CN106167528A - Exendin‑4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白和制备方法及用途 - Google Patents

Exendin‑4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白和制备方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN106167528A
CN106167528A CN201610555622.XA CN201610555622A CN106167528A CN 106167528 A CN106167528 A CN 106167528A CN 201610555622 A CN201610555622 A CN 201610555622A CN 106167528 A CN106167528 A CN 106167528A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion protein
serum albumin
human serum
hsa
lixisenatide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610555622.XA
Other languages
English (en)
Inventor
李树刚
张伟
辛渝
柴新娟
程丹凝
杨丹丹
余英鹏
曹莉君
于廷和
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHONGQING KERUN BIOMEDICAL R&D Co Ltd
Original Assignee
CHONGQING KERUN BIOMEDICAL R&D Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHONGQING KERUN BIOMEDICAL R&D Co Ltd filed Critical CHONGQING KERUN BIOMEDICAL R&D Co Ltd
Priority to CN201610555622.XA priority Critical patent/CN106167528A/zh
Publication of CN106167528A publication Critical patent/CN106167528A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种Exendin‑4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白和制备方法及用途，该融合蛋白由2分子Lixisenatide串联，其C端与人血清白蛋白N‑端连接，或者2分子Lixisenatide串联后，通过连接肽与人血清白蛋白连接，其结构式为(Lixisenatide)2‑HSA或者(Lixisenatide)2‑linker‑HSA。该融合蛋白属长效药物‑重组融合蛋白可有效降低动物体内血糖浓度，并延长Lixisenatide的半衰期。该融合蛋白在治疗II型糖尿病、肥胖症、脂肪肝及多囊卵巢综合症方面具有良好的应用前景。

Description

Exendin-4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白和制备方法及 用途
技术领域
本发明涉及生物技术与基因工程制药领域，特别涉及一种Exendin-4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白及制备方法和用途。
背景技术
促胰岛素分泌肽(Exendin-4)是一条39个氨基酸组成的直链多肽，发现于南美巨蜥的唾液中，其氨基酸序列与人类血液中调控血糖的胰高血糖素类似肽GLP-1有53％的同源性。Exendin-4是一种GLP-1受体激动剂，能模拟GLP-1这种内源性多肽的糖调控作用，降低空腹和餐后血糖。Exendin-4的活性主要通过与人体胰脏GLP-1受体结合而介导，由环腺苷酸(cAMP)依赖和β细胞分化机制引发葡萄糖依赖的胰岛素合成和分泌。Exendin-4不被二肽基肽酶－IV(DPP-IV)降解，在治疗II型糖尿病方面引起广泛关注，但Exendin-4药物有半衰期短的问题。
Lixisenatide是Exendin-4的突变体，其结构为将Exendin-4去掉38位的Pro，并在39位的Ser接6个Lys。经过了结构修饰，Lixisenatide的半衰期相对Exendin-4有所延长，可每日一次皮下注射，但作为II型糖尿病的治疗药物其半衰期仍然较短。
人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)是血液中的一个非常重要的天然蛋白，分子量约为66KD，具有多种生物学功能，是许多生物因子的载体蛋白，因其不能被肾小球滤过，在血液中半衰期长达14-21天，通常被用于药物的载体，以延长药物的半衰期。
目前，Exendin-4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白还未见报道。
发明内容
本发明目的是提供一种Exendin-4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白及制备方法和用途。所述融合蛋白在保持Lixisenatide的生物活性同时，延长其半衰期，使之成为新一代长效治疗糖尿病药物，并能在治疗肥胖症、脂肪肝及多囊卵巢综合症方面起作用。
本发明的技术方案是：
一种Exendin-4突变体(Lixisenatide)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示或氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述人血清白蛋白为人血清白蛋白全序列或者人血清白蛋白部分结构域片段。
所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的融合蛋白由1分子Lixisenatide的C-端与1分子Lixisenatide的N-端直接串联，2分子Lixisenatide串联后C-端与人血清白蛋白N-端直接连接，其结构通式为(Lixisenatide)2-HAS。
所述氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的融合蛋白由1分子Lixisenatide的C-端与1分子Lixisenatide的N-端直接串联，2分子Lixisenatide串联后C-端与人血清白蛋白N-端通过连接肽连接，其结构通式为(Lixisenatide)2-Linker-HSA。
所述连接肽为序列(GGGGS)n的肽，其中n为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，优选n为3。
含有上述融合蛋白的编码基因的表达载体，优选地，所述表达载体选自pPIC9，或者pPIC9K，或者pPICZαA，或者pPICZαB，或者pPICZαC，或者pPICZA，或者pPICZB，或者pPICZC，或者pPIC3.5K。
包含上述表达载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞为细菌或真菌；优选地，所述宿主细胞为酵母；优选地，所述宿主菌为毕赤酵母；优选地，所述毕赤酵母选自KM71，或者GS115，或者X-33，或者SMD1168。
上述融合蛋白的制备方法，有以下步骤：
1)构建融合蛋白重组表达载体(Lix)2-HSA-pPIC9、(Lix)2-L-HSA-pPIC9，获得重组表达工程菌(Lix)2-HSA-pPIC9/GS115、(Lix)2-L-HSA-pPIC9/GS115；
2)转化酵母宿主细胞；
3)培养能够表达权利要求1所述的融合蛋白宿主细胞；
4)从所述宿主细胞的培养物中回收所述融合蛋白；
5)回收的融合蛋白纯化，得到Exendin-4突变体(Lixisenatide)与人血清白蛋白(HSA)的重组融合蛋白。
上述融合蛋白在制备治疗糖尿病药物中的用途或制备用于减肥制剂中的用途。
上述融合蛋白在制备治疗心血管疾病或脂肪肝或多囊卵巢综合症药物中的用途。
本发明针对Lixisenatide半衰期短问题，采用基因工程技术制备两分子Lixisenatide与人血清白蛋白的融合蛋白，可增加Lixisenatide的稳定性，延长其在人体内的半衰期，提高对糖尿病的治疗效果；本发明所述融合蛋白用于制备治疗糖尿病药物，具有高稳定性、低副作用的良好效果。同时运用融合蛋白技术可以避免复杂的化学修饰和处理过程，易操作，降低成本。
本发明的有益效果是：
本发明采用基因重组技术，将2分子Exendin-4突变体Lixisenatide和人血清白蛋白进行融合表达，在保持Lixisenatide的药理特性的基础上延长其在体内的半衰期。在药学领域包括II型糖尿病、肥胖症、脂肪肝、心血管疾病及多囊卵巢综合症治疗方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明构建的表达质粒结构图；
图2为本发明构建的毕赤酵母表达工程菌摇瓶诱导筛选结果；
图3为本发明制备的融合蛋白SDS-PAGE电泳图；
图4为N端测序图谱；
图5为融合蛋白体外生物活性测定结果，其中，图5-1为转染后的细胞过表达GLP-1R蛋白的测定结果，图5-2为阳性细胞株筛选的测定结果，图5-3为融合蛋白生物活性检测结果；
图6为正常小鼠的糖耐量测试结果，其中，图6-1、图6-2、图6-3分别为0.5h、12h、30h小鼠糖耐量反应的实验结果；
图7为糖尿病模型鼠测试结果；
图8为肥胖鼠模型测试结果，其中，图8-1为1-14天融合蛋白在肥胖模型鼠上减肥结果，图8-2为14天后融合蛋白在肥胖模型鼠上减肥结果。
具体实施方式
实施例1 重组促胰岛素分泌肽突变体(Lixisenatide)融合蛋白工程菌构建
1、工程菌构建
Exendin-4突变体Lixisenatide(Lix)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，人血清白蛋白(HSA)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将2分子Lixisenatide和人血清白蛋白直接连接，融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，相应的编码核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
将2分子Lixisenatide和人血清白蛋白用连接肽(L)连接，融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，相应的编码核酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述融合蛋白对应的编码核酸序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6，分别在5’端加上pPIC9载体序列CTCGAGAAAAGA(下划线为XhoI识别序列)，分别在3’端加上序列TGATAA (下划线为两个终止密码子序列，方框为NotI识别序列)。
将设计的融合蛋白核酸序列委托通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成，并通过XhoI/NotI位点亚克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9，构建获得表达载体(Lix)2-HSA-pPIC9、(Lix)2-L-HSA-pPIC9，构建示意图如图1所示。
将构建的两种表达载体用SacI限制性核酸内切酶进行酶切，分别制备10μg线性化载体。用电击方法转化GS115感受态细胞，MD营养缺陷型平板筛选阳性克隆，获得重组表达工程菌(Lix)2-HSA-pPIC9/GS115、(Lix)2-L-HSA-pPIC9/GS115。
2、工程菌诱导筛选
分别接种4株(Lix)2-HSA-pPIC9/GS115，4株(Lix)2-L-HSA-pPIC9/GS115工程菌至100ml BMGY培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％无氨基酵母氮碱，1％甘油，0.00004％生物素，0.1M磷酸钾，pH6.0)，在1L三角瓶中，30℃，250rpm摇床培养过夜。第二天取100μl菌液测酵母OD600值为2-8时，4000g离心10min收集菌体，在25ml BMMY中重悬(1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％无氨基酵母氮碱，0.5％甲醇，0.00004％生物素，0.1M磷酸钾，pH6.0)，在250ml三角瓶中，250rpm，28℃诱导培养，每隔24h加入250ul甲醇诱导(甲醇终浓度为1％)，取样电泳。
结果如图2所示，泳道0为空载体对照诱导72h上清；泳道M为蛋白分子量标准；S1表示(Lix)2-HSA-pPIC9/GS115工程菌，泳道S1-1、S1-2、S1-3、S1-4为随机挑选4株工程菌诱导72h上清；S2表示(Lix)2-L-HSA-pPIC9/GS115工程菌，泳道S2-1、S2-2、S2-3、S2-4为随机挑选4株工程菌诱导72h上清。与空载体对照比较，在理论分子量76kD处，(Lix)2-HSA-pPIC9/GS115和(Lix)2-L-HSA-pPIC9/GS115工程菌均实行分泌表达，表达量占上清总蛋白30％以上。
实施例2 重组促胰岛素分泌肽突变体(Lixisenatide)融合蛋白工程菌发酵
将构建的毕赤酵母表达工程菌在固体YPG培养皿上划线，30℃恒温培养箱培养约2d，至单菌落长出。挑工程菌单菌落接种至30ml YPG培养基中，30℃，250rpm培养24h。1％转接至250ml YPG，摇菌1000ml，30℃，250rpm培养20h。10％接种至发酵罐NLF-22 10L FBS培养基中，接种前用氨水将pH调至5.0，发酵过程控制温度为28℃。培养基的pH值和溶氧通过流加氨水和增加搅拌速度和通气量来控制，溶氧大余30％。约20h后培养基中的碳源耗尽，菌密度达到100mg/ml，之后以300mL/h/10L培养基的速度开始流加补料培养基(50％甘油)继续培养，菌体量可以达到200mg/ml，以12mL/h/10L培养基的速度流加甲醇开始诱导，流加甲醇维持3-6h，之后提高甲醇流加速率并维持DO在30％以上。诱导表达时pH6.0，诱导时长48h。
实施例3 重组促胰岛素分泌肽突变体(Lixisenatide)融合蛋白分离纯化
1、菌体分离
发酵液用高速冷冻离心机分离菌体。离心力8000g，离心温度8-10℃，每次离心15分钟，收集上清，去沉淀。用0.45μm的中空纤维超滤柱微滤澄清，膜面积1平方米(GE生产)。
2、用Pheny Sepharose 6-Fast Flow(高取代基)进行初步纯化
1)层析柱规格：Ф10.0×H30(cm*cm)；柱床容量Ф10.0×H12(cm*cm)，940ml；
2)层析柱处理：用0.5M氢氧化钠清洗2000ml，用纯化水清洗至中性，流速200ml/min；
3)柱平衡：用20mM PB、1M硫酸铵、pH6.3的平衡缓冲液(20mM PB+0.5M NaCl)，平衡5000ml；流速200ml/min；
4)样品处理与进样：取“1“中微滤样品12L，加入4M硫酸铵溶液3L，使样品中硫酸铵的终浓度为1M；并用1M磷酸调节pH至6.3～6.4，进样，流速为100ml/min；
5)再平衡：完成进样后，用平衡缓冲液再平衡4000毫升(至基线附近)，流速200ml/min；
6)洗脱：洗脱流速200ml/min
①用20mM PB、0.5M硫酸铵pH6.3的缓冲液洗脱；洗脱体积2000毫升
②用20mM PB、0.2M硫酸铵pH6.3的缓冲液洗脱；洗脱体积2000毫升；
③用20mM PB pH6.3缓冲液洗脱；洗脱体积3000毫升，收集目的峰1500-1600毫升
④用纯化水洗脱；洗脱体积2000毫升；
3、Q-Sepharose-Fast Flow阴离子交换层析
1)层析柱规格：Ф5.0×H20(cm*cm)；柱床容量Ф5.0×H15(cm*cm)，290ml；
2)层析柱处理：用0.5M氢氧化钠清洗1000ml，用纯化水清洗至中性，再用2M氯化钠再生1000mnl，最后用纯化水清洗至电导率为1500～2000μs/cm，流速50ml/min；
3)层析柱平衡：用平衡缓冲液平衡，平衡体积为5倍柱体积(1500毫升)流速50ml/min；
4)样品处理：取用Pheny Sepharose 6-Fast Flow层析获得样品1500毫升(蛋白浓度约1.8～2.2mg/ml)，用1M氢氧化钠调节pH值至8.0，再用平衡缓冲液将样品稀释至3000毫升；
5)进样：流速为50ml/min，进样结束后，继续用平衡缓冲液平衡至检测器吸收值至基线附近(需平衡约3倍柱体积)；
6)洗脱，流速50ml/min
①用20mM PB、0.05M氯化钠pH8.0的缓冲液洗脱；洗脱体积500毫升；
②用20mM PB、0.1M氯化钠pH8.0的缓冲液洗脱；洗脱体积500毫升
③用20mM PB、0.2M氯化钠pH8.0的缓冲液洗脱；洗脱体积1000毫升，收集目的峰600-700毫升；
4、Butyl-Sepharose-4Fast Flow疏水层析
1)层析柱规格：Ф3.5×H40(cm*cm)；柱床容量Ф3.5×H26(cm*cm)，250ml；
2)层析柱处理：用0.5M氢氧化钠清洗500ml，用纯化水清洗至中性，流速20ml/min；
3)层析柱平衡：平衡缓冲液为20mM PB、1M硫酸铵pH7.4，平衡体积1000ml，流速20ml/min；
4)样品处理：取Q-Sepharose-Fast Flow阴离子交换层析获得的样品600毫升，加入加入4M硫酸铵溶液200ml，使样品中硫酸铵的终浓度为1M；用1M磷酸调节pH值至7.4，进样，流速为20ml/min；
5)再平衡：完成进样后，用平衡缓冲液再平衡2倍柱体积，然后洗脱；
6)洗脱：
①用20mM PB，0.5M硫酸铵pH7.4的缓冲液洗脱，
②用20mM PB，0.3M硫酸铵pH7.4的缓冲液洗脱，
③用20mM PB，0.2M硫酸铵pH7.4的缓冲液洗洗脱
④用20mM PB，pH7.4的缓冲液洗脱；收集洗脱峰(为目标组分)体积约600-750毫升；
5、超滤浓缩
1)超滤膜选型：波尔公司生产超滤夹具和超滤膜，膜面积0.1平方米，截留分子量范围10000Da；
2)超滤缓冲液：2L 20mM PB，pH7.4，
3)超滤：用超滤膜包先把样品浓缩10倍后，加入稀释缓冲液至原体积，再浓缩5倍，浓缩参数为泵转速为75转/分钟,流穿速率45毫升/分钟，压力0.15Mpa；浓缩后样品，用0.45μm针筒式过滤器过滤，即为原液。
6、SDS-PAGE检测
采用SDS-PAGE对分离纯化获得目的蛋白进行纯度分析，电泳纯度大于95％。如图3所示，泳道S1表示(Lixisenatide)2-HSA融合蛋白；泳道S2表示(Lixisenatide)2-linker-HSA融合蛋白；泳道M为蛋白质分子量标准。
实施例4 N端测序
将上述方法制备得到的融合蛋白，进行N末端氨基酸序列测定。经中国科学院上海生命科学研究院检测，测定结果与设计一致，与Lixisenatide N端序列一致，见图4。
实施例5 融合蛋白的体外生物活性检测
1、转染细胞
为了证明本发明的融合蛋白保留有Exendin-4的生物活性，使用HEK293-GLP-1R稳定细胞。Exendin-4特异性结合细胞膜上GLP-1R靶点，其生物功能是引起细胞胞内cAMP浓度变化。通过Exendin-4阳性药筛选稳定表达GLP-1R的细胞。
预先将HEK293细胞在6孔板中培养24h备用。用100μL Opti-MEM试剂稀释质粒，混匀后加入转染试剂MegaTran(质粒w/转染试剂v，1:3)，混匀后，静置10min。将质粒-转染试剂混合物加入6孔板细胞中，3-4h换成生长培养基。
2、阳性细胞株筛选
用western blot检测GLP-1R表达情况。10％SDS-PAGE，200V电泳30min。110V恒压转膜2h，5％脱脂奶粉室温封闭2h，1:500稀释GLP-1R抗体(Santa Cruz Biotechnology,Sc-66911)4度过夜孵育，1:1000稀释酶标二抗室温1h，加底物反应，曝光拍照。Western blot检测结果，HEK293细胞基本不表达GLP-1R，而转染后的细胞过表达GLP-1R蛋白，如图5-1所示。
用Exendin-4阳性药检测转染细胞HEK293-GLP-1R生物功能。将HEK293和HEK293-GLP-1R细胞均匀铺到96孔细胞培养板，无血清培养后。用0.5mM IBMX预处理细胞30min。加入不同浓度的艾塞那肽Ex-4(Baxter Pharmaceutical Solutions LLC,C254050)处理细胞15min。采用竞争酶联免疫吸附方法(ELISA)--Cyclic AMP检测试剂盒(cell signaling,4339)测定细胞内cAMP浓度。由此可知，HEK293细胞内cAMP浓度没有变化，而HEK293-GLP-1R细胞内cAMP浓度随艾塞那肽Ex-4浓度增加而增多，如图5-2所示。
上述两类结果说明HEK293-GLP-1R细胞成功转染并具有生物活性，可用于检测样品体外生物活性。
3、融合蛋白生物活性检测
将上述构建的HEK293-GLP1R细胞均匀铺到96孔细胞培养板，无血清培养后。用0.5mM IBMX预处理细胞30min。分别加入不同浓度艾塞那肽Ex-4(Baxter PharmaceuticalSolutions LLC,C254050)和融合蛋白样品(S1为(Lixisenatide)2-HSA融合蛋白；S2为(Lixisenatide)2-linker-HSA融合蛋白)，处理细胞15min。采用竞争酶联免疫吸附方法(ELISA)--Cyclic AMP检测试剂盒(cell signaling,4339)测定细胞内cAMP浓度，观察融合蛋白是否能有效促进cAMP变化。与阳性药物(艾塞那肽Ex-4)相比，融合蛋白组的cAMP显著升高，与艾塞那肽Ex-4有类似的作用，如图5-3所示。
由此可见，运用基因重组技术改造的长效药物有效的保留了生物活性。
实施例6 融合蛋白对正常小鼠的糖耐量实验
正常昆明小鼠(由重庆市中药研究院实验动物研究所提供)，体重为28-35g，禁食不禁水18h，然后腹腔分别给予生理盐水NS、阳性药物Exendin-4、融合蛋白(S1为(Lixisenatide)2-HSA融合蛋白；S2为(Lixisenatide)2-linker-HSA融合蛋白)，给药后于0.5h、12h、30h监测小鼠糖耐量反应。小鼠的糖耐量反应实验如下：灌胃15％葡萄糖溶液3g/kg(20mL/kg)，使用血糖仪(强生医疗器材有限公司)测定灌胃葡萄糖后的15、30、45、60、120min时血液中的葡萄糖浓度，然后绘制耐糖曲线图。
给药后0.5h、12h、30h小鼠糖耐量反应的实验结果如图6-1、图6-2、图6-3所示。
给药后0.5h检测糖耐量结果可知(图6-1)：给糖后15、30、45、60min融合蛋白S1、S2和Ex-4组血糖均显著低于NS组，S1、S2和Ex-4三组间没有显著性差异；给糖后120min，S1、S2组血糖仍低于NS组。
给药后12h检测糖耐量结果可知(图6-2)：给糖前，S1、S2和Ex-4组血糖值低于NS组；给糖后15、30、45、60、120min，S1、S2组血糖显著低于Ex-4组和NS组。Ex-4组血糖低于NS组，但没有显著性差异，说明Ex-4已经没有明显的控制血糖作用。
给药后30h检测糖耐量结果可知(图6-3)：给糖后15、30、45、60、120min，S1、S2血糖低于Ex-4组和NS组。Ex-4组血糖浓度曲线与NS组一致，Ex-4组已经没有控制血糖作用。
因此，S1、S2融合蛋白具有明显控制血糖浓度作用，且在体内作用时间明显延长，具有长效特点。
实施例7 融合蛋白在糖尿病模型鼠上药效观察
糖尿病模型鼠db/db(由重庆市中药研究院实验动物研究所提供)，其特征为高血糖，肥胖。本实验通过小鼠腹腔注射阴性对照HSA、融合蛋白(S1为(Lixisenatide)2-HSA融合蛋白；S2为(Lixisenatide)2-linker-HSA融合蛋白)(2mg/kg)，每两天一次，共12天，观察给药后0.5、1、2、24、48h血糖值。与阴性对照HSA相比，融合蛋白明显降低糖尿病模型鼠血糖值，具有显著降低血糖的作用，如图7所示。
实施例8：融合蛋白在肥胖模型鼠上减肥作用观察
8周龄的Zucker(fa/fa)大鼠适应性喂养2周后。每天1次给予阴性对照HSA、融合蛋白(S1为(Lixisenatide)2-HSA融合蛋白；S2为(Lixisenatide)2-linker-HSA融合蛋白)10μg/kg,ip，连续给药14天；然后按照每天给药2次10μg/kg,ip，连续给药42天。在初期20天，每天监测体重；第20天后每隔1周监测体重。结果如图8-1、图8-2所示，在最初14天，S1、S2组体重变化与对照组没有显著性差异；14天后，S1、S2组体重增长减缓，与对照组出现显著性差异。说明融合蛋白能明显抑制动物的食欲，从而减缓动物体重增长，具有减肥作用。

Claims (10)

1.一种Exendin-4突变体(Lixisenatide)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示或氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述人血清白蛋白为人血清白蛋白全序列或者人血清白蛋白部分结构域片段。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的融合蛋白由1分子Lixisenatide的C-端与1分子Lixisenatide的N-端直接串联，2分子Lixisenatide串联后C-端与人血清白蛋白N-端直接连接。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的融合蛋白由1分子Lixisenatide的C-端与1分子Lixisenatide的N-端直接串联，2分子Lixisenatide串联后C-端与人血清白蛋白N-端通过连接肽连接。
5.根据权利要求4所述的的融合蛋白，其特征在于：所述连接肽为序列(GGGGS)n的肽，其中n为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，优选n为3。
6.一种含有权利要求1所述融合蛋白的编码基因的表达载体。
7.一种包含权利要求6所述表达载体的宿主细胞。
8.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，有以下步骤：
1)构建融合蛋白重组表达载体(Lix)2-HSA-pPIC9、(Lix)2-L-HSA-pPIC9，获得重组表达工程菌(Lix)2-HSA-pPIC9/GS115、(Lix)2-L-HSA-pPIC9/GS115；
2)转化酵母宿主细胞；
3)培养能够表达权利要求1所述的融合蛋白宿主细胞；
4)从所述宿主细胞的培养物中回收所述融合蛋白；
5)回收的融合蛋白纯化，得到Exendin-4突变体(Lixisenatide)与人血清白蛋白(HSA)的重组融合蛋白。
9.权利要求1所述融合蛋白在制备治疗糖尿病药物中的用途或制备用于减肥制剂中的用途。
10.权利要求1所述融合蛋白在制备治疗心血管疾病或脂肪肝或多囊卵巢综合症药物中的用途。
CN201610555622.XA 2016-07-14 2016-07-14 Exendin‑4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白和制备方法及用途 Pending CN106167528A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610555622.XA CN106167528A (zh) 2016-07-14 2016-07-14 Exendin‑4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白和制备方法及用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610555622.XA CN106167528A (zh) 2016-07-14 2016-07-14 Exendin‑4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白和制备方法及用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106167528A true CN106167528A (zh) 2016-11-30

Family

ID=58066274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610555622.XA Pending CN106167528A (zh) 2016-07-14 2016-07-14 Exendin‑4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白和制备方法及用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106167528A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107298718A (zh) * 2017-08-04 2017-10-27 北京百华百汇生物科技有限公司 乌司他丁融合蛋白及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIKASH MANANDHAR AND JUNG-MO AHN: "Glucagon-like Peptide‑1 (GLP-1) Analogs: Recent Advances, New Possibilities, and Therapeutic Implications", 《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 *
LAURIE L. BAGGIO ET AL.: "An Albumin-Exendin-4 Conjugate Engages Central and Peripheral Circuits Regulating Murine Energy and Glucose Homeostasis", 《GASTROENTEROLOGY》 *
M. A. BUSH ET AL.: "Safety, tolerability, pharmacodynamics and pharmacokinetics of albiglutide, a long-acting glucagon-like peptide-1 mimetic,in healthy subjects", 《DIABETES, OBESITY AND METABOLISM》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107298718A (zh) * 2017-08-04 2017-10-27 北京百华百汇生物科技有限公司 乌司他丁融合蛋白及其制备方法与应用
CN107298718B (zh) * 2017-08-04 2020-10-23 北京百华百汇生物科技有限公司 乌司他丁融合蛋白及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106220724B (zh) 人成纤维细胞生长因子21重组蛋白及其制备方法和应用
CN108191981B (zh) 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法
CN101525386B (zh) Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备和用途
CN106432509B (zh) 一种治疗代谢疾病的重组人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其制备方法和应用
CN102816244A (zh) 一种Exendin-4肽与人血清白蛋白HSA的融合蛋白及其制备方法
CN101240033B (zh) 一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法
CN105440125A (zh) 地特胰岛素或其类似物的制备方法
CN101525387B (zh) 重组长效胰高血糖素样肽类似物及其制备方法
CN105198972A (zh) 一种高纯度重组人脑利钠肽的制备方法
CN104592381A (zh) 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法
CN105254763B (zh) 一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白、制备方法及其应用
CN111378027A (zh) 一种索玛鲁肽前体的制备方法
CN102796201B (zh) 一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法
CN101514229B (zh) 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物
CN113105561B (zh) 一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用
CN106608915A (zh) Glp-1(7-37)多肽类似物
CN106167528A (zh) Exendin‑4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白和制备方法及用途
CN101875699B (zh) 人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用
CN105218659B (zh) 人骨形成蛋白2成熟肽及其表达
CN104558148A (zh) 睫状神经营养因子突变体及其修饰型突变体和用途
CN109776653B (zh) 一种人血清白蛋白黏附肽及其应用
CN103467604B (zh) 一种睡眠肽融合蛋白及其应用
JPH02273193A (ja) 組換えインターロイキン―２融合蛋白質類
CN105085644A (zh) 一种蝎毒素蛋白包涵体的纯化与复性方法与应用
CN104945498A (zh) 长效化PEG-rExendin-4改构体偶联物的制备

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161130

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication