JP2001505568A - ペプチド特異的т細胞のアッセイ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ペプチドを新鮮な末梢血液単核細胞の液試料に加え、ペプチドに対して前感作されたＴ細胞によって作られたインターフェロン-γなどのサイトカインを検出することを含むペプチド特異的Ｔ細胞のアッセイ方法。アッセイ方法は早くて安く、またＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、結核、マラリア、HIVまたはインフルエンザを含む様々な疾患の状態の研究に有用であると期待される。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド特異的Ｔ細胞のアッセイ方法 本発明は、活性化されたペプチド特異的Ｔ細胞のアッセイ方法に関するもので ある。これは、Immunology、ユニット6.19、ページ6.19.1-8に最近のプロトコー ルが総説されている公知のELISPOTアッセイを発展させたものである。 固相化酵素免疫スポットアッセイ(ELISPOT)とも呼ばれるところのフィルター 免疫プラークアッセイは、元来は個々の抗体分泌Ｂ細胞を検出し定量するために 開発されたものである。この技術が開発されたことによって、従来のプラーク形 成細胞アッセイに代わる迅速かつ多目的の方法が提供された。最近の修正は、毎 秒約100分子という少量の特定の蛋白質を生産する細胞が検出可能となるまでにE LISPOTアッセイの感度を向上させた。これらのアッセイは、蛋白質分泌細胞をと りまく直接の環境での比較的高濃度の特定の蛋白質（たとえばサイトカイン）を 利用している。これらの細胞生産物は捕捉され、そして高親和性抗体を用いて検 出される。 ELISPOTアッセイは、同じサイトカイン分子上の異なるエピトープに対する２ つの高親和性サイトカイン特異性の抗体を用いるもので、それは２つのモノクロ ーナル抗体、または１つのモノクローナル抗体と１つの抗血清の組み合わせであ る。ELISPOTは、単一細胞によって分泌されたサイトカインを検出する呈色反応 に基づくスポットを生成する。このスポットは、もとのサイトカイン生成細胞の「 足跡」をあらわす。スポットは永久的なものであり、肉眼で、顕微鏡で、または 電子的に定量することができる。 ELISPOTアッセイは５つの特異的なステップを含んでいる。すなわち(1)精製し たサイトカイン特異的抗体を、ニトロセルロースで裏打ちしたマイクロタイター プレートに被覆すること；(2)そのプレートを、他の蛋白質の非特異的な吸収か ら防ぐためにブロックすること；(3)サイトカイン分泌細胞を、種々の異なる希 釈度で培養すること；(4)標識された第二の抗サイトカイン抗体を 加えること；および(5)抗体-サイトカイン複合体を検出すること。 本発明において、その手法は、特定のペプチドに対してインビボで前感作され たペプチド特異的Ｔ細胞のアッセイを開発するために用いられてきた。 すなわち本発明は、Ｔ細胞を含む液を提供し、ペプチドをその液に加え、液を 培養してサイトカインを放出させ、そして放出されたサイトカインを検出するこ とを含むペプチド特異的Ｔ細胞のアッセイ方法を提供するものである。好ましく はこの方法は、サイトカインに対する固定化された第一の抗体を担持する表面と Ｔ細胞を含む液を接触させ、ペプチドをその液へ加え、得られた液をサイトカイ ンを分泌するようにペプチドに対してインビボで前感作された(Pre-Sensitised) ペプチド特異的Ｔ細胞を生じる条件下で培養し、そして固定化された第一の抗体 と結合した分泌サイトカインを検出することから成Ｔ細胞を含む液をるものであ る。 細胞は、好ましくは末梢血液単核細胞(PBMC)である。それは、たとえばウイル スのような細胞内病原体による感染にかかっているか又はかかったことが知られ ている患者から適宜採取することができる。新鮮な細胞を用いるのが本発明の好 ましい態様である。何故ならば、インビトロで培養した細胞は、変化した特性が 進行することがあり、すなわちアッセイの診断的価値を減少させるからである。 このアッセイの目的は、特定のペプチドに対してインビボで前感作するかまたは 活性化されたペプチド特異的Ｔ細胞、たとえばCD8+またはCD4+細胞を同定し定量 することである。これらは非再賦活性Ｔ細胞、すなわちインビトロ培養で分裂/ 分化を生じる必要のない即時型エフェクター機能の能力のある細胞である。問題 のペプチドがそのような細胞に存在するときは、それらの細胞は種々のサイトカ インを分泌し、それらのうち何れか１つが本アッセイの目的のために選択される 。選択されるサイトカインは、好ましくはインターフェロン-γ（IFN-γ）であ る。 分泌されたサイトカインは、文献で公知の種々の方法のいずれかによって検出 することができる。好ましくはこのアッセイ方法は、IFN-γまたはその他の サイトカインに対する固定化された第一の抗体を担持する表面を提供することを 含んでいる。PBMCまたはその他の新鮮な細胞を含む液を、固定化抗体と接触する ところへおく。PBMCの約30%がCD8+細胞である。かつてインフルエンザウイルス に感染し回復した患者のPBMCの中では、10⁵から10⁶の中の約１コのCD8+細胞が、 インフルエンザウイルスと関連する特異的なエピトープに対して前感作されたこ とのある記憶細胞である。 本発明の方法は、ペプチドを液に加えることを含む。ペプチドは、よく特徴づ けられたウイルス感染の公知のエピトープであることができるし、またはあまり よく特徴づけられてないウイルス感染とたぶん関連するエピトープ候補であって もよい。得られた液の混合物は、インビボでその特定のウイルスから誘導された ペプチドに対して前感作されているようなペプチド特異的Ｔ細胞を賦活するよう な条件下で培養する。このペプチドは、CD8+細胞によって認識される長さ、たと えば7-15個か特に8-12個または8-10個のアミノ酸残基長である必要がある。CD8+ 細胞（およびその他のPBMC）の多くは、ペプチドに対して前感作されたであろう 少数のCD8+細胞に対するペプチドを提供するものと考えられる。もしそのような 活性化され又は前感作されたペプチド特異的Ｔ細胞が検査液の中に存在すれば、 それらはIFN-γまたは他のサイトカインを分泌することによって応答し、それは ついで固定化された抗体に結合する。 ペプチドは、非結合の形で新鮮な細胞へ加えられることが望ましい。ペプチド でパルス標識した培養細胞を加えることも可能ではあるが、これは定められたペ プチドエピトープを使用したときには必要ではない。ペプチドは、観察可能なシ グナルを生じるに充分な量だけ加えるべきである。液中の好ましい濃度範囲は0. 01から100AμＭ、とくに0.5-5.0μＭである。 培養は、選ばれた特定のペプチドに対してインビボで前感作してあるCD8+細胞 がIFN-γまたはその他のサイトカインを分泌できるに充分な時間だけ続けるべき である。培養は、非活動的なCD8+細胞が分化しそしてペプチドで活性化されサイ トカインを分泌し始める程度の長時間にわたって続けるべきでな い。これは、培養時間は4-24時間、さらに好ましくは6-16時間であることを示唆 する。テストの中の培養の部分は、インビトロでの細胞培養に必要とされる無菌 条件を用いずに１労働日または１晩で行なうことができるのが本発明の利点であ る。 培養中に、IFN-γやCD8+によって分泌される他のサイトカインの何れもが、表 面で固定化した第一の抗体と結合するようになる。培養後、その表面を洗って非 結合材料を除去する。検出のためには、サイトカインに対して標識した第二の抗 体を用いるのが好ましい。この方法を表面に適用すると、該抗体はそこに存在す る如何なるサイトカインとも結合するようになる。第二の抗体は好ましくは、第 一の抗体とは異なるエピトープを認識すべきである。第一および第二の抗体の片 方または両方は、好ましくはモノクローナルであるべきである。標識は、質量分 析または屈折率（たとえば表面プラスモン共鳴）で検出するための蛍光基、色彩 か化学ルミネッセンスを生じる酵素、放射性同位元素を含む領域でふつうに使用 されるもののうち如何なるものであってもよい。標識された抗体を使用するのは 便宜ではあるが必要ではない。サイトカインと特異的に結合する如何なる試薬も 、標識され使用されることができる。標識の検出および多分定量は、この分野で よく知られており、用いた標識の性質に適応した手段で行われる。 アッセイは、マルチウエルのプレートで便宜に行なうことができる。プレート の各々のウエルは、結合した第一の抗体を担持した表面をもっている。各々のウ エルへ、適当な数の、たとえば10³から10⁶個の細胞を含んだ液を加える。異なっ たペプチド及び/又は対照を、プレートの個々のウエルに加える。培養中にサイ トカインを分泌する細胞は、スポット（スポット形成性細胞すなわちSFC）とし て現われ、そして各々のウエル中のこれらの数や密度は容易に測定することがで きる。 このアッセイ技術は、公知の技術にくらべ次のような多くの利点をもっている 。 a) それは、一層迅速で便利である。アッセイの期間はわずか６時間であって 、滅菌の条件や技術を必要としない。前駆物質エフェクターＴ細胞を数え上げる 現在の方法は、限定希釈アッセイ（LDA）での自己支持細胞と特定の抗原でのイ ンビトロ培養を必要とする。そのような方法は煩雑で時間がかかる。 b) それは、最小の技術装置を必要とするのみで、熱帯地域や開発途上国なら びに通常の診断ラボでの分野条件に適している。これと対照的にLDAは、細胞を1 -2週間培養せねばならないので、多くの末梢血液リンパ球と、支持細胞を不活性 化するためのガンマ線照射源と、滅菌条件を必要とする。 c) それは、安全で非放射性である。しかしLDAの場合は、培養された細胞は 、放射性同位元素であるクロム-51を用いた細胞毒性Ｔ細胞アッセイ(CTL)でアッ セイが行われる。 d) それは、直接のエキスビボ(ex vivo)アッセイである。したがってそれは 、細胞が抗原と外因性のサイトカインと共にインビトロ培養を増殖させるときに 生じる未知のバイアスの導入なしに天然の状態でのエフェクター細胞を測定する 。 e) このアッセイはわずか６時間で行われる。すなわちペプチド特異的エフェ クター細胞を直接測定するもので、これらの細胞のインビトロでの増殖を必要と しない。アッセイが短時間であるということはまた、細胞がインビトロで活性と なる可能性をなくすることである。したがって、インビボで存在するエフェクタ ー機能を測定することになる。LDAは、何倍にも増殖する細胞を必要とする。し かし多くのエフェクター細胞はこういった条件では増殖せず、そのためLDAの結 果は、循環するエフェクターの真の数よりしばしば低くなる。 このアッセイ技術は、いろんな違った方面で価値があると期待されている。 i) まず、ペプチドの提示と認識と活性化におけるメカニズムへの研究のため である。以下に概略を示すような実験的研究を通して、本発明者等は末梢血液か ら新しく単離した抗原特異性のＴ細胞のフェノタイプとエフェクター機能への見 通しを得るに到った。 ii) また、直接に末梢血液からのHIVに感染した個人におけるペプチド特異的 エフェクターの定量のためである。 iii) また、たとえば薬物または治療ワクチンへの応答のような、慢性の感染 性疾患の進展またはそれに対する耐性の監視のためである。これは、HIV、Ｂ型 肝炎、およびＣ型肝炎において特に有用であることが期待される。 iv) また、新しいワクチンの設計における重要な予備工程であるところの、 疾病状態（エピトープマッピング）に含まれるであろうペプチドを同定すること である。これは、結核、マラリア、およびHIVについて興味があると期待される 。 v) また、たとえばインフルエンザのような特定の病気に罹患している患者の 、将来の感染に対する抵抗性の程度を監視するためである。 vi) また、たとえばマラリアのような実験的な予防ワクチンによる免疫を伴 うCD8+およびCD4+抗原特異性Ｔ細胞の誘導と保持を監視するためである。 以下の例は、本発明を説明するものである。 例1．インフルエンザウイルスへの免疫学的記憶：記憶状態での循環ペプチド 特異的CD8+活性化Ｔ細胞のエキスビボ計数と特性化 被験者は、補体仲介リンパ球による血清学的にHLAタイプの、健康な研究所の 個人または健康な成人のボランティアであった。５つのMHCクラスのI-制限イン フルエンザエピトープが用いられ、それらを表１に示した。 96ウエルの、PVDFで裏打ちしたプレートを、４℃で一晩または室温で３時間、 15μg/mlの抗IFN-γMab 1-DIKの100μｌで被覆した。プレートを洗浄し、次いで 室温で１時間、R10（ウシ胎児血清10%を含む標準組織培養培地）でブロックした 。被験者のPBMCを、ヘパリン化した全血から遠心分離により分離し、R10に再懸 濁し、そして96ウエルのPVDF裏打ちマイクロタイタープレートへ、最終容量がウ エルあたりのR10が100μｌとなるように加えた。添加する細胞の数は通常はウエ ルあたり5×10⁵であり、すべてのアッセイは２つのウエルで行なった。ペプチド は、M1 58-66ペプチド濃度を20nM に希釈したペプチド滴定実験１件を除き、通常は1-2μＭの最終濃度となるよう に添加した。アッセイは通常12-14時間行われたが、あるアッセイは抗原特異性 細胞が直接のエフェクター機能が可能であることの確認のために６時間行われた 。培養は、5%のCO₂を含む雰囲気中、37℃で行われた。培養は、ウエルの内容物 を振盪し洗浄することによって停止させた。次いでウエルに、１μg/mlのビオチ ン化した第二の抗IFN-γMAB 7-B6-1-ビオチン（スウェーデン、ストックホルム 、Mabtech）を100μｌ加え、プレートを３時間培養した。ストレプトアビジン- アルカリホスファターゼ結合物の1:1000希釈物の100μｌをウエルに加え、プレ ートを室温でさらに２時間培養した。ウエルを再び洗浄し、脱イオン水で1:25に 希釈したクロモジェニックなアルカリホスファターゼ100μｌをウエルに加えた 。室温で更に30-60分培養した後、ウエルを洗浄して呈色反応を終了させた。ス ポットを、解剖用立体顕微鏡を用い20倍の倍率で計数した。 結果 ５つの良く規定されたHLAクラスI-制限インフルエンザエピトープを用いて、 遊離のペプチドを、ELISPOTアッセイにおいて新しく単離されたPBMCへ最終濃度 ２μｍになるように添加した。この方法でテストした個体の殆どすべてにおいて 、個体に存在するHLAクラスＩ対立遺伝子で制限されたエピトープを用い、IFN- γを分泌するペプチドに特異的なエフェクターＴ細胞が検出された。表１は、こ れら５個のエピトープに対する応答をまとめたものである。これらのアッセイの 多くは、12-14時間おこなわれ、そして図１はウエルごとの異なる濃度のPBMCに おける応答を示す棒グラフである。しかしながら、記憶Ｔ細胞が14時間のアッセ イの途中において増殖するか又はインビトロで活性化される可能性を排除するた めに、６時間のアッセイもまた行われた。ペプチド特異的SFCが、図２に定量的 に同じM1 58−66エピトープについて示したようにして検出された。負の対照と して、ドナーが感染してない感染源からの無関係のペプチドを、新鮮なPBMCに直 接加えた。 ほとんどの実験は、最終ペプチド濃度２μｍで行なわれた。しかしながら、イ ンフルエンザHLA-A2.01-制限マトリックスエピトープについて図３に示したよう に、ペプチド濃度が0.02μｍまで減少したときにも、まだ応答は容易に検出可能 であった。 新鮮なPBMCからの、抗CD8抗体被覆した磁気ビーズによるCD8+Ｔ細胞の消耗は 、ペプチド特異的応答を完全に終わらせるものであり、これは公知のクラスI-制 限エピトープで引き出されたスポットを生じるエフェクターがCD8+Ｔリンパ球で あることを示すものである。これと逆に、CD4+細胞の消耗はIFN-γSFCの数を減 少するものではなく、これはCD4+も又それらのサイトカイン生産物も、新しく単 離したペプチド特異的CD8+Ｔ細胞によるエフェクター機能の獲得または配置には 必要でないことを示す。直接のエフェクター応答は、テストした特定のドナーに 存在するHLAクラスＩ対立遺伝子で制限されたインフルエンザエピトープに対し てのみ検出された。ドナーに存在しないHLAクラスＩ分子で制限されたインフル エンザエピトープの添加は、まったくSFCを生じなかった（データは示してない ）。 急性インフルエンザのときのペプチド特異的CD8+エフェクターCTLの増大は、 新鮮な未培養のPBMCで行なった公知の⁵¹Cr放出細胞毒性アッセイという手段によ り細胞を検出可能とするけれども、急性の病気から回復した後は、そのような細 胞はもはや検出不可能である。これは、それら細胞が存在しないのではなく、む しろ検出するには余りにも低い頻度で存在しているからであると思われる。急性 の病気から回復した後は、そのような細胞は本発明のELISPOTアッセイ技術でま だ検出可能である。 倍率をかけてのスポットの計数、およびこの数と新鮮なPBMCの添加数との比較 は、末梢血液で循環している活性化ペプチド特異的CD8+エフェクターの相対的頻 度の尺度となる。ドナーWBのHLA-A2.1-制限エピトープM158-56に対するIFN-γ- 分泌CD8+エフェクターの頻度は、本発明のアッセイ（1/15000）および従来の限 度希釈法(LDA)(1/103000)で測定された。 表１．新しく単離されたCD8+エフェクターＴ細胞で認識されるクラスI-制限イ ンフルエンザエピトープ 上の実験は、J．Exp．Med.，186，６，September 15，1997，859-865に詳しく 記載されており、それは参照としてここに含まれる。 例2．末梢血液から直接行われる、HIV-感染個人におけるペプチド特異的エフ ェクターの定量への応用 患者868の末梢血液から新しく単離され冷凍保存された末梢血液リンパ球（PBL ）を、抗インターフェロン-ガンマモノクローナル抗体であらかじめ被覆した、P VDF被覆の96ウエルのプレートに、１ウエルあたり50,000細胞の割合で平板培養 した。各々の抗体について副のウエルを設けた。２種類の副の対照ウエルを用い た。すなわち、患者868にはなかったHLA対立遺伝子であるHLA-B8で制限された、 ペプチドがなく無関係なHIV gagエピトープである。 ある範囲のペプチドおよびその対応する天然に存在する変種（患者868におい て既に同定されている）を、最終濃度が２μＭとなるように細胞に直接添加した 。これらのプレートを、5%のCO₂中37℃で12時間培養し、既に述べたようにして 展開させた(例１参照)。得られたスポットを、40倍の解剖顕微鏡で計数した。こ れらの結果は、図４に表の形で表わした。 例3．エム・ツベルクロシス（M．Tuberculosis）の分泌抗原でのCD4+およびCD 8+エピトープの同定 結核菌（ミコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacteriumtuberculosis))感 染においてCD8+細胞毒Ｔリンパ球が保護的役割を果たすことを示す証拠が増大し ているものの、結核菌特異性のCD8+Ｔ細胞はこれまでヒトでは同定されていなか った。逆の免疫遺伝学的アプローチを使って本発明者等は、結核菌のESAT-6およ び抗原85という２つの免疫優勢（immunodominant）抗原からHLAクラスＩ制限ペ プチド候補の配列を合成した。本発明者等は、結核菌感染の広範な臨床スペクト ルを表わす75の症例をスクリーニングした。末梢血液リンパ球はペプチドによっ てインビボで賦活され、そして⁵¹Cr放出アッセイでの細胞溶解活性と、ELISPOT アッセイでの単一細胞インターフェロンγ放出について試験された。本発明者等 は、患者や露出接触のESAT-6や抗原85から幾つものオクタマーやノナマーエピト ープを同定した。ある種のエピトープは、MHCクラスＩ制限の態様でCD8+リンパ 球によって認識され、その他のものはCD4+細胞によって優先的に認識された。 ESAT-6ならびに抗原85A、ＢおよびＣの配列は、HLAクラスＩのタイプA2、B7、 B8、B35、B52およびB53（それらは全て研究個体群中に存在する）に関して、対 立遺伝子特異性のペプチドモチーフを用いて調べた。 ESAT-6に関しては、HLA-A2、B8およびB52のペプチドモチーフに適合した配列 が同定された。これらのペプチドは合成され表２に示してある。HLA-B7、-B35お よび-B53に適合する配列はESAT-6の中には存在しなかったので、これらHLAクラ スＩ対立遺伝子のためのペプチドは合成されなかった。ペプチドは、ドナーPBMC のインビトロでの再賦活に用いられたプールへ分類された。CD8+エピトープであ ると判明したペプチドは、太字で示してある。同様にして、抗原85Aおよび85Cの 配列に基づいて、42個のペプチドを合成した。これらの中にはCD8+エピトープは 同定されず、該ペプチドは示されていない。 IFN-γのためのELISPOTアッセイ 抗IFN-γmAb 1-DIK 15μg/mlで前被覆した96ウエルのPVDF裏打ちプレートを、 RPMIで洗浄し、R10で１時間室温でブロックした。１つの実験では、１ウエルあ たり500,000の新しく単離した末培養のPBMCを用いた。別の実験では、短期間細 胞系（STCL）またはCD8+細胞毒Ｔリンパ球（CTL）またはクローンをRPMIで２回 洗浄し、R10に再懸濁し、そしてウエルあたり既知の細胞添加数で２つのウエル 中へ分散した。応答は、もし最低10個のSFCがウエルごとに存在し、更にこの数 が対照のウエルのものより少なくとも２倍であれば、有意であるとみなした。ペ プチドは、最終濃度が２μｌ（遊離ペプチド）となるように上澄液へ直接加えた 。プレートを5%CO₂、37℃で12時間培養した。0.05%のTween-20含有リン酸塩緩衝 食塩水で６回洗浄して細胞を除去し、プレートを、１μg/mlの第二のビオチン化 抗IFN-γmAb 7-B6-1-ビオチンで３時間培養した。上記のような洗浄を行ない、 ついで1:1000に希釈したストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ結合物で ２時間培養した。さらに洗浄してから、クロモジェニックなアルカリホスファタ ーゼ基質をウエルに添加し、30分後に、プレートを水道水で洗浄した。乾燥後、 スポット形成 細胞（SFC）を20倍の倍率下で計数した。 STCLは、Nature，346(1990)183-7に記載の方法で生成された。CD8+Ｔ細胞クロ ーンは、標準的方法で生成された。 ESAT-6特異的エフェクターＴ細胞の、末梢血液からの直接同定 ESAT-6中の２つのCD8+エピトープを同定した。結核縦隔リンパ節炎のドナーNP H54からのＴ細胞は、これら双方のエピトープに対応するペプチドを認識した。H LA-B52とHLA-A2.01をもつNPH54からの診断時に単離した未培養のPBMCは、エクス ビボELISPOTアッセイにおいてこれらのクラスＩ対立遺伝子のためのESAT-6誘導 ペプチドプールに応答するIFN-γを分泌した。複製ウエルで5×10⁵個のPBMCから 計数したIFN-γスポット形成細胞(SFC)の平均数は、ペプチドのない対照ウエル の場合のESAT-6ペプチドが２個であるのに対して、19個であった。応答するプー ルの中での個々のペプチド各々に対して、新しく単離したPBMCの引き続いてのア ッセイが行われた。IFN-γSFCはES12とES13ペプチドの応答の中で検出され、そ れらの配列はHLA-B52とHLA-A2.01ペプチドモチーフとそれぞれ適合していた。ES 12-とES13-特異性IFN-γSFCの頻度は、HLA-A2.01制限インフルエンザマトリック スエピトープM1 58-66のSFCとしての大きさと同じ程度であった。結核性骨髄炎 の第二のドナーNPH97からの非再賦活PBMCもまた、ES12エピトープを認識した。 この患者はまたHLA-B52と-A2.01をもっており、ES12特異的応答の大きさはHLA-A 2制限インフルエンザマトリックスエピトープに対する応答と類似していた。同 種のペプチド以外の刺激を用いたこれら12時間の短いエクスビボアッセイで新し く単離したＴ細胞による単一細胞IFN-γ放出は、これらの細胞はほとんど循環活 性エフェクターＴ細胞であろうことを示している。 例4. マラリアへの応用 本発明のアッセイ方法は、新しいマラリアワクチン候補であるRTS.Sの免疫 で誘発した抗原特異性細胞免疫応答の誘発を効果的に追跡するのに用いられた。 このワクチン候補は、412個のアミノ酸の蛋白質であるサーカムスポロゾイト蛋 白(CSP)抗原のペプチド配列の全てではないが殆どを含んでいる。10人の健康な ボランティアのPMBCを入手し、標準的な３回ワクチン投与の前、途中および後に 分析を行なった。RTS.Sに含まれるCSP抗原の全アミノ酸配列に及ぶ25個の15-mer ペプチドを、エピトープ特異性Ｔ細胞の検出のために用いた。IFN-γに対するエ クスビボELISPOTアッセイを、これら３つのペプチドを用い、一般に上記の例１ および３に記載のようにして行なった。その結果は、RTS.Sによるワクチン接種 は、10人のボランティア全てにおいてアッセイで使つた幾つものオリゴペプチド に応答する循環活性化Ｔ細胞の生産をもたらした。これらの実験は、ある種のペ プチドに特異的なＴ細胞の高い頻度（1/10,000PBMCにも達する）がRTS.Sによる ワクチン接種で誘発されることを示している。最も強く認識された細胞は、Th2 領域とCSP保存領域IIからのものである。これはピー・ファルシパルム（P．falc iparum）CSPのこれらの配列への応答は防御免疫を仲介することを示唆している 。現在進行中の研究ではこのアッセイ技術は、アフリカでの現地調査および第I/ II相の感染性の蚊の刺突についての研究においてRTS.Sによって誘発された細胞 免疫応答の研究に応用されつつある。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年１月２１日（１９９９．１．２１） 【補正内容】 請求の範囲 １．Ｔ細胞を含む液を提供し、ペプチドまたはペプチド含有成分をその液に加 え、液を培養してサイトカインを放出させ、そして放出されたサイトカインを検 出することを含むペプチド特異的エフェクターＴ細胞のアッセイ方法であって、 ペプチドに対してインビボで前感作されておりかつ、ペプチド存在下のインビト ロ培養で分裂／分化を生じる必要のない即時型エフェクター機能の能力のあるＴ 細胞だけによって、サイトカインの放出を可能にするような時間の間、培養が続 けられるアッセイ方法。 ２．サイトカインに対する固定化された第一の抗体を担持する表面とＴ細胞を 含む液を接触させ、ペプチドをその液へ加え、得られた液混合物をサイトカイン を分泌するようにペプチドに対して前感作されたペプチド特異的エフェクターＴ 細胞を生じる条件下で培養し、そして固定化された第一の抗体と結合した分泌サ イトカインを検出することを含む、請求の範囲第１項の方法。 ３．Ｔ細胞が末梢血液単核細胞である、請求の範囲第１項または第２項の方法 。 ４．ペプチド特異的エフェクターＴ細胞がCD8+またはCD4+細胞であり、サイト カインがIFN-γである、請求の範囲第１項から第３項までのいずれかの方法。 ５．Ｔ細胞に対して与えられるペプチドが7-15個のアミノ酸残基の長さである 、請求の範囲第１項から第４項までのいずれかの方法。 ６．得られた液混合物が非滅菌条件下で培養される、請求の範囲第１項から第 ５項までのいずれかの方法。 ７．ペプチドが公知のエピトープである、請求の範囲第１項から第６項までの いずれかの方法。 ８．液がインビトロで培養されていない新鮮なＴ細胞を含む、請求の範囲第１ 項から第７項までのいずれかの方法。 ９．培養が4-24時間の間続けられる、請求の範囲第１項から第８項までの いずれかの方法。 10．ペプチドまたはペプチド含有成分が５μＭ以下の液中濃度を与えるために 加えられる、請求の範囲第１項から第９項までのいずれかの方法。 11．液に加えられたペプチドまたはペプチド含有成分が非結合の形である、請 求の範囲第１項から第10項までのいずれかの方法。 12．Ｔ細胞が、病原体による感染に罹患しているか又は罹患したことがわかっ ている患者から採られたものである、請求の範囲第１項から第11項までのいずれ かの方法。 13．HIV感染の進行を監視するために行われる、請求の範囲第１項から第12項 までのいずれかの方法。 14．ワクチンの効果を監視するために行われる、請求の範囲第１項から第12項 までのいずれかの方法。 15．CD4+またはCD8+で標的された病原体誘導エピトープを決定するために行わ れる、請求の範囲第１項から第12項までのいずれかの方法。 16．感染性疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、結核、マラリア、HIVまたはインフル エンザの研究または診断または監視に応用される、請求の範囲第１項から第15項 までのいずれかの方法。 17．請求の範囲第１項から第16項までのいずれかの方法を行うためのキット。 18．与えられた疾患抗原についての少なくとも１つのペプチドまたはペプチド 含有成分と共にサイトカインをアッセイする手段を含む、請求の範囲第17項のキ ット。 19．AMASTEGNVおよびLQNLARTIから選択されたペプチド。 20．請求の範囲第19項の少なくとも１つのペプチドを含むワクチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｔ細胞を含む液を提供し、ペプチドをその液に加え、液を培養してサイト カインを放出させ、そして放出したサイトカインを検出することを含むペプチド 特異的Ｔ細胞のアッセイ方法。 ２．サイトカインに対する固定化された第一の抗体を担持する表面とＴ細胞を 含む液を接触させ、ペプチドをその液へ加え、得られた液混合物をサイトカイン を分泌するようにペプチドに対して前感作されたペプチド特異的Ｔ細胞を生じる 条件下で培養し、そして固定化された第一の抗体と結合した分泌サイトカインを 検出することを含む、請求の範囲第１項の方法。 ３．Ｔ細胞が末梢血液単核細胞である、請求の範囲第１項または第２項の方法 。 ４．ペプチド特異的Ｔ細胞がCD8+またはCD4+細胞であり、サイトカインがIFN- γである、請求の範囲第１項から第３項までのいずれかの方法。 ５．ペプチドが7-15個のアミノ酸残基の長さである、請求の範囲第１項から第 ４項までのいずれかの方法。 ６．得られた液混合物が非滅菌条件下で培養される、請求の範囲第１項から第 ５項までのいずれかの方法。 ７．ペプチドが公知のエピトープである、請求の範囲第１項から第６項までの いずれかの方法。 ８．Ｔ細胞が、細胞内病原体による感染に罹患しているか又は罹患したことが わかっている患者から採られたものである、請求の範囲第１項から第７項までの いずれかの方法。 ９．HIV感染の進行を監視するために行われる、請求の範囲第１項から第項ま でのいずれかの方法。 10．ワクチンの効果を監視するために行われる、請求の範囲第１項から第８項 までのいずれかの方法。 11． CD4+またはCD8+で標的された病原体誘導エピトープを決定するため に行われる、請求の範囲第１項から第８項までのいずれかの方法。 12．Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、結核、マラリア、HIVまたはインフルエンザの研究 に応用される、請求の範囲第１項から第11項までのいずれかの方法。