TW201311719A - 縮短之四聯蛋白（ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）－脂蛋白元ａ－ｉ融合蛋白、含其之脂肪顆粒及其用途 - Google Patents

Abstract

本文中報導縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白及包含該縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之脂肪顆粒以及其用途。

Description

縮短之四聯蛋白(TETRANECTIN)-脂蛋白元A-I融合蛋白、含其之脂肪顆粒及其用途

本發明係屬於脂蛋白及脂肪顆粒之領域。本文中報導縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白、包含此縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白及兩種不同磷脂醯膽鹼之脂肪顆粒，以及融合蛋白及脂肪顆粒之用途。

血漿脂蛋白係在血液中進行脂肪轉運及代謝之可溶性蛋白質-脂肪複合物。若干重要類別之脂蛋白係基於其密度、大小、化學組成及功能來區分。其中，或者表示為高密度脂肪顆粒之高密度脂蛋白(HDL)顆粒係由若干亞類構成，該等亞類之平均分子量不同，自180 kDa變化至360 kDa。其平均脂肪及蛋白質含量係每一者之50重量%。磷脂醯膽鹼(PC)佔總脂肪之38%，接著係膽固醇酯及少量之其他極性及非極性脂肪(包括游離膽固醇)。主要蛋白質組份係脂蛋白元A-I(Apo A-I)，佔人類HDL中總蛋白質重量之約60%。

HDL顆粒及其主要多肽脂蛋白元A-I參與逆向膽固醇轉運(RCT)。其中脂蛋白元A-I增加膽固醇自細胞、例如自血管壁之細胞之流出、脂肪之結合及卵磷脂-膽固醇-乙醯基-轉移酶之激活且從而藉由肝經由原生質流所達成之膽固醇消除。此係涉及細胞膜蛋白ATP結合盒轉運體A-I(ABCA-I)之主動轉運過程。

脂蛋白元A-I及基於脂蛋白元之治療法(例如重構HDL顆 粒)已在上一世紀之70年代後期及80年代早期得到鑒定。對於含有脂蛋白元A-I-Milano之脂肪顆粒，可顯示臨床證據(意味動脈硬化患者中斑顯著減少)。根據脂蛋白元A-I分子之天然存在之突變體設計脂蛋白元A-I-Milano(野生型脂蛋白元A-I之二聚體形式)。藉由用允許形成二硫鍵之半胱胺酸交換胺基酸殘基173(精胺酸)使能夠形成二聚體。

在WO 2009/131704中，報導適於隔絕膽固醇及其他分子之奈米結構，包含含有無機材料之核。在WO 2006/125304中，報導用於治療或預防冠狀動脈疾病之醫藥組合物。編碼與脂肪代謝及心血管疾病相關之脂蛋白元之組合物係報導於US 2002/0142953中。在WO 2005/084642中，報導缺輔基蛋白-螺旋形組合物。在WO 2009/036460中，報導經修飾人類脂蛋白元A-I多肽及其用途。二聚體及/或寡聚體形式之人類脂蛋白元A-I蛋白質突變蛋白之植物製造係報導於WO 2008/017906中。在WO 2007/137400中，報導用於治療心瓣狹窄之方法及化合物。在WO 2006/100567中，報導帶電脂蛋白複合物及其用途。

在US 2002/0156007中，報導脂蛋白元類似物。四聯蛋白三聚多肽係報導於US 2010/0028995中。在J.Cardiovas.Pharmacol.(51(2008)170-177)中，Graversen,J.H.等人報導脂蛋白元A-I之三聚阻止血漿澄清且保持抗動脈粥樣硬化性質。高密度脂蛋白投與-用於治療心血管疾病之新的治療方式係由Sirtori,C.R.等人報導。(Curr.Med.Chem.Immunol.Endocrine Metabol.Agents 5(2005)321-333)。

在WO 03/097696中，報導用於治療局部缺血性再灌注之方法及組合物。奈米級結合雙層、使用及製造方法係報導於WO 2009/097587中。在WO 2007/098122中，報導用於治療黃斑變性及相關眼病狀之方法。脂蛋白元類似物係報導於WO 02/38609中。在WO 2005/041866中，報導醫藥調配物。報導用於治療及預防冠狀動脈症候群之方法及投藥方案。基因療法、供應脂蛋白元A-I激動劑之方法及其用於治療血脂異常病症之用途係報導於WO 99/16409中。在WO 2008/106660中，報導分離之磷脂-蛋白質顆粒。採用脂蛋白元(APO A-I)模擬肽/磷脂複合物來預防及治療舒張期功能障礙之方法係報導於WO 2010/083611中。在WO 2008/156873中，報導APO A-I肽模擬物。囊封之HDL模擬肽係報導於WO 2008/094905中。在WO 98/56906中，報導三聚模組。

本文報導具有經改良製造性質、尤其較少形成表現副產物之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白。

已發現，以胺基酸殘基脯胺酸(P)作為第一編碼之胺基酸殘基起始之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白在粗大腸桿菌(E.coli)培養上清液中之分率係90%或更多，其中有效去除N端甲硫胺酸殘基。

本文所報導之一態樣係包含SEQ ID NO：01之胺基酸序列或其變體作為N端胺基酸序列之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白，該變體具有至少70%序列一致性， 其中SEQ ID NO：01具有胺基酸序列PIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ，且變體具有N端胺基酸殘基PIVN。

本文所報導之一態樣係包含本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白的脂肪顆粒。

在一實施例中，脂肪顆粒包含本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白及一或多種選自以下之脂肪：磷脂、溶血磷脂、半乳糖腦苷脂、神經節苷脂、腦苷脂、甘油酯、脂肪酸、三甘油酯、類固醇脂肪、膽固醇、膽固醇酯或其類似物或衍生物。

在一實施例中，脂肪顆粒包含a)本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白，b)磷脂醯膽鹼，及c)另一脂肪。

在一實施例中，另一脂肪係第二磷脂醯膽鹼。

在一實施例中，脂肪顆粒係由本文所報導之縮短之四聯 蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白、兩種不同磷脂醯膽鹼及清潔劑組成。

在一實施例中，磷脂醯膽鹼及第二磷脂醯膽鹼之不同在於一或兩個酯化為磷脂醯膽鹼之磷酸甘油主鏈之羧酸部分或羧酸部分衍生物。

在一實施例中，磷脂醯膽鹼係POPC且第二磷脂醯膽鹼係DPPC。

在一實施例中，脂肪顆粒中POPC與DPPC之莫耳比係99：1至1：99。在一實施例中，脂肪顆粒中POPC與DPPC之莫耳比係99：1至10：90。在一實施例中，脂肪顆粒中POPC與DPPC之莫耳比係99：1至25：75。

在一實施例中，本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白與POPC及DPPC非共價相關。

在一實施例中，本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白係包含三個單體之多聚體。

在一實施例中，脂肪顆粒包含小於0.75重量%清潔劑。在一實施例中，清潔劑係基於糖之清潔劑，或基於聚環氧烷烴之清潔劑，或基於之膽鹽清潔劑，或合成清潔劑或其組合。在一實施例中，清潔劑係膽酸。

在一實施例中，脂肪顆粒能夠結合至選自由以下組成之群之受體：內皮因子維生素B12受體(cubilin)、清道夫受體(Scavenger receptor)B類1型(SR-BI)、ATP結合盒1(ABCA-1)、卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶(LCAT)、膽固醇基酯轉移蛋白質(CETP)或磷脂轉移蛋白質(PLTP)。

在一實施例中，本發明之脂肪顆粒之特徵在於在脂肪顆粒中每個脂蛋白元單體之磷脂分子數量係40至120。在一實施例中，在脂肪顆粒中每個脂蛋白元單體之磷脂分子數量係50至90。

在一實施例中，縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白係以重組方式製造。

本文所報導之一態樣係包含本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒的醫藥組合物。

本文所報導之一態樣係用作藥劑的本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒。

本文所報導之一態樣係本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒用於製造藥劑之用途。

本文所報導之一態樣係本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒用於製造如下藥劑之用途- 用於急性冠狀動脈症候群患者之二級預防，或- 用於預防或治療動脈粥樣硬化，其中包含足以在個體中誘導逆向膽固醇轉運及/或斑安定之量的本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒，或- 用於誘導逆向膽固醇轉運及/或斑安定，或 - 用於清除/溶解/穩定個體之血管中之動脈粥樣硬化斑或用於將膽固醇自個體之動脈壁重新分配至肝，或- 用於預防或治療個體之心瓣狹窄，或- 用於增加個體中HDL顆粒之數量，或- 用於起始個體之逆向膽固醇轉運，或- 用於去除內毒素，或- 用於預防敗血性休克- 用於治療心絞痛，或- 用於治療心肌梗塞，或- 用於治療不穩定性心絞痛，或- 用於治療動脈狹窄，例如外周動脈疾病(PAD)、頸動脈狹窄、腦動脈狹窄或冠狀動脈狹窄，或- 用於治療血管性癡呆，或- 用於治療暫時性黑矇。

本文所報導之一態樣係本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒用於製造藥劑之用途。

本文所報導之一態樣係用於製造如下之藥劑之方法- 用於急性冠狀動脈症候群患者之二級預防，或- 用於預防或治療動脈粥樣硬化，其中包含足以在個體中誘導逆向膽固醇轉運及/或斑安定之量的本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒，或- 用於誘導逆向膽固醇轉運及/或斑安定，或 - 用於清除/溶解/穩定個體之血管中之動脈粥樣硬化斑或用於將膽固醇自個體之動脈壁重新分配至肝，或- 用於預防或治療個體之心瓣狹窄，或- 用於增加個體中HDL顆粒之數量，或- 用於起始個體之逆向膽固醇轉運，或- 用於去除內毒素，或- 用於預防敗血性休克- 用於治療心絞痛，或- 用於治療心肌梗塞，或- 用於治療不穩定性心絞痛，或- 用於治療動脈狹窄，例如外周動脈疾病(PAD)、頸動脈狹窄、腦動脈狹窄或冠狀動脈狹窄，或- 用於治療血管性癡呆，或- 用於治療暫時性黑矇。

本文所報導之一態樣係用於以下之方法- 急性冠狀動脈症候群患者之二級預防，或- 預防或治療動脈粥樣硬化，其中包含足以在個體中誘導逆向膽固醇轉運及/或斑安定之量的本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒，或- 用於誘導逆向膽固醇轉運及/或斑安定，或- 用於清除/溶解/穩定個體之血管中之動脈粥樣硬化斑或用於將膽固醇自個體之動脈壁重新分配至肝，或- 用於預防或治療個體之心瓣狹窄，或 - 用於增加個體中HDL顆粒之數量，或- 用於起始個體之逆向膽固醇轉運，或- 用於去除內毒素，或- 用於預防敗血性休克- 用於治療心絞痛，或- 用於治療心肌梗塞，或- 用於治療不穩定性心絞痛，或- 用於治療動脈狹窄，例如外周動脈疾病(PAD)、頸動脈狹窄、腦動脈狹窄或冠狀動脈狹窄，或- 用於治療血管性癡呆，或- 用於治療暫時性黑矇。

本文所報導之一態樣係用於治療以下疾病之本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒- 急性冠狀動脈症候群，或- 動脈粥樣硬化，或- 個體之血管中之動脈粥樣硬化斑，或- 個體之心瓣狹窄，或- 敗血性休克，或- 心絞痛，或- 心肌梗塞，或- 不穩定性心絞痛，或- 動脈狹窄，或- 外周動脈疾病(PAD)，或 - 頸動脈狹窄，或- 腦動脈狹窄，或- 冠狀動脈狹窄，或- 血管性癡呆，或- 暫時性黑矇。

本文所報導之一態樣係用於以下之本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒- 誘導逆向膽固醇轉運，或- 誘導斑安定，或- 清除或溶解或穩定動脈粥樣硬化斑，或- 將膽固醇自動脈壁重新分配至肝，或- 增加HDL顆粒之數量，或- 去除內毒素。

本文所報導之一態樣係治療患有以下疾病之個體之方法：急性冠狀動脈症候群，或動脈粥樣硬化，或動血管中之脈粥樣硬化斑，或心瓣狹窄，或敗血性休克，或心絞痛，或心肌梗塞，或不穩定性心絞痛，或動脈狹窄，或外周動脈疾病(PAD)，或頸動脈狹窄，或腦動脈狹窄，或冠狀動脈狹窄，或血管性癡呆，或暫時性黑矇，該方法包含向該個體投與有效量之本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒。

本文所報導之一態樣係用於以下之方法：誘導逆向膽固醇轉運，或誘導斑安定，或清除或溶解或穩定動脈粥樣硬化斑，或將膽固醇自動脈壁重新分配至肝，或增加之數量 HDL顆粒，或去除個體中之內毒素，該方法包含向該個體投與有效量之本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒，以誘導逆向膽固醇轉運，或誘導斑安定，或清除或溶解或穩定動脈粥樣硬化斑，或將膽固醇自動脈壁重新分配至肝，或增加HDL顆粒之數量，或去除內毒素。

在一實施例中，非正常脂肪含量係在體液中。在一實施例中，體液係全血或血清。

在一實施例中，非正常脂肪含量係升高之膽固醇含量。

在一實施例中，含有脂肪之沈積物係血管中之斑。

在一實施例中，該疾病係心血管疾病。

本文所報導之一態樣係治療特徵為非正常脂肪含量或身體組份內含有脂肪之沈積物之疾病或病狀的方法，其包含i)向需要治療或人工系統之個體投與治療有效量之本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒，及ii)視情況監測個體之脂肪含量或含有脂肪之沈積物之變化。

本文所報導之一態樣係用於患者急性冠狀動脈症候群之二級預防之方法，其包含向需要其之個體投與本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒。

本文所報導之一態樣係診斷組合物，其包含本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之 脂肪顆粒，其中標記脂蛋白元或脂肪顆粒，以允許檢測樣品或個體內之融合蛋白或脂肪顆粒。

本文所報導之一態樣係本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒用於診斷之用途。

本文所報導之一態樣係本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒之用途，其用於預防或治療患有以存在非正常脂肪含量或含有脂肪之沈積物為特徵之疾病或病狀的個體。

本文所報導之一態樣係編碼本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之核酸。

本文所報導之一態樣係包含本文所報導之核酸之細胞。

在一實施例中，細胞係選自大腸桿菌菌株，例如CSPZ-2、K12菌株294(ATCC 31446)、B、X 1776(ATCC 31537)、W3110(ATCC 273325)、BL21、RM_82、SCS_110、G、XL-1_F-、SE_13009、LA_5709、C 600、CSH_1、TG_1、UT400及UT5600。

本文所報導之一態樣係多聚體，其包含三種本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白作為單體，其中該等單體並非彼此共價結合。

定義

術語「脂蛋白元」表示脂肪或脂蛋白顆粒中所分別包含之蛋白質。

術語「脂蛋白元A-I」表示具有蛋白質-脂肪及蛋白質-蛋白質相互作用性質之兩親性螺旋多肽。脂蛋白元A-I係由肝及小腸合成為具有267個胺基酸殘基之初前脂蛋白元，該初前脂蛋白元係作為前脂蛋白元分泌，其裂解成具有243個胺基酸殘基之成熟多肽。脂蛋白元A-I係由6個至8個由22個胺基酸殘基組成且由通常為脯胺酸之連接體部分隔開之不同胺基酸重複組成，且在一些情形中係由若干個殘基構成之段組成。實例性人類脂蛋白元A-I胺基酸序列係報導於GenPept數據庫條目NM-000039或數據庫條目X00566；GenBank NP-000030.1(gi 4557321)中。關於人類脂蛋白元A-I(SEQ ID NO：02)，存在天然存在之變體，例如P27H、P27R、P28R、R34L、G50R、L84R、D113E、A-A119D、D127N、K131之缺失、K131M、W132R、E133K、R151C(胺基酸殘基151自Arg變成Cys，脂蛋白元A-I-Paris)、E160K、E163G、P167R、L168R、E171V、P189R、R197C(胺基酸殘基173自Arg變成Cys，脂蛋白元A-I-Milano)及E222K。亦包括具有保守胺基酸修飾之變體。

術語「心血管疾病」通常表示關於心臟或血管之疾病或病狀，例如動脈硬化、冠狀動脈心臟疾病、腦血管疾病、腹動脈疾病、局部缺血性心臟疾病或外周血管疾病。此一疾病可能不會在由該疾病所致之諸如以下等不良事件之前發現：心肌梗塞、中風、心絞痛、暫時性局部缺血發作、鬱血性心臟衰竭、主動脈瘤，大部分導致個體死亡。

術語「膽酸鹽「表示3α,7α,12α-三羥基-5β-膽烷-24-酸或其鹽，尤其鈉鹽。

可互換使用之術語「臨界微胞濃度」及其縮寫「CMC」表示表面活性劑或清潔劑之濃度，高於該濃度時個別清潔劑分子(單體)自發聚集成微胞(微胞、圓桿、層狀積垢等)。

術語「保守胺基酸修飾」表示胺基酸序列之修飾，其影響或改變本發明之脂肪顆粒或脂蛋白元之特性。修飾可藉由業內已知標準技術來引入，例如定點誘變及PCR介導之誘變。保守胺基酸修飾包括用具有類似側鏈之胺基酸殘基替代胺基酸殘基者。具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族已在業內經定義。該等家族包括具有以下側鏈之胺基酸：鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β-具支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，本文「變體」蛋白質係指胺基酸序列與「母體」蛋白質的胺基酸序列不同之分子，差異高達10個、在一實施例中約2個至5個添加、缺失及/或取代。可藉由誘變基於如Riechmann,L.等人，Nature 332(1988)323-327及Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033所述之分子模 擬來實施胺基酸序列修飾。

不同胺基酸序列之同源性及一致性可使用熟知演算法來計算，例如BLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM 55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85或BLOSUM 90。在一實施例中，演算法係BLOSUM 30。

脂肪顆粒係在其各別轉變溫度下藉由利用清潔劑溶解之脂肪培育脂蛋白元來形成。術語「清潔劑」表示表面活性化學物質。「清潔劑」通常係具有非極性疏水部分及極性親水部分之兩親分子。術語「兩性離子清潔劑」表示具有整體零電荷且同時包含至少一個帶正電荷之部分及至少一個帶負電荷之部分的表面活性化學化合物。在一實施例中，清潔劑係選自基於糖之清潔劑、基於聚環氧烷烴之清潔劑、基於膽鹽之清潔劑、合成清潔劑或其組合。術語「糖基於之清潔劑」表示選自以下之清潔劑：正-辛基-β-D-葡萄吡喃糖苷、正-壬基-β-D-葡萄吡喃糖苷、正-十二烷基-β-D-麥芽吡喃糖苷或5-環己基戊基-β-D-麥芽吡喃糖苷及其衍生物。術語「基於膽鹽之清潔劑」表示選自以下之清潔劑：膽酸鈉、膽酸鉀、膽酸鋰、3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基]-基-丙烷磺酸鹽(CHAPS)、3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基]-2-羥基丙烷磺酸鹽(CHAPSO)及其衍生物。術語「基於聚環氧烷烴之清潔劑」表示選自Tween 20、Triton X-100、Pluronic F68及其衍生物之清潔劑。術 語「合成清潔劑」表示選自Zwittergent 3-6、Zwittergent 3-8、Zwittergent 3-10、Zwittergent 3-12及其衍生物之清潔劑。

「有效量」之藥劑(例如醫藥調配物)係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。

可互換使用之術語「高密度脂蛋白顆粒」或其縮寫「HDL顆粒」表示包含脂蛋白元A-I作為主要蛋白質性化合物之脂肪-蛋白質-複合物。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已向其中引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉形體」及「轉形細胞」，其包括原代轉形細胞及源自其之子代，不考慮傳代次數。子代與親代細胞之核酸含量可不完全相同，且可含有突變。本文包括與原始轉形細胞中所篩選或選擇者具有相同功能或生物活性之突變子代。

術語「增加脂肪流出」及其語法等效物表示增加之自細胞或斑之脂肪流出含量及/或速率，促進脂肪流出，增強脂肪流出，有助於脂肪流出，上調脂肪流出，改善脂肪流出及/或加強脂肪流出。在一實施例中，脂肪流出包含磷脂、三甘油酯、膽固醇及/或膽固醇酯之流出。

個體(「individual」或「subject」)係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，例如猴)兔及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體為 人類。

術語「DPPC」表示磷脂1,2-二-棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼，亦稱為1,2-二棕櫚醯基-磷脂醯膽鹼。

術語「多聚體」表示由兩個或更多個單體組成之複合物。多聚體係藉由單體間之非共價相互作用來形成。每一單體包含多聚結構域。在一實施例中，多聚體包含2個或3個單體。在另一實施例中，多聚結構域係經由每一單體中所包含之個別多聚結構域間之非共價相互作用來相互作用。術語「多聚結構域」表示能夠使兩個或更多個單體分子以共價方式或以非共價方式結合之胺基酸序列。多聚結構域能夠與具有不同、類似或相同胺基酸序列之多聚結構域相互作用。在一實施例中，多聚結構域係四聯蛋白三聚結構元件或其衍生物，其具有與SEQ ID NO：03之共有胺基酸序列有至少68%一致之胺基酸序列。在一實施例中，SEQ ID NO：03之50位處之半胱胺酸殘基經不同胺基酸殘基取代，在另一實施例中經絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基或甲硫胺酸殘基取代。包含多聚結構域之多肽可與一或多種亦包含多聚結構域之其他多肽結合。多聚體形成可簡單地藉由在適宜條件下混合多肽來起始。在另一實施例中，多聚結構域具有SEQ ID NO：03之胺基酸序列，其中有1個至10個殘基已自該胺基酸序列之N-或C端缺失或添加至該胺基酸序列之N-或C端。在再一實施例中，多聚結構域具有SEQ ID NO：03之胺基酸序列，其中有6個或9個胺基酸殘基已自胺基酸序列之N端缺失。在又一實施例中，多聚結 構域具有SEQ ID NO：03之胺基酸序列，其中N端胺基酸殘基L或N端胺基酸殘基C及L已缺失。在一實施例中，多聚結構域係四聯蛋白三聚結構元件且具有SEQ ID NO：03之胺基酸序列。在一實施例中，該多聚體係同聚體。

多聚體可係同聚體或異聚體，此乃因包含多聚結構域之不同脂蛋白元可經組合納入多聚體中。在一實施例中，多聚體係三聚合同聚體。

根據一實施例，該多聚結構域係自四聯蛋白獲得。在一實施例中，該多聚結構域包含具有SEQ ID NO：04之胺基酸序列之四聯蛋白三聚結構元件。四聯蛋白三聚結構元件之三聚效應係由捲曲的纏繞型結構引起，該捲曲的纏繞型結構與另外兩個四聯蛋白三聚結構元件之捲曲的纏繞型結構相互作用而形成三聚體。四聯蛋白三聚結構元件可得自人類四聯蛋白、兔四聯蛋白、鼠類四聯蛋白或得自鯊魚軟骨之C型凝集素。在一實施例中，四聯蛋白三聚結構元件包含與SEQ ID NO：03之共有序列具有至少68%、或至少75%、或至少81%、或至少87%、或至少92%一致性的序列。

術語「非共價相互作用」表示非共價結合力，例如離子相互作用力(例如鹽橋)、非離子相互作用力(例如氫鍵)或疏水相互作用力(例如凡得瓦力(van-der-Waals force)或π-堆疊相互作用)。

當提及多肽序列時，「胺基酸序列一致性百分比(%)」係定義為在比對序列並(若需要)引入間隔以達到最大序列一 致性百分比後，指候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且任何保守取代則不視為序列一致性之一部分。可依熟習此項技術者所熟知之各種方式來測定胺基酸序列一致性百分比，以達成比對之目的，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。然而，出於本文目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%之值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech有限公司設計，且原始碼已與使用者文件一起歸檔於美國版權局(U.S.Copyright Office)Washington D.C.,20559中，其中其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech有限公司，South San Francisco,California公開獲得，或可自原始碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯適於在UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不改變。

在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形中，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)或對(against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可表達為相對於、與或對給定胺基酸序列B給定胺基酸序列A所具有或包含之一定胺基酸序列一致性%)如下來計算：100×分數X/Y 其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，倘若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另有明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%的值皆係如前面緊接段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。

術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其係呈使得其中所含活性成份之生物活性有效之形式，且不含對將投與調配物之個體具有不可接受之毒性的額外組份。

「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份外對個體無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

術語「磷脂醯膽鹼」表示由一個甘油部分、兩個羧酸部分及一個磷酸膽鹼部分組成之分子，其中甘油部分與其他部分各自藉由酯鍵(即兩個羧酸酯鍵及一個磷酸酯鍵)以共價方式結合，其中磷酸酯鍵係結合至甘油部分之1-羥基或3-羥基。術語「羧酸部分」表示包含至少一個醯基(R-C(O)O)之有機部分。磷脂醯膽鹼可係任一種類或來源。在一實施例中，磷脂醯膽鹼係選自蛋磷脂醯膽鹼、大豆磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二月桂基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、1-肉豆蔻醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚醯基-2-肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚 醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼、1-硬脂醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼、1-油醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼及其類似物及衍生物。

本文所用之所有磷脂可源自任一來源，即(若適當)源自大豆、乳、蛋或甚至不包括人類之動物之內部器官，其可係源自天然來源，或半合成或甚至完全合成。

術語「POPC」表示磷脂1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼，亦稱為1-棕櫚醯基-2-油醯基-磷脂醯膽鹼。

本文所用「治療(treatment)」(及其語法變化形式，例如「treat」或「treating」)係指試圖改變正治療個體之自然病程的臨床干預，且可出於預防性目的或在臨床病理學過程期間實施。治療之期望效應包括(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理學後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病發生或減緩疾病進展。

術語「變體」亦包括本文所報導之脂蛋白元或脂蛋白元模擬物之變體，其中在變體中，各別脂蛋白元或脂蛋白元模擬物之胺基酸序列包含一或多個胺基酸取代、添加或缺失。修飾可增強或降低脂蛋白元受體或脂蛋白元轉化酶對脂蛋白元之親和力，或可增強與各別脂蛋白元相比脂蛋白元變體之穩定性，或可增強與各別脂蛋白元相比脂蛋白元 變體在水溶液中之溶解性，或可增強與各別脂蛋白元相比在宿主細胞中/由宿主細胞進行之脂蛋白元變體重組製造。

縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白

本文報導縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白。

縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白係N端縮短之人類四聯蛋白三聚結構元件與野生型人類脂蛋白元A-I之融合蛋白。人類四聯蛋白部分之胺基酸序列縮短前9個胺基酸，從而始於10位之異白胺酸殘基並藉由N端胺基酸殘基脯胺酸延伸。由於此截斷，4位之蘇胺酸殘基處天然存在之O-糖基化位點已缺失。在四聯蛋白三聚結構元件與人類脂蛋白元A-I之間，有5個胺基酸殘基「SLKGS」(SEQ ID NO：05)已去除。

縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白可具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列，或係其具有至少70%序列一致性之變體。

四聯蛋白三聚結構元件提供允許形成三聚體且縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白的結構域，該融合蛋白包含藉由個體單體中每一者間之非共價相互作用構成的多聚體。

在一實施例中，野生型人類脂蛋白元A-I可係包含保守胺基酸取代之變體。

脂蛋白元A-I可以酶促方式、經由NMR光譜法或藉由使用單株或多株抗脂蛋白元-A-I抗體來測定。因此，本文所 報導之其他態樣係特異性結合本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之多株及單株抗體。該等抗體可利用熟習此項技術者已知之方法來獲得。同樣，用於免疫分析之融合蛋白、包含融合蛋白之脂肪顆粒及結合至融合蛋白或脂肪顆粒之抗體之標記可利用熟習此項技術者已知之方法來實施。

在一實施例中，野生型人類脂蛋白元A-I係包含1個至10個保守胺基酸取代之變體。

因此，在一實施例中，縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白具有胺基酸序列PIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(SEQ ID NO：01)。

所獲得具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列的縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白具有較少的具有(例如)一個額外N端胺基酸之副產物融合蛋白。此顯示於下表中。

若縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白係產生於大腸桿菌中，則其係自包涵體獲得。

脂肪顆粒

本文報導包含本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之脂肪顆粒。

在一實施例中，脂肪顆粒包含a)本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白，b)磷脂醯膽鹼，及c)另一脂肪。

在一實施例中，脂肪顆粒包含本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白、第一磷脂醯膽鹼及第二磷脂醯膽鹼。在一實施例中，第一磷脂醯膽鹼及第二磷脂醯膽鹼之不同在於一或兩個酯化為磷脂醯膽鹼之磷-甘油主鏈之羧酸部分或羧酸部分衍生物。在一實施例中，第一磷脂醯膽鹼係POPC且第二磷脂醯膽鹼係DPPC。

在一實施例中，縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白、磷脂醯膽鹼及另一脂肪在脂肪顆粒中係以非共價方式結合。

脂肪組合之選擇決定包含脂蛋白元之脂肪顆粒之效力及肝安全性。在使用兔進行之含有脂肪顆粒之DMPC之活體內研究中，已發現，用30 mg/kg治療之兔顯示嚴重副效應但仍存活，而用100 mg/kg治療之兔死亡。

活體外功能測試證實，含有諸如DPPC或POPC等單一磷脂醯膽鹼之脂肪顆粒激活LCAT。

亦顯示，當脂肪顆粒包含不同磷脂之組合時，膽固醇流出較多。在下表中，顯示利用經製備用於活體內兔研究且脂肪組成不同之磷脂組合獲得的結果。

活體內數據亦確認該等結果，該等數據顯示所有組合之膽固醇動員。然而，針對僅含有單一磷脂醯膽鹼DPPC或DPPC與鞘磷脂(SM)之組合之脂肪顆粒，測定到肝酶增加(圖1)。

自技術觀點來看，與利用純POPC形成相比，利用純DPPC形成脂肪顆粒更便利。藉由使用不同磷脂之組合降 低沈澱物形成之風險。同樣，與具有4℃之相轉變溫度之純POPC相比，純DPPC之相轉變溫度41℃使其更易於製備脂肪顆粒。同樣，所獲得之產物更均質。此可藉由脂肪顆粒分析經由SEC-MALLS(亦允許測定蛋白質-脂肪組合物之分析工具(蛋白質偶聯分析))來證實。在圖2中，顯示粒徑排阻層析法(UV280檢測)中所解析之樣品之層析圖。藉由出現多個分開或半分離峰可看出樣品之不均質性。

當使用純POPC產生脂肪顆粒時，脂肪顆粒中每個脂蛋白元單體之POPC分子數量在一實施例中係40至85，在一實施例中係50至80，且在一實施例中係54至75。

當使用純DPPC產生脂肪顆粒時，脂肪顆粒中每個脂蛋白元單體之DPPC分子數量在一實施例中係50至150，在一實施例中係65至135，在一實施例中係76至123，且在一實施例中係86至102。

當使用莫耳比為1：3之POPC與DPPC之混合物產生脂肪顆粒時，脂肪顆粒中每個脂蛋白元單體之磷脂分子數量在一實施例中係約50至約120，在一實施例中係約65至約105，且在一實施例中係約72至約96。

當使用莫耳比為1：1之POPC與DPPC之混合物產生脂肪顆粒時，脂肪顆粒中每個脂蛋白元單體之脂肪分子數量在一實施例中係50至120，在一實施例中係60至100，且在一實施例中係71至92。

當使用莫耳比為3：1之POPC與DPPC之混合物產生脂肪顆粒時，脂肪顆粒中每個脂蛋白元單體之脂肪分子數量在一 實施例中係50至90。在一實施例中，數量係60至90。在一實施例中，數量係60至88。在一實施例中，數量係60至80。

為產生包含脂蛋白元及POPC之脂肪顆粒，在一實施例中採用1：40至1：100之脂蛋白元與POPC之莫耳比，在一實施例中採用1：40至1：80之莫耳比，且在一實施例中採用約1：60之莫耳比。

為產生包含脂蛋白元及DPPC之脂肪顆粒，在一實施例中採用1：70至1：100之脂蛋白元與DPPC之莫耳比，在一實施例中採用1：80至1：90之莫耳比，且在一實施例中採用約1：80之莫耳比。

為產生包含脂蛋白元、POPC及DPPC之脂肪顆粒，在一實施例中採用1：60至1：100之脂蛋白元與POPC及DPPC之莫耳比(其中POPC與DPPC為1：3莫耳比)，在一實施例中，採用1：70至1：90之莫耳比，且在一實施例中，採用約1：80之莫耳比。

為產生包含脂蛋白元、DPPC及POPC之脂肪顆粒，在一實施例中脂蛋白元與POPC及DPPC之莫耳比(其中POPC與DPPC為1：1莫耳比)係1：60至1：100，在一實施例中，莫耳比係1：60至1：80，且在一實施例中，莫耳比係約1：70。

為產生包含脂蛋白元、DPPC及POPC之脂肪顆粒，在一實施例中採用1：50至1：100之脂蛋白元與POPC及DPPC之莫耳比(其中POPC與DPPC為3：1莫耳比)。在一實施例中，採用1：50至1：70之莫耳比。在一實施例中，採用約1：60之莫 耳比。

在一實施例中，若使用脂肪之混合物產生脂肪顆粒，則該混合物具有4℃至45℃、在一實施例中10℃至38℃且在一實施例中15℃至35℃之相轉變溫度。

脂肪顆粒在一實施例中包含每個脂肪顆粒1個至10個融合蛋白分子、在一實施例中每個脂肪顆粒1個至8個融合蛋白分子且在一實施例中每個脂肪顆粒1個至4個融合蛋白分子之平均數量。

在一實施例中，脂肪顆粒包含每個脂肪顆粒至少1個、或2個、或3個、或4個、或5個、或6個、或7個、或8個、或9個、或10個融合蛋白分子之平均數量。在一實施例中，平均數量係1。

在一實施例中，脂肪顆粒包含一或多種與融合蛋白無關之其他多肽。

非限制性地，脂肪顆粒可用作酶促輔助因子及/或用於承載脂肪、尤其膽固醇之載劑。

一或多種清潔劑可存在於本文所報導之脂肪顆粒中。該清潔劑可係任一清潔劑，即醫藥上可接受之清潔劑或無毒性濃度之其他清潔劑，例如非離子性或離子性清潔劑。非離子性清潔劑可係含有一或多個羥基之有機化合物之環氧烷衍生物。

在一實施例中，非離子性清潔劑係選自乙氧基化及/或丙氧基化醇、或酯化合物或其混合物。在一實施例中，酯係選自山梨糖醇及脂肪酸之酯，例如山梨醇酐單油酸酯或 山梨醇酐單棕櫚酸酯、油性蔗糖酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯固醇醚、聚氧乙烯-聚丙氧基烷基醚、嵌段聚合物及鯨蠟醚、聚氧乙烯蓖麻油或氫化蓖麻油衍生物及聚甘油脂肪酸酯。

在一實施例中，非離子性清潔劑係選自Pluronic®、Poloxamer®、Span®、Tween®、Polysorbate®、Tyloxapol®、Emulphor®或Cremophor®。

離子性清潔劑可係膽管劑。在一實施例中，離子性清潔劑係選自膽酸或去氧膽酸或其鹽及衍生物，或選自游離脂肪酸，例如油酸、亞麻油酸及其他。

在一實施例中，離子性清潔劑係選自陽離子脂肪(例如C₁₀-C₂₄烷基胺或烷醇胺)及陽離子膽固醇酯。

在一實施例中，脂肪顆粒包含小於0.75重量%清潔劑。

在一實施例中，脂肪顆粒包含小於0.3重量%清潔劑。

在一實施例中，清潔劑係選自基於糖之清潔劑、基於聚環氧烷烴之清潔劑、基於膽鹽之清潔劑、合成清潔劑或其組合。在一實施例中，清潔劑係膽酸。

性質：

本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒可用於治療及/或診斷以非正常脂肪含量或身體組份內之脂肪沈積物(例如血管中之斑)為特徵之疾病或病狀。

為測定本文所報導之脂肪顆粒支持LCAT催化之膽固醇 酯化之能力，可藉由添加膽固醇乙醇溶液將膽固醇納入脂肪顆粒中。相比於含有獨立於其脂蛋白元成份(例如野生型脂蛋白元A-I或四聯蛋白-脂蛋白元A-I)之DPPC之複合物，含有純POPC之脂肪顆粒為較好LCAT基質(圖3)。

包含POPC與DPPC之不同混合物之脂肪顆粒中膽固醇酯化之初速度顯示，相比於單一純磷脂醯膽鹼，混合物為較好LCAT基質。此可自膽固醇酯化之初速度看出(參見下表及圖4)。

可將藉由以下所獲得之巨噬細胞(例如人類THP1細胞)暴露於膽固醇受體測試化合物：將THP-1單核白血病細胞暴露於佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate)並加載放射性標記之膽固醇示蹤劑。

由受體測試化合物誘導之流出速度可計算為上清液中之膽固醇放射性與細胞加其上清液中之放射性之和的比率，且將該流出速度與暴露於不含受體之培養基的細胞相比較，並藉由線性擬合分析。可使用暴露於及不暴露於RXR-LXR激動劑之細胞實施平行實驗，已知該RXR-LXR 激動劑主要上調ABCA-1並使流出偏向ABCA-1介導之轉運。

與利用非脂化四聯蛋白-脂蛋白元A-I所獲得之流出相比，在未經RXR-LXR脂肪顆粒預治療之細胞中，可看到膽固醇流出之增加較多。在所測試系列中可觀測到，脂肪混合物對流出僅具有較小影響(圖5)。在經RXR-LXR預治療之細胞中使用非脂化四聯蛋白-脂蛋白元A-I，可看到膽固醇流出相當之增加。總增加與利用未經預治療之細胞所觀測到之增加相比較高。在所測試系列中可觀測到，脂肪混合物對流出僅具有較小影響(圖6)。

在兔中活體內測試不同脂肪顆粒。以靜脈內輸注施加脂肪顆粒，並在施加後96 h實施連續血液取樣。測定肝酶、膽固醇及膽固醇酯之值。所測試所有脂肪顆粒之血漿濃度均相當，該等濃度包含初始分佈期，隨後血漿濃度出現對數線性下降(圖7)。自下表可看出，藥物動力學參數對於所有所測試之化合物而言均類似。所觀測到之半衰期接近於1.5天。

自圖8可看出，膽固醇在血漿中經動員並酯化。甚至在四聯蛋白-脂蛋白元A-I之濃度已降低之後，血漿膽固醇酯含量仍繼續升高。當血漿四聯蛋白-脂蛋白元A-I含量已降低至約0.5 mg/ml(正常野生型脂蛋白元A-I之約50%)時，仍可檢測升高之膽固醇酯含量。

包含四聯蛋白-脂蛋白元A-I之脂肪顆粒不誘導兔中以及小鼠中之肝酶，如自兔1及9可看出。在靜脈內施加兩小時後所獲得之血漿樣品亦可未檢測到溶血(圖10)。

因此，本文所報導之態樣係包含本文所報導之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或本文所報導之脂肪顆粒之醫藥組合物及診斷組合物。

與下表中所顯示之非脂化脂蛋白元及其他脂肪顆粒相比，本文所報導之脂肪顆粒具有經改良之活體內性質。

將膽固醇動員至血液中之效率可藉由比較在活體內投與脂蛋白元之後總膽固醇與脂蛋白元濃度之各別偏移來測定。對於定量評估，計算總膽固醇之基線校正之濃度-時間曲線下面積(AUC)與脂蛋白元之濃度-時間曲線下面積之商。

本文所報導之脂肪顆粒、尤其包含SEQ ID NO：01之四聯蛋白-脂蛋白元及莫耳比為3：1之POPC與DPPC之脂肪顆粒顯示活體內增強之膽固醇動員。

脂肪顆粒之形成

為形成本文所報導之脂肪顆粒，已知不同方法，例如冷凍-乾燥、冷凍-解凍、清潔劑溶解接著透析、微流化、超音波處理及均質化。

例如，可利用經純化脂蛋白元培育磷脂與清潔劑之水性混合物。可以天然形式添加脂蛋白元。其後藉由透析或滲濾來去除清潔劑。包含縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之脂肪顆粒之形成可藉由以下來達成：在其各別轉變溫度下，利用清潔劑溶解之脂肪培育呈單體或多聚體形式之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白。藉由透析去除清潔劑導致脂肪顆粒之形成。用於形成含有脂蛋白元之脂肪顆粒之常用方法係基於在(例如)Jonas,A.,Methods Enzymol.128(1986)553-582或Experimental Lung Res 6(1984)255-270中所闡述之膽酸鹽方法。藉由透析去除清潔劑，可導致脂肪顆粒之形成。

對於脂肪顆粒之形成所必需考慮之要點係i)對生物活性 之要求及ii)關於脂肪顆粒之可製造性之技術要求。但是為了形成包含脂蛋白元之脂肪顆粒，該等要求卻朝相反方向。

自技術觀點看，將選擇含有具有16個碳原子及更短之鏈羧酸部分之飽和磷脂(例如二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，DPPC；二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，DMPC，等)。自生物數據來看則與其相反，可假設，含有具有至少16個碳原子之鏈之羧酸部分之不飽和磷脂(例如棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，POPC；硬脂醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼，SOPC)更有效且無肝毒性。

可使用磷脂醯膽鹼DPPC及POPC及其混合物來形成含有脂蛋白元之脂肪顆粒。該等實例性磷脂醯膽鹼之不同處在於一個羧酸部分且具有一個酯化為磷酸甘油主鏈之相同羧酸部分。當使用DPPC時，更容易製造脂肪顆粒。反之，POPC在活體外功能分析中，特定而言作為用於激活卵磷脂膽固醇乙醯基轉移酶(LCAT)之基質時更有效，該酶係將所動員膽固醇轉化成膽固醇酯時所必需。已發現，與僅包含一種磷脂醯膽鹼之脂肪顆粒相比，包含不同莫耳比之兩種磷脂醯膽鹼(例如POPC及DPPC)之混合物的脂肪顆粒具有改良之性質(參見例如圖4)。

已報導自源自人類HDL顆粒之重組脂蛋白元或去脂化脂蛋白元重構脂肪顆粒之不同方法(HDL=高密度脂蛋白)。例如，由磷脂與清潔劑之水性混合物與純化之脂蛋白元培育。添加天然形式之脂蛋白元。其後藉由透析或滲濾來去 除清潔劑。可藉由以下方式形成包含縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之脂肪顆粒：在其各別轉變溫度下，利用清潔劑溶解之脂肪培育縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白或其多聚體。藉由透析去除清潔劑導致脂肪顆粒之形成。

可藉由沈澱及/或層析法步驟之組合來純化脂肪顆粒。例如，可在疏水吸附層析法步驟中去除過量清潔劑(即並非脂肪顆粒之一部分之清潔劑)。可自疏水吸附材料利用清潔劑游離溶液回收脂肪顆粒。

提供以下實例、序列表及圖以幫助理解本發明，本發明之實際範圍係陳述於隨附申請專利範圍中。應瞭解，可對所述程序作出多種修改，而不背離本發明之精神。

序列表說明

SEQ ID NO：01 縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白。

SEQ ID NO：02 人類脂蛋白元A-I。

SEQ ID NO：03 人類四聯蛋白三聚結構域。

SEQ ID NO：04 縮短之人類四聯蛋白三聚結構域。

SEQ ID NO：05 所切除肽。

材料和方法 粒徑排阻HPLC：

利用ASI-100 HPLC系統(Dionex,Idstein，德國)上之Tosoh Haas TSK 3000 SWXL管柱來實施層析。在280 nm處藉由UV二極體陣列檢測器(Dionex)來檢測溶析峰。在將濃 樣品溶解至1 mg/ml之後，用由200 mM磷酸二氫鉀及250 mM氯化鉀組成之pH為7.0之緩衝液洗滌管柱，直至達成穩定基線為止。將分析運行在等度條件下使用0.5 ml/min流速於室溫下實施30分鐘。手動地將層析圖與Chromeleon(Dionex，Idstein，德國)整合。藉由將高分子量形式之曲線下的面積(AUC)與單體峰之AUC相比較來測定聚集(以%表示)。

動態光散射(DLS)：

DLS係用於量測粒徑(通常在亞微米大小範圍內)之非侵襲性技術。在本發明中，使用具有控制溫度之石英比色池(25℃)之Zetasizer Nano S裝置(Malvern Instruments,Worcestershire,UK)來監測介於1 nm與6 μm之間之大小範圍。以173°之角檢測背向散射雷射光之強度。強度波動之速率取決於粒子擴散速度，粒子擴散速度又受粒徑支配。因此，粒徑數據可自散射光強度之波動分析產生(Dahneke,B.E.(編輯)，Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering,Wiley有限公司(1983)；Pecora,R.,Dynamic Light Scattering：Application of Photon Correlation Spectroscopy,Plenum Press(1985))。使用DTS軟體(Malvern)之多重狹窄模式(multiple narrow mode)來計算隨強度之粒徑分佈。用未經稀釋之樣品實施實驗。

SEC-MALLS：

SEC-MALLS係粒徑排阻層析法與三檢測器系統之組 合：i)UV檢測、ii)折射指數檢測及iii)光散射檢測。為藉由大小進行分離，使用來自GE Healthcare之Superose 6管柱10/300 GL管柱。以等度方式利用pH 7.4之PBS緩衝液應用0.4 ml/min之流速來運行該方法。三個檢測器系統串聯連接。完整脂肪顆粒(蛋白質-脂肪顆粒)信號係藉由折射指數檢測器來監測，而在280 nm下測定之UV吸光度決定藉由蛋白質部分誘導之信號。藉由自完整信號簡單減去蛋白質UV信號來獲得脂肪部分之比例。施加光散射允許檢測各別種類之分子質量且從而脂肪顆粒之完整且詳細的描述。

清潔劑測定：

藉由與蒸發光散射檢測器(RP-ELSD)聯用之逆相層析法實施對殘餘清潔劑之測定。使用來自Phenomenex(Aschaffenburg，德國)之Luna C18 4.6×150 mm,5 μm,100 Å作為管柱。在穿過10 kDa膜離心後，使用90 μl之流出物用於HPLC分離。在等度條件下利用含有0.1%(v/v)三氟乙酸之74%(v/v)甲醇溶液實施溶析。將管柱溫度設定為30℃。藉由蒸發光散射檢測器施加30℃之霧化溫度、80℃之蒸發溫度及1.0 l/min之氣流來實施檢測。在膽酸鹽之範圍為0.22 μg至7.5 μg膽酸鹽之情形下藉由建立校準曲線來實施對殘餘清潔劑之量化。

蛋白質測定：

藉由使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數測定280 nm下之光學密度(OD)來測定蛋白質濃度。

重組DNA技術：

使用標準方法來操縱DNA，如Sambrook,J.等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，紐約(1989)中所闡述。根據製造商說明書來使用分子生物試劑。

實例1 大腸桿菌表現質體之製作及描述

藉由重組方法製備縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白。所表現之融合蛋白在N-至C端方向上具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列。

利用已知重組方法及技術藉由連接適當核酸區段來組裝編碼融合基因。藉由DNA測序來驗證藉由化學合成製得之核酸序列。用於產生具有SEQ ID NO：01之融合蛋白之表現質體可如下製得：質體1(1-pBRori-URA3-LACI-SAC)係用於在大腸桿菌中表現核-鏈黴抗生物素之表現質體。其係藉由連接3142 bp長之EcoRI/CelII-載體片段來產生，該EcoRI/CelII-載體片段源自具有435 bp長的核-鏈黴抗生物素編碼EcoRI/CelII片段之質體2(2-pBRori-URA3-LACI-T-重複；報導於EP-B 1 422 237中)。

核-鏈黴抗生物素大腸桿菌表現質體包含以下元件：- 載體pBR322之用於在大腸桿菌中複製之複製起點(與Sutcliffe,G.等人，Quant.Biol.43(1979)77-90之bp位 點2517-3160一致)，- 啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)中編碼血苷5'-磷酸去羧酶之URA3基因(Rose,M.等人，Gene 29(1984)113-124)，該URA3基因允許藉由大腸桿菌pyrF突變體菌株(尿嘧啶營養缺陷型)之互補進行質體選擇，- 核-鏈黴抗生物素表現盒，其包含- T5雜合啟動子(根據Bujard,H.等人，Methods.Enzymol.155(1987)416-433及Stueber,D.等人，Immunol.Methods IV(1990)121-152之T5-PN25/03/04雜合啟動子)，其包括根據Stueber,D.等人之合成核糖體結合位點，(參見上文)，- 核-鏈黴抗生物素基因，- 兩個噬菌體源轉錄終止子，λ-T0終止子(Schwarz,E.等人，Nature 272(1978)410-414)及fd-終止子(Beck,E.and Zink,B.,Gene 1-3(1981)35-58)，- 來自大腸桿菌之lacI抑制子基因(Farabaugh,P.J.,Nature 274(1978)765-769)。

用於表現縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之最終表現質體可藉由以下來製備：自質體1使用單一側翼EcoRI及CelII限制性核酸內切酶裂解位點切除核-鏈黴抗生物素結構基因，並將編碼融合蛋白之EcoRII/CelII限制位點側翼核酸插入3142 bp長的EcoRI/CelII-1質體片段中。

實例2 四聯蛋白-脂蛋白元A-I之表現

為表現本文所報導之融合蛋白，採用使能夠藉由大腸桿菌營養缺陷型(PyrF)之互補來進行無抗生性質體選擇之大腸桿菌宿主/載體系統(EP 0 972 838及US 6,291,245)。

藉由電穿孔利用表現質體使大腸桿菌K12菌株CSPZ-2(leuB、proC、trpE、th-1、△pyrF)轉形。首先使經轉形大腸桿菌細胞在37℃下於瓊脂板上生長。

對於預發酵，已使用補充有約1 g/l L-白胺酸、約1 g/l L-脯胺酸及約1 mg/l噻胺-HCl之根據Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，紐約(1989))之M9培養基。

對於預發酵，用原始種子庫安瓿中之2 ml接種1000 ml具有擋板之錐形燒瓶中之300 ml M9-培養基。在37℃下在旋轉振盪器上實施培養13小時，直至獲得1-3之光學密度(578 nm)為止。

對於發酵，使用根據Riesenberg等人之分批培養基(Riesenberg,D.等人，J.Biotechnol.20(1991)17-27)：27.6 g/l葡萄糖*H₂O，13.3 g/l KH₂PO₄，4.0 g/l(NH₄)₂HPO₄，1.7 g/l檸檬酸鹽，1.2 g/l MgSO₄*7 H₂O，60 mg/l檸檬酸鐵(III)，2.5 mg/l CoCl₂*6 H₂O，15 mg/l MnCl₂*4 H₂O，1.5 mg/l CuCl₂*2 H₂O，3 mg/l H₃BO₃，2.5 mg/l Na₂MoO₄*2 H₂O，8 mg/l Zn(CH₃COO)₂*2 H₂O，8.4 mg/l Titriplex III，1.3 ml/l Synperonic 10%消泡劑。分批培養基補充有5.4 mg/l噻胺-HCl及分別1.2 g/l L-白胺酸及 L-脯胺酸。饋料1溶液含有補充有19.7 g/l MgSO₄*7 H₂O之700 g/l葡萄糖。用於pH調節之鹼性溶液係分別補充有50 g/l L-白胺酸及50 g/l L-脯胺酸之12.5%(w/v)NH₃水溶液。將所有組份溶解於去離子水中。

在10 l Biostat C DCU3發酵槽(Sartorius,Melsungen，德國)中實施發酵。以6.4 l無菌發酵分批培養基加來自預發酵之300 ml接種物開始，在37℃、pH 6.9±0.2、500 mbar及10 l/min之通氣速率下實施分批發酵。在耗盡最初所補充之葡萄糖後，將溫度轉變至28℃且發酵進入饋料分批模式。此時，藉由添加饋料1以及不斷增加攪拌器速度(在10小時內自550 rpm至1000 rpm且在16小時內自1000 rpm至1400 rpm)及通氣速率(在10小時中自10 l/min至16 l/min且在5小時中自16 l/min至20 l/min)，將溶解氧之相對值(pO2)保持在50%(DO-stat，參見例如Shay,L.K.等人，J.Indus.Microbiol.Biotechnol.2(1987)79-85)。在培養大約8小時後，當pH達到調節下限(6.70)時，藉由添加鹼性溶液來供應額外胺基酸。藉由添加光學密度為70之1 mM IPTG來誘導重組治療蛋白質之表現。

在發酵結束時，在收穫之前利用加熱步驟將細胞質且可溶性經表現四聯蛋白-脂蛋白元A-I轉移至不可溶蛋白質聚集體(所謂包涵體)中，在該加熱步驟中，將發酵槽中之整個培養液加熱至50℃並持續1或2小時(參見例如EP-B 1 486 571)。其後，利用並流離心機(13,000 rpm,13 l/h)對發酵槽之內容物進行離心，且在進一步處理之前，將所收穫之 生物量儲存在-20℃下。合成之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白排他性地出現在呈不可溶蛋白質聚集體(所謂包涵體(IB))之形式之不可溶細胞碎片部分中。

利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析自發酵槽抽取之樣品(一個樣品在誘導之前抽取且其他樣品在誘導蛋白質表現之後於指定時間點抽取)。自每一樣品，將相同量之細胞(OD_標靶=5)重新懸浮於5 mL PBS緩衝液中並經由在冰上進行超音波處理來破壞。然後，對100 μL之每一懸浮液進行離心(15,000 rpm，5分鐘)，且將每一上清液取出並轉移至單獨小瓶中。此係用於區分所表現的可溶與不可溶標靶蛋白質。向每一上清液(=可溶)部分中添加300 μL之SDS樣品緩衝液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)，並向每一沈澱(=不可溶)部分中添加400 μL之SDS樣品緩衝液。在95℃下將樣品振盪加熱15分鐘，以溶解並還原樣品中之所有蛋白質。冷卻至室溫後，將5 μL之每一樣品轉移至4-20% TGX Criterion Stain游離聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad)中。另外，將5 μl分子量標準物(Precision Plus Protein標準物，Bio-Rad)及3種量(0.3 μl、0.6 μl及0.9 μl)之具有已知產物蛋白質濃度(0.1 μg/μl)之量化標準物置於凝膠上。

在200 V下將電泳運行60分鐘，且其後將凝膠轉移至凝膠DOC EZ成像儀(Bio-Rad)上並用UV輻射處理5分鐘。使用Image Lab分析軟體(Bio-Rad)分析凝膠影像。利用該三種標準物，利用>0.99之係數計算線性回歸曲線且由此計算原始樣品中標靶蛋白質之濃度。

實例3 縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之製備

藉由將所收穫之細菌細胞重新懸浮於Tris緩衝溶液(0.1 M，補充有1 mM MgSO₄，pH 7.0)中來實施包涵體製備。 添加DNAse之後，在900 bar之壓力下藉由均質化來破壞細胞。將包含1.5 M NaCl及60 mM EDTA之緩衝液溶液添加至均質化細胞懸浮液中。在利用25%(w/v)HCl將pH值調整至5.0後，在進一步離心步驟後獲得最終包涵體漿液。在進一步處理之前，可將漿液於單次使用、無菌塑膠袋中儲存在-20℃下。

將包涵體漿液(約15 kg)溶解於鹼性鉀鹽酸鹽溶液並藉由深層過濾使其澄清。或者，將包涵體漿液溶解於胍鹽酸鹽溶液(150 l，6.7 M)中。

實例4 縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之再摺疊及脂化 a)一般膽酸鹽方法

將純結晶POPC或DPPC(Lipoid，Switzerland)溶解於含有莫耳比磷脂：膽酸鹽為1：1.35之膽酸鹽之水性緩衝液(脂化緩衝液)中。在氮氣氛下培育混合物並使其在室溫下(POPC)或在55℃下(DPPC)避光，直至獲得澄清溶液為止。將脂肪-膽酸鹽澄清溶液冷卻至4℃(POPC)或儲存在41℃下(DPPC)。在4℃(POPC)或41℃(DPPC)下以經界定脂蛋白元：磷脂比率添加縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白。對於脂肪顆粒形成，在4℃(POPC)或41℃(DPPC)下在 氮氣氛下將反應混合物培育過夜並避光。最後，藉由針對脂化緩衝液進行廣泛透析(4℃/41℃)來去除膽酸鹽。最後，對樣品進行離心以去除所沈澱之材料。

可如上文所述來製備含有POPC及DPPC之膽酸鹽溶解脂肪溶液。藉由以期望比率組合脂肪溶液、接著儲存在各別T_m(T_m=相轉變溫度)下來製備脂肪混合物。如針對純脂肪溶液所述但在所選脂肪混合物之各別T_m下實施縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之脂肪顆粒形成。

可使用以下脂化緩衝液：

1.補充有250 mM精胺酸鹽酸鹽、7.5%蔗糖之50 mM磷酸鉀緩衝液，pH 7.5

2.補充有250 mM精胺酸鹽酸鹽、7.5%蔗糖、10 mM甲硫胺酸之50 mM磷酸氫二鉀緩衝液，pH 7.5

3.補充有140 mM NaCl、10 mM甲硫胺酸之250 mM叁-羥基胺基甲烷(TRIS)，pH 7.5

4.補充有250 mM精胺酸鹽酸鹽、7%海藻糖、10 mM甲硫胺酸之50 mM磷酸氫二鉀緩衝液，pH 7.5。

所形成包含縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白樣品之脂肪顆粒之均質性可藉由分析SEC來評估。總體而言，與磷脂之選擇相比，脂化緩衝液之選擇僅具有微小效應。DPPC-脂肪顆粒以一個主峰溶析，而POPC-脂肪顆粒顯示兩峰模式。顯示無論脂化緩衝液為何，脂肪顆粒形成均可行。在所測試之各種緩衝液中，最適當脂化緩衝液經鑑別為250 mM Tris、140 mM NaCl、10 mM甲硫胺酸，pH 7.4。

脂化混合物含有界定量之融合蛋白，且從而計算各別磷脂(例如POPC)之量。脂肪之莫耳量之所有計算值均係基於縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白單體。

可使用SEC-MALLS分析來獲得關於脂肪顆粒及其脂蛋白元-磷脂組合物之均質化的更詳細資訊(蛋白質偶聯分析)。圖11顯示SEC解析樣品之實例性層析圖(UV280檢測)。此時，1：160樣品分成三個分開的峰。1：80樣品看起來含有至少兩個不同大小之種類，如以雙峰所顯示。自樣品1：20所獲得之峰顯示最均質之產物。

蛋白質偶聯分析能夠計算自SEC管柱所溶析之每一脂肪顆粒之蛋白質(MW蛋白質)及脂肪組份(MW脂肪)之總分子量。基於縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白單體(32.7 kDa)及POPC(760 Da)之分子量，可計算脂肪顆粒之組成(n蛋白質及n POPC)。在所有莫耳比下脂肪顆粒主峰中所發現之脂蛋白元組份之分子量係大約100 kDa，與每脂肪顆粒之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白三聚體一致。比率n(POPC)/n(蛋白質單體)提供脂肪顆粒中每個縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白單體之POPC分子數量。每個縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白單體之POPC分子數量有所不同。值蛋白質%係用於脂化程度之參數。脂肪顆粒中蛋白質之百分比愈低，脂化程度愈高。

b)利用POPC及DPPC及膽酸鈉用於再摺疊及脂肪顆粒形成之快速稀釋方法

使縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白在大腸桿菌中表現，並根據實例1至3純化。純化後，藉由滲濾至含有250 mM Tris、140 mM NaCl、6.7 M胍鹽酸鹽之溶液(pH 7.4)中來交換緩衝液。將蛋白質濃度調整至約30 mg/ml。

製備兩種單獨的脂肪儲備溶液。在室溫下，藉由將100莫耳/l之POPC溶解於含有250 mM Tris-HCl、140 mM NaCl、135 mM膽酸鈉之緩衝液(pH 7.4)中來製備溶液A。在41℃下，藉由將100莫耳/l之DPPC溶解於250 mM Tris-HCl、140 mM NaCl、135 mM膽酸鈉(pH 7.4)中來製備溶液B。將脂肪儲備溶液A及B以3：1之比率混合，並在室溫下培育2小時。藉由將384 ml之脂肪儲備混合物稀釋至6365 ml之250 mM Tris-HCl、140 mM NaCl(pH 7.4)中來製備再摺疊緩衝液。在室溫下將此緩衝液再攪拌24小時。

藉由將750 ml存於250 mM Tris、140 mM NaCl、6.7 M胍鹽酸鹽中之包含縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白的溶液(pH 7.4)添加至再摺疊緩衝液中來起始再摺疊及脂肪顆粒形成。此形成1：10稀釋度之胍鹽酸鹽。在室溫下將溶液培育至少12小時，同時不斷攪拌。藉由滲濾實施清潔劑去除。

c)以變性或天然蛋白質開始之脂肪顆粒形成

條目a)(第一方法)中所報導之方法需要天然脂蛋白元用於脂肪顆粒形成，而條目b)(第二方法)中所報導之方法以完全變性脂蛋白元開始用於脂肪顆粒形成。

在實例性第一方法中，將存於6.7 M胍鹽酸鹽、50 mM Tris、10 mM甲硫胺酸中之變性且縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白(pH 8.0)以3.46 mg/ml之蛋白質濃度針對如下緩衝液進行廣泛透析：由250 mM Tris、140 mM NaCl、10 mM甲硫胺酸組成，pH為7.5。然後添加POPC與膽酸鹽之混合物，以得到溶液中最終濃度之6 mM POPC及8 mM膽酸鹽。此對應於每分子之縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白單體60分子之POPC的比率(60：1)。隨後藉由滲濾去除清潔劑。對所形成蛋白質-脂肪複合物之分析係藉由SEC-MALLS來進行。使用此方法，形成異質產物。

在實例性第二方法中，將存於6.7 M胍鹽酸鹽、50 mM Tris、10 mM甲硫胺酸中之變性且縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白(pH 8.0)直接1：10(v/v)稀釋至脂化緩衝液中，從而導致2.5 mg/ml之蛋白質濃度。脂化緩衝液係由6 mM膽酸鹽及4.5 mM POPC組成，與60：1之脂肪與蛋白質比率一致。使用此方法，形成均質產物。

d)25% DPPC/75% POPC

因此，如此實例之條目a)中所報導利用以下參數來實施脂肪顆粒形成：蛋白質：縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白

脂化緩衝液：250 mM Tris-HCl，140 mM NaCl，10 mM甲硫胺酸，pH 7.4

脂化：在18℃下

透析：在室溫下

所測試之莫耳比：1：60

脂肪顆粒的形成簡單直接。在下表中顯示SEC結果之總結(百分比係藉由整合AUC來計算)。

使用25% DPPC與75% POPC之脂肪混合物用於縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之脂肪顆粒形成，獲得莫耳比為1：60(蛋白質與磷脂)之均質產物。在下表中，顯示蛋白質與磷脂莫耳比為1：60且具有25% DPPC/75% POPC及縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之脂肪顆粒之蛋白質偶聯分析的總結。

實例5 脂蛋白元之施加 a)DPPC及POPC對LCAT活性之影響

可檢驗包含棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)或二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)以及重組野生型脂蛋白元A-I或四 聯蛋白-脂蛋白元A-I之脂肪顆粒支持藉由LCAT進行之膽固醇酯化的能力。

藉由添加膽固醇乙醇溶液將氚化膽固醇(4%；相對於磷脂醯膽鹼含量，以莫耳計)納入脂肪顆粒中。在37℃下，在存於125 μl(10 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM NaN₃；pH 7.4；2 mg/ml HuFAF白蛋白；4 mM β巰基-乙醇)中之0.2 μg/ml重組LCAT酶(ROAR biochemical)存在下，對所得蛋白質-脂肪複合物支持LCAT催化之膽固醇酯化之能力測試1小時。藉由添加氯仿：甲醇(2：1)來停止反應，且萃取脂肪。在膽固醇-膽固醇酯分離後藉由TLC及閃爍計數計算酯化「百分比」。若將20%或更少之示蹤劑納入所形成之酯中，則在實驗條件下反應速率可視為恆定。 使用XLfit軟體(IDBS)將實例性數據擬合至米曼氏(Michaelis Menten)方程。關於利用具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列及額外N端丙胺酸胺基酸殘基之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白所獲得之結果之可視化，參見圖3。

b)DPPC/POPC混合物對LCAT活性之影響

使用膽酸鹽作為清潔劑，藉由以1：4：80：113莫耳比將重組野生型脂蛋白元A-I與³H-膽固醇、DPPC/POPC混合物及膽酸鹽混合來製備脂肪顆粒。DPPC/POPC混合物含有100% POPC；75% POPC；50% POPC；25% POPC任一者。

藉由透析去除膽酸鹽之後，測試所得蛋白質-脂肪複合物支持LCAT催化之膽固醇酯化之能力。藉由添加膽固醇 乙醇溶液將³H-膽固醇(4%；相對於磷脂醯膽鹼含量，以莫耳計)納入脂肪顆粒中。在37℃下，在存於125 μl(10 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM NaN₃；pH 7.4；2 mg/ml HuFAF白蛋白；4 mM β巰基乙醇)中之0.2 μg/ml重組LCAT酶(ROAR biochemical)存在下，對所得蛋白質-脂肪複合物支持LCAT催化之膽固醇酯化之能力測試1小時。藉由添加氯仿：甲醇(2：1)來停止反應，且萃取脂肪。在膽固醇-膽固醇酯分離後藉由TLC及閃爍計數計算酯化「百分比」。若將小於20%之示蹤劑納入酯中，則在實驗條件下反應速率可視為恆定。對於具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列及額外N端丙胺酸胺基酸殘基之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白，使用XLfit軟體(IDBS)將實例性數據擬合至米曼氏方程並顯示於圖4中。

c)至THP-1源泡沫細胞之膽固醇流出

可藉由將THP-1單核白血病細胞暴露於佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯來獲得如人類THP-1細胞之巨噬細胞隨後，藉由在含有³H-膽固醇示蹤劑之乙醯基化LDL之存在下進一步培養來加載細胞。其後，將該等模型泡沫細胞暴露於膽固醇受體測試化合物，持續4 h-8 h(參見下文)。

收穫細胞培養物上清液且將細胞溶解於5% NP40中。流出分數可計算為上清液中之膽固醇放射性相對於細胞加上清液中之放射性之和的比率。減去自暴露於不含受體之培養基之細胞的流出，且藉由線性擬合來計算流出速度。使用自細胞之流出將流出速度標準化至作為參考之10 μg/ml 野生型脂蛋白元A-I(相對流出速度)。可根據膽固醇受體濃度及擬合至米曼氏方程之數據對在兩個單獨實驗中所獲得之相對流出速度繪圖。

可使用暴露於RXR-LXR激動劑之細胞實施平行實驗，已知該RXR-LXR激動劑上調ABCA-1轉運體，並使膽固醇轉運偏向ABCA-1介導之流出。

在利用具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列及額外N端丙胺酸胺基酸殘基之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白所測試之系列中，僅觀測到對脂肪混合物之適度影響(實例性數據顯示於圖5中)。

d)活體內研究

研究5種包含具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列及額外N端丙胺酸胺基酸殘基之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之脂肪顆粒變體：

i)僅POPC

ii)僅DPPC

iii)POPC：DPPC 3：1

iv)POPC：DPPC 1：1

v)DPPC：SM 9：1

經0.5 h以80 mg/kg對兔進行靜脈內輸注(n=3只兔/測試化合物)，接著在輸注後經96 h連續血液取樣。

利用ELISA分析脂蛋白元含量：

- 藥物含量

- 關於肝酶、膽固醇、膽固醇酯之血漿值之數據。

所測試所有組合物的血漿濃度皆極為相似，該等濃度顯示極短的顯著初始「分佈」期，隨後濃度出現對數線性下降(圖7)。下表顯示具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列及額外N端丙胺酸胺基酸殘基之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之藥物動力學數據。

所測定之藥物動力學(PK)參數對於所有所測試化合物而言均類似。同樣已發現個體間可變性。所測定之半衰期接近於1.5天，即與野生型脂蛋白元A-I相比有所增加。分佈體積類似於血漿體積(在兔中大約40 ml/kg)。

f)膽固醇動員

膽固醇在血漿中經動員並酯化。甚至在四聯蛋白-脂蛋白元A-I已降低之後，血漿膽固醇酯含量仍繼續升高。當血漿四聯蛋白-脂蛋白元A-I含量已降低至0.5 mg/ml(正常野生型脂蛋白元A-I之約50%)時，仍可檢測具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列及額外N端丙胺酸胺基酸殘基之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之升高的膽固醇酯含量(圖8)。

g)肝酶釋放

包含具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列及額外N端丙胺酸胺基酸殘基且含有POPC之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之脂肪顆粒並不誘導肝酶釋放(參見圖1)。類似於兔，含有POPC或POPC/DPPC混合物之四聯蛋白-脂蛋白元A-I之單一靜脈注射在小鼠中係安全的。含有莫耳比為1：3之DPPC：POPC之脂蛋白元組合物與單獨POPC相當(圖9)。

在5種製劑中之任一者中，直至輸注後兩小時才觀測到顯著溶血。在靜脈施加四聯蛋白-脂蛋白元A-I後兩小時所獲得之血漿樣品中，以光度計量方式測定溶血為紅色。使用全血之100%溶血(由0.44% Triton X-100-最終濃度產生)來校準(圖10)。

h)四聯蛋白-脂蛋白元A-I對人類臍靜脈內皮細胞之抗炎效應

將通路5-10 HUVEC(人類臍靜脈內皮細胞)在各別四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白(具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列及額外N端丙胺酸胺基酸殘基之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白)製劑中培育16小時，並用TNFα刺激最後的4小時。利用特異性抗體藉由FACS來檢測VCAM1表面表現。

實例6 脂肪顆粒穩定性

含有N端組胺酸標記及IgA蛋白酶裂解位點之野生型脂 蛋白元A-I可在大腸桿菌中表現並藉由管柱層析法純化，如在上文實例中所報導。藉由IgA蛋白酶裂解去除組胺酸標記，此形成具有SEQ ID NO：02之胺基酸序列及額外N端丙胺酸胺基酸殘基之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白。使用1：150比率之蛋白質與Lipoid S100大豆磷脂之混合物來組裝脂肪顆粒(HDL顆粒)。將顆粒儲存於含有5 mM磷酸鈉及1%蔗糖且pH值為7.3之緩衝液中。在培育後、在脂化後及在培育10天後，SE-HPLC顯示三個不同峰。在40℃下培育後，可檢測到在滯留時間10.8分鐘處之主要峰(47%之總蛋白質)，其在於5℃下儲存之樣品中不存在。10.8分鐘峰指示由於蛋白質去穩定而形成可溶性大分子量組裝體。

亦在5℃及40℃下培育含有具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列及額外N端丙胺酸殘基之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之HDL顆粒，該等HDL顆粒係自POPC：DPPC混合物(POPC與DPPC比率為3：1)開始而獲得。在高溫下培育導致輕微程度之峰前形成，但10.8分鐘處之高分子量組裝體無顯著移動(在11分鐘處<2%增加)。此應指示與含有野生型脂蛋白元A-I之顆粒相比經改良之HDL顆粒穩定性。

實例7 膽固醇動員

將膽固醇動員至血液中之效率可藉由比較在活體內投與脂蛋白元之後總膽固醇與脂蛋白元濃度之各別偏移來測定。對於定量評估，計算總膽固醇之基線校正之濃度-時間曲線下面積(AUC)與脂蛋白元之濃度-時間曲線下面積之 商。

在此實驗中，分析以下物質：-在大腸桿菌中表現並藉由管柱層析法純化之含有N端組胺酸標記及IgA蛋白酶裂解位點之野生型脂蛋白元A-I，如上文實例中所報導；藉由IgA蛋白酶裂解去除組胺酸標記；使用1：150之蛋白質與Lipoid S100大豆磷脂混合物比率組裝脂肪顆粒(HDL顆粒)，-脂蛋白元A-I Milano變體；使用1：40之蛋白質與POPC比率組裝脂肪顆粒(HDL顆粒)，-具有SEQ ID NO：02之四聯蛋白-脂蛋白元A-I；使用1：60之蛋白質與POPC及DPPC比率(POPC及DPPC之比率為3：1)組裝脂肪顆粒(HDL顆粒)。

將三種HDL顆粒施加給大鼠。針對各別AUC比率所獲得之值係顯示於下表中。

圖1 利用5種脂肪組成不同之脂肪顆粒實施之活體內兔研究的結果。上圖：可顯示所製得所有批料之膽固醇動員且因而顯示其效力。下圖：注意到藉由使用DPPC作為單一磷脂生成之脂肪顆粒之肝酶增加。

圖2 本發明之具有POPC及脂蛋白元之脂肪顆粒之SEC-MALLS分析；莫耳比為1：20至1：160。

圖3 DPPC及POPC對LCAT活性之影響。

圖4 含有POPC及/或DPPC之脂肪顆粒中膽固醇酯化之初速度。

圖5 在未經RXR-LXR激動劑致敏之細胞中流出至THP-1源泡沫細胞之膽固醇。

圖6 在使用RXR-LXR激動劑激活ABCA-I途徑之後流出至THP-1源泡沫細胞之膽固醇。

圖7 不同脂蛋白元組合物之時間依賴性血漿濃度。

圖8 血漿中膽固醇動員及酯化之時間及濃度進程。

圖9 小鼠中在單一靜脈注射100 mg/kg後包含本發明脂蛋白元之不同組合物之肝酶釋放的比較。

圖10 活體內兔研究-血漿中之自發溶血。

圖11 具有莫耳比為1：20至1：160之POPC與四聯蛋白-脂蛋白元A-I之脂肪顆粒之SEC-MALLS分析。

圖12 利用經DMPC(二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼)脂化之四聯蛋白-脂蛋白元A-I(1：100)(a)及在PBS中未經脂化 之四聯蛋白-脂蛋白元A-I(b)實施之活體內兔研究的結果。

圖13 在5℃及40℃下儲存之含有野生型脂蛋白元A-I(A)及本文所報導之四聯蛋白-脂蛋白元A-I(B)之脂肪顆粒的SE-HPLC層析圖。

<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份有限公司

<120> 縮短之四聯蛋白(TETRANECTIN)-脂蛋白元A-I融合蛋白、含其之脂肪顆粒及其用途

<130> 30581 FT

<140> 101130533

<141> 2012-08-22

<150> EP11178746

<151> 2011-08-25

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 四聯蛋白-脂蛋白元A-I(1)

<400> 1

<210> 2

<211> 267

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 51

<212> PRT

<213> 智人

<300> 三聚模組

<302>

<310> WO 98/56906

<311> 1998-06-11

<312> 1998-12-17

<313> (1)..(51)

<400> 3

<210> 4

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Claims (19)

1. 一種融合蛋白，其具有SEQ ID NO：01之胺基酸序列或係與SEQ ID NO：01之胺基酸序列具有至少70%序列一致性之變體。
2. 一種脂肪顆粒，其包含如請求項1之融合蛋白。
3. 如請求項2之脂肪顆粒，其包含如請求項1之融合蛋白，磷脂醯膽鹼，及脂肪。
4. 如請求項2至3中任一項之脂肪顆粒，其中其包含如請求項1之融合蛋白，第一磷脂醯膽鹼，及第二磷脂醯膽鹼。
5. 如請求項2至3中任一項之脂肪顆粒，其中其包含1-棕櫚醯基-2-油醯基-磷脂醯膽鹼及1,2-二棕櫚醯基-磷脂醯膽鹼。
6. 如請求項5之脂肪顆粒，其中1-棕櫚醯基-2-油醯基-磷脂醯膽鹼與1,2-二棕櫚醯基-磷脂醯膽鹼之莫耳比係99：1至25：75。
7. 如請求項2、3及6中任一項之脂肪顆粒，其中該融合蛋白係包含三個單體之多聚體。
8. 如請求項2、3及6中任一項之脂肪顆粒，其中其結合至選自由以下組成之群之受體：內皮因子維生素B12受體(cubilin)、清道夫受體(Scavenger receptor)B類1型 (SR-BI)、ATP-結合盒1(ABCA-1)、卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶(LCAT)、膽固醇基-酯轉移蛋白質(CETP)或磷脂轉移蛋白質(PLTP)。
9. 如請求項2、3及6中任一項之脂肪顆粒，其中該脂肪顆粒中每個脂蛋白元單體之磷脂分子數量係40至120。
10. 如請求項9之脂肪顆粒，其中該脂肪顆粒中每個脂蛋白元單體之磷脂分子數量係50至90。
11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之融合蛋白或如請求項2至10中任一項之脂肪顆粒。
12. 一種如請求項1之融合蛋白之用途，其用於製造藥劑。
13. 一種如請求項1之融合蛋白之用途，其用於製造如下藥劑：用於急性冠狀動脈症候群患者之二級預防，或用於預防或治療動脈粥樣硬化，或用於誘導逆向膽固醇轉運及/或斑安定，或用於清除/溶解/穩定個體之血管中之動脈粥樣硬化斑或用於將膽固醇自個體之動脈壁重新分配至肝，或用於預防或治療個體之心瓣狹窄，或用於增加個體中HDL顆粒之數量，或用於起始個體之逆向膽固醇轉運，或用於去除內毒素，或用於預防敗血性休克用於治療心絞痛，或用於治療心肌梗塞，或 用於治療不穩定性心絞痛，或用於治療動脈狹窄，例如外周動脈疾病(PAD)、頸動脈狹窄、腦動脈狹窄或冠狀動脈狹窄，或用於治療血管性癡呆，或用於治療暫時性黑矇。
14. 一種如請求項1之融合蛋白之用途，其用於製造用於治療以下疾病之藥劑：急性冠狀動脈症候群，或動脈粥樣硬化，或個體之血管中之動脈粥樣硬化斑，或個體之心瓣狹窄，或敗血性休克，或心絞痛，或心肌梗塞，或不穩定性心絞痛，或動脈狹窄，或外周動脈疾病(PAD)，或頸動脈狹窄，或腦動脈狹窄，或冠狀動脈狹窄，或血管性癡呆，或暫時性黑矇。
15. 一種如請求項1之融合蛋白之用途，其用於製造用於以下之藥劑： 誘導逆向膽固醇轉運，或誘導斑安定，或清除或溶解或穩定動脈粥樣硬化斑，或將膽固醇自動脈壁重新分配至肝，或增加HDL顆粒之數量，或去除內毒素。
16. 一種如請求項2至10中任一項之脂肪顆粒之用途，其用於製造藥劑。
17. 一種如請求項2至10中任一項之脂肪顆粒之用途，其用於製造如下藥劑：用於急性冠狀動脈症候群患者之二級預防，或用於預防或治療動脈粥樣硬化，或用於誘導逆向膽固醇轉運及/或斑安定，或用於清除/溶解/穩定個體之血管中之動脈粥樣硬化斑或用於將膽固醇自個體之動脈壁重新分配至肝，或用於預防或治療個體之心瓣狹窄，或用於增加個體中HDL顆粒之數量，或用於起始個體之逆向膽固醇轉運，或用於去除內毒素，或用於預防敗血性休克用於治療心絞痛，或用於治療心肌梗塞，或用於治療不穩定性心絞痛，或用於治療動脈狹窄，例如外周動脈疾病(PAD)、頸動 脈狹窄、腦動脈狹窄或冠狀動脈狹窄，或用於治療血管性癡呆，或用於治療暫時性黑矇。
18. 一種如請求項2至10中任一項之脂肪顆粒之用途，其用於製造用於治療以下疾病之藥劑：急性冠狀動脈症候群，或動脈粥樣硬化，或個體之血管中之動脈粥樣硬化斑，或個體之心瓣狹窄，或敗血性休克，或心絞痛，或心肌梗塞，或不穩定性心絞痛，或動脈狹窄，或外周動脈疾病(PAD)，或頸動脈狹窄，或腦動脈狹窄，或冠狀動脈狹窄，或血管性癡呆，或暫時性黑矇。
19. 一種如請求項2至10中任一項之脂肪顆粒之用途，其用於製造用於以下之藥劑：誘導逆向膽固醇轉運，或誘導斑安定，或 清除或溶解或穩定動脈粥樣硬化斑，或將膽固醇自動脈壁重新分配至肝，或增加HDL顆粒之數量，或去除內毒素。