KR101476255B1 - HIV-l 유래 T 세포 항원결정기를 갖는 재조합 펩타이드 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

HIV-l 유래 T 세포 항원결정기를 갖는 재조합 펩타이드 및 이를 포함하는 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한국인 HIV-l 감염 환자로부터 유래한 T 세포 항원결정기를 포함하는 재조합 펩타이드를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용하여 HIV-1 감염증을 예방, 진단 및 치료하는 방법을 제공한다. 상기 본 발명을 이용하여 한국인 HIV-1 감염 환자들로부터 세포성 면역 반응 유도 활성을 확인하였다.

Description

HIV-l 유래 T 세포 항원결정기를 갖는 재조합 펩타이드 및 이를 포함하는 백신 조성물 {Recombinant peptide having T cell epitope derived from HIV-1 and vaccine composition comprising thereof}
본 발명은 한국인 HIV-l 감염 환자로부터 유래한 T 세포 항원결정기를 포함하는 재조합 펩타이드 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용하여 HIV-1 감염증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency virus, HIV)는 인간의 면역 시스템에서 벗어나기 위해 빠르게 진화하고 있으며，HIV 변이는 숙주의 면역반응과 밀접한 연관성이 있는 것으로 보고되고 있다. HIV 특이적인 세포독성 T 세포 반응은 HIV 초기 감염에서 바이러스 복제를 억제하는 숙주의 면역반응에서 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다. 세포 독성 T 세포는 HIV가 감염된 세포를 T 세포 수용체를 통하여 인식하고 감염된 세포의 표면에 Human leukocyte antigen (HLA) classⅠ 분자에 바이러스성 펩타이드가 제시되면 감염된 세포를 인식하여 바로 사멸시키거나 IFN-γ와 다양한 사이토카인(cytokine)을 분비하여 숙주의 면역반응을 증가시킨다. 이와 같은 숙주의 면역반응은 바이러스 진화에 대한 강력한 선택압으로 작용하며, 이는 세포독성 T 세포 회피 돌연변이로 인한 다양한 변이주들의 출현을 유도하게 된다.
HIV의 감염으로 인해 숙주에서 유도되는 면역반응의 연구에서 중요하게 고려되는 부분이 항원결정기(epitope)이다. 숙주 외부에서 유입된 항원은 다수의 분자적 결합 부위를 가지므로 숙주가 만들어내는 항체의 표적이 되고, 항원상에 존재하는 항원결정기가 다양한 정도의 친화력을 가지는 다클론성 항체의 생산을 자극하여 숙주의 면역반응을 활성화시킨다. 즉, 항원결정기는 면역계가 항원을 식별할 수 있게 해주는 항원의 특정 부분으로 HIV 감염 시 숙주에서 유도되는 면역반응을 이해하는데 필수적인 요소이다. 따라서 이러한 항원이 지니는 항원결정기의 정확한 식별은 감염으로 인한 숙주의 면역반응을 이해하는데 큰 도움을 주며，특히 T 세포 항원결정기의 식별은 재조합 서브유닛 백신의 효과를 평가하고，펩타이드 기반의 백신을 개발하는데 중요한 정보를 제공한다.
1985년 국내에서 HIV 감염인이 최초로 보고된 이후 HIV 유전자는 변이를 거듭하면서 수렴진화하고 있다. 이는 숙주에 대한 HIV의 진화론적인 투쟁의 결과로서 일정 집단에서 확산되고 있는 바이러스는 특정한 숙주의 유전적，면역학적 특성에 저항할 수 있도록 돌연변이가 나타난다. 그 결과 현재 국내에서 전파되고 있는 HIV는 대부분이 HIV-1 서브타입 B로 이중 약 80% 정도가 한국인 클레이드(Korean c1ade) B라는 독특한 군집을 이루고 있으며 나머지는 외국에서 분리된 HIV-1 서브타입 B와 계통학적으로 유사한 HIV-1 서브타입 B로 알려져 있다. 따라서 국내에서 토착화되어 고유한 영역을 구축하고 있는 HIV-1 한국인 클레이드 B 바이러스가 한국인 HLA에 대한 공통 세포독성 T 세포의 세포성 면역반응을 유도하는 항원결정기를 찾는 것이 필요하다.
이에 본 발명자들은 한국인 HIV-1 분리주의 env 단백질로부터 신규한 T 세포 항원결정기를 확인하고자 노력한 결과, 한국인 HLA에 있어 공통 세포독성 T 세포의 세포성 면역반응을 유도하는 항원결정기를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
이와 같이, 본 발명은 HIV-1 한국인 클레이드 B 바이러스로부터 유래된 항원결정기로서, 한국인에 대해 공통 세포독성 T 세포의 세포성 면역반응을 유도하는 항원결정기를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 T 세포 항원결정기를 갖는 재조합 펩타이드를 포함하는 HIV 감염의 예방, 치료 및 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 펩타이드를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 재조합 펩타이드는 HIV-1 바이러스로부터 유래한 T 세포 항원결정기(epitope)로 기능할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 펩타이드는 HIV-1 전장유전자 서열 및 ORF 검색 프로그램을 이용하여 각 유전자 부위를 분석한 후, 이중 env 유전자 서열로 확인된 부위를 단백질 서열로 번역하고, 확인된 env 단백질 서열을 HIV 데이터베이스의 HIV 블라스트(blast)를 통해 확인할 수 있다. 상기 env 단백질은 gp160일 수 있고, HIV 데이터베이스는 로스알라모스 HIV 데이터베이스일 수 있다. 이러한 과정을 통해 분석한 아미노산 서열로부터 T 세포 항원결정기 후보를 선정할 수 있으며, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 보다 강력한 항원결정기를 선정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, HIV-1 바이러스는 HIV-1 한국인 클레이드 B 바이러스일 수 있다. 본 발명에 있어서, 항원결정기는 HIV-1 한국인 클레이드 B 바이러스가 한국인 HLA(human leukocyte antigen)에 대한 공통 세포독성 T 세포의 세포성 면역반응을 유도할 수 있다. 이에 따라, HIV-1 감염인의 HLA 타입을 확인할 수 있다. 본 발명에 있어서, HLA 타입핑은 HIV-1 감염인의 HIV-1 감염인의 말초혈액단핵세포(periphera1 blood mononuclear cell; PBMC)로부터 정제한 게노믹 DNA(genomic DNA)를 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, Sequence based typing(SBT) 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 펩타이드는 HIV-1 감염인의 HLA 타입이 일치하는 경우 또는 불일치하는 경우 모두 세포성 면역 반응 유도 활성을 가질 수 있다. 본 발명에 있어서, T 세포 항원결정기는 상기 재조합 펩타이드에 의한 세포성 면역 반응 여부를 통해 확인할 수 있다. 세포성 면역반응은 예를 들어, ELISPOT(Enzyme-linked Immunospot) 방법을 이용하여 측정할 수 있다. ELISPOT은 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 변형한 것으로서, 특정항원에 의해 활성화되어 사이토카인을 발현하는 말초혈개단구의 수를 측정하여 항원 특이적 T 세포 반응을 정량화할 수 있다(Karsson RK et. al., Poorly soluble peptides can mimicauthentic ELISPOT response, J Immunol Methods 285:89-92, 2004).
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 따른 재조합 펩타이드를 포함하는, HIV 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 백신 조성물을 제공한다. 백신 조성물 투여량내의 항원의 양은 통상적 백신에 있어서 현저한 부작용없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 특정 면역원의 사용에 따라 다를 수 있다. 특정 백신의 최적량은 항체 역자 및 피험자의 기타 반응의 관찰을 포함한 표준 연구에 의해 확인할 수 있다. 초기 백신접종에 이어서, 피험자는 약 4주내에 추가면역될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 펩타이드를 엔코딩하는 DNA를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 펩타이드를 합성하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 합성된 재조합 펩타이드의 순도는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98%이상일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조합 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "HIV-1 감염"은 HIV-1 바이러스에 대해 양성적으로 그리고 정확하게 진단받고, HIV-1 감염이 후속 관련 검사를 통해 확진 된 경우를 의미한다. 예를 들어, HIV-1 감염 개체는 몇몇 매개변수, 예를 들면, 바이러스 존재 량, CD4 T 세포 수 또는 AIDS의 임상 증상에 따라 분류될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "진단"은 HIV-1에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 정하거나, 개체가 HIV-1에 감염되었는지 여부를 판정하거나 HIV-1에 감염된 개체의 예후를 판정하거나 또는 테라메트릭스(theramatrix) 하는 것을 포함한다. 상기 용어 "예후"는 HIV-1 감염 환자에서 AIDS 발명 또는 AIDS로 진행될 위험성을 평가하기 위한 가능성을 의미한다. 상기 용어 "테라메트릭스"는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다.
본 발명은 달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 공학 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 본 발명을 실시하기 위한 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.
또한, 본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 본 발명에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당 업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 기술된 용어는, 당업자가 사용하는 맥락에 따라 다양하게 사용될 수 있으므로, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
본 명세서에서, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 카르복실 방향으로 이해된다. 본 명세서에서 제시될 수 있는 수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 본 명세서에서 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 제시되어 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 마찬가지로 본 명세서에서 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 제시되어 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 제시되어 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수지 범위를 포함할 것이다. 본 명세서에 기술된 발명의 명칭, 다양한 면 또는 구체예는 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "정량화"는 특정 단백질에 대한 임의의 적절한 유용한 측정을 포함하는 것으로 용어 "수량화"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 정량화 방법은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 다른 방법이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "통계학적으로 유의한(statistically significant)"은 얻어진 결과가 특정 확률 수준에서 우연한 변동에 기인한 것이 아니라는 것을 의미하고, 본 명세서에서 사용되는 한, 0.05(p = 0.05) 이하의 유의성 수준 또는, 100분의 5 미만의 오차 확률을 의미한다.
이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 재조합 펩타이드는, HIV-1 유래 재조합 T 세포 항원결정기를 이용하여 HIV-l 감염환자의 세포성 면역 반응을 유도함으로써, HIV-l 치료에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 제조합 펩타이드는 HIV-1 바이러스에 의해 유도되는 면역 반응에 대한 효과적인 연구 수행을 가능하게 하여, HIV-l 백신 및 치료제 개발에 이용될 수 있다. 또한, 외국에서 개발된 백신의 국내 적용 여부, 백신 투여 대상군 결정 등에 자료를 제공함으로써 HIV-l 치료에 소비되는 경제적 손실을 줄일 수 있을 것이다.
도 1은 예측된 펩타이드의 전체원자기반 시뮬레이션 안정성 결과 및 삼차원 결합모형을 보여주는 것으로서, A는 HLA A*020l, B는 HLA A*2402, C는 HLA B*1501형과 결합하는 펩타이드의 결합 에너지 및 결합모형을 보여준다.
도 2는 새로 도출한 항원결정기와 기존에 밝혀진 항원결정기와 비교한 것으로 로스알라모스 HIV 데이터베이스에 있는 기존의 HIV-1 env 부위의 항원결정기와 새로 도출한 3 종의 항원결정기를 비교하여 보여준다. 비교 결과 펩타이드 3의 경우 이미 밝혀진 항원결정기임을 확인한 반면 펩타이드 4와 펩타이드 6은 기존의 항원결정기와 다른 새로운 항원결정기로 확인되었다.
도 3은 항원결정기 후보인 3종류 펩타이드의 세포성 면역반응 분석을 위해 수행한 사람 IFN-γ ELISOPT 분석 결과 이미지이다. HIV-l 감염 환자의 말초혈액단핵세포를 일정량 넣고 펩타이드를 처리한 결과, 스폿(spot) 들이 나타나는 것을 확인하였다. A와 B는 14개의 잔여 검체를 이용한 사람 IFN-γ ELISOPT 어세이 결과이고, C는 울산대학교 병원에서 제공받은 7개의 검체를 이용한 사람 IFN-γ ELISOPT 어세이 결과이다.
도 4는 항원결정기 후보인 3종류의 펩타이드를 이용하여 세포성 면역반응을 분석한 결과이다. A는 14개의 잔여검체를 이용한 결과이고 B는 울산대학교 병원으로부터 제공받은 7개의 검체를 이용한 결과이다. 3종류의 펩타이드 (peptide 3, peptide 4, peptide 6)을 HIV-l 감염 환자에서 분리한 말초혈액단핵세포에 처리한 결과 환자에 따라 반응하는 펩타이드가 다르고，세포성 면역 반응 유도 능력도 다르게 나타나는 것으로 확인되었다.
도 5는 21개 검체의 HLA 타입과 사람 IFN-γ ELISOPT 어세이 결과를 통해 HLA 타입과 각각의 펩타이드들의 세포성 면역 반응 유도 활성과의 상관관계를 분석한 결과이다. A는 펩타이드 3과 B는 펩타이드 4, C는 펩타이드 6의 HLA 타입과의 상관관계를 분석하였다.
실시예 1
한국인 HIV -1 클론으로부터 env 단백질 서열 분석
한국질병관리본부가 보유 중인 7개의 HIV-l 전장유전자 서열을 이용하였다. ORF 검색 프로그램을 실행하여 각 유전자 부위를 찾고 그 중 env 유전자 서열을 확인한 다음 이를 단백질 서열로 번역하였다. 수득한 env (gp160) 단백질 서열을 로스알라모스 HIV 데이터베이스의 HIV 블라스트를 통해 확인하였다. 표 1은 7개의 env 단백질 서열을 나타낸 것이다.
표 1. 선정된 7개 env 단백질 서열
Figure 112014012422909-pat00001
Figure 112014012422909-pat00002
Figure 112014012422909-pat00003

실시예 2
1차 T세포 항원결정기 선정
HLA 클래스 Ⅰ의 T 세포 항원결정기를 예측 및 분석하기 위한 프로그램으로서, T 세포의 항원작용 기작의 여러 단계를 통합하고 최종 항원결정기를 예측하는 NetCTLpan 1.1 프로그램(http://www.cbs.dtu.dk/services /NetCTLpan/)을 사용하였다. 프로그램에서 예측을 위해 사용하는 프로테아좀/TAP결합/HLA결합(proteasome/TAP binding/HLA binding)을 위한 파라미터 값은, 프로그램에서 제공하는 기본값을 사용하였다. 파라미터 중 HLA 대립유전자에 대한 것은 한국인에서 빈번히 발견되는 종류로 A*020l (A2), A*0206 (A2), A*llOl(A3), A*2402 (A24), A*3303 (A3), B*1501 (B62), B*3501 (B7), B*4002 (B44), B*4403 (B44), B*4601 (B62), B*5101 (B7), B*5401 (B7), B*5801 (B58) 등을 중심으로 하여, 항원결정기 예측에 사용하였다. 또한 항원결정기의 길이는 여러 문헌에서 주로 사용한 나노머(nanomer;9-mer)로 예측을 수행하였다.
이와 같이, NetCTLpan 1.1 프로그램을 이용하여 7인의 한국인 env(gp160) 서열로부터 T세포 항원결정기를 예측 및 분석한 결과는 하기 표 2와 같다. 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 7개 서열에서 총 122개의 1차 항원결정기 후보군을 선정하였다.
표 2. 1차 T 세포 항원결정기 후보군
Figure 112014012422909-pat00004

실시예 3
2차 항원결정기 선정
상기 표 2에 제시된 항원결정기 후보군 중에서, 사용된 7개의 분리주 중 4개 이상의 분리주로부터 유래된 서열로부터 공통적으로 예측된 항원결정기를 강력한 항원결정기 후보로 간주하였다. 표 3은 이러한 기준으로 최종 선정된 8개의 2차 항원결정기 후보군을 나타낸다. 이들 중 4개의 항원결정기가 전체 7개 분리주 서열 가운데 6개 분리주 서열에서 공통적으로 예측되었고，HLA 대립유전자는 A*0201, A*2402, B*5801에 대한 항원결정기로 분석되었다.
표 3. 2차 선정된 T 세포 항원결정기 후보
Figure 112014012422909-pat00005

실시예 4
최종 항원결정기 선정
실시예 3에서 유전자 기반으로 예측 및 분석한 T 세포 항원결정기로부터, 보다 더 강력한 항원결정기를 수득하기 위해, 전체 원자기반 시뮬레이선(full atoms based-simulation)을 이용하였다. HLA 대립유전자와 실시예 3에서 수득한 2차 항원결정기를 이용하고 www.biomapstore.com 에서 제공하는 프로그램을 사용하여 분석하였다. 표 4는 최종 선정된 3개의 항원결정기를 Pep3, Pep4(서열번호: 1), 및 Pep6(서열번호: 2)으로 나타내고, 이들 각각이 특이적으로 결합하는 HLA 대립유전자를 함께 제시한다.
도 1에 나타난 바와 같이, HLA-A의 경우 펩타이드4(Pep4)와 HLA-A0201, 펩타이드3(Pep3)과 HLA-A2402가 가장 낮은 에너지를 주면서 결합하는 것으로, HLA-B의 경우에는 펩타이드 3(Pep3)와 HLA-B1501에 가장 낮은 에너지를 주면서 결합하는 것으로 계산되었다.
표 4. 예측된 펩타이드와 HLA 타입에 따른 안정성 비교
Figure 112014012422909-pat00006

실시예 5
최종 항원결정기의 특이성 확인
실시예 4에서 최종 선정된 3 종류의 항원결정기가 새로 밝혀진 항원결정기 인지 확인하기 위해 로스알라모스 HIV 분자생물학 데이터베이스(Los Alamos HIV Molecular Immunology database)에 있는 기존에 밝혀진 HIV-1 항원결정기와 비교하였다. 그 결과, 도 2에서 나타나 있는 바와 같이, peptide 3은 기존에 밝혀진 항원결정기로 확인되었고, peptide 4와 peptide 6은 새로 발견한 항원결정기임을 확인하였다.
실시예 6
HIV -1 감염인의 HLA 타입 확인
상기 실시예 4에서 도출한 최종 항원결정기 후보의 세포성 면역 반응 유도 활성을 확인하기 위해 질병관리본부 에이즈종양바이러스과에 2013년도에 HIV-1 확인 진단을 위해 제공받은 잔여검체 14종과 울산의대 병원에서 제공한 7명의 HIV-1 감염인의 혈액을 대상으로 하였다. 이때 사용한 21 개의 HIV-1 감염인의 HLA 타입을 확인하기 위해 sequence-based typing(SBT) 방법을 이용해 HLA 타입을 확인하였다. 본 발명에서는 AVITATM HLA-A SBT 및 AVITATM HLA-B SBT 제품(바이오위더스 ㈜)을 사용하였다. HLA-A 및 HLA-B 유전자에 특이적으로 반응하는 프라이머가 들어 있는 PCR mixture에 HIV-1 감염인의 PBMCs에서 분리한 게노믹 DNA를 넣은 후 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 전기영동으로 확인한 후 PCR 산물을 정제한 후 HLA-A 및 HLA-B 유전자의 유전자 서열을 분석하여 HLA 타입을 확인하였다. 표 5 는 잔여검체 14종(P1~14)과 울산의대 병원에서 제공한 혈액(P15~P21)의 HLA 타입을 나타낸 것이다.
표 5. HIV-1 감염인들의 HLA 타입 확인
Figure 112014012422909-pat00007
실시예 7
세포면역 유도 반응 실험
(1) 재조합 항원결정기 펩타이드의 제조
상기 실시예 4에서 도출한 최종 항원결정기 후보 3종류 (Pep3, Pep4, Pep6)를 대상으로 세포성 면역반응 유도 활성을 확인하기 위해, 먼저 재조합 T 세포 항원결정기를 제조하였다. 3종류의 항원결정기 아미노산 서열을 코스모진텍 회사에 제공하여 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드 합성 조건은 순도 90 % 이상으로 5~9 mg 정도로 합성하였다.
(2) 세포면역 유도 반응 실험
말초혈액단구세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)의 분리
질병관리본부 에이즈종양바이러스과에 2013년도에 HIV-1 확인 진단을 위해 제공받은 잔여검체 14종과 울산의대 병원에서 제공한 7명의 HIV-1 감염인의 혈액을 대상으로 하였다.
채혈한 혈액에서 Ficoll-Hypaque 1.077을 이용해 밀도구배 원심분리 방법을 통해 PBMCs를 분리하였다. 분리한 PBMCs를 PBS 버퍼로 워싱한 후 실험에 사용하기 전까지 액체질소에 보관하였다(Alexander S. et. al., Application of the IFN-γ ELISPOT assay to quantify T cell responses against proteins, Journal of Immunological Methods 247:17-24, 2001).
(3) HIV 특이 T 세포 면역반응 정량
상기에서 제조한 3종류의 펩타이드를 2 ㎍/㎖ 농도로 상기 분리한 PBMCs에 24 시간 동안 처리하여 세포성 면역 반응에서 나타나는 IFN-γ의 증가 여부를 확인하였다(Agatha M et. al., Hierarchical Targeting of Subtype C Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proteins by C8+ T cells: Correlation with Viral Load, J. Virol. 78:3233-3249, 2004).
이를 위해, T 세포 항원결정기 후보인 3종류의 재조합 펩타이드에 대한 사람 IFN-γ ELISPOT 분석을 수행하였다. HIV-1 감염 환자의 PBMCs를 웰당 1 ×105 개씩 넣고 재조합 펩타이드를 2 ㎍/㎖로 처리한 결과, 스폿(spot)들이 나타나는 것을 확인하였다. 스폿의 수를 확인하기 위해 ELISPOT 리더기(Cellular Technolgy Limited, Cleveland, USA)를 이용해 이미지를 스캐닝한 후 스폿의 수를 계수하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 3종류의 펩타이드 모두 HIV-l 환자의 말초혈액단핵세포에서 T 세포성 면역반응을 유도하는 한다는 것을 확인하였다.
또한, T 세포 항원결정기 후보인 3종류의 재조합 펩타이드를 이용하여 세포성 면역반응을 분석 결과를 도 4에 나타냈다. 음성대조군으로는 펩타이드를 처리하지 않은 배지를 이용하였다. 3종류의 펩타이드(펩타이드 3, 펩타이드 4, 펩타이드 6)를 HIV-l 감염 환자에서 분리한 말초혈액단핵세포에 처리한 결과, 환자에 따라 반응하는 펩타이드가 다르고，세포성 면역 반응 유도 능력도 다르게 나타나는 것을 확인하였다.
또한, HLA 타입과 각각의 펩타이드들의 세포성 면역 반응 유도 활성과의 상관관계를 분석한 결과를 도 5에 나타냈다. 분석 결과 펩타이드 3, 4, 6 모두 HLA 타입과의 일치와 불일치 모두에서 세포성 면역 반응 유도 활성이 나타났다.
<110> Republic of Korea <120> Recombinant peptide having T cell epitope derived from HIV-1 and vaccine composition comprising thereof <130> 50691 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 4 <400> 1 Leu Leu Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 6 <400> 2 Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe 1 5

Claims (8)

  1. 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 펩타이드를 포함하는, HIV 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 백신 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 재조합 펩타이드는 HIV-1 바이러스로부터 유래한 T 세포 항원결정기인, HIV 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 백신 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 HIV-1 바이러스는 HIV-1 한국인 클레이드 B 바이러스인, HIV 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 백신 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 재조합 펩타이드는 HIV-1 감염인의 HLA 타입이 일치하는 경우 또는 불일치하는 경우 모두에서 세포성 면역 반응 유도 활성을 갖는 것인, HIV 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 백신 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2001024810A1 (en) * 1999-10-05 2001-04-12 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to human immunodeficiency virus-1 using peptide and nucleic acid compositions
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