CN115819611A - 生长激素融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生长激素融合蛋白及其制备方法和用途，其中，根据本发明的实施例，生长激素融合蛋白包括：双链结构体，所述双链结构体具有第一恒定区Fc段和第二恒定区Fc段；和生长激素，所述生长激素与所述双链结构体的所述第一恒定区Fc段相连，其中，所述生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，所述生长激素融合蛋白是由非哺乳细胞表达体系表达的。根据本发明的实施例，通过采用生长激素与双链结构体的融合，能够延长生长激素在体内的半衰期，并且由于每个双链结构体仅携带一个生长激素，因此生长激素的活性位点并不受到空间位阻的影响，因此其活性更强，另外由于生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，因此安全性更高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及生长激素融合蛋白及其制备方法和用途，更具体地，本发明涉及一种生长激素融合蛋白、一种核酸分子、一种表达载体、一种重组细胞、一种制备生长激素融合蛋白的方法、一种药物组合物以及生长激素融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞或者药物组合物在制备药物中的用途。
背景技术
生长激素(human growth hormone，hGH)是由人脑垂体前叶分泌的一种蛋白质激素，由191个氨基酸组成，分子量为22.1KDa，生长激素能够促进骨骼生长，促进机体蛋白质合成和脂肪分解，增加肌细胞的数量和增大肌细胞的体积，调节免疫系统增强免疫能力。生长激素可以用于儿童内源性生长激素缺乏引起的矮小症、特纳综合症、成人GHD、烧伤及创伤的修复等症的治疗，还可以用于治疗慢性肾衰竭引起的身材矮小、短肠综合症及老年人延缓衰老等。
国内已上市的长效生长激素主要是通过PEG化来延长其半衰期，达到长效的目的。但是，有报道称将PEG化的重组人生长激素用于患有生长激素缺乏症的儿童时，患儿体内的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平没有能够恢复至正常水平。在临床前动物试验过程中发现反复给予试验动物注射PEG化的蛋白药物会引起空泡病变。另外，常规的生长激素表达产物，特别是以大肠杆菌表达的生长激素，由于目的蛋白基因起始必须碱基ATG的存在，使表达蛋白N末端必然含有甲硫氨酸，要想获得N末端不含甲硫氨酸的生长激素，需借助蛋白N端融合信号肽的作用来实现。N末端甲硫氨酸的存在，特别是生长激素的N末端甲硫氨酸的存在，会给治疗带来副作用。
因此，现有的长效生长激素技术仍有待改进。
发明内容
本发明充分考虑了生长激素现有技术中存在的上述问题，并在进一步对重组生长激素进行研究过程中，意外发现部分表达体系，例如大肠杆菌能够直接表达在N末端不携带甲硫氨酸的生长激素，而不需要借助信号肽的作用来实现。
因此，本发明提出了一种能够有效制备N末端不携带甲硫氨酸的重组生长激素的方法。
第一方面，本发明提出一种生长激素融合蛋白，根据本发明的实施例，其包括：双链结构体，所述双链结构体具有第一恒定区Fc段和第二恒定区Fc段；和生长激素，所述生长激素与所述双链结构体的所述第一恒定区Fc段相连，其中，所述生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，所述生长激素融合蛋白是由非哺乳细胞表达体系表达的。根据本发明的实施例，通过采用生长激素与双链结构体的融合，能够延长生长激素在体内的半衰期，并且由于每个双链结构体仅携带一个生长激素，因此生长激素的活性位点并不受到空间位阻的影响，因此其活性更强，另外由于生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，因此安全性更高。
第二方面，本发明提出了一种核酸分子，根据本发明的实施例，所述核酸分子编码第一方面所述的生长激素融合蛋白。利用该核酸分子可以有效地用于表达上述融合蛋白，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述生长激素的单体，并进一步通过体外组装形成最终的生长激素融合蛋白。
第三方面，本发明还提出了一种表达载体，根据本发明的实施例，所述表达载体携带第二方面所述的核酸分子。利用该表达载体能够在细胞内有效地表达上述融合蛋白，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述生长激素的单体，并进一步通过体外组装形成最终的生长激素融合蛋白。
第四方面，本发明还提出了一种重组细胞，根据本发明的实施例，该重组细胞含有：前面所述的核酸分子；或者前面所述的表达载体。
第五方面，本发明还提出了一种制备第一方面所述的生长激素融合蛋白的方法，其包括：获取双链结构体的第一单体和第二单体，其中，所述第一单体具有第一恒定区Fc段，所述第二单体具有第二恒定区Fc段，所述第一恒定区Fc段连接有生长激素；和使所述第一单体和所述第二单体形成异二聚体，以便获得所述生长激素融合蛋白。
由此，能够有效地制备前面所述的生长激素融合蛋白。
根据本发明的实施例，所述异二聚体是在体外形成的。
根据本发明的实施例，所述第一单体和所述第二单体是在非哺乳细胞表达体系中表达的。
根据本发明的实施例，所述第一单体和所述第二单体是相同的所述非哺乳细胞表达体系中表达的。
第六方面，本发明提出了一种药物组合物，其包括：
第一方面所述的生长激素融合蛋白。
第七方面，本发明还提出了前面所述的生长激素融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、前面所述的制备融合蛋白的方法制备获得的生长激素融合蛋白、药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例，所述生长激素异常相关疾病至少包括选自下列之一：儿童生长激素缺乏症、特纳综合征、慢性肾功能衰竭引起的身材矮小、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、短肠综合症、FGFR3突变的软骨发育不全。
附图说明
图1显示了根据本发明实施例的融合蛋白结构示意图；
图2显示了本发明生长激素融合蛋白在体内促进动物生长中的作用。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在对本发明描述的过程中，对于本文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本发明保护方案的限制。
如无特别说明，在本文中所使用的术语“生长激素”是指人生长激素或者与人生长激素具有相同或者一定同源性但生物学功能不受负面影响的蛋白(或者称为“变体”)，本领域技术人员能够容易通过已知的天然人生长激素的氨基酸序列结合常规的基因编辑手段获得期望的定点突变。
如无特别说明，在本文中所使用的术语“融合蛋白”是指至少两个蛋白质或者多肽融合而成的新型蛋白，通常可以通过基因工程等技术实现上述融合操作，例如通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。在本文中是指，生长激素与双链结构体的Fc段呈融合状态，需要说明的是，生长激素融合蛋白并不意味着蛋白质的所有部分都是通过融合的方式形成的，例如，双链结构体中的两个Fc段部分是可以通过二硫键等化学键连接在一起的。
如无特别说明，在本文中所使用的术语“同一性”可以通过常规的方法进行确定两个蛋白质序列之间的同一性，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
如无特别说明，在本文中所使用的术语“表达载体”指包括与在合适的宿主中能实现DNA表达的合适的调控序列可操作地连接的DNA序列的DNA构建体。这样的调控序列可以包括实现转录的启动子，任选的调控转录的操纵基因序列，编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。针对不同的细胞类型优选使用不同的表达载体。如这里使用的，“宿主菌株”或者“宿主细胞”指用于包括本发明DNA的表达载体的合适的宿主。在本文中，所使用的“非哺乳细胞表达体系”是指采用哺乳动物细胞以外的宿主细胞进行表达的体系，例如微生物细胞，诸如原核细胞或者低等真核细胞。
本发明是发明人在对现有的生长激素制剂进行深入研究后完成的。儿童和成人生长激素缺乏(GHD)，可以通过补充外源生长激素进行治疗。目前商业化重组人生长激素有普通生长激素和长效生长激素，普通生长激素体内半衰期短，约为2-3小时，注射后很快被肝脏、肾脏清除，因此需要每天皮下注射给药，给患者带来很多痛苦，同时，因为长期的体内注射重组人生长激素，也会在少数人群体内产生抗体，影响疗效。长效生长激素克服了普通生长激素体内半衰期短的缺点，在保持了较高活性的同时，使人体内半衰期大大延长，可以实现每周或更长时间皮下注射给药，极大改善了患者的用药依从性。
重组人生长激素由重组DNA技术生产而得，其氨基酸序列与天然人生长激素完全相同，是一条由191个氨基酸组成的多肽链，在53位与165位及182位与189位之间形成两对二硫键。生长激素分子表面存在2个受体结合位点，分别为结合位点1和结合位点2，血液循环中的生长激素到达目标组织后，先与细胞膜上的一个生长激素受体结合，然后再结合另外一个生长激素受体，形成受体二聚体复合物(一个生长激素分子结合两个生长激素受体)，激活下游的JAK2信号通路，从而发挥其促生长及其他功能作用。
从垂体源人生长激素到重组人生长激素再到长效重组人生长激素，其发展经历了多个不同的阶段。第一代生长激素为从人垂体中提取的垂体源生长激素，其来源受限、纯度低且易受病毒污染，长期使用具病毒感染风险。第二代生长激素是由Genentech利用E.coli包涵体技术开发出的含192个氨基酸的重组人生长激素，由于蛋白质N端含有起始甲硫氨酸，易产生抗体，长期使用大大降低生长激素的治疗作用。另外，由于其制剂粉针的形式，在制备过程中需要冻干，容易形成聚体，影响其体内促生长作用。
近些年的生长激素是通过微球、透明质酸、PEG修饰等长效制剂技术制得的长效重组人生长激素水针。长效化的实现，不再每天给药，而是每周给药一次，增加了患者依从性。制剂的水针形式，也克服了粉针的不良缺点。但是，这些制剂都引入了新的高分子化合物，外源性高分子化合物的长期使用，会引起体内抗体的产生，或者引起免疫原性等不良反应，导致体内药效下降。
国内已上市的长效生长激素主要是通过PEG化来延长其半衰期，达到长效的目的。但是，有报道称将PEG化的重组人生长激素用于患有生长激素缺乏症的儿童时，患儿体内的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平没有能够恢复至正常水平。另外，在临床前动物试验过程中发现反复给予试验动物注射PEG化的蛋白药物会引起脂肪空泡病变。
辉瑞公司的Somatrogon，是一种新分子实体，在天然人生长激素序列的C端和N端分别融合2个和1个来自人绒毛膜促性腺激素(HCG)β亚基的C末端肽(CTP)，使其半衰期得以延长，实现体内长效化。诺和诺德的Somapacitan是将重组人生长激素的第101位亮氨酸突变为半胱氨酸(L101C)，并在此突变半胱氨酸上连接一脂肪酸侧链，实现体内长效，化学合成和/或化学修饰技术实现生长激素长效化的同时，随之引入体内合成大分子产物或合成的脂肪酸链，长期使用可能对身体产生不良影响。
另外，发明人发现，现有表达体系多为哺乳动物细胞，其表达糖基化载体实现生长激素的长效化，由于生长激素与其受体作用的特殊性，需形成生长激素-受体二聚体复合物，而且一个生长激素分子需结合2个受体分子，才能正常发挥体内生物学效应，不同的生长激素-受体二聚体复合物结构影响生长激素的体内生物效应程度，产生生长激素与其受体结合的空间位阻，导致药效减弱。哺乳动物细胞为Fc融合蛋白或多肽的制备实现了可及性，极大地满足了临床治疗对药物的需求，但其特点是制备工艺繁杂、制备周期长、制备成本高，工艺放大困难、易产生糖型差异及电荷异构体。由此，发明人提出了大肠杆菌等微生物表达体系，例如原核表达体系或者低等真核表达体系，因为大肠杆菌具有表达产物均一、无糖基化修饰、不存在糖型差异及电荷异构体且发酵周期短、成本低的显著优点，特别适用于无糖基化要求的重组蛋白的生产。
发明人通过深入研究提出了与现有的生长激素相比，纯度更高、药效更好、不良反应更低、更安全、质量更容易控制、成本更低的含天然载体的长效生长激素制剂，同时契合生长激素与其受体作用原理进行结构设计，采用大肠杆菌表达系统来生产长效生长激素，以满足患者对此产品的需求。由此，可以采用天然载体实现其长效化、可以完全实现基因工程表达、制备成本显著降低的新型长效生长激素制备技术，制备出的生长激素具有纯度高、活性(效价)高、药效好的特点，相比其他长效生长激素，特别具有高活性、低成本的显著优势。
由此，第一方面，本发明提出一种生长激素融合蛋白，根据本发明的实施例，其包括：双链结构体，所述双链结构体具有第一恒定区Fc段和第二恒定区Fc段；和生长激素，所述生长激素与所述双链结构体的所述第一恒定区Fc段相连，其中，所述生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，所述生长激素融合蛋白是由非哺乳细胞表达体系表达的。
根据本发明的实施例，通过采用生长激素与双链结构体的融合，能够延长生长激素在体内的半衰期，并且由于每个双链结构体仅携带一个分子生长激素，因此生长激素的活性位点并不受到空间位阻的影响，因此其活性更强，另外由于生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，因此安全性更高。
这里的双链结构体包括第一单体和第二单体，其中，第一单体具有第一恒定区Fc段，第二单体具有第二恒定区Fc段，第一恒定区Fc段连接有生长激素，具体地，第一单体结构为：hGH-linker-CH2-CH3，第二单体结构为：CH2-CH3，且第一单体和第二单体之间通过二硫键相连。本发明提供的双链结构体中，恒定区Fc段均采用人IgG4 Fc，对天然人IgG4 Fc的CH2、CH3部分序列进行了氨基酸序列突变，并通过独立设计的刚性Linker序列形成了第一单体和第二单体。本发明中的双链结构体的Fc段采用人IgG4Fc的CH2、CH3部分序列是考虑IgG4 Fc不引起体内补体介导的CDC效应和NK细胞介导的ADCC效应，未采用天然人IgG4 Fc铰链区作为Linker，而采用独自设计的Linker是为避免IgG4分子在体内可能会经历Fab-arm交换的过程及避免IgG4 Fc产生的生长激素空间位阻。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白无糖基化修饰。由此，可以避免了因糖型差异可能带来的免疫原性风险，另外，因为生长激素融合蛋白无糖基化修饰，因此，在制备时不需要考虑由于糖性差异所带来的质量难以控制，因此，制备和质控方面更有优势。
糖基化修饰主要发生在哺乳细胞所表达的蛋白质中，大肠杆菌本身因没有糖基化作用，自然其表达的蛋白就没有糖基化修饰。正确的糖基化修饰蛋白更接近于人体天然蛋白，但哺乳细胞，如CHO细胞，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary)的简称，系非人类哺乳动物细胞系，表达糖型与人体内天然蛋白糖型有差异，有可能引起免疫反应等副作用。采用大肠杆菌表达无糖基化修饰的蛋白，可避免糖基化可能带来的副反应。采用无糖基化的Fc与生长激素的融合，能很好地实现生长激素体内长效化，对生长激素活性也没有影响，而无需借助糖基化来实现上述作用。
根据本发明的实施例，所述非哺乳细胞表达体系至少包括原核表达体系和低等真核表达体系二者之一，优选所述非哺乳细胞表达体系至少包括大肠杆菌表达体系和酵母表达体系的二者之一。例如，所述非哺乳细胞表达体系包括原核表达体系和低等真核表达体系的至少之一。优选地，所述非哺乳细胞表达体系至少包括大肠杆菌表达体系、酵母表达体系的至少之一。根据本发明的实施例，通过采用原核表达体系和低等真核表达体系的至少之一，其投资相对少、培养成本低、易于操作、培养时间短且能实现高密度发酵的表达系统，例如大肠杆菌，其质量均一性更好、更容易控制，并且发明人意外地发现原核表达体系和低等真核表达体系的至少之一不产生目标蛋白的糖基化，避免了因糖型差异可能带来的免疫原性风险，以及无糖型差异及电荷异构体可能导致的质量难以控制问题，同时这些表达体系采用无动物源性培养基，其安全性更好。
根据本发明的实施例，所述生长激素具有下列氨基酸序列之一：
(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，
X1FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQX2RSVEGSX3GF，
X1表示G、A或S，
X2表示G、A、S、C或缺失，
X3表示G、A、S、C或缺失；
或
(b)与(a)具有至少90％同一性的氨基酸序列。
由于野生型生长激素的N端含甲硫氨酸，长期使用，体内会产生抗体，影响治疗效果。为形成N端不含M的生长激素，N端加了氨基酸X1(G、A或S)，这样在表达后，蛋白N端会自然没有M。如果N端不加新的氨基酸，如序列所示第一个氨基酸为F情况下，表达后N端仍会有M存在。
在本发明中，在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中X1表示G、A或S的前提下，本领域技术人员能够理解，由于X2和X3非生长激素的活性中心，因此X2、X3可以分别独立地进行氨基酸取代和缺失，例如X2、X3可以分别独立地表示G、A、S、C或缺失。X2和X3位置处氨基酸取代或缺失一方面对整体的生长激素活性没有影响，另一方面能够避免在体外组装过程中产生二硫键错配，避免形成非正确构像的蛋白、影响生长激素的体内活性及因为错误构象蛋白的形成可能引起的体内免疫反应。
本发明提供的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N端不含甲硫氨酸，不会引起N端甲硫氨M带来的副作用。且较天然人生长激素，N端X1氨基酸不影响生长激素空间结构及生物活性。
根据本发明的实施例，进一步包括：连接肽，所述连接肽的一端与所述生长激素相连，另一端与所述双链结构体相连，所述连接肽含有至少一个序列单元GXaa1PXaa2，其中，在每个所述序列单元中，每个Xaa1分别独立地表示A、E和K之一，每个Xaa2分别独立地表示Q和N之一。根据本发明的实施例，在每个所述序列单元中，每个Xaa1分别独立地表示A、E和K的至少之一，每个Xaa2分别独立地表示Q和N的至少之一。
根据本发明的实施例，所述连接肽含有1～20个所述序列单元，优选1～5个，更优选3个。根据本发明的实施例，所述生长激素的C末端与所述连接肽相连。与常规的连接肽相比，根据本发明实施例的连接肽是富含G和/或A和/或P和/或Q和/或K和/或E和/或N氨基酸的小肽单元及其单元串联体，这样的连接肽为非柔性的，具有更刚性的结构，可以避免对生长激素活性位点的干扰，从而进一步提高最终所得到的融合蛋白的生物活性。
发明人发现，所述连接肽为柔性接头时，如通常的(GmSn)x结构，其中m为1-4，n为0-4，x为1-20之间的整数，该结构柔性强，易使与该结构融合的2个蛋白空间结构上发生“遮挡”，产生空间位阻，从而影响目标蛋白活性。而本发明中的生长激素的活性位点就存在于近C端区域，Linker设计不好，Fc的N端就会对生长激素的近C端区域的活性位点产生影响，形成空间位阻。而刚性结构Linker因其具有刚性，其融合的2个蛋白，能各自独立地保持自己的空间构象，不会产生空间“遮挡”现象。因此本发明采用特定的刚性接头，能够避免Fc的N端对生长激素的近C端区域的活性位点的影响。
生长激素活性位点干扰的原因：(1)linker的长度。linker越长，linker本身及Fc都有可能影响生长激素的活性位点，特别是本发明中生长激素的其中一个活性位点在近C端区域，其后就是linker，再后就是融合的另一个蛋白(Fc段)，空间结构很近，就可能产生影响。Linker也不能很短，否则会产生空间位阻。发明人发现，采用本发明上述长度的linker，不会干扰生长激素活性位点，对生长激素的活性没有产生影响；(2)linker的结构。发明人发现，linker结构柔性太强，融合的两个蛋白空间上会易于“摇摆”，相互影响各自构像或形成空间位阻，影响蛋白与其受体结合，影响蛋白的体内生物学作用(本发明形成hGH/GHR受体复合物，向下游进行信号转导，引起体内IGF-1水平变化，促进生长)，所以本发明选择刚性Linker，这样就能“基本固定”Linker前后两个蛋白的空间位置，使Linker前后的两个蛋白空间结构上各自独立的存在，不至于影响相互的构象或形成空间位阻、阻止生长激素与其受体结合及体内生物效应的发挥。
根据本发明的实施例，所述第一恒定区Fc段和所述第二恒定区Fc段具有不同的氨基酸序列。由此，可以避免融合蛋白形成同二聚体。根据本发明的实施例，所述第一恒定区Fc段和所述第二恒定区Fc段适于在体外形成异二聚体。根据本发明的实施例，所述第一恒定区Fc段和所述第二恒定区Fc段分别独立地具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列：SKYGPPX4PPX5PAPX6AX7GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFX8STYRVVSVLTVLHQDWLX9GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLX10CX11VKGFYPSDIAVEWESX12GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLX13SRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
其中，
X4表示R、K、D、E或C；
X5表示R、K、D、E或C；
X6表示R、K、D、E或缺失；
X7表示A、R、K、D、E或缺失；
X8表示D、E、G、Q或N；
X9表示D、E、G、Q或N；
X10表示G、S或W；
X11表示A、G、P或L；
X12表示D、E、G、Q或N；
X13表示I、P、V或Y。
根据本发明的实施例，X4、X5、X6和X7中至少一个为K或E或C。
根据本发明的实施例，在所述第一恒定区Fc段中，
X4表示C；
X5表示C；
X6表示K；
X7表示E；
X8表示N；
X9表示N；
X10表示W；
X11表示L；
X12表示N；
X13表示Y。
根据本发明的实施例，在所述第二恒定区Fc段中，
X4表示C；
X5表示C；
X6表示E；
X7表示K；
X8表示Q；
X9表示Q；
X10表示S；
X11表示A；
X12表示Q；
X13表示V。
由此，可以进一步提高融合蛋白在体外形成异二聚体的效率，避免同二聚体的形成，提高生产效率，降低生产成本。
根据本发明的实施例，本发明采用IgG4 Fc作为起始序列，是因为IgG4分子不具有体内补体介导的CDC效应和NK细胞介导的ADCC效应，避免了因IgG功能效应导致的对生长激素受体细胞的攻击，具安全性，同时又能通过Fc实现长效化。
根据本发明的实施例，采用IgG4 Fc作为原始序列，本发明的发明人通过一系列改造措施，得到了Fc的变体，意外发现能够有效地避免同二聚体的形成。发明人分析后发现，改造后的Fc段的电荷分布有利于异二聚体的形成，同时结构也更稳定，可有效避免制剂长期储存过程中的多聚体形成(更稳定)，并且改造后的Fc段的三维结构也是有利于异二聚体形成，实现目标分子中的第一变体恒定区Fc与第二变体恒定区Fc的稳定结合。另外，在改造后的Fc段中，为避免蛋白质的翻译后修饰，进行了目标位点的氨基酸突变。翻译后修饰(如脱酰胺化、氧化、异构化等)是蛋白质表达后的常见修饰过程，普遍存在于蛋白质和多肽类药物中，严重影响蛋白质等生物制品的质量，引起难以预测的药物临床不良反应。其中脱酰胺化是最常见的蛋白质翻译后修饰形式。为避免目标分子蛋白翻译后修饰的发生，特别是脱酰胺化的发生，根据本发明的实施例，发明人通过HPLC液相图证明本发明的融合蛋白并没有修饰体的产生。
根据本发明的实施例，本发明的融合蛋白可以利用天然hGH/GHR作用机制，实现体内更有效作用、更低的给药剂量。在体内生长激素与其受体结合，首先是生长激素位点1与其受体结合，形成生长激素/受体复合物，受体复合物再结合另外一个生长激素受体，形成生长激素/受体二聚体复合物，进而激活下游的JAK2信号通路，以促进生长及发挥其他功能作用。生长激素/受体二聚体复合物的形成，是其发挥体内作用的关键。根据本发明实施例的融合蛋白充分考虑生长激素-受体(hGH/GHR)结合过程中可能产生的空间位阻效应，包括长效载体(Fc)可能产生的空间位阻、生长激素本身及连接肽可能产生的空间位阻。根据本发明的实施例，融合蛋白结构的载体分子、连接肽及效应分子都有可能产生空间位阻效应，影响效应分子效应功能的正常发挥，其中能产生空间位阻的主要影响因素之一即连接肽序列，这与效应分子的受体结合区域及位置有关，为实现融合蛋白结构的不同分子(载体和效应分子)互不影响，实现长效的同时，分子效应不受影响(长效、有效)，同时可有效降低融合分子间的空间位阻，充分暴露生长激素分子的受体结合位点，实现长效的同时，最大化体内生物活性(效应)。
根据本发明的实施例，上述融合蛋白是采用非哺乳动物细胞例如原核细胞或者低等真核细胞等微生物表达系统。由此，质量更容易控制，同时具有显著低的制备成本。原核表达体系表达产物不产生目标蛋白的糖基化，避免了因糖型差异可能带来的免疫原性风险，无糖型差异及电荷异构体可能导致的质量难以控制问题，同时原核体系培养采用无动物源性培养基，更安全，以及众所周知的低成本制备优势。
根据本发明的实施例，体外细胞水平实验表明，本发明的高活性重组长效人生长激素融合蛋白其体外结合活性及生物学活性，显著高于已上市长效人生长激素。动物体内试验表明，本发明的高活性重组长效人生长激素融合蛋白其体内药效显著优于已上市长效人生长激素，具有良好体内PK水平。促生长试验表明，相较普通人生长激素及已上市长效人生长激素，本发明的重组人生长激素融合蛋白促生长作用更显著。另外，体外FcRn结合实验表明，活性与人体天然IgG4 Fc效果相同，预示其体内可能具有更长的半衰期，能够实现1周或更长时间给药一次，可大大减少给药频次，增加患者依从性。体外细胞检测高活性重组长效人生长激素融合蛋白与GHR结合活性，二者具有符合设计预期的结合特性，表明高活性重组长效人生长激素融合蛋白具有很小的空间位阻。
第二方面，本发明还提出了一种核酸分子，根据本发明的实施例，所述核酸分子编码第一方面所述的生长激素融合蛋白。利用该核酸分子可以有效地用于表达上述融合蛋白，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述生长激素的单体，并进一步通过体外组装形成最终的生长激素融合蛋白。需要说明的是，这里的核酸分子不需要编码上述融合蛋白的全部序列，可以包括两类核酸分子，分别编码两个单体，进一步可以在体外进行组装得到异二聚体即可。例如，所述第一单体具有第一恒定区Fc段，所述第二单体具有第二恒定区Fc段，所述第一恒定区Fc段连接有生长激素。
第三方面，本发明提出一种表达载体，所述表达载体携带第二方面所述的核酸分子。利用该表达载体能够在细胞内有效地表达上述融合蛋白，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述生长激素的单体，并进一步通过体外组装形成最终的生长激素融合蛋白。
第四方面，本发明还提出了一种重组细胞，根据本发明的实施例，该重组细胞含有：前面所述的核酸分子；或者前面所述的表达载体。
第五方面，本发明还提出了一种制备第一方面所述的生长激素融合蛋白的方法，其包括：获取双链结构体的第一单体和第二单体，其中，所述第一单体具有第一恒定区Fc段，所述第二单体具有第二恒定区Fc段，所述第一恒定区Fc段连接有生长激素；和使所述第一单体和所述第二单体形成异二聚体，以便获得所述生长激素融合蛋白。
由此，能够有效地制备前面所的生长激素融合蛋白。
本发明的实施例，可以采用非哺乳动物细胞进行上述单体的表达，与哺乳动物细胞表达体系例如CHO相比，CHO细胞表达长效生长激素，若表达同二聚体产物，表达蛋白分子均一，质量好，纯度高。但是若表达异二聚体产物，则会存在很大问题，最大问题就是表达产物不均一，目的产物纯度低，其中最主要杂质即形成异二聚体的两个单体形成的各自同二聚体，由于目标异二聚体与2个单体的同二聚体的性质相近，所以很难从表达产物中将其除去。另外采用CHO表达系统，培养基成分复杂、培养成本高，病毒污染风险大，培养时间长、控制过程复杂、染菌风险大，且CHO细胞反应器相较原核细胞反应器投资巨大，或采用一次性生物反应器，成本高、投资大。
根据本发明的实施例，可以采用投资相对少、培养成本低、易于操作、培养时间短且能实现高密度发酵的微生物表达体系，例如大肠杆菌表达系统(成本更低、质量均一性更好、更容易控制)，不使用合成的高分子化学物质作为长效载体，且无需体外偶联。通过体外组装，在蛋白质纯化过程中自动组装成异二聚体，且发明人意外的发现异二聚体组装过程中，没有CHO细胞表达过程中产生的构成异二聚体的两个单体形成的各自同二聚体。本发明的第一单体和第二单体的体外组装可以通过本领域已知的体外组装方法实现，或者可以通过本发明后面具体实施例中所描述的方法实现。在培养大肠杆菌后，通过诱导表达、破碎细胞、收获包涵体。并经过简单的纯化，即可获得高纯度异二聚体结构目标产物。
第六方面，本发明提出了一种药物组合物，其包括：
第一方面所述的生长激素融合蛋白。
第七方面，本发明还提出了前面所述的生长激素融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、前面所述的制备融合蛋白的方法制备获得的生长激素融合蛋白、药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例所述生长激素异常相关疾病包括选自下列的至少之一：儿童生长激素缺乏症、特纳综合征、慢性肾功能衰竭引起的身材矮小、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、短肠综合症、FGFR3突变的软骨发育不全。
在本发明中，如果没有特别说明，术语“rhGH”、“生长激素”、“hGH”、“人生长激素”可互换使用。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下通过实施例详细说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制
实施例1：rhGH-Fc/Fc表达载体的设计与构建
1.1目的基因设计与合成
根据目的蛋白氨基酸序列，设计目的基因核苷酸序列，根据大肠杆菌偏爱密码子进行优化，确定其核苷酸序列如SEQ ID NO:3(第一变体)、SEQ ID NO:4(第二变体)。设计序列委托宝生物工程(大连)有限公司合成。
SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列如下：
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAGCTTCCCGACCATCCCGCTGTCTCGTCTGTTCGACAACGCTATGCTGCGTGCTCACCGTCTGCACCAGCTGGCGTTCGACACCTACCAGGAATTTGAAGAAGCTTACATCCCGAAAGAACAGAAATACTCTTTCCTGCAGAACCCGCAGACCTCTCTGTGCTTCTCTGAATCTATCCCGACCCCGTCTAACCGTGAAGAAACCCAGCAGAAATCTAACCTGGAACTGCTGCGTATCTCTCTGCTGCTGATCCAGTCTTGGCTGGAACCGGTTCAGTTCCTGCGTTCTGTTTTCGCTAACTCTCTGGTTTACGGTGCTTCTGACTCTAACGTTTACGACCTGCTGAAAGACCTGGAAGAAGGTATCCAGACCCTGATGGGTCGTCTGGAAGACGGTTCTCCGCGTACCGGTCAGATCTTCAAACAGACCTACTCTAAATTCGACACCAACTCTCACAACGACGACGCTCTGCTGAAAAACTACGGTCTGCTGTACTGCTTCCGTAAAGACATGGACAAAGTTGAAACCTTCCTGCGTATCGTTCAGTGCCGTTCTGTTGAAGGTTCTTGCGGTTTCGGAGCACCTCAGGGTGCTCCACAAGGCGCGCCGCAAAGCAAATACGGCCCGCCATGTCCACCGTGTCCAGCACCGAAGGCTGAAGGCGGTCCGTCTGTTTTTCTGTTTCCGCCGAAACCGAAAGACACCCTGATGATTAGTCGTACCCCGGAAGTTACCTGCGTTGTTGTTGACGTCAGCCAGGAAGATCCGGAAGTTCAGTTCAACTGGTACGTTGACGGCGTTGAAGTTCATAACGCGAAAACCAAACCGCGCGAAGAACAGTTCAACAGTACCTATCGCGTTGTTAGCGTACTGACCGTTCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAATGCAAAGTCAGCAACAAAGGCCTGCCGAGCAGCATTGAAAAAACCATCAGCAAAGCGAAAGGCCAACCGCGCGAACCGCAAGTTTATACCCTGCCGCCGTCTCAGGAAGAAATGACCAAAAACCAGGTCAGCCTGTGGTGTCTGGTTAAAGGCTTCTACCCGAGCGATATCGCAGTTGAGTGGGAAAGTAACGGTCAACCGGAGAACAACTATAAAACCACCCCGCCGGTTCTGGATAGCGACGGTAGCTTTTTCCTGTACAGTCGTCTGACCGTTGATAAAAGCCGTTGGCAGGAAGGCAACGTTTTTAGCTGTAGCGTCATGCACGAAGCCCTGCATAACCATTACACCCAGAAAAGCCTGAGCCTGAGTCTGGGTAAATAATAAGGATCC
SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列如下：
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGTCTAAATACGGCCCGCCATGTCCACCGTGTCCAGCACCGGAGGCTAAAGGTGGTCCGAGCGTGTTCCTGTTTCCACCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTTCTCGTACTCCGGAGGTAACTTGCGTAGTAGTTGATGTGAGCCAGGAAGATCCGGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTTGACGGTGTTGAGGTTCATAACGCCAAGACTAAACCACGTGAAGAACAGTTCCAAAGCACCTACCGTGTGGTAAGCGTGCTGACCGTTCTGCACCAAGATTGGCTGCAAGGTAAGGAGTACAAATGTAAAGTAAGCAACAAAGGCCTGCCGAGCAGCATTGAGAAGACCATCTCTAAGGCTAAAGGTCAACCACGCGAGCCGCAGGTGTACACTCTGCCACCAAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCTCTGAGTTGTGCAGTTAAGGGTTTCTACCCGAGCGATATTGCGGTAGAATGGGAATCTCAAGGTCAGCCGGAGAACAACTATAAGACCACTCCACCAGTTCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTCCTGGTATCCCGTCTGACCGTTGACAAATCCCGTTGGCAGGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTTCTGTTATGCACGAGGCGCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCTCTGTCCCTGAGCCTGGGTAAATAATAAGGATCC
SEQ ID NO:3(第一变体)编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示：SFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGAPQGAPQGAPQSKYGPPCPPCPAPKAEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:4(第二变体)编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示：
SKYGPPCPPCPAPEAKGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLQGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESQGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
1.2表达载体的构建
目的基因两端分别具有XbaI和BamHI酶切位点，分别用XbaI和BamHI双酶切目的基因序列及pET-28a(+)载体，切胶回收，酶切后的目的基因片段与pET-28a(+)酶切后长片段连接，转化，筛选，得表达目的基因的基因工程菌。
实施例2：rhGH-Fc/Fc蛋白的表达与纯化
目的基因工程菌接入装有LB培养基的药瓶中培养，待OD600达到1.6-2.0，转入5L发酵罐中培养，起始培养体积2.5L，培养温度37℃，搅拌转速600rpm，待OD600升至50开始诱导，诱导剂IPTG，浓度0.5mM，诱导时间4-6h.
镜检发酵液菌体生长，并观察表达状况。10000rpm,4℃离心收集菌体。
收集菌体高压匀浆破碎，破碎压力700-800Bar，至少2个循环，至镜检无完整细胞存在。离心收集包涵体。
体外组装：首先将第一变体及第二变体的包涵体蛋白分别溶解在相同的含8M尿素的包涵体溶解Buffer中，全部溶解后，二者按1：1比例混合，得包涵体溶解液，包涵体溶解液混合均匀后按1：10-1：100比例加入到组装缓冲液中，过夜静置放置。其中包涵体溶解Buffer含有下列组分：Tris或Tris-HCl，浓度50-100mM；NaCl，浓度100-150mM；精氨酸，浓度10-50mM；EDTA，浓度5-20mM；pH值6.0-8.0，上述组装缓冲液含有下列组分：Tris或Tris-HCl，浓度10-20mM；NaCl，浓度10-50mM；精氨酸，浓度100-500mM；GSSG，浓度10-20mM；GSH，浓度0-5mM；EDTA，浓度5-10mM，Buffer pH值5.0-7.0。
蛋白纯化：过夜静置混合液用1.0M盐酸调pH值3.0-3.5，进行protein A层析，洗脱液调pH值至6.0-7.0，分别进行疏水层析、阴离子层析，得纯化后目的蛋白。Protein A层析条件：平衡缓冲液：20mM Na2HPO4，0.15M NaCl，pH 7.0，洗脱缓冲液：0.1M glycine，pH 3.0，中和缓冲液：1M Tris，pH 8.5。疏水层析条件：平衡缓冲液：10-30mM Tris或Tris-HCl，0.5-1.0M NaCl，pH 6.0-7.0。洗脱缓冲液：10-30mM Tris或Tris-HCl，pH 6.0-7.0。阴离子层析条件：平衡缓冲液：10-30mM Tris或Tris-HCl,pH 6.0-7.0。洗脱缓冲液：10-30mM Tris或Tris-HCl，0.5-1.0M NaCl，pH 6.0-7.0。
实施例3：rhGH-Fc/Fc蛋白中刚性接头和柔性接头对细胞生物学活性的影响
将实施例1中SEQ ID NO:5中的刚性接头-(GAPQ)3-替换为柔性接头-(GGGGS)4-，按照实施例2中同样方法获得含有柔性接头的生长激素融合蛋白(样品名称GH(GGGGS)4)，并将其与实施例2中获得的rhGH-Fc/Fc蛋白(样品名称GH(GAPQ)3)进行生物学活性对比。
生物学活性检测过程：取对数生长期的BAF3/GHR细胞，用移液管将培养瓶中的细胞悬液转移至50ml离心管中，以1000rpm离心5min后弃上清液，以2ml分析培养基重悬细胞制成单细胞悬液，将细胞悬液加入装有15ml分析培养基的培养瓶内混匀，放入CO2培养箱饥饿24-36小时。
分析培养基组成如下表1所示：
| 名称 | 理论量 |
| FBS | 10％ |
| 100x的青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | 1％ |
| 100x的非必需氨基酸 | 2％ |
| 1mol/L的NaHCO<sub>3</sub> | 0.2％ |
| 潮霉素B | 1μg/mL |
| RPMI 1640培养基 | 补足至配制体积 |
取饥饿培养后的BAF3/GHR细胞，用移液管将培养瓶中的细胞悬液转移至50ml离心管中，以1000rpm离心5min后弃上清液，以2ml分析培养基重悬细胞制成单细胞悬液。取10μl单细胞悬液加入10μl台盼蓝染色液中，用细胞计数仪或显微镜计数。
以分析培养基调整细胞密度至2.0±0.2×105个/ml，以50μl/孔，铺于96孔细胞培养板的B-G行2-12列内，B-G行第一列每孔加50μl分析培养基，将96孔细胞培养板放入CO2培养箱中培养1h。
样品处理：以无菌水溶解供试品(样品GH(GGGGS)4、样品GH(GAPQ)3)至浓度为1mg/ml。供试品溶液的预稀释：以分析培养基将供试品稀释至浓度为100ng/ml的供试品溶液，每次稀释倍数不超过100倍。供试品：取一块透明96孔板作为稀释板，在稀释板中除B12–G12(阳性对照)和B2–G2外，其余每个孔加入100μl的分析培养基。稀释板的E2-G2孔中，分别加入100ng/ml供试品溶液150μl。使用12通道的微量移液器在酶标板上进行4倍稀释。从第一列(B2-G2)中吸出50μL，转移到第二列，混合二十次。然后从第二列中吸出50μL转移到第三列，混合二十次。在整个酶标板上重复这个步骤，直到B10-G10列。并从B10-G10列吸出50μL溶液后弃掉。
加入供试品：96孔细胞培养板培养1h后，使用12通道微量移液器，从稀释板的B行到G行的各孔中转移50μl到含有细胞的96孔培养板的相应孔中。转移后，轻轻晃动96孔细胞培养板30s，然后在CO2培养箱中培养68-72h。96孔细胞培养板培养完成后，向每个加药孔中加入10μl Alamar-Blue检测液，放入CO2培养箱中继续培养4小时。将96孔板放到酶标仪中，激发光544nm，发射光590nm，进行检测。
生物学活性检测结果如以下表2所示：
表2
| 样品名称 | EC50(nM) | 相对效力 |
| GH(GAPQ)<sub>3</sub> | 1.203 | 100％ |
| GH(GGGGS)<sub>4</sub> | 3.192 | 37.7％ |
上述表2结果显示，具有本发明的刚性接头的rhGH-Fc/Fc蛋白，相比含有柔性接头的生长激素融合蛋白，EC50更小，生物学活性更高。发明人发现，本发明提供的生长激素融合蛋白，利用刚性接头连接第一单体和双链结构体，使得蛋白保持自己的空间构象，不会产生结构“遮挡”现象。本发明采用刚性接头，能够避免Fc的N端对生长激素的近C端区域的活性位点的影响，从而能够进一步提升生长激素的细胞生物学活性。
实施例4：rhGH-Fc/Fc蛋白细胞生物学活性测定
采用实施例3中相同方法进行JHM0202和上市对照品(金赛增)的细胞生物学活性检测。rhGH-Fc/Fc蛋白以及上市对照品细胞生物学活性如表3(EC50：nM)。
表3
表3中1st、2nd、3rd是指三次生物学活性重复测定获得的结果。
上述数据看出，实施例2中纯化获得的rhGH-Fc/Fc蛋白样品(JHM0202)，呈现较上市对照品更小的EC50值(均值比1/2.98)。表明JHM0202蛋白具有更好的体外细胞生物学活性。
实施例5：rhGH-Fc/Fc蛋白与FcRn结合活性
rhGH-Fc/Fc蛋白为生长激素与IgG4 Fc的融合蛋白，IgG4 Fc以pH依赖的方式结合Fc受体(FcRn)，通过受体介导的再循环机制从而延长生长激素半衰期，用SPR技术检测rhGH-Fc/Fc蛋白与FcRn之间结合的亲和力常数(KD)。
脱盐柱处理FcRn样品，活化CM5芯片，将rhGH-Fc/Fc蛋白样品稀释至6μg/mL进样，偶联样品，封闭芯片。将分析物FcRn稀释到46.875、93.75、187.5、375、750、1500、3000和6000nM 8个浓度，进样检测，结合时间为60s，解离时间为90s。实验数据用平衡法拟合得到动力学数据，结果见表4。
表4JHM02样品与人类FcRn结合的亲和力数据(pH 6.0)
SPR结果显示rhGH-Fc/Fc样品(JHM0202)、IgG4 Fc与人类FcRn在pH6.0条件下亲和力相当，预示rhGH-Fc/Fc蛋白与天然人IgG4 Fc具有相似的体内半衰期，可以实现rhGH的体内长效。
实施例6：rhGH-Fc/Fc蛋白体内促生长生物学活性测定
实验采用幼龄雄性SD大鼠，耳道法手术摘除垂体，分别在术后2、3周时称重，选取2～3周体重增长率在±10％以内，外观健康的大鼠为造模成功模型。根据体重增长率(±6.0％)优选出40只模型，并按体重和体重增长率随机均衡分成4组，分别为模型对照组(0nmol/kg)，JHM0202受试样品组(51nmol/kg，每周注射一次)，上市对照品组(金赛增，51nmol/kg，每周注射一次)和诺泽对照组(9nmol/kg)(诺泽为一种普通生长激素，每天注射一次)，每组10只。另10只假手术大鼠设为正常对照组(0nmol/kg)。
分组后皮下注射给药，诺泽对照组每天给药1次，连续4周。其余实验组1次/周，共给药4次。测定指标：每天称量1次体重，并计算体重增长率。实验结果见附图2。基于体重增长率的数据结果可以看出：与模型对照组相比，各给药组均表现出显著的体重增长。JHM0202受试样品组和上市对照品组均达到了与假手术对照组正常大鼠相当的体重增长。与诺泽对照组相比，JHM0202受试样品组第28天的体重增长率显著大于诺泽对照组(p<0.05)。JHM0202受试样品组28天的体重增长率高于上市对照品组。上述结果表明JHM0202受试样品组显示出良好的体内促生长作用。
实施例7：rhGH-Fc/Fc蛋白体内药代动力学
供试样品JHM0202和上市对照品(金赛增)在大鼠体内的药代动力学。12只雄性大鼠，随机分为2组，供试品JHM0202组6只，上市对照品组6只，分别皮下单次注射JHM0202样品51nmol/kg及上市对照品51nmol/kg。各组样品采集时间点为：给药前(0h)及给药后2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、216h。
用ELISA法检测生物样品中血药浓度，并运用WinNonLin8.0软件按照非房室模型计算药代动力学参数；见表5。
表5大鼠单次皮下注射JHM02/金赛增平均药代参数(MEAN±SD)
大鼠单次皮下给予单剂量JHM0202及上市对照品后，两药物血药浓度均呈现先上升后下降的趋势，且达峰时间范围较为一致。JHM0202较上市对照品呈现出更小的体内消除常数Kel(1/3.6)及更长的体内消除半衰期T1/2(3.78/1)，达峰血药浓度Cmax，JHM0202高于上市对照品(1.25/1)，体内暴露程度AUC0-t，JHM0202也高于上市对照品(1.28/1)。揭示JHM0202较上市对照品具有更好的体内药代特性，能够实现更长的体内半衰期，长效化作用更明显。
实施例8：rhGH-Fc/Fc蛋白对大鼠IGF-1水平的影响
大鼠眶静脉丛采血约1mL，3800rpm离心分离血浆，Elisa法测定IGF-1的含量。
给药前、D3、D24，模型对照组大鼠血浆IGF-1含量显著低于正常对照组(p<0.05)。模型对照组、受试样品组、上市对照品组(金赛增)和诺泽对照组(一种普通生长激素，每天注射一次)，大鼠血浆IGF-1含量在给药前各组间无显著差异。表6显示了各实验组大鼠血浆IGF-1含量变化。
表6各实验组大鼠血浆IGF-1含量变化(pg/mL，n＝10，
)
注：*p＜0.05与模型组比较；
基于IGF-1的分析结果显示：给药前，各给药组大鼠血浆IGF-1含量显著低于正常对照组(p<0.05)，但各给药组间无显著差异。第3天，JHM0202受试样品组及上市对照品组大鼠血浆IGF-1含量显著大于诺泽对照组(p<0.05)，且JHM0202受试样品组大鼠血浆IGF-1含量大于上市对照品组，更大于正常对照组。第24天，JHM0202受试样品组及上市对照品组大鼠血浆IGF-1含量显著大于诺泽对照组(p<0.05)，JHM0202受试样品组大鼠血浆IGF-1含量大于上市对照品组，同时大于正常对照组。说明JHM0202受试样品组较上市对照品组具有更好的体内刺激生长作用，同时也较诺泽对照组具有非常好的体内刺激生长作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 君合盟生物制药（杭州）有限公司
<120> 生长激素融合蛋白及其制备方法和用途
<130> BI3212034
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 192
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 生长激素的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa表示G、A或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (183)..(183)
<223> Xaa表示G、A、S、C或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (190)..(190)
<223> Xaa表示G、A、S、C或缺失
<400> 1
Xaa Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe
20 25 30
Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn
35 40 45
Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser
65 70 75 80
Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
100 105 110
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
115 120 125
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr
130 135 140
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn
145 150 155 160
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
165 170 175
Phe Leu Arg Ile Val Gln Xaa Arg Ser Val Glu Gly Ser Xaa Gly Phe
180 185 190
<210> 2
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第一恒定区Fc段或第二恒定区Fc段的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa表示R、K、D、E或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa表示R、K、D、E或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa表示A、R、K、D、E或缺失
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> Xaa表示D、E、G、Q或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (96)..(96)
<223> Xaa表示D、E、G、Q或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (147)..(147)
<223> Xaa表示G、S或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (149)..(149)
<223> Xaa表示A、G、P或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (165)..(165)
<223> Xaa表示D、E、G、Q或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (188)..(188)
<223> Xaa表示I、P、V或Y
<400> 2
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Xaa Pro Pro Xaa Pro Ala Pro Xaa Ala Xaa
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Xaa
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Xaa Cys Xaa Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Xaa Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Xaa Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 3
<211> 1352
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第一变体的核苷酸序列
<400> 3
tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac catgagcttc ccgaccatcc 60
cgctgtctcg tctgttcgac aacgctatgc tgcgtgctca ccgtctgcac cagctggcgt 120
tcgacaccta ccaggaattt gaagaagctt acatcccgaa agaacagaaa tactctttcc 180
tgcagaaccc gcagacctct ctgtgcttct ctgaatctat cccgaccccg tctaaccgtg 240
aagaaaccca gcagaaatct aacctggaac tgctgcgtat ctctctgctg ctgatccagt 300
cttggctgga accggttcag ttcctgcgtt ctgttttcgc taactctctg gtttacggtg 360
cttctgactc taacgtttac gacctgctga aagacctgga agaaggtatc cagaccctga 420
tgggtcgtct ggaagacggt tctccgcgta ccggtcagat cttcaaacag acctactcta 480
aattcgacac caactctcac aacgacgacg ctctgctgaa aaactacggt ctgctgtact 540
gcttccgtaa agacatggac aaagttgaaa ccttcctgcg tatcgttcag tgccgttctg 600
ttgaaggttc ttgcggtttc ggagcacctc agggtgctcc acaaggcgcg ccgcaaagca 660
aatacggccc gccatgtcca ccgtgtccag caccgaaggc tgaaggcggt ccgtctgttt 720
ttctgtttcc gccgaaaccg aaagacaccc tgatgattag tcgtaccccg gaagttacct 780
gcgttgttgt tgacgtcagc caggaagatc cggaagttca gttcaactgg tacgttgacg 840
gcgttgaagt tcataacgcg aaaaccaaac cgcgcgaaga acagttcaac agtacctatc 900
gcgttgttag cgtactgacc gttctgcatc aggattggct gaacggcaaa gagtacaaat 960
gcaaagtcag caacaaaggc ctgccgagca gcattgaaaa aaccatcagc aaagcgaaag 1020
gccaaccgcg cgaaccgcaa gtttataccc tgccgccgtc tcaggaagaa atgaccaaaa 1080
accaggtcag cctgtggtgt ctggttaaag gcttctaccc gagcgatatc gcagttgagt 1140
gggaaagtaa cggtcaaccg gagaacaact ataaaaccac cccgccggtt ctggatagcg 1200
acggtagctt tttcctgtac agtcgtctga ccgttgataa aagccgttgg caggaaggca 1260
acgtttttag ctgtagcgtc atgcacgaag ccctgcataa ccattacacc cagaaaagcc 1320
tgagcctgag tctgggtaaa taataaggat cc 1352
<210> 4
<211> 740
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第二变体的核苷酸序列
<400> 4
tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac catgtctaaa tacggcccgc 60
catgtccacc gtgtccagca ccggaggcta aaggtggtcc gagcgtgttc ctgtttccac 120
cgaaaccgaa agataccctg atgatttctc gtactccgga ggtaacttgc gtagtagttg 180
atgtgagcca ggaagatccg gaggtgcagt tcaactggta tgttgacggt gttgaggttc 240
ataacgccaa gactaaacca cgtgaagaac agttccaaag cacctaccgt gtggtaagcg 300
tgctgaccgt tctgcaccaa gattggctgc aaggtaagga gtacaaatgt aaagtaagca 360
acaaaggcct gccgagcagc attgagaaga ccatctctaa ggctaaaggt caaccacgcg 420
agccgcaggt gtacactctg ccaccaagcc aggaagagat gaccaagaat caggtgtctc 480
tgagttgtgc agttaagggt ttctacccga gcgatattgc ggtagaatgg gaatctcaag 540
gtcagccgga gaacaactat aagaccactc caccagttct ggattccgac ggctctttct 600
tcctggtatc ccgtctgacc gttgacaaat cccgttggca ggaaggcaac gtgttctctt 660
gttctgttat gcacgaggcg ctgcacaacc actacaccca gaagtctctg tccctgagcc 720
tgggtaaata ataaggatcc 740
<210> 5
<211> 432
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第一变体编码的氨基酸序列
<400> 5
Ser Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe
20 25 30
Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn
35 40 45
Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser
65 70 75 80
Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
100 105 110
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
115 120 125
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr
130 135 140
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn
145 150 155 160
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
165 170 175
Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
Gly Ala Pro Gln Gly Ala Pro Gln Gly Ala Pro Gln Ser Lys Tyr Gly
195 200 205
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Lys Ala Glu Gly Gly Pro Ser
210 215 220
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
225 230 235 240
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
245 250 255
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
260 265 270
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
275 280 285
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
290 295 300
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
305 310 315 320
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
340 345 350
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
355 360 365
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
370 375 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
385 390 395 400
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
405 410 415
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
420 425 430
<210> 6
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第二变体编码的氨基酸序列
<400> 6
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Lys
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Gln
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Gln Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
Claims (23)
1.一种生长激素融合蛋白，其特征在于，包括：
双链结构体，所述双链结构体具有第一恒定区Fc段和第二恒定区Fc段；和
生长激素，所述生长激素与所述双链结构体的所述第一恒定区Fc段相连，
其中，
所述生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，
所述生长激素融合蛋白是由非哺乳细胞表达体系表达的。
2.根据权利要求1所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述生长激素融合蛋白无糖基化修饰。
3.根据权利要求1所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述非哺乳细胞表达体系至少包括原核表达体系和低等真核表达体系二者之一，优选所述非哺乳细胞表达体系至少包括大肠杆菌表达体系和酵母表达体系的二者之一。
4.根据权利要求1所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述生长激素具有下列氨基酸序列之一：
(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，
X1FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQX2RSVEGSX3GF，
X1表示G、A或S，
X2表示G、A、S、C或缺失，
X3表示G、A、S、C或缺失；
或
(b)与(a)具有至少90％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，进一步包括：
连接肽，所述连接肽的一端与所述生长激素相连，另一端与所述双链结构体相连，所述连接肽含有至少一个序列单元GXaa1PXaa2，
其中，在每个所述序列单元中，每个Xaa1分别独立地表示A、E和K之一，每个Xaa2分别独立地表示Q和N之一。
6.根据权利要求5所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述连接肽含有1～20个所述序列单元，优选1～5个，更优选3个。
7.根据权利要求5所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述生长激素的C末端与所述连接肽相连。
8.根据权利要求1所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述第一恒定区Fc段和所述第二恒定区Fc段具有不同的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的生长激素激素融合蛋白，其特征在于，所述第一恒定区Fc段和所述第二恒定区Fc段适于在体外形成异二聚体。
10.根据权利要求8或9所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述第一恒定区Fc段和所述第二恒定区Fc段分别独立地具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列：
SKYGPPX4PPX5PAPX6AX7GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFX8STYRVVSVLTVLHQDWLX9GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLX10CX11VKGFYPSDIAVEWESX12GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLX13SRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
其中，
X4表示R、K、D、E或C；
X5表示R、K、D、E或C；
X6表示R、K、D、E或缺失；
X7表示A、R、K、D、E或缺失；
X8表示D、E、G、Q或N；
X9表示D、E、G、Q或N；
X10表示G、S或W；
X11表示A、G、P或L；
X12表示D、E、G、Q或N；
X13表示I、P、V或Y。
11.根据权利要求10所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，X4、X5、X6和X7中至少一个为K或E或C。
12.根据权利要求10所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，在所述第一恒定区Fc段中，
X4表示C；
X5表示C；
X6表示K；
X7表示E；
X8表示N；
X9表示N；
X10表示W；
X11表示L；
X12表示N；
X13表示Y。
13.根据权利要求10所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，在所述第二恒定区Fc段中，
X4表示C；
X5表示C；
X6表示E；
X7表示K；
X8表示Q；
X9表示Q；
X10表示S；
X11表示A；
X12表示Q；
X13表示V。
14.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～13中任一项所述的生长激素融合蛋白。
15.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求14所述的核酸分子。
16.一种重组细胞，其特征在于，含有：
权利要求14所述的核酸分子；或者
权利要求15所述的表达载体。
17.一种制备权利要求1～13中任一项所述的生长激素融合蛋白的方法，其特征在于，包括：
获取双链结构体的第一单体和第二单体，其中，所述第一单体具有第一恒定区Fc段，所述第二单体具有第二恒定区Fc段，所述第一恒定区Fc段连接有生长激素；和
使所述第一单体和所述第二单体形成异二聚体，以便获得所述生长激素融合蛋白。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述异二聚体是在体外形成的。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述第一单体和所述第二单体是在非哺乳细胞表达体系中表达的。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述第一单体和所述第二单体是相同的所述非哺乳细胞表达体系中表达的。
21.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～13中任一项所述的生长激素融合蛋白。
22.权利要求1～13中任一项所述的生长激素融合蛋白、权利要求14所述的核酸分子、权利要求15所述的表达载体、权利要求16所述的重组细胞、权利要求17～20中任一项所述的方法制备获得的生长激素融合蛋白、权利要求21所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防生长激素异常相关疾病。
23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于，所述生长激素异常相关疾病至少包括选自下列之一：
儿童生长激素缺乏症、特纳综合征、慢性肾功能衰竭引起的身材矮小、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、短肠综合症、FGFR3突变的软骨发育不全。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111658414.XA CN115819611B (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 生长激素融合蛋白及其制备方法和用途 |
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