GLP-1类似物融合蛋白,及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一类新型GLP-1类似物融合蛋白,及其制备这种融合蛋白的方法。该类GLP-1类似物融合蛋白用于治疗糖尿病及相关的多种疾病或紊乱。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其类似物例如Exendin-4被广泛的用来研究治疗2型糖尿病,由于GLP-1多肽在体内被蛋白酶二肽基肽酶Ⅳ(DPP-IV)所迅速失活,在血浆中的半衰期很短,使其难以在临床上被广泛使用;而Exendin-4对DPP-Ⅳ的酶降解不敏感,其稳定性增加,但分子量较低(4187.61D),在体内半衰期短,所以每天必须注射两次,这阻碍了在临床上使用。目前许多努力用来解决这个技术难题,例如缓释微球、PEG修饰,脂肪酸链修饰,白蛋白融合。其中白蛋白融合技术在保持目的蛋白的生物学和治疗功能的同时,通过与人白蛋白融合大大提高了其在体内半衰期。
尽管GLP-1类制剂及其衍生物用于治疗糖尿病是现实可行的.但是因为糖尿病患者一经诊断后必须长期持续给药,终生接受治疗,因此对于该类制剂的安全性、经济性和使用便利性的要求都是极其迫切的。但是,现有的GLP-1/HSA融合类制剂还存在很大弊端。
首先,与GLP-1分子相比,白蛋白分子量巨大,因此两者融合后因为空间位阻原因导致GLP-1/HSA融合蛋白基本不具有生物学活性。Albugon是Laurie L.Baggio等设计了一种新的GLP-1/HSA融合蛋白,就是在其两者间插入一个额外的GLP-1分子作为间隔物,但其生物学活性仅仅保留了约1%;生物学活性的下降导致临床剂量的大幅增加(Laurie L.Baggio,Qingling Huang,Theodore J.Brown,and Daniel J.Drucker,DIABETES Vol.53:2492-2500(2004))。例如GLP-1类似物埃塞那肽
![Figure BDA00003606925400011](https://patentimages.storage.googleapis.com/6d/5b/a7/db32f1a6dc2ad4/BDA00003606925400011.png)
临床每次给药剂量仅为5-10微克,每天1-2次,但是Albugon临床有效给药剂量达到4毫克/天,折合成摩尔数增加了近22倍。临床剂量的大幅增加会带来两个问题:1.增加潜在的免疫原性风险。限于注射给药容量问题,剂量增大势必导致药物制剂浓度的增加,如GLP-1类似物制剂Byetta单次给药仅为5-10微克(50微升),浓度仅为0.25毫克/毫升,而临床中Albugon单次剂量达到30毫克/人,制剂浓度高达30-50毫克/毫升。高浓度的蛋白制剂在运输和贮存期间容易造成蛋白质聚体增加。已有的研究表明,治疗用蛋白聚体增加,会增加免疫原性(Anne S.De Groot and David W.Scott,TrendsImmunol Vol.28No.11:482-490)。重组蛋白多聚体会通过交联B细胞受体,激活B细胞增生从而启动B细胞和T细胞免疫(Rosenberg,A.S.Effects of protein aggregates:animmunologic perspective.AAPS J.8:501–507(2006))。而且,重组蛋白多聚体也更容易被抗原递呈细胞(APC)所吞噬,从而加快驱使树突细胞(dendritic cell,DC)的成熟从而激发多种免疫反应。(Anne S.De Groot and David W.Scott,Trends Immunol Vol.28No.11:482-490)。因此,GLP-1/HSA融合蛋白制剂剂量的显著增加必然会导致抗体生成的风险加大;2.GLP-1/HSA融合蛋白类制剂需要通过极其复杂的生物工程技术制备,其单位蛋白量成本高昂,给药剂量的大幅增加将使得药物价格无法被糖尿病患者所承受。
其次,由于GLP-1序列大部分呈无规则卷曲构象,极易受蛋白酶攻击而被降解,因此额外加入的第二个GLP-1使得Albugon更易受到蛋白酶攻击而不稳定。这个不稳定在两个方面都体现了弊端:1.在进行重组表达Albugon时,无论是生产成本低廉的酵母表达系统还是高昂的哺乳动物细胞表达系统,分泌在培养上清中的GLP-1/HSA融合蛋白易受蛋白酶降解,既导致表达量下降,也会产生很多不均一酶解产物而使得最终产物不均一;2.Albugon注射进入体内后在体内循环时也易受蛋白酶降解而失效。
此外,限于制品稳定性问题,目前该类制品都需要低温保存和运输,因此对于糖尿病人外出旅行携带极不方便。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷,设计并制备了一种新型的GLP-1类似物融合蛋白,该融合蛋白由三个区域组成:GLP-1类似物-连接肽-人血清白蛋白(HSA)。与现有产品相比,该融合蛋白具有如下突出优点:
1.更好的热稳定性,可以在室温条件下长期保存而活性不下降,便于病人随身携带使用
2.更好的耐蛋白酶稳定性,在发酵上清及体内稳定性是现有该类融合蛋白的3倍以上,易于工业化制备。
3.更高的生物学活性,其生物学活性是现有该类融合蛋白的10倍以上。
应用本发明制备的包含GLP-1类似物的化合物具有很低的生产成本,更高的生物学活性,更优的体内外稳定性,从而有望成为一类更佳的糖尿病治疗药物。
本发明一方面公开了一种新型的GLP-1类似物融合蛋白,该融合蛋白结构为:GLP-1类似物-连接肽-人血清白蛋白(HSA)。
本发明所述的GLP-1类似物融合蛋白,其结构中第一个区域为GLP-1类似物,其序列如SEQ ID NO:1:HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVK所示,或者至少与其保持85%,90%,95%,或99%的同源性;进一步的,也可包含2个,3个GLP-1或其类似物重复序列;进一步的,第一区域也可以是与GLP-1功能相似的同系物Exendin-4。
天然GLP-1在体内经过加工,成熟肽从该分子切割前6个氨基酸。因此,按照本领域习惯将GLP-1的第一个氨基酸指定为7号。如SEQ ID NO:1中所示对该多肽中的所有氨基酸连续编号。例如,第7位为组氨酸,第8位为甘氨酸。GLP-1序列中的非保守位置可以被其他氨基酸所替换而不改变其活性,如Gly8→Ala,Ser或Cys;Glu9→Asp,Gly,Ser,Cys,Thr,Asp,Gln,Tyr,Ala,Val,Ile,Leu,Met或Phe;Gly10→Ser,Cys,Thr,Asp,Glu,Tyr,Ala,Val,Ile,Leu,Met或Phe;Asp15→Glu;Val16→Leu或Tyr;Ser18→Lys;Glu21→Asp;Gly22→Glu或Ser;Glu23→Arg;Ala24→Arg;Lys26→Gly,Ser,Cys,Thr,Asp,Glu,Tyr,Ala,Val,Ile,Leu,Met,Phe,Arg;Lys34→Gly,Ser,Cys,Thr,Asp,Glu,Tyr,Ala,Val,Ile,Leu,Met,Phe,Arg;Arg36→Gly,Ser,Cys,Thr,Asp,Glu,Tyr,Ala,Val,Ile,Leu,Met,Phe,lys。GLP-1序列C末端亦可以缺失1,2个或3个氨基酸。(WolfgangGlaesner等,美国专利US7452966)。
所述的GLP-1类似物融合蛋白,其结构中第二个区域为一个长度不超过26个氨基酸的连接肽,具有如下通式:(Xaa)x-(Pro)y-(Xaa)z,其中Xaa选自G,A,S中的一种或几种的任意组合,x,y,z均为整数,且x,z≥3,26≥x+y+z≥14,10≥y≥3,1≥y/(x+z)≥0.13。连接肽N端与第一区域C末端以肽键相连,C端与HSA的N端以肽键相连。
Xaa选自G,A,S中的一种或几种的任意组合是指:不同位置的Xaa均可从G,A,S这三种氨基酸残基中任选,不同位置的Xaa可以一致也可以不一致。
进一步的,所述连接肽序列选自:
a)GGGSSPPPGGGGSS(SEQ ID NO:11)
b)GGGSSGGGSSPPPAGGGSSGGGSS(SEQ ID NO:12)
c)GGGAPPPPPPPPPPSSGGG(SEQ ID NO:13)
d)AGGGAAGGGSSGGGPPPPPGGGGS(SEQ ID NO:14)
e)GGSSGAPPPPGGGGS(SEQ ID NO:15)
f)GGGSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)
所述的GLP-1类似物融合蛋白,第三个区域为人血清白蛋白(HSA)。其序列如SEQ ID NO:2所示,或者至少与其保持85%,90%,95%,99%的同源性。HSA序列中的非保守位置可以被其他氨基酸所替换而不改变其活性,如Cys34→Ser;Leu407→Ala;Leu408→Val;Arg408→Val;Val409→Ala;Arg410→Ala;Lys413→Gln;Arg410→Ala(Plumridge等,国际专利WO2011051489)。
SEQ ID NO:2:
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATL
RETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR
YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK
VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYA
EAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE
YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES
LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCK
ADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
在本案的较佳案例中,所述的GLP-1类似物融合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3-5。
a)SEQ ID NO:3:
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGSSPPPGGGGSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFED
HVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRP
EVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRL
KCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKEC
CEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLE
KCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCC
KHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSE
KERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
b)SEQ ID NO:4:
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGAPPPPPPPPPPSSGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQ
CPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLP
RLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISS
KLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTY
ETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKV
GSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADI
CTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
c)SEQ ID NO:5:
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA
FAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK
DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELR
DEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICE
NQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLL
LRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEV
SRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAET
FTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
本发明第二方面,公开了一种多核苷酸,其编码所述GLP-1类似物融合蛋白。
在本案的较佳实例中,所述的GLP-1类似物融合蛋白,其核苷酸编码序列为SEQ ID NO:10,其对应的蛋白序列为SEQ ID NO:5。本发明的GLP-1类似物融合蛋白;其核苷酸编码序列还可为SEQ ID NO:8,其对应的蛋白序列为SEQ ID NO:3;或者为SEQ ID NO:9,其对应的蛋白序列为SEQ ID NO:4。
SEQ ID NO:8.GLP-1类似物融合蛋白核苷酸编码序列
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGT
GAAAGGTGGTGGATCTTCTCCACCACCAGGTGGTGGAGGCTCTTCAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTA
AAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGAT
CATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATC
ACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTG
CAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCA
GAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAG
ACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTG
CTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTC
AAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAA
AGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTG
AATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGC
TGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATT
AGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGT
ATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAG
AAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCA
GAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACA
CCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGT
AAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGA
GAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACAAAATGCTGCACAGAGTCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGG
AAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAG
AAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTTGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAA
AGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGG
GTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTATAA
SEQ ID NO:9.GLP-1类似物融合蛋白核苷酸编码序列
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGT
GAAAGGCGGGGGTGCTCCACCACCACCACCACCACCACCACCACCATCTTCCGGAGGCGGTGATGCACACAAGAGTGAGG
TTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAG
TGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGA
AAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAA
TGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCC
CGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATA
TGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAG
AATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCT
GCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAG
CCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCC
ATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGT
AAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGC
TGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCC
TGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATAT
GAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCT
TGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGC
TATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTG
GGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTT
ATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACAAAATGCTGCACAGAGTCCTTGGTGAACAGGCGACCAT
GCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATA
TGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTTGTGAAACACAAGCCCAAGGCAAC
AAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCT
GCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTATAA
SEQ ID NO:10.GLP-1类似物融合蛋白核苷酸编码序列
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGT
GAAAGGCGGTGGATCTTCTGGTGCTCCACCACCATCTGGTGGTGGAGGCTCTGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGCGGGGGTT
CAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCC
TTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATG
TGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTC
TTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAA
GATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGAC
ATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAA
GGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGG
GATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGC
ATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCA
AAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAA
AATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGT
GGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATG
CTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTG
CTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGT
GTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAG
AGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTC
TCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCT
ATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACAAAATGCTGCACAGAGT
CCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACA
TTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTTGT
GAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCA
AGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTATAA
编码含有GLP-1类似物融合蛋白的核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法;也可以先合成具有GLP-1氨基酸序列的核苷酸序列,然后通过定点突变、定向诱变或以其它本领域熟知的技术来插入、替换、剔除序列以获得所需的核苷酸序列。
编码载体蛋白的核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。在本发明的一个具体实施例中,载体蛋白的核苷酸序列为编码人血清白蛋白的核苷酸序列或至少95%的序列与其一致。
编码GLP-1类似物核苷酸序列和编码载体蛋白的核苷酸序列之间的融合技术见于本领域的一般描述,如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等,科学出版社,1995)
本发明第三方面,公开了一种制备前述融合蛋白的方法,该方法包括:构建含有融合蛋白基因序列的表达载体,然后将含有融合蛋白基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达,从表达产物中分离获得所述的融合蛋白。
构建含有融合蛋白基因序列的表达载体,可通过先合成编码GLP-1类似物的核苷酸序列,而后将此核苷酸序列与编码人血清白蛋白的核苷酸序列融合并构建至合适表达载体中获得。
有表达GLP-1类似物融合蛋白的基因序列可以通过本领域技术人员熟知的表达系统表达,包括但不限于用重组噬菌体、质粒等载体转化的细菌,用酵母表达载体转化的酵母,用真菌载体转化的丝状真菌、用病毒载体感染的昆虫细胞、动物细胞等等。在本发明的一个具体实施例中,表达系统选用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌形式表达,巴斯德毕赤酵母具有高水平表达、成本低、以及具有真核表达系统的蛋白质加工、折叠、翻译后修饰的优点。在具体生产中,细胞可以在实验室中通过摇瓶培养,或者通过发酵罐发酵培养(包括连续、分批、补料分批和固体状态发酵)。
分泌到培养基的融合蛋白可以通过本领域技术人员熟知的方法纯化,包括担不限于超滤、硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、以及离子交换层析、疏水层析、反相层析、分子筛层析等。在本发明的一个具体实施例中,发明者采用联合亲和层析、疏水层析和离子交换层析的三步层析手段使融合蛋白纯化到均一。
本发明第四方面,公开了所述GLP-1类似物融合蛋白在制备治疗糖尿病及相关疾病药物上的用途。
本发明第五方面,公开了一种药物组合物,含有前述GLP-1类似物融合蛋白及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。
所述药物组合物的主要用途为治疗糖尿病及相关疾病。所述相关疾病包括:Ⅱ型糖尿病、Ⅰ型糖尿病、肥胖、Ⅱ型糖尿病患者严重心血管事件和其他严重并发症等(Madsbad S,Kielgast U,Asmar M,et al.Diabetes Obes Metab.2011May;13(5):394-407;Issa CM,AzarST.Curr Diab Rep,2012Oct;12(5):560-567;Neff LM,Kushner RF.Diabetes Metab SyndrObes,2010Jul20;3:263-273;Sivertsen J,Rosenmeier J,Holst JJ,et al.Nat RevCardiol,2012Jan31;9(4):209-222)。
本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)糖类或其衍生物、氨基酸类或其衍生物、表面活性剂,植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、醇类、甘油,各种防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、盐、缓冲液,水、诸如此类也可加入其中,这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性。
本发明的药物组合物可以用本领域技术人员所熟知的技术配制,包括液体或凝胶体,冻干的或其他形式,以产生储存稳定的适合对人或动物给药的药物。
本发明第六方面,公开了一种治疗糖尿病及其相关疾病的方法,为向对象施用本发明的GLP-1类似物融合蛋白。
前述融合蛋白用于治疗包括患有非胰岛素依赖型和胰岛素依赖型糖尿病、肥胖及多种其他疾病患者的方法可参考现有的GLP-1类药物制剂,如
(GLP-1类似肽),
(GLP-1/HSA融合蛋白),
((GLP-1/Fc融合蛋白))等,其使用剂量范围为0.05-1毫克/公斤。
本发明的蛋白质可以单独给药,或以各种组合给药,以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。
本发明使用以下缩写:
GLP-1(glucagon like protein-1)胰高血糖素样肽-1;HSA(human serum albumin)人血清白蛋白。
附图说明
图1不同结构GLP-1类似物融合蛋白表达电泳图,泳道1-9分别为表1所述1-9号序列融合蛋白表达结果。
图2正常恒河猴单次皮下注射GLP-1类似物融合蛋白药效动力学试验
A:GLP-1-E3-HSA皮下注射1天后进行分级葡萄糖输注时恒河猴的血糖水平
B:GLP-1-E3-HSA皮下注射4天后进行分级葡萄糖输注时恒河猴的血糖水平
C:GLP-1-E3-HSA皮下注射1天后进行分级葡萄糖输注时恒河猴的胰岛素水平
D:GLP-1-E3-HSA皮下注射4天后进行分级葡萄糖输注时恒河猴的胰岛素水平
图3猕猴单次给药后药物-时间曲线图
序列说明:
SEQ ID NO:1.GLP-1类似物氨基酸序列
SEQ ID NO:2.HSA氨基酸序列
SEQ ID NO:3.GLP-1类似物融合蛋白氨基酸序列
SEQ ID NO:4.GLP-1类似物融合蛋白氨基酸序列
SEQ ID NO:5.GLP-1类似物融合蛋白氨基酸序列
SEQ ID NO:6.GLP-1类似物核苷酸编码序列
SEQ ID NO:7.HSA核苷酸编码序列
SEQ ID NO:8.GLP-1类似物融合蛋白核苷酸编码序列
SEQ ID NO:9.GLP-1类似物融合蛋白核苷酸编码序列
SEQ ID NO:10.GLP-1类似物融合蛋白核苷酸编码序列
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例1重组融合蛋白表达质粒构建
GLP-1类似物核苷酸编码序列(SEQ ID NO:6):
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAA
1.13′端带HSA融合片段的(GLP-1类似物)2基因片段:
人工合成如下寡核苷酸序列(SEQ ID NO:17):
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGC TGGTGAAACACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCT TGGCTGGTGAAAGATGCACACAAGAGTGAGG
其中,单划线部分为(GLP-1类似物)2基因序列,其余部分为HSA N端部分编码序列。
1.23′端带HSA融合片段的GLP-1类似物-(Gly4Ser)3基因片段
人工合成如下寡核苷酸序列(SEQ ID NO:18):
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGC TGGTGAAAGGTGGTGGAGGCTCTGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGCGGGGGTTCAGATGCACACAAGAGTGAGG
其中,单划线部分为GLP-1类似物-(Gly4Ser)3基因序列,其余部分为HSA N端部分编码序列。
1.33′端带HSA融合片段的GLP-1类似物-(Gly4Ser)4基因片段
人工合成如下寡核苷酸序列(SEQ ID NO:19):
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGC TGGTGAAAGGTGGTGGAGGCTCTGGTGGTGGAGGCTCTGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGCGGGGGTTCAGATGCACACAAGAGTGAGG
其中,单划线部分为GLP-1类似物-(Gly4Ser)4基因序列,其余部分为HSA N端部分编码序列。
1.43′端带HSA融合片段的GLP-1类似物-E1基因片段
人工合成如下寡核苷酸序列(SEQ ID NO:20):
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGC TGGTGAAAGGTGGTGGATCTTCTCCACCACCAGGTGGTGGAGGCTCTTCAGATGCACACAAGAGTGAGG
其中,单划线部分为GLP-1类似物-E1基因序列,其余部分为HSA N端部分编码序列。
1.53′端带HSA融合片段的GLP-1类似物-E2基因片段
人工合成如下寡核苷酸序列(SEQ ID NO:21):
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGC TGGTGAAAGGTGGAGGCTCTTCAGGTGGAGGCTCTTCACCACCACCAGCTGGTGGAGGCTCTTCAGGTGGAGGCTCTTCAGATGCACACAAGAGTGAGG
其中,单划线部分为GLP-1类似物-E2基因序列,其余部分为HSA N端部分编码序列。
1.63′端带HSA融合片段的GLP-1类似物-E3基因片段
人工合成如下寡核苷酸序列(SEQ ID NO:22):
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGC TGGTGAAAGGCGGGGGTGCTCCACCACCACCACCACCACCACCACCACCATCTTCCGGAGGCGGTGATGCACACAAGAGTGAGG
其中,单划线部分为GLP-1类似物-E3基因序列,其余部分为HSA N端部分编码序列。
1.73′端带HSA融合片段的GLP-1类似物-E4基因片段
人工合成如下寡核苷酸序列(SEQ ID NO:23):
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGC TGGTGAAAGCTGGCGGGGGTGCTGCTGGAGGCGGGTCTTCTGGCGGGGGTCCACCACCACCACCAGGAGGCGGGGGTTCAGATGCACACAAGAGTGAGG
其中,单划线部分为GLP-1类似物-E4基因序列,其余部分为HSA N端部分编码序列。
1.83′端带HSA融合片段的GLP-1类似物-E5基因片段
人工合成如下寡核苷酸序列(SEQ ID NO:24):
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGC TGGTGAAAGGTGGATCTTCTGGTGCTCCACCACCACCAGGAGGCGGGGGTTCAGATGCACACAAGAGTGAGG
其中,单划线部分为GLP-1类似物-E5基因序列,其余部分为HSA N端部分编码序列。
1.93′端带HSA融合片段的GLP-1类似物-E6基因片段
人工合成如下寡核苷酸序列(SEQ ID NO:25):
CACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGAGCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGC TGGTGAAAGGCGGTGGATCTTCTGGTGCTCCACCACCATCTGGTGGTGGAGGCTCTGGAGGTGGAGGTTCCGGAGGCGGG GGTTCAGATGCACACAAGAGTGAGG
其中,单划线部分为GLP-1类似物-E6基因序列,其余部分为HSA N端部分编码序列。
E1:GGGSSPPPGGGGSS(SEQ ID NO:11)
E2:GGGSSGGGSSPPPAGGGSSGGGSS(SEQ ID NO:12)
E3:GGGAPPPPPPPPPPSSGGG(SEQ ID NO:13)
E4:AGGGAAGGGSSGGGPPPPPGGGGS(SEQ ID NO:14)
E5:GGSSGAPPPPGGGGS(SEQ ID NO:15)
E6:GGGSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)
注:(Xaa)x-(Pro)y-(Xaa)z,其中Xaa为G,A,S中的一种或几种的任意组合,x,z≥3,26≥x+y+z≥14,10≥y≥3,1≥y/(x+z)≥0.13。连接肽N端与第一区C末端以肽键相连,C端与HSA的N端以肽键相连。
2.HSA基因的扩增
HSA核苷酸编码序列(SEQ ID NO:7):
GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTT
TGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTG
TTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTT
CGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGA
TGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACAT
TTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGG
TATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGA
TGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCAT
GGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAA
GTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAA
TCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGG
AAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCT
GAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCT
GAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGT
TCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAG
TACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTC
AAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTAT
CCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACAAAATGCTGCACAGAGTCC
TTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATT
CACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTTGTGA
AACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAG
GCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTATAA
引物设计:
GLP-1/P1(SEQ ID NO:26):5’-TCTCTCGAGAAAAGACACGGCGAAGGGACCTTTACCAGTG-3’(XhoI酶切位点)
HSA/P1(SEQ ID NO:27):5’-GATGCACACAAGAGTGAGG-3’
HSA/P2(SEQ ID NO:28):5’-TTAGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’(NotI酶切位点)
以Human Serum Albumin/HSA/ALB Gene cDNA Clone/ORF Clone基因(北京义翘神州生物技术有限公司)为模板,HSA/P1与HSA/P2为引物,扩增HSA片断,PCR体系为:模板0.5μl,25μmol/L的HSA/P1与HSA/P2引物各1μl,2mmol/L的dNTP4μl,5xPS反应缓冲液10μl,PrimeStar DNA聚合酶2.5U,ddH2O补充体积至50μl。
PCR条件为:98℃变性10分钟,68℃1分48秒,25个循环后,4℃保温。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳切胶回收分子量约1750bp的条带。
3.融合基因的扩增
3.1(GLP-1类似物)2-HSA融合基因的扩增
将(GLP-1类似物)2基因片段与HSA的PCR产物等摩尔混合作为模板,GLP-1/P1和HSA/P2为引物,扩增(GLP-1类似物)2-HSA,PCR体系为:0.5μl模板,25μmol/L的GLP-1/P1和HSA/P2引物各1μl,2mmol/L的dNTP4μl,5xPS反应缓冲液10μl,PrimeStar DNA聚合酶2.5U,ddH2O补充体积至50μl。PCR条件:98℃10秒,68℃2分30秒,25个循环后4℃保温。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳切胶回收分子量约1950bp的条带。
3.2GLP-1类似物-(Gly4Ser)3-HSA融合基因的扩增
GLP-1类似物-(Gly4Ser)3基因片段与HSA的PCR产物的等摩尔混合物为模板,PCR体系及PCR条件同3.1,PCR产物用琼脂糖凝胶电泳切胶回收分子量约1930bp的条带。
3.3GLP-1类似物-(Gly4Ser)4-HSA融合基因的扩增
GLP-1类似物-(Gly4Ser)4基因片段与HSA的PCR产物的等摩尔混合物为模板,PCR体系及PCR条件同3.1,PCR产物用琼脂糖凝胶电泳切胶回收分子量约1950bp的条带。
3.4GLP-1类似物-E1-HSA融合基因的扩增
GLP-1类似物-E1基因片段与HSA的PCR产物的等摩尔混合物为模板,PCR体系及PCR条件同3.1,PCR产物用琼脂糖凝胶电泳切胶回收分子量约1930bp的条带。
3.5GLP-1类似物-E2-HSA融合基因的扩增
GLP-1类似物-E2基因片段与HSA的PCR产物的等摩尔混合物为模板,PCR体系及PCR条件同3.1,PCR产物用琼脂糖凝胶电泳切胶回收分子量约1960bp的条带。
3.6GLP-1类似物-E3-HSA融合基因的扩增
GLP-1类似物-E3基因片段与HSA的PCR产物的等摩尔混合物为模板,PCR体系及PCR条件同3.1,PCR产物用琼脂糖凝胶电泳切胶回收分子量约1940bp的条带。
3.7GLP-1类似物-E4-HSA融合基因的扩增
GLP-1类似物-E4基因片段与HSA的PCR产物的等摩尔混合物为模板,PCR体系及PCR条件同3.1,PCR产物用琼脂糖凝胶电泳切胶回收分子量约1960bp的条带。
3.8GLP-1类似物-E5-HSA融合基因的扩增
GLP-1类似物-E5基因片段与HSA的PCR产物的等摩尔混合物为模板,PCR体系及PCR条件同3.1,PCR产物用琼脂糖凝胶电泳切胶回收分子量约1930bp的条带。
3.9GLP-1类似物-E6-HSA融合基因的扩增
GLP-1类似物-E6基因片段与HSA的PCR产物的等摩尔混合物为模板,PCR体系及PCR条件同3.1,PCR产物用琼脂糖凝胶电泳切胶回收分子量约1970bp的条带。
4.融合蛋白表达质粒的构建
4.1(GLP-1类似物)2-HSA表达质粒的构建
先对表达载体质粒pPIC9进行XhoI、NotI双酶切。具体条件如下:表达载体质粒pPIC9,10μl;XhoI1μl,NotI1μl,10×酶切缓冲液(H)4μl(购自Takara公司);ddH2O24μl,总体积40μl。(GLP-1类似物)2-HSA片段做同样的双酶切。37℃恒温水浴箱内反应2小时,通过琼脂糖凝胶电泳回收线性化的质粒DNA和(GLP-1类似物)2-HSA基因片段。将回收的载体和基因片段连接构建成融合蛋白表达质粒(GLP-1类似物)2-HSA/pPIC9。连接体系一般为10μl,载体和基因片段的摩尔比为1:2-10,10×T4DNA ligase缓冲液1μl,T4DNA ligase1μl,加无菌水至总体积10μl。连接反应于16℃恒温水浴锅内反应1小时。连接产物转化E.coliTop10感受态细胞,转化克隆斑用通用引物5’AOX1和3’AOX1为引物PCR鉴定,将鉴定正确的克隆的菌液送金斯瑞生物技术公司,使用通用引物5’AOX1和3’AOX1进行测序。经测序验证符合预期。
4.2GLP-1类似物-(Gly4Ser)3-HSA表达质粒的构建
除融合蛋白基因片段采用GLP-1类似物-(Gly4Ser)3-HSA融合基因替代外,其余均同4.1,测序验证符合预期。
4.3GLP-1类似物-(Gly4Ser)4-HSA表达质粒的构建
除融合蛋白基因片段采用GLP-1类似物-(Gly4Ser)4-HSA融合基因替代外,其余均同4.1,测序验证符合预期。
4.4GLP-1类似物-E1-HSA表达质粒的构建
除融合蛋白基因片段采用GLP-1类似物-E1-HSA融合基因替代外,其余均同4.1,测序验证符合预期。
4.5GLP-1类似物-E2-HSA表达质粒的构建
除融合蛋白基因片段采用GLP-1类似物-E2-HSA融合基因替代外,其余均同4.1,测序验证符合预期。
4.6GLP-1类似物-E3-HSA表达质粒的构建
除融合蛋白基因片段采用GLP-1类似物-E3-HSA融合基因替代外,其余均同4.1,测序验证符合预期。
4.7GLP-1类似物-E4-HSA表达质粒的构建
除融合蛋白基因片段采用GLP-1类似物-E4-HSA融合基因替代外,其余均同4.1,测序验证符合预期。
4.8GLP-1类似物-E5-HSA表达质粒的构建
除融合蛋白基因片段采用GLP-1类似物-E5-HSA融合基因替代外,其余均同4.1,测序验证符合预期。
4.9GLP-1类似物-E6-HSA表达质粒的构建
除融合蛋白基因片段采用GLP-1类似物-E6-HSA融合基因替代外,其余均同4.1,测序验证符合预期。
实施例2融合蛋白表达工程菌的构建
分别挑选含有(GLP-1类似物)2-HSA/pPIC9、GLP-1类似物-(Gly4Ser)3-HSA/pPIC9、GLP-1类似物-(Gly4Ser)4-HSA/pPIC9、GLP-1类似物-E1-HSA/pPIC9、GLP-1类似物-E2-HSA/pPIC9、GLP-1类似物-E3-HSA/pPIC9、GLP-1类似物-E4-HSA/pPIC9、GLP-1类似物-E5-HSA/pPIC9、GLP-1类似物-E6-HSA/pPIC9表达载体质粒的细菌克隆,分别提取各表达载体质粒,然后分别用SalI线性化各质粒,通过琼脂糖凝胶电泳回收线性化的各质粒DNA,最后用电转化的方法分别把各线性化质粒转入毕赤酵母GS115感受态细胞中。电击完后马上加入1ml1M山梨醇溶液将菌体混匀,转至1.5ml离心管中,30℃静置1.5小时后将菌体悬液涂布于RDB选择性平板上,每300μl涂布一块平板。将平板置于30℃培养,直至单菌落出现,将获得的阳性菌落转至新鲜的RDB平板上培养24h后,分别挑取在RDB平板上长出对应各GLP-1类似物融合蛋白的单菌落接于10ml BMGY培养基中,30℃、250rpm培养24小时,静置沉淀后弃上清,用10ml BMMY(2%甲醇)重悬,30℃、250rpm诱导48小时,离心取上清进行10%SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达,如果条带大小符合预期,将融合蛋白N端测序,测序结果符合预期的单菌落即为各GLP-1类似物融合蛋白的表达工程菌株。
线性化质粒具体条件如下:表达载体质粒60μl,SalI2.5μl,10x缓冲液(H)20μl,ddH2O补至总体积200μl。37℃恒温水浴箱内反应3小时,
感受态细胞制备具体方法如下:先进行菌体的准备,挑取酵母单菌落,接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中,30℃、250rpm培养过夜。然后取30μl的培养物接种至含有50ml YPD培养基的250ml三角瓶中,30℃、250rpm培养过夜,至OD600达到1-1.5。再将细胞培养物于冰上预冷10min后,于4℃,1500g离心5min,弃上清,用40ml的预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。离心后,再用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。再离心,用5ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,再离心,用80μl的冰预冷的1M山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。
电转化具体方法如下:将10μl线性化质粒与80μl的上述感受态菌体混匀,转至0.2cm冰预冷的电转化杯中。将电转化杯冰浴5min,然后用1500V电压进行电击。
实施例3GLP-1类似物融合蛋白的制备
参考毕赤酵母表达手册(A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteinsin Pichia pastoris.Invitrogen Corporation)将实施例2获得的表达各GLP-1类似物融合蛋白的菌种接种于YPD培养基,30℃220~280rpm振荡培养至菌体湿重约50g/L,按10%接种量进罐(Biostat C10,Sartorius),30℃,pH5.0,30%饱和度溶氧培养20h后连续流加甲醇开始诱导,控制溶氧40%饱和度,诱导4h后将温度降低到22℃,50h后结束诱导,用10000g离心15min收集发酵上清液。
纯化采用BLUE亲和、PHE疏水、DEAE离子交换和凝胶排阻四步层析。首先将发酵上清液用20mM pH7.0磷酸钠溶液稀释3倍,过Blue Sepharose Fast Flow(XK50/20,GE healthcare)亲和层析柱,用PBS平衡后,再用2M NaCl,20mM pH6.5磷酸钠溶液洗脱目的蛋白。向所收蛋白溶液中加入(NH4)2SO4,使终浓度达到0.5M,过PHE Sepharose Fast Flow(XK50/20,GE healthcare)层析柱,经0.6M(NH4)2SO4溶液平衡后,用5mM pH6.5磷酸钠缓冲液洗脱蛋白。将收到的蛋白再用5mM pH6.5磷酸钠缓冲液稀释2倍后过离子交换层析,采用DEAESepharose Fast Flow(XK50/20,GE healthcare)层析柱,直接用PBS洗脱目的蛋白。最后通过Sephadex G25coarse(XK50/60,GE healthcare)凝胶层析柱脱盐置换到5mM pH6.5磷酸钠缓冲液中。将表达上清和纯化的融合蛋白分别用非还原SDS-PAGE分析。如图1所示,不同结构的GLP-1类似物融合蛋白在表达时的稳定性就有较大差异,其中(GLP-1类似物)2-HSA稳定性最差。
实施例4体外活性试验
根据文献(Zlokarnik G,Negulescu PA,Knapp TE,Mere L,Burres N,Feng L,Whitney M,Roemer K,Tsien RY.Science.279(5347):84-8.(1998)),构建带有人GLP-1受体和CRE-Luc报告基因的HEK-293细胞,以50000细胞/孔/200μl含10%FBS的DMEM培养基接种到Costar96孔细胞培养板中。接种后第二天,吸掉培养液,将含500μM IBMX、梯度稀释的GLP-1类似物融合蛋白的无血清DMEM培养液50μl加入各孔,孵育5-6小时后,加入50μl荧光素酶底物(Bright-GloTMLuciferase Assay System,Promega,E2620),反应2分钟,转移到costar96孔全白微孔板中,在多功能酶标仪(SpectraMax M5system,Molecular Device)上测定荧光值,根据荧光值描绘剂量反应曲线,确定EC50值。以(GLP-1类似物)2-HSA的活性为100%计,计算各融合蛋白的相对活性。结果见表1,Gly4Ser作为连接肽,其体外活性与GLP-1类似物作为连接肽基本相似;而当GLP-1类似物与HSA之间插入一段如权利要求1所述的序列后(序列E1-E6),融合蛋白的体外活性提高了7-10倍左右。
表1
融合蛋白 |
相对活性(%) |
标准差 |
1(GLP-1类似物)2-HSA |
100 |
17 |
2GLP-1类似物-(Gly4Ser)3-HSA |
103 |
18 |
3GLP-1类似物-(Gly4Ser)4-HSA |
108 |
22 |
4GLP-1类似物-E1-HSA |
752 |
98 |
5GLP-1类似物-E2-HSA |
823 |
124 |
6GLP-1类似物-E3-HSA |
1108 |
89 |
7GLP-1类似物-E4-HSA |
957 |
141 |
8GLP-1类似物-E5-HSA |
1003 |
125 |
9GLP-1类似物-E6-HSA |
763 |
99 |
实施例5体外稳定性分析
取高度纯化的GLP-1类似物融合蛋白原液,加入适量的氯化钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠,用氢氧化钠或盐酸调pH7.4,再加注射用水使每毫升含GLP-1类似物蛋白5.0mg,氯化钠9mg,磷酸盐20μmol。用0.22μm的PVDF或PES滤膜过滤除菌,100级环境下无菌封装于西林瓶,样品存放于稳定性试验箱,保存温度25℃,在0,1,3个月时取样保存于-70度冰箱待检。合并所有待分析样品检测SDS-PAGE纯度和细胞生物学活性。SDS-PAGE纯度检测方法如实施例1所述,待检样品的上样量为10ug。另上自身对照1ug,0.5ug,0.2ug,0.1ug,0.05ug,经光密度扫描,获得标准曲线,计算各杂蛋白含量百分比,最终算得融合蛋白纯度。体外活性测定方法如实施例4所述,以各样品0个月时活性为100%计。活性测定前样品用Superdex7510/30分子筛柱(GE Healthcare)分离去除分子量小于10000Da的降解片段,避免其对测活的干扰。结果见表2,GLP-1类似物与HSA之间插入GLP-1类似物作为连接肽时,活性保留率最差,融合蛋白最不稳定。
表2
实施例6血清稳定性分析
取纯化后的高浓度GLP-1类似物融合蛋白原液,按体积比1:25加入到猴血清中,过滤除菌,无菌封装到西林瓶中,37℃孵育。于第0天,15天,30天取样保存于-70度冰箱待检。合并所有待分析样品,以Anti-GLP-1单抗(Antibodyshop)为捕捉抗体,Goat anti-HumanAlbumin-HRP(Bethyl Laboratories)为检测抗体通过夹心ELISA法测定融合蛋白浓度。因为捕捉抗体结合于融合蛋白GLP-1类似物部分,检测抗体结合于白蛋白部分,因此测定的融合蛋白浓度与未降解部分含量正相关。结果见表3,30天后猴血清中(GLP-1类似物)2-HSA大部分已经降解,而其他样品保留了将近40%。
表3血清中融合蛋白含量随时间变化情况
注:以0天测定的浓度为100%计。
实施例7小鼠腹腔注射葡萄糖耐受试验
32只KM小鼠,雌雄各半,过夜禁食不禁水18小时,皮下注射1.0mg/kg的HSA(对照组)、(GLP-1类似物)2-HSA、GLP-1类似物-E3-HSA和GLP-1类似物-E6-HSA。给药1、8小时后分别进行腹腔注射葡萄糖耐受试验(IPGTT):腹腔注射1.5g/kg葡萄糖,注射葡萄糖前(t=0)及注射后10、20、30、60、90、120分钟后取血测定血液中葡萄糖含量(YSI2700型生化分析仪)。与对照组(HSA组)比较,(GLP-1类似物)2-HSA、GLP-1类似物-E3-HSA和GLP-1类似物-E6-HSA组小鼠血糖显著降低,血糖曲线峰下面积(AUC0-120min)均显著低于对照组(结果见表4)。其中,给药1小时后进行IPGTT时,三组间各个时间点血糖水平类似,血糖曲线峰下面积(AUC0-120min)也相似,组间无显著性差异(P>0.05);但在给药8小时后进行IPGTT时,10-30min GLP-1类似物-E3-HSA和GLP-1类似物-E6-HSA组的血糖水平要显著低于(GLP-1类似物)2-HSA,血糖AUC0-120min也显著低于(GLP-1类似物)2-HSA组(P<0.01)。结果表明,(GLP-1类似物)2-HSA和GLP-1类似物-E3-HSA均能有效降低小鼠空腹血糖,并具有长效特性,但GLP-1类似物-E3-HSA和GLP-1类似物-E6-HSA组较(GLP-1类似物)2-HSA组具有更显著和持续的降糖效果。
表4KM小鼠单次药后1h和8h IPGTT血糖峰下面积AUC0-120min
实施例8正常恒河猴单次皮下注射GLP-1类似物融合蛋白药效动力学试验
恒河猴单次皮下注射0.5mg/kg的(GLP-1类似物)2-HSA或GLP-1类似物-E3-HSA,24h和96h后进行分级静脉注射葡萄糖试验:静脉注射葡萄糖溶液(20%右旋糖溶液,200mg/ml)10mg/kg/min(3.0ml/kg/h)持续20min,随后给予葡萄糖溶液25mg/kg/min(7.5ml/kg/h)持续20min。葡萄糖注射后0、10、20、30、40min采集血液测定血糖和胰岛素。血糖测定使用YSI2700型生化分析仪,胰岛素测定使用酶联免疫吸附方法(Insulin ELISA试剂盒,DRG International,Inc.)。两组间血糖在药后1d各时间点无显著差异(结果见图2)。,给药后4d时10、30、40min组间有显著差异(P<0.05或P<0.01);组间胰岛素在药后1d和4d的20、40min时间点都具有显著差异(P<0.01)。结果表明,GLP-1类似物-E3-HSA较(GLP-1类似物)2-HSA能更好促进胰岛素分泌,降低正常恒河猴分级静脉注射葡萄糖试验中血糖水平。
实施例9食蟹猴单次给药药物代谢动力学研究
食蟹猴单次皮下注射0.5mg/kg的(GLP-1类似物)2-HSA和GLP-1类似物-E3-HSA,分别于药前(t=0)、药后4、8、12、24、48、72、96、120、144、216h采集血样并分离血清,-80度冷冻保存后合并检验。以Anti-GLP-1单抗(Antibodyshop)为捕捉抗体,Goat anti-HumanAlbumin-HRP(Bethyl Laboratories)为检测抗体测定血清中的融合蛋白浓度(见图3),并计算药物代谢动力学参数(见表5)。研究表明0.5mg/kg的GLP-1类似物-E3-HSA在食蟹猴体内的半衰期为102h(约4d),而(GLP-1类似物)2-HSA半衰期约为60h(2.5d)。
表5
parameters |
(GLP-1类似物)2-HSA |
GLP-1类似物-E3-HSA |
Cmax(ng/ml) |
3954 |
4452 |
Tmax(h) |
24 |
24 |
AUC0-∞(ng/ml*h) |
356210 |
516613 |
T1/2(h) |
60 |
102 |
CL(ml/h/kg) |
1.404 |
0.968 |
实施例10食蟹猴重复皮下给药免疫原性
食蟹猴每周皮下注射一次1mg/kg的(GLP-1类似物)2-HSA和GLP-1类似物-E3-HSA,连续给药3个月。给药前(t=0)、给药后1、2、3个月分别采集血样并分离血清,-80度冰冷冻保存后合并检验。使用酶联免疫吸附方法(ELISA)来测定可能产生的猴抗融合蛋白抗体。以对应的融合蛋白为包被物,加入不同稀释度的待检血清样品,用mouse-anti-monkey IgG为检测抗体来测定抗体的滴度。同时,在相似的测定条件下,待检血清样品中加入人血清白蛋白(终浓度为60μM)作为拮抗物,来进一步分析产生的抗体特异性(见表6)。研究结果显示,多次给药后两者均有抗体生成,最高滴度达到1:6400,而且两者产生的抗体趋势与滴度基本一致。进一步在血清中加入人血清白蛋白(HSA)进行拮抗分析,结果显示存在HSA时血清滴度显著下降,说明所生成的抗体基本均被HSA所拮抗。因此说明猴反复注射融合蛋白后所生成的抗体大部分是针对融合蛋白中的人血清白蛋白部分,而没有生成抗GLP-1类似物部分的抗体。
表6
注抗体滴度<1:100定义为未检出(N.D.)
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