KR20140135959A - 온-컬럼 효소적 절단 - Google Patents

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KR20140135959A
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로베르토 팔켄스타인
아델베르트 그로스만
프리데리케 헤쎄
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본원은 N-말단 또는 C-말단에서 금속 이온 친화성 크로마토그래피 태그 및 프로테아제(protease) 절단 부위를 포함하는 전구폴리펩티드로부터 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피로 폴리펩티드를 수득하는 방법으로서, 결합된 전구폴리펩티드를 프로테아제와 함께 항온처리하여 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하고, 이때 상기 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질이 우레아 용액으로 1회 이상 세척되어 있는, 방법을 보고한다.

Description

온-컬럼 효소적 절단{ON-COLUMN ENZYMATIC CLEAVAGE}
본 발명은 온-컬럼(on-column) 절단에 의한 금속 이온 친화성 크로마토그래피 태그의 효소적 제거와 조합된 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피를 이용한 폴리펩티드 정제 및 폴리펩티드 제조 분야에 관한 것이다. 따라서, 본원은 폴리펩티드를 함유하는 금속 이온 친화성 크로마토그래피 태그를 프로테아제(protease)를 사용하여 온-컬럼 절단하는 방법을 보고한다.
단백질은 오늘날 의학 포트폴리오에서 중요한 역할을 수행한다. 재조합 폴리펩티드의 제조를 위한 발현 시스템은 최신기술로 잘 공지되어 있다. 약학 제품에서 사용되는 폴리펩티드는 원핵세포, 예컨대, 이. 콜라이(E. coli) 및 포유동물 세포, 예컨대, CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, BHK 세포, PER.C6(등록상표) 세포 등에서 주로 생성된다.
인간 적용을 위해 모든 약학 물질은 상이한 기준을 충족시켜야 한다. 인간에 대한 생물약제의 안전성을 보장하기 위해, 예를 들면, 심각한 위험을 야기할 핵산, 바이러스 및 숙주 세포 단백질을 제거해야 한다. 규제 요건을 충족시키기 위해, 제조 공정 후 하나 이상의 정제 단계를 수행해야 한다. 특히, 순도, 처리량 및 수율은 적절한 정제 공정을 결정하는 데에 있어서 중요한 역할을 수행한다.
단백질 정제를 위한 다양한 방법들, 예컨대, 미생물 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 양이온 교환(설포프로필 또는 카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식 이온 교환, (예를 들면, 티오에테르 리간드를 사용한) 티오친화성 흡착, (예를 들면, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용한) 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피, (예를 들면, Ni(II) 및 Cu(II) 친화성 물질을 사용한) 금속 이온 킬레이트 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 확립되어 있고 널리 이용된다(예를 들면, 문헌(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) 참조).
고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 근거한 방법을 이용하여 금속 이온 친화성 크로마토그래피 태그(친화성 태그) 및 프로테아제 절단 부위를 포함하는 전구폴리펩티드를 정제하고 효소적으로 절단할 수 있다는 것을 발견하였다. 보다 정확하게는, 계속되는 공정 단계가 수행될 수 있게 하기 위해, 즉 절단된 폴리펩티드가 계속되는 대규모 다운스트림(예를 들면, 정제) 공정 단계가 수행될 수 있게 하는 농도 및 순도로 회수될 수 있게 하기 위해 IMAC 컬럼에 결합된 전구폴리펩티드가 우레아 함유 용액과 1회 이상 접촉, 예를 들면, 세척되어야 한다는 것을 발견하였다.
본원에서 보고된 한 양태는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼 상에서의 프로테아제 절단 부위의 온-컬럼 효소적 절단으로 N-말단 또는 C-말단에서 금속 이온 친화성 크로마토그래피 태그, 및 상기 태그와 상기 폴리펩티드 사이에 위치한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 전구폴리펩티드로부터 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 (하기 순서로) 포함하는 방법이다:
- 상기 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 결합된 상기 전구폴리펩티드를 변성시키는 단계,
- 상기 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 결합된 상기 전구폴리펩티드를 재생시키는 단계, 및
- 상기 결합된 전구폴리펩티드를 프로테아제와 함께 항온처리하여 폴리펩티드를 제조하는 단계.
한 실시양태에서, 변성은 결합된 전구폴리펩티드를 변성제를 포함하는 용액과 접촉시킴으로써 일어난다. 한 실시양태에서, 전구폴리펩티드의 재생은 변성된 전구폴리펩티드를 변성제 무함유 용액과 접촉시킴으로써 일어난다.
본원에서 보고된 한 양태는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼 상에서의 프로테아제 절단 부위의 온-컬럼 효소적 절단으로 N-말단 또는 C-말단에서 금속 이온 친화성 크로마토그래피 태그, 및 상기 태그와 상기 폴리펩티드 사이에 위치한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 전구폴리펩티드로부터 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법이다:
- 결합된 전구폴리펩티드를 변성제를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계,
- 임의적으로, 이전 단계에서 사용된 변성제를 포함하는 용액이 우레아 또는 우레아 유도체를 함유하지 않는 경우 상기 결합된 전구폴리펩티드를 우레아 또는 우레아 유도체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계, 또는 이전 단계에서 사용된 변성제를 포함하는 용액이 우레아 또는 우레아 유도체와 변성제의 혼합물을 포함하는 경우 상기 결합된 전구폴리펩티드를 우레아 또는 우레아 유도체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계, 및
- 상기 결합된 전구폴리펩티드를 프로테아제와 함께 항온처리하여 상기 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 폴리펩티드를 제조하는 단계.
한 실시양태에서, 상기 방법은 프로테아제와 함께 항온처리하기 직전에 변성제 무함유 용액으로 세척하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 금속 이온 친화성 크로마토그래피 태그는 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 회수 단계 전에 재생된다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 천연 형태로 회수된다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 변성된 형태로 회수된다.
한 실시양태에서, 우레아 또는 우레아 유도체는 약 0.5 M 내지 약 8 M의 농도를 갖는다. 한 실시양태에서, 우레아 또는 우레아 유도체는 약 2 M 내지 8 M의 농도를 갖는다. 한 실시양태에서, 우레아 또는 우레아 유도체는 약 4 M의 농도를 갖는다.
한 실시양태에서, 변성제는 구아니디늄 클로라이드, 우레아, 티오우레아 및 테트라메틸우레아로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 변성제는 구아니디늄 클로라이드이다.
한 실시양태에서, 변성제는 약 0.5 M 내지 약 6 M의 농도를 갖는다. 한 실시양태에서, 변성제는 약 1.5 M 내지 약 3 M의 농도를 갖는다. 한 실시양태에서, 변성제는 약 2 M의 농도를 갖는다.
한 실시양태에서, 변성제는 구아니디늄 클로라이드이고 약 0.5 M 내지 약 6 M의 농도를 갖는다. 한 실시양태에서, 농도는 약 1.5 M 내지 약 3 M이다. 한 실시양태에서, 농도는 약 2 M이다.
한 실시양태에서, 전구폴리펩티드는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 천연 형태 또는 변성된 형태로 적용된다.
한 실시양태에서, 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질은 고정된 아연 친화성 크로마토그래피 물질이다.
한 실시양태에서, 프로테아제는 IgA 프로테아제, 트립신 및 그랜자임(granzyme) B로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 IgA 프로테아제이다.
한 실시양태에서, 변성제 무함유 용액은 약 0.01 M 내지 약 2 M의 완충제를 포함한다. 한 실시양태에서, 변성제 무함유 용액은 약 0.5 M 내지 약 1.5 M의 완충제를 포함한다. 한 실시양태에서, 변성제 무함유 용액은 약 1 M 내지 약 1.2 M의 완충제를 포함한다.
한 실시양태에서, 변성제 무함유 용액은 약 pH 8의 pH 값에서 약 0.5 M 내지 약 1.5 M의 트라이스를 포함한다. 한 실시양태에서, 변성제 무함유 용액은 약 pH 8의 pH 값에서 약 1 M 내지 약 1.2 M의 트라이스를 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-글리코실화된 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 아포지단백질 A-I이거나 아포지단백질 A-I을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 01 내지 서열번호 03으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 인슐린 유사 성장인자 1(IGF-1)이거나 인슐린 유사 성장인자 1(IGF-1)을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 인슐린 유사 성장인자 1(IGF-1) 폴리펩티드이다.
본원에서 보고된 한 양태는 하기 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법이다:
- 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포의 배양 배지로부터 수득된 상기 폴리펩티드를 본원에서 보고된 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 방법으로 정제하여 상기 폴리펩티드를 제조하는 단계.
한 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 하기 단계들을 포함한다:
- 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포를 배양하는 단계,
- 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계,
- 상기 폴리펩티드가 봉입체(inclusion bodies)의 형태로 회수되는 경우, 상기 폴리펩티드를 가용화하고/하거나 리폴딩하는 단계, 및/또는
- 상기 폴리펩티드를 본원에서 보고된 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 방법으로 정제하여 상기 폴리펩티드를 제조하는 단계.
한 실시양태에서, 원핵세포는 이. 콜라이 세포, 바실러스 세포 또는 효모 세포이다.
한 실시양태에서, 진핵세포는 CHO 세포, BHK 세포, HEK 세포, NS0 세포 또는 Sp2/0 세포이다.
도 1a는 천연 조건 하에서 절단 및 용출 전에 우레아 함유 용액으로 IMAC 컬럼을 세척하지 않고 온-컬럼 절단된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드를 용출하는 것을 보여주는 도면이다. 상기 단백질은 구아니디늄 클로라이드 함유 용액에서 가용화되고 컬럼에 적용되었다.
도 1b는 폴리펩티드의 도 1a의 용출 도면을 확대한 것이다. 우레아를 사용한 후속 세척은 날카로운 피크를 발생시킨다.
도 2는 전구폴리펩티드의 효소적 온-컬럼 절단 전에 구아니디늄 클로라이드 함유 용액, 우레아 함유 용액 및 완충된 용액(트라이스 완충제)으로 세척하는 단계를 포함하는, 온-컬럼 절단된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 용출을 보여주는 도면이다.
도 3은 전구폴리펩티드의 효소적 온-컬럼 절단 전에 구아니디늄 클로라이드 함유 용액, 우레아 함유 용액 및 완충된 용액(트라이스 완충제)으로 세척하는 단계를 포함하는, 온-컬럼 절단된 IGF-1 전구폴리펩티드의 용출을 보여주는 도면이다.
본원은 프로테아제에 의한 전구폴리펩티드의 온-컬럼 절단으로 전구폴리펩티드로부터 폴리펩티드를 수득하는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 방법으로서, 한 실시양태에서 변성 조건 하에서의 제1 세척 단계, 예를 들면, 변성제, 예컨대, 구아니디늄 클로라이드 함유 용액을 사용한 제1 세척 단계, 및 우레아 또는 우레아 유도체 함유 용액을 사용한 제2 세척 단계를 포함하는 방법을 보고한다. 특히, 본원에서 보고된 방법에 의해 수득된 폴리펩티드는 천연 형태로 컬럼으로부터 회수될 수 있다.
결합된 전구폴리펩티드가 효소적 절단 전에 우레아 또는 우레아 유도체 함유 용액으로 세척되는 경우 i) 폴리펩티드가 1 mg/㎖ 초과의 농도로 수득되고, ii) IMAC에 결합된 전구폴리펩티드를 세척하기 위해 사용된 구아니디늄 클로라이드가 제거되기 때문에 상기 폴리펩티드는 추가 크로마토그래피 단계에서 더 프로세싱될 수 있는 형태로 컬럼으로부터 회수될 수 있다는 것을 발견하였다.
용어 "적용하는" 및 이의 문법적 동의어는 정제될 관심 있는 물질을 함유하는 용액이 정지상과 접촉되는 정제 방법의 부분적 단계를 의미한다. 이것은 a) 정지상이 위치한 크로마토그래피 장치에 상기 용액을 첨가한다는 것, 또는 b) 관심 있는 물질을 포함하는 용액에 정지상을 첨가한다는 것을 의미한다. a)의 경우, 정제될 관심 있는 물질을 함유하는 용액이 정지상을 통과하여 상기 정지상과 상기 용액 중의 상기 물질 사이의 상호작용을 가능하게 한다. 조건, 예컨대, pH, 전도성, 염 농도, 온도 및/또는 유속에 따라, 상기 용액의 일부 물질들은 상기 정지상에 결합되어 상기 용액으로부터 제거된다. 다른 물질들은 용액에 남아있다. 용액에 남아있는 물질은 통과 유동물에서 발견될 수 있다. "통과 유동물"은 그의 기원과 관계없이 크로마토그래피 장치의 통과 후 수득된 용액을 의미한다. 이것은 컬럼을 씻어내는 데에 사용되거나 정지상에 결합된 하나 이상의 물질의 용출을 야기하는 데에 사용되는, 관심 있는 물질을 함유하는 적용된 용액 또는 완충제일 수 있다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 장치는 컬럼 또는 카세트이다. 관심 있는 물질은 정제된 형태 또는 심지어 실질적으로 균질한 형태로 관심 있는 물질을 수득하기 위한 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면, 침전, 염석, 한외여과, 정용여과, 동결건조, 친화성 크로마토그래피 또는 용매 부피 감소에 의해 정제 단계 후 용액으로부터 회수될 수 있다. b)의 경우, 정지상이 정제될 관심 있는 물질을 함유하는 용액에, 예를 들면, 고체로서 첨가되어, 상기 정지상과 상기 용액 중의 상기 물질 사이의 상호작용을 가능하게 한다. 상호작용 후, 상기 정지상은 예를 들면, 여과에 의해 제거되고, 상기 관심 있는 물질은 상기 정지상에 결합되어 상기 용액으로부터 상기 정지상과 함께 제거되거나, 상기 관심 있는 물질은 상기 정지상에 결합되지 않고 상기 용액에 남아있다.
용어 "완충된" 또는 "완충제를 포함하는"은 산성 또는 염기성 물질의 첨가 또는 방출로 인한 pH의 변화가 완충제 물질에 의해 균형이 잡힌 용액을 의미한다. 이러한 효과를 발생시키는 임의의 완충제 물질 또는 완충제가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 완충제 물질은 인산 또는 이의 염, 아세트산 또는 이의 염, 시트르산 또는 이의 염, 모르폴린, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 또는 이의 염, 이미다졸 또는 이의 염, 히스티딘 또는 이의 염, 글리신 또는 이의 염, 및 트라이스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 또는 이의 염으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 완충제 물질은 이미다졸 또는 이의 염 및 히스티딘 또는 이의 염으로부터 선택된다. 임의적으로, 완충된 용액은 추가 무기 염도 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 무기 염은 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 시트르산나트륨 및 시트르산칼륨으로부터 선택된다.
"폴리펩티드"는 천연적으로 제조되든 아니면 합성적으로 제조되든 관계없이 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산들로 구성된 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드는 "펩티드"로서 지칭될 수 있는 반면, 2개 이상의 폴리펩티드로 구성되거나 100개 초과의 아미노산 잔기들로 구성된 1개의 폴리펩티드를 포함하는 분자는 "단백질"로서 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 비-아미노산 성분, 예컨대, 탄수화물 기, 금속 이온 또는 카복실산 에스터도 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 추가될 수 있고 세포의 종류에 따라 상이할 수 있다. 폴리펩티드는 본원에서 그들의 아미노산 골격 구조 또는 그 자신을 암호화하는 핵산의 관점에서 정의된다. 예컨대, 탄수화물 기의 추가는 일반적으로 특정되지 않으나, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
용어 "결합-및-용출 방식"은 크로마토그래피 정제 방법을 수행하는 한 방식을 의미한다. 이때, 정제될 관심 있는 폴리펩티드를 함유하는 용액을 정지상, 특히 고체상에 적용하고, 이로써 관심 있는 폴리펩티드는 정지상과 상호작용하고 그 위에 보유된다. 관심 있지 않는 물질은 통과 유동물 또는 상청액과 함께 제거된다. 그 후, 관심 있는 폴리펩티드는 용출 용액의 적용에 의해 제2 단계에서 정지상으로부터 회수된다.
용어 "온-컬럼 절단"은 크로마토그래피 정제 방법을 수행하는 한 방식을 의미한다. 이때, 정제될 폴리펩티드는 전구폴리펩티드를 크로마토그래피 물질에 결합시킬 수 있는 태그를 함유하고 상기 태그와 상기 폴리펩티드 사이에서 프로테아제 절단 부위를 함유하는 전구폴리펩티드로서 결합되고, 상기 절단 부위를 인식하여 태그의 절단을 수행함으로써 상기 폴리펩티드를 유리시키는 프로테아제와의 항온처리에 의해 상기 크로마토그래피 물질로부터 회수된다. 상기 폴리펩티드는 용액에서 발견될 수 있는 반면, 상기 태그는 상기 크로마토그래피 물질에 결합된 상태로 남아있다.
용어 "봉입체"는 원핵세포의 모든 세포 성분들을 포함하는, 총 세포 단백질의 상당한 부분을 차지하는 응집된 관심 있는 폴리펩티드의 조밀한 세포내 덩어리를 의미한다.
용어 "리폴딩된" 또는 "재생된"은 변성된 형태로부터 수득된 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 리폴딩의 목적은 리폴딩 단계 없이 생성된 경우 단백질이 가질 활성보다 더 높은 수준의 활성을 갖는 단백질을 생성하는 것이다. 폴딩된 단백질 분자는 최소한의 자유 에너지를 갖는 입체구조에서 가장 안정하다. 대다수의 수용성 단백질들은 대다수의 소수성 아미노산들이 물로부터 떨어져 분자의 내부에 존재하는 방식으로 폴딩한다. 단백질을 함께 유지하는 약한 결합은 폴리펩티드가 언폴딩되게, 즉 변성되게 하는 다수의 처리에 의해 파괴될 수 있다. 폴딩된 단백질은 이온 결합, 반데르발스 상호작용, 수소 결합, 이황화 결합 및 공유 결합을 포함하는, 아미노산들 그 자체와 그들의 환경 사이의 여러 종류의 상호작용의 생성물이다.
본원에서 사용된 용어 "변성된" 또는 "변성되어 있는"은 천연 또는 리폴딩된 상태에서 분자에 존재하는 이온 결합, 공유 결합 및 반데르발스 상호작용이 파괴되어 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드의 변성은 예를 들면, 8 M 우레아 또는 6 M 구아니디늄 클로라이드, 환원제, 예컨대, 머캡토에탄올, 열, pH, 온도 및 다른 화학물질을 사용한 처리에 의해 달성될 수 있다. 시약, 예컨대, 8 M 우레아 또는 6 M 구아니디늄 클로라이드는 수소 결합 및 소수성 결합 둘다를 파괴하고, 머캡토에탄올도 첨가되는 경우, 시스테인들 사이에 형성되어 있는 이황화 가교(S-S)는 2개의 -S-H 기로 환원된다. 천연 또는 리폴딩된 상태에서 이황화 결합을 함유하는 폴리펩티드의 리폴딩은 단백질이 이황화 결합을 재형성하도록 시스테인 잔기 상에 존재하는 -S-H 기의 산화도 수반할 수 있다. "변성된" 폴리펩티드는 2차, 3차 및/또는 4차 구조가 천연 구조가 아닌 폴리펩티드이다. 이 비-천연 형태의 폴리펩티드는 가용성을 나타낼 수 있으나, 동시에 생물학적 불활성 입체구조로 존재할 수 있다. 또는, 폴리펩티드는 불용성을 나타낼 수 있고, 예를 들면, 불일치된 또는 미형성된 이황화 결합을 갖는 생물학적 불활성 입체구조로 존재할 수 있다. 이 불용성 폴리펩티드는 봉입체 내에 함유될 수 있으나 반드시 그러할 필요는 없다.
용어 "변성된 형태"는 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 갖는 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 갖지 않는 폴리펩티드의 형태를 의미한다.
용어 "천연 형태"는 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 갖는 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 갖는 폴리펩티드의 형태를 의미한다. "재생된" 폴리펩티드는 그의 천연 형태로 존재한다.
용어 "변성제 무함유"는 변성제 또는 변성 물질이 적용된 (세척) 용액에 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 이것은 변성제 무함유 용액과 접촉된 폴리펩티드가 그의 천연 형태로 존재할 것임을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "친화성 크로마토그래피"는 "친화성 크로마토그래피 물질"을 사용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 친화성 크로마토그래피에서, 폴리펩티드는 크로마토그래피 작용기와의 정전기 상호작용, 소수성 결합 및/또는 수소 결합의 형성에 따라 그들의 생물학적 활성 또는 화학구조에 근거하여 분리된다. 친화성 크로마토그래피 물질로부터 특이적으로 결합된 폴리펩티드를 회수하기 위해, 경쟁자 리간드가 첨가되거나 크로마토그래피 조건, 예컨대, 완충제의 pH 값, 극성 또는 이온 강도가 변경된다. "친화성 크로마토그래피 물질"은 상이한 단일 크로마토그래피 작용기들이 특정 종류의 폴리펩티드에만 결합하도록 조합되어 있는 복합 크로마토그래피 작용기를 포함하는 크로마토그래피 물질이다. 이 크로마토그래피 물질은 그의 크로마토그래피 작용기의 특이성에 따라 특정 종류의 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 예시적인 "친화성 크로마토그래피 물질"은 헥사히스티딘 태그를 함유하는 융합 폴리펩티드 또는 다수의 표면 노출된 히스티딘, 시스테인 및/또는 트립토판 잔기를 갖는 폴리펩티드의 결합을 위한 "고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질", 예컨대, Ni(II)-NTA(NTA = 니트릴로트라이아세트산), Zn(II)-IDA(IDA = 이미노다이아세트산) 또는 Cu(II)-NTA 함유 물질; "항체 결합 크로마토그래피 물질", 예컨대, 단백질 A; "효소 결합 크로마토그래피 물질", 예컨대, 효소 기질 유사체, 효소 보조인자 또는 효소 억제제를 크로마토그래피 작용기로서 포함하는 크로마토그래피 물질; 또는 "렉틴 결합 크로마토그래피 물질", 예컨대, 폴리사카라이드, 세포 표면 수용체, 당단백질 또는 온전한 세포를 크로마토그래피 작용기로서 포함하는 크로마토그래피 물질이다. 한 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 물질은 Zn(II)-IDA이다.
본원에서 사용된 용어 "고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피"는 "고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질"을 사용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 금속 이온 친화성 크로마토그래피는 크로마토그래피 작용기로서 벌크 물질에 결합되는 금속 이온, 예컨대, Cu(II), Ni(II) 또는 Zn(II)과 특히 이미다졸 함유 측쇄 및 티올 기 함유 측쇄를 갖는 폴리펩티드의 표면 노출된 아미노산 측쇄의 전자 공여자 기 사이의 킬레이트의 형성에 근거한다. 상기 킬레이트는 측쇄가 적어도 부분적으로 양성자화되지 않는 pH 값에서 형성된다. 결합된 폴리펩티드는 pH 값에서의 변화, 즉 양성자화에 의해 크로마토그래피 물질로부터 회수될 수 있다. 예시적인 "고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질"은 하이트랩(HiTrap) 킬레이팅 HP(지이 헬쓰케어 유럽 게엠베하(GE Healthcare Europe GmbH), 독일 소재) 또는 프락토겔(Fractogel) EMD 킬레이트(머크(Merck), 독일 다름스타트 소재)이다.
폴리펩티드를 정제하는 방법들은 잘 확립되어 있고 널리 이용된다. 이들은 단독으로 또는 함께 이용된다. 이러한 방법들은 예를 들면, 착물화된 금속 이온(예를 들면, Ni(II) 친화성 물질 및 Cu(II) 친화성 물질) 또는 미생물 유래의 단백질(예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피)을 갖는 티올 리간드를 사용하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노에틸 수지) 및 혼합 방식 교환 크로마토그래피, (예를 들면, 티오에테르 리간드를 사용한) 티오친화성 흡착, (예를 들면, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용한) 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 분취 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)이다.
용어 "효소적 절단 부위"는 프로테아제에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 펩티드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기들의 서열을 의미한다. 한 실시양태에서, 프로테아제 절단 부위는 IgA-프로테아제 절단 부위, 그랜자임 B 절단 부위, Tev 프로테아제 절단 부위, 프레시전(Prescission) 프로테아제 절단 부위, 트롬빈 절단 부위, 인자 Xa 절단 부위, 트립신 절단 부위, 카이모트립신(Chymotrypsin) 절단 부위 또는 엔테로키나제(Enterokinase) 절단 부위이다.
한 실시양태에서, 프로테아제는 IgA-프로테아제, 그랜자임 B, Tev 프로테아제, 프레시전 프로테아제, 트롬빈, 인자 Xa, 트립신, 카이모트립신 또는 엔테로키나제이다.
용어 "IgA-프로테아제"는 "↓" 이 절단된 결합의 위치를 표시하는 하기 서열들 중 하나를 포함하는 인식 부위를 갖는 네이세리아 고노로이애(Neisseria gonorrhoeae)로부터 유래된 프로테아제를 의미한다:
Figure pct00001
상기 서열들에서, 처음 3개 서열은 보다 빈번하게 선택되고 절단된다.
전구폴리펩티드의 온-컬럼 절단을 이용하는, 즉 전구폴리펩티드가 크로마토그래피 컬럼에 결합되어 있는 동안 전구폴리펩티드로부터의 폴리펩티드의 유리가 수행되고 전구폴리펩티드가 구아니디늄 클로라이드 함유 용액으로 세척되는 본원에서 보고된 방법에서 상기 컬럼은 우레아 또는 우레아 유도체 함유 용액으로 1회 이상 세척되어야 한다는 것을 발견하였다.
한 실시양태에서, 상기 컬럼은 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 결합된 전구폴리펩티드를 프로테아제와 함께 항온처리하기 전에 우레아 또는 우레아 유도체를 포함하는 용액으로 세척된다.
한 실시양태에서, 상기 컬럼은 전구폴리펩티드를 프로테아제와 함께 항온처리한 후 우레아 또는 우레아 유도체를 포함하는 용액으로 세척된다. 한 실시양태에서, 우레아 또는 우레아 유도체 함유 용액을 사용한 세척에 의해 폴리펩티드는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 회수된다.
한 실시양태에서, 우레아 또는 우레아 유도체 함유 용액을 사용한 세척은 즉시 연이어, 즉 프로테아제와의 항온처리 전에 변성제를 함유하지 않는 완충된 용액(완충제를 포함하는 용액)을 사용한 세척에 의해 수행된다.
변성제, 예컨대, 구아니디늄 염 또는 우레아를 사용한 세척 동안, 예를 들면, 폴리펩티드가 이. 콜라이에서 생성된 경우 내독소가 제거될 수 있다.
변성제를 사용한 세척 단계 동안, 폴리펩티드는 세척 단계 전에 천연 형태로 존재하는 경우 변성되거나, 변성된 형태로 이미 존재하는 경우 변성된 형태로 유지된다.
프로테아제를 사용한 전구폴리펩티드의 온-컬럼 절단 전에 우레아 또는 우레아 유도체 이외의 다른 변성제의 제거는 전구폴리펩티드의 온-컬럼 절단을 개선하고 계속되는 공정 단계가 수행될 수 있게 한다는 것을 발견하였다.
변성제 무함유 완충된 용액을 사용한, 즉 천연 조건 하에서의 세척 동안, 전구폴리펩티드는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 결합된 상태로 남아있으면서 그의 천연 상태로 복귀된다.
따라서, 본원에서 보고된 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 수득하거나 정제하는 방법으로서, 이때 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 결합된 전구폴리펩티드는 우레아 또는 우레아 유도체 함유 용액으로 1회 이상 세척된다:
- 결합된 전구폴리펩티드를 프로테아제와 함께 항온처리하여 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계.
한 실시양태에서, 우레아 함유 용액을 사용한 세척은 프로테아제의 적용 전에 또는 프로테아제와 함께 항온처리한 후에 수행된다. 우레아 함유 용액을 사용한 세척이 프로테아제와 함께 항온처리한 후에 수행되는 경우, 세척 단계는 동시에 폴리펩티드의 회수 단계이다.
따라서, 본원에서 보고된 방법은 결합-및-용출 방식으로, 즉 전구폴리펩티드가 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 먼저 결합된 후, 추가 단계에서 폴리펩티드가 전구폴리펩티드 내의 프로테아제 절단 부위의 절단에 의해 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질로부터 회수되는 방식으로 작동된다. 간헐적 세척 단계가 본원에서 보고된 방법에 포함될 수 있다.
용어 "변성제" 또는 "변성 물질"은 폴리펩티드를 그의 천연 형태에서 비-천연, 즉 변성된 형태로 전환시키는 화합물을 의미한다. 변성제는 일반적으로 무질서화제(chaotropic agent)이다. 예시적인 변성제는 우레아 및 우레아 유도체(예를 들면, 티오우레아 및 테트라메틸우레아), 구아니딘 및 구아니딘 유도체(예를 들면, 구아니디늄 클로라이드), 테트라알킬 암모늄 염, 장쇄 설폰산 에스터, 및 리튬 퍼클로레이트이다. 용어 "변성제"는 변성제들의 혼합물로서 이해될 수도 있다.
한 실시양태에서, 변성제는 우레아 또는 우레아 유도체이다.
한 실시양태에서, 변성제는 구아니디늄 클로라이드이다.
한 실시양태에서, 변성제는 우레아이다. 한 실시양태에서, 우레아는 2 M 내지 8 M의 농도를 갖는다.
한 실시양태에서, 변성제는 티오우레아이다. 한 실시양태에서, 티오우레아는 1.5 M 내지 3 M의 농도를 갖는다.
본원에서 보고된 양태의 한 실시양태에서, 폴리펩티드를 정제하거나 제조하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
- 전구폴리펩티드를 포함하는 용액을 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 적용하여 상기 전구폴리펩티드를 상기 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 결합시키는 단계,
- 임의적으로, 상기 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질을 구아니디늄 클로라이드를 포함하는 용액으로 세척하여 원치 않는 폴리펩티드를 제거하는 단계,
- 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질을 우레아를 포함하는 용액으로 세척하여, 상기 전구폴리펩티드를 효소적 절단을 위해 컨디셔닝하고 상기 폴리펩티드를 추가 다운스트림 프로세싱을 위해 컨디셔닝하는 단계, 및
- 결합된 전구폴리펩티드를 프로테아제와 함께 항온처리하여 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계.
(전구폴리펩티드를 포함하는) 폴리펩티드는 진핵세포 및 원핵세포, 예컨대, CHO 세포, HEK 세포 및 이. 콜라이 세포에서 재조합적으로 제조될 수 있다. 폴리펩티드가 원핵세포에서 제조되는 경우, 상기 폴리펩티드는 일반적으로 불용성 봉입체의 형태로 수득된다. 상기 봉입체는 원핵세포 및 배양 배지로부터 용이하게 회수될 수 있다. 봉입체에서 불용성 형태로 수득된 폴리펩티드는 정제 및/또는 리폴딩 절차가 수행될 수 있기 전에 가용화되어야 한다.
따라서, 본원에서 보고된 제2 양태는 하기 단계들을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법이다:
- 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포를 배양하는 단계,
- 상기 원핵세포 또는 진핵세포 및/또는 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계,
- 임의적으로, 상기 폴리펩티드가 봉입체의 형태로 회수되는 경우, 상기 폴리펩티드를 가용화하고/하거나 리폴딩하는 단계, 및
- 상기 폴리펩티드를 본원에서 보고된 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 방법으로 정제하여 폴리펩티드를 제조하는 단계.
한 실시양태에서, 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 방법은 하기 단계들을 포함한다:
- 전구폴리펩티드를 포함하는 용액을 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 이때 상기 용액이 변성제를 포함하거나 변성제를 포함하지 않는, 단계,
- 임의적으로, 상기 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질을, 구아니디늄 클로라이드를 포함하는 용액으로 세척하는 단계,
- 상기 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질을, 우레아 또는 우레아 유도체를 포함하는 용액으로 세척하는 단계, 및
- 결합된 전구폴리펩티드를 프로테아제와 함께 항온처리하여 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 전구폴리펩티드이다.
상기 보고된 모든 양태들의 상이한 실시양태들이 이하에 제공되어 있다.
한 실시양태에서, 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질은 제1 단계에서 완충된 용액으로 컨디셔닝된다. 이 용액은 변성제를 포함할 수 있으나 반드시 포함할 필요는 없다. 컨디셔닝 용액의 완충제는 전구폴리펩티드를 포함하는 용액의 완충제와 동일할 수 있거나 상이할 수 있다.
그 후, 전구폴리펩티드를 포함하는 용액은 컨디셔닝된 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 적용된다. 이 단계에서, 전구폴리펩티드는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질 상에 보유된다(결합/흡착된다). 이 용액은 변성제를 포함할 수 있으나 반드시 포함할 필요는 없다. 적재 용액의 완충제는 후속 세척 용액의 완충제와 동일할 수 있거나 상이할 수 있다.
임의적으로, 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질을 전구폴리펩티드로 적재한 후, 세척 용액을 적재된 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 적용할 수 있다. 이 용액은 구아니디늄 클로라이드를 (단독) 변성제로서 포함한다.
세척 용액을, 결합된 전구폴리펩티드를 갖는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 적용한다. 이 용액은 우레아 또는 우레아 유도체를 단독 변성제로서 포함한다.
임의적으로, 세척 단계 후, 전구폴리펩티드는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 여전히 결합되어 있는 동안 상기 결합된 전구폴리펩티드를 갖는 상기 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질을 변성제 무함유 완충된 용액으로 세척함으로써 천연 형태로 전환된다.
최종적으로, 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩티드를 회수하기 위해, 상기 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 태그와 상기 폴리펩티드 사이의 프로테아제 절단 부위를 특이적으로 절단하는 프로테아제와 함께 컬럼을 항온처리한다. 항온처리 후, 절단된 전구폴리펩티드, 즉 폴리펩티드를 컬럼의 통과 유동물로부터 회수한다. 회수는 임의적으로 변성제 함유 용액에 의해 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드를 정제하거나 수득하는 방법은 컬럼 크로마토그래피 방법이다.
상이한 단계들에서 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 적용되는, 전구폴리펩티드를 포함하는 용액, 즉 적재 용액을 제외한 상이한 용액들의 부피는 서로 독립적으로 1배 내지 20배 컬럼 부피, 한 실시양태에서 1배 내지 10배 컬럼 부피이다.
한 실시양태에서, 세척 용액의 적용은 3배 내지 20배 컬럼 부피를 위한 적용이다. 한 실시양태에서, 세척 용액의 적용은 3배 내지 10배 컬럼 부피를 위한 적용이다.
본원에서 보고된 방법은 이하에서 국제 특허출원 공개 제WO2012/28526호에서 보고된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 단백질 및 국제 특허출원 공개 제WO2008/025527호에서 보고된 IGF-1로 예시된다.
테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 인간 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소 및 야생형 인간 아포지단백질 A-I을 포함한다. 인간 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소의 아미노산 서열은 처음 9개 아미노산에 의해 단축될 수 있으므로, 천연 절두 부위인 위치 10의 이소류신 잔기로 시작될 수 있다. 이 절두의 결과로서, 위치 4의 쓰레오닌 잔기에서 O-글리코실화 부위가 결실된다. 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소와 인간 아포지단백질 A-I 사이에서 5개의 아미노산 잔기 SLKGS가 제거되었다.
개선된 발현 및 정제를 위해, N-말단 정제 태그, 예를 들면, 헥사히스티딘 태그, 및 정제 태그의 제거를 위한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구축물을 발생시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 IgA 프로테아제이고, 프로테아제 절단 부위는 IgA 프로테아제 절단 부위이다. 프로테아제의 특이적 절단의 결과로서 프로테아제 절단 부위의 일부 아미노산 잔기들은 폴리펩티드의 N 말단에서 보유된다. 즉, IgA 프로테아제 절단 부위의 경우 2개의 아미노산 잔기(제1 아미노산 잔기로서 알라닌, 글리신, 세린 또는 쓰레오닌, 및 제2 아미노산 잔기로서 프롤린)는 폴리펩티드, 예를 들면, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드의 N-말단에서 유지된다.
테트라넥틴 삼량체화 구조 요소는 각각의 개별 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 단량체들 사이의 비-공유 상호작용에 의해 구성되는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 동종삼량체의 형성을 가능하게 하는 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, 아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 변이체이다.
한 실시양태에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(인터페론 단편, 태그 및 절단 부위 함유 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드)는 발현 및 정제 태그를 포함하고 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00002
한 실시양태에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(태그 및 절단 부위 함유 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드)는 발현 및 정제 태그를 포함하고 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00003
한 실시양태에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(태그 및 절단 부위 함유 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드)는 발현 및 정제 태그를 포함하고 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00004
폴리펩티드가 이. 콜라이 균주에서 재조합적으로 제조되는 경우 N-말단 메티오닌 잔기는 통상적으로 이. 콜라이 프로테아제에 의해 효율적으로 절단되지 않는다는 것을 인지해야 한다. 따라서, N-말단 메티오닌 잔기는 제조된 폴리펩티드에 부분적으로 존재한다.
하기 실시에, 서열 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 사상을 벗어나지 않으면서 기재된 절차를 변경시킬 수 있다는 것이 이해된다.
실시예
재료 및 방법
달리 명시되어 있지 않은 한, 상이한 크로마토그래피 방법들이 크로마토그래피 물질 제조자의 매뉴얼에 따라 수행되었다.
재조합 DNA 기법:
표준 방법을 문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989))에 기재된 바와 같이 DNA 조작을 위해 이용하였다. 분자생물학 시약들을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다.
단백질 측정:
아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광계수를 이용하여 광학 밀도(OD)를 280 nm(이때, 기준 파장은 320 nm임)에서 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다.
크기 배제 HPLC:
크로마토그래피를 ASI-100 HPLC 시스템(다이노넥스(Dionex), 독일 이드스테인 소재) 상의 토소 하스(Tosoh Haas) TSK 3000 SWXL 컬럼으로 수행하였다. 용출 피크를 UV 다이오드 어레이 검출기(다이오넥스)로 280 nm에서 모니터링하였다. 농축된 샘플을 1 mg/㎖까지 용해시킨 후, 안정한 기준이 달성될 때까지 상기 컬럼을 200 mM 인산이수소칼륨 및 250 mM 염화칼륨으로 구성된 완충제(pH 7.0)로 세척하였다. 실온에서 30분에 걸쳐 0.5 ㎖/분의 유속을 이용하여 등용매 조건 하에서 분석 실시를 수행하였다. 크로마토그램을 크로멜레온(Chromeleon)(다이오넥스, 독일 이드스테인 소재)으로 수동으로 적분하였다.
역상 HPLC(RP-HPLC):
순도를 RP-HPLC로 분석하였다. 아세토니트릴/수성 TFA 구배를 이용하여 페노메넥스(Phenomenex) C18 컬럼 상에서 분석을 수행하였다. 용출 프로파일을 215 nm에서 UV 흡광도로서 모니터링하였다. 용출된 물질의 백분율을 용출된 단백질의 총 피크 면적에 근거하여 계산하였다.
DNA 역치 시스템:
예를 들면, 문헌(Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403)을 참조한다.
숙주 세포 단백질 측정:
마이크로타이터 플레이트의 웰의 벽을 혈청 알부민과 스트렙타비딘의 혼합물로 코팅하였다. HCP에 대한 염소 유래의 다중클론 항체를 마이크로타이터 플레이트의 웰의 벽에 결합시켰다. 세척 단계 후, 마이크로타이터 플레이트의 상이한 웰들을 상이한 농도의 HCP 보정 서열 및 샘플 용액과 함께 항온처리하였다. 항온처리 후, 결합되지 않은 샘플 물질을 완충제 용액으로 세척하여 제거하였다. 검출을 위해, 상기 웰을 항체 퍼록시다제 접합체와 함께 항온처리하여 결합된 숙주 세포 단백질을 검출하였다. 고정된 퍼록시다제 활성을 ABTS와의 항온처리 및 405 nm에서의 검출로 검출하였다.
DNA 측정:
바이오틴을 마이크로타이터 플레이트에 결합시켰다. 스트렙타비딘, 단일 가닥 DNA 및 바이오티닐화된 단일 가닥 DNA 결합 단백질로 구성된 반응 혼합물을 첨가하였다. 상기 결합 단백질은 DNA에 결합할 수 있었고 바이오티닐화되었다. 이 방식으로, 샘플 혼합물로부터 DNA를 특이적으로 제거할 수 있었다. 스트렙타비딘은 마이크로타이터 플레이트 상의 바이오틴뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 결합 단백질에 커플링된 바이오틴에도 결합하였다. 우레아제(urease)에 커플링된 DNA 특이적 항체를 이 총 복합체에 첨가하였다. 우레아의 첨가는 pH의 국소 변화를 야기하는 우레아의 가수분해를 일으켰다. 이 변화는 변경된 표면 전위로서 검출될 수 있다. 표면 전위의 변화는 결합된 DNA의 양에 비례하였다. 단일 가닥 DNA를 프로테이나제 K 분해 및 SDS를 사용한 변성으로 수득하였다.
봉입체로부터 폴리펩티드를 단리하고 가용화하고 리폴딩하는 일반적인 방법:
인용된 문헌에서 수행된 방법 이외에 예를 들면, 문헌(Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: Creighton, T.E., (ed.): Protein function: A Practical Approach, Oxford University Press (1997) 57-99)의 방법에 따라 봉입체의 제조를 수행할 수 있다. 봉입체를 -70℃에서 저장하였다. 마찬가지로, 봉입체의 가용화를 문헌(Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: Creighton, T.E., (ed.): Protein function: A Practical Approach, Oxford University Press (1997) 57-99)의 방법에 따라 수행할 수 있다.
실시예 1
이. 콜라이 발현 플라스미드의 제조 및 설명
테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드를 재조합 수단으로 제조하였다. 발현된 전구폴리펩티드의 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음과 같다:
- 아미노산 메티오닌(M),
- CDLPQTHSL(서열번호 19)의 아미노산 서열을 갖는 인터페론 서열의 단편,
- GS 연결제,
- HHHHHH(서열번호 20)의 아미노산 서열을 갖는 헥사히스티딘 태그,
- GS 연결제,
- VVAPPAP(서열번호 11)의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위, 및
- 서열번호 04의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I.
상기 전술된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드는 IgA 프로테아제를 사용한 시험관내 효소적 온-컬럼 절단에 의해 성숙 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드를 방출시킨 전구체 폴리펩티드이다.
적절한 핵산 분절을 연결하여 공지된 재조합 방법 및 기법으로 전구폴리펩티드 암호화 융합 유전자를 조립하였다. 화학적 합성에 의해 제조된 핵산 서열을 DNA 서열분석으로 검증하였다. 서열번호 04의 융합 폴리펩티드를 암호화하는, 서열번호 01의 테트라넥틴 아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 제조용 발현 플라스미드를 다음과 같이 제조하였다.
이. 콜라이 발현 플라스미드의 제조
플라스미드 4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)은 이. 콜라이에서 코어-스트렙타비딘을 발현시키기 위한 발현 플라스미드이다. 플라스미드 1966으로부터 유래된 3142 bp 길이의 EcoRI/CelII-벡터 단편(1966-pBRori-URA3-LACI-T-반복부; 유럽 특허 제1 422 237호에서 보고됨)을 EcoRI/CelII-단편을 암호화하는 435 bp 길이의 코어-스트렙타비딘과 라이게이션시켜 상기 발현 플라스미드를 발생시켰다.
코어-스트렙타비딘 이. 콜라이 발현 플라스미드는 하기 요소들을 포함한다:
- 이. 콜라이에서 복제하기 위한 벡터 pBR322 유래의 복제 기점(문헌(Sutcliffe, G. et al., Quant. Biol. 43(1979) 77-90)에 따라 bp 위치 2517 내지 3160에 상응함);
- 이. 콜라이 pyrF 돌연변이체 균주(우라실 영양요구)의 보완에 의한 플라스미드 선별을 가능하게 하는 오로티딘 5'-포스페이트 데카복실라제(decarboxylase)(Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124)를 암호화하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 URA3 유전자;
- i) T5 하이브리드 프로모터(문헌(Bujard, H., et al. Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433) 및 문헌(Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152)에 따른 T5-PN25/03/04 하이브리드 프로모터(상기 문헌(Stueber, D., et al.)에 따른 합성 리보좀 결합 부위를 포함함)),
ii) 코어-스트렙타비딘 유전자, 및
iii) 2개의 박테리오파지 유래의 전사 종결요소, 즉 λ-T0 종결요소(Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414) 및 fd 종결요소(Beck E. and Zink, B. Gene 1-3 (1981) 35-58)
를 포함하는 코어 스트렙타비딘 발현 카세트; 및
- 이. 콜라이로부터 유래된 lacI 리프레서 유전자(Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769).
단일 플랭킹 EcoRI 및 CelII 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 절단 부위를 사용하여 벡터 4980으로부터 코어-스트렙타비딘 구조 유전자를 절개하고 EcoRII/CelII 제한 부위에 의해 플랭킹된 전구체 폴리펩티드 암호화 핵산을 3142 bp 길이의 EcoRI/CelII 4980 벡터 단편 내로 삽입함으로써 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 발현을 위한 최종 발현 플라스미드를 제조하였다.
실시예 2
테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 발현
전구폴리펩티드의 발현을 위해, 이. 콜라이 영양요구(PyrF)의 보완으로 항생제 무함유 플라스미드 선별을 가능하게 하는 이. 콜라이 숙주/벡터 시스템을 사용하였다(유럽 특허출원 제0972838호 및 미국 특허 제6,291,245호 참조).
이. 콜라이 K12 균주 CSPZ-2(leuB, proC, trpE, th-1, ΔpyrF)를 발현 플라스미드 p(IFN-His6-IgA-테트라넥틴-아포지단백질 A-I)로 전기천공하여 형질전환시켰다. 형질전환된 이. 콜라이 세포를 37℃에서 한천 플레이트 상에서 먼저 생장시켰다.
발효 프로토콜 1:
예비발효를 위해, 약 1 g/ℓ의 L-류신, 약 1 g/ℓ의 L-프롤린 및 약 1 mg/ℓ의 티아민-HCl로 보충된 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition (December 1989))에 따른 M9 배지를 사용하였다.
예비발효를 위해, 조절벽(baffle)을 갖는 1000 ㎖ 삼각 플라스크 내의 300 ㎖ M9 배지를 2 ㎖의 일차 시드 뱅크 앰플로 접종하였다. 1 내지 3의 광학 밀도(578 nm)가 수득될 때까지 37℃에서 13시간 동안 회전 진탕기 상에서 배양을 수행하였다.
발현을 위해 문헌(Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27)에 따른 회분 배지를 사용하였다: 27.6 g/ℓ 글루코스*H2O, 13.3 g/ℓ KH2PO4, 4.0 g/ℓ (NH4)2HPO4, 1.7 g/ℓ 시트레이트, 1.2 g/ℓ MgSO4*7H2O, 60 mg/ℓ 철(III) 시트레이트, 2.5 mg/ℓ CoCl2*6H2O, 15 mg/ℓ MnCl2*4H2O, 1.5 mg/ℓ CuCl2*2H2O, 3 mg/ℓ H3BO3, 2.5 mg/ℓ Na2MoO4*2H2O, 8 mg/ℓ Zn(CH3COO)2*2H2O, 8.4 mg/ℓ 티트라이플렉스(Titriplex) III, 및 1.3 ㎖/ℓ 신퍼론닉(Synperonic) 10% 소포제. 상기 회분 배지를 5.4 mg/ℓ의 티아민-HCl 및 각각 1.2 g/ℓ의 L-류신 및 L-프롤린으로 보충하였다. 공급물 1 용액은 19.7 g/ℓ의 MgSO4*7H2O로 보충된 700 g/ℓ 글루코스를 함유하였다. pH 조절을 위한 알칼리성 용액은 50 g/ℓ의 L-류신 및 50 g/ℓ의 L-프롤린으로 보충된 12.5%(중량/부피) NH3 수용액이었다. 모든 성분들을 탈이온수에 용해시켰다.
10 ℓ 바이오스타트(Biostat) C DCU3 발효기(사르토리우스(Sartorius), 독일 멜순겐 소재)에서 발효를 수행하였다. 6.4 ℓ의 멸균 발효 회분 배지 및 예비발효로부터 수득된 300 ㎖의 접종물로부터 출발하여 회분 발효를 37℃, pH 6.9 ± 0.2, 500 mbar 및 10 ℓ/분의 통기 속도로 수행하였다. 초기에 보충된 글루코스가 소모된 후, 온도를 28℃로 변경하였고, 발효는 유가 방식으로 들어갔다. 이때, 교반기 속도(10시간 이내에 550 rpm부터 1000 rpm까지, 및 16시간 이내에 1000 rpm부터 1400 rpm까지) 및 통기 속도(10시간 이내에 10 ℓ/분부터 16 ℓ/분까지, 및 5시간 이내에 16 ℓ/분부터 20 ℓ/분까지)를 일정하게 증가시키면서 공급물 1을 첨가함으로써 용존 산소(pO2)의 상대적인 값을 50%로 유지하였다(DO-스타트, 예를 들면, 문헌(Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. Biotechnol. 2 (1987) 79-85) 참조). 약 8시간의 배양 후 pH가 조절 하한(6.70)에 도달하였을 때 알칼리성 용액의 첨가로부터 추가 아미노산의 공급이 발생하였다. 70의 광학 밀도에서 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 치료 단백질의 발현을 유도하였다.
발효기로부터 채취된 샘플을 유도 1시간 전, 및 단백질 발현의 유도 후 특정 시점에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다. 모든 샘플로부터 동일한 양의 세포(OD목표 = 5)를 5 ㎖ PBS 완충제에 재현탁하고 얼음 상에서 초음파처리로 파괴하였다. 그 다음, 100 ㎕의 각각의 현탁액을 원심분리하고((15,000 rpm, 5분), 각각의 상청액을 회수하여 별도의 바이알에 옮겼다. 이것은 발현된 가용성 표적 단백질과 발현된 불용성 표적 단백질을 구별하기 위한 것이다. 400 ㎕의 SDS 샘플 완충제(Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685)를 각각의 상청액(= 가용성) 분획 300 ㎕ 및 각각의 펠렛(=불용성) 분획에 첨가하였다. 샘플을 진탕 하에서 95℃에서 15분 동안 가열하여 샘플 중의 모든 단백질들을 가용화하고 환원시켰다. 실온까지 냉각시킨 후, 5 ㎕의 각각의 샘플을 4% 내지 20% TGX 크리테리온 스테인 프리(Criterion Stain Free) 폴리아크릴아미드 겔(바이오-라드(Bio-Rad))에 옮겼다. 추가로, 공지된 생성물 단백질 농도(0.1 ㎍/㎕)를 갖는 5 ㎕의 분자량 표준물(프레시전 플러스(Precision Plus) 단백질 표준물, 바이오-라드) 및 0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9 ㎕의 정량 표준물을 상기 겔 상에 위치시켰다.
전기영동을 200 V에서 60분 동안 실시한 후, 겔을 GelDOC EZ 이미저(바이오-라드)에 옮기고 UV 방사선으로 5분 동안 프로세싱하였다. 이미지 랩(Image Lab) 분석 소프트웨어(바이오-라드)를 이용하여 겔 이미지를 분석하였다. 3개의 표준물을 사용하여 0.99 초과의 계수로 선형 회귀 곡선을 계산하였고, 원래의 샘플 중의 표적 단백질의 농도를 계산하였다.
발효의 말기에서, 발효기 내의 전체 배양액이 수거 전에 1시간 또는 2시간 동안 50℃까지 가열되는 가열 단계를 수행하면서, 발현된 세포질 가용성 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드를 소위 봉입체인 불용성 단백질 응집체에 옮겼다(예를 들면, 유럽 특허 제1 486 571호 참조). 그 후, 발효기의 내용물을 통과 유동 원심분리(13,000 rpm, 13 ℓ/h)로 원심분리하고, 수거된 바이오매스를 추가 프로세싱까지 -20℃에서 저장하였다. 합성된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드는 소위 봉입체(IB)인 불용성 단백질 응집체의 형태로 불용성 세포 데브리스 분획에서만 발견되었다.
발효 프로토콜 2:
예비발효를 위해, 약 1 g/ℓ의 L-류신, 약 1 g/ℓ의 L-프롤린 및 약 1 mg/ℓ의 티아민-HCl로 보충된 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition (December 1989))에 따른 M9 배지를 사용하였다.
예비발효를 위해, 조절벽을 갖는 1000 ㎖ 삼각 플라스크 내의 300 ㎖ 변경된 M9 배지를 한천 플레이트로부터 접종하였거나 1 ㎖ 내지 2 ㎖의 일차 시드 뱅크 앰플로 접종하였다. 1 내지 3의 광학 밀도(578 nm)가 수득될 때까지 37℃에서 13시간 동안 회전 진탕기 상에서 배양을 수행하였다.
테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 발효 및 고수율 발현을 위해 하기 회분 배지 및 공급물을 사용하였다: 8.85 g/ℓ 글루코스, 63.5 g/ℓ 효모 추출물, 2.2 g/ℓ NH4Cl, 1.94 g/ℓ L-류신, 2.91 g/ℓ L-프롤린, 0.74 g/ℓ L-메티오닌, 17.3 g/ℓ KH2PO4*H2O, 2.02 g/ℓ MgSO4*7H2O, 25.8 mg/ℓ 티아민-HCl, 및 1.0 ㎖/ℓ 신퍼로닉 10% 소포제. 공급물 1 용액은 333 g/ℓ 효모 추출물 및 333 g/ℓ 85% 글리세롤을 함유하였고 1.67 g/ℓ L-메티오닌 및 각각 5 g/ℓ L-류신 및 L-프롤린으로 보충되었다. 공급물 2는 600 g/ℓ L-프롤린의 용액이었다. pH 조절을 위한 알칼리성 용액은 10%(중량/부피) KOH 용액이었고, 75% 글루코스 용액을 산으로서 사용하였다. 모든 성분들을 탈이온수에 용해시켰다.
10 ℓ 바이오스타트 C DCU3 발효기(사르토리우스, 독일 멜순겐 소재)에서 발효를 수행하였다. 5.15 ℓ의 멸균 발효 회분 배지 및 예비발효로부터 수득된 300 ㎖ 접종물로부터 출발하여 유가 발효를 25℃, pH 6.7 ± 0.2, 300 mbar 및 10 ℓ/분의 통기 속도로 수행하였다. 초기에 보충된 글루코스가 소모되기 전, 배양은 15의 광학 밀도(578 nm)에 도달하였고, 공급물 1이 70 g/h로 공급되기 시작하였을 때 발효는 유가 방식으로 들어갔다. 배양물 중의 글루코스 농도를 모니터링하여, 글루코스 축적을 피하고 6.9의 조절 상한 근처에서 pH를 유지하면서 공급물 1을 최대 150 g/h까지 증가시켰다. 50의 광학 밀도(578 nm)에서 공급물 2를 10 ㎖/h의 일정한 공급 속도로 공급하기 시작하였다. 교반기 속도(500 rpm부터 1500 rpm까지), 통기 속도(10 ℓ/분부터 20 ℓ/분까지) 및 압력(300 mbar부터 500 mbar까지)을 동시에 증가시킴으로써 용존 산소(pO2)의 상대적인 값을 50% 초과 수준으로 유지하였다. 90의 광학 밀도에서 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 치료 단백질의 발현을 유도하였다.
발효기로부터 채취된 7개의 샘플을 유도 1시간 전, 및 단백질 발현의 유도 후 특정 시점에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다. 모든 샘플로부터 동일한 양의 세포(OD목표 = 5)를 5 ㎖ PBS 완충제에 재현탁하고 얼음 상에서 초음파처리로 파괴하였다. 그 다음, 100 ㎕의 각각의 현탁액을 원심분리하고(15,000 rpm, 5분), 각각의 상청액을 회수하여 별도의 바이알에 옮겼다. 이것은 발현된 가용성 표적 단백질과 발현된 불용성 표적 단백질을 구별하기 위한 것이다. 200 ㎕의 SDS 샘플 완충제(Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685)를 각각의 상청액(= 가용성) 분획 300 ㎕ 및 각각의 펠렛(=불용성) 분획에 첨가하였다. 샘플을 진탕 하에서 95℃에서 15분 동안 가열하여 샘플 중의 모든 단백질들을 가용화하고 환원시켰다. 실온까지 냉각시킨 후, 5 ㎕의 각각의 샘플을 10% 비스-트라이스 폴리아크릴아미드 겔(노바겐(Novagen))에 옮겼다. 추가로, 공지된 생성물 단백질 농도(0.1 ㎍/㎕)를 갖는 5 ㎕의 분자량 표준물(프레시전 플러스 단백질 표준물, 바이오-라드) 및 0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9 ㎕의 정량 표준물을 상기 겔 상에 위치시켰다.
전기영동을 200 V에서 35분 동안 실시한 후, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R 염료로 염색하고 가열된 물로 탈색하고 디지털화를 위해 광학 밀도측정계(GS710, 바이오-라드)에 옮겼다. 콴티 원(Quantity One) 1-D 분석 소프트웨어(바이오-라드)를 이용하여 겔 이미지를 분석하였다. 3개의 표준물을 사용하여 0.98 초과의 계수로 선형 회귀 곡선을 계산하였고, 원래의 샘플 중의 표적 단백질의 농도를 계산하였다.
발효의 말기에서, 발효기 내의 전체 배양액이 수거 전에 1시간 또는 2시간 동안 50℃까지 가열되는 가열 단계를 수행하면서, 발현된 세포질 가용성 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드를 소위 봉입체(IB)인 불용성 단백질 응집체에 옮겼다(예를 들면, 유럽 특허 제1 486 571호 참조). 가열 단계 후, 합성된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드는 IB의 형태로 불용성 세포 데브리스 분획에서만 발견되었다.
발효기의 내용물을 4℃ 내지 8℃까지 냉각시키고 통과 유동 원심분리(13,000 rpm, 13 ℓ/h)로 원심분리하고, 수거된 바이오매스를 추가 프로세싱까지 -20℃에서 저장하였다. 총 수거된 바이오매스 수율은 발현된 구축물에 따라 39 g/ℓ 내지 90 g/ℓ 건조 물질이었다.
실시예 3
테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 봉입체 제조
수거된 세균 세포를 인산칼륨 완충 용액 또는 트라이스 완충 용액(0.1 M, 1 mM MgSO4로 보충됨, pH 6.5)에 재현탁하여 봉입체 제조를 수행하였다. DNAse의 첨가 후, 세포를 900 bar의 압력에서 균질화하여 파괴하였다. 1.5 M NaCl 및 60 mM EDTA를 포함하는 완충제 용액을 균질화된 세포 현탁액에 첨가하였다. 25%(중량/부피) HCl을 사용하여 pH 값을 5.0으로 조절한 후, 최종 봉입체 슬러리를 추가 원심분리 단계 후 수득하였다. 상기 슬러리를 추가 프로세싱까지 일회용 멸균 플라스틱 백 내에서 -20℃에서 저장하였다.
실시예 4a
변성 조건 하에서 His 태그-부착된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 IB 가용화
실시예 3의 봉입체 슬러리를 6 M의 최종 구아니디늄 클로라이드(GdmCl) 농도에서 GdmCl로 가용화하였다. 가용화 후, 상기 슬러리를 적층형 필터들의 병용으로 여과하였다. 변성된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 이 용액을 3배 희석하여 50 mM 인산나트륨 안충제(pH 8.0) 중의 2 M의 최종 GdmCl 농도를 수득하고 다시 여과하여 하기 크로마토그래피 단계(실시예 5 참조)에 적합한 투명한 용액을 수득하였다.
실시예 4b
비-변성 조건 하에서 His 태그-부착된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 IB 가용화
실시예 3의 봉입체 슬러리를 1시간 동안 약 30 mM의 수산화칼륨 용액(pH 11.5로 조절됨)으로 가용화하였다. 그 후, pH 값을 pH 8로 조절하고, 상기 슬러리를 적층형 필터들의 병용으로 여과하였다. 여과액은 하기 크로마토그래피 단계(실시예 5 참조)에 적합하였다.
실시예 5a
IMAC 컬럼 상에의 변성된 His 태그-부착된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 적재
팩킹된 겔 층 ㎖ 당 15 mg 내지 20 mg의 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드 적재량으로 실시예 4a의 용액을 Zn2+ 이온으로 미리 적재되고 변성 적재 완충제(2 M GdmCl, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0, 4배 컬럼 부피)로 평형화된 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC; 프락토겔(등록상표) EMD 킬레이트, 카탈로그 번호 110338, 머크, 독일 다름스타트 소재, 230 ㎖ 컬럼 부피, 24 cm 비드 높이, 3.5 cm 직경) 컬럼 상에 적재하였다. 단백질과 컬럼의 결합은 His 태그와 고정된 Zn2+ 이온의 상호작용에 의해 달성되었다.
실시예 5b
IMAC 컬럼 상에의 천연 His 태그-부착된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 적재
팩킹된 겔 층 ㎖ 당 15 mg 내지 20 mg의 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드 적재량으로 실시예 4b의 용액을 Zn2+ 이온으로 미리 적재되고 천연 적재 완충제(30 mM 인산나트륨, pH 8.0, 4배 컬럼 부피)로 평형화된 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC; 프락토겔(등록상표) EMD 킬레이트, 카탈로그 번호 110338, 머크, 독일 다름스타트 소재, 230 ㎖ 컬럼 부피, 24 cm 비드 높이, 3.5 cm 직경) 컬럼 상에 적재하였다. 단백질과 컬럼의 결합은 His 태그와 고정된 Zn2 + 이온의 상호작용에 의해 달성되었다.
실시예 6
His 태그-부착된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드로 적재된 IMAC 컬럼의 세척
적재 후, 변성 조건 하에서 비-특이적으로 결합된 단백질 및 다른 오염물질을 제거하기 위해 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질 함유 컬럼을 4배 내지 6배 컬럼 부피의 변성 적재 완충제(2 M GdmCl, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0)로 세척하였다.
이 세척 단계 후, 컬럼으로부터 남아있는 GdmCl을 제거하기 위해 3배 컬럼 부피의 경우 250 mM 트라이스 완충제(pH 8.0)에 용해된 4 M 우레아를 사용하여 변성 조건 하에서 제2 세척 단계를 수행하였다.
(결합된 단백질의 카바모일화를 피하기 위해) 우레아 세척 단계 직후, 천연 조건 하에서 세척 단계를 수행하여 변성 우레아를 제거하고 IMAC에 결합된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 재생을 가능하게 하였다(결합된 단백질의 재생은 후속 단백질용해성 절단 및 천연 용출을 위한 전제조건이다). 3배 이상의 컬럼 부피의 경우 예를 들면, 1 M 트라이스 완충제(pH 8.0)를 사용하여 천연 세척 단계를 수행하였다. 이 세척 단계 후, 비-특이적으로 결합된 오염물질을 더 제거하기 위해 1 M 트라이스 이외에 예를 들면, 이미다졸 및/또는 아르기닌을 함유하는 완충제(예시적인 트라이스/이미다졸/아르기닌 완충제는 1 M 트라이스, 70 mM 이미다졸 및 180 mM 아르기닌의 조성을 가짐)를 사용하여 다른 천연 세척 단계를 수행한 후, 1 M 내지 1.2 M 트라이스(pH 8.0)를 사용하여 최종 세척 단계를 수행할 수 있다. 예를 들면, 이미다졸 및/또는 아르기닌의 농도는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질로부터 결합된 단백질을 용출하지 않는 방식으로 선택되어야 한다.
실시예 7
His 태그-부착된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 온-컬럼 절단 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 용출
IgA 프로테아제(EC 3.4.24.13)를 처음 적재된 His 태그-부착된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드에 비해 1:500의 농도에서 최종 천연 세척 완충제(1 M 내지 1.2 M 트라이스, pH 8.0)에 용해시켰다(예를 들면, 15 mg/㎖의 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 적재의 경우 30 ㎍/㎖의 IgA 프로테아제). 이 용액으로부터, 1배 컬럼 부피를 컬럼 상에 적재한 후, 12시간 이상 동안 유동을 정지시켜 프로테아제가 컬럼에 결합된 전구단백질을 절단하여, 즉 His 태그를 절단하여 컬럼으로부터 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 방출할 수 있게 하였다.
프로테아제 항온처리 후, 상기 컬럼을 천연 세척 완충제(1 M 내지 1.2 M 트라이스, pH 8.0)로 세척하여 His 태그로부터 절단된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 용출하였다.
절단되고 회수된 폴리펩티드의 수율은 적용된 전구폴리펩티드의 경우 약 60% 내지 75%이다.
기재된 실시예에 의해 수득된 용출된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 추가 크로마토그래피 단계로 더 정제한 후, 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO2012/28524호에 기재된 바와 같이 지질화시킬 수 있다.
하기 표에서 한 예시적인 실시에 대해 수득된 결과가 요약되어 있다.
Figure pct00005
실시예 8
실시예 6에 기재된 우레아 세척 단계를 누락한 His 태그-부착된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드-적재된 IMAC 컬럼의 세척, His 태그-부착된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 온-컬럼 절단 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 용출
실시예 5a에 따라 변성 조건 하에서 적재한 후, 변성 조건 하에서 비-특이적으로 결합된 단백질 및 다른 오염물질을 제거하기 위해 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질 함유 컬럼을 4배 내지 6배 컬럼 부피의 변성 적재 완충제(2 M GdmCl, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0)로 세척하였다.
GdmCl 세척 단계 후, 천연 조건 하에서 세척 단계를 수행하여 변성 GdmCl를 제거하고 IMAC에 결합된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 재생을 가능하게 하였다(결합된 단백질의 재생은 후속 단백질용해성 절단 및 천연 용출을 위한 전제조건이다). 3배 이상의 컬럼 부피의 경우, 예를 들면, 1 M 트라이스 완충제(pH 8.0)를 사용하여 천연 세척 단계를 수행하였다. 이 세척 단계 후, 비-특이적으로 결합된 오염물질을 더 제거하기 위해 1 M 트라이스 이외에 예를 들면, 이미다졸 및/또는 아르기닌을 함유하는 완충제(예시적인 트라이스/이미다졸/아르기닌 완충제는 1 M 트라이스, 70 mM 이미다졸 및 180 mM 아르기닌의 조성을 가짐)를 사용하여 다른 천연 세척 단계를 수행한 후, 1 M 내지 1.2 M 트라이스(pH 8.0)를 사용하여 최종 세척 단계를 수행할 수 있다. 예를 들면, 이미다졸 및/또는 아르기닌의 농도는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질로부터 결합된 단백질을 용출하지 않는 방식으로 선택되어야 한다.
IgA 프로테아제(EC 3.4.24.13)를 처음 적재된 His 태그-부착된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드에 비해 1:500의 농도에서 최종 천연 세척 완충제(1 M 내지 1.2 M 트라이스, pH 8.0)에 용해시켰다(예를 들면, 15 mg/㎖의 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 적재의 경우 30 ㎍/㎖의 IgA 프로테아제). 이 용액으로부터, 1배 컬럼 부피를 컬럼 상에 적재한 후, 12시간 이상 동안 유동을 정지시켜 프로테아제가 컬럼에 결합된 전구단백질을 절단하여, 즉 His 태그를 절단하여 컬럼으로부터 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 방출할 수 있게 하였다.
프로테아제 항온처리 후, 상기 컬럼을 천연 세척 완충제(1 M 내지 1.2 M 트라이스, pH 8.0)로 세척하여 His 태그로부터 절단된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 용출하였다.
우레아 세척 단계를 누락하였을 때 절단되고 회수된 폴리펩티드의 수율은 적용된 전구폴리펩티드의 경우 약 20배 컬럼 부피의 천연 세척 완충제로 용출한 후에조차도 50% 미만이다. 이들 조건들 하에서 용출물 중의 단백질 농도는 실시예 7에 기재된 조건 하에서 수득된 용출물(약 2 mg/㎖)에 비해 매우 낮다(약 0.2 mg/㎖).
테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 천연 세척 완충제로 용출한 후 우레아 세척 단계를 수행하였을 때 또 다른 약 40%의 절단된 폴리펩티드가 약 0.9 mg/㎖의 농도로 회수될 수 있다.
실시예 9
IGF-1 전구폴리펩티드의 봉입체 제조
수거된 세균 세포를 인산칼륨 완충 용액 또는 트라이스 완충 용액(0.1 M, 1 mM MgSO4로 보충됨, pH 6.5)에 재현탁하여 봉입체 제조를 수행하였다. DNAse의 첨가 후, 세포를 900 bar의 압력에서 균질화하여 파괴하였다. 1.5 M NaCl 및 60 mM EDTA를 포함하는 완충제 용액을 균질화된 세포 현탁액에 첨가하였다. 25%(중량/부피) HCl을 사용하여 pH 값을 5.0으로 조절한 후, 최종 봉입체 슬러리를 추가 원심분리 단계 후에 수득하였다. 상기 슬러리를 추가 프로세싱까지 일회용 멸균 플라스틱 백 내에서 -20℃에서 저장하였다.
실시예 10
변성 조건 하에서 His 태그-부착된 IGF-1 전구폴리펩티드의 IB 가용화
실시예 9의 봉입체 슬러리 40 g을 6 M의 최종 구아니디늄 클로라이드(GdmCl) 농도에서 가용화 완충제(6.7 M GdmCl, 1 mM EDTA, 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.0)로 가용화하였다. 가용화 후, 상기 슬러리를 적층형 필터들의 병용으로 여과하였다. 변성된 IGF-1 전구폴리펩티드의 이 용액을 3배 희석하여 50 mM 인산나트륨 안충제(pH 8.0) 중의 2 M의 최종 GdmCl 농도를 수득하고 다시 여과하여 약 400 ㎖ 최종 부피의 투명한 용액을 수득하였다.
실시예 11
변성된 His 태그-부착된 IGF-1 전구폴리펩티드의 재생
400 ㎖의 가용화된 IGF-1 전구폴리펩티드를 3시간 동안 3.6 ℓ의 재생 완충제(1 M 아르기닌, 2 mM GSH, 0.1 mM GSSG, pH 8.0)에 첨가하였다. IGF-1 전구폴리펩티드를 교반하면서 5시간 동안 재생시킨 후, 교반 없이 12시간 동안 재생시켰다. 재생을 완료한 후, 용액을 후속 IMAC 크로마토그래피의 평형화 완충제(2 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0)의 7배 부피에 대하여 정용여과하여 총 21배 부피를 발생시켰다.
실시예 12
IMAC 컬럼 상에의 변성된 His 태그-부착된 IGF-1 전구폴리펩티드의 적재
1 ℓ의 실시예 11의 용액을 Zn2+ 이온으로 미리 적재되고 변성 적재 완충제(2 M GdmCl, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0, 2배 컬럼 부피)로 평형화된 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC; 프락토겔(등록상표) EMD 킬레이트, 카탈로그 번호 110338, 머크, 독일 다름스타트 소재, 230 ㎖ 컬럼 부피, 24 cm 비드 높이, 3.5 cm 직경) 컬럼 상에 적재하였다. 단백질과 컬럼의 결합은 His 태그와 고정된 Zn2+ 이온의 상호작용에 의해 달성되었다.
실시예 13
His 태그-부착된 IGF-1 전구폴리펩티드로 적재된 IMAC 컬럼의 세척
적재 후, 변성 조건 하에서 비-특이적으로 결합된 단백질 및 다른 오염물질을 제거하기 위해 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질 함유 컬럼을 10배 컬럼 부피의 변성 적재 완충제(2 M GdmCl, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0)로 세척하였다.
이 세척 단계 후, 컬럼으로부터 남아있는 GdmCl을 제거하기 위해 3배 컬럼 부피의 경우 250 mM 트라이스 완충제(pH 8.0)에 용해된 4 M 우레아를 사용하여 변성 조건 하에서 제2 세척 단계를 수행하였다.
(결합된 단백질의 카바모일화를 피하기 위해) 우레아 세척 단계 직후, 천연 조건 하에서 세척 단계를 수행하여 변성 우레아를 제거하고 IMAC에 결합된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구폴리펩티드의 재생을 가능하게 하였다(결합된 단백질의 재생은 후속 단백질용해성 절단 및 천연 용출을 위한 전제조건이다). 4배 컬럼 부피의 경우 예를 들면, 1 M 트라이스 완충제(pH 8.0)를 사용하여 천연 세척 단계를 수행하였다. 이 세척 단계 후, 비-특이적으로 결합된 오염물질을 더 제거하기 위해 1 M 트라이스 이외에 예를 들면, 이미다졸 및/또는 아르기닌을 함유하는 완충제(예시적인 트라이스/이미다졸/아르기닌 완충제는 1 M 트라이스, 70 mM 이미다졸 및 180 mM 아르기닌의 조성을 가짐, pH 8.0)를 사용하여 다른 천연 세척 단계를 수행한 후, 1.2 M 트라이스(pH 8.0)를 사용하여 최종 세척 단계를 수행하였다.
실시예 14
His 태그-부착된 IGF-1 전구폴리펩티드의 온-컬럼 절단 및 IGF-1의 용출
IgA 프로테아제(EC 3.4.24.13)를 처음 적재된 His-IGF-1 전구폴리펩티드에 비해 1:500의 농도에서 최종 천연 세척 완충제(1.2 M 트라이스, pH 8.0)에 용해시켰다. 이 용액으로부터, 1.1배 컬럼 부피를 컬럼 상에 적재한 후, 12시간 동안 유동을 정지시켜 프로테아제가 컬럼에 결합된 전구단백질을 절단하여, 즉 His 태그를 절단하여 컬럼으로부터 IGF-1을 방출할 수 있게 하였다.
프로테아제 항온처리 후, 상기 컬럼을 천연 세척 완충제(1.2 M 트라이스, pH 8.0)로 세척하여 His 태그로부터 절단된 IGF-1을 용출하였다.
각각의 크로마토그램은 도 3에 제시되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> On-column enzymatic cleavage <130> 30890 WO <140> PCT/EP2013/053872 <141> 2013-02-27 <150> EP 12157510.4 <151> 2012-02-29 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> interferon and tag and cleavage site containing tetranectin-apolipoprotein A-I fusion polypeptide <400> 1 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser His His His His His 1 5 10 15 His Gly Ser Val Val Ala Pro Pro Ala Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys 20 25 30 Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp 35 40 45 Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln 50 55 60 Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu 65 70 75 80 Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val 85 90 95 Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu 100 105 110 Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu 115 120 125 Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu 130 135 140 Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys 145 150 155 160 Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu 165 170 175 Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu 180 185 190 Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser 195 200 205 Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala 210 215 220 Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu 225 230 235 240 Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala 245 250 255 Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys 260 265 270 Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu 275 280 285 Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys 290 295 300 Lys Leu Asn Thr Gln 305 <210> 2 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> short leader and tag and cleavage site containing tetranectin-apolipoprotein A-I fusion polypeptide <400> 2 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Val Val Ala Pro 1 5 10 15 Pro Ala Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met 20 25 30 Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala 35 40 45 Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln 50 55 60 Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val 65 70 75 80 Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala 85 90 95 Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val 100 105 110 Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln 115 120 125 Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu 130 135 140 Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu 145 150 155 160 Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln 165 170 175 Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys 180 185 190 Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg 195 200 205 Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro 210 215 220 Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr 245 250 255 Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp 260 265 270 Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe 275 280 285 Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 290 295 300 <210> 3 <211> 298 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tag and cleavage site containing tetranectin-apolipoprotein A-I fusion polypeptide <400> 3 His His His His His His Gly Ser Val Val Ala Pro Pro Ala Pro Ile 1 5 10 15 Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu 20 25 30 Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu 35 40 45 Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp 50 55 60 Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser 65 70 75 80 Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln 85 90 95 Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe 100 105 110 Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp 115 120 125 Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp 130 135 140 Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln 145 150 155 160 Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro 165 170 175 Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu 180 185 190 Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg 195 200 205 Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu 210 215 220 Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly 225 230 235 240 Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser 245 250 255 Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly 260 265 270 Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu 275 280 285 Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 290 295 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4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 9 Pro Pro Gly Pro 1 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzymatic cleavage site <400> 10 Pro Arg Pro Pro Thr Pro 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzymatic cleavage site <400> 11 Val Val Ala Pro Pro Ala Pro 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzymatic cleavage site <400> 12 Val Val Ala Pro Pro Ser Pro 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzymatic cleavage site <400> 13 Val Val Ala Pro Pro Thr Pro 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzymatic cleavage site <400> 14 Val Val Ala Pro Pro Gly Pro 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzymatic cleavage site <400> 15 Ala Pro Pro Ala Ala Pro 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzymatic cleavage site <400> 16 Pro Arg Pro Pro Ala Pro 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzymatic cleavage site <400> 17 Pro Arg Pro Pro Ser Pro 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzymatic cleavage site <400> 18 Pro Arg Pro Pro Gly Pro 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hexahistidine affinity tag <400> 20 His His His His His His 1 5 <210> 21 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe 1 5 10 15 Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu 20 25 30 Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala 35 40 45 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 50 55 60 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 65 70 75 80 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 85 90 95 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 100 105 110 Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp 115 120 125 Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr 130 135 140 Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu 145 150 155 160 Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys 165 170 175 Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys 180 185 190 Lys Gly Lys 195

Claims (15)

  1. 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼 상에서의 프로테아제(protease) 절단 부위의 온-컬럼(on-column) 효소적 절단으로 N-말단 또는 C-말단에서 금속 이온 친화성 크로마토그래피 태그, 및 상기 태그와 폴리펩티드 사이에 위치한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 전구폴리펩티드로부터 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법:
    - 상기 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 결합된 상기 전구폴리펩티드를 변성시키는 단계,
    - 상기 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 결합된 상기 전구폴리펩티드를 재생시키는 단계, 및
    - 상기 결합된 전구폴리펩티드를 프로테아제와 함께 항온처리하여 폴리펩티드를 제조하는 단계.
  2. 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼 상에서의 프로테아제 절단 부위의 온-컬럼 효소적 절단으로 N-말단 또는 C-말단에서 금속 이온 친화성 크로마토그래피 태그, 및 상기 태그와 폴리펩티드 사이에 위치한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 전구폴리펩티드로부터 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법:
    - 결합된 전구폴리펩티드를 변성제를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계,
    - 임의적으로, 이전 단계에서 사용된 변성제를 포함하는 용액이 우레아 또는 우레아 유도체를 함유하지 않는 경우 상기 결합된 전구폴리펩티드를 우레아 또는 우레아 유도체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계, 또는 이전 단계에서 사용된 변성제를 포함하는 용액이 우레아 또는 우레아 유도체와 변성제의 혼합물을 포함하는 경우 상기 결합된 전구폴리펩티드를 우레아 또는 우레아 유도체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계, 및
    - 상기 결합된 전구폴리펩티드를 프로테아제와 함께 항온처리하여 상기 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 폴리펩티드를 제조하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    프로테아제와 함께 항온처리하기 직전에 변성제 무함유 용액으로 세척하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드가 천연 형태로 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드가 변성된 형태로 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    변성제가 구아니디늄 클로라이드, 우레아, 티오우레아 및 테트라메틸우레아로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    변성제가 0.5 M 내지 6 M의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    우레아 또는 우레아 유도체가 0.5 M 내지 8 M의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    전구폴리펩티드가 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질에 천연 형태 또는 변성된 형태로 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 물질이 고정된 아연 친화성 크로마토그래피 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    프로테아제가 IgA 프로테아제, 트립신 및 그랜자임(granzyme) B로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    변성제 무함유 용액이 약 pH 8의 pH 값에서 0.5 M 내지 1.5 M 트라이스(Tris)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드가 비-글리코실화된 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드가 아포지단백질 A-I, 아포지단백질 A-I을 포함하는 융합 폴리펩티드, 인간 인슐린 유사 성장인자 1(IGF-1) 또는 인슐린 유사 성장인자 1(IGF-1)을 포함하는 융합 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포의 배양 배지로부터 수득된 폴리펩티드를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 방법으로 정제하여 상기 폴리펩티드를 제조하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
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