）について
も立証されている。ＤＲＢ１*１５０１（ＤＲ２ｗ２β1）、ＤＲＢ５*０１０１
（ＤＲ２ｗ２β2）、ＤＲＢ１*１６０１（ＤＲ２ｗ２１β1）、ＤＲＢ５*０２０
１（ＤＲ５１Ｄｗ２１）およびＤＲＢ４*０１０１（ＤＲｗ５３）アッセイにつ
いてのβ鎖特異性の問題は、線維芽細胞の使用によって回避される。ＤＲβ分子
特異性に関するアッセイの開発および確証は、以前に記載されている（例えば、
Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１
９９８を参照のこと）。
【０２４７】 上に概説された結合アッセイは、例えば、実施例２に記載されるようなスーパ
ーモチーフおよび／またはモチーフを保有するエピトープを分析するために使用
され得る。
【０２４８】 （実施例２．ＨＬＡスーパーモチーフおよびモチーフを保有するＣＴＬ候補エ
ピトープの同定）。
【０２４９】 本発明のワクチン組成物は、広範な集団適用範囲を達成するための、複数のＨ
ＬＡすスーパーモチーフまたはモチーフを含む複数のエピトープを含み得る。こ
の実施例は、このようなワクチン組成物に含ませるためのスーパーモチーフおよ
びモチーフを保有するエピトープの同定を例示する。集団適用範囲の計算を、以
下に記述されるストラテジーを用いて実施した。
【０２５０】 （スーパーモチーフおよび／またはモチーフを保有するエピトープの同定のた
めのコンピュータ検索およびアルゴリズム） 実施例２および５において、モチーフ保有ペプチド配列を同定するために実施
される検索は、１９９４ Ｌｏｓ Ａｌｍａｏｓデータベースにおいて入手可能
であったＨＩＶ−１クレードＢウイルス株からのタンパク質配列データを使用し
た。
【０２５１】 エピトープを保有するＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩのスーパーモチーフま
たはモチーフについてのコンピュータ検索は、以下のように実施された。全ての
翻訳されたＨＩＶタンパク質配列を、テキスト記号検索（ｔｅｘｔ ｓｔｒｉｎ
ｇ ｓｅａｒｃｈ）ソフトウェアプログラム（例えば、ＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ
１．４（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓｎａ Ｄｉｅｇｏ））を使用して分析して、適切
なＨＬＡ結合モチーフを含む潜在ペプチド配列を同定した；代替のプログラムは
、明細書中でのモチーフ／スーパーモチーフの開示の観点から、当該分野の情報
に従って容易に生成される。さらに、このような計算は、頭の中で行われ得る。
同定されたＡ２スーパーモチーフ配列、Ａ３スーパーモチーフ配列およびＤＲス
ーパーモチーフ配列を、特定のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する
それらの能力を予測するための多項式アルゴリズムを使用してスコア付けした。
これらの多項式アルゴリズムは、伸長したモチーフおよび精製されたモチーフの
両方を考慮し（すなわち、異なる位置で異なるアミノ酸の影響を考慮すること）
、そしてペプチド−ＨＬＡ分子相互作用の全親和性（つまり、ΔＧ）が以下の型
の線形多項式関数として近似され得るという事実に本質的に基づく：
【０２５２】
【化７】
【０２５３】 ここで、ａjiは、ｎ個のアミノ酸のペプチドの配列に沿った所定の位置（ｉ）で
の所定のアミノ酸（ｊ）の存在の効果を表す係数である。この方法の重要な仮定
は、各位置での効果が、本質的に互いに独立である（すなわち、個々の側鎖の独
立な結合）ことである。残基ｊが、ペプチドの位置ｉに生じる場合、一定の量の
ｊiがペプチドの残りの配列に関わらず、このペプチドの結合の自由エネルギー
に寄与することを仮定する。この仮定は、ペプチドが、実質的に伸びたコンホメ
ーションで、ＭＨＣに結合し、そしてＴ細胞によって認識されるということを立
証した本発明者らの研究室からの研究によって証明される（本明細書においてデ
ータは省略した）。
【０２５４】 特定のアルゴリズム係数の導出方法は、Ｇｕｌｕｋｏｔａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２６７：１２５８−１２６，１９９７に記載されている；（Ｓｉｄｎｅ
ｙら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６；およびＳｏ
ｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１９９
８をまた、参照のこと）。簡潔には、全てのｉ位置について、アンカーおよび非
アンカーと同様に、ｊを保有する全てのペプチドの平均相対結合（ＡＲＢ）の幾
何平均は、群の残りに対して計算され、そしてｊiの推定値として使用される。
クラスＩＩペプチドについて、複数の整列が可能である場合、最も高いスコアの
配列のみが使用され、反復手順に続く。試験セットにおける所定のペプチドのア
ルゴリズムスコアを計算するために、ペプチドの配列に対応するＡＲＢ値が、掛
け算される。この積が、選択された閾値を超えた場合、このペプチドは、結合す
ると予測される。適切な閾値は、所望の予測の厳密さの程度の関数として選択さ
れる。
【０２５５】 （ＨＬＡ−２スーパータイプ交差反応性ペプチドの選択） ９つのＨＩＶ構造的タンパク質および調節タンパク質からの完全なタンパク質
配列が、モチーフ同定ソフトウェアを使用して、整列され、次いでスキャンされ
て、ＨＬＡ−Ａ２−スパーモチーフ一次アンカー特異性を含む保存された９マー
および１０マー配列を同定した。この分析は、１９９４ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ
データベースにおける全ての単離物を含む。保存基準は、抗原に従って変化した
：ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖについてはクレードＢ単離物の８０％より大きい；ｎ
ｅｆ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒについては７０％より大きい；ｖｐｕについては
６０％より大きい。
【０２５６】 総計２３３の保存されたＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフー陽性配列を同定した
。次いで、これらの配列に対応するペプチドを合成し、そしてインビトロで精製
したＨＬＡ−Ａ*０２０１分子を結合するそれらの能力について試験した（ＨＬ
Ａ−Ａ*０２０１は、原型のＡ２スーパータイプ分子であると考えられる）。３
０のペプチドが、≦５００ｎＭのＩＣ50値で結合した；３０のうちの５個は、高
い結合親和性（ＩＣ50値≦５０ｎＭ）を有し、そして２５個は、中程度の結合親
和性（５０〜５００ｎＭの範囲）を有した（表ＸＸＶＩＩ）。
【０２５７】 ３０のＡ*０２０１結合ペプチドを、続いて、さらなるＡ２スーパータイプ分
子（Ａ*０２０２、Ａ*０２０３、Ａ*０２０６およびＡ*６８０２）に結合する能
力について試験した。表ＸＸＶＩＩに示されるように、３０のペプチドのうちの
２０は、試験された５つのＡ２−スーパータイプ対立遺伝子の少なくとも３つを
結合するＡ２スパータイプ交差反応性バインダーであることが見出された。
【０２５８】 （ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープの選択） 上記でスキャンされたＨＩＶタンパク質配列をまた、ＨＬＡ−Ａ３スパーモチ
ーフ一次（ｐｒｉｍａｒｙ）アンカーを有するペプチドの存在について試験した
。総計３５３個の保存された９マーまたは１０マーモチーフ含有配列を同定した
。対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ａ*０３０１およびＨＬＡ−Ａ*１
１０１分子（２つの最も一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子）への結合につ
いて試験した。６６のペプチドが、２つの対立遺伝子のうちの１つに、≦５００
ｎＭの結合親和性で結合することが見出された（表ＸＸＶＩＩＩ）。これらのペ
プチドを、次いで、他の一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子（Ａ*３１０１
、Ａ*３３０１、およびＡ*６８０１）への結合交差反応性について試験した。２
１個のペプチドが、試験された５個のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ分子のうちの
少なくとも３個に結合した（表ＸＸＶＩＩＩ）。表ＸＸＶＩＩＩはまた、上に概
略された検索基準を使用して選択されなかったが、Ａ３スーパータイプ交差反応
性バインダーであることが示されている２つの１１マーペプチドを含む。
【０２５９】 （ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープの選択） 同じＨＩＶ標的抗原タンパク質配列をまた、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフを
有する保存された９マーまたは１０マーの存在について分析する場合、５４の配
列が同定された。対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ｂ*０７０２（も
最も一般的なＢ７スーパータイプ対立遺伝子（すなわち、原型のＢ７スーパータ
イプ対立遺伝子））への結合について試験した。１６のペプチドは、Ｂ*０７０
２に、≦５００ｎＭのＩＣ50で結合した（表ＸＸＩＸ）。次いで、これらのペプ
チドを、他の一般的なＢ７スーパータイプ分子（Ｂ*３５０１、Ｂ*５１０１、Ｂ * ５３０１およびＢ*５４０１）への結合について試験した。表ＸＸＩＸに示され
るように、１６のペプチドのうちの８が、試験された５個のＢ７スーパータイプ
対立遺伝子の３つ以上に結合し得た。
【０２６０】 （Ａ１およびＡ２４モチーフ保有エピトープの選択） 集団適用範囲をさらに増加させるために、ＨＬＡ−Ａ１エピトープおよびＨＬ
Ａ−Ａ２４エピトープを、ワクチン構築物に組み込み得る。上で利用されたＨＩ
Ｖ標的抗原からのタンパク質配列データの分析をまた、保存配列を含むＨＬＡ−
Ａ１−およびＡ２４−モチーフを同定するために実施する。
【０２６１】 ５の保存されたＨＩＶ誘導ペプチドが同定され、これらのペプチドは、Ａ*０
１０１に、５００ｎＭ以下のＩＣ50で結合する（表ＸＸＸ）。１１の保存された
ＨＬＡ−Ａ*２４０２結合ＨＩＶ誘導ペプチドをまた同定し、これらのうちの５
つは、１００ｎＭ以下のＩＣ50で結合した（表ＸＸＸＩ）。
【０２６２】 （実施例３．免疫原性の確認） （Ａ*０２０１免疫原性の評価） Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスにおいて誘導されたＣＴＬは、ヒ
ト系で誘導されたＣＴＬに類似する特異性を示すことが示されている（例えば、
Ｖｉｔｉｅｌｌｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７−１０１５，１９
９１；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７−１０
１，１９９６を参照のこと）。従って、これらのマウスは、上の実施例２に同定
された２０のＡ２スーパータイプ交差反応性ペプチドの免疫原性を評価するため
に使用した。
【０２６３】 ペプチド免疫に続く、トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ誘導が記述さ
れている（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７−１０
１５，１９９１；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５
３−４７６１，１９９７）。これらの研究において、マウスに、過剰のＩＡb拘
束ヘルパーペプチド（１４０μｌ／マウス）の存在下でＩＦＡに乳化された各ペ
プチド（５０μｌ／マウス）を用いて、尻尾の根元に皮下注射した（ＨＢＶコア
１２８〜１４０、Ｓｅｔｔｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−５５
９２，１９９４）。注射の１１日後、脾細胞をペプチド負荷同系ＬＰＳ芽細胞（
ｂｌａｓｔ）の存在下でインキュベートした。６日後、培養物を、ペプチドパル
ス標的を使用して細胞傷害活性についてアッセイした。表ＸＸＸＩＩに要約され
たデータは、８つのペプチドがＡ*０２０１／Ｋbトランスジェジェニックマウス
において初期ＣＴＬ応答を誘導し得たことを示す。（これらの研究について、ペ
プチドは、それがＣＴＬを誘導する場合、陽性であると考えられた（少なくとも
２つのトランスジェニック動物において、Ｌ．Ｕ．３０／１０6細胞≧２（Ｗｅ
ｎｔｗｏｒｔｈら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７−１０１，１９９
６）））。
【０２６４】 交差反応性候補ＣＴＬエピトープをまた、リコール（ｒｅｃａｌｌ）ＣＴＬＣ
ＴＬ応答ＨＩＶ感染患者を刺激する能力について試験した。簡潔には、ＨＩＶに
感染した患者からのＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍｌの合成ペプチドの存在下で培養
した。７日目および１４日目の後に、培養物をペプチドで再刺激した。この培養
物を、２１日目に、51Ｃｒ放出アッセイにおける特定のペプチドでパルスされた
標的細胞を使用して、細胞溶解活性についてアッセイした。これらのデータをま
た、表ＸＸＸＩＩに要約する。示されるように、分析した１９のペプチドのうち
の１５は、ＨＩＶ感染患者からのＰＢＭＣを使用してリコールＣＴＬ応答におい
て認識された。
【０２６５】 免疫原性に関してスクリーニングされるペプチドのセットは、２つの過剰なペ
プチド、１２６１．１４および１２６１．０４（これらは単一アミノ酸で長さが
異なる）を含んだ。両方のペプチドは、スーパータイプの縮重結合を示すが、２
つのペプチドのうちの短いもののみが、免疫原性を示した。試験されなかった１
つのスーパータイプペプチド（１２１１．０９）は、ＨＩＶ感染患者から単離さ
れたＣＴＬ株によって認識されることが報告された。要約すると、ヒトにおいて
免疫原性である１６個のＡ２−スーパータイプ交差反応性ペプチドが、同定され
；これらのペプチドのうちの５３％はまた、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマ
ウスにおいて認識される。１６個のペプチドは、５つのＨＩＶ抗原由来のエピト
ープを提示する：ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｐｒ、およびｎｅｆ。
【０２６６】 （Ａ*０３／Ａ１１免疫原性の評価） 上記実施例２で同定されたＡ３−スーパータイプ交差反応性ペプチドのうちの
２１個を、免疫原性に関して評価した（表ＸＸＸＩＩＩ）。ペプチドをＨＬＡ−
Ａ１１／Ｋbトランスジェニックマウスを用いて、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニ
ックマウスに関して上記のプロトコールを用いて（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３−４７６１、１９９７）およびＨＩＶ感染患
者から得られたＰＢＭＣを用いてスクリーニングし、ＣＴＬリコール応答を刺激
するための能力に関して試験した。ＨＬＡ−Ａ１１トランスジェニックマウスに
おいてＣＴＬを誘導し得た１０個のペプチドを同定した。
【０２６７】 ３個のペプチド９６６．０１、９４０．０３、および１０６９．４７は、ＨＩ
Ｖ感染患者において免疫原性であることが共同研究者によって示された。ペプチ
ド９６６．０１および１０６９．４７はまた、トランスジェニックマウスにおい
てＣＴＬ応答を誘導し、ペプチド９４０．０３は、患者のみにおいて免疫原性を
示した。
【０２６８】 要約すると、２３個のＡ３−スーパータイプ交差反応性結合ペプチドのうちの
１１個が、ＨＬＡ−Ａ１１トランスジェニックマウスまたはＨＩＶ感染患者のい
ずれかにおいて免疫原性であることが見出された。これらのペプチドは、３つの
ＨＩＶ抗原由来のエピトープを提示する：ｐｏｌ、ｅｎｖ、およびｎｅｆ。
【０２６９】 （Ｂ７免疫原性の評価） 実施例２で同定されたＢ７−スーパータイプ交差反応性結合ペプチドの免疫原
性スクリーニングを使用して、ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスおよびＨ
ＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣを用いて、Ａ２−スーパーモチーフ保有ペプチドお
よびＡ３−スーパーモチーフ保有ペプチドの評価と類似の様式で免疫原性を評価
する。これらのペプチドのうちの３つは、ＨＩＶ感染患者において免疫原性であ
ると報告されている。
【０２７０】 （実施例４．アナログを作製することによるネイティブなエピトープの結合能
力を改善するための、拡大されたスーパーモチーフの実行） ＨＬＡモチーフおよびＨＬＡスーパーモチーフ（第１の残基および／または第
２の残基を含む）は、本明細書中に実証されるように、高度に交差反応性のネイ
ティブなペプチドの同定および調製において有用である。さらに、ＨＬＡモチー
フおよびＨＬＡスーパーモチーフの定義はまた、アナログ化され得るかあるいは
ペプチドに特定の特徴（例えば、スーパータイプを含むＨＬＡ分子の群内でのよ
り大きな交差反応性、および／またはこれらのＨＬＡ分子のうちのいくらかもし
くは全てに対するより大きな結合親和性）を与えるために「固定化」され得るネ
イティブなペプチド配列内の残基を同定することによって、高度に交差反応性の
エピトープを操作することを可能にする。調節された結合親和性を示すアナログ
ペプチドの例を、本実施例に示す。
【０２７１】 （一次アンカー残基におけるアナログ化（ａｎａｌｏｇｉｎｇ）） 実施例２に示されるように、２０個のＨＩＶ由来のＡ２−スーパータイプ拘束
エピトープを同定した。ペプチド操作戦略を実行して、試験されたＡ２スーパー
タイプ対立遺伝子の３／５を結合する上記で同定された候補エピトープの交差反
応性をさらに増加する。開示されたデータ（例えば、関連かつ同時係属中のＵ．
Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２２６，７７５）に基づいて、Ａ２−スーパーモチーフ保有
ペプチドの主要なアンカーを、例えば、好ましくは２位にＬ、Ｉ、Ｖ、もしくは
Ｍを、およびＣ末端にＩもしくはＶを導入するために変更する。
【０２７２】 アナログペプチドの交差反応性を分析するために、各操作されたアナログを、
原型Ａ２スーパータイプ対立遺伝子Ａ*０２０１への結合に関して最初に試験し
て、次いで、Ａ*０２０１結合能力が維持される場合、Ａ２スーパータイプ交差
反応性に関して試験した。
【０２７３】 あるいは、ペプチドを、１つもしくは全てのスーパータイプメンバーへの結合
に関して試験し得、次いで、アナログ化して、集団の適用範囲を付加するために
いずれか１つ（またはより多く）のスーパータイプメンバーへの結合親和性を調
節する。
【０２７４】 同様に、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープのアナログをまた操作
する。例えば、Ａ３−スーパータイプ分子のうちの３／５へのペプチド結合を、
２位に好ましい残基（Ｖ、Ｓ、Ｍ、またはＡ）を保有するために一次アンカー残
基において操作し得る。
【０２７５】 次いで、アナログペプチドを、Ａ*０３およびＡ*１１（原型Ａ３スーパータイ
プ対立遺伝子）を結合する能力に関して試験する。次いで、代表的に、５００ｎ
Ｍ以下の結合能力を示すペプチドを、Ａ３−スーパータイプ交差反応性に関して
試験する。
【０２７６】 Ａ２モチーフ保有ペプチドおよびＡ３モチーフ保有ペプチドと同様に、Ｂ７ス
ーパーモチーフ保有ペプチドをまたアナログ化（ａｎａｌｏｇｕｅ）する。例え
ば、３以上のＢ７−スーパータイプ対立遺伝子を結合するペプチドを、増加した
交差反応性結合を達成するために調節する。Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチド
は、例えば、Ｓｉｄｎｅｙら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９
０、１９９６）によって示されるように、Ｃ末端の一次アンカー位置に好ましい
残基（Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＦ）を保有するために操作され得る。
【０２７７】 （二次アンカー残基におけるアナログ化） ＨＬＡモチーフおよびＨＬＡスーパーモチーフに関して規定される２次アンカ
ー残基をまた、改変された結合活性、代表的には増加した交差反応性結合および
／または増加した親和性を有するペプチドを操作するために使用する。例えば、
１位に控えめな単一アミノ酸置換を提示するＢ７スーパーモチーフ保有ペプチド
の結合能力を分析する。例えば、ペプチド１２６１．０１（表ＸＸＩＸ）のよう
なペプチドを、１位においてＦの代わりにＬを置換するためにアナログ化し得、
続いて、改変された結合活性（例えば、増加した結合親和性および／または増加
した交差反応性）に関して評価し得る。この手順は、改変された結合特性を有す
るアナログ化ペプチドを同定する。
【０２７８】 改善された結合能力または交差反応性を有する操作されたアナログを、例えば
、ＩＦＡ免疫またはリポペプチド免疫の後に、ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニック
マウスにおいて免疫原性に関して試験する。アナログ化ペプチドを、代表的に、
ＨＩＶ感染患者由来のＰＢＭＣを用いてリコール応答を刺激する能力に関してさ
らに試験する。
【０２７９】 従って、たった１つのアミノ酸置換の使用によって、ＨＬＡスーパータイプ分
子に対するペプチドリガンドの結合親和性および／または交差反応性を増加する
ことは可能である。
【０２８０】 （実施例５．ＨＬＡ−ＤＲ結合モチーフを有するＨＩＶ由来配列の同定） ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩモチーフを保有す
るペプチドエピトープは、実施例１〜３に記載される方法論と同様の方法論を用
いて以下に概説されるように同定される。
【０２８１】 （ＨＬＡ−ＤＲ−スーパーモチーフ保有エピトープの選択） ＨＩＶ由来のＨＬＡクラスＩＩ ＨＴＬエピトープを同定するために、ＨＬＡ
クラスＩスーパーモチーフ／モチーフ配列の同定のために使用された同じＨＩＶ
抗原由来のタンパク質配列を、ＨＬＡ−ＤＲ−モチーフまたはＨＬＡ−ＤＲ−ス
ーパーモチーフを保有する配列の存在に関して分析した。詳細には、ＤＲ−スー
パーモチーフを含む１５マーの配列（９マーのコア、ならびにＮ末端およびＣ末
端の隣接領域に３つの残基をさらに含む（全部で１５アミノ酸））を選択した。
【０２８２】 ＤＲ分子へのペプチド結合を推定するためのプロトコールは、開発されている
（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３、
１９９８）。個々のＤＲ分子に特異的なこれらのプロトコールは、９マーコア領
域のスコア付けおよび格付けを可能にする。各プロトコールは、９マーコア内の
ＤＲ−スーパーモチーフ一次アンカーの存在に関してペプチド配列をスコア付け
する（すなわち、１位および６位において）のみでなく、二次アンカーの存在に
関して配列をさらに評価する。対立遺伝子特異的選択表（例えば、Ｓｏｕｔｈｗ
ｏｏｄら、同書を参照のこと）を用いて、これらのプロトコールが、特定のＤＲ
分子を結合する高い可能性を有するペプチド配列を効率的に選択することが見出
されている。さらに、これらのプロトコールを連繋して実施すること（詳細には
、ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、およびＤＲ７に関するもの）が、効率的にＤＲ交差反応
性ペプチドを選択し得ることが見出されている。
【０２８３】 上記で同定されたＨＩＶ由来のペプチドを、種々の一般的なＨＬＡ−ＤＲ分子
に対するその結合能力に関して試験した。全てのペプチドを、一次パネルにおい
てＤＲ分子（ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、およびＤＲ７）への結合に関して最初に試験
した。次いで、これら３個のＤＲ分子のうちの少なくとも２個に結合するペプチ
ドを、２次アッセイにおいてＤＲ２ｗ２ β１分子、ＤＲ２ｗ２ β２分子、Ｄ
Ｒ６ｗ１９分子、およびＤＲ９分子への結合に関して試験した。最後に、４個の
二次パネルのＤＲ分子のうちの少なくとも２個（従って、蓄積的に７個の異なる
ＤＲ分子のうちの少なくとも４個）に結合するペプチドを、３次アッセイにおい
てＤＲ４ｗ１５分子、ＤＲ５ｗ１１分子、およびＤＲ８ｗ２分子への結合に関し
てスクリーニングした。１次、２次および３次スクリーニングアッセイを含む１
０個のＤＲ分子のうちの少なくとも７個を結合するペプチドを、交差反応性ＤＲ
結合因子とみなした。これらのスクリーニングパネルの組成物および関連抗原の
表現型頻度を、表ＸＸＸＩＶに示す。
【０２８４】 １３個のＨＩＶ由来ペプチドが、１０個の一般的なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子の
うちの少なくとも７個に結合することを見出した。これらの１３個のペプチドの
配列、および１次〜３次パネルにおける各アッセイに関するこれらの結合能力を
、表ＸＸＸＶに示す。ペプチドエピトープのこのセットは、主にｐｏｌから由来
するが、ｇａｇおよびｅｎｖ由来のエピトープもまた含む。
【０２８５】 （ＤＲ３モチーフペプチドの選択） ＨＬＡ−ＤＲ３は白色人種集団、黒色人種集団およびヒスパニック集団におい
て優勢な対立遺伝子であるので、ＤＲ３結合能力は、ＨＴＬエピトープの選択に
おいて重要な判断基準である。しかし、以前に作成されたデータは、ＤＲ３が単
にめったに他のＤＲ対立遺伝子と交差反応しないことを示した（Ｓｉｄｎｅｙら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２６３４−２６４０、１９９２；Ｇｅｌｕｋら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８、１９９４；Ｓｏｕｔｈｗ
ｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：３３６３−３３７３、１９９８）。ＤＲ
３ペプチド結合モチーフが大部分の他のＤＲ対立遺伝子の特異性と異なるようで
ある点から、これは全く驚くべきことではない。ワクチン候補物を開発する際の
最大効率のために、ＤＲ３モチーフがＤＲスーパーモチーフ領域に近接してクラ
スター形成されることが望ましい。従って、候補物であることが示されたペプチ
ドはまた、そのＤＲ３結合能力に関してアッセイされ得る。しかし、ＤＲ３モチ
ーフの異なる結合特異性を考慮して、ＤＲ３のみに対するペプチド結合はまた、
ワクチン処方物中の含有物に関する候補物としてみなされ（ｏｃｎｓｉｄｅｒ）
得る。
【０２８６】 ＤＲ３を結合するペプチド効率的に同定するために、９個の標的ＨＩＶ抗原を
、Ｇｅｌｕｋら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８、１９９４
）によって報告された２つのＤＲ３特異的結合モチーフのうちの１つの保有する
保存配列に関して分析した。次いで、対応するペプチドを、合成し、そして１μ
Ｍまたはより良好な親和性（すなわち、１μＭ未満）を有するＤＲ３を結合する
能力に関して試験した。（ｉｖｅ）この結合判断基準に合うペプチドを見出し（
表ＸＸＸＶＩ）、そしてこれによって、ＨＬＡクラスＩＩの高い親和性結合因子
として性格付けた。これら５個のうち、４個は、ｐｏｌ由来のエピトープを提示
し、そして１個はｖｐｕ由来である。
【０２８７】 ＤＲ３結合エピトープはまた、ワクチン組成物中に含まれ得る。
【０２８８】 （実施例６．ＨＩＶ由来のＨＴＬエピトープの免疫原性） ＨＴＬエピトープの免疫原性を、代表的には、適切なトランスジェニックマウ
スモデルを用いたＣＴＬエピトープの免疫原性の決定に類似した様式で、そして
／またはＨＩＶ感染個体から単離されたＰＢＭＣを用いてリコール応答を刺激す
る能力を評価することによって、評価する。
【０２８９】 実施例５で同定された１３個のＨＬＡクラスＩＩ ＤＲ−スーパーモチーフ結
合エピトープのうちの１１個の免疫原性を、リコール増殖応答に関して、ＨＩＶ
感染された個体から単離されたＰＢＭＣを試験する研究において評価した。これ
らのペプチドの全て１１個は、ＤＲ拘束増殖応答を刺激することが見出された（
表ＸＸＸＶＩＩ）。
【０２９０】 ＤＲ３−モチーフ保有ペプチドは、代表的に、同様の様式で評価される。この
ような研究は、ＨＩＶ患者由来のクラスＩＩエピトープの免疫原性を実証する。
【０２９１】 （実施例７．集団適用範囲の幅を決定するための、種々の民族背景におけるＨ
ＬＡ−スーパータイプの表現型頻度の算出） 本実施例は、複数スーパーモチーフおよび／または複数モチーフを含む多重エ
ピトープからなるワクチン組成物の集団適用範囲の幅に関する評価を示す。
【０２９２】 集団適用範囲を分析するために、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度分布を決定し
た。各ＨＬＡ対立遺伝子に関する遺伝子頻度分布は、二項式分布式 ｇｆ＝１−
（ＳＱＲＴ（１−ａｆ））を使用して抗原または対立遺伝子頻度から算出した（
例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３、１
９９６を参照のこと）。全部の表現型頻度を得るために、累積遺伝子頻度を算出
し、そして累積抗原頻度を逆関数式［ａｆ＝１−（１−Ｃｇｆ）2］の使用によ
って誘導した。
【０２９３】 頻度データがＤＮＡタイピングのレベルにおいて利用可能でない場合、対応す
る血清学的に規定された抗原頻度を、想定した。全ての潜在スーパータイプ集団
の適用範囲を得るために、連鎖不平衡は想定せず、そして、スーパータイプの各
々に属することが確認された対立遺伝子のみ、含めた（最小概算）。座の間（ｉ
ｎｔｅｒ−ｌｏｃｉ）の組み合わせによって達成された潜在適用範囲の全体の概
算は、Ａ適用範囲に非Ａでカバーされた集団の比（これは、考慮されるＢ対立遺
伝子によってカバーされると予想され得る）を加算することによって作成した（
例えば、全体＝Ａ＋Ｂ*（１−Ａ））。Ａ３様スーパータイプの確認されたメン
バーは、Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ*３３０１、Ａ*６８０１である。Ａ３様スー
パータイプはＡ３４、Ａ６６、およびＡ*７４０１もまた含み得るが、これらの
対立遺伝子は、全体の頻度算出には含まれなかった。同様に、Ａ２様スーパータ
イプファミリーの確認されたメンバーは、Ａ*０２０１、Ａ*０２０２、Ａ*０２
０３、Ａ*０２０４、Ａ*０２０５、Ａ*０２０６、Ａ*０２０７、Ａ*６８０２、
およびＡ*６９０１である。最後にＢ７様スーパータイプの確認された対立遺伝
子は、Ｂ７、Ｂ*３５０１−０３、Ｂ５１、Ｂ*５３０１、Ｂ*５４０１、Ｂ*５５
０１−２、Ｂ*５６０１、Ｂ*６７０１、およびＢ*７８０１である（潜在的には
、Ｂ*１４０１、Ｂ*３５０４−０６、Ｂ*４２０１およびＢ*５６０２もである）
。
【０２９４】 Ａ２−スーパータイプ、Ａ３−スーパータイプ、およびＢ７−スーパータイプ
を組み合わせることによって達成される集団適用範囲は、５個の主要な民族群に
おいて約８６％である（表ＸＸＩを参照のこと）。適用範囲は、Ａ１モチーフお
よびＡ２４モチーフを保有するペプチドを含むことによって拡大され得る。平均
して、５個の異なる主要な民族群（白人、北米黒人、中国人、日本人、およびヒ
スパニック）にわたって、Ａ１は、集団の１２％で、そしてＡ２４は集団２９％
で存在する。これらを考え合わせると、これらの対立遺伝子は、これら同じ民族
集団において３９％の平均頻度で提示される。Ａ１およびＡ２４がＡ２−スーパ
ータイプ対立遺伝子、Ａ３−スーパータイプ対立遺伝子、Ｂ７−スーパータイプ
対立遺伝子の適用範囲と組み合わされる場合、主要な民族集団にわたる全適用範
囲は、９５％より上である。類似のアプローチを使用して、クラスＩＩモチーフ
保有エピトープの組み合わせを用いて達成される集団適用範囲を概算し得る。
【０２９５】 （好ましいＨＬＡクラスＩエピトープの要約） 要約すると、上記実施例に示されたデータに基づいて、ＨＩＶから誘導された
４７個の免疫原性および／または交差反応性結合の好ましいＣＴＬペプチドエピ
トープが、同定された（表ＸＸＸＶＩＩＩを参照のこと）。これら４７個のエピ
トープのうち、６個は、ｇａｇ由来であり、２２個はｐｏｌ由来であり、１０個
はｅｎｖ由来であり、３個はｎｅｆ由来であり、そして各々ｒｅｖ由来の１つ、
ｖｉｆ由来の１つ、およびｖｐｒ由来の１つのエピトープである。このエピトー
プのセットは、１６個のＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープ（２個は
ｇａｇ由来、８個はｐｏｌ由来、３個はｅｎｖ由来、２個はｖｐｒ由来、１つは
ｎｅｆ由来）を含み、これらの全ては、ＨＩＶ感染患者において認識される。１
０個のＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有候補エピトープは、６個のｐｏｌ由来
エピトープ、２個のｅｎｖ由来エピトープおよび各々ｇａｇから１つ、ｖｉｆか
ら１つおよびｎｅｆから１つのエピトープを含む。ペプチド１２７３．０８およ
び１２７３．０３を除外して、全てのエピトープは、ＨＬＡトランスジェニック
マウスにおいて免疫原性である。抗原多様性を増強するために２個のさらなるペ
プチドが含まれる。
【０２９６】 ＣＴＬエピトープセットはまた、８個のＢ７拘束ペプチドを含む。これら８個
のうち、３個のエピトープは、患者において免疫原性であると報告されている。
５個のＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドを、スーパータイプ結合に基づく候補
物として含めた。ヒトにおける免疫原性研究（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｄｏｏｌａｎら、Ｉｍｍ
ｕｎｉｔｙ ７：９７、１９９７；およびＴｈｒｅｌｋｅｌｄら、Ｊ，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５９：１６４８、１９９７）は、高度に交差反応性な結合ペプチドが
ほとんど常にエピトープとして認識されることを示した。これらの結果を提供し
、そしてＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドに関して利用可能な制限された免疫
原性データを考慮すると、Ｂ７−スーパータイプ結合親和性の使用は、多様な集
団において免疫原性であるワクチンへの封入に関して候補エピトープを同定する
際に、重要な選択判断基準である。
【０２９７】 同様に、Ａ１拘束ペプチドおよびＡ２４拘束ペプチドを、候補エピトープの実
証された免疫原性および結合親和性の両方に基づいて含めた。好ましいエピトー
プのうちの５個は、ＨＩＶ感染患者由来（ｆｏｒｍ）のリコールＣＴＬ応答にお
いて認識されることが報告されている。１００ｎＭ以下の結合親和性を有する高
いパーセンテージペプチドが免疫原性であることが見出されているので、４個の
Ａ２４拘束ペプチドを、ワクチン候補物として含めた。５００ｎＭ以下のＩＣ50 を有するそれぞれの対立遺伝子に結合する、さらなる５個のＡ２４拘束エピトー
プおよび４個のＡ１拘束エピトープをまた含めて、より大きな程度の集団適用範
囲を提供した。
【０２９８】 これらの４７個のＣＴＬエピトープに関して、平均集団適用範囲は、５個の主
要な民族集団の各々において９５％よりも大きいことが予想される。ゲーム理論
モンテカルロシミュレーション分析（これは、当該分野で公知である（例えば、
Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｍ．Ｊ．およびＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．「Ａ ｃｏｕｒｓ
ｅ ｉｎ ｇａｍｅ ｔｈｅｏｒｙ」ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ、１９９４））を用い
て、白人、北米黒人、日本人、中国人、およびヒスパニックの民族群からなる集
団において９０％の個体が、本明細書中に記載されるワクチンエピトープの７個
以上を認識することが概算された（図１）。
【０２９９】 （好ましいＨＬＡクラスＩＩエピトープの要約） ワクチン組成物に関して好ましいＨＩＶ由来のＨＴＬエピトープの列挙を、表
ＸＸＸＩＸに要約する。ＨＴＬエピトープのセットは、１３個のＤＲスーパーモ
チーフ保有ペプチドおよび５個のＤＲ３モチーフ保有ペプチドを含む。大多数の
エピトープは、ｐｏｌから誘導され、３個はｇａｇから、２個はｅｎｖから、そ
して１個はｖｐｕから誘導される。ＨＴＬエピトープのこのパネルによって示さ
れる概算された集団適用範囲全体は、５個の主要な民族群の各々において９１％
よりも多いことを概算する（表ＸＬ）。
【０３００】 （実施例８．プライミング後の内因性プロセシング抗原のＣＴＬ認識） 本実施例は、実施例１〜６において記載されるように同定されそして選択され
たネイティブなペプチドエピトープおよびアナログペプチドにより誘導されるＣ
ＴＬが、内因的に合成された（すなわち、ネイティブな）抗原を認識することを
決定する。
【０３０１】 実施例３におけるようなペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２スーパー
モチーフ保有エピトープ）で免疫されたトランスジェニックマウスから単離した
エフェクター細胞を、ペプチドコーティングされた刺激細胞を使用してインビト
ロで刺激する。６日後、細胞傷害性についてエフェクター細胞をアッセイし、そ
してペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細胞株をさらに再刺激する。さらに６
日後、ペプチドの存在下または非存在下で51Ｃｒ標識化Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２．１
／Ｋb標的に対する細胞傷害性活性についてこれらの細胞株を試験し、そしてま
た、内因的に合成された抗原を保有する51Ｃｒ標識化標的細胞（すなわち、ＨＩ
Ｖ発現ベクターで安定にトランスフェクトした細胞）に対して試験する。
【０３０２】 その結果は、ペプチドエピトープでプライム（ｐｒｉｍｅ）した動物から得た
ＣＴＬ株が、内因的に合成されたＨＩＶ抗原を認識することを実証する。このよ
うな分析のために使用されるトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価さ
れるエピトープに依存する。ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウ
スに加えて、ヒトＡ１１（これはまた、Ａ３エピトープを評価するために使用さ
れ得る）およびＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかの他のトランスジ
ェニックマウスモデルを特徴づけ、そして他（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２
４についてのトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１マ
ウスおよびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデル（これは、ＨＴＬエピトープを評価する
ために使用され得る）も開発されている。
【０３０３】 （実施例９．トランスジェニックマウスにおける、ＣＴＬ−ＨＴＬ結合体化エ
ピトープの活性） 本実施例は、ＨＩＶ ＣＴＬ／ＨＴＬペプチド結合体の使用によるトランスジ
ェニックマウスにおけるＣＴＬおよびＨＴＬの誘導を例示する。ここでワクチン
組成物は、ＨＩＶに感染した患者またはＨＩＶの危険にある個体に投与されるペ
プチドを含む。このペプチド組成物は、多重ＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピト
ープを含み得る。この分析は、ワクチン組成物に１以上のＨＴＬエピトープを含
ませることにより達成され得る免疫原性の増強を示す。このようなペプチド組成
物は、例えば、表ＸＸＶＩ−ＸＸＩＸから選択される少なくとも１つのＣＴＬエ
ピトープまたはそのエピトープのアナログを含む好ましいＣＴＬエピトープに結
合体化されたＨＴＬエピトープを含み得る。ＨＴＬエピトープは、例えば、表Ｘ
ＸＸＩＩから選択される。このペプチドは、所望ならば、脂質化（ｌｉｐｉｄａ
ｔｅ）され得る。
【０３０４】 免疫手順：トランスジェニックマウスの免疫を、記載される（Ａｌｅｘａｎｄ
ｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３〜４７６１、１９９７）ように
行った。例えば、Ａ２／Ｋbマウス（これは、ヒトＨＬＡ Ａ２．１対立遺伝子
についてトランスジェニックであり、そしてＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフまた
はＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープの免疫原性の評価のために有用
である）を、不完全フロイントアジュバント中か、またはペプチド組成物が脂質
化ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体である場合は、ＤＭＳＯ／生理食塩水中、またはペプチ
ド組成物がポリペプチドである場合にはＰＢＳまたは不完全フロイトアジュバン
ト中で０．１ｍｌのペプチドで皮下に（尾部の基部）プライムする。プライミン
グの７日後、これらの動物から得た脾細胞をペプチドでコーティングした同系照
射ＬＰＳ活性化リンパ芽球で再刺激する。
【０３０５】 細胞株：ペプチド特異的細胞傷害性アッセイのための標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ
２．１／Ｋbキメラ遺伝子でトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞である（例
えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７，１９９１
）。
【０３０６】 インビトロＣＴＬ活性化：プライミングの１週間後、脾細胞（３０×１０6細
胞／フラスコ）を１０ｍｌの培養培地／Ｔ２５フラスコ中で、同系照射（３００
０ラド）ペプチドコートリンパ芽球（１０×１０6細胞／フラスコ）と共に、３
７℃にて共存培養する。６日後、エフェクター細胞を回収し、そして細胞傷害性
活性についてアッセイする。
【０３０７】 細胞傷害性活性についてのアッセイ：標的細胞（１．０〜１．５×１０6）を
２００μｌの51Ｃｒの存在下で、３７℃にてインキュベートする。６０分後、細
胞を３回洗浄し、そしてＲ１０培地に再懸濁する。必要な場合、ペプチドを１μ
ｇ／ｍｌの濃度で添加する。アッセイのために、Ｕ字型底の９６ウェルプレート
において１０4の51Ｃｒ標識化標的細胞を異なる濃度のエフェクター細胞に添加
する（２００μｌの最終容量）。３７℃にて６時間インキュベーション後、上清
の０．１ｍｌのアリコートを各ウェルから取りだし、そして放射活性をＭｉｃｒ
ｏｍｅｄｉｃ自動γ計数器において決定する。パーセント比溶解を、式：パーセ
ント比溶解＝１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）
により決定する。同じ条件化で行った別のＣＴＬアッセイ間の比較を容易にする
ために、51Ｃｒ放出データ（％）を溶解単位／１０6細胞として表現する。１溶
解単位は、６時間51Ｃｒ放出アッセイにおける１０，０００標的細胞の３０％溶
解を達成するために必要とされるエフェクター細胞の数として任意に決定する。
比溶解単位／１０6を得るために、ペプチドの非存在下で得た溶解単位／１０6を
ペプチドの存在下で得た溶解単位／１０6から減算する。例えば、ペプチドの非
存在下にて３０％51Ｃｒ放出を５０：１のエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比（
すなわち、１０，０００標的について５×１０5エフェクター細胞）で得る場合
およびペプチド存在下（すなわち、１０，０００標的について５×１０4エフェ
クター細胞）で５：１にて得る場合、比溶解単位は：［（１／５０，０００）−
（１／５００，０００）］×１０6＝１８ＬＵである。
【０３０８】 結果を、免疫原性ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体化ワクチン調製物を注射した動物のＣ
ＴＬ応答の大きさを評価するために分析し、そして実施例３において概説したよ
うにＣＴＬエピトープを使用して達成したＣＴＬ応答の大きさと比較する。これ
に類似の分析を行い、複数のＣＴＬエピトープおよび／または複数のＨＴＬエピ
トープを含むペプチド結合体の免疫原性を評価し得る。これらの手順に従って、
ＣＴＬ応答が誘導されること、そして同時に、ＨＴＬ応答が、このような組成物
の投与の時に誘導されることを見出した。
【０３０９】 （実施例１０．ＨＩＶ特異的ワクチンに含ませるためのＣＴＬおよびＨＴＬエ
ピトープの選択） 本実施例は、本発明のワクチン組成物についてのペプチドエピトープの選択の
ための手順を例示する。組成物中のペプチドは、核酸配列の形態、ペプチドをコ
ードする単一または１以上のいずれかの配列（すなわちミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇ
ｅｎｅ））での形態あり得るか、または単一ペプチドおよび／またはポリエピト
ープペプチドであり得る。
【０３１０】 以下の原則を、ワクチン組成物に含ませるためのエピトープのアレイを選択す
る時に使用する。以下の原則の各々は、選択を行うために平衡化される。
【０３１１】 投与の際に、ウイルスクリアランスと相関する免疫応答を模倣するエピトープ
が選択される。例えば、ＨＩＶを一掃する患者が、少なくとも１つのＨＩＶ抗原
における少なくとも３エピトープに対する免疫応答を生じることが観察された場
合、３〜４エピトープが、ＨＬＡクラスＩについて含まれるべきである。同様の
比率をＨＬＡクラスＩＩエピトープを決定するために使用する。
【０３１２】 ＨＩＶエピトープのアレイを選択する場合に、エピトープの少なくともいくつ
かが初期タンパク質または後期タンパク質から誘導されることが好ましい。急性
感染または、潜伏感染のいずれかの後に、ウイルスが複製される場合に、ＨＩＶ
の初期プロモーターが発現される。従って、可能な最も初期の段階で疾患の症状
を軽減するために初期段階タンパク質由来のエピトープを使用することが特に好
ましい。
【０３１３】 ＨＬＡクラスＩ分子については５００ｎＭ以下のＩＣ50、クラスＩＩについて
は、１０００ｎＭ以下のＩＣ50の結合親和性を有するエピトープがしばしば選択
される。十分なスーパーモチーフ保有ペプチドまたは対立遺伝子特異的モチーフ
保有ペプチドの十分なアレイを、広範な集団適用範囲を与えるために選択する。
例えば、エピトープを、少なくとも８０％集団適用範囲を提供するために選択す
る。モンテカルロ分析（当該分野で公知の統計学的評価）が、集団適用範囲の幅
または重複性を評価するために使用され得る。
【０３１４】 ポリエピトープ組成物（例えば、ミニ遺伝子）を作製する場合、典型的に、目
的のエピトープを含む可能な限り最小のペプチドを生成することが所望される。
使用される原理は、入れ子状（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープを含むペプチドを選択
する場合に使用される原理と、同一でなければ類似するものである。
【０３１５】 同一標的タンパク質の複数の改変体の配列が利用可能である場合には、潜在ペ
プチドエピトープはまた、それらの保存に基づいて選択され得る。例えば、保存
基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体、またはクラスＩＩ結合ペプチ
ドの９マーのコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価される配列に関し
て指示されたパーセンテージで保存されていることを規定し得る。
【０３１６】 ワクチン組成物に含まれるペプチドエピトープは、例えば、表ＸＸＶＩ〜ＸＸ
ＩＸおよび表ＸＸＸＩＩに列挙されたものから選択される。選択されたペプチド
から構成されるワクチン組成物は、投与された場合に、安全であり、有効であり
、そして急性ＨＩＶ感染を一掃する免疫応答と同様の大きさで免疫応答を誘発す
る。
【０３１７】 （実施例１１．ミニ遺伝子多重エピトープ性ＤＮＡプラスミドの構築） 本実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築のための一般的指針を提供する
。当然のことながら、ミニ遺伝子プラスミドは、本明細書中に記載されるような
、種々の構造のＣＴＬおよび／またはＨＴＬのエピトープまたはエピトープアナ
ログを含み得る。発現プラスミドは、例えば、同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０
９／３１１，７８４（５／１３／９９付け出願）およびＩｓｈｉｏｋａら，Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：３９１５−３９２５，１９９９において記載されるよ
うに構築され、そして評価される。ＨＩＶエピトープの発現のためのこのような
プラスミドの例を、図２に示す。図２は、ミニ遺伝子構築物におけるＨＩＶペプ
チドエピトープの方向を例示する。
【０３１８】 ミニ遺伝子発現プラスミドは、代表的に、複数のＣＴＬおよびＨＴＬペプチド
エピトープを含む。本実施例では、ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ｂ７スーパーモチ
ーフ保有ペプチドエピトープ、およびＨＬＡ−Ａ１および−Ａ２４モチーフ保有
ペプチドエピトープが、ＤＲ−スーパーモチーフ保有エピトープおよび／または
ＤＲ３エピトープと組み合わせて使用される（図２）。好ましいエピトープは、
例えば、表ＸＸＶＩ〜ＸＸＩＸおよびＸＸＸＩＩにおいて同定される。ＨＬＡク
ラスＩスーパーモチーフまたは複数のＨＩＶ抗原由来のモチーフ保有ペプチドエ
ピトープが選択され、その結果、複数のスーパーモチーフ／モチーフが提示され
て、広範な集団適用範囲を保証する。同様に、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを、
複数のＨＩＶ抗原から選択して、広範な集団適用範囲を提供する。すなわち、Ｈ
ＬＡ−１−４−７スーパーモチーフ保有エピトープおよびＨＬＡ ＤＲ３モチー
フ保有エピトープの両方が、ミニ遺伝子構築物に含まれるために選択される。次
いで、選択されたＣＴＬおよびＨＴＬエピトープは、発現ベクターにおける発現
のためにミニ遺伝子中に組み込まれる。
【０３１９】 このような構築物はさらに、小胞体にＨＴＬエピトープを指向させる配列を含
み得る。例えば、Ｉｉタンパク質を、同時係属中の出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／
３１１，７８４（５／１３／９９付け出願）に記載のように、１以上のＨＴＬエ
ピトープに融合し得る。ここで、Ｉｉタンパク質のＣＬＩＰ配列は取り除かれ、
そしてＨＬＡクラスＩＩエピトープ配列で置き換えられ、その結果、ＨＬＡクラ
スＩＩエピトープは小胞体に指向され、この小胞体で、エピトープはＨＬＡクラ
スＩＩ分子に結合する。
【０３２０】 本実施例は、ミニ遺伝子保有発現プラスミドの構築のために使用される方法を
例示する。ミニ遺伝子組成物のために使用され得る他の発現ベクターは利用可能
であり、そして当業者に公知である。
【０３２１】 ミニ遺伝子ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列およびコンセン
サスマウスκＩｇ軽鎖シグナル配列を含み、次いで、本明細書中に開示された原
理に従って選択されたＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含む。この構築
物はまた、例えば、配列を含み得、この配列は、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｍｙｃ−Ｈ
ｉｓベクターによってコードされるＭｙｃおよびＨｉｓ抗体エピトープタグに融
合されたオープンリーディングフレームをコードする。
【０３２２】 平均して１５ヌクレオチドの重複を有する約７０ヌクレオチド長の重複性オリ
ゴヌクレオチド（例えば、８オリゴヌクレオチド）は、合成され、そしてＨＰＬ
Ｃ精製される。このオリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープ、な
らびに適切なリンカーヌクレオチド、Ｋｏｚａｋ配列、およびシグナル配列をコ
ードする。最終的な多重エピトープ性ミニ遺伝子は、ＰＣＲを使用する３セット
の反応において重複性オリゴヌクレオチドを伸長させることによってアセンブル
される。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ ９６００ ＰＣＲ機を使用し、そして以下
の条件を使用して、合計３０回実施する：９５℃にて１５秒間、アニーリング温
度（各プライマー対に関して最も低く算出されたＴｍより５度低い）で３０秒間
、および７２℃にて１分間。
【０３２３】 最初のＰＣＲ反応については、各５μｇの２つのオリゴヌクレオチドをアニー
リングし、そして伸長する：オリゴヌクレオチド１＋２、３＋４、５＋６、およ
び７＋８を、Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液（１×＝１０ｍＭ ＫＣＬ，１０ｍＭ（
ＮＨ4）2ＳＯ4，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩化物，ｐＨ８．７５，２ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ4，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、各０
．２５ｍＭのｄＮＴＰ、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌ
の反応物中で組み合わせる。全長のダイマー産物をゲル精製し、そして１＋２お
よび３＋４の産物、ならびに５＋６および７＋８の産物を含む２つの反応物を混
合し、アニーリングし、そして１０回伸長させる。次いで、２つの反応物の半分
を混合し、そして５回のアニーリングおよび伸長を実施し、次いで、隣接プライ
マーを添加して、さらに２５回、全長産物を増幅する。全長産物をゲル精製し、
そしてｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、そして
個々のクローンを、配列決定によってスクリーニングする。
【０３２４】 （実施例１２．プラスミド構築物およびプラスミド構築物が免疫原性を誘導す
る程度） プラスミド構築物（例えば、実施例１１に従って構築されるプラスミド）が、
免疫原性を誘導し得る程度は、エピトープ発現核酸構築物でのＡＰＣの形質導入
またはトランスフェクション後の、このＡＰＣによるエピトープ提示を試験する
ことによって、インビトロで評価され得る。このような研究は、「抗原性」を決
定し、そしてヒトＡＰＣの使用を可能にする。このアッセイは、細胞表面上での
エピトープ−ＨＬＡクラスＩ複合体の密度を定量することによって、Ｔ細胞によ
って認識される状況下でエピトープがＡＰＣによって提示される能力を決定する
。定量は、ＡＰＣから溶出されるペプチドの量を直接測定することによって実施
され得るか（例えば、Ｓｉｊｔｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５６：６８３−６
９２，１９９６；Ｄｅｍｏｔｚら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：６８２−６８４，１
９８９を参照のこと）；または、ペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合体の数は、感染
もしくはトランスフェクトされた標的細胞によって誘導される溶解もしくはリン
ホカイン放出の量を測定し、次いで、溶解もしくはリンホカイン放出の等価な量
を得るために必要とされるペプチドの濃度を決定することによって推定され得る
（例えば、Ｋａｇｅｙａｍａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４：５６７−５７６
，１９９５を参照のこと）。
【０３２５】 あるいは、免疫原性は、マウスへのインビボ注射と、その後のＣＴＬおよびＨ
ＴＬ活性のインビトロ評価とを通して評価され得る。これらは、同時係属中のＵ
．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４（５／１３／９９付け出願）およびＡｌｅ
ｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６１，１９９４において詳
述されるように、それぞれ、細胞傷害性アッセイおよび増殖アッセイを使用して
分析される。
【０３２６】 例えば、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーファミリーペプチドを含むＤ
ＮＡミニ遺伝子構築物（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４に記載
のように生成されたｐＭｉｎミニ遺伝子構築物）が、インビボでＣＴＬを誘導す
る能力を評価するために、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbトランスジェニック
マウスに、筋内で１００μｇの裸のｃＤＮＡを用いて免疫する。ｃＤＮＡ免疫に
よって誘導されるＣＴＬのレベルを比較するための手段として、コントロール群
の動物もまた、実際のペプチド組成物で免疫する。この実際のペプチド組成物は
、それらがミニ遺伝子によってコードされるような、単一のポリペプチドとして
合成される多重性エピトープを含む。
【０３２７】 免疫された動物由来の脾細胞を、個々の組成物（ミニ遺伝子においてコードさ
れるペプチドエピトープまたはポリエピトープ性ペプチド）の各々で２回刺激し
、次いで、51Ｃｒ放出アッセイにおいて、ペプチド特異的細胞傷害性活性につい
てアッセイする。この結果によって、Ａ２拘束エピトープに対して指向されたＣ
ＴＬ応答の大きさが示され、このようにして、ミニ遺伝子ワクチンおよびポリエ
ピトープ性ワクチンのインビボ免疫原性が示される。従って、ミニ遺伝子は、ポ
リエピトープ性ペプチドワクチンと同様に、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプ
チドエピトープに対して指向された免疫応答を誘発することが見出された。同様
の分析もまた、他のＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウス
モデルを使用して実施し、ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７モチーフまたはスー
パーモチーフエピトープによるＣＴＬの誘導を評価する。
【０３２８】 クラスＩＩエピトープをコードするミニ遺伝子が、インビボでＨＴＬを誘導す
る能力を評価するために、例えば、ＤＲトランスジェニックマウス、または適切
なマウスＭＨＣ分子と交差反応するようなエピトープについては、Ｉ−Ａb拘束
マウスに、筋内で１００μｇのプラスミドＤＮＡを用いて免疫する。ＤＮＡ免疫
によって誘導されるＨＴＬのレベルを比較する手段として、コントロール動物群
もまた、完全フロイントアジュバント中に乳化された実際のペプチド組成物で免
疫する。ＣＤ４＋Ｔ細胞（すなわち、ＨＴＬ）を、免疫した動物の脾細胞から精
製し、そして各個々の組成物（ミニ遺伝子中にコードされるペプチド）で刺激す
る。ＨＴＬ応答を、3Ｈ−チミジン取り込み増殖アッセイ（例えば、Ａｌｅｘａ
ｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６１，１９９４を参照のこと）
を使用して、測定する。この結果によって、ＨＴＬ応答の大きさが示され、この
ようにして、ミニ遺伝子のインビボ免疫原性が示される。
【０３２９】 実施例１１に記載されるように構築されたＤＮＡミニ遺伝子はまた、プライム
ブーストプロトコールを使用するブースト剤と組み合わせるワクチンとして評価
され得る。ブースト剤は、組換えタンパク質（例えば、Ｂａｒｎｅｔｔら，Ａｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４，補遺３
：Ｓ２９９−Ｓ３０９，１９９８）または例えば、目的の完全なタンパク質をコ
ードするミニ遺伝子またはＤＮＡを発現する組換えワクシニア（例えば、Ｈａｎ
ｋｅら，Ｖａｃｃｉｎｅ １６：４３９−４４５，１９９８；Ｓｅｄｅｇａｈら
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：７６４８−５３，１
９９８；ＨａｎｋｅおよびＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ ６６：１７７−１８１，１９９９；ならびにＲｏｂｉｎｓｏｎら，Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｍｅｄ．５：５２６−３４，１９９９を参照のこと）から構成され得る。
【０３３０】 例えば、プライムブーストプロトコールにおいて使用されるＤＮＡミニ遺伝子
の効力を、最初にトランスジェニックマウスにおいて評価する。この実施例にお
いて、Ａ２．１／Ｋbのトランスジェニックマウスを、少なくとも１つのＨＬＡ
−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを含む免疫原性ペプチドをコードするＤＮ
Ａミニ遺伝子１００μｇを用いて、ＩＭで免疫する。インキュベーション期間の
後（３〜９週間の範囲）、このマウスを、このＤＮＡミニ遺伝子によってコード
される同じ配列を発現する組換えワクシニアウイルスの１０7ｐｆｕ／マウスを
用いてＩＰでブーストする。コントロールマウスを、ミニ遺伝子配列を有さない
か、またはこのミニ遺伝子をコードするＤＮＡを有するがワクシニアブーストを
有さない、ＤＮＡまたは組換えワクシニアの１００μｇで免疫する。２週間のさ
らなるインキュベーション期間の後、マウス由来の脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴア
ッセイにおいてペプチド特異的活性について直ちにアッセイする。さらに、脾細
胞を、ミニ遺伝子および組換えワクシニアにおいてコードされるＡ２−拘束ペプ
チドエピトープを用いてインビトロで刺激し、次いで、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ
においてペプチド特異的についてアッセイする。
【０３３１】 プライムブーストプロトコールにおいて利用されるミニ遺伝子は、ＤＮＡ単独
を有する場合よりも、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドに対するより大き
な免疫応答を誘発することが見出される。このような分析はまた、ＨＬＡ−Ａ１
１またはＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて行われて、ＨＬ
Ａ−Ａ３またはＨＬＡ−Ｂ７モチーフあるいはスーパーモチーフエピトープによ
るＣＴＬ誘導を評価し得る。
【０３３２】 ヒトにおけるプライムブーストプロトコールの使用は、実施例２０に記載され
る。
【０３３３】 （実施例１３．予防的使用のためのペプチド組成物） 本発明のワクチン組成物を、ＨＩＶ感染の危険性を有する人において、このよ
うな感染を防ぐために使用し得る。例えば、複数のＣＴＬおよびＨＴＬエピトー
プ（例えば、実施例９および／または１０で選択されるもの）を含むポリエピト
ープ性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）ペプチドエピトープ組成物（まはた同じも
のを含む核酸）（これらはまた、集団の８０％より多くを標的化するために選択
される）を、ＨＩＶ感染の危険性を有する個体に投与する。
【０３３４】 例えば、ペプチドに基づく組成物は、複数のエピトープを含む単一のポリペプ
チドとして提供され得る。このワクチンを、典型的には、アジュバント（例えば
、不完全フロイントアジュバント）を含む生理学的溶液中で投与する。最初の免
疫のためのペプチドの用量は、７０ｋｇの患者について約１〜約５０，０００μ
ｇであり、一般的には１００〜５，０００μｇである。ワクチンの最初の投与の
後に、４週間でブースター投薬量を投与し、その後ＰＢＭＣサンプル中のエピト
ープ特異的ＣＴＬ集団の存在を決定する技術によって、この患者における免疫応
答の大きさを評価する。さらなるブースター用量を、必要に応じて投与する。こ
の組成物は、ＨＩＶ感染に対する予防法として安全および有効の両方であること
が見出される。
【０３３５】 あるいは、典型的にはトランスフェクト因子を含む組成物を、当該分野で公知
の方法論および本明細書中で開示される方法論に従って、核酸に基づくワクチン
の投与のために使用し得る。
【０３３６】 （実施例１４．ネイティブＨＩＶ配列由来のポリエピトープ性ワクチン組成物
） 好ましくは、クラスＩおよび／またはクラスＩＩのスーパーモチーフまたはモ
チーフの各々について規定されるコンピュータアルゴリズムを用いて、ネイティ
ブＨＩＶポリタンパク質配列がスクリーニングされて、複数のエピトープを含む
ポリタンパク質の「比較的短い」領域を同定し、そしてこのネイティブＨＩＶポ
リタンパク質配列は、好ましくはネイティブの抗原全体よりも長さが短い。複数
の異なるエピトープ（重複したものでさえ）を含むこの比較的短い配列は、ミニ
遺伝子構築物を作製するために選択され、そして使用される。この構築物は、こ
のペプチドを発現するために操作され、これはネイティブのタンパク質配列に対
応する。この「比較的短い」ペプチドは、一般には２５０アミノ酸長未満であり
、しばしば１００アミノ酸長未満であり、好ましくは７５アミノ酸長未満であり
、そしてより好ましくは５０アミノ酸長未満である。このワクチン組成物のタン
パク質配列を選択する。なぜなら、これは、この配列内に含まれるエピトープの
最大数を有する（すなわち、これは高濃度のエピトープを有する）ためである。
本明細書中に示されるように、エピトープモチーフは、入れ子状でも重複しても
よく、例えば、２つの９マーエピトープおよび１つの１０マーエピトープが、１
０アミノ酸ペプチド中に存在し得る。このようなワクチン組成物を、治療目的ま
たは予防目的のために投与する。
【０３３７】 このワクチン組成物は、好ましくは、例えばＨＩＶ由来の３つのＣＴＬエピト
ープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含む。このポリエピトープ性の
ネイティブ配列を、ペプチドとしてか、またはこのペプチドをコードする核酸配
列をしてかのいずれかで投与する。あるいは、このネイティブ配列のアナログが
作製され得、これによってエピトープの１つ以上が、このポリエピトープ性ペプ
チドの交差反応性および／または結合親和性特性を変更する置換を含む。
【０３３８】 この実施例の実施形態は、免疫系のまだ未知の局面として、プロセシングがネ
イティブの入れ子状配列に適用され、それによって治療的または予防的な免疫応
答を誘導するワクチン組成物の生成を容易にするという可能性を提供する。さら
に、このような実施形態は、現在未知のＨＬＡの構成についてのモチーフ保有エ
ピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形態（アナログを欠く）は、ネ
イティブのＨＩＶ抗原に実際に存在する複数のペプチド配列に対する免疫応答に
関し、従って、任意の接合性エピトープの評価の必要性を回避する。最後に、こ
の実施形態は、核酸ワクチン組成物の生成の場合に、規模の節約を提供する。
【０３３９】 この実施形態と関連して、当該分野の原理に従ってコンピュータプログラムが
誘導され得、これは、標的配列において、配列長当たりのエピトープの最大数を
同定する。
【０３４０】 （実施例１５．複数の疾患に関するポリエピトープ性ワクチン組成物） 本発明のＨＩＶペプチドエピトープを、１つ以上の他の疾患と関連する標的抗
原由来のペプチドエピトープと共に使用して、ＨＩＶならびに１つ以上の他の疾
患の予防または処置に有用なワクチン組成物を生成する。他の疾患の例としては
、ＨＣＶおよびＨＢＶが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３４１】 例えば、集団の９８％より多くを標的とする複数のＣＴＬおよびＨＴＬエピト
ープを含むポリエピトープ性ペプチド組成物を、ＨＢＶおよびＨＩＶ感染の両方
の危険性を有する個体に投与するために生成し得る。この組成物は、種々の疾患
に関連する原因由来の複数のエピトープを取り込む単一のポリペプチドとして提
供され得るか、または１つ以上の分散したエピトープを含む組成物として投与さ
れ得る。
【０３４２】 （実施例１６．免疫応答を評価するためのペプチドの使用） 本発明のペプチドを、ＨＩＶに関する特定のＣＴＬまたはＨＴＬ集団の存在に
対する免疫応答を分析するために使用し得る。このような分析を、Ｏｇｇら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３−２１０６，１９９８によって記載されるよう
な様式で行い得る。以下の実施例において、本発明に従うペプチドを、免疫原と
してではなく、診断目的または予後判定目的のための試薬として使用する。
【０３４３】 この実施例において、高度に感受性のヒト白血球抗原テトラマー複合体（「テ
トラマー」）を、例えば、感染の異なる段階で、またはＡ*０２０１モチーフを
含むＨＩＶペプチドを使用する免疫の後に、ＨＬＡ Ａ*０２０１−陽性個体か
らのＨＩＶ ＨＬＡ−Ａ*０２０１特異的ＣＴＬの頻度の断面分析のために使用
する。テトラマー複合体を、記載されるように合成する（Ｍｕｓｅｙら，Ｎ．Ｅ
ｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１２６７，１９９７）。手短に言うと、精製され
たＨＬＡ重鎖（この実施例においてはＡ*０２０１）およびβ２−ミクログロブ
リンを、原核生物発現系によって合成する。この重鎖を、膜貫通細胞質ゾルの尾
の欠失およびＢｉｒＡ酵素学的ビオチン化部位を含む配列のＣＯＯＨ末端付加に
よって改変する。この重鎖（２−ミクログロブリン）およびペプチドを、希釈に
よって再折り畳みする。４５ｋＤの再折り畳み産物を、高速タンパク質液体クロ
マトグラフィーによって単離し、次いで、ビオチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、アデノシン５’三リン酸およびマグネシウムの存在
下でＢｒｉＡによってビオチン化する。ストレプトアビジン−フィコエリトリン
結合体を、１：４のモル比で加え、そしてこのテトラマー産物を１ｍｇ／ｍｌま
で濃縮する。得られた産物をテトラマー−フィコエリトリンと呼ぶ。
【０３４４】 患者の血液サンプルの分析のために、約１００万のＰＢＭＣを３００×ｇで５
分間遠心分離し、そして５０μｌの冷却リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁する。
三色（Ｔｒｉ−ｃｏｌｏｒ）分析を、抗ＣＤ８−三色、および抗ＣＤ３８と一緒
に、テトラマー−フィコエリトリンを用いて行う。このＰＢＭＣを、テトラマー
および抗体と一緒に３０〜６０分間氷上でインキュベートし、次いで、ホルムア
ルデヒド固定化の前に２回洗浄する。コントロールサンプルのうち９９．９８％
より多くを含むために、ゲートを適用する。このテトラマーについてのコントロ
ールは、Ａ*０２０１−陰性個体およびＡ*０２０１−陽性の非感染ドナーの両方
を含む。次いで、このテトラマーで染色された細胞のパーセンテージを、フロー
サイトメトリーによって決定する。この結果は、エピトープ拘束ＣＴＬを含むＰ
ＢＭＣサンプル中の細胞の数を示し、これによってＨＩＶエピトープに対する免
疫応答の程度を容易に示し、従って、ＨＩＶでの感染の段階、ＨＩＶへの曝露の
状態、または防御応答または治療応答を誘発するワクチンへの曝露の状態を示す
。
【０３４５】 （実施例１７．リコール応答を評価するためのペプチドエピトープの使用） 本発明のペプチドエピトープを、患者におけるＴ細胞応答（例えば、急性応答
またはリコール応答）を評価するための試薬として使用する。このような分析を
、感染から回復した患者、ＨＩＶで慢性的に感染した患者、またはＨＩＶワクチ
ンでワクチン接種した患者で行い得る。
【０３４６】 例えば、ワクチン接種された人のクラスＩ拘束ＣＴＬ応答を、分析し得る。こ
のワクチンは、任意のＨＩＶワクチンであり得る。ＰＢＭＣを、ワクチン接種さ
れた個体およびＨＬＡ型から収集する。次いで、本発明の適切なペプチドエピト
ープ（最適には、複数のＨＬＡスーパータイプファミリーメンバーとの交差反応
性を提供するためのスーパーモチーフを保有するペプチドエピトープ）を、この
ＨＬＡ型を保有する個体由来のサンプルの分析のために使用する。
【０３４７】 ワクチン接種された個体由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑ
ｕｅ密度勾配（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）で分離し、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で３回洗
浄し、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマ
イシン（５０μｇ／ｍｌ）、および１０％の熱不活性化ヒトＡＢ血清を含むＨｅ
ｐｅｓ（１０ｍＭ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）（完全ＲＰＭＩ）中に再懸濁し、そしてミクロ培養形式を使用し
てプレーティングする。本発明のエピトープを含む合成ペプチドを、各ウェルに
１０μｇ／ｍｌで加え、そして刺激の最初の週の間のＴ細胞援助（ｈｅｌｐ）の
供給源として、ＨＢＶコア１２８〜１４０エピトープを各ウェルに１μｇ／ｍｌ
で加える。
【０３４８】 このミクロ培養形式において、４×１０5ＰＢＭＣを、９６ウェルの丸底プレ
ート中の１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩにおいて、８つの複製培養物中のペ
プチドで刺激する。３日目および１０日目に、１００ｍｌの完全ＲＰＭＩおよび
２０Ｕ／ｍｌの最終濃度のｒＩＬ−２を各ウェルに加える。７日目に、この培養
物を９６ウェルの平底プレートに移し、そしてペプチド、ｒＩＬ−２および１０ 5 の照射された（３，０００ｒａｄ）自己支持細胞で再刺激する。この培養物を
、１４日目に細胞傷害活性について試験する。陽性のＣＴＬ応答は、以前に記載
されるように（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１１０４，
１１０８，１９９６；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９
７：１６５５−１６６５，１９９６；およびＲｅｈｅｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１４３２−１４４０，１９９６）、非感染のコントロ
ール被験体との比較に基づいて、１０％より高い特異的51Ｃｒ放出を示すために
、８つの複製培養物のうちの２つ以上を必要とする。
【０３４９】 標的細胞株は、自己および同種異系ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬであり、これは
、米国組織適合性および免疫遺伝学協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ）（ＡＳＨＩ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入するか、または記載さ
れるように（Ｇｕｉｌｈｏｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２６７０−２６７８，
１９９２）患者のプールから樹立するかのいずれかである。
【０３５０】 細胞傷害性アッセイを、以下の様式で行う。標的細胞は、同種異系ＨＬＡと一
致したか、または自己のＥＢＶで形質転換されたＢリンパ芽球腫細胞株のいずれ
かからなり、これを本発明の合成ペプチドエピトープと一緒に１０μＭで一晩イ
ンキュベートし、そして１００μＣｉの51Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．
，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて１時間標識し、その後
これらをＨＢＳＳで４回洗浄する。
【０３５１】 細胞溶解活性を、３，０００標的／ウェルを含むＵ底９６ウェルプレートを使
用して、標準的な４−ｈ、分割ウェル51Ｃｒ放出アッセイにおいて決定する。刺
激されたＰＢＭＣを、１４日目に、２０〜５０：１のエフェクター／標的（Ｅ／
Ｔ）比で試験する。細胞傷害性パーセントを、以下の式：１００×［（実験の放
出−自発性の放出）／最大放出−自発性の放出）］から決定する。最大放出は、
界面活性剤（２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）による標的の溶解によって決定する。自発
性の放出は、全ての実験において最大放出の２５％未満である。
【０３５２】 このような分析の結果は、ＨＩＶまたはＨＩＶワクチンへの以前の曝露によっ
てＨＬＡ拘束ＣＴＬ集団が刺激される程度を示す。
【０３５３】 クラスＩＩ拘束ＨＴＬ応答をまた、分析し得る。精製したＰＢＭＣを、１．５
×１０5細胞／ウェルの密度で９６ウェル平底プレートで培養し、そして１０μ
ｇ／ｍｌの合成ペプチド、抗原全体、またはＰＨＡで刺激する。細胞を、各条件
について４〜６ウェルの複製物中に日常的にプレーティングする。７日の培養後
、この培地を除去し、そして１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮な培地に交換す
る。２日後、１μＣｉ 3Ｈ−チミジンを各ウェルに加え、そしてさらに１８時
間インキュベーションを続ける。次いで、細胞ＤＮＡをガラス繊維マットの上に
収集し、そして3Ｈ−チミジンの取り込みについて分析する。抗原特異的Ｔ細胞
の増殖を、抗原の存在下での3Ｈ−チミジン取り込みを抗原の非存在下での3Ｈ−
チミジン取り込みで除算した比として計算する。
【０３５４】 （実施例１８．ヒトにおける特異的ＣＴＬ応答の誘導） 本発明のＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを含む免疫原性組成物についてのヒト
の臨床試験を、ＩＮＤのＩ期として調整し、段階的研究を行い、そして無作為で
二重盲のプラシーボ制御試験として行う。このような試験を、例えば以下のよう
に設計する： 合計約２７の被験体を登録（ｅｎｒｏｌｌ）し、そして３つのグループに分け
る： グループＩ：３つの被験体にプラシーボを注射し、そして６つの被験体に５μ
ｇのペプチド組成物を注射する； グループＩＩ：３つの被験体にプラシーボを注射し、そして６つの被験体に５
０μｇのペプチド組成物を注射する； グループＩＩＩ：３つの被験体にプラシーボを注射し、そして６つの被験体に
５００μｇのペプチド組成物を注射する。
【０３５５】 最初の注射の４週間後に、全ての被験体に同じ投薬量でブースター接種を受け
させる。
【０３５６】 この研究で測定される終点は、このペプチド組成物の安全性および耐容性、な
らびにその免疫原性に関する。このペプチド組成物に対する細胞の免疫応答は、
このペプチド組成物の内因性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）活性の指標であり、そして
従って、生物学的有効性の測定としてみなされ得る。以下は、安全性および有効
性の終点に関連する臨床的データおよび研究室データを要約する。
【０３５７】 安全性：有害な事象の発生率を、プラシーボ処置グループおよび薬物処置グル
ープでモニターし、そして程度および可逆性の観点から評価する。
【０３５８】 ワクチンの有効性の評価：ワクチンの有効性の評価のために、被験体を、注射
の前および注射の後に出血させる。末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａ
ｑｕｅ密度勾配遠心分離によって新鮮なヘパリン処理した血液から単離し、凍結
媒体中に等分し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬおよびＨＴＬ活性に
ついてアッセイする。
【０３５９】 このワクチンは、安全および有効の両方であることが見出される。
【０３６０】 （実施例１９．ＨＩＶで感染した患者におけるＩＩ期試験） ＣＴＬ−ＨＴＬペプチド組成物のＨＩＶ感染患者への投与の効果を研究するた
めに、ＩＩ期試験を行う。この試験の主な目的は、慢性的に感染したＨＩＶ患者
においてＣＴＬを誘導するために効率的な用量およびレジメンを決定すること、
これらの患者におけるＣＴＬおよびＨＴＬ応答の誘導の安全性を証明すること、
およびウイルス負荷における減少およびＣＤ４+細胞の数における増加によって
明らかにされるように、慢性的に感染したＨＩＶ患者の臨床画像を改善するＣＴ
Ｌの活性化の程度を見ることである。このような研究は、例えば以下のように設
計される： この研究は、複数の中央施設（ｃｅｎｔｅｒ）で行われる。この試験設計は、
開放性標識（ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ）で非管理の用量段階的プロトコールであり
、ここでこのペプチド組成物は単一用量として投与され、その６週間後に同用量
の単一のブースターを投与する。この投薬量は、１回の注射当たり５０、５００
および５，０００マイクログラムである。薬物に関連する有害な効果（重症度お
よび可逆性）を記録する。
【０３６１】 ３つの患者分類が存在する。最初のグループは、５０マイクログラムのペプチ
ド組成物を注射され、第２および第３のグループは、それぞれ５００および５，
０００マイクログラムのペプチド組成物を注射される。各グループの患者は、２
１〜６５歳の範囲（男性および女性の両方を含む）であり、そして多様な民族的
背景を表す。この患者の全てを５年間にわたってＨＩＶで感染させ、そしてこの
患者はＨＣＶ、ＨＢＶおよびデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）陰性であるが、陽性
レベルのＨＩＶ抗原を有する。
【０３６２】 このペプチド組成物の投与の効果を評価するために、ウイルス負荷およびＣＤ
４+レベルをモニターする。このワクチン組成物は、ＨＩＶ感染の処置において
安全および有効の両方であることが見出される。
【０３６３】 （実施例２０．プライムブーストプロトコールを用いるＣＴＬ応答の誘導） プライムブーストプロトコールはまた、ヒトへのこのワクチンの投与のために
使用され得る。このようなワクチンレジメンは、例えば、裸のＤＮＡの最初の投
与、続いてこのワクチンをコードする組換えウイルス、あるいはアジュバントに
おいて投与される組換えタンパク質／ポリペプチドまたはペプチド混合物を使用
するブーストを含み得る。
【０３６４】 例えば、最初の免疫を、複数の部位に０．５〜５ｍｇの量でＩＭ（あるいはＳ
ＣまたはＩＤ）で投与される裸の核酸の形態の発現ベクター（例えば、実施例１
１において構築される発現ベクター）を使用して行う。この核酸（０．１〜１０
００μｇ）をまた、遺伝子銃を使用して投与し得る。３〜４週間のインキュベー
ション期間の後、ブースター用量を投与する。このブースターは、例えば５−１
０7〜５×１０9ｐｆｕの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスである。代替的な
組換えウイルス（例えば、ＭＶＡ、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、また
はアデノ随伴ウイルス）をまた、ブースターについて使用し得るか、あるいはこ
のポリエピトープ性タンパク質またはこのペプチドの混合物を、投与し得る。ワ
クチンの有効性の評価のために、患者の血液サンプルを免疫の前、ならびに最初
のワクチンおよびこのワクチンのブースター用量の投与の後の間隔に得る。末梢
血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって新鮮な
ヘパリン処理した血液から単離し、凍結媒体中に等分し、そして凍結保存する。
サンプルを、ＣＴＬおよびＨＴＬ活性についてアッセイする。
【０３６５】 この結果の分析は、ＨＩＶに対する防御免疫を達成するために十分な大きさの
応答が作製されていることを示す。
【０３６６】 （実施例２１．樹状細胞を使用するワクチン組成物の投与） 本発明のペプチドエピトープを含むワクチンを、ＡＰＣ、またはＤＣのような
「専門的」ＡＰＣを使用して投与し得る。この実施例において、ペプチドパルス
されたＤＣを患者に投与して、インビボでＣＴＬ応答を刺激する。この方法にお
いて、樹状細胞を単離し、拡大し、そして本発明のペプチドＣＴＬおよびＨＴＬ
エピトープを含むワクチンでパルスする。この樹状細胞を患者に注入して戻して
、インビボのＣＴＬおよびＨＴＬ応答を誘発する。次いで、この誘導されたＣＴ
ＬおよびＨＴＬは、このワクチン中のエピトープが誘導されるタンパク質を保有
する特定の標的細胞を破壊するか、またはこの標的細胞の破壊を促進する。
【０３６７】 例えば、エピトープ保有ペプチドのカクテルを、ＰＢＭＣ、またはそれから単
離されるＤＣにエキソビボで投与する。ＤＣの収集を容易にするための薬学（ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎTM（Ｍ
ｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）を
使用し得る。ペプチドでＤＣをパルスした後かつ患者に再注入する前に、このＤ
Ｃを洗浄して未結合ペプチドを除去する。
【０３６８】 臨床的に理解されるように、そして臨床的結果に基づいて当業者によって容易
に決定されるように、患者に再注射されたＤＣの数は変化し得る（例えば、Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：３２８，１９９８；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：５２，
１９９６およびＰｒｏｓｔａｔｅ ３２：２７２，１９９７を参照のこと）。患
者当り２〜５０×１０6ＤＣが代表的に投与されるが、より大きい数のＤＣ（例
えば、１０7または１０8）もまた提供され得る。このような細胞集団は、代表的
に５０〜９０％間のＤＣを含む。
【０３６９】 いくつかの実施形態においては、ペプチド負荷ＰＢＭＣをＤＣの精製なしで患
者に注射する。例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎTMなどの薬剤を使用して
処理後に産生された、ＤＣを含むＰＢＭＣを、ＤＣを精製せずに、患者に注射す
る。投与されたＰＢＭＣの総数は、しばしば、１０8〜１０10まで変化する。一
般的に、患者に注射される細胞用量は、例えば、特異的な抗ＤＣ抗体を用いる免
疫蛍光分析によって決定されるような、各患者の血液中のＤＣの割合に基づく。
従って、例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎTMが、所定の患者の末梢血液に
おける２％ＤＣを動員し、その患者が、５×１０6ＤＣを受容する場合、この患
者は、総量２．５×１０8ペプチド負荷ＰＢＭＣで注射される。Ｐｒｏｇｅｎｉ
ｐｏｉｅｔｉｎTMなどの薬剤によって動員される％ＤＣは、代表的には、２〜１
０％の間であると推定されるが、当業者によって理解されるように変化し得る。
【０３７０】 （ＣＴＬ／ＨＴＬ応答のエキソビボ活性化） あるいは、ＨＩＶ抗原に対するエキソビボＣＴＬまたはＨＴＬ応答は、ＡＰＣ
の供給源（例えば、ＤＣ）および適切な免疫原性ペプチドと共に患者または遺伝
的に適合性のＣＴＬまたはＨＴＬ前駆細胞を組織培養の際に、インキュベートす
ることによって誘導され得る。適切なインキュベーション時間後（代表的には、
約７〜２８日間）（ここで、前駆細胞は活性化され、そして、エフェクター細胞
へと増殖する）、細胞を患者に注入し戻す（ここで、エフェクター細胞は、これ
らの特異的な標的細胞を破壊するかまたはその破壊を容易にする）。
【０３７１】 （実施例２２．モチーフ保有ペプチドの同定の代替的な方法） モチーフ保有ペプチドを同定する別の方法は、規定されたＭＨＣ分子を保有す
る細胞からこれらを溶出することである。例えば、組織分類に使用されるＥＢＶ
形質転換Ｂ細胞株は、どのＨＬＡ分子をこれらが発現するかを決定するために広
範に特徴付けられている。特定の場合において、これらの細胞は、ＨＬＡ分子の
単一の型のみを発現する。次いで、これらの細胞は、病原性生物によって感染さ
れ得るかまたは目的の抗原（例えば、ＨＩＶ調節または構造タンパク質）を発現
する核酸でトランスフェクトされ得る。その後、感染の結果として（またはトラ
ンスフェクションの結果として）産生されたペプチドの内因性抗原のプロセシン
グによって産生されたペプチドは、細胞内のＨＬＡ分子に結合し、そして輸送さ
れ、そして細胞表面に提示される。
【０３７２】 次いで、ペプチドを穏やかな酸性条件に曝すことによって、ＨＬＡ分子から溶
出し、そして、これらのアミノ酸配列を、例えば、質量スペクトル分析（例えば
、Ｋｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３，１９９４）によって決
定した。特定のＨＬＡ分子に結合する大部分のペプチドはモチーフを保有してい
るので、このことは、細胞上に発現される特定のＨＬＡ分子と相関するモチーフ
保有ペプチドを獲得するための代替的な様式である。
【０３７３】 あるいは、いかなる内因性ＨＬＡ分子も発現しない細胞株は、単一のＨＬＡ対
立遺伝子をコードする発現構築物でトランスフェクトされ得る。次いで、これら
の細胞は、記載されるように使用され得る（すなわち、これらは、細胞の表面に
提示された目的の病原体または抗原に対応するペプチドを単離するために、目的
の抗原をコードする核酸を有する病原体生物で感染され得るかまたは目的の抗原
をコードする核酸でトランスフェクトされ得る）。このような分析から得られた
ペプチドは、細胞中で発現される単一のＨＬＡ対立遺伝子への結合に対応するモ
チーフを保有する。
【０３７４】 当業者によって理解されるように、当業者は、１より多くのＨＬＡ対立遺伝子
を保有する細胞に対して同様の分析を行ない得、続いて、発現される各ＨＬＡ対
立遺伝子に特異的なペプチドを決定し得る。さらに、当業者はまた、感染または
トランスフェクション以外の手段（例えば、タンパク質抗原の負荷）が抗原の供
給源を細胞に提供するために使用され得ることを認識する。
【０３７５】 上記実施例は、本発明を例示するために提供されるのであって、その範囲を制
限するためではない。例えば、主要組織適合遺伝子複合体（すなわち、ＨＬＡ）
についてのヒトの専門用語が、この文書の全体で使用される。これらの原則が他
の種に対してもまた及び得ることが理解される。従って、本発明の他の改変体は
、当業者にとって容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲によって含まれる
。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的
のために本明細書中で参考として援用される。
【０３７６】 （表Ｉ）
【０３７７】
【表１】
【０３７８】 太文字の残基が好ましく、イタリック体の残基はさほど好ましくない：上記の表
に示されるように、ペプチドが、モチーフまたはスーパーモチーフの各主要なア
ンカー位置に主要なアンカーを有する場合、ペプチドはモチーフ保有であるとみ
なされる。
【０３７９】 （表Ｉａ）
【０３８０】
【表２】
【０３８１】* ２がＶまたはＱの場合、Ｃ末端はＬではない。 太文字の残基が好ましく、イタリック体の残基はさほど好ましくない：上記の表
に示されるように、ペプチドが、モチーフまたはスーパーモチーフの各主要なア
ンカー位置に主要なアンカーを有する場合、ペプチドはモチーフ保有であるとみ
なされる。
【０３８２】 （表ＩＩ）
【０３８３】
【表３】
【０３８４】
【０３８５】
【０３８６】
【０３８７】
【０３８８】
【０３８９】 イタリック体の残基は、さほど好ましくないかまたは「許容的な」残基を示す。
表ＩＩの情報は、他に示されない限り、９マーに特異的である。
【０３９０】 （表ＩＩＩ）
【０３９１】
【表４】
【０３９２】 イタリック体の残基は、さほど好ましくないかまたは「許容的な」残基を示す。
【０３９３】 （表ＩＶ．ＨＬＡクラスＩ標準ペプチド結合親和性）
【０３９４】
【表５】
【０３９５】 （表Ｖ．ＨＬＡクラスＩＩ標準ペプチド結合親和性）
【０３９６】
【表６】
【０３９７】 「命名」欄は、表ＸＩＸおよびＸＸにおいて使用される対立遺伝子の名称を列挙
する。
【０３９８】
【表７】
【０３９９】
【表８】
【０４００】
【０４０１】
【０４０２】
【０４０３】
【０４０４】
【０４０５】
【０４０６】
【０４０７】
【０４０８】
【表９】
【０４０９】
【０４１０】
【０４１１】
【０４１２】
【０４１３】
【０４１４】
【０４１５】
【０４１６】
【０４１７】
【０４１８】
【０４１９】
【０４２０】
【０４２１】
【０４２２】
【０４２３】
【０４２４】
【０４２５】
【０４２６】
【０４２７】
【０４２８】
【０４２９】
【０４３０】
【０４３１】
【０４３２】
【０４３３】
【０４３４】
【０４３５】
【０４３６】
【０４３７】
【０４３８】
【０４３９】
【０４４０】
【０４４１】
【０４４２】
【０４４３】
【０４４４】
【０４４５】
【０４４６】
【０４４７】
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【０４５０】
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【０４５３】
【０４５４】
【０４５５】
【表１０】
【０４５６】
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【表１１】
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【０６０８】
【０６０９】
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【０６１１】
【０６１２】
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【０６１６】
【０６１７】
【０６１８】
【０６１９】
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【０６２１】
【０６２２】
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【０６５０】
【０６５１】
【０６５２】
【０６５３】
【０６５４】
【０６５５】
【０６５６】
【表１９】
【０６５７】
【０６５８】
【０６５９】
【０６６０】
【０６６１】
【０６６２】
【０６６３】
【表２０】
【０６６４】
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【０６６９】
【０６７０】
【０６７１】
【０６７２】
【０６７３】
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【表２１】
【０６７５】
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【０６７８】
【０６７９】
【０６８０】
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【０６８２】
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【表２２】
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【０７００】
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【０７１０】
【表２８】
【０７１１】
【表２９】
【０７１２】
【表３０】
【０７１３】
【表３１】
【０７１４】
【０７１５】
【表３２】
【０７１６】
【表３３】
【０７１７】
【表３４】
【０７１８】
【表３５】
【０７１９】
【表３６】
【０７２０】
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【表３８】
【０７２２】
【表３９】
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【表４０】
【０７２４】
【表４１】
【０７２５】
【表４２】
【０７２６】
【表４３】
【０７２７】
【表４４】
【０７２８】
【表４５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、平均集団における、ＨＬＡ−Ａ分子およびＨＬＡ−Ｂ分子によって結
合されるＰＦ候補エピトープの数の関数としての、遺伝子型の総頻度のグラフを
提供する。
【図２】 図２は、実験モデルミニ遺伝子構築物における、ペプチドエピトープの位置を
例示する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/08 7/08 14/16 14/16 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｋ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ０７Ｋ 14/47 // Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 サウスウッド， スコット アメリカ合衆国 カリフォルニア 92071， サンティー， ストラスモア ドライブ 19679 (72)発明者 リビングストン， ブライアン ディー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92129， サン ディエゴ， チャコ コート 13555 (72)発明者 チェスナット， ロバート アメリカ合衆国 カリフォルニア 92007， カーディフ−バイ−ザ−シー， キング ス クロス ドライブ 1473 (72)発明者 ベイカー， デニース マリエ アメリカ合衆国 カリフォルニア 92126， サン ディエゴ， カミニト ラバー ナンバー21 11575 (72)発明者 セリス， エステバン アメリカ合衆国 ミネソタ 55902， ロ チェスター， ライト ロード エス．ダ ブリュー． 3683 (72)発明者 クボ， ラルフ ティー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92009， カールスバッド， ペア ツリー ドラ イブ 6921 (72)発明者 グレイ， ホワード エム． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037， ラ ホヤ， カミニト バテア 1461 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CA18 DA36 FA11 FB08 4B024 AA01 BA35 CA02 DA02 HA17 4C085 AA03 AA04 BA69 BB11 CC08 DD62 EE01 EE03 EE05 4H045 AA10 AA30 BA10 BA60 CA05 CA40 DA86 EA29 FA74

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 調製されたヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）エピト
    ープを含む組成物であって、該エピトープが、以下の配列： 【化１】 からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、組成物。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の群から選択される２個のエピトープを含む
    、請求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の群から選択される３個のエピトープを含む
    、請求項１に記載の組成物。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、以下： 【化２】 からなる群から選択される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをさらに
    含む、組成物。
  5. 【請求項５】 前記組成物がヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープをさ
    らに含む、請求項１に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 前記ＨＴＬエピトープが、汎ＤＲ結合分子である、請求項５
    に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 前記エピトープが、リポソーム上またはリポソーム内にある
    、請求項１に記載の組成物。
  8. 【請求項８】 前記ペプチドが脂質に結合されている、請求項１に記載の組
    成物。
  9. 【請求項９】 前記エピトープが、ＨＬＡ重鎖とβ２−ミクログロブリンと
    ストレプトアビジンとの複合体に結合され、それによってテトラマーを形成する
    、請求項１に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 前記エピトープが、抗原提示細胞上のＨＬＡ分子に結合さ
    れている、請求項１に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の組
    成物。
  12. 【請求項１２】 前記組成物が薬学的賦形剤をさらに含む、請求項１に記載
    の組成物。
  13. 【請求項１３】 前記エピトープが単位用量形態である、請求項１に記載の
    組成物。
  14. 【請求項１４】 前記エピトープが、該エピトープをコードする組換え核酸
    分子から発現される、請求項１に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項１に記載の調製されたエピトープをコードする組換
    え核酸分子を含む、発現ベクター。
  16. 【請求項１６】 組成物であって、該組成物は、以下： 【化３】 からなる群から選択される、少なくとも２個のヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩ
    Ｖ−１）ペプチドエピトープを含む、５００個未満のアミノ酸残基の調製された
    ペプチドを含み、ここで該ペプチドは、ネイティブなペプチド配列との１００％
    同一性を有する５０個未満連続したアミノ酸を含む、組成物。
  17. 【請求項１７】 少なくとも２個のエピトープが、スペーサーを介して連結
    されている、請求項１６に記載の組成物。
  18. 【請求項１８】 第３のエピトープをさらに含む、請求項１６に記載の組成
    物。
  19. 【請求項１９】 前記第３のエピトープが、以下： 【化４】 からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
  20. 【請求項２０】 ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープである第３のエ
    ピトープをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
  21. 【請求項２１】 前記ＨＴＬエピトープが、汎ＤＲ結合分子である、請求項
    ２０に記載の組成物。
  22. 【請求項２２】 前記ペプチドが、リポソーム上またはリポソーム内にある
    、請求項１６に記載の組成物。
  23. 【請求項２３】 前記ペプチドが脂質に結合されている、請求項１６に記載
    の組成物。
  24. 【請求項２４】 前記ペプチドが、請求項１６に記載の群における少なくと
    も３個のエピトープをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
  25. 【請求項２５】 前記ペプチドが、請求項１６に記載の群における少なくと
    も４個のエピトープをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
  26. 【請求項２６】 前記ペプチドが、請求項１６に記載の群における少なくと
    も５個のエピトープをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
  27. 【請求項２７】 前記ペプチドが、請求項１６に記載の群における少なくと
    も６個のエピトープをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
  28. 【請求項２８】 前記組成物が薬学的賦形剤をさらに含む、請求項１６に記
    載の組成物。
  29. 【請求項２９】 さらに前記ペプチドが単位用量形態である、請求項１６に
    記載の組成物。
  30. 【請求項３０】 前記ペプチドが、該ペプチドをコードする組換え核酸から
    発現される、請求項１６に記載の組成物。
  31. 【請求項３１】 請求項１６に記載の調製されたペプチドをコードする組換
    え核酸を含む、発現ベクター。
  32. 【請求項３２】 調製されたヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）エピ
    トープを含む組成物であって、該エピトープは、表ＶＩＩ〜ＸＸにおいて示され
    る配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、組成物。
  33. 【請求項３３】 前記組成物が表ＶＩＩ〜ＸＸにおいて示される配列からな
    る群から選択されるアミノ酸配列からなる、さらなるエピトープを含む、請求項
    ３２に記載の組成物。
  34. 【請求項３４】 前記エピトープが、該エピトープをコードする組換え核酸
    分子から発現される、請求項３２に記載の組成物。
  35. 【請求項３５】 表ＶＩＩ〜ＸＸにおいて示される配列からなる群から選択
    される、少なくとも２個のヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）ペプチドエ
    ピトープを含む、５００個未満のアミノ酸残基の調製されたペプチドを含む、組
    成物。
  36. 【請求項３６】 前記調製されたペプチドが、該ペプチドをコードする組換
    え核酸分子から発現される、請求項３５に記載の組成物。
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