CN103068368A - 产生四连蛋白-载脂蛋白a-i脂质颗粒的方法,脂质颗粒本身及其应用 - Google Patents
产生四连蛋白-载脂蛋白a-i脂质颗粒的方法,脂质颗粒本身及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103068368A CN103068368A CN2011800386711A CN201180038671A CN103068368A CN 103068368 A CN103068368 A CN 103068368A CN 2011800386711 A CN2011800386711 A CN 2011800386711A CN 201180038671 A CN201180038671 A CN 201180038671A CN 103068368 A CN103068368 A CN 103068368A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- apolipoprotein
- lipid
- albumen
- seq
- detergent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1275—Lipoproteins; Chylomicrons; Artificial HDL, LDL, VLDL, protein-free species thereof; Precursors thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
Abstract
本文报道一种用于产生脂质颗粒的方法,所述方法包括下述步骤:i)提供包含变性载脂蛋白的第一溶液,ii)将所述第一溶液加入第二溶液中,所述第二溶液包含至少两种脂质和洗涤剂,但是不含载脂蛋白,和iii)从步骤ii)获得的溶液中去除所述洗涤剂并且由此产生脂质颗粒。
Description
本发明涉及脂蛋白和脂质颗粒领域。本文报道了产生包含载脂蛋白、磷脂酰胆碱和脂质的脂质颗粒的方法,以及四连蛋白-载脂蛋白A-I。
发明背景
血浆脂蛋白是可溶性的蛋白-脂质复合物,其在血液中进行脂质运输和代谢。基于它们的密度、尺寸、化学组成和功能,对数种主要种类的脂蛋白进行了区分。在它们之中,也被称为高密度脂质颗粒的高密度脂蛋白(HDL)颗粒由平均分子量从180kD变化到360kDa的数个亚类组成。它们的平均脂质和蛋白含量分别是50重量%。磷脂酰胆碱(PC)占总脂质的38%,其次是胆固醇酯和小量的其他极性和非极性脂质,包括游离的胆固醇。主要的蛋白成分是载脂蛋白A-I(Apo A-I),代表人HDL中约60%的总蛋白重量。
在人体中的胆固醇,尤其是在循环的体液如血液中的胆固醇,不以分离的分子形式存在,而是以与某些蛋白的复合物(脂蛋白)形式存在。胆固醇的主要级分与低密度脂蛋白(LDL)或与高密度脂蛋白(HDL)复合。LDL颗粒包含载脂蛋白B作为主要的蛋白质化合物,而HDL颗粒包含载脂蛋白A-I作为主要的蛋白质化合物。
由HDL颗粒吸收的胆固醇被酶卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)酯化。胆固醇酯具有增加的疏水性并朝向HDL颗粒的核心扩散。HDL-胆固醇-酯颗粒可以被递送到肝脏并从循环中去除。
HDL颗粒和其主要的多肽载脂蛋白A-I参与反向胆固醇运输(RCT)。其中载脂蛋白A-I增加胆固醇从细胞中的流出(例如从血管壁的细胞中流出),脂质的结合和卵磷脂胆固醇乙酰转移酶的激活,并由此通过肝脏经血浆流动清除胆固醇。这是主动运输过程,涉及细胞膜蛋白ATP-结合-盒式-转运蛋白-A-I(ABCA-I)。
基于载脂蛋白A-I和载脂蛋白的治疗剂,例如重构的HDL颗粒已经在上世纪的70年代晚期和80年代早期进行了鉴定。对于包含脂质颗粒的载脂蛋白A-I-Milano,可以显示临床证据(意味着在动脉硬化患者中显著的斑块减少)。载脂蛋白A-I-Milano是一种野生型载脂蛋白A-I的二聚体形式,根据载脂蛋白A-I分子天然存在的突变体进行设计。通过将氨基酸残基173(精氨酸)改变为半胱氨酸从而允许形成二硫键能够形成二聚体。
在WO2009/131704中,报道了适合螯合胆固醇和其他分子的包含含有无机材料核心的纳米结构。在WO2009/097587中报道了用于产生纳米级别的界面双层的方法,包括在获得混合物的约1小时内从中间体混合物中消除洗涤剂。在WO2006/125304中,报道了治疗或预防冠状动脉疾病的药物组合物。在US2002/10142953中报道了涉及脂质代谢和心血管疾病的编码载脂蛋白的组合物。在WO2005/084642中,报道了脱辅基蛋白质-共螯合剂(apoprotein-cochelate)组合物。在WO2007/137400中,报道了治疗瓣膜狭窄的方法和化合物。在WO2005/041866中报道了用于治疗和预防急性冠状动脉综合征的药物制剂、方法和给药方案。
在US6,287,590中,报道了通过共-冷冻干燥形成的肽/脂质复合物。在US6,037,323中报道了载脂蛋白A-I激动剂以及它们用于治疗血脂异常疾病(dislipidemic disorders)的应用。
在WO2009/097587中,报道了纳米级别的界面双层、应用和产生方法。在WO2005/065708中报道了具有提高的耐受性的在免疫原性组合物中的疏水蛋白制剂。在WO2006/069371中,报道了预防、抑制和/或逆转动脉粥样硬化的血浆脂质化方法。在FR2915490中报道了包含膜蛋白的蛋白脂质体(proteoliposomes)的形成。
发明概述
本文报道了一种用于产生包含蛋白的脂质颗粒的方法。已经发现可以从包含变性蛋白的溶液通过快速稀释到包含至少一种脂质和洗涤剂的溶液中形成脂质颗粒。在该步骤中,洗涤剂的浓度被减少到CMC以下。使用这种方法,可以省去前面的产生天然性质(naturation)步骤,并且因此,使用如本文报道的方法,能够更快的产生脂质颗粒。
在一个实施方案中,稀释是约1∶3(v∶v)到约1∶20(v∶v)。
在一个实施方案中,稀释是约1∶5(v∶v)到约1∶10(v∶v)。
在一个实施方案中,稀释是约1∶5(v∶v)。
在一个实施方案中,洗涤剂被稀释至少约3倍。在一个实施方案中,洗涤剂被稀释至少约5倍。
本文报道的一个方面是用于产生脂质颗粒的方法,所述方法包括下述步骤:
i)提供包含变性蛋白的第一溶液,
ii)将第一溶液加入包含至少一种脂质和洗涤剂但不包含所述蛋白的第二溶液中,和
iii)从在步骤ii)中获得的溶液去除洗涤剂并且由此产生脂质颗粒。
在一个实施方案中,第一溶液不包含脂质。
在一个实施方案中,蛋白是重组产生的蛋白。
在一个实施方案中,蛋白是载脂蛋白。在另一个实施方案中,载脂蛋白是纯化的载脂蛋白。
在一个实施方案中,载脂蛋白具有选自SEQ ID NO:01,02和04-52和66-67的氨基酸序列的氨基酸序列或包含至少一个含有SEQ ID NO:01,02和04-52和66和67的氨基酸序列的至少80%的连续片段。
在一个实施方案中,载脂蛋白具有氨基酸序列或是选自SEQ ID NO:01,02和04-52和66和67的氨基酸序列的至少80%的连续片段。
在一个实施方案中,载脂蛋白是载脂蛋白A-I。在一个实施方案中,载脂蛋白A-I是人载脂蛋白A-I。在另一个实施方案中,载脂蛋白是四连蛋白-载脂蛋白A-I,其具有氨基酸序列SEQ ID NO:01或SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67。
在一个实施方案中,载脂蛋白具有带有选自R151C和R197C的突变SEQ ID NO:06的氨基酸序列。
在一个实施方案中,第二溶液具有是所述第一溶液体积的至少两倍的体积。
在一个实施方案中,所述第二溶液具有所述第一溶液体积的约3倍到约20倍。在一个实施方案中,所述第二溶液具有所述第一溶液体积的约5倍到约10倍。
在一个实施方案中,至少一种脂质选自磷脂、脂肪酸和类固醇脂质。
在一个实施方案中,至少一种脂质是任选地彼此独立地选自磷脂、脂肪酸和类固醇脂质的至少两种脂质。在另一个实施方案中,至少一种脂质来自1-4种脂质,即选自包括一种脂质、两种脂质、三种脂质和四种脂质的组。
在一个实施方案中,第二溶液包含磷脂、脂质和洗涤剂。
在一个实施方案中,第二溶液由磷脂、脂质、洗涤剂和缓冲盐组成。
在一个实施方案中,脂质是两种不同的磷脂。在另一种实施方案中,脂质是两种不同的磷脂酰胆碱。在另一个实施方案中,第一磷脂酰胆碱和第二磷脂酰胆碱的不同之处在于一个或两个脂肪酸残基或脂肪酸残基衍生物,其被酯化为磷脂酰胆碱的甘油主链。在一个实施方案中,第一磷脂酰胆碱是POPC,第二磷脂酰胆碱是DPPC。
在一个实施方案中,洗涤剂选自基于糖的洗涤剂,基于聚氧乙烯的洗涤剂,基于胆汁盐的洗涤剂,合成洗涤剂或其组合。在另一个实施方案中,洗涤剂选自胆酸,两性洗涤剂(Zwittergent)或它们的盐。
在本文报道的方法的一个实施方案中,第一溶液基本不含脂质颗粒。
在一个实施方案中,所述方法在步骤ii)之后和步骤iii)之前包括一个下述步骤iia):温育在步骤ii)中获得的溶液。在一个实施方案中,温育和/或去除在从4℃-45℃的温度进行。
在一个实施方案中,用洗涤剂温育多肽约0.5小时到约60小时。在一个实施方案中,用洗涤剂温育多肽约0.5小时到约20小时。在一个实施方案中,用洗涤剂温育多肽约2小时到约60小时。在一个实施方案中,用洗涤剂温育多肽约12小时到约20小时。在一个实施方案中,用洗涤剂温育多肽约16小时。
在一个实施方案中,洗涤剂是具有高CMC的洗涤剂。在另一个实施方案中,洗涤剂是具有至少5mM的CMC的洗涤剂。在另一个实施方案中,洗涤剂是具有至少10mM的CMC的洗涤剂。
在一个实施方案中,洗涤剂的浓度在第二溶液中是至少0.5×CMC。
在一个实施方案中,通过渗滤或透析或吸附来进行去除。在一个实施方案中,吸附选自亲和色谱法或疏水色谱法。在一个实施方案中,去除通过透析进行。
在一个实施方案中,第一溶液具有第一体积,第二溶液具有第二体积,在第一溶液中的蛋白具有限定的浓度,并且在第二溶液中的脂质和洗涤剂各具有限定的浓度,并且在步骤ii)中,载脂蛋白的浓度,脂质的浓度和洗涤剂的浓度被改变/减少,允许形成脂质颗粒。
在一个实施方案中,所述方法包括下述步骤:
iv)纯化脂质颗粒并由此制备脂质颗粒。
本文报道的一个方面是通过如本文报道的方法获得的脂质颗粒。
本文报道的一个方面是药物组合物,所述药物组合物包含用本文报道的方法获得的含有载脂蛋白的脂质颗粒,以及将本文报道的脂质颗粒用于制备治疗动脉粥样硬化的药物的应用。
发明详述
定义
术语“载脂蛋白”指分别在脂质或脂蛋白颗粒中包含的蛋白。
术语“载脂蛋白A-I”指具有蛋白-脂质和蛋白-蛋白相互作用性质的两亲性螺旋多肽。载脂蛋白A-I作为267个氨基酸残基的前载脂蛋白原(prepro-apoliprotein)由肝脏和小肠合成,所述前载脂蛋白原作为载脂蛋白原(pro-apolipoprotein)被分泌,其被切割为具有243个氨基酸残基的成熟多肽。载脂蛋白A-I由被接头部分分隔的6-8个不同的氨基酸重复序列组成,所述氨基酸重复序列分别由22个氨基酸残基组成,所述接头部分通常是脯氨酸,并且在某些情形中,由数个残基组成的片段组成。示例性的人载脂蛋白A-I氨基酸序列在GenPept数据库登录号NM-000039或数据库登录号X00566;GenBank NP-000030.1(gi4557321)中报道。人载脂蛋白A-I(SEQ ID NO:06)存在天然存在的变体,如P27H,P27R,P28R,R34L,G50R,L84R,D113E,A-A119D,D127N,缺失K131,K131M,W132R,E133K,R151C(氨基酸残基151由Arg变化为Cys,载脂蛋白A-I-Paris),E160K,E163G, P167R,L168R,E171V, P189R,R197C(氨基酸残基173由Arg改变为Cys,载脂蛋白A-I-Milano)和E222K。还包括具有保守氨基酸修饰的变体。
在一个实施方案中,四连蛋白-载脂蛋白A-I包含免疫球蛋白A蛋白酶(IgA蛋白酶)的切割位点的片段。从IgA蛋白酶已知的识别位点包含下述序列,其中“↓”表示切割键的位置:
Pro-Ala-Pro↓Ser-Pro (SEQ ID NO:61)
Pro-ProSer-Pro (SEQ ID NO:62)
Pro-Pro↓Ala-Pro (SEQ ID NO:63)
Pro-Pro↓Thr-Pro (SEQ ID NO:64)
Pro-Pro↓Gly-Pro (SEQ ID NO:65),
其中更频繁地选择和切割前三个。
术语“载脂蛋白模拟物”指模拟各个载脂蛋白的功能的合成多肽。例如,“载脂蛋白A-I模拟物”是显示关于去除胆固醇(即反向胆固醇流出)与天然载脂蛋白A-I相当的生物功能的合成多肽。在一个实施方案中,载脂蛋白A-I模拟物包含至少一个两亲性α-螺旋,其具有在疏水-亲水界面集簇的带正电荷的氨基酸残基和在亲水性面的中心集簇的带负电荷的氨基酸残基。为了模拟载脂蛋白A-I的功能,载脂蛋白模拟物包含从15-29个氨基酸残基的重复多肽,在一个实施方案中,包含22氨基酸残基(PVLDEFREKLNEELEALKQKLK(SEQ ID NO:04);PVLDLFRELLNELLEAL KQKLK(SEQ ID NO:05))的重复多肽。
术语“至少一个”指一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或更多。术语“至少两个”指两个,三个,四个,五个,六个,七个,八个,九个,十个或更多。
术语“心血管疾病”一般指关于心脏或血管的疾病或病症,如动脉粥样硬化、冠状动脉心脏病、脑血管疾病、主动脉疾病(aortoiliac disease)、局部缺血性心脏病或外周血管疾病。这些疾病在作为疾病结果的恶性事件发生之前可能不会被发现,所述恶性事件如心肌梗塞、卒中、心绞痛、短暂性脑缺血性发作、充血性心力衰竭、主动脉瘤,这些恶性事件大多数情况下会导致受试者死亡。
术语″胆酸盐″指3α,7α,12α-三羟基-5β-胆-24-酸或其盐,尤其是其钠盐。可以通过在它们各自的转变温度与洗涤剂溶解的脂质一起温育载脂蛋白来形成脂质颗粒。
术语“临界胶束浓度”及其缩写“CMC”,可以交互使用,指这样的表面活性剂或洗涤剂浓度,超过所述浓度,个体洗涤剂分子(单体)自发团聚为胶束(胶束,圆杆,层状结构等)。
术语“保守氨基酸修饰”指不会影响或改变根据本发明的脂质颗粒或载脂蛋白的特性的氨基酸序列修饰。修饰可以通过本领域已知的标准技术引入,如位点定向诱变和PCR-介导的突变。保守氨基酸修饰包括其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的修饰。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸),具有酸性侧链的氨基酸(例如,天冬氨酸、谷氨酸),具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸),具有非极性侧链的氨基酸(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸),具有β-支链侧链的氨基酸(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此“变体”蛋白,在本文指这样的分子,其氨基酸序列与“母体”蛋白氨基酸序列的不同在于至多10个添加、缺失和/或置换,在一个实施方案中,从约2个到约5个的添加、缺失和/或置换。可以通过基于Riechmann,L.,等,Nature(自然)332(1988)323-327,和Queen,C.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033.所述的分子建模的诱变来进行氨基酸序列修饰。
术语“洗涤剂”指表面活性化学物质。“洗涤剂”通常是具有非极性疏水部分和极性亲水部分的两亲性分子。术语“两性离子洗涤剂(zwitterionicdetergent)”指总电荷为零并且同时包含至少一个带正电荷的部分和至少一个带负电荷的部分的表面活性化学化合物。在一个实施方案中,洗涤剂选自基于糖的洗涤剂,基于聚氧化烯的洗涤剂,基于胆汁盐的洗涤剂,合成洗涤剂或其组合。术语“基于糖的洗涤剂”指选自正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷或5-环已基戊基-β-D-吡喃麦芽糖苷及其衍生物的洗涤剂。术语“基于胆汁盐的洗涤剂”指选自胆酸钠、胆酸钾、胆酸锂、3-[(3-氯酰氨基丙基)二甲基铵基]-基-丙烷磺酸酯(CHAPS)、3-[(3氯酰氨基丙基)二甲基铵基]-2-羟基丙烷磺酸酯(CHAPSO),和其衍生物的洗涤剂。术语“基于聚氧化烯的洗涤剂”指选自Tween20、Triton X-100,Pluronic F68和其衍生物的洗涤剂。术语“合成洗涤剂”指选自两性洗涤剂3-6、两性洗涤剂3-8、两性洗涤剂3-10、两性洗涤剂3-12和其衍生物的洗涤剂。
术语“高密度脂蛋白颗粒”或其缩写“HDL颗粒”,可以交互使用,指包含载脂蛋白A-I作为主要的蛋白化合物的脂质-蛋白复合物。
术语“免疫测定法”指用单克隆抗体进行的标准固相免疫测定法,包括在吸附/固定在固相上的抗体(捕获抗体),抗原和与酶缀合的针对抗原的另一表位的抗体(示踪抗体)之间形成复合物。因此,形成多层结构:固相-捕获抗体-抗原-示踪抗体。在由多层结构催化的反应中,抗体-缀合的酶的活性与温育介质中的抗原浓度成比例。标准夹心式方法也被称为双抗原桥连免疫测定法,因为捕获抗体和示踪抗体结合于抗原的不同表位。其它类型的测定法是放射性免疫测定法、荧光免疫测定法和酶联免疫测定法。进行所述测定法的方法以及实际应用和程序是本领域技术人员已知的。免疫测定法可以以均相免疫测定法或异相免疫测定法形式进行。
术语″增加脂质流出″和其语法等同成分指自细胞或斑块增加的脂质流出的水平和/或速率,促进脂质流出,增强脂质流出,协助脂质流出,上调脂质流出,提高脂质流出,和/或加强脂质流出。在一个实施方案中,脂质流出包括磷脂、甘油三酯、胆固醇和/或胆固醇酯的流出。
术语“DMPC”指磷脂二豆蔻酰磷脂酰胆碱。
术语“DPPC”指磷脂1,2-二-棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱,也被称为1,2-二棕榈酰-磷脂酰胆碱。
术语“多聚体”指由两个以上单体组成的复合物。多聚体在单体之间通过非共价相互作用形成。每个单体包含多聚化的结构域。在一个实施方案中,多聚体包含2或3个单体。在另一个实施方案中,多聚化结构域通过在包含在每个单体中的个体多聚化结构域之间的非共价相互作用来相互作用。术语″多聚化结构域″指能够共价或非共价缔合两个以上单体分子的氨基酸序列。多聚化结构域能够与不同、类似或相同氨基酸序列的多聚化结构域相互作用。在一个实施方案中,多聚化结构域是四连蛋白三聚化结构元件或其衍生物,其具有与SEQ ID NO:53的共有氨基酸序列具有至少68%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中,在SEQ ID NO:53的位置50的半胱氨酸残基被不同的氨基酸残基置换,在另一个实施方案中,被丝氨酸残基或苏氨酸残基或甲硫氨酸残基置换。包含多聚化结构域的多肽可以与一个或多个也包含多聚化结构域的其它多肽缔合。可以简单地通过在适合的条件下混合多肽来起始多聚体形成。在另一个实施方案中,多聚化结构域具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列,其中在氨基酸序列的N端或C端缺失或添加1-10个残基。在另一个实施方案中,多聚化结构域具有SEQID NO:53的氨基酸序列,其中在氨基酸序列的N-端缺失6或9个氨基酸残基。在又一个实施方案中,多聚化结构域具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列,其中缺失了N端氨基酸残基L或N端氨基酸残基C和L。在一个实施方案中,多聚化结构域是四连蛋白三聚化结构元件并且具有SEQ IDNO:54的氨基酸序列。在一个实施方案中,多聚体是同聚体。
多聚体可以是同聚体或异聚体,因为包含多聚化结构域的不同载脂蛋白可以组合结合到所述多聚体中。在一个实施方案中,多聚体是三聚体同聚体。
按照一个实施方案,多聚化结构域获自四连蛋白。在一个实施方案中,多聚化结构域包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的四连蛋白三聚化结构元件。四连蛋白三聚化结构元件三聚化作用由卷曲的螺旋结构导致,所述卷曲的螺旋结构与两个其他四连蛋白三聚化结构元件的卷曲的螺旋结构相互作用以形成三聚体。四连蛋白三聚化结构元件可以获自人四连蛋白,获自兔四连蛋白,获自鼠四连蛋白,或获自鲨鱼软骨的C-型凝集素。在一个实施方案中,四连蛋白三聚化结构元件包含与SEQ ID NO53的共有序列具有至少68%,或至少75%,或至少81%,或至少87%,或至少92%同一性的序列。
术语“非共价相互作用”指非共价结合力如离子相互作用力(例如盐桥),非离子相互作用力(例如,氢键),或疏水相互作用力(例如,范德华力或π-堆积相互作用)。
术语″相变温度″指诱导脂质物理状态从有序的凝胶相(,其中烃链充分延伸并且紧密包装)向无序的液晶相(其中烃链随机定向并且流动)变化所需要的温度。可以在所用的磷脂/磷脂混合物的相变温度或相变温度以上的温度进行脂质颗粒的形成。在下表1中列出数种磷脂酰胆碱和其混合物的相变温度。
表1:纯的磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱混合物的相变温度
术语“磷脂酰胆碱”指由一个甘油部分,两个羧酸部分和一个磷酸胆碱部分组成的分子,其中甘油部分与其他部分分别通过酯键,即两个羧酸酯键和一个磷酸酯键共价结合,其中磷酸酯键与甘油部分的1-羟基或3-羟基结合。术语“羧酸部分”指包含至少一个酰基(R-C(O)O)的有机部分。磷脂酰胆碱可以是任何种类或来源的。在一个实施方案中,磷脂酰胆碱选自卵磷脂酰胆碱,大豆磷脂酰胆碱,二棕榈酰磷脂酰胆碱,二豆蔻酰磷脂酰胆碱,二硬脂酰磷脂酰胆碱,二月桂酰磷脂酰胆碱,二棕榈酰磷脂酰胆碱,1-豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱,1-棕榈酰-2-豆蔻酰磷脂酰胆碱,1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱,1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱,二油酰磷脂酰胆碱,1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱,1-油酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱,和其类似物和衍生物。
本文所用的所有磷脂可以来自任何来源,即(如果合适),来自大豆、乳、蛋或甚至除了人之外的动物的内部器官,它们可以来自天然来源,或半合成来源或甚至完全合成来源。
″多肽″是由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物,不管其是天然产生或合成产生的。可以将少于约20个氨基酸残基的多肽称为“肽”而将由两个以上多肽组成或包含一个100个氨基酸残基以上的多肽的分子称为“蛋白”。多肽还可以包含非氨基酸成分,如碳水化合物基团,金属离子,或羧酸酯。非氨基酸成分可以由表达多肽的细胞添加,并且可以随细胞类型变化。多肽在本文中由它们的氨基酸主链结构或编码其的核酸限定。通常不指定诸如碳水化合物的添加,但是其可以存在。
术语“POPC”指磷脂1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱,也称为1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱。
术语“快速”指在至多10小时内完成的过程。快速稀释是其中在至多10小时内将第一溶液加入第二溶液中的过程。在一个实施方案中,该过程在至多5小时内完成,在另一个实施方案中,在至多2小时内完成。
术语“基本不含”指包含蛋白和一种或多种脂质的溶液包含少于5%(w/w)脂质颗粒,少于2.5%脂质颗粒,少于1%脂质颗粒或少于0.5%脂质颗粒。
术语“变体”还包括本文报道的载脂蛋白的变体或载脂蛋白模拟物,其中在变体中,各个载脂蛋白或载脂蛋白模拟物的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸置换、添加或缺失。修饰可以增加或减少载脂蛋白对于载脂蛋白受体或载脂蛋白转化酶的亲和性,或可以与各个载体蛋白相比增加载脂蛋白变体的稳定性,或可以与相应载脂蛋白相比增加载脂蛋白变体在水溶液中的溶解性,或可以与各个载脂蛋白相比增加载脂蛋白变体在宿主细胞中/由宿主细胞的重组产生。
本文报道的
已经发现脂质颗粒可以从包含变性蛋白但不包含洗涤剂且不包含脂质的溶液开始,通过快速稀释到包含洗涤剂和至少一种脂质但不含有蛋白的溶液中来直接形成。可以省去一般需要的产生天然性质的步骤,因此提供用于产生脂质颗粒的更简单和可靠的方法。另外,形成更均一的脂质颗粒。
用于产生脂质颗粒的方法
本文报道了一种用于产生包含蛋白的脂质颗粒的方法,所述方法包括下述步骤:
i)提供包含变性蛋白的第一溶液,
ii)将第一溶液加入包含脂质和洗涤剂但无蛋白,即不含所述蛋白的第二溶液,和
iii)从在步骤ii)中获得的溶液去除洗涤剂,并且由此产生脂质颗粒。
在一个实施方案中,用于产生包含载脂蛋白的脂质颗粒的方法,包括下述步骤:
i)提供包含变性载脂蛋白的第一溶液,
ii)将第一溶液加入包含脂质和洗涤剂但不含载脂蛋白的第二溶液中,和
iii)从步骤ii)获得的溶液中去除洗涤剂并由此产生脂质颗粒。
在一个实施方案中,第二溶液具有是第一溶液的体积的至少两倍的体积。
在一个实施方案中,第二溶液具有是第一溶液的体积的约3倍到约20倍的体积。在一个实施方案中,第二溶液具有是第一溶液的体积的约5倍到约10倍的体积。
在一个实施方案中,第二溶液包含至少两种不同的脂质,所述脂质彼此独立地选自磷脂、脂肪酸和类固醇脂质。在另一个实施方案中,至少两种不同的脂质是两种不同的磷脂酰胆碱。在一个实施方案中,第一磷脂酰胆碱是POPC,第二磷脂酰胆碱是DPPC。
在一个实施方案中,洗涤剂选自胆酸、两性洗涤剂或它们的盐。
已经报道了许多从天然存在或重组产生的多肽(如例如来自人HDL颗粒的载脂蛋白A-I或脱脂质(delipidated)载脂蛋白A-I)产生脂质颗粒的不同方法。其中,例如与纯化的载脂蛋白A-I一起温育磷脂(如棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)与洗涤剂(如胆酸钠)的水性混合物,其中以天然,即非变性形式使用载脂蛋白A-I。形成脂质颗粒后通过透析或渗滤去除洗涤剂。
如本文报道的方法允许在单一步骤中完全再折叠和脂质化变性蛋白。通过使用如本文报道的方法,可以获得具有提高的产品质量的脂质颗粒,可以省却预处理蛋白所需要的时间,并且用于生物药物生产的大规模加工首次成为可能。
本文报道的方法允许在单一步骤中完全再折叠和脂质化变性的载脂蛋白A-I。通过使用本文报道的方法,可以获得具有提高的产品质量的脂质颗粒,可以省去预处理载脂蛋白A-I所消耗的时间,和生物制药生产的大规模加工第一次成为可能。
对于脂质颗粒形成工艺开发必须要考虑的要点是i)需要生物活性,和ii)涉及脂质颗粒的可制造性的技术要求。例如,对于形成包含载脂蛋白的脂质颗粒,这些要求指向相反的方向。
从技术观点,将选择包含具有16个碳原子以下链的羧酸部分的饱和磷脂(例如,二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱,DPPC;二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱,DMPC等)。与此相反,从生物学数据可以认为包含具有至少16个碳原子链的羧酸部分的不饱和磷脂(例如,棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱,POPC;硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱,SOPC)是更有效的,并且对肝无毒。
磷脂组合的选择决定包含载脂蛋白的脂质颗粒的功效和肝安全性。在使用兔进行的包含DMPC的脂质颗粒的体内研究中,已经发现用30mg/kg处理的兔显示严重的副作用,但是存活下来,而用100mg/kg处理的兔则死亡。结果清楚地显示对于胆固醇的动员和因此对于分子的功效需要脂质化(图23)。
体外功能测试证实了包含单磷脂酰胆碱如DPPC或POPC的脂质颗粒激活了LCAT。
还显示对于不同磷脂的组合,胆固醇流出更高。
表2:用于体内兔研究制备的磷脂组合,不同之处在于其脂质组成
这些结果也由显示对于所有组合的胆固醇动员的体内数据所证实。然而,对于仅包含单磷脂酰胆碱DPPC,或DPPC和鞘磷脂(SM)的组合的脂质颗粒而言,可以确定肝酶的增加(图1)。
因此,通过如本文报道的方法获得的脂质颗粒也是一个方面。
从技术观点,与用纯的POPC形成比较,用纯的DPPC形成脂质颗粒更为方便。通过使用不同磷脂的组合减少沉淀形成的风险。此外,与具有4℃的相变温度的纯POPC比较,纯DPPC的41℃的相变温度也使得制备脂质颗粒更为容易。而且,获得的产物更为均一。这也可以被通过SEC-MALLS进行的脂质颗粒分析所证实,所述SEC-MALLS是允许测定蛋白-脂质组合物的分析工具(蛋白-缀合物分析)。在图2中,显示了以大小排阻色谱法(UV280检测)解析的样品的色谱图。可以通过多个分离的或半解离的峰的出现来观察样品的不均一性。
当使用纯的POPC制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的POPC分子数目在一个实施方案中是40-85,在一个实施方案中,是50-80,在一个实施方案中,是54-75。
当使用纯DPPC制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的DPPC分子数目,在一个实施方案中,是50-150,在一个实施方案中,是65-135,在一个实施方案中,是76-123,并且在一个实施方案中,是86-102。
当将摩尔比为1∶3的POPC和DPPC的混合物用于制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的磷脂分子数目,在一个实施方案中,是约50-约120,在一个实施方案中,是约65-约105,并且在一个实施方案中,是约72-约96。
当将摩尔比为1∶1的POPC和DPPC的混合物用于制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的脂质分子数目在一个实施方案中,是50-120,在一个实施方案中,是60-100,在一个实施方案中,是71到92,并且在一个实施方案中是71-85。
当将摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的混合物用于制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的脂质分子数目,在一个实施方案中,是50-105。
当将摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的混合物用于制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的脂质分子数目,在一个实施方案中,是60-95。
当将摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的混合物用于制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的脂质分子数目,在一个实施方案中,是60-90。
当将摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的混合物用于制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的脂质分子数目在一个实施方案中,是60-88。
当将摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的混合物用于制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的脂质分子数目,在一个实施方案中,是62-80。
当将摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的混合物用于制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的脂质分子数目,在一个实施方案中,是66-86。
当将摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的混合物用于制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的脂质分子数目,在一个实施方案中,是64-70。
当将摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的混合物用于制备脂质颗粒时,在脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的脂质分子数目,在一个实施方案中,是约66。
对于制备包含载脂蛋白和POPC的脂质颗粒,在一个实施方案中,应用1∶40-1∶100的载脂蛋白与POPC的摩尔比,在一个实施方案中,应用1∶40-1∶80的摩尔比,在一个实施方案中,应用约1∶60的摩尔比。
对于制备包含载脂蛋白和DPPC的脂质颗粒,在一个实施方案中,应用1∶70-1∶100的载脂蛋白与DPPC的摩尔比,在一个实施方案中,应用1∶80-1∶90的摩尔比,在一个实施方案中,应用约1∶80的摩尔比。
对于制备包含载脂蛋白、POPC和DPPC的脂质颗粒,在一个实施方案中,应用1∶60-1∶100的载脂蛋白与(POPC和DPPC)(POPC和DPPC的摩尔比1∶3)的摩尔比,在一个实施方案中,应用1∶70-1∶90的摩尔比,并且在一个实施方案中,应用约1∶80的摩尔比。
对于制备包含载脂蛋白、DPPC和POPC的脂质颗粒,在一个实施方案中,应用1∶60-1∶100的载脂蛋白与(POPC和DPPC)(POPC和DPPC的摩尔比1∶1)的摩尔比,在一个实施方案中,应用1∶60-1∶80的摩尔比,并且在一个实施方案中,应用约1∶70的摩尔比。
对于制备包含载脂蛋白、DPPC和POPC的脂质颗粒,在一个实施方案中,应用1∶60-1∶100的载脂蛋白与(POPC和DPPC)(POPC和DPPC的摩尔比3∶1)的摩尔比,在一个实施方案中,应用1∶50-1∶70的摩尔比,并且在一个实施方案中,应用约1∶60的摩尔比。
在一个实施方案中,将多肽用洗涤剂温育约0.5小时到约60小时。在一个实施方案中,将多肽用洗涤剂温育约0.5小时到约20小时。在一个实施方案中,将所述多肽用洗涤剂温育约2小时到约60小时。在一个实施方案中,将所述多肽用洗涤剂温育约12小时到约20小时。在一个实施方案中,将所述多肽用洗涤剂温育约16小时。
在一个实施方案中,如果使用脂质的混合物来制备脂质颗粒,混合物具有4℃-45℃的相变温度,在一个实施方案中,具有10℃-38℃的相变温度,并且在一个实施方案中,具有15℃-35℃的相变温度。
对于形成包含载脂蛋白的脂质颗粒,已知不同方法,如冻干、冻融、洗涤剂溶解随后透析、微射流、超声处理和匀浆化。
脂质颗粒可以包含,在一个实施方案中,平均1-10个载脂蛋白分子,在一个实施方案中,平均1-8个载脂蛋白分子/脂质颗粒,在一个实施方案中,平均1-4个载脂蛋白分子/脂质颗粒。
在一个实施方案中,脂质颗粒可以包含平均数目为至少1,或2,或3,或4,或5,或6,或7,或8,或9,或10个载脂蛋白分子/脂质颗粒。在一个实施方案中,平均数是1。
在一个实施方案中,除了载脂蛋白之外,脂质颗粒包含一种或多种其他的多肽。
不受限制地,脂质颗粒可以充当酶促辅因子和/或用于吸收脂质的脂质(尤其是胆固醇)的载体。
在如本文报道的脂质颗粒中还可以存在一种或多种洗涤剂。所述洗涤剂可以是任何药用洗涤剂,如非离子型或离子型洗涤剂。非离子洗涤剂可以是包含一个或多个羟基的有机化合物的烯化氧衍生物。在一个实施方案中,非离子洗涤剂选自乙氧基化和/或丙氧基化醇或酯化合物或其混合物。在另一种实施方案中,酯选自山梨糖醇和脂肪酸的酯,如脱水山梨糖醇单油酸酯或、脱水山梨醇单棕榈酸酯,油性蔗糖酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯固醇醚、聚氧乙烯-聚丙氧烷基醚、嵌段聚合物和cethyl醚(cethylether)、聚氧乙烯蓖麻油或氢化蓖麻油衍生物和聚甘氨酸脂肪酸酯。在一个实施方案中,非离子型洗涤剂选自 或
离子型洗涤剂可以是胆管剂。在一个实施方案中,所述离子型洗涤剂选自胆酸或脱氧胆酸,或它们的盐和衍生物,或选自游离脂肪酸,如油酸、亚油酸和其它。
在一个实施方案中,离子型洗涤剂选自阳离子脂质如C10-C24烷基胺或烷醇胺和阳离子胆固醇酯。在一个实施方案中,洗涤剂是具有高CMC的洗涤剂。在又一个实施方案中,洗涤剂是具有至少5mM CMC的洗涤剂。
在一个实施方案中,脂质颗粒包含少于0.75重量%洗涤剂。
在一个实施方案中,脂质颗粒包含少于0.30重量%洗涤剂。
在一个实施方案中,脂质颗粒包含少于0.1重量%洗涤剂。
在一个实施方案中,脂质颗粒包含少于0.05重量%洗涤剂。
在一个实施方案中,所述洗涤剂选自基于糖的洗涤剂,基于聚氧乙烯的洗涤剂,基于胆汁盐的洗涤剂,合成洗涤剂或其组合。在另一个实施方案中,洗涤剂是胆酸或两性洗涤剂。
在一个实施方案中,在根据本发明的方法中,第一溶液基本不含脂质颗粒。
在一个实施方案中,所述方法在步骤ii)之后在步骤iii)之前,包括下述步骤iia)温育在步骤ii)中获得的溶液。在一个实施方案中,将多肽用洗涤剂温育约0.5小时到约60小时。在一个实施方案中,将多肽用洗涤剂温育约0.5小时到约20小时。在一个实施方案中,将所述多肽用洗涤剂温育约2小时到约60小时。在一个实施方案中,将所述多肽用洗涤剂温育约12小时到约20小时。在一个实施方案中,将所述多肽用洗涤剂温育约16小时。
在一个实施方案中,温育和/或去除在4℃-45℃的温度进行。
在一个实施方案中,通过渗滤或透析进行去除。
在一个实施方案中,第一溶液具有第一体积,第二溶液具有第二体积,在第一溶液中的蛋白,如载脂蛋白具有限定的浓度,在第二溶液中的脂质和洗涤剂分别具有限定的浓度,其中在步骤ii)中,载脂蛋白的浓度、脂质的浓度和洗涤剂的浓度被改变/减少,允许形成脂质颗粒。通过稀释载脂蛋白溶液和添加脂质和洗涤剂,调节一方面载脂蛋白与脂质的适合比率和另一方面脂质与洗涤剂的适合比率,允许形成脂质颗粒。
在一个实施方案中,所述方法包括下述步骤:
iv)纯化脂质颗粒并由此产生脂质颗粒。
例如,为了产生包含载脂蛋白的脂质颗粒,从技术观点可以选择包含具有16个原子和更短的链的羧酸部分的饱和磷脂(例如,二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱,DPPC;二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱,DMPC等)。从生物学角度来看,与此相反,可以设想包含具有至少16个C原子的链的羧酸部分的不饱和磷脂(例如棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱,POPC;硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱,SOPC)是更有效并且是非-肝毒性的。
可以使用磷脂酰胆碱DPPC和POPC及其混合物用于形成包含载脂蛋白的脂质颗粒。这些示例性的磷脂酰胆碱在一个羧酸部分不同并具有一个相同的被酯化为磷酸甘油主链的羧酸部分。当使用DPPC时,制备脂质颗粒更为容易。相反,POPC在体外功能测定中更为有效,特别是作为激活卵磷脂胆固醇乙酰转移酶(LCAT)的底物,所述酶对于将动员的胆固醇转化为胆固醇酯是必须的。已经发现,与仅包含一种磷脂酰胆碱的脂质颗粒相比,以不同摩尔比包含两种磷脂酰胆碱,例如POPC和DPPC的混合物的脂质颗粒是有利的(见,例如图4)。
例如,脂质颗粒可以仅包含POPC。当将1∶40直至1∶80摩尔比的载脂蛋白:脂质用于产生脂质颗粒时,每个载脂蛋白单体的POPC分子数目可以在54-75之间变化。在一个实施方案中,载脂蛋白与POPC的摩尔比是1∶40-1∶80,在一个实施方案中,摩尔比是1∶50-1∶70,在一个实施方案中,摩尔比是约1∶60。
因此,对于产生包含载脂蛋白和POPC的脂质颗粒,载脂蛋白与POPC的摩尔比是从1∶40到1∶100,在一个实施方案中,摩尔比是1∶40到1∶80,并且在一个实施方案中,摩尔比是约1∶60。
例如,脂质颗粒可以仅包含DPPC。当将1∶40直至1∶80摩尔比的载脂蛋白∶脂质用于产生脂质颗粒时,每个载脂蛋白单体的DPPC分子数目可以在76-123之间变化。在一个实施方案中,载脂蛋白与DPPC的摩尔比是1∶70-1∶100,在一个实施方案中,摩尔比是1∶75-1∶90,在一个实施方案中,摩尔比是约1∶80。
例如,可以从摩尔比为1∶3的POPC和DPPC的混合物开始制备脂质颗粒。当将1∶60直至1∶100摩尔比的载脂蛋白∶脂质用于产生脂质颗粒时,每个载脂蛋白单体的磷脂分子数目可以在72-112之间变化。在一个实施方案中,载脂蛋白与(POPC和DPPC)的摩尔比是1∶70-1∶90,在一个实施方案中,摩尔比是1∶75-1∶85,在一个实施方案中,摩尔比是约1∶80。
因此,对于产生包含载脂蛋白,POPC和DPPC的脂质颗粒,载脂蛋白与(POPC和DPPC)(POPC和DPPC摩尔比为1∶3)的摩尔比在一个实施方案中,是1∶60-1∶100,在一个实施方案中,摩尔比是1∶70-1∶90,并且在一个实施方案中,摩尔比是约1∶80。
例如,可以从摩尔比为1∶1的POPC和DPPC的混合物开始制备脂质颗粒。当将1∶60直至1∶100摩尔比的载脂蛋白∶脂质用于制备脂质颗粒时,每个载脂蛋白单体的磷脂分子数目可以在71-111之间变化。在一个实施方案中,载脂蛋白与(POPC和DPPC)的摩尔比是1∶60-1∶80,在一个实施方案中,摩尔比是1∶65-1∶75,在一个实施方案中,摩尔比是约1∶70。
因此,对于产生包含载脂蛋白,DPPC和POPC的脂质颗粒,载脂蛋白与(POPC和DPPC)(POPC和DPPC摩尔比为1∶1)的摩尔比在一个实施方案中,是1∶60-1∶100,在一个实施方案中,摩尔比是1∶60-1∶80,并且在一个实施方案中,摩尔比是约1∶70。
例如,可以从摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的混合物开始制备脂质颗粒。当将1∶60直至1∶100摩尔比的载脂蛋白∶脂质用于制备脂质颗粒时,每个载脂蛋白单体的磷脂分子数目可以在46-93之间变化。在一个实施方案中,载脂蛋白与(POPC和DPPC)的摩尔比是1∶50-1∶70,在一个实施方案中,摩尔比是1∶55-1∶65,在一个实施方案中,摩尔比是约1∶60。
因此,对于产生包含载脂蛋白,DPPC和POPC的脂质颗粒,载脂蛋白与(POPC和DPPC)(其中POPC和DPPC摩尔比为3∶1)的摩尔比在一个实施方案中,是1∶60-1∶100,在一个实施方案中,摩尔比是1∶50-1∶70,并且在一个实施方案中,摩尔比是约1∶60。
在一个实施方案中,载脂蛋白作为载脂蛋白的水溶液提供并且可以在重组生产或任何其它来源的载脂蛋白生产后获自下游加工,并且可以包含不同浓度纯度不同的载脂蛋白。
基本上,脂质颗粒的形成通过将多肽与洗涤剂溶解的脂质在它们各自的转变温度一起温育来实现。通过透析去除洗涤剂导致由脂双层组成的脂质颗粒的形成。
基本上,脂质颗粒形成可以通过将四连蛋白-载脂蛋白A-I或其多聚体与洗涤剂溶解的脂质在它们各自的转变温度一起温育来实现。通过透析去除洗涤剂导致脂质颗粒的形成,所述脂质颗粒由被α-螺旋载脂蛋白围绕的脂双层组成。
脂质颗粒可以通过沉淀和/或色谱步骤的组合来进行纯化。例如,过量的洗涤剂,即不是脂质颗粒的一部分的洗涤剂可以在疏水吸附色谱步骤中去除。在一个实施方案中,纯化脂质颗粒的方法的步骤包括疏水吸附色谱步骤。在另一个实施方案中,用于疏水吸附步骤的色谱材料选自ExtractiGel D(获自Pierce Biotechnology,Rockford IL,USA),CALBIOSORBTM(获自Calbiochem,San Diego,CA,USA),SDR30HyperDTM溶剂-洗涤剂去除层析树脂(获自PALL Corporation,Ann Arbor,MI,USA)。脂质颗粒用不含洗涤剂的溶液从疏水吸附材料中回收。
在一个实施方案中,使用透析来去除具有高CMC的洗涤剂。
药物和诊断组合物:
通过如本文报道的方法获得的脂质颗粒可以用于治疗和/或诊断疾病或病症。
可以将如本文报道的四连蛋白-载脂蛋白A-I或如本文报道的脂质颗粒用于治疗和/或诊断由不正常的脂质水平或脂质在身体部分(如血管中的斑块)的沉积表征的疾病或病症。
为了确定得到的蛋白质-脂质复合物支持LCAT催化的胆固醇酯化的能力,通过快速添加胆固醇乙醇溶液来将胆固醇结合到如本文报道的脂质颗粒中。与包含独立于它们的载脂蛋白成分(如野生型载脂蛋白A-I或四连蛋白-载脂蛋白A-I)之外的DPPC的复合物相比,包含纯的POPC的脂质颗粒是更好的LCAT底物(图3)。
在包含不同的POPC和DPPC混合物的脂质颗粒中胆固醇酯化的起始速度显示与任一种纯的磷脂酰胆碱相比,混合物是更好的LCAT底物,如可以从胆固醇酯化的起始速度观察到的(见表3和图4)。
表3:在包含磷脂的不同混合物的脂质颗粒中的胆固醇酯化的起始速度
将通过将THP-1单核细胞白血病细胞暴露于佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(phorbol myristate acetate)并负载放射性标记的胆固醇示踪物获得的巨噬细胞如人THP1细胞暴露于胆固醇受体测试化合物。
可以将通过受体测试化合物诱导的流出速度计算为在上清液中的胆固醇放射性与细胞中放射性加它们上清液的放射性总和的比率并与暴露于不包含受体的介质的细胞进行比较,并通过线性拟合分析。可以使用暴露和不暴露于RXR-LXR激动剂的细胞进行平行实验,所述RXR-LXR激动剂已知主要上调ABCA-1并偏向向ABCA-1介导的运输的流出。
在未用RXR-LXR脂质颗粒预处理的细胞中,与用非脂质化四连蛋白-载脂蛋白A-I获得的流出比较,可以观察到在胆固醇流出中的更高增加。可以在测试系列中观察到脂质混合物对流出的仅少量影响(图5)。在用RXR-LXR预处理的细胞中,可以观察到在包含非脂质化的四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的胆固醇流出的可比较的增加。与用未经预处理的细胞观察到的比较,总的增加更高。在测试系列中仅观察到脂质混合物对流出的较小影响(图6)。
在兔中体内测试不同的脂质颗粒。将脂质颗粒作为静脉内输注施用,并且在施用后在96小时内进行系列血液取样。测定肝酶、胆固醇和胆固醇酯的值。对于所有包含起始分布相的测试脂质颗粒,血浆浓度是相当的,随后血浆浓度对数线性下降(图7)。如可以从表4中观察到的,对于所有测试化合物而言,药物代谢动力学参数是类似的。观察到的半衰期接近于1.5天。
表4:测定的药物代谢动力学参数
如可以从图8中观察到的,在血浆中动员和酯化胆固醇。甚至在四连蛋白-载脂蛋白A-I的浓度已经开始降低后,血浆胆固醇酯水平确实继续增加。当血浆四连蛋白-载脂蛋白A-I水平已经减少到约0.5mg/ml(约50%的正常野生型载脂蛋白A-I),仍旧可以检测到增加的胆固醇酯水平。
包含四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒不诱导兔和小鼠中的肝酶,如可以从图1和9中观察到的。此外,在静脉内施用后两小时获得的血浆样品中可以确定没有溶血(图10)。
因此,本发明的方面是药物组合物和诊断组合物,其包含如本文报道的含有载脂蛋白的脂质颗粒或包含如本文报道的四连蛋白-载脂蛋白A-I。
如在下述表5中显示,与非脂质化的载脂蛋白和其它脂质颗粒比较,如本文报道的脂质颗粒具有提高的体内性质。
表5:不同载脂蛋白和脂质颗粒的体内性质
可以通过在体内施用载脂蛋白后比较总胆固醇的相应排出(respectiveexcursion)与载体蛋白浓度来确定胆固醇动员到血液中的效率。对于定量评估,计算在总胆固醇的浓度-时间曲线下的基线校正面积(AUC)与在载脂蛋白的浓度-时间曲线下的面积的商。
如本文报道的脂质颗粒,尤其是包含SEQ ID NO:01的四连蛋白-载脂蛋白和摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的脂质颗粒,显示体内增加的胆固醇动员。
四连蛋白-载脂蛋白A-I
除了上述概括的脂质颗粒之外,本文还报道四连蛋白-载脂蛋白A-I。
四连蛋白-载脂蛋白A-I是人四连蛋白三聚化结构元件和野生型人载脂蛋白A-I的融合蛋白。人四连蛋白部分的氨基酸序列可以缩短前面9个氨基酸,从位置10的异亮氨酸残基(天然存在的截短位点)开始。作为这种截短的后果,缺失了在位置4的苏氨酸残基的O-糖基化位点。在四连蛋白三聚化结构元件和人载脂蛋白A-I之间,去除了五个氨基酸残基“SLKGS”(SEQ ID NO:03)。
为了提高的表达和纯化,产生包含N-端纯化标记物,例如六组氨酸-标记物并且包含IgA蛋白酶切割位点的构建体。作为特异性切割的结果,在纯化后两个氨基酸-丙氨酸和脯氨酸-保留在根据本发明的四连蛋白-载脂蛋白A-I的N端并且所述四连蛋白-载脂蛋白A-I具有SEQ ID NO:01的序列。
四连蛋白三聚化结构元件提供允许形成三聚化的四连蛋白-载脂蛋白A-I多聚体的结构域,所述多聚体由在每个个体四连蛋白-载脂蛋白A-I单体之间的非共价相互作用构成。
通过使用不同的生产方法,可以省去纯化-标记物和IgA蛋白酶切割位点,形成氨基酸序列为SEQ ID NO:02的四连蛋白-载脂蛋白A-I。
在一个实施方案中,载脂蛋白可以是包含保守氨基酸置换的变体或是载脂蛋白A-I模拟物。
载脂蛋白A-I可以通过酶促、通过NMR光谱学或通过使用单克隆或多克隆抗-载脂蛋白-A-I抗体来确定。因此,本文报道的其他方面是多克隆和单克隆抗体,其特异性结合如本文报道的四连蛋白-载脂蛋白A-I。可以用本领域技术人员已知的方法获得所述抗体。此外,可以用本领域技术人员已知的方法进行用于免疫测定法中的抗体的标记。
在一个实施方案中,载脂蛋白可以是包含保守氨基酸置换的变体,或是载脂蛋白A-I模拟物。在一个实施方案中,四连蛋白-载脂蛋白A-I具有SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67的氨基酸序列,其中X选自SEQ ID NO:68-SEQ ID NO:105。
因此,在一个实施方案中,四连蛋白-载脂蛋白A-I具有下述氨基酸序列IVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(SEQ ID NO:02)。
在一个实施方案中,四连蛋白-载脂蛋白A-I具有下述氨基酸序列(A,G,S,T)PIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(SEQ ID NO:66)。
在一个实施方案中,四连蛋白-载脂蛋白A-I具有下述氨基酸序列(M)HHHHHHXIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(SEQ IDNO:67),其中X可以是下述氨基酸序列的任一个:A,G, S,P,AP,GP,SP,PP,GSAP(SEQ ID NO:68),GSGP(SEQ ID NO:69),GSSP(SEQ ID NO:70),GSPP(SEQ ID NO:71),GGGS(SEQ ID NO:72),GGGGS(SEQ ID NO:73),GGGSGGGS(SEQ ID NO:74),GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:75),GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:76),GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:77),GGGSAP(SEQ ID NO:78),GGGSGP(SEQ IDNO:79),GGGSSP(SEQ IDNO:80),GGGSPP(SEQ ID NO:81),GGGGSAP(SEQ ID NO:82),GGGGSGP(SEQ ID NO:83),GGGGSSP(SEQ ID NO:84),GGGGSPP(SEQ ID NO:85),GGGSGGGSAP(SEQ ID NO:86),GGGSGGGSGP(SEQ ID NO:87),GGGSGGGSSP(SEQ ID NO:88),GGGSGGGSPP(SEQ ID NO:89),GGGSGGGSGGGSAP(SEQ ID NO:90),GGGSGGGSGGGSGP(SEQ IDNO:91),GGGSGGGSGGGSSP(SEQ ID NO:92),GGGSGGGSGGGSPP(SEQ IDNO:93),GGGGSAP(SEQ ID NO:94),GGGGSGP(SEQ ID NO:95),GGGGSSP(SEQ ID NO:96),GGGGSPP(SEQ ID NO:97),GGGGSGGGGSAP(SEQ IDNO:98),GGGGSGGGGSGP(SEQ ID NO:99),GGGGSGGGGSSP(SEQ IDNO:100),GGGGSGGGGSPP(SEQ ID NO:101),GGGGSGGGGSGGGGSAP(SEQ ID NO:102),GGGGSGGGGSGGGGSGP(SEQ ID NO:103),GGGGSGGGGSGGGGSSP(SEQ ID NO:104),和GGGGSGGGGSGGGGSPP(SEQ ID NO:105)。
如果在大肠杆菌菌株中产生异源多肽,通常用蛋白酶不能有效切割去除氨基-端甲硫氨酸残基,由此氨基端甲硫氨酸残基部分存在于产生的多肽中。
提供下述实施例,序列表和图来辅助理解本发明,在后附权利要求中提出的真实范围。要理解,可以在不背离本发明精神的前提下,对所述方法进行修饰。
序列表描述
SEQ ID NO:01 四连蛋白-载脂蛋白A-I(1).
SEQ ID NO:02 四连蛋白-载脂蛋白A-I(2).
SEQ ID NO:03 肽.
SEQ ID NO:04 载脂蛋白A-I模拟物(1).
SEQ ID NO:05 载脂蛋白A-I模拟物(2).
SEQ ID NO:06 人载脂蛋白A-I.
SEQ ID NO:07 人载脂蛋白A-II.
SEQ ID NO:08 人载脂蛋白A-IV.
SEQ ID NO:09 人载脂蛋白A-V.
SEQ ID NO:10 人载脂蛋白C-I.
SEQ ID NO:11 人载脂蛋白C-II.
SEQ ID NO:12 人载脂蛋白C-III.
SEQ ID NO:13 人载脂蛋白C-IV.
SEQ ID NO:14 人载脂蛋白D.
SEQ ID NO:15 人载脂蛋白E.
SEQ ID NO:16 人载脂蛋白F.
SEQ ID NO:17 人载脂蛋白H.
SEQ ID NO:18 人载脂蛋白L-I.
SEQ ID NO:19 人载脂蛋白L-II.
SEQ ID NO:20 人载脂蛋白L-III.
SEQ ID NO:21 人载脂蛋白L-IV.
SEQ ID NO:22 人载脂蛋白L-V.
SEQ ID NO:23 人载脂蛋白L-VI.
SEQ ID NO:24 人载脂蛋白M.
SEQ ID NO:25 人载脂蛋白O.
SEQ ID NO:26 人载脂蛋白OL.
SEQ ID NO:27 人载脂蛋白clus.
SEQ ID NO:28 载脂蛋白.
SEQ ID NO:29 载脂蛋白.
SEQ ID NO:30 载脂蛋白.
SEQ ID NO:31 载脂蛋白.
SEQ ID NO:32 载脂蛋白.
SEQ ID NO:33 载脂蛋白.
SEQ ID NO:34 载脂蛋白.
SEQ ID NO:35 载脂蛋白.
SEQ ID NO:36 载脂蛋白.
SEQ ID NO:37 载脂蛋白.
SEQ ID NO:38 载脂蛋白.
SEQ ID NO:39 载脂蛋白.
SEQ ID NO:40 载脂蛋白.
SEQ ID NO:41 载脂蛋白.
SEQ ID NO:42 载脂蛋白.
SEQ ID NO:43 载脂蛋白.
SEQ ID NO:44 载脂蛋白.
SEQ ID NO:45 载脂蛋白.
SEQ ID NO:46 载脂蛋白.
SEQ ID NO:47 载脂蛋白.
SEQ ID NO:48 载脂蛋白.
SEQ ID NO:49 载脂蛋白.
SEQ ID NO:50 载脂蛋白.
SEQ ID NO:51 载脂蛋白.
SEQ ID NO:52 载脂蛋白.
SEQ ID NO:53 人四连蛋白三聚化结构域.
SEQ ID NO:54 缩短的人四连蛋白三聚化结构域
SEQ ID NO:55 人干扰素片段.
SEQ ID NO:56 六组氨酸标记物.
SEQ ID NO:57 融合蛋白.
SEQ ID NO:58 引物N1.
SEQ ID NO:59 引物N2.
SEQ ID NO:60 IgA蛋白酶切割位点.
SEQ ID NO:61 IgA蛋白酶切割位点.
SEQ ID NO:62 IgA蛋白酶切割位点.
SEQ ID NO:63 IgA蛋白酶切割位点.
SEQ ID NO:64 IgA蛋白酶切割位点.
SEQ ID NO:65 IgA蛋白酶切割位点.
SEQ ID NO:66 四连蛋白-载脂蛋白A-I.
SEQ ID NO:67 具有his-标记物的四连蛋白-载脂蛋白A-I.
SEQ ID NO:68-105接头.
附图描述
图1用五种其脂质组成不同的脂质颗粒进行的体内兔研究的结果。上部:胆固醇动员,并且因此可以对于所有制备的批次显示功效。底部:对于通过使用DPPC作为单磷脂产生的脂质颗粒注意到肝酶的增加。
图2根据本发明的POPC和载脂蛋白的脂质颗粒的SEC-MALLS分析;摩尔比为1∶20-1∶160。
图3DPPC和POPC对LCAT活性的影响。
图4在包含POPC和/或DPPC的脂质颗粒中的胆固醇酯化的起始速度。
图5在用RXR-LXR激动剂激发的细胞中胆固醇向THP-1衍生的泡沫细胞的流出。
图6在使用RXR-LXR激动剂激活ABCA-I途径后胆固醇向THP-1衍生的泡沫细胞流出。
图7不同载脂蛋白组合物的时间依赖性血浆浓度。
图8胆固醇动员和酯化在血浆中的时间和浓度进程。
图9在单次静脉内注射100mg/kg.后在小鼠中包含本发明的载脂蛋白的不同组合物的肝酶释放的比较。
图10体内兔研究-血浆中的自发的溶血作用。
图11使用250mM Tris-HCl,140mM NaCl,pH7.5.进行的脂质颗粒的分析SEC。
图12使用50mM K2HPO4,250mM精氨酸盐酸盐,7.5%海藻糖在pH7.5进行的脂质颗粒的分析SEC。
图131∶20-1∶320摩尔比的POPC和四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的非变性PAGE(泳道1:非变性标记物;泳道2:摩尔比1∶320;泳道3:摩尔比1∶160;泳道4:摩尔比1∶80;泳道5:摩尔比1∶80(f/t);泳道6:摩尔比1∶40;泳道7:摩尔比1∶20;泳道8:载脂蛋白(形成六聚体))。
图141∶20-1∶160摩尔比的POPC和四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的SEC-MALLS分析。
图15POPC和四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的SEC色谱图(UV280信号)的叠加。
图16摩尔比为1∶40的POPC和四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的SEC-MALLS分析。
图17用1∶20-1∶100摩尔比获得的DPPC和四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的非变性PAGE(1:分子量标记物;2:不含脂质的四连蛋白-载脂蛋白A-I;3∶1∶20;4∶1∶40;5∶1∶60;6∶1∶80;7∶1∶100)。
图18在1∶60(最上的曲线)-1∶100(最低的曲线)的摩尔比获得的POPC∶DPPC=3∶1和四连蛋白-载脂蛋白A-I的混合物的脂质颗粒的SEC-MALLS分析(UV280信号)
图19使用胆酸盐、两性洗涤剂3-8,3-10和3-12进行的四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的非变性PAGE SDS。在每个凝胶上的泳道1:纯的载脂蛋白;在每个凝胶上的泳道2:0.1xCMC胆酸盐脂质化的样品作为参考。
图20使用3x CMC两性洗涤剂3-8和POPC(载脂蛋白∶磷脂摩尔比=1∶60)进行的四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的SEC-MALLS蛋白缀合物分析。
图21使用2x CMC两性洗涤剂3-10和POPC(载脂蛋白∶磷脂摩尔比=1∶60)进行的四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的SEC-MALLS蛋白缀合物分析。
图22使用POPC进行的四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的SEC-MALLS蛋白质缀合分析。上面:从天然的四连蛋白-载脂蛋白A-I形成的脂质颗粒;下面:从变性的四连蛋白-载脂蛋白A-I形成的脂质颗粒。
图23用DMPC(1∶100)(二豆蔻酰磷脂酰胆碱)脂质化的四连蛋白-载脂蛋白A-I进行的体内兔研究的结果(a)和用在PBS中未脂质化的四连蛋白-载脂蛋白A-I进行的体内兔研究(b)结果。
图24在5℃和40℃贮存的包含野生型载脂蛋白A-I(A)和如本文报道的四连蛋白-载脂蛋白A-I(B)的脂质颗粒的SE-HPLC色谱图。
材料和方法
大小排阻-HPLC:
用在ASI-100HPLC系统(Dionex,Idstein,德国)上的Tosoh Haas TSK3000SWXL柱进行色谱法。通过UV二极管阵列检测器(Dionex)在280nm监测洗脱峰。在将浓缩的样品溶解到1mg/ml后,将柱用由200mM磷酸二氢钾和250mM氯化钾pH7.0的缓冲液进行洗涤直到获得稳定的基线。在30分钟内在室温使用0.5ml/min的流速在恒溶剂成分的条件下(isocraticcondition)进行分析轮次。将色谱图与Chromeleon(Dionex,Idstein,Germany)手动整合。通过比较高分子量形式的曲线下面积(AUC)与单体峰值的AUC来确定以%表示的聚合。
动态光散射(DLS):
DLS是测量颗粒大小,典型地在亚微米大小范围内的非侵入性技术。在本发明中,将具有温度控制石英比色杯(25℃)的Zetasizer Nano S装置(Malvern Instruments,Worcestershire,UK)用于监测1nm-6μm之间的大小范围。在173°的角度检测反向散射激光的光的强度。强度在取决于颗粒扩散速度的速率波动,所述颗粒扩散速度又由颗粒大小控制。因此可以通过分析散射的光强度的波动来产生颗粒大小数据(Dahneke,B.E(ed.),Measurement of Suspended particles by Quasielectric Light Scattering(通过拟电子化光散射测量悬浮的颗粒),Wiley Inc.(1983);Pecora,R.,DynamicLight Scattering:Application of Photon Correlation Spectroscopy(光子相关光谱学的动态光散射应用),Plenum Press(1985))。使用DTS软件(Malvern)的多窄模式计算强度的大小分布。用未稀释的样品进行实验。
SEC-MALLS:
SEC-MALLS是大小排阻色谱法与三个检测器系统的组合:i)UV检测,ii)折射指数检测和iii)光散射检测。对于通过大小分离,使用来自GEHealthcare的Superose6柱10/300GL柱。所述方法用pH7.4的PBS缓冲液恒溶剂成分地进行,应用0.4ml/min的流速。系列地连接三种检测器系统。通过折射指数检测器监测完整的脂质颗粒(蛋白-脂质颗粒)信号,而在280nm测定的UV吸光度确定由蛋白部分诱导的信号。脂质级分的比例通过将蛋白UV信号从完整信号中简单扣除来获得。施加光散射允许检测各自种类的分子量,并且因此可以完整和详细的描述脂质颗粒。
洗涤剂测定
通过与蒸发光散射检测器偶联的反相色谱法(RP-ELSD)进行残余的洗涤剂的测定。使用来自Phenomenex(Aschaffenburg,Germany)的Luna C184.6x150mm,5μm,作为柱。在通过10kDa膜离心后,将90μl的流过物用于HPLC分离。在恒溶剂成分的条件下,用包含0.1%(v/v)三氟乙酸的74%(v/v)甲醇溶液在恒溶剂成分的条件下进行洗脱。将柱温设定在30℃。通过蒸发光散射检测器进行检测,应用30℃的喷雾温度,80℃的蒸发温度和1.0l/min的气流。通过在范围为0.22μg-7.5μg胆酸盐的胆酸盐情形中,建立标准曲线来进行残余的洗涤剂的量化。
蛋白测定:
通过测定在280nm的光密度(OD)来测定蛋白浓度,使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数。
重组DNA技术:
使用标准方法来操作DNA,如在Sambrook,J.,等.,Molecular cloning:A laboratory manual(分子克隆实验指南);Cold Spring Harbor LaboratoryPress(冷泉港实验室),冷泉港,New York,1989中所述。根据生产商的说明书来使用分子生物学试剂。
实施例1
制备和描述大肠杆菌表达质粒
通过重组方式制备四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽。N端到C端方向的表达融合多肽的氨基酸序列如下:
-氨基酸甲硫氨酸(M),
-具有CDLPQTHSL(SEQ ID NO:55)的氨基酸序列的干扰素序列片段,
-GS接头,
-具有HHHHHH(SEQ ID NO:56)的氨基酸序列的六组氨酸标记物
-GS接头,
-具有VVAPPAP(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的IgA蛋白酶切割位点,和
-具有SEQ ID NO:02氨基酸序列的四连蛋白-载脂蛋白A-I。
如上所述的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽是前体多肽,四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽通过使用IgA蛋白酶体外酶促切割来从所述前体多肽进行释放。
前体多肽编码融合基因通过用已知的重组方法和技术连接适合的核酸片段来装配。通过化学合成制备的核酸序列通过DNA测序证实。如下制备用于产生编码SEQ ID NO:31的融合蛋白的SEQ ID NO:01的四连蛋白-载脂蛋白A-I的表达质粒。
制备大肠杆菌表达质粒
质粒4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)是用于表达大肠杆菌中的核心-链霉抗生物素蛋白的表达质粒。其通过连接来自质粒1966(1966-pBRori-URA3-LACI-T-重复序列;在EP-B1422237中报道)的3142bp长的EcoRI/CelII-载体片段与435bp的编码EcoRI/CelII-片段的长核心-链霉抗生物素蛋白产生
核心-链霉抗生物素蛋白大肠杆菌表达质粒包括下述元件:
-用于在大肠杆菌中复制的来自载体pBR322的复制起点(对应于Sutcliffe,G.,等,Quant.Biol.43(1979)77-90所述的2517-3160bp位置),
-编码乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶的酿酒酵母的URA3基因(Rose,M.et al.Gene29(1984)113-124),其允许通过大肠杆菌pyrF突变体菌株(尿嘧啶营养缺陷型)的互补进行质粒选择,
-核心-链霉抗生物素蛋白表达盒,包括
-T5杂合启动子(根据Bujard,H.,等.Methods.Enzymol(酶学方法).155(1987)416-433和Stueber,D.,等,Immunol.Methods(免疫学方法)IV(1990)121-152所述的T5-PN25/03/04杂合启动子),包括根据Stueber,D.等所述的合成核糖体结合位点(见前文),
-核心-链霉抗生物素蛋白基因,
-两个噬菌体-来源的转录终止子,λ-T0终止子(Schwarz,E.,等,Nature272(1978)410-414)和fd-终止子(Beck E.和Zink,B.Gene1-3(1981)35-58),
-来自大肠杆菌的lacI阻遏基因(Farabaugh,P.J.,Nature274(1978)765-769)。
通过使用唯一的侧连EcoRI和CelII限制性内切酶切割位点从载体4980中切除核心-链霉抗生物素蛋白结构基因,并将EcoRII/CelII限制性位点侧邻的编码前体多肽的核酸插入3142bp长的EcoRI/CelII-4980载体片段来制备表达四连蛋白-载脂蛋白A-I前体多肽的最终表达质粒。
实施例2
表达四连蛋白-载脂蛋白A-I
为了表达融合蛋白,使用大肠杆菌宿主/载体系统,其通过大肠杆菌营养缺陷型(PyrF)的互补能够进行无抗生素的质粒选择(EP0972838和US6,291,245)。
用表达质粒p(IFN-His6-IgA-四连蛋白-载脂蛋白A-I)进行电穿孔来转化大肠杆菌K12菌株CSPZ-2(leuB,proC,trpE,th-1,ApyrF)。首先将转化的大肠杆菌细胞在37℃在琼脂平板上培养。
发酵方案1:
关于预先发酵,使用根据Sambrook等(Molecular Cloning:A laboratorymanual(分子克隆:实验室手册).冷泉港实验室出版社;第2版(1989年12月)的M9培养基,其补充了约1g/l L-亮氨酸,约1g/l L-脯氨酸和约1mg/l硫胺-HCl。
关于预先发酵,用原始接种物储藏安瓿中的2ml接种在具有挡板的1000ml锥形瓶(Erlenmeyer-flask)中的300ml M9-培养基中。在37℃,在旋转摇床上进行培养13小时,直到观察到1-3的光密度(578nm)。
对于发酵,使用根据Riesenberg等所述的分批培养基(Riesenberg,D.,等,J.Biotechnol.20(1991)17-27):27.6g/l葡萄糖*H2O,13.3g/l KH2PO4,4.0g/l(NH4)2HPO4,1.7g/l柠檬酸盐,1.2g/l MgSO4*7H2O,60mg/l柠檬酸铁(III),2.5mg/l CoCl2*6H2O,15mg/l MnCl2*4H2O,1.5mg/l CuCl2*2H2O,3mg/l H3BO3,2.5mg/l Na2MoO4*2H2O,8mg/l Zn(CH3COO)2*2H2O,8.4mg/l Titriplex III,1.3ml/l Synperonic10%消泡剂。分别给分批培养基补充5.4mg/l硫胺-HCl和1.2g/l L-亮氨酸和L-脯氨酸。进料1溶液包含700g/l葡萄糖,补充了19.7g/l MgSO4*7H2O。用于pH调节的碱溶液是分别补充了50g/l L-亮氨酸和50g/l L-脯氨酸的12.5%(w/v)NH3水溶液。所有成分溶解在去离子水中。
发酵在10l Biostat C DCU3发酵器(Sartorius,Melsungen,Germany)中进行。用6.41灭菌的发酵分批培养基加300ml来自预发酵的接种物开始,在37℃,pH6.9±0.2,500mbar和10l/min的通气速率进行分批发酵。在开始补充的葡萄糖消耗完之后,将温度调节到28℃,发酵进入补料-分批模式。此时,通过加入进料1组合恒定增加的搅拌器速度(在10小时内550rpm-1000rpm和在16小时内从1000rpm-1400rpm)和通气速率(在10小时内从10l/min-16l/min和在5小时内从16l/min-20l/min),将溶氧(pO2)的相对值保持在50%(DO-stat,见例如Shay,L.K.,等,J.Indus.Microbiol.Biotechnol.2(1987)79-85)。当培养约8小时后pH达到调节下限(6.70)时加入碱溶液,导致供应另外的氨基酸。通过在光密度70加入1mM IPTG来诱导重组治疗蛋白的表达。
在发酵结束时,在收集之前,使用加热步骤(其中在发酵器中的整个培养基被加热到50℃达1或2小时),胞质和可溶性表达的四连蛋白-载脂蛋白A-I被转到不可溶的蛋白聚集体,所谓的包含体(见,例如EP-B1486571)。随后,将发酵器的内容物用无逆流离心机(13,000rpm,13l/h)离心并将收获的生物量贮存在-20℃直到进一步加工。只在不可溶的细胞碎片级分中发现不可溶的蛋白聚集体形式(所谓的包含体(IBs))的合成的四连蛋白-载脂蛋白A-I前体蛋白。
只在不可溶的细胞碎片级分中发现不可溶的蛋白聚集体形式(所谓的包含体(IBs))的合成的融合蛋白。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从发酵器中回收的样品,一个是诱导前的样品,其它的是在诱导蛋白表达后指定的时间点的样品。从每个样品,将相同量的细胞(OD靶标=5)重新悬浮在5mL PBS缓冲液中并通过在冰上的超声处理来破坏。接着,将100μL每种悬浮液离心(15,000rpm,5分钟),并回收每个上清液,将其转移到单独的瓶中。这是为了区分可溶性和不可溶的表达靶蛋白。向每个上清液(=可溶性)级分加入300μL和每个沉淀(=不可溶)级分加入400μL的SDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature227(1970)680-685)。在摇动情况下,将样品在95℃加热15分钟以溶解和还原在样品中的所有蛋白。在冷却到室温后,将5μL每种样品转到4-20%TGX Criterion Stain Free聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)中。另外,将5μl分子量标准(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)和具有已知产物蛋白浓度(0.1μg/μl)的3种量(0.3μl,0.6μl和0.9μl)的量化标准设置在凝胶上。
在200V运行电泳60分钟,并随后将凝胶转到GelDOC EZ成像器(Bio-Rad)并用UV照射处理5分钟。使用Image Lab分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。使用三个标准,计算线性回归曲线,系数>0.99,并且使用其计算在原始样品中的靶蛋白的浓度。
发酵方案2:
关于预先发酵,使用根据Sambrook等(Molecular Cloning:A laboratorymanual(分子克隆:实验室手册).冷泉港实验室出版社;第2版(1989年12月)的M9培养基,其补充了约1g/l L-亮氨酸,约1g/l L-脯氨酸和约1mg/l硫胺-HCl。
关于预先发酵,从琼脂平板或用原始接种物储藏安瓿中的1-2ml接种在具有挡板的1000ml锥形瓶中的300ml改良M9-培养基中。在37℃,在旋转摇床上进行培养13小时,直到观察到1-3的光密度(578nm)。
对于发酵和高产率表达四连蛋白-载脂蛋白A-I,使用下述批次培养基和进料:
8.85g/l葡萄糖,63.5g/l酵母提取物,2.2g/l NH4Cl,1.94g/l L-亮氨酸,2.91g/l L-脯氨酸,0.74g/l L-甲硫氨酸,17.3g/l KH2PO4*H2O,2.02g/lMgSO4*7H2O,25.8mg/l硫胺-HCl,1.0ml/l Synperonic 10%消泡剂。进料1溶液包含333g/l酵母提取物和333g/l85%-甘油,分别补充了1.67g/l L-甲硫氨酸和5g/l L-亮氨酸和L-脯氨酸。进料2是600g/l L-脯氨酸的溶液。用于pH调节的碱性溶液是10%(w/v)KOH溶液,作为酸使用75%葡萄糖溶液。所有成分溶解在去离子水中。
发酵在10l Biostat C DCU3发酵器(Sartorius,Melsungen,Germany)中进行。用5.15l灭菌的发酵分批培养基加300ml来自预发酵的接种物开始,在25℃,pH6.7±0.2,300mbar和10 l/min的通气速率进行分批发酵。在开始补充的葡萄糖消耗完之前,培养物达到15的光密度(578nm),并且发酵进入进料-批次模式,此时进料1以70g/h开始。在培养物中监测葡萄糖浓度,将进料1增加到最大150g/h,同时避免葡萄糖累积并保持pH接近调节上限6.9。在50的光密度(578nm),进料2以10ml/h的恒定进料速率开始。通过平行增加搅拌器速度(500rpm-1500rpm),通气速率(10l/min-20l/min)和压力(300mbar-500mbar)保持溶氧(pO2)的相对值在50%以上。通过在90的光密度加入1mM IPTG来诱导重组治疗蛋白的表达。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从发酵器中回收的七个样品,一个是诱导前的样品,其它的是在诱导蛋白表达后指定的时间点的样品。从每个样品,将相同量的细胞(OD靶标=5)重新悬浮在5mL PBS缓冲液中并通过在冰上的超声处理来破坏。接着,将100μL每种悬浮液离心(15,000rpm,5分钟),并回收每个上清液,将其转移到单独的瓶中。这是为了区分可溶性和不可溶的表达靶蛋白。向每个上清液(=可溶性)级分加入300μL和每个沉淀(=不可溶)级分加入200μL的SDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature227(1970)680-685)。在摇动情况下,将样品在95℃加热15分钟以溶解和还原在样品中的所有蛋白。在冷却到室温后,将5μL每种样品转到10%Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(Novagen)中。另外,将5μl分子量标准(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)和具有已知产物蛋白浓度(0.1μg/μl)的3种量(0.3μl,0.6μl和0.9μl)的量化标准设置在凝胶上。
将电泳在200V运行35分钟,接着用考马斯亮蓝R染料对凝胶进行染色,用加热的水退色并将其转到光密度计上进行数字化(GS710,Bio-Rad)。使用Quantity One1-D分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。使用三个标准,计算线性回归曲线,系数>0.98,并且使用其计算在原始样品中的靶蛋白的浓度。
在发酵结束时,在收集之前,使用加热步骤(其中在发酵器中的整个培养基被加热到50℃达1或2小时),胞质和可溶性表达的四连蛋白-载脂蛋白A-I被转到不可溶的蛋白聚集体,所谓的包含体(见,例如EP-B1486571)。加热步骤后,只在不可溶的细胞碎片级分中发现IBs形式的合成的四连蛋白-载脂蛋白A-I前体蛋白。
将发酵器的内容物冷却到4-8℃,用无逆流离心机(13,000rpm,13l/h)离心,并将收获的生物量贮存在-20℃直到进一步加工。取决于表达的构建体,总的收获的生物量产率范围在39g/l和90g/l干物质。
实施例3
制备四连蛋白-载脂蛋白A-I
通过在磷酸钾缓冲溶液或Tris缓冲溶液(0.1M,补充1mM MgSO4,pH6.5)中再悬浮收集的细菌细胞进行包含体制备。在加入DNAse后,通过在900bar的压力匀浆来破坏细胞。将包含1.5M NaCl和60mM EDTA的缓冲溶液加入匀浆的细胞混悬液。在用25%(w/v)HCl将pH值调节到5.0后,在进一步离心步骤后获得最终的包含体浆液。将浆液贮存在-20℃,单次使用的灭菌的塑料袋中直到进一步加工。
将包含体浆液(约15kg)溶解在盐酸胍溶液(150 l,6.7M)中。在通过深度过滤澄清加溶物后,将溶液加入Zn-螯合的亲和性色谱材料中。通过Zn-螯合色谱材料纯化融合多肽并通过IgA蛋白酶切割。随后,用阴离子交换色谱法和阳离子交换色谱法步骤进一步纯化多肽。这些步骤在包含尿素的溶液(7M),即在变性条件下进行。将这些步骤用于去除多肽片段、内毒素和其他的杂质。进行包含6.7M盐酸胍的溶液中的渗滤。获得的最终溶液包含变性的四连蛋白-载脂蛋白A-I。
实施例4
四连蛋白-载脂蛋白A-I的再折叠和脂质化
a)一般方法
将纯的结晶POPC或DPPC(Lipoid,Switzerland)溶解在水性缓冲液(脂质化缓冲液)中,所述缓冲液以1∶1.35摩尔比磷脂∶胆酸盐包含胆酸盐。将所述混合物在氮气气氛下温育并且在室温(POPC)或在55℃(DPPC)避光,直到获得澄清溶液。将澄清的脂质-胆酸盐溶液冷却到4℃(POPC)或贮存在41℃(DPPC)。在限定的载脂蛋白∶磷脂比率,在4℃(POPC)或41℃(DPPC)加入纯化的四连蛋白-载脂蛋白A-I。对于脂质颗粒形成,在氮气气氛下在4℃(POPC)或41℃(DPPC)并且避光将反应混合物温育过夜。最终,通过针对脂质化缓冲液的大量透析(4℃/41℃)来去除胆酸盐。最终,离心样品来去除沉淀的材料。
如上制备包含纯的POPC或纯的DPPC的胆酸盐溶解的脂质溶液。通过在需要的比率组合脂质溶液来制备脂质混合物随后在各自Tm(Tm=相变温度)贮存。如对于纯的脂质溶液所述进行,但是在选择的脂质混合物的各自Tm进行四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒形成。
已经测试了下述脂质化缓冲液:
1.在pH7.5,用250mM盐酸精氨酸,7.5%蔗糖补充的50mM磷酸钾缓冲液
2.在pH7.5,用250mM盐酸精氨酸,7.5%蔗糖,10mM甲硫氨酸补充的50mM磷酸氢二钾缓冲液
3.在pH7.5,用140mM NaCl,10mM甲硫氨酸补充的250mM tris-羟基氨基甲烷(TRIS)
4.在pH7.5,用250mM盐酸精氨酸、7%海藻糖,10mM甲硫氨酸补充的50mM磷酸氢二钾缓冲液。
通过分析SEC评估从四连蛋白-载脂蛋白A-I样品形成的脂质颗粒的均匀性(图11和12)。总之,与磷脂的选择相比,脂质缓冲液的选择仅具有微小的作用。DPPC-脂质颗粒作为一个主峰洗脱,而且POPC-脂质颗粒显示两个峰值模式。脂质化缓冲液的选择受到载脂蛋白的纯化过程以及稳定的无脂质的载脂蛋白的供应的影响。显示能够与脂质化缓冲液无关地形成脂质颗粒。在各种测试的缓冲液中,最适合的脂质化缓冲液鉴定为250mM Tris、140mM NaCl,10mM甲硫氨酸,pH7.5。
脂质化混合物分别包含限定量的载脂蛋白,并且相应计算磷脂,例如POPC的量。脂质的摩尔量的计算都基于四连蛋白-载脂蛋白A-I单体。
b)POPC和胆酸盐
表6:使用纯的POPC用四连蛋白-载脂蛋白A-I作为实例形成脂质颗粒。计算蛋白单体的载脂蛋白∶磷脂的摩尔比。对照:不加入脂质(纯的Apo)温育载脂蛋白和不加入载脂蛋白(无Apo)温育脂质。
*在离心后澄清
在整个过程中,从1∶40-1∶160的摩尔比保持澄清。没有观察到通过过量磷脂的浑浊也没有观察到蛋白沉淀。
通过非变性PAGE分析脂质颗粒样品(见图13)。用样品1∶80(泳道4)发现最均一的条带模式。此外,1x冻/融(-80℃)也没有改变样品的外观(泳道5)。样品1∶320和1∶160的条带模式显示不均匀的产物,导致多个条带(泳道2和3)。样品1∶40以及此外1∶20具有在主产物条带以下的另外的条带(泳道6和7)。纯的四连蛋白-载脂蛋白A-I的迁移模式在图13的泳道8中显不。
SEC-MALLS分析用于获得关于脂质颗粒和它们的载脂蛋白-磷脂组成的均一性的更详细的信息(蛋白-缀合物分析)。图14显示SEC分辨的样品的色谱图(UV280检测)。在这里,将1∶160样品分为三个单独的峰。1∶80样品显示包含至少两个不同大小的种类,如作为双峰所显示的。从样品1∶20获得的峰值显示最均匀的产物。
在5的步骤中,使用四连蛋白-载脂蛋白A-I(3.84mg/ml;10mg/样品)进行实验,并且载脂蛋白∶磷脂摩尔比从1∶40增加到1∶80。在低于1∶40的摩尔比,脂质颗粒形成是不完全的。通过实验排除了在大于1∶80的摩尔比,在通过透析去除胆酸盐之后,样品变得浑浊。而且,在更高的脂质比率,脂质颗粒变得更加的不均匀。
表7:使用纯的POPC的四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒形成。基于四连蛋白-载脂蛋白A-I单体计算载脂蛋白∶磷脂的摩尔比。
*在透析前和透析后的体积2.6ml
**在所述方法的SD内
在-3℃的转变温度温育过程中,所有的样品保持视觉上的澄清。在通过透析去除胆酸盐后,观察到样品1∶40-1∶65的增加的浊度。可以通过离心去除沉淀并且随后样品保持澄清。
SEC-MALLS分析用于获得关于形成的脂质颗粒和它们的载脂蛋白-磷脂组成的均一性的详细信息(蛋白-缀合物分析)。在分析大小排阻色谱法上所有的脂质颗粒是可比地均一(SEC;图15),显示小的后峰值,这在更低的摩尔比是更为显著的。此外,在峰值模式上存在更高的摩尔比向更高分子量的显著的移动。在表8中提供各自保留时间。
表8:大小排阻色谱法结果的总结:通过曲线下面积(AUC)的积分计算百分比
蛋白-缀合物分析(在表8中总结)能够计算从SEC柱上洗脱的每种脂质颗粒的蛋白(MW蛋白)以及脂质成分(MW脂质)的总分子量。基于四连蛋白-载脂蛋白A-I单体(32.7kDa)和POPC(760Da)的分子量,可以计算脂质颗粒的组成(n蛋白和n POPC)。对应于每个脂质颗粒的四连蛋白-载脂蛋白A-I三聚体,在所有摩尔比的脂质颗粒主峰中发现的载脂蛋白成分的分子量是约100kDa。n(POPC)/n(蛋白单体)的比率提供在脂质颗粒中每个四连蛋白-载脂蛋白A-I单体的POPC分子的数目。尽管应用了从1∶40直至1∶80的摩尔比,每个四连蛋白-载脂蛋白A-I单体的POPC分子的数目在54和75之间变化。%蛋白值是脂质化程度的参数。蛋白在脂质颗粒中的百分比越低,脂质化程度越高。
表9:如在图16中显示的,POPC和四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的蛋白缀合物分析总结。
c)DPPC和胆酸盐
在脂质化之前,用pH7.5的50mM KH2PO4,250mM精氨酸盐酸盐,7%海藻糖,10mM甲硫氨酸透析四连蛋白-载脂蛋白A-I。在5的步骤中,使用1∶60-1∶100的摩尔比(脂质浓度增加)对四连蛋白-载脂蛋白A-I(3.84mg/ml,3mg/样品)进行脂质化。脂质化缓冲液是250mM Tris-HCl,140mMNaCl,10mM甲硫氨酸,pH7.5.
表10:载脂蛋白与DPPC的脂质颗粒的样品综述
*对于蛋白单体计算的
在脂质颗粒形成过程中,没有观察到蛋白沉淀或通过过量脂质的浑浊。在最终产物中的四连蛋白-载脂蛋白A-I的产率越高,用于脂质化的DPPC越多。
在非变性PAGE上在1∶20样品中发现残余的无脂质的载脂蛋白(泳道3,图17)。在非变性PAGE上,1∶40和1∶60样品看上去最均匀(泳道4和5),而1∶80和1∶100样品在主要的脂质颗粒条带上还包含另外的更高的分子条带(泳道6和7)。
SEC-MALLS蛋白缀合物分析用于表征在DPPC脂质颗粒形成之后获得的脂质颗粒的组成(MW DPPC:734Da)。在1∶80和以下的摩尔比获得均匀的SEC峰。在更高的脂质比率,出现前-峰(见,例如在表11中的1∶90的样品)。
表11:DPPC和四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的SEC-MALLS蛋白缀合物分析总结
用1∶80-1∶90摩尔比发现脂质化的最高程度(蛋白的最低百分比)。此外,DLS揭示在1∶80-1∶90(>98%)的比率的最为均匀的颗粒形成,颗粒大小为14-17nm。
d)75%DPPC/25%POPC
如在本实施例a)-c)项中报道的相应地进行脂质颗粒形成,使用下述参数:
蛋白:四连蛋白-载脂蛋白A-I在3.84mg/ml,3mg/样品
脂质化缓冲液:250mM Tris-HCl,140mM NaCl,10mM甲硫氨酸pH7.5
脂质化:在34℃
透析:在4℃
测试的摩尔比: 在5的步骤中,1∶60-1∶100,具有增加的脂质
脂质颗粒形成简单易行,并且与用纯的脂质进行的方法相当。在所述方法和透析过程中,所有的样品保持澄清。对于所有测试的比率(~85%),脂质颗粒的产率是类似的。SEC-MALLS分析显示1∶80的摩尔比导致具有90.9%主峰,无前峰和9.1%后峰的最均匀的脂质颗粒。蛋白缀合物分析显示在所有样品的主要种类中,1个四连蛋白-载脂蛋白A-I三聚体/脂质颗粒的存在(见图18和表12和13)。
表12:SEC结果的总结;通过AUC积分计算百分比
表13:75%DPPC/25%POPC和四连蛋白-载脂蛋白A-I脂质颗粒的蛋白-缀合物分析总结.
e)50%DPPC/50%POPC
如在本实施例a)-c)项中报道的相应地进行脂质颗粒形成,使用下述参数:
蛋白:四连蛋白-载脂蛋白A-I在3.84mg/ml,3mg/样品
脂质化缓冲液:250mM Tris-HCl,140mM NaCl,10mM甲硫氨酸pH7.5
脂质化:在27℃
透析:在室温
测试的摩尔比:在5的步骤中,1∶60-1∶100,具有增加的脂质
所有的样品在所述方法和透析过程中保持澄清。对于所有测试的比率,脂质颗粒的产率是类似的。
表14:SEC结果的总结;通过AUC的积分计算百分比。
使用50%DPPC和50%POPC的脂质混合物来用于四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒形成,在1∶70的摩尔比获得最均匀的产物(见表14)。产物关于主峰是89.9%纯的,并且包含一个单一的四连蛋白-载脂蛋白A-I三聚体(见表15)。
表15:具有50%DPPC/50%POPC和四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的蛋白缀合物分析总结
f)25%DPPC/75%POPC
如在本实施例a)-c)项中报道的相应地进行脂质颗粒形成,使用下述参数:
蛋白:四连蛋白-载脂蛋白A-I在3.84mg/ml,3mg/样品
脂质化缓冲液:250mM Tris-HCl,140mM NaCl,10mM甲硫氨酸pH7.5
脂质化:在18℃
透析:在室温
测试的摩尔比:在5的步骤中,1∶60-1∶100,具有增加的脂质
脂质颗粒形成简单易行,并且与使用纯的脂质的方法相当。在所述方法和透析过程中,所有样品保持澄清。
表16:SEC结果的总结;通过AUC的积分计算百分比。
使用25%DPPC和75%POPC的脂质混合物来形成四连蛋白-载脂蛋白A-I,在1∶60的摩尔比获得最均匀的产物(见表17)。产物关于主峰是90.2%纯的,并且包含一个单一的四连蛋白-载脂蛋白A-I三聚体(见表15)。
表17:25%DPPC/75%POPC和四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的蛋白缀合物总结。
g)使用两性洗涤剂形成脂质颗粒
如在本实施例的a)-c)项报道(使用具有下述参数)相应地进行脂质颗粒的形成,除了用合成洗涤剂两性洗涤剂取代胆酸盐:
蛋白:四连蛋白-载脂蛋白A-I,在23.5mg/ml
缓冲液:50mM Tris-HCl,7.2M盐酸胍,10mM甲硫氨酸,pH8
脂质化缓冲液:250mM Tris-HCl,140mM NaCl,pH7.5
100%POPC,载脂蛋白∶磷脂摩尔比=1∶60
表18:脂质颗粒形成的各种方法和观察/参数的样品综述
在非变性PAGE上分析包含四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒。无脂质的四连蛋白-载脂蛋白A-I在140kDa迁移(在图19中泳道1),而脂质颗粒显示向232kDa和440kDa之间的更高分子量的特征性移动。
在所有用各自洗涤剂的仅0.1x CMC制备的样品中检测无脂质的四连蛋白-载脂蛋白A-I,但是没有检测到脂质颗粒(图19,泳道2,8,13,和19)。然而,0.5x CMC浓度的洗涤剂足以使两性洗涤剂3-8和3-10能够使四连蛋白-载脂蛋白A-I形成脂质颗粒(泳道3,9,和14)。使用两性洗涤剂3-12,没有发生脂质颗粒形成,直到达到2.0x CMC的浓度(泳道21)。
图20显示使用3x CMC两性洗涤剂3-8和POPC(载脂蛋白∶磷脂摩尔比=1∶60)的包含四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的SEC-MALLS色谱图。蛋白-缀合物分析的结果总结在表18中。脂质颗粒级分由两种不同的种类组成,如在SEC色谱图中在两个重叠的峰中显示的。然而,这两个种类非常相似,不同之处主要在每个颗粒的四连蛋白-载脂蛋白A-I分子的数目(对于峰1为4.2和对于峰2为3.5)。
表19:在两性洗涤剂3-8存在时形成的脂质颗粒的蛋白-缀合物分析的总结。
图21显示SEC-MALLS分析的色谱图和表19使用2x CMC两性洗涤剂3-10和POPC(载脂蛋白∶磷脂摩尔比=1∶60)的包含四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的蛋白-缀合物分析的总结。两个峰包含分别含有3.5和5个四连蛋白-载脂蛋白A-I分子的脂质颗粒。
表20:在存在两性洗涤剂3-10时形成的脂质颗粒的蛋白-缀合物分析总结。
使用两性洗涤剂3-12和POPC(载脂蛋白∶磷脂摩尔比=1∶60)的包含四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒形成的结果总结在表21中。脂质颗粒级分由两种不同的种类组成,如在SEC色谱图中在两个重叠的峰中显示的。然而,这两个种类非常相似,不同之处主要在每个颗粒的四连蛋白-载脂蛋白A-I分子的数目。
表21:在存在两性洗涤剂3-12时形成的脂质颗粒的蛋白-缀合物分析总结。
使用胆酸盐和POPC(载脂蛋白∶磷脂摩尔比=1∶60)的包含四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒形成的结果总结在表21中。脂质颗粒级分由两种不同的种类组成,如在SEC色谱图中在两个重叠的峰中显示的。然而,这两个种类非常相似,不同之处主要在每个颗粒的四连蛋白-载脂蛋白A-I分子的数目。
表22:在存在胆酸盐时形成的脂质颗粒的蛋白-缀合物分析的总结
实施例5
用于再折叠和脂质颗粒形成的迅速稀释方法
a)POPC和胆酸钠
将四连蛋白-载脂蛋白A-I在大肠杆菌中表达并且根据实施例1-3纯化(方法1)。纯化后,将缓冲液通过渗滤改变为pH7.4的包含250mM Tris,140mM NaCl,6.7M盐酸胍的溶液。将蛋白浓度调节到28mg/ml。
通过在室温将100摩尔/l POPC溶解在包含250mM Tris-HCl,140mMNaCl,135mM胆酸钠的pH7.4的缓冲液中来制备脂质贮存溶液。将脂质贮存溶液在室温温育2小时。通过将77ml脂质贮存混合物稀释到1478ml的250mM Tris-HCl,140mM NaCl,pH7.4中来制备再折叠缓冲液。将该缓冲液在室温,搅拌另外7小时。
再折叠和脂质颗粒形成通过将在250mM Tris,140mM NaCl,6.7M盐酸胍,pH7.4中的162ml四连蛋白-载脂蛋白A-I加入再折叠缓冲液来起始。这导致盐酸胍的1∶10稀释液。将溶液在室温温育16小时,同时持续搅拌。通过渗滤进行洗涤剂的去除。
表23:通过用POPC快速稀释获得的脂质颗粒的蛋白缀合物分析的总结
将四连蛋白-载脂蛋白A-I在大肠杆菌中表达并且根据实施例1-3纯化(方法2)。纯化后,将缓冲液通过渗滤改变为pH7.4的包含50mM Tris,10mM L-甲硫氨酸,6.7M盐酸胍的溶液。将蛋白浓度调节到20.4mg/ml。
通过在室温将100摩尔/l磷脂(POPC∶DPPC比率为3∶1)溶解在包含250mM Tris-HCl,140mM NaCl,10mM L-甲硫氨酸,135mM胆酸钠的pH7.4的缓冲液中来制备脂质贮存溶液。通过将3.7ml脂质贮存溶液稀释到35.6ml的250mM Tris-HCl,140mM NaCl,pH7.4中来制备再折叠缓冲液。将该缓冲液在室温,搅拌另外2小时。
再折叠和脂质颗粒形成通过将在50mM Tris,10mM L-甲硫氨酸,6.7M盐酸胍,pH8.0中的9.8ml四连蛋白-载脂蛋白A-I加入再折叠缓冲液来起始。这导致盐酸胍的1∶5稀释液。将溶液在室温温育过夜,同时持续搅拌。通过渗滤进行洗涤剂的去除。
表24:通过用POPC/DPPC/胆酸盐混合物快速稀释获得的脂质颗粒的蛋白缀合物分析总结。
b)POPC和DPPC和胆酸钠
将四连蛋白-载脂蛋白A-I在大肠杆菌中表达并且根据实施例1-3纯化。纯化后,将缓冲液通过渗滤改变为pH7.4的包含250mM Tris,140mMNaCl,6.7M盐酸胍的溶液。将蛋白浓度调节到30mg/ml。
制备两种单独的脂质贮存溶液。通过在室温将100摩尔/l POPC溶解在包含250mM Tris-HCl,140mM NaCl,135mM胆酸钠的pH7.4的缓冲液中来制备溶液A。在41℃,通过将100moles/l DPPC溶解在250mM Tris-HCl,140mM NaCl,135mM胆酸钠pH7.4中来制备溶液B。将脂质贮存溶液A和B以3∶1的比率混合并且在室温温育2小时。通过将384ml脂质贮存溶液稀释到6365ml的250mM Tris-HCl,140mM NaCl,pH7.4中来制备再折叠缓冲液。将该缓冲液在室温,搅拌另外24小时。
再折叠和脂质颗粒形成通过将在250mM Tris,140mM NaCl,6.7M盐酸胍,pH7.4中的750ml四连蛋白-载脂蛋白A-I加入再折叠缓冲液来起始。这导致盐酸胍的1∶10稀释液。将溶液在室温温育至少12小时,同时持续搅拌。通过渗滤进行洗涤剂的去除。
表25:通过用POPC∶DPPC=1∶1快速稀释获得的脂质颗粒的蛋白缀合物分析总结
c)不同的盐酸胍浓度
将根据本发明的四连蛋白-载脂蛋白A-I在大肠杆菌中表达并且从包含体通过金属螯合物亲和性色谱法进行纯化(见实施例1-3)。纯化后,将缓冲液通过渗滤改变为pH7.4的包含250mM Tris,140mM NaCl,6.7M盐酸胍的溶液。将蛋白浓度调节到28mg/ml。
通过在室温将100摩尔/l POPC溶解在包含250mM Tris-HCl,140mMNaCl,135mM胆酸钠的pH7.4的缓冲液中来制备脂质贮存溶液。将脂质贮存溶液在室温温育2小时。通过将脂质贮存溶液稀释到250mM Tris-HCl,140mM NaCl,pH7.4中来制备再折叠缓冲液。将该缓冲液在室温,搅拌另外12小时。将不同量的四连蛋白-载脂蛋白A-I稀释到再折叠缓冲液中:1∶5,1∶7.5,1∶10,1∶12.5。这导致盐酸胍在再折叠缓冲液中的不同残余浓度。所述溶液允许在室温搅拌o/n以起始再折叠和脂质颗粒形成。通过透析去除洗涤剂。
表26:通过用不同稀释比率快速稀释获得的脂质颗粒的蛋白缀合物分析总结。
d)存在尿素时的POPC和胆酸钠
将四连蛋白-载脂蛋白A-I在大肠杆菌中表达并且根据实施例1-3纯化。纯化后,将缓冲液通过渗滤改变为pH7.4的包含250mM Tris,140mMNaCl,6.7M尿素的溶液。将蛋白浓度调节到28mg/ml。
通过在室温将100摩尔/l POPC溶解在包含250mM Tris-HCl,140mMNaCl,135mM胆酸钠的pH7.4的缓冲液中来制备脂质贮存溶液。将脂质贮存溶液在室温温育2小时。通过将77ml脂质贮存混合物稀释到1478ml的250mM Tris-HCl,140mM NaCl,pH7.4中来制备再折叠缓冲液。将该缓冲液在室温,搅拌另外7小时。
再折叠和脂质颗粒形成通过将在250mM Tris,140mM NaCl,6.7M尿素,pH7.4中的162ml四连蛋白-载脂蛋白A-I加入再折叠缓冲液来起始。这导致尿素的1∶10稀释液。将溶液在室温温育16小时,同时持续搅拌。通过渗滤进行洗涤剂的去除。
e)POPC和胆酸钠和野生型载脂蛋白A-I
在另一种示例性第二方法中,将在6.7M盐酸胍,50mM Tris,10mM甲硫氨酸,pH8.0中的人载脂蛋白A-I(野生型载脂蛋白A-I)稀释1∶5(v/v)到脂质化缓冲液中,得到0.6mg/ml的蛋白浓度。所述脂质化缓冲液由7mM胆酸盐,4mM POPC和1.3mM DPPC组成,对应的脂质∶蛋白比率为240∶1。将SEC-MALLS用于分析复合物形成。在由约200脂质分子组成的复合物中发现约两个载脂蛋白分子。
表27:蛋白缀合物分析总结
实施例6
从变性或天然蛋白开始的脂质颗粒形成
如在实施例4中报道的方法(第一方法)需要天然载脂蛋白用于脂质颗粒形成,而在实施例5中报道的方法(第二方法)用充分变性的载脂蛋白开始进行脂质颗粒形成。
在示例性的第一方法中,将在6.7M盐酸胍,50mM Tris,10mM甲硫氨酸,pH8.0中的变性四连蛋白-载脂蛋白A-I使用由250mM Tris,140mMNaCl,10mM甲硫氨酸组成的pH7.5的缓冲液进行广泛透析,蛋白浓度为3.46mg/ml。接着,加入POPC和胆酸盐的混合物以在溶液中产生6mMPOPC和8mM胆酸盐的最终浓度。这对应于60分子POPC/四连蛋白-载脂蛋白A-I单体的比率(60∶1)。随后,通过渗滤去除洗涤剂。通过SEC-MALLS分析形成的蛋白-脂质复合物。使用这种方法,形成不均匀的产物,其中形成的种类中有约60%包括超过三种的四连蛋白-载脂蛋白A-I单体。
在示例性的第二方法中,将在6.7M盐酸胍,50mM Tris,10mM甲硫氨酸,pH8.0中的变性的四连蛋白-载脂蛋白A-I直接稀释1∶10(v/v)到脂质化缓冲液中,得到2.5mg/ml的蛋白浓度。所述脂质化缓冲液由6mM胆酸盐和4.5mM POPC组成,对应的脂质与蛋白比率是60∶1。使用这种方法,形成均匀的产物,包括超过90%的单一形成种类,其中每四连蛋白-载脂蛋白A-I分子结合60分子的脂质(见图22)。
表28:蛋白缀合物分析总结
实施例7
用胆酸盐-和两性洗涤剂-溶解的POPC/DPPC对胰岛素-F进行的脂质化
选择用于脂质颗粒形成的蛋白是商购的胰岛素(InsulinLispro,Lilly)。该蛋白的分子量是5808Da。为了增加胰岛素在脂质颗粒中的检测极限,将蛋白用NHS-荧光素(6-[荧光素-5(6)-羧基氨基]已酸N-羟基琥珀酰亚胺酯,Sigma Aldrich#46940-5MG-F)标记。
使用POPC和DPPC的1∶1混合物如在实施例4中报道进行两性洗涤剂-和胆酸盐介导的NHS-荧光素-标记的胰岛素(胰岛素-F)的脂质化。将0.5mM脂质混合物溶解于在PBS pH7.4中的1x CMC胆酸盐,2x CMC两性洗涤剂3-8或5x CMC两性洗涤剂3-10中。脂质的溶解在超声波浴中在45℃1小时来实现。将胰岛素-F加入溶解的脂质中,蛋白∶脂质的摩尔比为1∶2(两性洗涤剂3-8)或1∶1.2(两性洗涤剂3-10和胆酸盐)。在室温,将脂质化混合物温育1小时,随后使用PBS pH7.4进行广泛透析以去除洗涤剂。
使用荧光检测(494nm ext.,521nm em.)和UV280吸收将形成的脂质颗粒和对照样品在SE-HPLC上进行分析。在SE-HPLC上对每种脂质化方法分析三种不同的样品:溶解在PBS中的胰岛素-F,在PBS中不含胰岛素F的脂质体和包含胰岛素-F的脂质颗粒。非脂质化的胰岛素-F在约40min的洗脱时间从柱上洗脱,并且通过荧光和UV280检测来检测峰。脂质化的胰岛素F-样品以两个单独的峰从柱上洗脱,所述峰通过荧光和UV280检测。迟峰(峰的最大值在约40min)与胰岛素-F对照样品共同迁移。在15min洗脱时间的早峰比纯的胰岛素-F具有更高的分子量,并且由脂质化的胰岛素-F组成。不含脂质颗粒的蛋白在15min的洗脱时间洗脱。
实施例8
载脂蛋白的应用
a)DPPC和POPC对LCAT活性的影响
检查包含棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和重组野生型载脂蛋白A-I或四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒支持通过LCAT进行胆固醇酯化的能力。
氚化的胆固醇(4%;相对于基于摩尔的磷脂酰胆碱含量)通过加入胆固醇乙醇溶液来结合在脂质颗粒中。在存在在125μl(10mM Tris,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM NaN3;pH7.4;2mg/ml HuFAF白蛋白;4mMβ-巯基乙醇)中的0.2μg/ml重组LCAT酶(ROAR生物化学)时,在37℃进行1小时测试得到的蛋白-脂质复合物支持LCAT催化的胆固醇酯化的能力。通过加入氯仿∶甲醇(2∶1)来终止反应并提取脂质。在通过TLC分离胆固醇-胆固醇酯并闪烁计数后计算“百分比”酯化。因为少于20%的示踪物被结合到形成的酯中,在反应条件下反应速率能够认为是恒定的。使用XLfit软件(IDBS),数据拟合于米-曼方程(Michaelis Mentenequation)。对于这些结果的显示,见图3。
b)DPPC/POPC混合物对LCAT活性的影响
通过将重组野生型载脂蛋白A-I与3H胆固醇、DPPC/POPC混合物和胆酸盐以1∶4∶80∶113摩尔比混合后,使用胆酸盐作为洗涤剂来制备脂质颗粒。DPPC/POPC混合物包含任一100%POPC;75%POPC;50%POPC;25%POPC。
在通过透析去除胆酸盐后,测试得到的蛋白-脂质复合物支持LCAT催化的胆固醇酯化的能力。通过加入胆固醇乙醇溶液将3H胆固醇(4%;相对于基于摩尔的磷脂酰胆碱含量)结合在脂质颗粒中。在存在在125μl(10mM Tris,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM NaN3;pH7.4;2mg/ml HuFAF白蛋白;4mMβ-巯基乙醇)中的0.2μg/ml重组LCAT酶(ROAR生物化学)时,在37℃进行1小时测试得到的蛋白-脂质复合物支持LCAT催化的胆固醇酯化的能力。通过加入氯仿∶甲醇(2∶1)来终止反应并提取脂质。在通过TLC分离胆固醇-胆固醇酯并闪烁计数后计算“百分比”酯化。因为少于20%的示踪物被结合到酯中,在反应条件下反应速率能够认为是恒定的。使用XLfit软件(IDBS),数据拟合于米-曼方程并显示在图4中。
表3a:表观动力学参数
c)胆固醇向THP-1衍生的泡沫细胞的流出
通过将THP-1单核细胞白血病细胞暴露于佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(phorbol myristate acetate)获得巨噬细胞如人THP-1细胞。随后,通过将细胞在存在包含3H胆固醇示踪物的乙酰化的LDL时进一步培养来负载。接着,将这些模型泡沫细胞暴露于胆固醇受体4h-8h测试化合物(见下)。
收获细胞培养物上清液并将细胞在5%NP40中切割。将流出分数计算为在上清液中的胆固醇放射性相对于在细胞加上清液中的放射性的总和的比率。扣除暴露于不包含受体的介质的细胞的流出并且通过线性拟合计算流出速度。使用从细胞中的流出,相对于作为参考的10μg/ml野生型载脂蛋白A-I来对流出速度进行标准化(相对流出速度)。将在两个单独的实验中获得的相对流出速度作图为胆固醇受体浓度的函数并将数据拟合于米-曼方程。
使用暴露于RXR-LXR激动剂的细胞进行平行实验,所述RXR-LXR激动剂已知上调ABCA-1转运蛋白,并使胆固醇运输偏向ABCA-1介导的流出。
在测试系列中仅观察到脂质混合物的微小影响(图5和表29)。
表29:不同的样品.
RXR-LXR预处理泡沫细胞强烈增加向非脂质化物质的流出,与未处理的细胞相比,最大速度增加6倍。对脂质颗粒的影响则小得多,具有2倍增加,反映了ABCA-1转运蛋白向胆固醇流出的较小贡献(图6)。
d)体内研究
研究了5种脂质颗粒变体:
i)仅POPC
ii)仅DPPC
iii)POPC∶DPPC 3∶1
iV)POPC∶DPPC 1∶1
V)DPPC∶SM 9∶1
在80mg/kg,在0.5h内对兔进行静脉内输注(n=3只兔/测试化合物),随后在输注后96h内进行系列血液取样。
用ELISA分析载脂蛋白水平:
-药物水平
-关于肝酶、胆固醇、胆固醇酯的血浆值的数据。
对于所有测试组合物,血浆浓度是非常相似的,显示极不明显的起始“分布”相,随后是浓度的对数线性下降(图7,表3)。
表3:药物代谢动力学数据.
对于所有测试化合物,测定的药物代谢动力学(PK)参数是相似的。此外,还发现了低个体内可变性。测定的半衰期接近于1.5天,即与野生型载脂蛋白A-I相比增加。分布的体积与血浆体积相似(在兔中,大约40ml/kg)。
f)胆固醇动员
在血浆中动员和酯化胆固醇。甚至在四连蛋白-载脂蛋白A-I已经开始减少后,血浆胆固醇酯水平的确继续增加。当血浆四连蛋白-载脂蛋白A-I水平已经减少到0.5mg/ml(约正常野生型载脂蛋白A-I的约50%),仍旧可检测到增加的胆固醇酯水平(图8)。
g)肝酶释放
包含含有POPC的四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒不诱导肝酶释放(图1)。类似于兔,单一静脉内注射根据本发明的包含POPC或POPC/DPPC混合物的四连蛋白-载脂蛋白A-I在小鼠中是安全的。包含摩尔比为1∶3的DPPC∶POPC的载脂蛋白组合物与单独的POPC是相当的(图9)。
没有观察到明显的溶血作用,直到在五个制备物的任一种中输注后2小时。通过光电比色测定溶血作用为在静脉内施用四连蛋白-载脂蛋白A-I后2小时获得的血浆样品中的红色。将100%的全血溶血作用(通过0.44%Triton X-100-最终浓度产生)用于校准(图10)。
h)四连蛋白-载脂蛋白A-I对人脐静脉内皮细胞的抗炎作用
将5-10代HUVECs(人脐静脉内皮细胞)在各个四连蛋白-载脂蛋白A-I制备物中温育16小时,并用TNFα刺激最后4小时。通过FACS,用特异性抗体检测VCAM1表面表达。
实施例9
脂质颗粒稳定性
将包含N-端组氨酸-标记和IgA蛋白酶切割位点的野生型载脂蛋白A-I在大肠杆菌中表达并通过柱色谱法纯化,如在上述实施例中所报道的。通过IgA蛋白酶切割去除组氨酸-标记。使用1∶150比率的蛋白与Lipoid S100大豆磷脂混合物装配脂质颗粒(HDL颗粒)。将所述颗粒贮存在包含5mM磷酸钠和1%蔗糖,pH值为7.3的缓冲液中。SE-HPLC揭示在脂质化后温育和温育10天后三个独立的峰。在40℃温育后,可以检测到在10.8分钟保留时间的主要的峰(47%的总蛋白),这在贮存于5℃的样品中不存在。10.8分钟的峰显示由于蛋白不稳定,形成可溶性大分子量装配体。
从POPC∶DPPC混合物(POPC与DPPC比率为3∶1)起始获得的如本文报道的包含四连蛋白-载脂蛋白A-I的HDL颗粒也在5℃和40℃温育。在升温的温育导致轻微程度的前锋形成,但是没有显著的向在10.8分钟的高分子量装配体的移动(在11分钟<2%增加)。这说明,与包含野生型载脂蛋白A-I的颗粒相比,提高的HDL颗粒稳定性。
实施例10
胆固醇动员
在体内施用载脂蛋白后,通过比较总胆固醇的各次排出与载脂蛋白浓度能够测定胆固醇动员到血液中的效率。关于定量评估,计算总胆固醇的基线校正的在浓度-时间曲线下面积(AUC)与载脂蛋白的在浓度-时间曲线下的面积的商。
在本实验中,分析下述物质:
-将包含N-端组氨酸-标记和IgA蛋白酶切割位点的野生型载脂蛋白A-I在大肠杆菌中表达并通过柱色谱法纯化,如在上述实施例中所报道的;通过IgA蛋白酶切割去除组氨酸-标记;使用1∶150比率的蛋白与Lipoid S100大豆磷脂混合物装配脂质颗粒(HDL颗粒);
-载脂蛋白A-I Milano变体:使用1∶40比率的蛋白与POPC装配脂质颗粒(HDL颗粒),
-如本文报道的四连蛋白-载脂蛋白A-I;使用1∶60比率的蛋白与(POPC和DPPC)(POPC和DPPC比率为3∶1)装配脂质颗粒(HDL颗粒)。
将三种HDL颗粒施加于大鼠。见关于各AUC比率获得的值显示在表30中。
表30:胆固醇动员
Claims (15)
1.用于产生脂质颗粒的方法,所述方法包括下述步骤:
i)提供包含变性蛋白的第一溶液,
ii)将所述第一溶液加入包含至少一种脂质和洗涤剂但不含所述蛋白的第二溶液中,和
iii)从在步骤ii)中获得的溶液中去除所述洗涤剂并且由此产生脂质颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述第二溶液具有所述第一溶液体积的约3倍到约20倍的体积。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于所述第一溶液不含脂质。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于所述蛋白具有选自SEQ ID NO:01,02,04-52,66或67的氨基酸序列的氨基酸序列,或包含至少一种包含SEQ ID NO:01,02,04-52,66或67的氨基酸序列的至少80%的连续片段。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于所述蛋白是具有SEQ IDNO:01或SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67的氨基酸序列的四连蛋白-载脂蛋白A-I。
6.根据前述权利要求任一项的方法,其特征在于所述至少一种脂质是两种不同的磷脂酰胆碱。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于第一磷脂酰胆碱是POPC,并且第二磷脂酰胆碱是DPPC。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于所述洗涤剂选自胆酸、两性洗涤剂或它们的盐。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于所述方法在步骤ii)之后和步骤iii)之前包括下述步骤:
iia)温育在步骤ii)中获得的溶液。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于所述温育和/或去除在4℃-45℃的温度进行。
11.根据权利要求9和10中任一项所述的方法,其特征在于所述温育进行约2小时到约60小时。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于所述洗涤剂是具有高CMC的洗涤剂。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于所述去除通过渗滤或透析或吸附进行。
14.通过权利要求1-13中任一项所述的方法获得的脂质颗粒。
15.药物组合物,所述药物组合物包含权利要求14所述的脂质颗粒。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP10008995.2 | 2010-08-30 | ||
EP10008995 | 2010-08-30 | ||
PCT/EP2011/064600 WO2012028524A2 (en) | 2010-08-30 | 2011-08-25 | Method for producing a lipid particle, the lipid particle itself and its use |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103068368A true CN103068368A (zh) | 2013-04-24 |
Family
ID=44532851
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2011800386711A Pending CN103068368A (zh) | 2010-08-30 | 2011-08-25 | 产生四连蛋白-载脂蛋白a-i脂质颗粒的方法,脂质颗粒本身及其应用 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2611419A2 (zh) |
JP (1) | JP2013544488A (zh) |
KR (1) | KR20130047749A (zh) |
CN (1) | CN103068368A (zh) |
BR (1) | BR112013004397A2 (zh) |
CA (1) | CA2807433A1 (zh) |
MX (1) | MX2013001541A (zh) |
RU (1) | RU2013111678A (zh) |
WO (1) | WO2012028524A2 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103408669A (zh) * | 2013-08-01 | 2013-11-27 | 江苏泰康生物医药有限公司 | Glp-1类似物融合蛋白,及其制备方法和用途 |
CN112546201A (zh) * | 2019-09-26 | 2021-03-26 | 中国科学院生物物理研究所 | 人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体在治疗和/或预防糖尿病中的应用 |
CN116396358A (zh) * | 2023-06-08 | 2023-07-07 | 时夕(广州)生物科技有限公司 | 一种骨靶向纳米脂质颗粒的制备及应用 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150044718A1 (en) | 2012-02-29 | 2015-02-12 | Hoffmann-La Roche Inc. | On-column enzymatic cleavage |
DE202019003092U1 (de) * | 2019-07-24 | 2020-01-17 | Ruth-Maria Korth | Test zur Bestimmung von Proteophospholipiden und FIDA-Formeln zur Bestimmung von Schutzfaktoren , die mit Substraten auszugleichen sind |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004007549A1 (en) * | 2002-07-15 | 2004-01-22 | Bayer Healthcare Ag | Process for the purification of interleukin-4 and its muteins |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4608347A (en) * | 1982-04-15 | 1986-08-26 | Bernstam Victor A | Compositions, uses and methods creating reverse micelles for the clarification of biological fluids to obtain undistorted assay of analytes following clarification |
SE500941C2 (sv) | 1989-08-16 | 1994-10-03 | Algy Persson | Förfarande och apparat för snittning av ett preparat |
US5500366A (en) * | 1990-09-18 | 1996-03-19 | Biotech Australia Pty. Ltd. | Polynucleotide encoding T-cell epitopes of the protein TraT |
US5652339A (en) * | 1993-12-31 | 1997-07-29 | Rotkreuzstiftung Zentrallaboratorium | Method of producing reconstituted lipoproteins |
US6037323A (en) | 1997-09-29 | 2000-03-14 | Jean-Louis Dasseux | Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders |
US6287590B1 (en) | 1997-10-02 | 2001-09-11 | Esperion Therapeutics, Inc. | Peptide/lipid complex formation by co-lyophilization |
US6291245B1 (en) | 1998-07-15 | 2001-09-18 | Roche Diagnostics Gmbh | Host-vector system |
EP0972838B1 (en) | 1998-07-15 | 2004-09-15 | Roche Diagnostics GmbH | Escherichia coli host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy |
EP1276754A4 (en) | 2000-04-14 | 2005-04-06 | Nuvelo Inc | MATERIALS AND METHODS RELATING TO LIPID METABOLISM |
CN1268641C (zh) * | 2000-11-10 | 2006-08-09 | 普罗蒂奥制药公司 | 载脂蛋白类似物 |
CA2443365C (en) | 2002-11-19 | 2010-01-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for the recombinant production of antifusogenic peptides |
PE20050438A1 (es) | 2003-10-20 | 2005-06-14 | Esperion Therapeutics Inc | Formulas farmaceuticas, metodos y regimenes de dosificacion para el tratamiento y la prevencion de sindromes coronarios agudos |
AU2004312067A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-21 | Wyeth | Formulations of hydrophobic proteins in an immunogenic composition having improved tolerability |
WO2005084642A1 (en) | 2004-01-28 | 2005-09-15 | Biodelivery Sciences International, Inc. | Apoprotein cochleate compositions |
WO2006069371A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Baylor College Of Medicine | A method of plasma lipidation to prevent, inhibit and/or reverse atherosclerosis |
US20060275356A1 (en) | 2005-05-25 | 2006-12-07 | Burgess James W | Pharmaceutical compositions for treating or preventing coronary artery disease |
CA2653840A1 (en) | 2006-06-01 | 2007-12-06 | Institut De Cardiologie De Montreal | Use of a peptide/phospholipid complex acting as a reverse lipid transport agonist for treatment of valvular stenosis |
FR2915490B1 (fr) * | 2007-04-26 | 2011-10-28 | Univ Joseph Fourier Grenoble I | Formation de proteoliposomes contenant des proteines membranaires a l'aide d'un systeme de synthese proteique acellulaire |
EP2195337A1 (en) * | 2007-10-08 | 2010-06-16 | Anaphore, Inc. | Trimeric il-1ra |
US8999320B2 (en) * | 2008-01-30 | 2015-04-07 | The Rockefeller University | Nanoscale bound bilayers, methods of use and production |
DK2288336T3 (en) | 2008-04-25 | 2017-03-13 | Univ Northwestern | NANOSTRUCTURES SUITABLE FOR COMPLEXATION OF CHOLESTEROL |
-
2011
- 2011-08-25 CN CN2011800386711A patent/CN103068368A/zh active Pending
- 2011-08-25 RU RU2013111678/15A patent/RU2013111678A/ru not_active Application Discontinuation
- 2011-08-25 KR KR1020137005032A patent/KR20130047749A/ko not_active Application Discontinuation
- 2011-08-25 WO PCT/EP2011/064600 patent/WO2012028524A2/en active Application Filing
- 2011-08-25 EP EP11749404.7A patent/EP2611419A2/en not_active Withdrawn
- 2011-08-25 CA CA2807433A patent/CA2807433A1/en not_active Abandoned
- 2011-08-25 MX MX2013001541A patent/MX2013001541A/es unknown
- 2011-08-25 BR BR112013004397A patent/BR112013004397A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-08-25 JP JP2013526413A patent/JP2013544488A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004007549A1 (en) * | 2002-07-15 | 2004-01-22 | Bayer Healthcare Ag | Process for the purification of interleukin-4 and its muteins |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ANA JONAS,ET AL.: "Structural and functional properties of reconstituted high density lipoprotein discs prepared with six apolipoprotein A-l variants", 《JOURNAL OF LIPID RESEARCH》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103408669A (zh) * | 2013-08-01 | 2013-11-27 | 江苏泰康生物医药有限公司 | Glp-1类似物融合蛋白,及其制备方法和用途 |
CN103408669B (zh) * | 2013-08-01 | 2016-01-20 | 江苏泰康生物医药有限公司 | Glp-1类似物融合蛋白,及其制备方法和用途 |
CN112546201A (zh) * | 2019-09-26 | 2021-03-26 | 中国科学院生物物理研究所 | 人工脂蛋白颗粒apoA-Ⅳ脂肪体在治疗和/或预防糖尿病中的应用 |
CN116396358A (zh) * | 2023-06-08 | 2023-07-07 | 时夕(广州)生物科技有限公司 | 一种骨靶向纳米脂质颗粒的制备及应用 |
CN116396358B (zh) * | 2023-06-08 | 2023-08-29 | 时夕(广州)生物科技有限公司 | 一种骨靶向纳米脂质颗粒的制备及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2013111678A (ru) | 2014-10-10 |
WO2012028524A2 (en) | 2012-03-08 |
WO2012028524A3 (en) | 2012-11-15 |
EP2611419A2 (en) | 2013-07-10 |
JP2013544488A (ja) | 2013-12-19 |
MX2013001541A (es) | 2013-03-18 |
KR20130047749A (ko) | 2013-05-08 |
CA2807433A1 (en) | 2012-03-08 |
BR112013004397A2 (pt) | 2017-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20150250725A1 (en) | Method for producing a lipid particle, the lipid particle itself and its use | |
KR101631363B1 (ko) | 테트라넥틴 아포지방단백질 a-i, 이를 함유하는 지질 입자 및 이의 용도 | |
US11376309B2 (en) | Lipoprotein complexes and manufacturing and uses thereof | |
Wright et al. | Crystal structure of human GM2-activator protein with a novel β-cup topology | |
FI113052B (fi) | Menetelmä rekonstituoidun lipoproteiinin valmistamiseksi | |
CN103068368A (zh) | 产生四连蛋白-载脂蛋白a-i脂质颗粒的方法,脂质颗粒本身及其应用 | |
WO2010009065A9 (en) | Organic compounds | |
CN103068369A (zh) | 产生四连蛋白-载脂蛋白a-i颗粒的方法,由此获得的脂质颗粒及其应用 | |
JP6207507B2 (ja) | 短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインa−i融合タンパク質、それを含む脂質粒子、及びその使用 | |
TW201311719A (zh) | 縮短之四聯蛋白(tetranectin)-脂蛋白元a-i融合蛋白、含其之脂肪顆粒及其用途 | |
AU2015271986B2 (en) | Lipoprotein complexes and manufacturing and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1181663 Country of ref document: HK |
|
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130424 |
|
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1181663 Country of ref document: HK |