KR20180108585A - T 세포 반응성 플랫폼 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 시험관내에서 항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법으로서, (a) 후보 항원 폴리펩타이드가 밀접하게 부착된 포식성(phagocytable) 입자를 제공하는 단계로서, 폴리펩타이드가 부착된 입자를 변성 세척으로 처리하여, 후속 단계를 방해하지 않을 정도로 충분히 낮은 내독소 수준이 유도된 것인 단계; (b) 생존 가능한 항원 제시 세포를 제공하는 단계; (c) 항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 허용하는 조건 하에, 세척된 입자를 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; (d) 생존 가능한 T 세포를 포함하는 검정될 T 세포 시료를 제공하는 단계; (e) 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T 세포의 특이적인 활성화를 허용하는 조건 하에, T 세포 시료를 입자와 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및 (f) T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항원 특이적 T 세포 활성화의 확인을 포함하는 진단 및 분석 방법 분야에 관한 것이다.
적응 면역계는, 보다 포괄적인 방식으로 반응하는 선천 면역계와는 대조적으로, 유기체가 맞닥드리는 상이한 병원체들 또는 세포 손상 상황들에 특이적으로 적응하고 반응할 수 있는 면역계의 분지(branch)를 구성한다. 적응 시스템은 체액성 면역력, 즉 B 세포에 의해 분비되는 항체, 및 T 세포 매개 면역력을 둘 다 포함한다. 적응 면역계의 특이성은 B 세포 및 T 세포 상에서 발현되는 B 세포 수용체 및 T 세포 수용체에 있다. 유전자 절편들의 복잡한 혼합 시스템을 통해, 신체는 거의 무한정하게 다양한 B 세포들 및 T 세포들을 생성하며, 각각의 세포는 소정의 단백질 또는 펩타이드에 대한 특이적인 수용체를 발현한다.
T 세포는 적응 면역계의 주요 파트를 형성하는 림프구로서, 여기서 T 세포는 세포 매개 면역력에서 중심적인 역할을 한다. 한정성(defining) T 세포 수용체(TCR)는 세포 표면 상에서 발현되고, 각각의 수용체는 MHC(주 조직적합성 복합체; major histocompatibility complex) 분자의 맥락에서 제시된 항원 유래 펩타이드를 인지한다. 몇몇 유형의 T 세포들이 존재하며, 각각의 T 세포는 세포 면역 반응에서 별개의 기능을 가진다.
간략하게는, 상이한 기능들을 가진 2가지 주요 유형의 T 세포들이 존재한다. CD8-양성 세포독성 T 세포는 세포 상의 MHC 부류 I 수용체(인간에서, 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I로 지칭됨) 상에서 제시된 펩타이드에 결합할 것이다. 모든 유핵 세포들은 HLA 부류 I을 발현한다. 제시된 펩타이드가 외래물(대부분 종종 바이러스 감염의 징후임)로서 간주되는 경우, 세포독성 T 세포는 단백질 그랜자임 B 또는 퍼포린에 의해 세포를 사멸시킬 것이다. 표면 마커 CD4를 발현하는 헬퍼 T 세포(Th)는 사멸화시키지 않으며, 그보다는 Th는, 세포들 사이에서 전염증성 신호 및 이따금 저해성 신호를 둘 다 증대시킬 단백질인 사이토카인의 분비에 의해 면역 반응을 조직화한다. T 헬퍼 세포의 또 다른 중요한 기능은 B 세포의 부류 스위칭(class switching)을 유도하는 것이며, 예를 들어 IgM-분비 B 세포를 IgG-분비 세포로 전환시키는 것이며, 이는 항원에 대한 체액성 면역 반응을 증가시킬 것이다.
T 헬퍼 세포는 이의 TCR을 통해, 소위 항원 제시 세포(APC) 또는 내피 세포 상에서 특이적으로 발현되는 수용체인 MHC-II(인간에서, HLA 부류 II로 지칭됨) 상에 제시된 이의 상응하는 펩타이드에 결합할 것이다. T 세포 활성화는, Th-APC 상호작용이 발생하는 미세환경, 및 APC 상에서 발현되는 소위 공동-자극성 분자의 유형에 따라 다르다. T 헬퍼 세포는 상이한 Th-서브세트들, 예를 들어 전염증성 Th1, Th2, Th17 세포, 또는 조절 T 세포(Treg)로 지칭되는 저해성 T 헬퍼 세포 유형으로 분화할 수 있다. 조절 T 세포 서브세트는, 억제되지 않은(unrestrained) 면역계가 유해하고 조직 손상 및 자가면역력을 초래할 수 있기 때문에, 면역 반응을 제어하는 데 매우 중요하다.
항원 특이적 T 세포 활성화를 확인하는 데 적합한 몇몇 방법들이 존재하며, 분비된 사이토카인의 ELISpot, FluoroSpot, 유세포분석과 함께 사이토카인의 세포내 염색, FASCIA, 증식 검정(예를 들어 티미딘 혼입, CFSE 또는 BrdU 염색), MHC-I 또는 II 사량체를 이용한 특이적인 TCR-검출, 및 ELISA- 또는 루미넥스(Luminex) 분석이 있다.
ELISpot 기술을 이용하여, 당업자는 자극에 반응하여 세포에 의한 특이적인 사이토카인의 방출을 직접적으로 검출한다. 세포는 막 상에 접종되고, 사이토카인 분비 세포의 수가 측정된다. 어떤 사이토카인이 측정되고 있는지에 따라, 상이한 변수들, 예컨대 대식세포 또는 T 세포 활성화가 측정될 수 있다. FluoroSpot은 ELISpot 기술을 구축하고, 몇몇 상이한 분비된 사이토카인들의 동시적인 판독을 허용한다. 이는, 세포 활성화의 보다 정확하고 미묘한 차이의 추정을 허용한다. 이들 방법은 둘 다 T 세포 활성화를 측정하는 신속하고 용이한 방식을 제공한다.
최근, 재조합적으로 발현되는 단백질들, 즉 클로닝 기술 및 박테리아 또는 포유류 발현 시스템을 이용하여 제조된 단백질들의 큰 수합물(collection)은 인간 아틀라스 프로젝트와 같은 대규모 노력에 의해 생성되어 왔다. 발명자들은, 특이적으로 T 세포 활성화인 항원에 대한 이러한 폴리펩타이드 수합물을 스크리닝할 수 있는 것이 상당한 과학적 및 실용적인 관심일 것임을 실현하였다. 예를 들어, 자가면역 질환, 신생물 질환, 알레르기 또는 감염성 질환에 의해 영향을 받는 환자 유래의 T 세포 시료를 폴리펩타이드 라이브러리에 대해 스크리닝하며, 환자의 T 세포가 반응하고 있는 어떤 에피토프인지 확인하는 것이 관심있을 것이다. 현재의 방법들은 일반적으로, 환자의 면역계가 어떤 에피토프에 대한 항체를 생성하고 있는지(즉, 체액성 반응) 확인하는 데 초점을 맞추고 있으며, 적응 면역계의 주요 파트인 T 세포 매개 면역력에 대한 관련 정보는 제공하지 못하고 있다. 따라서, 환자 또는 환자 그룹에서 T 세포 활성화를 유도하는 항원들을 대규모로 확인할 수 있는 것은, 질병에 대한 신규 바이오마커의 새로운 풀(pool)에 다가가고, 보다 양호한 진단을 가능하게 하며, 환자에서 질병 진행의 모니터링을 지지하고, 치료적 표적의 식별을 돕는 등을 수행할 수 있을 것이다.
실용적인 이유에서, 오늘날 존재하는 큰 폴리펩타이드 수합물은 통상 이. 콜라이에 의해 발현되는 단백질들로 제조되며, 따라서 숙주 세포의 외막으로부터 유래된 내독소를 상당한 양으로 함유한다. 환경 오염으로 인해, 심지어 진핵 숙주에서 제조되거나 비-생물학적 펩타이드 합성에 의해 제조되는 폴리펩타이드 수합물은 내독소를 실용적으로 유의한 수준으로 함유한다. 큰 수합물의 제조 시, 내독소가 단백질에 결합하는 경향이 있고 일단 이들 내독소가 일단 폴리펩타이드 시료를 오염시키면 종종 제거되기 어렵기 때문에, 내독소를 검출보다 낮은 수준까지 제거하는 과정을 구축하는 것은 비실용적이다.
불행하게는, T 세포 활성화를 확인하는 검정법이 갖고 있는 보편적인 문제점은, T 세포와 접촉하게 되는 심지어 낮은 수준의 내독소라도, 통상적으로 매우 낮은 수준의 항원 특이적 활성화를 가리는(masking) 활성화를 유도한다는 것이다. 시험중인 T 세포 집단 중 작은 분율만이 (최근 항원과 맞닥드린 피험자의 혈액 내에서 약 1/10000로) 주어진 항원과 항원 특이적 방식으로 반응하는 반면, 큰 분율의 세포들은 내독소에 반응하여, 백그라운드를 높은 수준으로 발생시킬 것이다. 아주 흔한(ubiquitous) 내독소 오염을 고려하면, 현재의 폴리펩타이드 수합물을 이용하여 상기 열거된 스크리닝을 수행하는 것은 실현 가능하지 않다.
따라서, 후보 항원 조제물에서 내독소 오염을 관용할 수 있는 항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하며, 큰 폴리펩타이드 수합물의 스크리닝을 가능하게 하는 방법이 여전히 당업계에 요망되고 있다. 본 발명의 목적은 항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하기 위한 개선된 방법 및 수단을 제공하는 것이다.
정의
내독소, 예를 들어 리포다당류(LPS)는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 그람-음성 박테리아의 외부 세포벽 상에서 발견되는 공유 결합된 지질 및 다당류 서브유닛을 포함한다.
CD4 + T 세포 또는 T 헬퍼 세포는 사이토카인 분비를 통해 면역 반응을 조직화하는 세포이다. 이들 세포는 B 세포의 항체 부류 스위칭, 세포독성 T 세포의 팽창을 자극하거나 포식세포를 강화하는 것과 같이, 다른 면역 세포의 억제 또는 강화를 둘 다 수행할 수 있다. 이들 세포는 APC 상의 MHC 부류 II를 통한 항원 제시에 의해 활성화되고, 특정 항원 내의 대략 15개 아미노산의 신장부(stretch)(소위 T 세포 에피토프)에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 인지한다.
CD8 + T 세포 또는 세포독성 T 세포는 종양 세포, 감염된 세포 또는 그렇지 않다면 손상된 세포를 사멸화시키는 세포이다. CD4+ T 세포와는 달리, 이들 세포는 활성화를 위해 APC를 필요로 하지 않는다. 이들의 T 세포 수용체는, 모든 유핵 세포 상에서 발현되는 단백질인 MHC 부류 I에 의해 제시되는 항원 유래 펩타이드(대략 9개 내지 11개 아미노산 길이)를 인지한다.
항원 특이적 T 세포 활성화는 TCR과, 공동-자극과 조합하여 MHC(HLA) 분자 상에서 제시된 한정된(defined) 펩타이드 사이의 상호작용을 필요로 하는 과정이다.
단백질 에피토프 시그니처 태그(PrEST): 숙주(예컨대 인간) 유래의 단백질의 단편인 재조합적으로 생성된 펩타이드는, 이들 펩타이드가 유래되는 단백질의 독특한 펩타이드 서열을 나타낸다(문헌[Lindskog M, Rockberg J, Uhlen M, Sterky F. Selection of protein epitopes for antibody production. Biotechniques. 2005;38(5):723-7] 참조).
항원 제시 세포(APC)는 전형적으로, 수지상세포(DC), B 세포 또는 대식세포이며, 세포외 유기체 또는 단백질, 즉 항원을 포식작용하거나 내재화하고, 가공 후 MHC 부류 II 상에서 항원-유래 펩타이드를 CD4+T 세포에 제시하는 세포이다. 혈액에서, 단핵구가 가장 풍부한 항원 제시 세포이다.
포식성 입자(phagocytable particle)는 면역계의 세포, 특히 단핵구에 의해 포식될 수 있는 입자로서 정의된다.
말초 혈액 단핵 세포, PBMC는 전혈의 밀도 구배 원심분리에 의해 제조되는 인간 혈액의 분획이다. PBMC 분획은 주로 림프구(70% 내지 90%) 및 단핵구(10% 내지 30%)로 구성되는 한편, 적혈구, 과립구 및 혈장은 제거되었다.
[도면의 간단한 설명]
도 1. 내독소 제거를 위한 상이한 세척들에 대한 비교. 상이한 세척들로 처리된 단백질 커플링된 비드에 반응하는 단핵구 활성을 평가하였으며, 상이한 변성 세척들의 유효성을 비-세척된 비드와 비교하였다. 더 낮은 활성화가 바람직하다. P-값을 원-웨이(one-way) ANOVA를 사용하여 확인하였다. 스테이플(staple)은 SD를 나타낸다.
도 2. 세포 증식 검정법을 이용한 T 세포 활성화의 측정. 티미딘 혼입 검정법은 오브알부민 민감화된 마우스로부터의 비장세포를 사용한다. 오브알부민 커플링된 비드, 소 혈청 알부민 커플링된 비드 및 배지를 비교한다. P-값을 스튜던츠 T-테스트를 이용하여 확인하였으며, p<0.05이 확인된 경우 표시하였다. 스테이플은 SD를 나타낸다.
도 3. MS에서 의심된 자가항원으로 자극된 경우, 다발성 경화증(MS)-환자 및 건강한 대조군에서 T 세포 활성화를 비교하는 IFNγ/IL-22/IL-17 FluoroSpot 검정법. P-값은 만 휘트니 U 테스트(Mann-Whitney-U test)를 이용하여 확인되었으며, 확인된 경우 기재되었다. 스테이플은 평균의 CI95%를 나타낸다.
도 4. 다발성 경화증-환자에서 125개 단백질들의 라이브러리에 대한 자가항원 스크리닝. MS-환자의 PBMC 유래의 T 세포 활성화와 건강한 대조군의 PBMC 유래의 T 세포 활성화의 비교. 패널 A, IL22-FluoroSpot에 의한 활성화 확인. 패널 B, IL17-FluoroSpot에 의한 활성화 확인. 패널 C, IFNγ FluoroSpot에 의한 활성화 확인. 환자의 T 세포는 라이브러리 내의 소정의 단백질들에 대해 유의하게 더 많이 반응한다. 열린 사각형 및 채워진 원형은 각각 환자 및 대조군의 PBMC에서 평균 활성화를 가리킨다. 스테이플은 평균의 CI95%를 나타낸다. P-값을 투-웨이(two-way) ANOVA를 사용하여 확인하였다. 별표는 P-값을 나타낸다.
도 5. T 세포 활성화에 미치는 비드 크기의 효과. 오브알부민 민감화된 마우스 유래의 비장세포를 이용한 증식 검정법(티미딘 혼입을 이용함). 직경이 5.6 ㎛, 1 ㎛ 및 0.2 ㎛인 상이한 크기의 비드들에 커플링된 오브알부민의 비교. P-값을 스튜던츠 T-테스트를 사용하여 확인하였으며, p<0.05가 확인된 경우 기재하여 표시하였다. 스테이플은 SD를 나타낸다.
[발명의 내용]
본 발명은 하기 항목들에 관한 것이다. 하기 항목들에 개시된 주제는, 이러한 주제가 특허 청구항에 개시된 것과 동일한 방식으로 개시된 것으로 간주되어야 한다.
1.
항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법으로서,
a.
후보 항원 폴리펩타이드가 밀접하게 부착된 포식성 입자를 제공하는 단계로서, 폴리펩타이드가 부착된 입자는 변성 세척으로 처리되어, 후속 단계를 방해하지 않을 정도로 충분히 낮은 내독소 수준이 유도된 것인 단계;
b.
생존 가능한 항원 제시 세포를 제공하는 단계;
c.
항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 허용하는 조건 하에, 세척된 입자를 시험관내에서 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
d.
생존 가능한 T 세포를 포함하는 검정될 T 세포 시료를 제공하는 단계;
e.
항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T 세포의 특이적인 활성화를 허용하는 조건 하에, T 세포 시료를 시험관내에서 입자와 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
f.
T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계
를 포함하는, 항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법.
2.
항목 1에 있어서, 단계 (a') 후보 폴리펩타이드를 포식성 입자와 밀접하게 부착시키는 단계, 및/또는 (a'') 입자와 부착된 후보 항원을 변성 세척으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
3.
항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법으로서,
a.
포식성 입자를 제공하는 단계;
b.
후보 항원 폴리펩타이드를 입자에 밀접하게 부착시키는 단계;
c.
폴리펩타이드가 부착된 입자를 변성 세척으로 처리하여, 후속 단계를 방해하지 않을 정도로 충분히 낮은 내독소 수준을 유도하는 단계;
d.
생존 가능한 항원 제시 세포를 제공하는 단계;
e.
항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 허용하는 조건 하에, 세척된 입자를 시험관내에서 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
f.
생존 가능한 T 세포를 포함하는 검정될 T 세포 시료를 제공하는 단계;
g.
항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T 세포의 특이적인 활성화를 허용하는 조건 하에, T 세포 시료를 시험관내에서 입자와 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
h.
T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계
를 포함하는, 항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법.
4.
항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, T 세포 활성화 정도를 관련 참조 물질과 비교하는 단계로서, 참조 물질과 비교하여 시료 내의 더 높은 T 세포 활성화 정도는, 후보 항원이 시료에서 항원 특이적 T 세포 활성화를 유도한다는 결론을 시사하는 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
5.
항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계가, 시료 내의 활성화된 T 세포의 분율을 판단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
6.
항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 수 개의 후보 항원들을 동일한 T 세포 시료에 대해 검정하는 것인 방법.
7.
항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, 10 이상의 후보 항원들을 동일한 T 세포 시료에 대해 검정하는 것인 방법.
8.
항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 입자의 최대 치수가 5.6 ㎛ 미만, 바람직하게는 4 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 3 ㎛ 미만, 보다 더 바람직하게는 0.5 ㎛ 내지 2 ㎛ 또는 가장 바람직하게는 약 1 ㎛인 방법.
9.
항목 8에 있어서, 입자가 실질적으로 구형인 방법.
10.
항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 있어서, 변성 세척이, 폴리펩타이드가 부착된 입자를 높은 pH, 예컨대 pH 13 이상, 보다 바람직하게는 pH 14 이상, 가장 바람직하게는 pH 14.3 이상으로 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
11.
항목 1 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, 변성 세척이, 폴리펩타이드가 부착된 입자를 낮은 pH로 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
12.
항목 1 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 변성 세척이, 폴리펩타이드가 부착된 입자를 고온, 예컨대 90℃ 이상, 보다 바람직하게는 92℃ 이상, 가장 바람직하게는 95℃ 이상으로 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
13.
항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 있어서, 변성 세척이, 폴리펩타이드가 부착된 입자를 충분한 농도, 예컨대 5 M, 6 M, 7 M 또는 8 M 이상에서 변성제, 예컨대 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드로 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
14.
항목 1 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, 변성 세척은, 항원 내의 내독소 양을, T 세포 활성화 검정에서 내독소의 최종 농도가 100 pg/ml 미만, 바람직하게는 50 pg/ml 미만, 보다 바람직하게는 25 pg/ml 미만, 가장 바람직하게는 10 pg/ml 미만이 되도록 유도하는 것인 방법.
15.
항목 1 내지 14 중 어느 한 항목에 있어서, 입자가 상자성을 갖는 것인 방법.
16.
항목 1 내지 15 중 어느 한 항목에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가 입자에 공유 결합되는 것인 방법.
17.
항목 1 내지 16 중 어느 한 항목에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가 금속 킬레이트를 통해 입자에 결합되는 것인 방법.
18.
항목 1 내지 17 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 제시 세포 및 T 세포 시료가 동일한 개체로부터 유래된 것인 방법.
19.
항목 1 내지 18 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 제시 세포 및 T 세포 시료가 동일한 혈액 시료로부터 유래된 것인 방법.
20.
항목 1 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 제시 세포 및 T 세포 시료가 동일한 개체의 PBMC 시료로부터 유래된 것인 방법.
21.
항목 20에 있어서, PBMC 시료가 신선하거나, 동결 처리되어 있던 것인 방법.
22.
항목 1 내지 18 중 어느 한 항목에 있어서, T 세포 시료가 종양, 바람직하게는 종양 내의 림프관으로부터 유래된 것인 방법.
23.
항목 1 내지 18 중 어느 한 항목에 있어서, T 세포 시료가 복수(ascite)로부터 유래되는 것인 방법.
24.
항목 1 내지 23 중 어느 한 항목에 있어서, T 세포 시료가 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
25.
항목 1 내지 24 중 어느 한 항목에 있어서, 세척된 입자, 항원 제시 세포 및 T 세포 시료가 동시에 접촉되는 것인 방법.
26.
항목 1 내지 25 중 어느 한 항목에 있어서, T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계가, IFN-γ, IL-17, IL-22 또는 이들의 조합의 분비에 의해 반응하는 항원 제시 세포와 접촉된 T 세포의 분율을 판단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
27.
항목 1 내지 26 중 어느 한 항목에 있어서, 다발성 경화증을 진단하거나 다발성 경화증의 경과를 추적하기 위한 것이며, T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계를 포함하고, IL-17 및/또는 IL-22의 분비에 의해 반응하는 항원 제시 세포와 접촉된 T 세포의 분율을 판단하는 단계를 포함하는 방법.
28.
항목 1 내지 27 중 어느 한 항목에 있어서, T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계가 ELISpot 또는 FluoroSpot 기술을 이용하여 수행하는 것인 방법.
29.
항목 1 내지 28 중 어느 한 항목에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가 50 이상의 아미노산, 바람직하게는 75 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 100 이상의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
30.
항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가 단백질 에피토프 시그니처 태그(PrEST) 형태인 방법.
31.
항목 1 내지 30 중 어느 한 항목에 있어서, T 세포 시료가 인간으로부터 유래되고, 후보 항원 폴리펩타이드 서열이 인간으로부터 유래되는 것인 방법.
32.
항목 1 내지 31 중 어느 한 항목에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가, 질병과 연관된 것으로 공지되어 있거나 의심되는 항원으로부터 유래되는 것인 방법.
33.
항목 1 내지 32 중 어느 한 항목에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가,
a.
자가면역 질환으로 영향을 받는 조직 또는 세포에서 고도로 발현되는 것으로 공지된 폴리펩타이드;
b.
신생물 질환과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드;
c.
자가면역 질환과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드;
d.
감염성 질환과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드; 또는
e.
알레르기 또는 유사한 과민증과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드
로부터 유래되는 것인 방법.
34.
항목 1 내지 33 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 대상에서 자가반응성을 진단하기 위한 것이며,
a.
후보 펩타이드 자가항원이 밀접하게 부착된 포식성 입자를 제공하는 단계로서, 폴리펩타이드가 부착된 입자는 변성 세척으로 처리되어, 후속 단계를 방해하지 않을 정도로 충분히 낮은 내독소 수준이 유도된 것인 단계;
b.
생존 가능한 T 세포 및 생존 가능한 항원 제시 세포를 포함하는, 시험 대상으로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 시료를 제공하는 단계;
c.
항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 허용하고 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T 세포의 특이적인 활성화를 허용하는 조건 하에, PBMC 시료를 시험관내에서 입자와 접촉시키는 단계;
d.
접촉된 PBMC 시료 내의 활성화된 T 세포의 분율을 정량화하는 단계; 및
e.
정량화된 분율을 건강한 대상 유래의 동등하게 정량화된 분율과 비교하는 단계로서, 시험 대상 내의 더 높은 분율의 활성화된 T 세포가, 시험 대상 내의 후보 자가항원에 대한 자가반응성을 시사하는 것인 단계
를 포함하는 방법.
본 발명은 하기에서 보다 상세히 개시된 바와 같은 항원 특이적 T 세포 활성화의 검정을 위한 방법 및 수단을 제공한다. 항원 특이적 T 세포 활성화에 대한 검정에서 내독소-오염된 폴리펩타이드와 연관된 문제점을 해결함으로써, 이러한 방법 및 수단은 바이오마커 발견, 진단, 환자에서 질병 진행의 모니터링, 치료 표적의 식별 등을 위해 새로운 폴리펩타이드 및 기존의 폴리펩타이드 수합물들의 대규모 스크리닝을 가능하게 하고 용이하게 한다.
항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법
제1 양태에서, 본 발명은 시험관내에서 항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a.
후보 항원 폴리펩타이드가 밀접하게 부착된 포식성 입자를 제공하는 단계로서, 여기서, 폴리펩타이드가 부착된 입자를 변성 세척으로 처리하여, 본 방법의 후속 단계 (b-f)를 방해하지 않을 정도로 충분히 낮은 내독소 수준을 유도하는 단계;
b.
생존 가능한 항원 제시 세포(APC)를 제공하는 단계;
c.
항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 허용하는 조건 하에, 세척된 입자를 시험관내에서 상기 입자와 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
d.
생존 가능한 T 세포를 포함하는 검정될 T 세포 시료를 제공하는 단계;
e.
항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T 세포의 특이적인 활성화를 허용하는 조건 하에, T 세포 시료를 시험관내에서 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
f.
T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계
를 포함한다.
본 방법은 추가로, 단계 (a') 후보 폴리펩타이드를 포식성 입자와 밀접하게 부착시키는 단계 및/또는 (a'') 입자와 부착된 후보 항원을 변성 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 제1 양태의 방법은
a.
포식성 입자를 제공하는 단계;
b.
후보 항원 폴리펩타이드를 입자에 밀접하게 부착시키는 단계;
c.
폴리펩타이드가 부착된 입자를 변성 세척하여, 본 방법의 후속 단계 (d-h) 중 임의의 단계를 방해하지 않을 정도로 충분히 낮은 내독소 수준을 유도하는 단계;
d.
생존 가능한 항원 제시 세포를 제공하는 단계;
e.
항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 허용하는 조건 하에, 세척된 입자를 시험관내에서 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
f.
생존 가능한 T 세포를 포함하는 검정될 T 세포 시료를 제공하는 단계;
g.
항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T 세포의 특이적인 활성화를 허용하는 조건 하에, T 세포 시료를 시험관내에서 입자와 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
h.
T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계
를 포함할 수 있다.
세척된 입자, 항원 제시 세포 및 T 세포 시료는 동일한 용기 내에서 동시에 접촉될 수 있다. 세포의 항원 특이적 활성화를 허용하는 조건에 있어서, T 세포 시료를 입자와 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계에서의 조건은, 비-항원 특이적인 T 세포 활성화로 인한 백그라운드가 검정을 방해하지 않을 정도로 충분히 낮아야 한다.
후보 항원 폴리펩타이드
후보 항원 폴리펩타이드 바람직하게는 50 이상의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 적어도 75 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 100 이상의 아미노산을 포함한다. 후보 항원 폴리펩타이드는 단백질 에피토프 시그니처 태그(PrEST) 형태일 수 있다. PrEST로 구성된 큰 단백질 라이브러리, 예를 들어 인간 아틀라스 프로젝트 내에서 제조된 라이브러리가 이미 존재한다(문헌[Uhlen M, Fagerberg L, Hallstrom BM, Lindskog C, Oksvold P, Mardinoglu A, et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 2015;347(6220):1260419] 참조). PrEST는 상응하는 전장 단백질에 독특한 아미노산 서열을 함유하고, 대부분의 인간 단백질들에 대한 항체를 생성하기 위해 대규모 인간 아틀라스 프로젝트에 사용되어 왔다. 동일한 인간 단백질에 대한 몇몇 PrEST의 사용은, 관련된 T 세포 에피토프를 발견할 기회를 증가시킨다. APC에 의해 제시되는 단편보다 더 큰 항원 폴리펩타이드가 또한, APC에 의한 항원 분해가 균일한 과정이 아니기 때문에 각각의 항원의 광범위하게 다양한 에피토프들이 제시될 것임을 보장한다. 즉, 소정의 크기의 폴리펩타이드 항원들의 사용은, APC의 포식작용 경로를 이용함으로써 가능해지고, 세포성 가공 없이 MHC-수용체에 직접적으로 결합할 수 있는 짧은 펩타이드 내에서 항원을 제시하는 것과는 대조적으로, 더 적은 항원 폴리펩타이드를 사용해서도 항원의 개선된 검출을 허용한다.
후보 항원 폴리펩타이드는 질병과 연관이 있는 것으로 공지되거나 의심되는 항원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 후보 항원 폴리펩타이드는,
a.
자가면역 질환으로 영향을 받는 조직 또는 세포에서 고도로 발현되는 것으로 공지된 폴리펩타이드; 예로는 프로인슐린, 수초-부착된 단백질이 있음;
b.
신생물 질환과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드; 예로는 에스트로겐 수용체, 표피 성장 인자 수용체, 사이클린-의존적 키나제 1이 있음;
c.
자가면역 질환과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드; 예로는 수초 희돌기교세포 단백질, 수초 염기성 단백질, 트랜스알돌라제(Transaldolase)가 있음;
d.
감염성 질환과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드; 예로는 바이러스 캡시드 항원, 박테리아 장독소(enterotoxin)가 있음;
e.
알레르기 또는 유사한 과민증과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드; 예로는 Canf 1, Equc1, Feld1가 있음;
f.
공지된 종양 항원; 예를 들어 p53, ERBB2(Erb-B2 수용체 티로신 키나제 2), PIK3CA(포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제)에서 보편적인 돌연변이에 의해 형성되는 네오항원(neoantigen);
g.
공지된 변형된 단백질, 예컨대 시트룰린화된(citrullinated), 변이체 또는 인산화된 단백질
로부터 유래된다.
T 세포 시료 및 후보 항원 폴리펩타이드는 동일한 종 또는 상이한 종들로부터 유래된다. 예를 들어 자가면역력 또는 신생물 질환의 연구에 있어서, T 세포 시료 및 후보 항원 폴리펩타이드는 바람직하게는 동일한 종으로부터 유래된다. 감염성 질환의 연구에 있어서, T 세포 시료는 숙주로부터 유래되는 반면, 후보 항원 폴리펩타이드는 관심 병원체로부터 유래된다. 알레르기 또는 유사한 과민증의 연구에 있어서, T 세포 시료는 관심 피험자로부터 유래되는 반면, 후보 항원 폴리펩타이드는 피험자에서 알레르기 또는 다른 과민 반응을 이끌어내는 것으로 공지되거나 의심되는 상이한 종으로부터 유래된다.
T 세포 시료가 인간으로부터 유래될 수 있고, 후보 항원 폴리펩타이드 서열이 인간으로부터 유래될 수 있다.
입자 특성
입자는 항원 제시 세포(APC; 하기에 고찰됨)에 의해 포식될 수 있다. APC는 많은 상이한 물질 및 모양의 입자들을 포식할 수 있다. 대조적으로, 입자의 크기는 포식작용을 제한한다. 너무 작은 크기 및 세포는 입자를 포식하는 것을 유발하지 못할 것이다. 너무 큰 크기 및 세포는, 입자가 세포에 맞춰지지(fit) 않을 것이기 때문에 입자를 포식할 수 없을 것이다.
입자의 최대 치수는 5.6 ㎛ 미만, 바람직하게는 4 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 3 ㎛ 미만, 보다 더 바람직하게는 0.5 ㎛ 내지 2 ㎛, 또는 가장 바람직하게는 약 1 ㎛일 수 있다. 입자는 실질적으로 구형일 수 있으며, 이 경우, 치수는 직경을 지칭할 것이다.
박테리아의 크기와 유사한 크기는, APC에 의한 완전한 포식작용을 용이하게 한다. 이를 보장하기 위해, 항원은 APC에 의해 분해되고, 후속적으로 MHCII를 통해 T 세포에 제시된다. 최적의 크기는 특정한 APC의 유형에 따라 다르고, 일상적인 실험에 의해 확인될 수 있다(실시예 5, 도 5 참조).
입자는 상자성을 가질 수 있으며, 이는 입자가 자석에 의해 수합되고/거나 제자리에 고정될 수 있게 함으로써 하기 고찰된 변성 세척을 용이하게 한다. 그러나, 세척을 다른 수단들에 의해, 예를 들어 입자를 컬럼 내에 고정시키거나 입자를 중력 또는 원심분리에 의해 침강시킴으로써 수행하는 것이 또한 가능하다.
항원 폴리펩타이드와 입자의 부착
항원 폴리펩타이드는, 항원을 입자로부터 해리시키지 않으면서 하기 고찰된 바와 같은 변성 세척을 수행하는 것을 허용하는 방식으로 입자에 부착된다.
폴리펩타이드를 입자에 부착시키는 한 가지 가능한 방식은 실시예 1에 나타나 있다. 그러나, 정확한 부착 방식은 본 발명의 방법에 중요하지 않다. 바람직하게는, 후보 항원 폴리펩타이드는 입자에 공유 결합된다. 대안적으로, 후보 항원 폴리펩타이드는 금속 킬레이트를 통해 입자에 결합될 수 있다.
예를 들어, 금속 킬레이트 리간드, 예컨대 이미노다이아세트산과 연결된 입자는 금속 이온, 예컨대 Cu2+, Zn2+, Ca2+, Co2+ 또는 Fe3+에 결합할 수 있다. 이들 금속 킬레이트는 다시, 예를 들어 히스티딘 또는 시스테인을 함유하는 단백질 및 펩타이드에 큰 강도로 결합할 수 있다. 따라서, 금속 킬레이트를 가진 입자는, 결합된 펩타이드/단백질 내의 LPS 및 다른 오염성 구성성분들의 양을 감소시키기 위해 엄격한 세척을 허용하는 방식으로, 펩타이드/단백질에 비공유 흡착될 수 있다.
변성 세척
변성 세척은, 후보 항원 폴리펩타이드 내의 내독소의 수준을, 항원 특이적 T 세포 활성화 정도를 판단하는 이후의 단계를 방해하지 않는 수준까지 감소시키기 위해 수행된다.
내독소가 폴리펩타이드에 밀접하게 부착하기 때문에, 정의상 2차 및 3차 구조를 적어도 일시적으로 교란시키는 변성 세척의 수행은 고도로 유리하고, 많은 경우 내독소를 폴리펩타이드로부터 해리시키는 데 필수적이다. 본 출원에서, 심지어 매우 낮은 양의 내독소도 방해를 유발한다.
항원 제시 세포는 항원 폴리펩타이드를 포식한 후 작은 단편으로 분해할 것이며, 따라서 일시적인 변성 및 비가역적인 변성(3D-구조의 교란) 둘 다가 관용될 수 있다. 본 발명에 의해 개시된 바와 같은 입자와의 부착은 변성된 단백질의 취급을 허용하며, 부착되지 않는다면 이러한 변성된 단백질은 불용성으로 되거나 응집될 수 있다.
실시예 2 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 특정한 변성 세척 방식은 본 발명의 맥락에서 중요하지 않다. 예를 들어, 변성 세척은 부착된 폴리펩타이드를 높은 pH, 낮은 pH, 고온, 변성제 또는 이들의 조합으로 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 변성 세척은 부착된 폴리펩타이드를 높은 pH 또는 강한 변성제, 예컨대 8 M 우레아 또는 6 M 구아니딘-HCl로 처리하는 단계를 포함한다. 가장 바람직하게는, 변성 세척은 부착된 폴리펩타이드를 13.0 이상, 보다 바람직하게는 14.0 이상, 가장 바람직하게는 14.3 이상의 높은 pH로 처리하는 단계를 포함한다. 변성은 부착된 폴리펩타이드를 1 M 내지 5 M, 바람직하게는 1 M 내지 3 M, 보다 바람직하게는 1.5 M 내지 2.5 M, 가장 바람직하게는 2 M의 강알칼리, 예컨대 NaOH 또는 KOH, 바람직하게는 NaOH를 이용한 세척으로 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
변성 세척의 특정한 이점은, 입자 및 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 조제물이 멸균되도록 조건이 선택될 수 있다는 점이다. 조제물이 생존 가능한 미생물에 의해 오염되는 경우, 세포 배양물에서의 후속 단계가 위태로워지는(compromised) 경향이 있다. 특히, 높은 pH 세척(예를 들어 pH >14)은 편리하게는, 제조물을 동시에 그리고 신속하게 멸균하고, 내독소를 제거하는 데 효과적인 변성 세척을 달성할 수 있다.
유리하게는, 변성 세척은, 내독소를 분해하거나 불활성화시키며, 그 외에도 내독소를 배출하는 것이다. 높은 pH 세척(예를 들어 pH >14)은 내독소에 대해 불활성화 효과를 가진다.
세척은 단일 세척 또는 몇 번의 반복된 세척, 예컨대 2회, 3회, 4회 또는 5회의 세척을 포함할 수 있다.
변성 세척은, 내독소가 항원 특이적 T 세포 활성화가 적절하게 검출되는 것을 방해할 정도로 너무 높지 않도록, 본원에 개시된 바와 같은 항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법과 융화성인 후보 항원 폴리펩타이드 내의 내독소 수준을 유도해야 한다. 잔여 내독소의 수준은 편리하게는, 본원의 실시예 2에 기재된 바와 같이 단핵구 활성화 검정(IL-1β/IL-6 FluoroSpot)을 사용하여 시험될 수 있다. 내독소의 관용 수준은 상황, 특히 항원 농도에 따라 다르다. 그러나, 항원 내의 내독소의 양은 바람직하게는, T 세포 활성화 검정에서 내독소의 최종 농도가 100 pg/ml 미만(즉, 0 pg/ml 내지 100 pg/ml), 바람직하게는 50 pg/ml 미만, 보다 바람직하게는 25 pg/ml 미만, 가장 바람직하게는 10 pg/ml 미만이 되는 양이다. 시료 내의 내독소의 측정 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 LAL 검정법이 있다.
항원 제시 세포(APC) 및 T 세포 시료
본 발명의 맥락에서, APC는 전문적인 항원 제시 세포, 예컨대 단핵구/대식세포 또는 수지상세포이다. APC는 1차(primary) 세포 또는 불멸화된 세포일 수 있다.
APC는 이들 APC가, T 세포가 반응할 수 있는 항원 특이적인(MHC 제약된) 맥락에서, T 세포에 항원을 제시할 수 있도록 T 세포 시료의 T 세포와 융화되어야 한다. APC 및 T 세포 시료는 바람직하게는 동일한 종으로부터 수득되고, MHC 수용체에 대해 공여자-매칭된다. 그러나, 상이한 종들 유래의 일반적으로 조작된 APC의 사용이 또한 고려된다.
항원 제시 세포 및 T 세포 시료가 동일한 개체로부터 유래되는 경우, APC와 T 세포 사이에서 임의의 미스매치 잠재성이 피해진다.
항원 제시 세포 및 T 세포 시료는 동일한 혈액 시료로부터 유래될 수 있으며, 이는 실용적인 관점에서 유리하다. 항원 제시 세포 및 T 세포 시료는 동일한 개체의 PBMC 시료로부터 유래될 수 있다. 말초 혈액 시료로부터 PBMC를 수득하는 것은 일상적인 프로토콜이며, 동일한 시점에 동일한 개체로부터 APC 및 T 세포 둘 다에 대한 유용한 공급원을 제공한다.
PBMC 시료는 신선하게 사용되거나 동결 처리될 수 있다. 동결된 세포의 사용 가능성은 수송 관점에서 큰 실용적인 이점을 가진다.
T 세포 시료는 종양, 바람직하게는 종양 내의 림프관으로부터 유래될 수 있다.
T 세포 시료는 또한, 복수(ascite)로부터 유래될 수 있다.
T 세포 시료는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 둘 다 포함하는 전체 PBMC, 정제된 T 세포 집단, 또는 (a) 특정 T 세포 집단(들)이 제거된 PBMC를 포함할 수 있다.
T 세포 활성화 정도의 확인
본 방법은 추가로, T 세포 활성화 정도를 관련 참조 물질과 비교함으로써, 참조 물질과 비교하여 시료 내의 더 높은 T 세포 활성화 정도가, 후보 항원이 시료에서 항원 특이적 T 세포 활성화를 유도한다는 결론을 시사하는 단계를 포함할 수 있다. 참조는 "활성화"를 정의하는 데 중요하며, 따라서 활성화 정도는 바람직하게는 참조 시료와의 비교에서 정의된다. 참조 시료는 예를 들어, 환자 시료를 분석할 때 정상적인 건강한 개체의 시료, 종양 또는 종양 드레이닝(draining) 림프절 시료를 분석할 때 정상적인 조직의 시료, 또는 치료 효과를 추적할 때 치료 이전의 시료일 수 있다. 참조 시료는, 진단/예후 결론에 대한 역치를 설정하고, 항원 특이적 양성 효과, 즉 활성화, 또는 음성 효과, 즉 하향조절을 확인하는 데 사용된다.
T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계는 시료 내의 활성화된 T 세포의 분율, 즉 시료 내의 총 T 세포와 비교하여 활성화된 T 세포의 수를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 참조 시료 내의 활성화된 세포의 분율과 비교하여 활성화된 세포의 분율은, 특이적인 항원에 대한 T 세포 활성화의 규모의 측정값을 제공할 것이다. 바람직하게는 각각의 분석에서, 개별 시료 내의 자발적인 활성화의 수준("백그라운드 활성화 수준")은 항원이 없이 인큐베이션된 시료, 즉 음성 대조군에서 확인된다. 백그라운드 활성화는 분석 시 보상될 수 있으며; 즉, 활성화 분율은, 음성 대조군에 대한 활성화 분율이 제해진(subtracted) 네트값(net value)을 기반으로 계산될 수 있다.
실시예 3에 나타낸 바와 같이, T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계는 ELISpot/FluoroSpot-기술 또는 증식 검정법(즉, 티미딘 혼입)을 사용하여 수행될 수 있다. 그러나, 이러한 목적에 적합한 다른 검정법 및 기술들도 공지되어 있으며, 사용될 수 있다. T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계는, 인터페론 감마(IFN-γ), 인터루킨 17(IL-17), 인터루킨 22(IL-22) 또는 이들의 조합의 분비에 의해 반응하는 항원 제시 세포와 접촉된 T 세포의 분율을 예를 들어 ELISpot 또는 FluoroSpot 검정법에 의해 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 관련된 피분석물(analyte)(사이토카인들의 조합(들))이 특정한 질병 또는 질환을 분석하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 알레르기 환자를 분석하는 경우, Th1/Th17 사이토카인보다는 Th2 사이토카인이 분석될 수 있다. T-reg 사이토카인은 암, 알레르기, 및 백신 치료를 추적할 때 관심있을 수 있다. 따라서, FluoroSpot 기술은 다양한 질환들에서 다양한 후보 항원 펩타이드들에 대한 관련된 활성화 프로파일의 분석을 가능하게 한다. 이는 예를 들어 환자, 질병 중증도 및 진행 사이에서 불균일성(heterogeneity)에 대한 정보를 부가한다.
실시예 3에 나타낸 바와 같이, IL-17 및/또는 IL-22 분비의 확인은 놀랍게도, MS 환자를 건강한 대조군으로부터 구별하는 데 있어서 IFN-γ보다 더 양호하다. 따라서, T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계는 바람직하게는, IL-17 및/또는 IL-22의 분비에 의해 반응하는 항원 제시 세포와 접촉된 T 세포의 분율을 판단하는 단계를 포함하고, 이러한 방법은 다발성 경화증을 진단하거나 다발성 경화증의 경과를 추적하기 위한 것이다. 즉, MS를 앓고 있거나 MS를 앓고 있는 것으로 의심되는 피험자로부터 유래된 T 세포 시료가 바람직하게는, 후보 항원에 반응하여 IL-17 및/또는 IL-22 분비에 대해 분석된다.
멀티플렉스 분석
실시예 4에 나타낸 바와 같이, 수 개의 후보 항원들이 동일한 T 세포 시료에 대해 검정될 수 있다. 바람직하게는, 10 이상의 후보 항원들이 동일한 T 세포 시료에 대해 검정된다. 본 발명의 방법을 이용하면, 부가적인 시료는 본질적으로 실험실 작업을 많이 증가시키지 않는다. 본원에서 본 발명의 방법의 강점은, 많은 노력 없이도 다수의 항원들을 스크리닝하는 것이 용이하다는 점이다. 이의 이점은 예를 들어, 가능한 자가항원들의 대규모 스크리닝의 수행이 가능하다는 것이, 참된 자가항원을 발견할 기회를 증가시킨다는 점이다.
자가반응성의 진단
제1 양태의 방법은 시험 대상에서 자가반응성을 진단하는 방법일 수 있으며, 상기 방법은
a.
후보 펩타이드 자가항원이 밀접하게 부착된 포식성 입자를 제공하는 단계로서, 여기서, 폴리펩타이드가 부착된 입자를 변성 세척으로 처리하여, 후속 단계를 방해하지 않을 정도로 충분히 낮은 내독소 수준을 유도하는 단계;
b.
생존 가능한 T 세포 및 생존 가능한 항원 제시 세포를 포함하는, 시험 대상으로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 시료를 제공하는 단계;
c.
항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 허용하고 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T 세포의 특이적인 활성화를 허용하는 조건 하에, PBMC 시료를 시험관내에서 입자와 접촉시키는 단계;
d.
접촉된 PBMC 시료 내의 활성화된 T 세포의 분율을 정량화하는 단계; 및
e.
정량화된 분율을 건강한 대상 유래의 동등하게 정량화된 분율과 비교함으로써, 시험 대상 내의 활성화된 T 세포의 더 높은 분율이 시험 대상 내의 후보 자가항원에 대한 자가반응성을 가리키는 것인, 단계
를 포함한다.
실시예 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 많은 다양한 자가항원들을 동시에 신속하게 스크리닝하기 위한 강력한 툴을 제공하며, MS로 한정되지 않는다. 스크리닝 가능한 후보 단백질 라이브러리는 질병 및 환자에 따라 용이하게 디자인될 수 있다.
본 방법은, 항원 특이적인 T 세포가 질병의 특징이고 항원 라이브러리가 문제의 질병에 적응되는 한, 자가면역 질환 외에도 다른 염증성 질병들에 사용될 수 있다.
용어 "포함하는(comprising)"은 수반하는(including) 것으로서 해석되어야 하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 모든 참조문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 제목 및 부제와 함께 섹션으로의 본 개시내용의 배열은 단순히 가독성을 개선하기 위한 것일 뿐, 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 특히 분할(division)은 상이한 제목 및 부제들 하에 특징들을 서로 조합하는 것을 임의의 방식으로 배제하거나 제한하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 비드에 폴리펩타이드의 커플링
폴리펩타이드를 유리(free) 카르복실산 기를 함유하는 비드에 공유 커플링하였다. 이 실시예에서, Dynabeads® MyOne™ 카르복실산(ThermoFischer Scientific)을 사용하였다(1 ㎛ 직경 구체). 비신코닌산(bicinchoninic acid), BCA 단백질 검정법을 사용하여, 성공적인 커플링을 보장하기 위해 커플링 이전 및 이후에 단백질 농도를 측정하였다. 몇몇 폴리펩타이드들을 시험하였으며, 평균 48.7 ㎍(평균: 48.7, SD: 20.5, N=10)을 1 mg 비드 당 커플링하였다. 제조업체의 설명에 따라, 50 ㎍ 폴리펩타이드가 1 mg 비드 당 커플링될 수 있으며, 이는, 이 실시예에서 수행된 커플링의 효율이 높았음을 가리킨다.
실시예 2: 변성 세척에 의한 내독소 제거
상이한 유형의 변성 세척들에 의한 내독소 제거를 시험하기 위해, 4개의 상이한 변성 세척 조건들을 시험하였다: (a) 높은 pH(2 M NaOH pH 14.3), (b) 열(95℃) 및 변성제((c) 8 M 우레아 및 (d) 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드). 단핵구 활성이 내독소에 의해 강하게 증가되고 따라서 단핵구 활성화가 잔여 LPS의 모니터링에 사용될 수 있기 때문에, 잔여 내독소 수준을 단핵구 활성화 검정법(IL-1β/IL-6 FluoroSpot)을 사용하여 시험하였다.
모든 시험된 유형의 변성 세척들은, 단핵구 활성화의 양을 비세척된 비드와 비교하여 유의하게 낮추었다(도 1 참조)(모든 세척들에 대해 P<0.0001). 변성 세척은 효과적이어서, 세척된 비드는 세포를 음성 대조군과 유사한 정도까지 자극하였다. 2 M NaOH 및 후속해서 근접하게는 8 M 우레아를 이용한 세척은 내독소를 최저 양으로 유도하였다.
실시예 3: T 세포 활성화 검정법
FluoroSpot
FluoroSpot 검정법을, 16명의 다발성 경화증 환자들 및 9명의 건강한 대조군들 유래의 시료를 이용하여 수행하였다. 환자 및 대조군 유래의 PBMC를 FluoroSpot 플레이트 내에서 의심되는 자가항원과 함께 인큐베이션하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 몇몇의 MS 환자들은 활성화된 세포를 유의하게 더 높은 수로 보여주었다(패널 a). MS 환자는 IL-22 분비성 활성화된 세포를 37.4(95%CI 13.0-52.9)의 평균 수로 가졌으며, 한편 건강한 대조군은 활성화된 세포를 3.3(95%CI 0.97-5.6)의 평균 수로 가졌다. 차이의 P 값 = 0.0062. IL-17 분비성 활성화된 세포의 경우, 그 수는 0.28(CI95% -1.4-2.0)과 비교하여 환자에서 14.7(CI95% 5.3-24.1)이었으며, 차이의 P 값 <0.0007이었다(패널 b). 그러나, IFNγ 분비성 세포의 경우, 환자에서 평균 수가 80.0(CI95% 22.3-138)인 반면 대조군에서 33(CI95% 7.1-59.0)이었으며 P=0.495(패널 c)로, 그 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다. 유의성은 만 휘트니 U 테스트를 사용하여 계산하였다.
이들 결과는, 비드에 커플링된 항원을 이용한 T 세포의 활성화가 FluoroSpot 검정법을 이용하여 측정될 수 있으며, 환자 대 건강한 대조군의 비교가 수행될 수 있음을 보여준다. 놀랍게는, T 세포 활성화에 전형적인 마커인 IFNγ는 환자 대 대조군 비교에서 가장 약한 차이를 보여주었다. 그러나, IL-17 및 IL-22가 둘 다, 환자와 대조군 사이에서 강한 유의한 차이를 보여주었으며, 이는 이들 사이토카인이, MS에서 자가항원을 찾을 때 분석하기 더 적합한 사이토카인일 것임을 가리킨다.
증식 검정법
티미딘 혼입을 이용한 증식 검정법. 오브알부민(OVA) 면역화된 마우스의 비장세포를 OVA 또는 BSA 커플링된 비드와 함께 인큐베이션하여, 항원 특이적인 증식을 측정하였다. 비드와 함께 인큐베이션된 세포의 증식을 자극 지수(SI; stimulation index)로서 표현하였다(도 2에 나타낸 바와 같이, OVA-비드와 함께 인큐베이션된 세포는 증식 증가를 나타내었으며, SI는 2.69(95%CI 1.6 - 3.78, P<0.005)이었음). BSA와 함께 인큐베이션된 세포는 증식 증가에 실패하였으며, SI는 0.9(95%CI 0.7-1.1, P=0.37)이었다.
이들 결과는, 비드에 커플링된 항원을 이용한 면역 세포(이 실시예에서는 비장세포)의 활성화가 증식 검정법에 의해 측정될 수 있음을 보여준다. 이는 또한, OVA 커플링된 비드가 증식을 자극하였으나 BSA 커플링된 비드는 증식을 유도하는 데 완전히 실패하였기 때문에, 관찰된 증식이 항원 특이점임을 보여준다. 실험은, 비드에 커플링된 항원이 항원 특이적 T 세포 증식의 시험관내 자극에 사용될 수 있음을 보여준다. 티미딘 혼입은 증식을 측정하기 위한 단지 하나의 방법이며, 따라서 증식을 측정하기 위한 다른 방법들, 예를 들어 CFSA 희석 및 BrdU 혼입 검정법이 또한 이용 가능할 것이다.
실시예 4: MS에서 125개 단백질의 라이브러리에 대한 자가항원 스크린
다발성 경화증에서 자가항원의 식별; 비드에 커플링된 다수의 PrEST들에 대한 T 세포 활성화의 측정은, IFNγ/IL-22/IL-17A FluoroSpot을 T 세포 활성화에 대한 검정법으로서 사용한다. 이와 유사한 스크리닝은, 건강한 대조군과 비교하여 MS 환자의 PBMC에서 더 높은 T 세포 반응을 자극하는 항원들을 검출함으로써 가능한 자가항원을 식별하고, 어떤 항원을 추가로 분석해야 하는지 결정하는 것을 돕는다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 16명의 환자 및 9명의 건강한 대조군의 이러한 스크리닝에서, 평균 환자 및 평균 대조군 수 활성화된 세포 사이에서 통계학적으로 유의한 차이는 투-웨이 ANOVA를 사용하여 분석되는 경우 확인될 수 있다. IL-22 분비성 활성화된 T 세포의 경우, 5개의 항원들인 항원 #6(P<0.0001), 항원 #18(P<0.0001), 항원 #23(P<0.0001), 항원 #29(P<0.0001) 및 항원 #33(P<0.05)에서 차이가 확인될 수 있었다(패널 a). IL-17 분비성 T 세포의 경우, 환자와 대조군 사이의 차이가 동일한 5개의 항원들인 항원 #6(P<0.05), 항원 #18(P<0.0001), 항원 #23(P<0.01), 항원 #29(P<0.0001) 및 항원 #33(P<0.05)에 대해 확인될 수 있었다(패널 b). IFNγ에 대해, 차이는 항원 #18(p<0.0001)에 대해서만 확인될 수 있었다(패널 c).
이들 결과는, 본 발명의 방법이 MS에서 새로운 가능한 자가항원을 식별하기 위한 툴인 자가항원 스크리닝으로서 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 5: 포식 가능한 비드에 대한 적합한 비드 크기의 식별
티미딘 혼입을 이용한 증식 검정법을 사용하여, 항원 특이적 T 세포 활성화에 미치는 비드 크기의 효과를 시험하였다. 오브알부민(OVA) 면역화된 마우스의 비장세포를 상이한 크기의 OVA 커플링된 비드들을 이용하여 자극하여, 항원 특이적인 증식을 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 직경이 0.2 ㎛인 OVA-비드와 함께 인큐베이션된 세포는 증식 증가를 보여주었으며, 이때 평균 SI는 4.1(95%CI 2.4-5.8, P=0.007)이었다. 직경이 1 ㎛인 OVA-비드와 함께 인큐베이션된 세포는 증식 증가를 보여주었으며, 이때 평균 SI는 8.4(95%CI 6.1-10.6, P<0.005)이었다. 직경이 5.6 ㎛인 OVA-비드와 함께 인큐베이션된 세포는 증식을 자극하는 데 실패하였으며, 이때 평균 SI는 1.1(95%CI 0.4-2.7, P=0.876)이었다.
이들 결과는, 상이한 크기의 비드들에 커플링된 항원이 세포 증식을 자극할 수 있음을 보여준다. 직경이 약 1 ㎛인 비드가 세포 자극의 측면에서 가장 효율적인 것으로 보이며, 크기가 0.2 ㎛까지 줄어든 비드도 여전히 작동한다. 크기가 1 ㎛보다 큰 비드도 작동하지만, 직경이 5.6 ㎛까지 근접하게 됨에 따라 비드는 세포를 자극하는 데 완전히 실패하는 것으로 예측하는 것이 합리적이다. 1 ㎛가 박테리아 크기와 유사하기 때문에 이 크기가 최적의 크기임을 가정하는 것이 합리적이다. 우리의 면역계는 이 크기의 미생물/입자를 포식하고 반응하도록 진화하였다. 정상적인 항원 제시 세포는 크기가 10 ㎛ 내지 15 ㎛의 범위이다.
재료 및 방법
실시예 1
유리 카르복실산 기를 함유하는 상자성 비드에 대한 단백질의 공유 커플링
이 실시예에서, 직경이 1 ㎛인 Dynabeads® MyOne™ 카르복실산(ThermoFischer Scientific)을 사용하여, 커플링 절차를 제조업체의 설명에 따라 수행하였다(NHS(N-하이드록시숙신이미드) 및 EDC(에틸 카르보다이이미드)를 사용하는 2-단계 절차).
비드를, MES-완충제(25 mM MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), pH 6)를 이용하여 2회 세척하였다. 그런 다음, MES-완충제 중 50 mg/ml NHS(N-하이드록시숙신이미드) 및 50 mg/ml EDC(N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보다이이미드)를 비드에 첨가함으로써 카르복실산 기를 활성화시키고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 비드를 자석을 이용하여 수합하고, 상층액을 제거한 다음, 비드를 MES-완충제를 이용하여 2회 세척하였다. 단백질을 MES-완충제 내에서 1 mg/ml, 총 100 ug의 농도까지 희석시키고, 비드에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비드를 자석을 이용하여 수합하고, 상층액을 제거한 다음, 단백질-농도 측정을 위해 모아 두었다. 50 mM Tris pH 7.4를 15분 동안 이용하여, 비반응된 활성화된 카르복실산 기를 ?칭(quench)시켰다. 그런 다음, 비드를 PBS pH 7.4로 세척하고, -80℃에서 저장하였다.
비드에 커플링된 단백질의 양을 측정하기 위해, BCA 단백질 검정법 키트(Pierce BCA 단백질 검정법 키트, ThermoFisher Scientific)를 사용하여, 커플링 이전에 단백질의 단백질 농도뿐만 아니라 커플링 이후에 상층액 중 단백질 농도를 측정하였다. BCA-검정법을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하였다.
실시예 2
변성 세척에 의한 내독소 제거
비드를 이. 콜라이에서 생성된 재조합 단백질과 커플링하였다. 단백질-커플링된 비드를 몇몇 상이한 변성 조건들에서 세척하여, 내독소의 제거를 보장하였다. 잔여 내독소를 단핵구 반응성 검정법(IL1B/IL6 FluoroSpot-검정법, MABTECH, 스웨덴)을 사용하여 측정하였다.
내독소 제거를 위해, 비드를 3개의 상이한 세척-완충제들인 2 M NaOH pH 14.3, 8 M 우레아 또는 6 M 구아니딘(구아니딘-HCl) 중 하나를 이용하여 세척하였으며, 이들은 모두 RT에서 멸균수 중에 있었으며, 또는 이들을 95℃에서 PBS 내에서 인큐베이션하였다. 비드를 완충제 내에 현탁시키고, 4분 동안 교반한 다음, 자석을 이용하여 수합하고, 상층액을 제거하였다. 이를 3회 반복하였다. 열 처리된 비드를 PBS pH 7.4에 넣었으며, 95℃에서 5분 동안 가열 블록(heating block) 내에 넣었고, 그런 다음 자석을 이용하여 수합하였으며, 상층액을 제거하였다. 이를 3회 반복하였다. 그런 다음, 비드를 멸균 PBS로 3회 세척하여, 임의의 잔여 세척-완충제를 제거하였다.
내독소 수준을 측정하기 위해, 단핵구 반응성 검정법을 사용하였다(IL-1β/IL-6 FluoroSpot-검정법, MABTECH, 스웨덴). 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque(GE Healthcare, 스웨덴 웁살라 소재) 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 세포를 cRPMI(10% 태아 소 혈청, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지)에 현탁시켰다. 3,000,000개의 비드들을 FluoroSpot 플레이트 내의 각각의 웰에, 각각의 유형의 비드 및 각각의 유형의 세척에 대해 4벌 중복으로 첨가하였다. 비세척된 비드, LPS 및 배지를 대조군으로서 사용하였다. 세포를 FluoroSpot 플레이트에 1개 웰 당 200 ㎕ cRPMI 세포 중 10,000개 및 5,000개 세포의 농도로 첨가하였다(각각의 세포 농도 및 각각의 유형의 비드의 2개 웰). 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 보습된 분위기에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 제조업체의 프로토콜에 따라 발색시키고, FluoroSpot 판독기에서 판독하였다.
실시예 3
FluoroSpot
환자 대 대조군 T 세포 활성화 대 MS에서 의심되는 자가항원을 분석하기 위한 FluoroSpot 검정법을 IFNγ/IL17/IL22 FluoroSpot(MABTECH)을 이용하여 진행하였다. 프로토콜은 정확히 실시예 4에 기재된 것이었지만, 여기서 125개 단백질들의 전체 라이브러리 대신에 1개의 항원에 대한 반응만을 분석하였다.
증식 검정법
오브알부민 민감화된 마우스의 비장세포에서 티미딘 혼입을 이용하는 증식 검정법. 자극물로서, 비드(Dynabeads® MyOne™ 카르복실산)에 커플링된 오브알부민(SigmaAldrich) 및 BSA(SigmaAldrich)를 사용하였다.
알루미늄 하이드록사이드에 흡착된 100 ㎍ 오브알부민(Sigma)을 매달 주사함으로써 마우스를 오브알부민에 대해 면역화시켰다. 처음 주사 후 3개월째에, 마우스를 안락사시키고, 비장을 수거하였다. 비장세포를 문헌[Thunberg et al. 2009, Allergy 64:919]에 기재된 바와 같이 표준 절차에 의해 준비하였다.
세포를 cRPMI 내에서 오브알부민 커플링된 비드 또는 BSA 커플링된 비드(1개 세포 당 10개 비드)와 함께 5일 동안 인큐베이션하였다. 모든 세포들을 37℃ 및 6% CO2에서 보습된 분위기에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 1 μCi/웰 [3H] 티미딘을 마지막 18시간의 인큐베이션 동안 세포 배양물에 첨가하였다. 자극된 3벌 중복으로부터 수득된 1분 당 평균 계수(cpm)를 비자극된 세포의 평균 cpm 값으로 나누고, 자극 지수(SI)로서 표현하였다. ≥2.0의 SI-값이 일반적으로 양성으로 여겨진다.
실시예 4
단백질 커플링된 비드(Dynabeads® MyOne™ 카르복실산(ThermoFischer Scientific))를 자극물로서 사용하는 다발성 경화증에서 125개 단백질들의 라이브러리에 대한 자가항원 스크리닝, 및 T 세포 활성화를 측정하기 위한 검정법으로서 FluoroSpot(IFNγ/IL17/IL22 FluoroSpot, MABTECH).
총 18명의 다발성 경화증 환자 및 9명의 건강한 대조군 유래의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하였다. 125개의 상이한 단백질들은 인간 아틀라스 프로젝트 유래의 광범위하게 다양한 인간-특이적 PrEST들로 구성되었다. PrEST를 제조업체의 프로토콜에 따라 비드에 커플링하였다(실시예 1에 기재된 바와 같음).
PBMC를 표준 프로토콜에 따라 Ficoll-Paque(GE Healthcare, 스웨덴 웁살라 소재) 구배 원심분리에 의해 정맥혈 시료(BD Vacutainer EDTA-튜브에서 채혈함)로부터 단리하였다. 세포를 동결 배지(45% FCS, 45% RPMI, 10% DMSO) 내에서 동결시키고, -150℃에 저장하였다.
125개의 상이한 PrEST들을 45개의 상이한 풀들로 풀링(pool)하여 FluoroSpot의 96웰 포맷에 맞췄으며, 후속적으로 2 M NaOH에서 세척하여 내독소를 제거하였다(실시예 2에 기재된 바와 같음). 3,000,000개의 비드를 FluoroSpot 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였으며, 각각의 상이한 풀을 2벌 중복으로 진행시켰다. 항-CD3를 양성 대조군으로서 사용하였으며, 배지 단독 및 네이키드(naked) 비드를 가진 배지를 음성 대조군으로서 사용하였다.
PBMC를 37℃에서 수조 내에서 해동시키고, cRPMI(RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙타비딘)에서 세척하였다. 200 ㎕ cRPMI 중 250,000개 세포를 각각의 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 보습된 분위기에서 44시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 제조업체(Mabtech)의 프로토콜에 따라 발색시키고, FluoroSpot 판독기에서 판독하였다.
실시예 5
오브알부민 민감화된 마우스의 비장세포 및 오브알부민 커플링된 비드를 사용하여, 상이한 크기의 비드들의 유효성을 평가하였다. 표면 상에 카르복실산을 가지고 있으며 직경이 5.6 ㎛, 1 ㎛ 및 0.2 ㎛인 상자성 비드들을 실시예 1의 프로토콜에 따라 오브알부민 또는 소 혈청 알부민에 커플링하였다.
항원 특이적인 T 세포 활성화를 자극하는 비드의 유효성을 시험하기 위해, 증식 검정법(3H 티미딘 혼입을 이용함)을 사용하였다. 비드 농도 : 세포 농도는 5.6 ㎛ 비드의 경우 1:1이며, 1 ㎛ 비드의 경우 10:1이고, 0.2 ㎛ 비드의 경우 500:1이었다. 세포와 함께 인큐베이션하는 동안 총 단백질 농도는 5.6 ㎛, 1 ㎛ 및 0.2 ㎛ 에 대해 각각 125 ng/ml, 160 ng/ml 및 160 ng/ml인 것으로 계산되었다. 증식 검정법을 실시예 3에서와 동일한 방식으로 진행시켰다.
Claims (34)
- 항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법으로서,
a. 후보 항원 폴리펩타이드가 밀접하게 부착된 포식성(phagocytable) 입자를 제공하는 단계로서, 폴리펩타이드가 부착된 입자는 변성 세척으로 처리되어, 후속 단계를 방해하지 않을 정도로 충분히 낮은 내독소 수준이 유도된 것인 단계;
b. 생존 가능한 항원 제시 세포를 제공하는 단계;
c. 항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 허용하는 조건 하에, 세척된 입자를 시험관내에서 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
d. 생존 가능한 T 세포를 포함하는 검정될 T 세포 시료를 제공하는 단계;
e. 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T 세포의 특이적인 활성화를 허용하는 조건 하에, T 세포 시료를 시험관내에서 입자와 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
f. T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계
를 포함하는, 항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법. - 제1항에 있어서, (a') 후보 폴리펩타이드를 포식성 입자와 밀접하게 부착시키는 단계, 및/또는 (a'') 입자와 부착된 후보 항원을 변성 세척으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법으로서,
a. 포식성 입자를 제공하는 단계;
b. 후보 항원 폴리펩타이드를 입자에 밀접하게 부착시키는 단계;
c. 폴리펩타이드가 부착된 입자를 변성 세척으로 처리하여, 후속 단계를 방해하지 않을 정도로 충분히 낮은 내독소 수준을 유도하는 단계;
d. 생존 가능한 항원 제시 세포를 제공하는 단계;
e. 항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 허용하는 조건 하에, 세척된 입자를 시험관내에서 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
f. 생존 가능한 T 세포를 포함하는 검정될 T 세포 시료를 제공하는 단계;
g. 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T 세포의 특이적인 활성화를 허용하는 조건 하에, T 세포 시료를 시험관내에서 입자와 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
h. T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계
를 포함하는, 항원 특이적 T 세포 활성화를 검정하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 활성화 정도를 관련 참조 물질과 비교하는 단계로서, 참조 물질과 비교하여 시료 내의 더 높은 T 세포 활성화 정도는, 후보 항원이 시료에서 항원 특이적 T 세포 활성화를 유도한다는 결론을 시사하는 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계가, 시료 내의 활성화된 T 세포의 분율을 판단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 수 개의 후보 항원들을 동일한 T 세포 시료에 대해 검정하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 10 이상의 후보 항원들을 동일한 T 세포 시료에 대해 검정하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 입자의 최대 치수가 5.6 ㎛ 미만, 바람직하게는 4 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 3 ㎛ 미만, 보다 더 바람직하게는 0.5 ㎛ 내지 2 ㎛ 또는 가장 바람직하게는 약 1 ㎛인 방법.
- 제8항에 있어서, 입자가 실질적으로 구형인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변성 세척이, 폴리펩타이드가 부착된 입자를 높은 pH, 예컨대 pH 13 이상, 보다 바람직하게는 pH 14 이상, 가장 바람직하게는 pH 14.3 이상으로 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 변성 세척이, 폴리펩타이드가 부착된 입자를 낮은 pH로 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변성 세척이, 폴리펩타이드가 부착된 입자를 고온, 예컨대 90℃ 이상, 보다 바람직하게는 92℃ 이상, 가장 바람직하게는 95℃ 이상으로 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 변성 세척이, 폴리펩타이드가 부착된 입자를 충분한 농도, 예컨대 5 M, 6 M, 7 M 또는 8 M 이상에서 변성제, 예컨대 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드로 처리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 변성 세척은, 항원 내의 내독소 양을, T 세포 활성화 검정에서 내독소의 최종 농도가 100 pg/ml 미만, 바람직하게는 50 pg/ml 미만, 보다 바람직하게는 25 pg/ml 미만, 가장 바람직하게는 10 pg/ml 미만이 되도록 유도하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 상자성을 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가 입자에 공유 결합되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가 금속 킬레이트를 통해 입자에 결합되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포 및 T 세포 시료가 동일한 개체로부터 유래된 것인 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포 및 T 세포 시료가 동일한 혈액 시료로부터 유래된 것인 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포 및 T 세포 시료가 동일한 개체의 PBMC 시료로부터 유래된 것인 방법.
- 제20항에 있어서, PBMC 시료가 신선하거나, 동결 처리되어 있던 것인 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 시료가 종양, 바람직하게는 종양 내의 림프관으로부터 유래된 것인 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 시료가 복수(ascite)로부터 유래되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 시료가 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세척된 입자, 항원 제시 세포 및 T 세포 시료가 동시에 접촉되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계가, IFN-γ, IL-17, IL-22 또는 이들의 조합의 분비에 의해 반응하는 항원 제시 세포와 접촉된 T 세포의 분율을 판단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 다발성 경화증을 진단하거나 다발성 경화증의 경과를 추적하기 위한 것이며, T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계를 포함하고, IL-17 및/또는 IL-22의 분비에 의해 반응하는 항원 제시 세포와 접촉된 T 세포의 분율을 판단하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 시료에서 T 세포 활성화 정도를 판단하는 단계를, ELISpot 또는 FluoroSpot 기술을 이용하여 수행하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가 50 이상의 아미노산, 바람직하게는 75 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 100 이상의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가 단백질 에피토프 시그니처 태그(PrEST) 형태인 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 시료가 인간으로부터 유래되고, 후보 항원 폴리펩타이드 서열이 인간으로부터 유래되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가, 질병과 연관된 것으로 공지되어 있거나 의심되는 항원으로부터 유래되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 항원 폴리펩타이드가,
a. 자가면역 질환으로 영향을 받는 조직 또는 세포에서 고도로 발현되는 것으로 공지된 폴리펩타이드;
b. 신생물 질환과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드;
c. 자가면역 질환과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드;
d. 감염성 질환과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드; 또는
e. 알레르기 또는 유사한 과민증과 연관이 있는 것으로 공지된 폴리펩타이드
로부터 유래되는 것인 방법. - 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 대상에서 자가반응성을 진단하기 위한 것이며,
a. 후보 펩타이드 자가항원이 밀접하게 부착된 포식성 입자를 제공하는 단계로서, 폴리펩타이드가 부착된 입자는 변성 세척으로 처리되어, 후속 단계를 방해하지 않을 정도로 충분히 낮은 내독소 수준이 유도된 것인 단계;
b. 생존 가능한 T 세포 및 생존 가능한 항원 제시 세포를 포함하는, 시험 대상으로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 시료를 제공하는 단계;
c. 항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 허용하고 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T 세포의 특이적인 활성화를 허용하는 조건 하에, PBMC 시료를 시험관내에서 입자와 접촉시키는 단계;
d. 접촉된 PBMC 시료 내의 활성화된 T 세포의 분율을 정량화하는 단계; 및
e. 정량화된 분율을 건강한 대상 유래의 동등하게 정량화된 분율과 비교하는 단계로서, 시험 대상 내의 더 높은 분율의 활성화된 T 세포가, 시험 대상 내의 후보 자가항원에 대한 자가반응성을 시사하는 것인 단계
를 포함하는 방법.
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| Gengoux Christine et al, International Immunology (1995.), vol 7, no 1, pp 45-48. * |
| Jadidi Niaragh F et al, Scandinavian Journal of Immunology (2011.), vol 74, no 1, pp 1-13. * |
| Morita H et al, Allergy (2011.), vol 66, no 7, pp 985-986. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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