ES2713378T3 - Proteína de fusión de análogo de GLP-1 y método de preparación y uso de la misma - Google Patents

Proteína de fusión de análogo de GLP-1 y método de preparación y uso de la misma Download PDF

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Abstract

Una proteína de fusión de análogo de GLP-1, caracterizada por que una estructura de la proteína de fusión es análoga de GLP-1-péptido conector-seroalbúmina humana, la secuencia de aminoácidos del péptido conector es una cualquiera de las SEQ ID NO. 11-16, un extremo N del péptido conector está conectado con un extremo C del análogo de GLP-1 mediante un enlace peptídico y un extremo C del péptido conector está conectado con un extremo N de la seroalbúmina humana mediante un enlace peptídico, en la que el análogo de GLP-1 es uno cualquiera de los siguientes: a) que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1; b) que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1 en que la Gly de la secuencia en la posición 2 está remplazada por Ala, Ser o Cys y/o Glu en la posición 3 está remplazada por Asp, Gli, Ser, Cys Thr, Asp, Gln, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met o Phe y/o Gly en la posición 4 está remplazada por Ser, Cys, Thr, Asp, Glu, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met o Phe y/o Asp en la posición 9 está remplazada por Glu y/o Val en la posición 10 está remplazada por Leu o Tyr y/o Ser en la posición 12 está remplazada por Lys y/o Glu en la posición 15 está remplazada por Asp y/o Ala en la posición 18 está remplazada por Arg y/o Lys en la posición 20 está remplazada por Gly, Ser, Cys, Thr, Asp, Glu, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe o Arg y/o Lys en la posición 28 está remplazada por Gly, Ser, Cys, Thr, Asp, Glu, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe o Arg sin cambiar la actividad de la misma; c) que comprende 2 o 3 secuencias repetitivas del análogo de GLP-1 de a) o b), o que comprende 2 o 3 secuencias repetitivas de un GLP-1; y d) que es exendina-4 o en la que una secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de análogo de GLP-1 se selecciona de las SEQ ID NO. 3-5.

Description

DESCRIPCION
Protema de fusion de analogo de GLP-1 y metodo de preparacion y uso de la misma
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una protema de fusion de analogo de GLP-1 novedosa y a un metodo para preparar la protema de fusion. La protema de fusion de analogo de GLP-1 se usa para tratar la diabetes y diversas enfermedades relacionadas o disfunciones.
Antecedentes de la invencion
El peptido-1 de tipo glucagon (GLP-1) y analogos del mismo tales como exendina-4 se usan ampliamente por los investigadores en el tratamiento de diabetes de tipo -2. Como los polipeptidos de GLP-1 se inactivan rapidamente in vivo por la proteasa dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) y el periodo de semivida de los polipeptidos de GLP-1 en plasma es muy corta, es diffcil la aplicacion clmica extensiva de polipeptidos de GLP-1. Como la exendina-4 no es sensible a la degradacion enzimatica de DPP-IV, la estabilidad de la misma esta aumentada, sin embargo, la masa molecular es inferior (4187,61 Da) y el periodo de semivida in vivo es corto, se necesitan dos inyecciones cada dfa de modo que se dificulta el uso clmico. Actualmente, se han hecho muchos esfuerzos por resolver el problema tecnico mediante microesferas de liberacion mantenida, modificacion con PEG, modificacion con cadena de acido graso y fusion con albumina, en la que la tecnica de fusion con albumina mantiene las funciones biologicas y curativas de las protemas diana y mejora enormemente de forma simultanea el periodo de semivida in vivo de la misma mediante fusion con albumina humana.
Aunque las preparaciones de GLP-1 y derivados de las mismas son realmente factibles para el tratamiento de la diabetes, se necesita administracion continua a largo plazo una vez se han diagnosticado los pacientes diabeticos, los pacientes diabeticos tienen que aceptar el tratamiento durante toda la vida y, de este modo los requisitos sobre seguridad, econoirna y conveniencia de uso de las preparaciones son extremadamente elevados. Sin embargo, las preparaciones de fusion de GLP-1/HSA existentes tienen enormes defectos.
En primer lugar, en comparacion con las moleculas de GLP-1, la masa molecular de la albumina es grande. Por lo tanto, despues de la fusion de las mismas, debido a la impedancia esterica, las protemas de fusion de GLP-1/HSA no tienen actividad biologica sustancial. Albugon es una nueva protema de fusion de GLP-1/HSA disenada por Laurie L. Baggio, et al., que se caracteriza por que se inserta una molecula de GLP-1 adicional entremedias como un espaciador. Sin embargo, aproximadamente un 1 % unicamente de la actividad biologica de la misma se conserva. La disminucion de la actividad biologica causa el gran aumento de la dosificacion clmica (Laurie L. Baggio, Qingling Huang, Theodore J. Brown y Daniel J. Drucker, DIABETES Vol. 53: 2492-2500 (2004)). Por ejemplo, con respecto a un analogo de GLP-1 Byetta®, la dosificacion de administracion clmica es unicamente de 5-10 |jg por vez y 1-2 veces por dfa. Sin embargo, la dosificacion de administracion eficaz clmica de Albugon alcanza 4 mg por dfa, cuyo numero de moles esta aumentado en aproximadamente 22 veces. El gran aumento de la dosificacion clmica causa los dos siguientes problemas: 1) aumento de los riesgos de inmunogenicidad potencial; El aumento de la dosificacion inevitablemente causa el aumento de la concentracion de preparaciones de medicamentos debido a una limitacion del volumen de administracion, por ejemplo, la dosificacion en una vez de la preparacion de analogo de GLP-1 Byetta es unicamente de 5-10 jg (50 j 1), la concentracion es unicamente de 0,25 mg/ml, sin embargo, la dosificacion en una unica vez clmica de Albugon alcanza 30 mg/persona y la concentracion de la preparacion alcanza hasta 30-50 mg/ml; durante el transporte y almacenamiento de preparaciones de protema de alta concentracion, el contenido de polfmeros protemicos se aumenta facilmente; los investigadores han demostrado que el aumento de los polfmeros protemicos de tratamiento aumentara la inmunogenicidad (Anne S. De Groot y David W. Scott, Trends Immunol Vol. 28 N.° 11:482­ 490); los polfmeros protemicos recombinados activaran la hiperplasia de linfocitos B por entrecruzamiento de receptores de linfocitos B de modo que se posibilita la inmunidad de linfocitos B y linfocitos T (Rosenberg, A.S. Effects of protein aggregates: an immunologic perspective. AAPS J. 8: 501-507 (2006)); ademas, los polfmeros protemicos recombinados se fagocitan facilmente por las celulas presentadoras de antfgeno (APC), de modo que se acelera la madurez de las celulas dendnticas (DC) y, por lo tanto, se estimulan diversas respuestas inmunitarias (Anne S. De Groot y David W. Scott, T rends Immunol Vol. 28 N.° 11:482-490); y por lo tanto, el aumento notable de la dosificacion de las preparaciones de protema de fusion de GLP-1/HSA causara inevitablemente el aumento del riesgo de produccion de anticuerpos; y 2) las preparaciones de protema de fusion de GLP-1/HSA tienen que prepararse usando tecnologfas de bioingeniena extremadamente complejas, el coste por cantidad unitaria de protema es elevado y el gran aumento de la dosificacion de administracion causara que los pacientes diabeticos no puedan permitirse los medicamentos.
En segundo lugar, como la mayona de las secuencias de GLP-1 son irregulares y estan enroscadas y se degradan facilmente debido al ataque por proteasa, un segundo GLP-1 anadido adicional causa que Albugon se vea atacado mas facilmente por proteasa y llegue a ser inestable. La inestabilidad muestra defectos en los dos siguientes aspectos: 1) cuando Albugon se recombina y expresa, independientemente de un sistema de expresion de levadura de bajo coste o un sistema de expresion de celula de m a i^e ro de alto coste, la protema de fusion de GLP-1/HSA secretada en el sobrenadante de cultivo se degrada facilmente por proteasa, y la degradacion no solamente da lugar a la disminucion del nivel de expresion, sino que tambien da lugar a la produccion de muchos hidrolizados enzimaticos no uniformes, de modo que se provoca que los productos finales no sean uniformes; y 2) despues de inyectar Albugon in vivo, Albugon se degrada facilmente por proteasa y llega a ser ineficaz durante la circulacion in vivo.
Ademas, debido a una limitacion de la estabilidad del producto, actualmente todos estos productos tienen que almacenarse y transportarse a baja temperatura y, de ese modo, es muy inconveniente para los pacientes diabeticos llevar los productos cuando estan fuera y viajando.
A partir del documento EP 1 724 284 A2 se conocen protemas de fusion de GLP-1. Estas protemas de fusion comprenden un primer polipeptido con un extremo N y un extremo C fusionado a un segundo polipeptido con un extremo N y un extremo C, en el que el primer polipeptido es un compuesto de GLP-1 y el segundo polipeptido se seleccionadas del grupo que consiste en albumina humana, analogos de albumina humana y fragmentos de albumina humana y en el que el extremo C del primer polipeptido se fusiona al extremo N del segundo polipeptido mediante un conector peptidico.
Sumario de la invencion
El proposito de la presente invencion es superar los defectos de la tecnica anterior, disenar y preparar una protema de fusion de analogo de GLP-1 novedosa, que consiste en tres regiones de la siguiente manera: analogo de GLP-1-peptido conector-HSA (seroalbumina humana). En comparacion con los productos existentes, las notables ventajas de esta protema de fusion son las siguientes:
1. La estabilidad termica es mejor, la protema de fusion puede almacenarse durante un largo plazo a temperatura ambiente sin causar que disminuya la actividad, y la protema de fusion puede transportarse convenientemente con y usarse por los pacientes.
2. La estabilidad resistente a proteasa es mejor, la estabilidad en sobrenadante fermentado e in vivo es mas de 3 veces la de la protema de fusion existente y se facilita la preparacion industrial.
3. La actividad biologica es mayor y la actividad biologica de la misma es mas de 10 veces la de la protema de fusion existente.
Los compuestos que contienen analogos de GLP-1 preparados adoptando la presente invencion tienen las ventajas de coste de produccion muy bajo, mayor actividad biologica y mejor estabilidad in vivo e in vitro, y de este modo se espera que los compuestos lleguen a ser un tipo mejor de medicamentos para el tratamiento de la diabetes.
En un primer aspecto, la presente invencion divulga una protemas de fusion de analogo de GLP-1 novedosa, cuya estructura es analogo de GLP-1-peptido conector-seroalbumina humana (HSA).
En la protema de fusion de analogo de GLP-1 divulgada por la presente invencion, la primera region en la estructura de la misma es un analogo de GLP-1, en el que una secuencia del mismo es como se muestra por la SEQ ID NO. 1: HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVK; ademas, el analogo de GLP-1 tambien puede comprender 2 o 3 secuencias repetitivas de GLP-1 o analogos del mismo; y, ademas, la primera region tambien puede ser un homologo exendina-4 con funciones similares a GLP-1.
Despues de procesar GLP-1 natural in vivo, se cortan los 6 primeros aminoacidos de una molecula peptfdica madura. Por lo tanto, de acuerdo con un habito en la tecnica, un primer aminoacido de GLP-1 se denomina como N.° 7. Como se muestra en la SEQ ID NO. 1, todos los aminoacidos del polipeptido se enumeran de forma continua. Por ejemplo, el 7.° sitio es una histidina y el 8.° es una glicina. Pueden remplazarse posiciones no conservativas en la secuencia de GLP-1 por otros aminoacidos sin cambiar la actividad de la misma. Por ejemplo, G ly8^Ala, Ser o Cys, Glu9^Asp, Gli, Ser, Cys, Thr, Asp, Gln, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met o Phe; Gly10^Ser, Cys, Thr, Asp, Glu, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met o Phe, Asp1S^-Glu, Va116^-Leu o Tyr; Ser18^Lys, Glu21^Asp, Ala24^Arg; Lys26^Gly, Ser, Cys, Thr, Asp, Glu, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Arg; Lys34^Gly, Ser, Cys, Thr, Asp, Glu, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Arg. El extremo C de GLP-1 puede tener una deficiencia de 1,2 o 3 aminoacidos (Wolfgang Glaesner et al., patente de Estados Unidos US7452966).
En la protema de fusion de analogo de GLP-1, la segunda region en la estructura de la misma es un peptido de conexion. Un extremo N del peptido conector se conecta con un extremo C de la primera region mediante un enlace peptfdico, y un extremo C del peptido conector se conecta con el extremo N de la HSA mediante un enlace peptfdico.
Ademas, la secuencia del peptido conector se selecciona de:
Figure imgf000003_0001
Figure imgf000004_0001
En la protema de fusion de analogo de GLP-1, una tercera region en la estructura de la misma es seroalbumina humana (HSA). Una secuencia de la misma es como se muestra por la SEQ ID NO. 2. Pueden remplazarse posiciones no conservativas en la secuencia de HSA por otros aminoacidos sin cambiar la actividad de la misma, tales como Cys34^Ser, Leu407^Ala, Leu408^Val, Val409^Ala, Arg410^Ala, Lys413^-Gln (Plumridge et al., patente internacional WO2011051489). SEQ ID NO. 2:
Figure imgf000004_0002
Una secuencia de aminoacidos de la protema de fusion de analogo de GLP-1 puede seleccionarse de las SEQ ID NO. 3-5.
a) SEQ ID NO. 3:
Figure imgf000004_0003
b)SEQ ID NO. 4:
Figure imgf000005_0001
c) SEQ ID NO. 5:
Figure imgf000005_0002
En un segundo aspecto, la presente invencion divulga un polinucleotido que codifica la protema de fusion de analogo de GLP-1.
En realizaciones preferidas de la presente invencion, una secuencia codificante de nucleotidos de la protema de fusion de analogo de GLP-1 es la SEQ ID NO. 10 y una secuencia protemica correspondiente de la misma es la SEQ ID NO. 5. La secuencia codificante de nucleotidos de la protema de fusion de analogo de GLP-1 divulgada por la presente invencion tambien puede ser la SEQ ID NO. 8 y la secuencia protemica correspondiente de la misma es la SEQ ID NO. 3; o la secuencia codificante de nucleotidos es la SEQ ID NO. 9 y la secuencia protemica correspondiente de la misma es la SEQ ID NO. 4.
SEQ ID NO. 8: secuencia codificante de nucleotidos de la protema de fusion de analogo de GLP-1
Figure imgf000006_0001
SEQ ID NO. 9: secuencia codificante de nucleotidos de la protema de fusion de analogo de GLP-1
Figure imgf000007_0001
SEQ ID NO. 10: secuencia codificante de nucleotidos de la protema de fusion de analogo de GLP-1
Figure imgf000008_0001
La secuencia de nucleotidos que codifica la protema de fusion de analogo de GLP-1 puede prepararse mediante cualquier tecnica apropiada bien conocida por los expertos en la materia incluyendo, aunque sin limitacion, tecnica de ADN recombinante, smtesis qmmica y similares; y tambien, en primer lugar puede sintetizarse una secuencia de nucleotidos que tiene una secuencia de aminoacidos de GLP-1 y despues las secuencias se interponen, remplazan o eliminan mediante mutacion dirigida al sitio, mutagenesis dirigida u otras tecnicas bien conocidas en la tecnica para obtener la secuencia de nucleotidos necesaria.
La secuencia de nucleotidos que codifica la protema transportadora puede prepararse mediante cualquier tecnica apropiada bien conocida para los expertos en la materia. En una realizacion espedfica de la presente invencion, la secuencia de nucleotidos de la protema transportadora es una secuencia de nucleotidos que codifica HSA o al menos mantiene un 95 % de consistencia con la secuencia de nucleotidos que codifica HSA.
Para una tecnica de fusion entre la secuencia de nucleotidos que codifica el analogo de GLP-1 y la secuencia de nucleotidos que codifica la protema transportadora, vease la descripcion general en la tecnica, tal como Molecular Cloning (J. Sambrook et al., Science Press, 1995).
En un tercer aspecto, la presente invencion divulga un metodo para preparar la protema de fusion mencionada anteriormente. El metodo comprende las siguientes etapas: construir un vector de expresion que contiene una secuencia genica de la protema de fusion, despues transformar el vector de expresion que contiene la secuencia genica de la protema de fusion en una celula hospedadora para la expresion inducida y separar y obtener la protema de fusion de los productos de expresion.
El vector de expresion para construir la secuencia genica que contiene la protema de fusion puede obtenerse sintetizando en primer lugar la secuencia de nucleotidos que codifica el analogo de GLP-1, despues fusionando la secuencia de nucleotidos con la secuencia de nucleotidos que codifica HSA y finalmente construyendo un vector de expresion apropiado.
La secuencia genica que expresa la protema de fusion de analogo de GLP-1 puede expresarse mediante sistemas de expresion bien conocidos para los expertos en la materia incluyendo, aunque sin limitacion, bacterias transformadas usando vectores tales como fagos recombinantes y plasmidos, levadura transformada usando vectores de expresion de levadura, hongos filamentosos transformados usando vectores de hongos, celulas de insecto y celulas animales infectadas usando vectores vmcos y similares. En una realizacion espedfica de la presente invencion, la sistema de expresion selecciona y uso expresion de secrecion de Pichia pastoris. Pichia pastoris tiene un alto nivel de expresion y es de bajo coste y tiene las ventajas de procesamiento, plegamiento y modificacion postraduccional de protemas de un sistema de expresion eucariota. Durante la produccion real, las celulas pueden cultivarse mediante un matraz de agitacion en un laboratorio o pueden cultivarse mediante fermentacion en un tanque de fermentacion (incluyendo fermentacion continua, discontinua, semicontinua y en estado solido).
La protema de fusion que se secreta al medio de cultivo puede purificarse mediante metodos bien conocidos por los expertos en la materia incluyendo, aunque sin limitacion, ultrafiltracion, precipitacion en sulfato de amonio, precipitacion con acetona, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa hidrofoba, cromatograffa de fase inversa, cromatograffa en tamiz molecular y similares. En una realizacion espedfica de la presente invencion, el autor de la invencion adopta un medio cromatografico de tres etapas que une cromatograffa de afinidad, cromatograffa hidrofoba y cromatograffa de intercambio ionico para posibilitar que la protema de fusion se purifique uniformemente.
En un cuarto aspecto, la presente invencion divulga la protema de fusion de analogo de GLP-1 para su uso como medicamento.
En un quinto aspecto, la presente invencion divulga una composicion farmaceutica que contiene la protema de fusion de analogo de GLP-1 y al menos un vetffculo o excipiente farmaceuticamente aceptable.
La composicion farmaceutica se usa principalmente para tratar la diabetes y enfermedades relacionadas.
En un sexto aspecto, la presente invencion divulga una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas con diabetes, que contiene la protema de fusion de analogo de GLP-1 y al menos un vetffculo o excipiente farmaceuticamente aceptable.
Las enfermedades relacionadas incluyen diabetes de tipo-2, diabetes de tipo-1, obesidad, eventos cardiovasculares graves de pacientes que padecen diabetes de tipo-2 y otras complicaciones graves (Madsbad S, Kielgast U, Asmar M, et al. Diabetes Obes Metab. mayo de 2011;13(5):394-4o7;Issa CM, Azar ST.Curr Diab Rep, octubre de 2012;12(5):560-567; Neff LM, Kushner RF. Diabetes Metab Syndr Obes, 20 de julio de 2010;3:263-273;Sivertsen J, Rosenmeier J, Holst JJ, et al. Nat Rev Cardiol, 31 de enero de 2012;9(4):209-222).
Los vehffculos inorganicos u organicos inactivos bien conocidos para los expertos en la materia incluyen (aunque sin limitacion) sacaridos y derivados de los mismos, aminoacidos o derivados de los mismos, tensioactivos, aceite vegetal, cera, grasa y compuestos polihidroxi tales como polietilenglicol, alcoholes, glicerol, diversos conservantes, antioxidantes, estabilizantes, sales, solucion tamponante, agua y similares que pueden anadirse a los mismos, y estas sustancias se usan para mejorar la estabilidad de la composicion o mejorar la actividad o eficacia biologica de la misma de acuerdo con las necesidades.
La composicion farmaceutica divulgada por la presente invencion puede prepararse adoptando tecnicas bien conocidas para los expertos en la materia, incluyendo formas ffquidas o en gel, liofilizadas u otras formas, para producir medicamentos que sean estables durante el almacenamiento y sean adecuadas para su administracion a seres humanos o animales.
En un septimo aspecto, la presente invencion divulga la protema de fusion de analogo de GLP-1 para su uso en el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas con diabetes.
Para la protema de fusion mencionada anteriormente para su uso en el tratamiento de pacientes que padecen diabetes no insulinodependiente o insulinodependiente, obesidad y otras diversas enfermedades, puede hacerse una referencia a las preparaciones medicinales de GLP-1 existentes tales como Byetta® (peptido analogo de GLP-1), Albugon® (protema de fusion de GLP-1/HSA) y Dulaglutide® (protema de fusion de GLP-1/Fc, y el intervalo de dosificacion de las mismas es de 0,05-1 mg/kg.
La protema divulgada por la presente invencion puede administrarse en solitario, administrate mediante diversas combinaciones o administrarse junto con otras preparaciones de tratamiento.
En la presente invencion, se usan las siguientes abreviaturas:
GLP-1 (protema-1 de tipo glucagon); HSA (seroalbumina humana)
Descripcion de los dibujos
La fig. 1 ilustra un SDS-PAGE de la expresion de protemas de fusion de analogo de GLP-1 con diferentes estructuras, en la que los carriles 1-9 son respectivamente los resultados de expresion de protemas de fusion con las secuencias n.° 1-9.
Las fig. 2A-D ilustran los resultados de un ensayo farmacodinamico de una protema de fusion de analogo de GLP-1 despues de inyeccion subcutanea de una unica dosis en un macaco de la India normal, en la que
La fig. 2A ilustra los niveles de glucosa en sangre de un macaco de la India durante la infusion gradual de glucosa despues de 1 dfa tras inyeccion subcutanea de GLP-1-E3-HSA.
La fig. 2B ilustra los niveles de glucosa en sangre de un macaco de la India durante la infusion gradual de glucosa despues de 4 dfa tras inyeccion subcutanea de GLP-1-E3-HSA.
La fig. 2C ilustra los niveles de insulina de un macaco de la India durante la infusion gradual de glucosa despues de 1 dfa tras inyeccion subcutanea de GLP-1-E3-HSA.
La fig. 2D ilustra los niveles de insulina de un macaco de la India durante la infusion gradual de glucosa despues de 4 dfa tras inyeccion subcutanea de GLP-1-E3-HSA.
La fig. 3 ilustra un grafico de la curva de concentracion-tiempo despues de administracion de una unica dosis a un macaco de la India.
DESCRIPCION DE SECUENCIAS:
SEQ ID NO. 1: secuencia de aminoacidos de analogo de GLP-1
SEQ ID NO.2: Secuencia de aminoacidos de HSA
SEQ ID NO.3: Secuencia de aminoacidos de protema de fusion de analogo de GLP-1
SEQ ID NO.4: Secuencia de aminoacidos de protema de fusion de analogo de GLP-1
SEQ ID NO.5: Secuencia de aminoacidos de protema de fusion de analogo de GLP-1
SEQ ID NO. 6: Secuencia codificante de nucleotidos de analogo de GLP-1
SEQ ID NO. 7: Secuencia codificante de nucleotidos de HSA
SEQ ID NO.8: secuencia codificante de nucleotidos de la protema de fusion de analogo de GLP-1
SEQ ID NO.9: secuencia codificante de nucleotidos de la protema de fusion de analogo de GLP-1
SEQ ID NO. 10: secuencia codificante de nucleotidos de la protema de fusion de analogo de GLP-1
DESCRIPCION DE LAS REALIZACIONES
La presente invencion se describira a continuacion mediante realizaciones espedficas. Un experto en la materia puede entender facilmente otras ventajas y eficacias de la presente invencion de acuerdo con los contenidos divulgados por la descripcion. La presente invencion tambien puede implementarse o aplicarse mediante otras realizaciones espedficas diferentes. Pueden hacerse diversas modificaciones o cambios a todos los detalles en la descripcion basandose en diferentes puntos de vista y aplicaciones sin alejarse del espmtu de la presente invencion.
Salvo que se indique de otro modo, los metodos experimentales, metodos de deteccion, metodos de preparacion divulgados por la presente invencion adoptan las tecnicas convencionales de biologfa molecular, bioqmmica, estructura de cromatina y analisis, qmmica analttica, cultivo celular, ADN recombinante en la tecnica y tecnicas convencionales en tecnicas relacionadas.
Realizacion 1: construccion de plasmido de expresion de protema de fusion recombinante
Secuencia codificante de nucleotidos de analogo de GLP-1 (SEQ ID NO. 6):
Figure imgf000011_0001
1.1 Segmento genico de (analogo de GLP-1)2 con un segmento de fusion de HSA en el extremo 3':
Se sintetizo de forma artificial una secuencia oligonucleotidica (SEQ ID NO. 17) de la siguiente manera:
Figure imgf000011_0002
en la que la parte marcada con una lmea es una secuencia genica de (analogo de GLP-1)2 y la otra parte es una secuencia codificante del extremo N de HSA.
1.2 Segmento genico de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)3 con un segmento de fusion de HSA en el extremo 3':
Se sintetizo de forma artificial una secuencia oligonucleotidica (SEQ ID NO. 18) de la siguiente manera:
Figure imgf000011_0003
en la que la parte marcada con una lmea es una secuencia genica de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)3 y la otra parte es una secuencia codificante del extremo N de HSA.
1.3 Segmento genico de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)4 con un segmento de fusion de HSA en el extremo 3':
Se sintetizo de forma artificial una secuencia oligonucleotidica (SEQ ID NO. 19) de la siguiente manera:
Figure imgf000011_0004
en la que la parte marcada con una lmea es una secuencia genica de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)4 y la otra parte es una secuencia codificante del extremo N de HSA.
1.4 Segmento genico de analogo de GLP-1-EI con un segmento de fusion de HSA en el extremo 3':
Se sintetizo de forma artificial una secuencia oligonucleotidica (SEQ ID NO. 20) de la siguiente manera:
Figure imgf000011_0005
en la que la parte marcada con una lmea es una secuencia genica de analogo de GLP-1-EI y la otra parte es una secuencia codificante del extremo N de HSA.
1.5 Segmento genico de analogo de GLP-1-E2 con un segmento de fusion de HSA en el extremo 3':
Se sintetizo de forma artificial una secuencia oligonucleotidica (SEQ ID NO. 21) de la siguiente manera:
Figure imgf000012_0001
en la que la parte marcada con una lmea es una secuencia genica de analogo de GLP-1-E2 y la otra parte es una secuencia codificante del extremo N de HSA.
1.6 Segmento genico de analogo de GLP-1-E3 con un segmento de fusion de HSA en el extremo 3':
Se sintetizo de forma artificial una secuencia oligonucleotidica (SEQ ID NO. 22) de la siguiente manera:
Figure imgf000012_0002
en la que la parte marcada con una lmea es una secuencia genica de analogo de GLP-1-E3 y la otra parte es una secuencia codificante del extremo N de HSA.
1.7 Segmento genico de analogo de GLP-1-E4 con un segmento de fusion de HSA en el extremo 3':
Se sintetizo de forma artificial una secuencia oligonucleotidica (SEQ ID NO. 23) de la siguiente manera:
Figure imgf000012_0003
en la que la parte marcada con una lmea es una secuencia genica de analogo de GLP-1-E4 y la otra parte es una secuencia codificante del extremo N de HSA.
1.8 Segmento genico de analogo de GLP-1-E5 con un segmento de fusion de HSA en el extremo 3':
Se sintetizo de forma artificial una secuencia oligonucleotidica (SEQ ID NO. 24) de la siguiente manera:
Figure imgf000012_0004
en la que la parte marcada con una lmea es una secuencia genica de analogo de GLP-1-E5 y la otra parte es una secuencia codificante del extremo N de HSA.
1.9 Segmento genico de analogo de GLP-1-E6 con un segmento de fusion de HSA en el extremo 3':
Se sintetizo de forma artificial una secuencia oligonucleotidica (SEQ ID NO. 25) de la siguiente manera:
Figure imgf000012_0005
en la que la parte marcada con una lmea es una secuencia genica de analogo de GLP-1-E6 y la otra parte es una secuencia codificante del extremo N de HSA.
E1: GGGSSPPPGGGGSS (SEQ ID NO. 11)
E2: GGGSSGGGSSPPPAGGGSSGGGSS (SEQ ID NO. 12)
E3: GGGAPPPPPPPPPPSSGGG (SEQ ID NO. 13)
E4: AGGGAAGGGSSGGGPPPPPGGGGS (SEQ ID NO. 14)
E5: GGSSGAPPPPGGGGS (SEQ ID NO. 15)
E6: GGGSSGAPPPSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO. 16)
Notas: (Xaa)x-(Pro)y-(Xaa)z, en la que Xaa es uno o cualquier combinacion de una pluralidad de G, A y S, x, z>3, 26>x+y+z>14, 10>y>3 y 1>y/(x+z)>0,13. Un extremo N del peptido de conexion se conecta con un extremo C de la primera region mediante un enlace peptidico, y un extremo C del peptido de conexion se conecta con un extremo N de la HSA mediante un enlace peptidico.
Figure imgf000013_0002
2. Amplificacion del gen de HSA
Secuencia codificante de nucleotidos de HSA (SEQ ID NO. 7):
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Diseno de cebador:
GLP-1/P1 (SEQ ID NO. 26): 5' -TCTCTCGAGAAAAGACACGGCGAAGGGACCTTTACCA GTG-3' (sitio de restriccion para la enzima XhoI)
HSA/P1 (SEQ ID NO. 27): 5' -GAT G CACACAAGAGT GAGG-3'
HSA/P2 (SEQ ID NO. 28): 5' -TTAGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3' -(sitio de restriccion para la enzima Notl)
Se uso clon de ADNc del gen de seroalbumina humana/HSA/ALB/gen del clon de ORF (Sino Biological Inc.) como molde, se usaron HSA/P1 y HSA/P2 como cebadores, se amplifico un segmento de HSA y un sistema de PCR que inclma 0,5 j l de molde, 1 j l de 25 jmol/l HSA/P1 y HSA/P2, respectivamente, 4 j l de 2 mmol/l de dNTP, 10 j l de solucion de tampon de reaccion PS 5x, 2,5 U de ADN polimerasa PrimerStar y se anadio ddH2O hasta 50 jl.
Las condiciones de PCR inclman desnaturalizacion durante 10 min a 98 °C y 1 min y 48 s a 68 °C, 25 ciclos y despues conservacion con calor a 4 °C. Para los productos de PCR, se recuperaron bandas con masa molecular de aproximadamente 1750 pb mediante extraccion de gel usando electroforesis en gel de agarosa.
3. Amplificacion del gen de fusion
3.1 Amplificacion del gen de fusion de (analogo de GLP-1)2-HSA
Se uso mezcla de segmentos genicos de (analogo de GLP-1)2 y productos de PCR de HSA mezclados en igualdad de moles como molde, se usaron GLP-1/P1 y HSA/P2 como cebadores, se amplifico (analogo de GLP-1)2-HSA y un sistema de PCR que inclma 0,5 j l de molde, 1 j l de 25 jmol/l de GLP-1/P1 y HSA/P2 respectivamente, 4 j l de 2 mmol/l de dNTP, 10 j l de solucion de tampon de reaccion PS 5x, 2,5 U de ADN polimerasa PrimerStar y se anadio ddH2O hasta 50 jl. Las condiciones de p Cr inclman 10 s a 98 °C y 2 min y 30 s a 68 °C, 25 ciclos y despues conservacion con calor a 4 °C. Para los productos de PCR, se recuperaron bandas con masa molecular de aproximadamente 1950 pb mediante extraccion de gel usando electroforesis en gel de agarosa.
3.2 Amplificacion del gen de fusion de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)3-HSA
Se uso mezcla de segmentos genicos de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)3 y productos de PCR de HSA mezclados en igualdad de moles como molde, un sistema de PCR y las condiciones de PCR fueron las mismas que las de 3.1, y para los productos de PCR, se recuperaron bandas con masa molecular de aproximadamente 1930 pb mediante extraccion de gel usando electroforesis en gel de agarosa.
3.3 Amplificacion del gen de fusion de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)4-HSA
Se uso mezcla de segmentos genicos de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)4 y productos de PCR de HSA mezclados en igualdad de moles como molde, un sistema de PCR y las condiciones de PCR fueron las mismas que las de 3.1, y para los productos de PCR, se recuperaron bandas con masa molecular de aproximadamente 1950 pb mediante extraccion de gel usando electroforesis en gel de agarosa.
3.4 Amplificacion del gen de fusion de analogo de GLP-1-El-HSA
Se uso mezcla de segmentos genicos de analogo de GLP-1-EI y productos de PCR de HSA mezclados en igualdad de moles como molde, un sistema de PCR y las condiciones de PCR fueron las mismas que las de 3.1, y para los productos de PCR, se recuperaron bandas con masa molecular de aproximadamente 1930 pb mediante extraccion de gel usando electroforesis en gel de agarosa.
3.5 Amplificacion del gen de fusion de analogo de GLP-1-E2-HSA
Se uso mezcla de segmentos genicos de analogo de GLP-1-E2 y productos de PCR de HSA mezclados en igualdad de moles como molde, un sistema de PCR y las condiciones de PCR fueron las mismas que las de 3.1, y para los productos de PCR, se recuperaron bandas con masa molecular de aproximadamente 1960 pb mediante extraccion de gel usando electroforesis en gel de agarosa.
3.6 Amplificacion del gen de fusion de analogo de GLP-1-E3-HSA
Se uso mezcla de segmentos genicos de analogo de GLP-1-E3 y productos de PCR de HSA mezclados en igualdad de moles como molde, un sistema de PCR y las condiciones de PCR fueron las mismas que las de 3.1, y para los productos de PCR, se recuperaron bandas con masa molecular de aproximadamente 1940 pb mediante extraccion de gel usando electroforesis en gel de agarosa.
3.7 Amplificacion del gen de fusion de analogo de GLP-1-E4-HSA
Se uso mezcla de segmentos genicos de analogo de GLP-1-E4 y productos de PCR de HSA mezclados en igualdad de moles como molde, un sistema de PCR y las condiciones de PCR fueron las mismas que las de 3.1, y para los productos de PCR, se recuperaron bandas con masa molecular de aproximadamente 1960 pb mediante extraccion de gel usando electroforesis en gel de agarosa.
3.8 Amplificacion del gen de fusion de analogo de GLP-1-E5-HSA
Se uso mezcla de segmentos genicos de analogo de GLP-1-E5 y productos de PCR de HSA mezclados en igualdad de moles como molde, un sistema de PCR y las condiciones de PCR fueron las mismas que las de 3.1, y para los productos de PCR, se recuperaron bandas con masa molecular de aproximadamente 1930 pb mediante extraccion de gel usando electroforesis en gel de agarosa.
3.9 Amplificacion del gen de fusion de analogo de GLP-1-E6-HSA
Se uso mezcla de segmentos genicos de analogo de GLP-1-E6 y productos de PCR de HSA mezclados en igualdad de moles como molde, un sistema de PCR y las condiciones de PCR fueron las mismas que las de 3.1, y para los productos de PCR, se recuperaron bandas con masa molecular de aproximadamente 1970 pb mediante extraccion de gel usando electroforesis en gel de agarosa.
4. Construccion de plasmido de expresion de protema de fusion
4.1 Construccion de plasmido de expresion de (analogo de GLP-1)2-HSA
En primer lugar, se realizo restriccion con dos enzimas Xhol y Notl en un plasmido de vector de expresion pPIC9. Las condiciones espedficas fueron las siguientes: 10 pl del plasmido de vector de expresion pPIC9; 1 pl de Xhol, 1 pl de Notl y 4 pl de solucion de tampon de restriccion enzimatica 10x (H) (adquirido de Takara); t 24 pl de ddH2O y un volumen total de 40 pl. Se realizo restriccion similar con dos enzimas en un segmento de (analogo de GLP-1)2-HSA. Se realizo reaccion durante 2 h en un bano de agua de temperatura constante a 37 °C, y se recupero el ADN plasirndico linealizado y el segmento genico de (analogo de GLP-1)2-HSA mediante electroforesis en gel de agarosa. El vector y el segmento genico recuperados se ligaron para construir un plasmido de expresion de protema de fusion (analogo de GLP-1)2-HSA/pPIC9. Un sistema de ligamiento en general era de 10 pl de volumen, siendo la relacion molar del vector a los segmentos genicos de 1: (2-10), incluyendo 1 pl de solucion de tampon de ADN ligasa T4 10x, 1 pl de ADN ligasa T4 y agua esteril anadida hasta 10 pl. Se realizo reaccion de ligamiento durante 1 h en un bano de agua de temperatura constante a 16 °C. Los productos de ligamiento se transformaron en celulas competentes de E. coli Top10, las placas de clones transformados se sometieron a identificacion por PCR usando los cebadores generales 5' AOX1 y 3' AOX1 como cebadores, la solucion de bacterias clonadas identificadas correctamente se suministro a GenScript Corporation y se realizo secuenciacion usando los cebadores generales 5' AOX1 y 3' AOX1. Como se verifico por la secuenciacion, se cumplio lo esperado.
4.2 Construccion de plasmido de expresion de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)3-HSA
Excepto por el segmento genico de la protema de fusion que se remplazo por un gen de fusion de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)3-HSA, lo demas fue igual que en 4.1, y como se verifico por la secuenciacion, se cumplio lo esperado.
4.3 Construccion de plasmido de expresion de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)4-HSA
Excepto por el segmento genico de la protema de fusion que se remplazo por un gen de fusion de analogo de GLP-1-(Gly4Ser)4-HSA, lo demas fue igual que en 4.1, y como se verifico por la secuenciacion, se cumplio lo esperado.
4.4 Construccion de plasmido de expresion de analogo de GLP-1-E1-HSA
Excepto por el segmento genico de la protema de fusion que se remplazo por un gen de fusion de analogo de GLP-1-E1-HSA, lo demas fue igual que en 4.1, y como se verifico por la secuenciacion, se cumplio lo esperado.
4.5 Construccion de plasmido de expresion de analogo de GLP-1-E2-HSA
Excepto por el segmento genico de la protema de fusion que se remplazo por un gen de fusion de analogo de GLP-1-E2-HSA, lo demas fue igual que en 4.1, y como se verifico por la secuenciacion, se cumplio lo esperado.
4.6 Construccion de plasmido de expresion de analogo de GLP-1-E3-HSA
Excepto por el segmento genico de la protema de fusion que se remplazo por un gen de fusion de analogo de GLP-1-E3-HSA, lo demas fue igual que en 4.1, y como se verifico por la secuenciacion, se cumplio lo esperado.
4.7 Construccion de plasmido de expresion de analogo de GLP-1-E4-HSA
Excepto por el segmento genico de la protema de fusion que se remplazo por un gen de fusion de analogo de GLP-1-E4-HSA, lo demas fue igual que en 4.1, y como se verifico por la secuenciacion, se cumplio lo esperado.
4.8 Construccion de plasmido de expresion de analogo de GLP-1-E5-HSA
Excepto por el segmento genico de la protema de fusion que se remplazo por un gen de fusion de analogo de GLP-1-E5-HSA, lo demas fue igual que en 4.1, y como se verifico por la secuenciacion, se cumplio lo esperado.
4.9 Construccion de plasmido de expresion de analogo de GLP-1-E6-HSA
Excepto por el segmento genico de la protema de fusion que se remplazo por un gen de fusion de analogo de GLP-1-E6-HSA, lo demas fue igual que en 4.1, y como se verifico por la secuenciacion, se cumplio lo esperado.
Realizacion 2: construccion de bacterias genomanipuladas para expresion de la protema de fusion
Se seleccionaron clones que conteman respectivamente los plasmidos de vector de expresion (analogo de GLP-1)2-HSA/pPIC9, analogo de GLP-1-(Gly4Ser)3-HsA/pPIC9, analogo de GLP-1-(Gly4Ser)4-HSA/pPIC9, analogo de GLP-1-E1-HSA/pPIC9, analogo de GLP-1-E2-HSA/pPIC9, analogo de GLP-1-E3-HSA/pPIC9, analogo de GLP-1-E4-HSA/pPIC9, analogo de GLP-1-E5-HSA/pPIC9 y analogo de GLP-1-E6-HSA/pPIC9. Los plasmidos de vector de expresion se extrajeron respectivamente, despues se linealizaron respectivamente usando SalI. El ADN plasmfdico linealizado se recupero respectivamente mediante electroforesis en gel de agarosa y, finalmente, se transformaron respectivamente en celulas competentes de Pichia pastoris GS115 usando un metodo electrotransformacion. Despues de la descarga electrica, se anadio 1 ml de solucion de sorbitol 1 M a la celula y se mezclo inmediatamente, despues las solucion se transfirio a un tubo de centnfuga de 1,5 ml y se puso a 30 °C durante 1,5 h, despues la suspension celular se recubrio sobre placas selectivas de RDB por cada 300 pl de suspension celular. Las placas se cultivaron a 30 °C para el cultivo hasta que aparecieron colonias individuales. Las colonias positivas se transfirieron a placas de RDB recientes y se cultivaron durante 24 h, despues las colonias individuales, correspondientes a cada protema de fusion de analogo de GLP-1, que crecieron en las placas de RDB se seleccionaron respectivamente y se inocularon en 10 ml de medio de cultivo BMGY, se cultivaron durante 24 h a 30 °C y 250 rpm. La suspension celular se coloco y el sobrenadante se descarto, despues las celulas se resuspendieron usando 10 ml de BMMY (metanol al 2 %). Las celulas se indujeron durante 48 h a 30 °C y 250 rpm, despues el sobrenadante se recogio por centrifugacion para detectar la expresion de las protemas de fusion mediante electroforesis en SDS-PAGE al 10 %. Los extremos N de las protemas de fusion se secuenciaron si el tamano de las bandas de electroforesis cumplfa lo esperado, y los resultados de secuenciacion que cumplfan lo esperado significan que las cepas genomanipuladas con cada protema de fusion de analogo de GLP-1 se construyeron satisfactoriamente.
Las condiciones espedficas para linealizar los plasmidos fueron las siguientes: 60 pl de plasmido de vector de expresion, 2,5 pl de SalI, 20 pl de soluciones de tampon 10x (H) y se anadieron a 200 pl mediante ddH2O. La reaccion se realizo durante 3 h en un bano de agua de temperatura constante a 37 °C.
Un metodo espedfico para preparar celulas comprendfa las siguientes etapas: en primer lugar se preparan las colonias, se seleccionan colonias individuales de levadura, se inoculan las colonias individuales en un matraz triangular de 50 ml que contema 5 ml de medio de cultivo YPD y se realiza cultivo a 30 °C y 250 rpm durante la noche; despues se recogen y se inoculan 30 pl de cultivo en un matraz triangular de 250 ml que contema 50 ml de medio de cultivo YPD y se realiza cultivo a 30 °C y 250 rpm durante la noche hasta que la DO600 alcanzo 1-1,5; se preenfria el cultivo celular en hielo durante 10 min, despues se realiza centrifugacion durante 5 min a 4 °C y 1500 xg, se descarta el sobrenadante y se resuspende la precipitacion de celulas con 40 ml de agua esteril preenfriada, se centrifugan, despues se resuspende la precipitacion de celulas con 25 ml de agua esteril preenfriada, se vuelven a centrifugar y se resuspende la precipitacion de celulas con 5 ml de solucion de sorbitol 1 M preenfriada, despues se vuelven a centrifugar y se resuspende la precipitacion de celulas con 80 pl de solucion de sorbitol 1 M preenfriada.
Un metodo de electrotransformacion espedfico comprendfa las siguientes etapas: se mezclan uniformemente 10 pl de plasmidos linealizados con 80 pl de las celulas competentes, se transfiere la mezcla a una cubeta de electrotransformacion preenfriada en hielo de 0,2 cm, se coloca la cubeta de electrotransformacion en un bano de hielo durante 5 min y despues se realiza la descarga electrica usando un voltaje de 1500 V.
Realizacion 3: preparacion de protemas de fusion de analogo de GLP-1
Con referencia al Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris (Invitrogen Corporation), se inocularon cepas, que expresan cada una protema de fusion de analogo de GLP-1, que se obtuvieron en la realizacion 2, en medio de cultivo YPD. El cultivo se realizo agitando a 30 °C y 220-280 rpm hasta que el peso en un humedo de las celulas alcanzo aproximadamente 50 g/l, las celulas se inocularon en biorreaccion (Biostat C10, Sartorius) mediante una dosificacion de un 10 %. El cultivo se realizo durante 20 h a 30 °C, pH 5,0 y un 30 % de saturacion de oxfgeno disuelto. Despues se suministro de forma continua metanol para iniciar la induccion. La saturacion de oxfgeno disuelto se controlo al 40 %. La temperatura se redujo hasta 22 °C despues de la induccion durante 4 h. La induccion se finalizo despues de 50 h y el sobrenadante se recogio por centrifugacion durante 15 min a 10000 xg y se recogio el sobrenadante fermentado.
Se adopto cromatograffa de cuatro etapas de afinidad BLUE, hidrofoba de PHE, de intercambio ionico con DEAE y de exclusion molecular para la purificacion. En primer lugar, el sobrenadante fermentado se diluyo tres veces usando solucion de fosfato de sodio pH 7,020 mM, despues la solucion se paso a traves de la columna de cromatograffa de afinidad Blue Sepharose Fast Flow (XK 50/20, GE healthcare), se realizo el equilibrado usando PBS y despues se eluyo la protema diana usando NaCl 2 M y solucion de fosfato de sodio pH 6,5 20 mM. Se anadio (NH4)2SO4 en la solucion de protema recogida para posibilitar que la concentracion final alcanzara 0,5 M, la solucion de protema se paso a traves de una columna de cromatograffa PHE Sepharose Fast Flow (XK 50/20, GE healthcare), se realizo equilibrado usando 0,6 M (NH4)2SO4, y despues la protema se eluyo usando solucion de tampon fosfato de sodio pH 6,5 5 mM. La protema recogida se diluyo dos veces usando solucion de tampon de fosfato de sodio pH 6,5 5 mM, despues la solucion se paso a traves de una columna de cromatograffa de intercambio ionico y la protema diana se eluyo directamente usando PBS adoptando una columna de cromatograffa DEAE Sepharose Fast Flow (XK 50/20, GE healthcare). Finalmente, se realizo desalacion a traves de una columna de cromatograffa de gel grueso Sephadex G25 (XK 50/60, GE healthcare) para lograr el desplazamiento en la solucion de tampon fosfato de sodio pH 6,55 mM. El sobrenadante de expresion y la protema de fusion purificada se analizaron respectivamente usando SDS-PAGE no reductor. Como se muestra en la fig. 1, hubo una gran diferencia en la estabilidad de las protemas de fusion de analogo de GLP-1 con diferentes estructuras durante la expresion, en la que la estabilidad de (analogo de GLP-1)2-HSA es la peor.
Realizacion 4: ensayo de actividad in vitro
De acuerdo con la bibliograffa (Zlokarnik G, Negulescu PA, Knapp TE, Mere L, Burres N, Feng L, Whitney M, Roemer K, Tsien RY. Science. 279 (5347): 84-8. (1998)), se construyeron celulas HEK-293 que portaban receptores de GLP-1 humanos y genes indicadores CRE-Luc, y se uso cultivo DMEM que contema un 10 % de FBS de acuerdo con 50 000 celulas/pocillo/200 pl para la inoculacion en una placa de cultivo celular de 96 pocillos Costar. En el segundo dfa despues de la inoculacion, se absorbio la solucion de cultivo, se anadieron 50 pl de solucion de cultivo DMEM sin suero de protemas de fusion de analogo de GLP-1 diluidas por etapas que conteman IBMX 500 pM en cada pocillo, se realizo incubacion durante 5-6 h, despues se anadieron 50 pl de sustrato de luciferasa (sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo™, Promega, E2620). La reaccion se realizo durante 2 min, despues la solucion se transfirio a una placa de micropocillos toda blanca de 96 pocillos Costar. Los valores de fluorescencia se determinaron en un lector de microplaca ELISA multifuncional (sistema SpectraMax M5, Molecular Device). Se represento una curva de respuesta a dosis de acuerdo con los valores de fluorescencia y se determino un valor de CE50. Tomando la actividad de (analogo de GLP-1)2-HSA como un 100 %, se calculo la actividad relativa de cada protema de fusion. Los resultados fueron como se muestra en la tabla 1. La actividad in vitro de Gly4Ser como peptido de conexion fue sustancialmente similar a la de un analogo de GLP-1 como peptido de conexion; y, sin embargo, cuando se insertaba un segmento de secuencias (E1-E6) de acuerdo con la reivindicacion 1 entre el analogo de GLP-1 y HSA, la actividad in vitro de la protema de fusion se mejoraba en aproximadamente 7-10 veces.
T l 1
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Realizacion 5: analisis de estabilidad in vitro
Se recogio solucion madre de protema de fusion de analogo de GLP-1 de alta pureza, se anadieron cantidades apropiadas de cloruro de sodio, hidrogenofosfato de disodio y dihidrogenofosfato de disodio, se regulo el pH hasta 7,4 usando hidroxido de sodio o acido clorhndrico y despues se anadio agua para inyeccion para posibilitar que 1 ml de solucion contuviera 5,0 mg de protema de analogo de GLP-1, 9 mg de cloruro de sodio y 20 pmol de fosfato. Las bacterias se retiraron usando una membrana de filtro de PVDF o PES de 0,22 pm. La solucion se envaso asepticamente en un frasco de penicilina en un entorno de clase-100. La muestra se almaceno en una caja de ensayo de estabilidad a 25 °C y se recogieron muestras respectivamente en el mes 0, 1 y 3 y se almacenaron en un refrigerador a -70 °C para la deteccion. Todas las muestras a analizar se combinaron y se detecto la pureza en SDS-PAGE y la actividad biologica celular. El metodo para detectar la pureza de SDS-PAGe fue como se describe en la realizacion 1 y la cantidad de carga de la muestra a detectar fue 10 ug. Ademas, se cargaron 1 ug, 0,5 ug, 0,2 ug, 0,1 ug y 0,05 ug de control propio. Se realizo barrido de densidad optica para obtener una curva patron, se calculo el contenido porcentual de cada protema impura y finalmente se calculo la pureza de la protema de fusion. El metodo para determinar la actividad in vitro fue como se describe en la realizacion 4, y se tomo la actividad de cada muestra en el mes cero como el 100 %. Antes de la determinacion de la actividad, la muestra se separo usando una columna de tamiz molecular Superdex 7510/30 (GE Healthcare) para eliminar los segmentos degradados con masa molecular que era mas pequena de 10000 Da. Para evitar la alteracion de la misma hasta la determinacion de la actividad. Los resultados son como se muestra en la tabla 2. Cuando el analogo de GLP-1 se insertaba como un peptido de conexion entre el analogo de GLP- y HSA, la tasa de conservacion de actividad era la peor y la protema de fusion era la mas inestable.
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Realizacion 6: Analisis de estabilidad en suero
Se recogio solucion madre de protema de fusion de analogo de GLP-1 de alta pureza purificada y se anadio a suero de mono de acuerdo con una relacion volumetrica de 1:25, se realizo filtracion para eliminar las bacterias, la solucion se envaso asepticamente en un frasco de penicilina y se realizo incubacion a 37 °C. Se recogieron muestras en el dfa 0, 15 y 30 y se almacenaron en un refrigerador a -70 °C para la deteccion. Todas las muestras a analizar se combinaron y se determino la concentracion de protema de fusion mediante un metodo de ELISA emparedado usando anticuerpos monoclonales anti-GLP-1 (Antibodyshop) como anticuerpos de captura y anticuerpo de cabra antialbumina humana-HRP (Bethyl Laboratories) como anticuerpos de deteccion. Como los anticuerpos de captura se unieron a la parte del analogo de GLP-1 de la protema de fusion y los anticuerpos de deteccion se unieron a la parte de la albumina, la concentracion de protema de fusion determinada se correlaciono positivamente con el contenido de la parte no degradada. Los resultados fueron como se muestra en la tabla 3. Despues de 30 dfas, la mayona de (analogo de GLP-1)2-HSA en el suero de mono ya se habfa degradado y aproximadamente un 40 % de las otras muestras estaba conservado.
Tabla 3 Situacion de cambio del contenido de protema de fusion en suero con el tiempo
Figure imgf000019_0002
Realizacion 7: ensayo de tolerancia de glucosa intraperitoneal en ratones
En total se cogieron 32 ratones KM incluyendo 16 ratones hembra y 16 ratones macho y se alimentaron sin pienso, pero con agua unicamente durante la noche durante 18 h, y despues se realizo inyeccion subcutanea de 1,0 mg/kg de HSA (grupo de control), (analogo de GLP-1)2-HSA, analogo de GLP-1-E3-HSA y analogo de GLP-1-E6-HSA. Despues de 1 hora y 8 horas despues de la administracion, se realizaron respectivamente ensayos de tolerancia de glucosa intraperitoneal (IPGTT), se realizo inyeccion intraperitoneal de 1,5 g/kg de glucosa y se recogio sangre antes (t=0) de inyeccion de glucosa y despues de 10 min, 20 min, 30 min, 60 min, 90 min y 120 min despues de inyeccion de glucosa para determinar el contenido de glucosa en sangre (analizador bioqmmico YSI2700). En comparacion con el grupo de control (grupo de HSA), la glucosa en sangre de los ratones de los grupos de (analogo de GLP-1)2-HSA, analogo de GLP-1-E3-HSA y analogo de GLP-1-E6-HSA estaba obviamente reducida, y el area bajo la curva (ABC0-120min) de la glucosa en sangre era obviamente menor que la del grupo de control (los resultados fueron como se muestra en la tabla 4). Cuando el IPGTT se realizaba despues de 1 hora tras la administracion, los niveles de glucosa en sangre en el punto temporal respectivo entre los tres grupos eran similares, las areas bajo la curva (ABC0-120min) de la glucosa en sangre tambien eran similares, y no existfan diferencias notables (P>0,05) entre los grupos; y, sin embargo, cuando se realizaba IPGTT despues de 8 horas tras la administracion, los niveles de glucosa en sangre de los ratones de los grupos de analogo de GLP-1-E3-HSA y analogo de GLP-1-E6-HSA a los 10-30 min eran obviamente inferiores a los del grupo de (analogo de GLP-1)2-HSA, y la ABC0-120min de la glucosa en sangre tambien era obviamente inferior a la del grupo de (analogo de GLP-1)2-HSA (P<0,01). Los resultados mostraron que tanto (analogo de GLP-1)2-HSA como analogo de GLP-1-E3-HSA podfan reducir de forma eficaz la glucosa en sangre en ayunas de los ratones y teman una caractenstica de larga accion, pero en comparacion con el grupo de (analogo de GLP-1)2-HSA, los grupos de analogo de GLP-1-E3-HSA y analogo de GLP-1-E6-HSA teman efectos reductores de glucosa en sangre mas notables y continuos.
Tabla 4 Areas bajo la curva (ABC0-120min) de la glucosa en sangre durante IPGTT a 1 h y 8 h despues de la administracion de dosis unica a ratones KM
Figure imgf000019_0001
Realizacion 8: ensayo farmacodinamico de proteina de fusion de analogo de GLP-1 despues de inyeccion subcutanea de una unica dosis a macaco de la India normal
Se realizo inyeccion subcutanea de una unica dosis de 0,5 mg/kg de (analogo de GLP-1)2-HSA o analogo de GLP-1-E3-HSA a un macaco de la India, se realizaron ensayos de glucosa intravenosa por etapas despues de 24 h y 96 h, se realizo inyeccion intravenosa de solucion de glucosa (solucion de dextrosa al 20 %, 200 mg/ml) de forma continua durante 20 min de acuerdo con 10 mg/kg/min (3,0 ml/kg/h), y despues se administro solucion de glucosa de forma continua durante 20 min de acuerdo con 25 mg/kg/min (7,5 ml/kg/h). Se adquirio sangre despues de 0, 10 min, 20 min, 30 min y 40 min tras inyeccion de glucosa para determinar la glucosa y la insulina en sangre. Se uso analizador bioqmmico YSI2700 para determinar la glucosa en sangre y se uso ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (kit de ELlSA de insulina, DRG International, Inc.) para determinar la insulina. No hubo diferencia notable en la glucosa en sangre entre los dos grupos en el punto temporal respectivo despues de un dfa tras la administracion (los resultados se muestran en las fig. 2A-D). Hubo una diferencia notable (P<0,05 o P<0,01) entre los grupos a 10 min, 30 min y 40 min tras 4 dfas despues de la administracion; y hubo una diferencia notable (P<0,01) en la insulina entre los grupos en los puntos temporales de 20 min y 40 min tras 1 dfa y 4 dfas despues de la administracion. Los resultados mostraron que, en comparacion con (analogo de GLP-1)2-HSA, el analogo de GLP-1-E3-HSA podfa promover mejor la secrecion de insulina y reducir el nivel de glucosa en sangre en el ensayo de glucosa intravenosa por etapas realizado al macaco de la India normal.
Realizacion 9: investigacion farmacocinetica despues de administracion de una unica dosis a macaco cangrejero
Se realizo respectivamente inyeccion subcutanea de una unica dosis de 0,5 mg/kg de (analogo de GLP-1)2-HSA y analogo de GLP-1-E3-HSA a macacos cangrejeros, se adquirio respectivamente sangre antes de la administracion(t=0) y despues de 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h y 216 h tras la administracion, se separo el suero, se realizo crioconservacion a -80 °C y despues el suero se combino y se detecto. Se determino la concentracion de protema de fusion en el suero usando anticuerpos monoclonales anti-GLP-1 (Antibodyshop) como anticuerpos de captura y anticuerpo de cabra antialbumina humana-HRP (Bethyl Laboratories) como anticuerpos de deteccion (vease la fig. 3), y se calcularon los parametros farmacocineticos (vease la tabla 5). La investigacion mostro que el periodo de semivida del analogo de GLP-1-E3-HSA a 0,5 mg/kg en el organismo del macaco cangrejero era de 102 h (aproximadamente 4 dfas) y el periodo de semivida del (analogo de GLP-1)2-HSA era de 60 h (2,5 dfas).
T l
Figure imgf000020_0001
Realizacion 10: inmunogenicidad despues de administracion subcutanea repetitiva a macaco cangrejero
Se realizo semanalmente inyeccion subcutanea de 1 mg/kg (de analogo de GLP-1)2-HSA y analogo de GLP-1-E3-HSA a macacos cangrejeros, y la administracion se realizo de forma continua durante 3 meses. Se adquirio respectivamente sangre antes de la administracion (t=0) y despues de 1 mes, 2 meses y 3 meses tras la administracion, se separo el suero, se realizo crioconservacion a -80 °C y despues el suero se combino y se detecto. Se determinaron anticuerpos de mono antiprotema de fusion que se produdan posiblemente usando ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA). Las protemas de fusion correspondientes se usaron como sustancias incrustantes, se anadieron muestras de suero a detectar de diferente dilucion y se determino el tttulo de los anticuerpos usando anticuerpo de raton anti-IgG de mono como anticuerpos de deteccion. Simultaneamente, en condiciones de determinacion similares, se anadio seroalbumina humana como antagonista a las muestras de suero a detectar (concentracion final de 60 |jM) para analizar adicionalmente la especificidad de los anticuerpos producidos (vease la tabla 6). Los resultados de investigacion muestran que, despues de administracion repetitiva, se produdan anticuerpos por ambos, el tttulo mas alto alcanzaba 1:6400 y las tendencias y los tttulos de los anticuerpos producidos por ambos eran sustancialmente coherentes. Se anadio adicionalmente HSA al suero para el analisis antagonista, los resultados mostraron que el tttulo del suero disminrna obviamente bajo la existencia de HSA y se indica que los anticuerpos producidos estaban antagonizados sustancialmente por HSA. Por lo tanto, indicaron que la mayona de los anticuerpos producidos despues de la inyeccion repetitiva de protema de fusion a macacos estaban dirigidos a la parte de HSA en la protema de fusion y no se produdan anticuerpos antianalogo de GLP-1.
Figure imgf000021_0001

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una protema de fusion de analogo de GLP-1, caracterizada por que una estructura de la protema de fusion es analoga de GLP-1-peptido conector-seroalbumina humana, la secuencia de aminoacidos del peptido conector es una cualquiera de las SEQ ID NO. 11-16, un extremo N del peptido conector esta conectado con un extremo C del analogo de GLP-1 mediante un enlace pepffdico y un extremo C del peptido conector esta conectado con un extremo N de la seroalbumina humana mediante un enlace pepffdico, en la que el analogo de GLP-1 es uno cualquiera de los siguientes:
a) que tiene una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 1;
b) que tiene una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 1 en que la Gly de la secuencia en la posicion 2 esta remplazada por Ala, Ser o Cys y/o Glu en la posicion 3 esta remplazada por Asp, Gli, Ser, Cys Thr, Asp, Gln, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met o Phe y/o Gly en la posicion 4 esta remplazada por Ser, Cys, Thr, Asp, Glu, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met o Phe y/o Asp en la posicion 9 esta remplazada por Glu y/o Val en la posicion 10 esta remplazada por Leu o Tyr y/o Ser en la posicion 12 esta remplazada por Lys y/o Glu en la posicion 15 esta remplazada por Asp y/o Ala en la posicion 18 esta remplazada por Arg y/o Lys en la posicion 20 esta remplazada por Gly, Ser, Cys, Thr, Asp, Glu, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe o Arg y/o Lys en la posicion 28 esta remplazada por Gly, Ser, Cys, Thr, Asp, Glu, Tyr, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe o Arg sin cambiar la actividad de la misma;
c) que comprende 2 o 3 secuencias repetitivas del analogo de GLP-1 de a) o b), o que comprende 2 o 3 secuencias repetitivas de un GLP-1; y
d) que es exendina-4
o en la que una secuencia de aminoacidos de la protema de fusion de analogo de GLP-1 se selecciona de las SEQ ID NO. 3-5.
2. La protema de fusion de analogo de GLP-1 de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que una secuencia de aminoacidos de la seroalbumina humana es la SEQ ID NO. 2 o la secuencia de la SEQ ID No .2 en que la Cys de la secuencia en la posicion 34 esta remplazada por Ser y/o Leu en la posicion 407 esta remplazada por Ala y/o Leu en la posicion 408 esta remplazada por Val y/o Val en la posicion 409 esta remplazada por Ala y/o Arg en la posicion 410 esta remplazada por Ala y/o Lys en la posicion 413 esta remplazada por Gln sin cambiar la actividad de la misma.
3. Un polinucleotido que codifica la protema de fusion de analogo de GLP-1 de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2.
4. El polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 3, caracterizado por que una secuencia del polinucleotido se selecciona de las SEQ ID NO. 8-10.
5. Un metodo para preparar la protema de fusion de analogo de GLP-1 de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, comprendiendo el metodo las siguientes etapas: construir un vector de expresion que contiene una secuencia genica de la protema de fusion de analogo de GLP-1, despues transformar el vector de expresion en una celula hospedadora para la expresion inducida, y separar y obtener la protema de fusion de los productos de expresion.
6. El metodo para preparar la protema de fusion de analogo de GLP-1 de acuerdo con la reivindicacion 5, caracterizado por que el vector de expresion es pPIC9; y la celula hospedadora es Pichia pastoris.
7. El metodo para preparar la protema de fusion de analogo de GLP-1 de acuerdo con la reivindicacion 5, caracterizado por que un metodo para preparar y obtener la protema de fusion de los productos de expresion comprende la etapa de separar y obtener la protema de fusion adoptando un metodo cromatografico de tres etapas que une cromatograffa de afinidad, cromatograffa hidrofoba y cromatograffa de intercambio ionico.
8. La protema de fusion de analogo de GLP-1 de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 para su uso como medicamento.
9. Una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas con diabetes, que contiene la protema de fusion de analogo de GLP-1 de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 y al menos un vehmulo o excipiente farmaceuticamente aceptable.
10. Una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas con diabetes, que contiene la protema de fusion de analogo de GLP-1 de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 y al menos un vehmulo o excipiente farmaceuticamente aceptable.
11. La protema de fusion de analogo de GLP-1 de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 para su uso en el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas con diabetes.
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