CN104945498A - 长效化PEG-rExendin-4改构体偶联物的制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基因重组Exendin-4改构体与Y型马来酰亚胺(Y-MAL-40K)聚乙二醇偶联而成的偶联产物制备工艺，相比未经PEG偶联修饰的rExendin-4，在人体内血浆半衰期明显延长，偶联物较好保留了rExendin-4生物学活性，达到减少用药次数，降低免疫原性作用，可以开发成治疗II型糖尿病的长效药物制剂。

Description

长效化PEG-rExendin-4改构体偶联物的制备

技术领域

本发明涉及一种长效化的II型糖尿病治疗药物，应用基因重组Exendin-4改构体与特定Y型聚乙二醇衍生物偶联的新型制备工艺，生物学活性稳定，体内代谢时间明显延长。属于基因工程多肽药物制备和长效蛋白药物开发技术领域。 

技术背景

GLP-1能在人体内血糖浓度增高时，刺激胰岛β细胞分泌胰岛素降低血糖，不会引起低血糖和体重增加，能保护患者的β细胞和修复受损的β细胞，延缓疾病进程。天然的GLP-1在体内会被DPP-IV迅速降解，其半衰期只有1-2分钟，限制了其本身作为药物开发的价值。近年来GLP-1类似物作为II型糖尿病的治疗药物倍受青睐，由美国Amylin和Elililly公司共同开发的Exenatide(商品名Byetta)已于2005年在美国上市，2011年在中国上市。Exendin-4是从希拉毒蜥(Heloderma suspectum)唾液中分离得到的含有39个氨基酸序列的GLP-1类似物，与天然的GLP-1有53％的结构同源性，能够与GLP-1受体结合。通过与GLP-1受体结合发挥促胰岛素分泌的作用，有效降低空腹和餐后血糖的作用，用于治疗II型糖尿病。并且Exendin-4对DPP-IV具有很好的耐受性，在体内半衰期约2小时，患者需要每日注射给药2次，患者使用不便，因此开发长效剂型或者非注射途径给药的制剂是该类药物发展的趋势。 

聚合物修饰技术是上世纪70年代发展起来的一种常用修饰技术，其中尤以聚乙二醇化技术为代表。该技术是将聚乙二醇(PEG)与蛋白药物化学结合，形成PEG与蛋白质或多肽的偶联物，制备长效蛋白质和多肽药物的制剂。 

用聚乙二醇对蛋白质药物修饰具有很多优点：a)增大蛋白质药物的分子量，减少被肾小球过滤的频率，提高药物在体内的半衰期；b)保护蛋白质免受蛋白酶的降解；c)屏蔽外源性蛋白质的免疫原性，减少副作用；d)蛋白质被修饰后仍能保持一定的活性，通过在体内长时间循环，起到稳定的治疗效果；e)聚乙二醇是FDA已经批准的药用材料，只要解决修饰剂和修饰工艺中的关键技术，就能迅速得到批准并投入应用。 

目前聚乙二醇化技术已发展到第二代------定点聚乙二醇化技术(Site-specific PEGylation)。定点聚乙二醇化技术可以特异地修饰蛋白药物的某一特定氨基酸，从而避免随机修饰的盲目性。这样既可以选择远离蛋白质多肽活性中心结构，减少非定点聚乙二醇化所带来的生物活性降低；又能选择性屏蔽某些抗原位点，减少免疫原性。同时，偶联物结构与活性保持高度一致。 

发明内容

本发明所要解决的首要技术课题是提供一种有利于工业化生产，且能明显减少用药次数，用于治疗II 型糖尿病的长效药物。 

本发明的技术方案：在rExendin-4非活性区C末端突变或插入一个Cys，以活化的Y型马来酰亚胺聚乙二醇衍生物为PEG修饰剂，rExendin-4中唯一的巯基加成到Y型PEG的马来酰亚胺的双键上，实现对蛋白质的定点修饰。 

rExendin-4原序列SEQ见序列表。 

本发明中rExendin-4改构体采用基因重组法，将Exendin-4原序列中第39位丝氨酸(Ser)基因突变为半胱氨酸(Cys)，或在其基因序列中终止密码子TGA前直接插入编码一个半胱氨酸的三联体密码子(TGT)，然后直接在大肠杆菌系统中发酵表达。与化学合成方法相比，生产简便，安全性好，无毒性试剂，制造成本低，且易于规模放大。 

本发明所选用聚乙二醇分子为Y型马来酰亚胺聚乙二醇衍生物(结构见下)，分子量为40,000道尔顿。相比直链或其他分子量低于40,000的支链聚乙二醇衍生物，具有更长的体内半衰期。 

Y型聚乙二醇修饰为巯基定点单取代偶联反应。 

本发明所要解决的另一个技术课题是提供上述rExendin-4改构体与Y型聚乙二醇偶联物的制备工艺。 

所述长效化PEG-rExendin-4的制备方法，控制缓冲体系的盐浓度范围在10～100mmol/L之间；pH值范围在6.0～9.0之间，优选7.5～8.5之间；加入重组Exendin-4与Y型马来酰亚胺聚乙二醇衍生物反应，控制两反应物的摩尔质量比范围在0.5～10之间，优选3～7之间；反应时间范围在0.5～24小时之间，优选1～5小时之间；控制反应温度范围在4℃～37℃之间，优选20℃～30℃之间。 

反应产物经过稀释、Q-Sepharose离子交换色谱层析分离纯化，收集各组分，用高效液相色谱法分别鉴定，收集主产物峰，即得一个聚乙二醇分子连接一个重组Exendin-4的PEG-rExendin-4。 

与现有技术相比，本发明具有突出的实质性特点和显著的技术进步。 

主要表现在以下3个方面： 

本发明所提供的聚乙二醇化重组Exendin-4药物的优点是提供在体内更长时间的血液水平，具有明显的长效性，减少注射次数而使患者容易接受； 

本发明所述的重组Exendin-4改构体是采用基因工程的方法，使用本研究室保藏的菌种，用大肠杆菌表达，经发酵、纯化后获得，纯度大于97％，且保持较高的生物活性；相比化学合成方法，具有安全高效、生产简易稳定、易于规模放大且周期短、成本低等优点； 

本发明采用对重组Exendin-4改构体的C末端定点单取代修饰方法，即以活化的Y型马来酰亚胺聚乙 二醇衍生物和重组Exendin-4改构体中唯一的巯基通过共价键方式连接，使产物的稳定性、均一性大大提高，容易纯化，纯化产物的生物学活性能够较好地保留，体内半衰期明显延长。 

附图概述 

图1rExendin-4与PEG不同摩尔比例修饰反应结果的HPLC鉴别图，其中a)rExendin-4∶PEG＝1∶3；b)rExendin-4∶PEG＝1∶5；c)rExendin-4∶PEG＝1∶7； 

图2rExendin-4与PEG不同pH值条件修饰反应结果的HPLC鉴别图，其中a)pH＝7.0；b)pH＝7.5c)pH＝8.0；d)pH＝8.5； 

图3rExendin-4与PEG反应物离子交换色谱图，其中P1：PEG和次产物；P2：主产物PEG-rExendin-4；P3：rExendin-4 

图4PEG-rExendin-4纯化后产物HPLC纯度鉴别图 

图5PEG-rExendin-4体外活性检测图 

图6皮下注射PEG-rExendin-4在大鼠体内的浓度时间曲线 

具体实施方式

实施例1 

在本实施例中使用的重组Exendin-4改构体的纯度大于97％，且保持有较高的生物学活性；往浓度为1～2mg/ml重组Exendin-4改构体溶液(含20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，50mM氯化钠，pH7.0)中，分别按蛋白与PEG不同摩尔比，分次加入PEG(Y-MAL-40K)，用涡旋混合器迅速混合，并于室温条件(20～30℃)下反应1～3小时。以RP-HPLC检测反应效率。其中Exendin-4改构体与PEG按1∶3，1∶5和1∶7的反应结果见图1，最佳摩尔比为1∶3～1∶7。 

实施例2 

在本实施例中使用的重组Exendin-4改构体的纯度大于97％，且保持有较高的生物学活性；往浓度为 1～2mg/ml重组Exendin-4改构体溶液(含20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，50mM氯化钠)，pH6.0～9.0，按蛋白与PEG摩尔比为1∶5的比例，分次加入PEG(Y-MAL-40K)，用涡旋混合器迅速混合，并于室温条件(20～30℃)下反应1～3小时。其中不同pH反应体系的反应结果见图2，最佳pH为7.5～8.5。 

实施例3 

在本实施例中使用的重组Exendin-4改构体的纯度大于97％，且保持有较高的生物学活性；往浓度为1～2mg/ml重组Exendin-4改构体溶液(含20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，50mM氯化钠)，pH7.5，按蛋白与PEG摩尔比为1∶3的比例，分次加入PEG(Y-MAL-40K)，用涡旋混合器迅速混合，分别以不同温度和反应时间反应，降低温度并延长反应时间。其中以20～30℃下反应1～3小时为最佳。 

实施例4  聚乙二醇化重组Exendin-4的分离纯化工艺 

用20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(pH7.5)5倍稀释样品，上样于用20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(pH7.5)平衡3～5CV的Q-Sepharose离子交换层析柱，上样后用含1M NaCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(pH7.5)梯度洗脱，在AKTA Purifier收集洗脱峰，用高效液相色谱法分别鉴定，收集主产物峰P2(见图3)，经浓缩处理后，所得到的聚乙二醇化重组Exendin-4药物的纯度可大于99％，再经过过滤除菌、冷冻干燥后即为产品。 

实施例5  聚乙二醇化重组Exendin-4的HPLC纯度鉴定 

本实施例选用C4色谱柱(150mm×4.6mm)，检测波长为214nm，柱温30℃，流速0.8mL/min；以H₂O(0.1％TFA)为流动相A，以乙腈(0.1％TFA)为流动相B；线性梯度洗脱从20％B到60％B。结果表明：所纯化聚乙二醇化重组Exendin-4纯度大于99％，见图4。 

实施例6  聚乙二醇化重组Exendin-4的体外活性检测 

本实施例选用大鼠胰岛素瘤细胞株RIN-m5F，用一定浓度梯度的重组Exendin-4和聚乙二醇化重组Exendin-4分别刺激细胞，按照Cayman的cAMP酶免试剂盒说明书检测药物刺激细胞后胞内的cAMP含量。结果表明，相比未修饰的rExendin-4，至少保留10％的生物学活性，见图5。 

实施例7  聚乙二醇化重组Exendin-4药物在大鼠体内的存留时间实验 

本实施例选用SD大鼠雌雄各6只，采用皮下注射聚乙二醇化重组Exendin-4，并以重组Exendin-4作为对照，评价其在大鼠血液中的存留时间。 

采集不同时间点药代样品：药前(0h)，药后1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、240h、336h。血药浓度检测使用美国康肽公司(Phoenix Pharmaceuticals，Inc.，California，USA)Enzyme Immunoassay Kit(EIA)试剂盒。 

该项实验结果表明，药物在SD大鼠体内的达峰时间为24h，在药后24-72h血药浓度比较平稳，基本呈平台状。给药72h后，血清药物浓度迅速下降，基本以一级消除动力学消除，末端消除半衰期为28.44h，清除率为8.58ml/h/kg。药物的平均滞留时间为61.56h。见图6。与重组Exendin-4体内半衰期2～3h相比较，聚乙二醇化重组Exendin-4经皮下注射途径给药，能显著延长在血液中的存留时间，延迟被清除的时间，具有长效的作用。 

Claims (3)

1.一种新型的rExendin-4改构体rEX-C39与Y型马来酰亚胺PEG化学偶联而产生的化合物，相比未经PEG偶联修饰的rExendin-4，保留至少10％的生物学活性，其体内血浆半衰期明显延长。

2.权利1所述的rExendin-4改构体与PEG偶联物的偶联方法为：偶联反应缓冲液的盐浓度范围控制在10～100mmol／L之间；pH值范围在6.0～9.0之间，优选7.5～8.5之间；加入重组Exendin-4改构体与Y型马来酰亚胺聚乙二醇，两反应物的摩尔比范围在0.5～10之间，优选3～7之间；反应时间范围在0.5～24小时之间，优选1～5小时之间；反应温度范围在4℃～37℃之间，优选20℃～30℃之间。

3.反应产物经过稀释、用Q-Sepharose HP离子交换色谱层析分离纯化，收集单一主峰，即得PEG-rExendin-4改构体偶联物。