CN103333238A - 一种mPEG-MAL-aGLP-1复合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种mPEG-MAL-aGLP-1复合物，其由人胰高血糖素样肽-1衍生物aGLP-1与单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺mPEG-MAL通过加成反应而连接构成，所述aGLP-1的C端氨基酸的巯基-SH与所述mPEG-MAL的末端双键形成共价键而连接；其中，所述aGLP-1具有如Seq ID No.2、Seq ID No.3或Seq ID No.4之任一种结构。本发明mPEG-MAL-aGLP-1复合物避免了修饰位点的多态性，使后续纯化大为简便，得率高，成本低，该复合物半衰期进一步延长，持续降血糖时间达24小时，并且可经口服途径给药，可更好应用于糖尿病治疗。
Description
技术领域
本发明属于肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域，具体涉及一种单甲氧基聚乙二醇修饰的人胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like Peptide1，GLP-1)衍生物(GLP-1衍生物，aGLP-1)，即，一种单甲氧基聚乙二醇-人胰高血糖素样肽-1衍生物复合物。
背景技术
GLP-1首次于1987年被认定为一种葡萄糖依赖的肠分泌激素肽，主要由远端回肠、结肠和直肠的L细胞分泌。这种含31个氨基酸的多肽通过靶细胞上的G蛋白偶联受体传递信号，从而产生葡萄糖依赖性促胰岛素释放、刺激生长抑素释放、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空和胃酸分泌等生理作用，是一种治疗糖尿病尤其是II型糖尿病的多肽药物，具有广泛的社会效益和巨大的经济效益。
但是，GLP-1在体内很容易被二肽酰基肽酶IV(Dipeptidyl Peptidase4，DPP IV)降解为脱去N端His7-Ala8-残基的无活性的GLP-1(9-37)或GLP-1(9-36)-NH2。静脉注射GLP-1在体内的半衰期仅为3～5分钟，限制了GLP-1的临床应用。
目前GLP-1治疗糖尿病的研究方向之一是通过对GLP-1的结构进行改变，得到GLP-1衍生物，用该衍生物治疗糖尿病，达到延长药物在体内的药效时间的目的。背景技术已经提出一种GLP-1衍生物及其制备方法(中国专利申请200910045188.0)，该衍生物半衰期长于GLP-1的半衰期，持续降血糖时间至少可达7小时。
经研究表明，蛋白质和多肽药物经聚乙二醇(PEG)修饰后的显著优点之一就是半衰期大大延长。但是，由于PEG-多肽/蛋白质复合物是通过蛋白质/多肽的氨基酸游离氨基和PEG的琥珀酰亚胺酯键形成的酰胺键连接在一起的复合物，若蛋白质/多肽上具有多个带有游离氨基的氨基酸，则聚乙二醇修饰蛋白质/多肽的位点和修饰程度常难以控制，导致后续纯化和质量控制都比较困难，制备步骤繁琐、得率低、成本高。
发明内容
针对现有技术存在的PEG修饰蛋白质/多肽的修饰位点、修饰程度的不可控制的缺陷，本发明提出的aGLP-1衍生物复合物(mPEG-MAL-aGLP-1复合物)，将GLP-1衍生物(即aGLP-1)与单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(即mPEG-MAL)进行加成反应，通过aGLP-1的C端氨基酸的巯基-SH与mPEG-MAL的末端双键进行加成反应，得到定点修饰产物mPEG-MAL-aGLP-1复合物，从而避免了修饰位点的多态性，使后续纯化大为简便，得率高，成本低。mPEG-MAL-aGLP-1复合物保留了aGLP-1的生物学活性，并且与aGLP-1相比，半衰期进一步延长，持续降血糖时间甚至可达24小时，从而使一天给药一次成为可能，可更好应用于糖尿病治疗。此外，现有的GLP-1及其衍生物的给药途径均为注射给药，而本发明提出的aGLP-1衍生物复合物，由于mPEG-MAL对其的包裹作用避免或减缓了胃肠道蛋白酶对aGLP-1衍生物的降解，口服给药也有效，从而能更好地用于临床。
本发明要解决的第一个技术问题是提出一种aGLP-1衍生物的复合物mPEG-MAL-aGLP-1，该复合物是由人胰高血糖素样肽-1衍生物aGLP-1与单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺mPEG-MAL通过加成反应而连接构成，所述aGLP-1的C端氨基酸Cys上的巯基-SH与所述mPEG-MAL的末端双键形成共价键而连接。该复合物是通过aGLP-1衍生物C端氨基酸的巯基-SH与单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL)的末端双键进行加成反应制备得到的单点修饰产物。
其中，该复合物中的aGLP-1衍生物指GLP-1衍生物，详细见申请号为200910045188.0的中国发明专利“一种GLP-1衍生物”。该复合物中的mPEG-MAL是从商业公司购买的单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺，其分子量为2～40KD。
本发明还提供所述mPEG-MAL-aGLP-1复合物的制备方法。本发明将aGLP-1衍生物与mPEG-MAL进行加成反应，即aGLP-1衍生物C端氨基酸的巯基-SH与单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL)的末端双键进行加成反应，得到定点修饰产物mPEG-MAL-aGLP-1复合物，所述的mPEG-MAL分了量为2～40KD。
本发明mPEG-MAL-aGLP-1复合物的制备方法，具体包括如下操作步骤：
第一步，将1份重量的粉末状aGLP-1衍生物溶解于500份重量的100mM，pH7.4磷酸盐缓冲液中，再与500份重量的200mM，pH6.0～9.0磷酸盐缓冲液混和。
第二步，向第一步所得的溶液中加入1.2～119.0份重量的含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇，混和均匀，所述的单甲氧基聚乙二醇是分了量为2～40KD的单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺，即mPEG-MAL。
第三步，将第二步所得的溶液置于4～30℃下进行mPEG修饰反应0.5～24小时。
第四步，将经第三步修饰反应处理的溶液置于-20℃终止反应，至此，制得mPEG-MAL-aGLP-1复合物粗品溶液。
第五步，取经第四步制得的粗品溶液用20mM，pH3.0的柠檬酸缓冲液稀释10倍，上SP-FF层析柱，用含0～1MNaCl的20mM，pH3.0的柠檬酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，在波长为280nm处收集3个吸收峰中的第2和第3吸收峰的洗脱溶液。
第六步，将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore AmiconUltra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0.2～3.9份重量的产物，即mPEG-MAL-aGLP-1复合物纯品，所述产物的分子量介于5.5～43.5KD。
第六步所述的产物具有本发明提出的结构：由aGLP-1衍生物和含经琥珀酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇组成，两者通过aGLP-1衍生物的C端氨基酸的巯基-SH与单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL)的末端双键进行加成反应制备得到。
本发明的技术方案的进一步特征在于，在上述制备方法的第一步中，aGLP-1衍生物的结构为如Seq ID No.2、Seq ID No.3或Seq ID No.4之任一种，本发明的aGLP-1衍生物中C端氨基酸为Cys。
本发明在上述制备方法的第二步中，该复合物中的mPEG-MAL是从商业公司购买的单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺，其分子量为2～40KD。
常见的聚乙二醇修饰蛋白质反应是由活化的聚乙二醇与蛋白质的游离氨基反应，例如单甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺(mPEG-SPA)或分枝状单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯(mPEG-NHS)，两者携带的琥珀酰亚胺酯键，能与蛋白的游离氨基形成酰胺键连接在一起。蛋白质中若含有多个带有游离氨基的赖氨酸或精氨酸，则在聚乙二醇修饰反应中会形成多点修饰产物，修饰位点、修饰程度均难以控制。例如，天然GLP-1分子中，含两个赖氨酸，一个精氨酸，以及N端的组氨酸，能提供游离氨基的位点共有4个，在常见的聚乙二醇修饰反应中会出现多点修饰产物，且即使是单点修饰产物，也是不均一的产物，给后续纯化和质量控制带来难题。本发明采用PEG单点修饰的技术手段，获得定点修饰的单一产物，经纯化后的产物得率会显著提高。
本发明还提供了mPEG-MAL-aGLP-1复合物在制备治疗糖尿病的药物中作该药物的活性成分的应用。
本发明还提供了mPEG-MAL-aGLP-1复合物在制备治疗糖尿病的药物中，可以注射给药和/或口服给药。
本发明还提供了一种组合物，所述组合物含有有效量的本发明mPEG-MAL-aGLP-1复合物以及药学可接受的成分。
本发明的优点是：利用aGLP-1衍生物的氨基酸Cys的游离巯基与单甲氧基聚乙二醇的马来酰亚胺活化末端双键在温和的生理状态下进行反应，形成硫醚键，从而使得到的aGLP-1衍生物的复合物mPEG-MAL-aGLP-1的性质十分稳定，不易被水解分离。由于使用的修饰剂mPEG-MAL为高亲水性的线性无毒的高分子化合物，当其与aGLP-1衍生物稳定结合后能在aGLP-1衍生物分子表面形成一种屏障，使得aGLP-1衍生物更加不易被体内的蛋白酶降解，从而进一步提高其生物稳定性。同时由于经mPEG-MAL修饰的aGLP-1衍生物分子量增大，因而在体内的半衰期延长，提高了aGLP-1衍生物的生物利用度。因此，本发明制备得到的mPEG-MAL-aGLP-1复合物不仅能注射给药，还能口服给药，克服了以往GLP-1及其衍生物不能口服给药的问题。进一步，由于是定点修饰，用本方法制备aGLP-1衍生物的mPEG-MAL-aGLP-1复合物，方法简便，原料易得，纯化方便，生产成本低。
附图说明
图1为mPEG-MAL-aGLP-1复合物的SP-FF层析分离纯化图。其中，1是穿透峰，含mPEG-MAL；2，3均是单点修饰的mPEG-MAL-aGLP-1吸收峰，及少量未修饰的aGLP-1。
图2为mPEG-MAL-aGLP-1复合物纯品(未冷冻干燥)的SDS-PAGE电泳图。其中，2是单点修饰的mPEG-MAL-aGLP-1。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。以下实施例中所用mPEG-MAL、化学试剂等，以及未注明具体条件的实验方法，按常规或按商品供货商所建议的条件进行。
实施例1mPEG-MAL-aGLP-1复合物的制备
在本实施例中，aGLP-1衍生物的结构式为：aGLP-1(7-36)，即Seq ID No.2，Seq IDNo.2序列如下：
His-Xaa2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa20-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa28-Gly-Xaa30。
其中Xaa2＝D-Ala，Xaa20＝Ser，Xaa28＝Ala，Xaa30＝Cys，mPEG-MAL的分子量为2KD。
第一步，将1.0mg aGLP-1溶解于0.5ml的100mM，pH7.4磷酸盐缓冲液中，再与0.5ml的pH6.0～9.0的200mM磷酸盐缓冲液混和；
第二步，向第一步的溶液中加入0.6mg分子量为2KD的mPEG-MAL，混和均匀；
第三步，将第二步所得的溶液置于4℃～30℃下进行mPEG修饰反应0.5～24小时；
第四步，将经第三步处理的溶液置于-20℃终止反应，至此，制得aGLP-1的复合物粗品溶液；
第五步，取经第四步制得的粗品溶液用20mM，pH3.0的柠檬酸缓冲液稀释10倍，上SP-FF层析柱，用含0～1MNaCl的20mM，pH3.0的柠檬酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，在波长为280nm处收集3个吸收峰中的第2和第3吸收峰的洗脱溶液；
说明：参见图1，图中，1是3个吸收峰中的第一个吸收峰，即穿透峰，含mPEG-MAL；2和3分别是3个吸收峰中的第2和第3个吸收峰，均是单点修饰的mPEG-MAL-aGLP-1吸收峰，及少量未修饰的aGLP-1。
第六步，将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0.2mg的、分子量为5.5KD的aGLP-1的复合物纯品。
上述第二步中，分子量为2KD的mPEG-MAL的加入量可分别为3.0mg和6.0mg；上述第六步中，可分别得到0.6mg和0.4mg的分子量为5.5KD的aGLP-1衍生物的复合物纯品。
说明：将第六步制得的aGLP-1复合物纯品用蒸馏水复溶，制备成1mg/mL的溶液，取20ul进行SDS-PAGE电泳，结果示于图2，图中，4是单点修饰的mPEG-MAL-aGLP-1。
实施例2mPEG-MAL-aGLP-1复合物的制备
在本实施例中，所采用aGLP-1衍生物的结构式见表1，mPEG-MAL的分子量为2KD。
在本实施例中mPEG-MAL-aGLP-1复合物按实施例1中的实验条件和实验步骤制备。
表1aGLP-1衍生物结构
实施例3mPEG-MAL-aGLP-1复合物的制备
在本实施例中，aGLP-1衍生物的结构式为：aGLP-1(7-36)，即Seq ID No.2，其中Xaa2＝Ser，Xaa20＝Ser，Xaa28＝Ala，Xaa30＝Cys，mPEG-MAL的分子量为20KD。
第一步，将1.0mg aGLP-1溶解于0.5ml的100mM，pH7.4磷酸盐缓冲液中，再与0.5ml的pH6.0～9.0的200mM磷酸盐缓冲液混和；
第二步，向第一步的溶液中加入6.0mg分子量为20KD的mPEG-MAL，混和均匀；
第三步至第五步按实施例一中相应操作步骤进行。
第六步，将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore AmiconUltra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0.7mg的、分子量为23.5KD的aGLP-1衍生物的复合物纯品。
上述第二步中，分子量为20KD的mPEG-MAL的加入量可分别为30.0mg和60.0mg；上述第六步中，可分别得到2.1和1.4mg的分子量为23.5KD的aGLP-1衍生物的复合物纯品。
实施例4mPEG-MAL-aGLP-1复合物的制备。
在本实施例中，aGLP-1衍生物的结构式见表1，mPEG-MAL的分子量为20KD。
在本实施例中mPEG-MAL-aGLP-1复合物按实施例3中的实验条件和实验步骤制备。
实施例5mPEG-MAL-aGLP-1复合物的制备。在本实施例中，aGLP-1衍生物的结构式为：aGLP-1(7-36)，即Seq ID No.2，其中Xaa2＝Ser，Xaa20＝Ser，Xaa28＝Ala，Xaa30＝Cys，mPEG-MAL的分子量为40KD。
第一步，将1.0mg aGLP-1溶解于0.5ml的100mM，pH7.4磷酸盐缓冲液中，再与0.5ml的pH6.0～9.0的200mM磷酸盐缓冲液混和；
第二步，向第一步的溶液中加入11.9mg分子量为40KD的mPEG-MAL，混和均匀；
第三步至第五步按实施例一中相应操作步骤进行。
第六步，将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore AmiconUltra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到1.3mg的、分子量为43.5KD的aGLP-1衍生物的复合物纯品。
上述第二步中，分子量为40KD的mPEG-MAL的加入量可分别为59.5mg和119.0mg；上述第六步中，可分别得到3.9和2.6mg的分子量为43.5KD的aGLP-1衍生物的复合物纯品。
实施例6mPEG-MAL-aGLP-1复合物的制备。
在本实施例中，aGLP-1衍生物的结构式见表1，mPEG-MAL的分子量为40KD。
在本实施例中mPEG-MAL-aGLP-1复合物按实施例5中的实验条件和实验步骤制备。
实施例7mPEG-MAL-aGLP-1复合物经注射给药的降血糖效果
实验材料与方法：
雄性健康昆明小鼠(清洁级，上海复旦大学医学院动物中心提供)；
50％葡萄糖溶液，0.9％NaCl溶液，aGLP-1衍生物，mPEG-MAL-aGLP-1复合物；
血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司)；
雄性健康昆明小鼠禁食过夜，分为13组，每组6只。第1组，葡萄糖对照组；第2-4组，aGLP-1衍生物给药组；第5-13组，本发明的复合物mPEG-MAL-aGLP-1给药组，所用复合物mPEG-MAL-aGLP-1为实施例1-6中制备得到的目的产物。本实施例中各给药组的aGLP-1衍生物和复合物mPEG-MAL-aGLP-1结构式及给药量见表2。
表2用于注射测试的aGLP-1衍生物和mPEG-MAL-aGLP-1复合物
第1组腹腔注射100ul50％葡萄糖溶液；第2-4组腹腔注射100ul50％葡萄糖溶液和0.4ug的aGLP-1衍生物；第5-13组腹腔注射100ul50％葡萄糖溶液和1，2.7，5ug的mPEG-MAL-aGLP-1复合物。给药时间记为零时刻，每次测血糖前30min开始给各组补充200ul50％葡萄糖溶液，分别于400、445、540、630、1145、1560分钟进行小鼠尾静脉取血10ul，用血糖测试仪测定血糖浓度。
结果如表3所示，所示数值均为6只小鼠的血糖平均值。与葡萄糖组小鼠相比，在给药后400分钟之内，aGLP-1衍生物给药组和mPEG-MAL-aGLP-1复合物给药组均能降低小鼠血糖，说明按本发明方法制备出的mPEG-MAL-aGLP-1复合物保留了aGLP-1衍生物的生物学活性。445分钟时，aGLP-1衍生物组小鼠与葡萄糖组小鼠的血糖值没有区别，提示aGLP-1衍生物已代谢完，不再具有降血糖作用。而mPEG-MAL-aGLP-1复合物给药组的小鼠血糖一直低于葡萄糖组，且基本保持稳定，说明mPEG-MAL-aGLP-1复合物的半衰期延长，仍能有效地控制血糖浓度，有效降血糖时间持续至少24-26小时。
表3mPEG-MAL-aGLP-1复合物的注射降血糖效果
*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001vs NS组
本实施例中所用的mPEG-MAL-aGLP-1复合物也可是实施例1至实施例6所制备的其它产物。它们按照本实施例的方法进行活性测定，均可得到类似的实验结果。
实施例8mPEG-MAL-aGLP-1复合物经口服给药的降血糖作用。
实验材料与方法：
雄性健康昆明小鼠(清洁级，上海复旦大学医学院动物中心提供)；
50％葡萄糖溶液，0.9％NaCl溶液，aGLP-1衍生物，mPEG-MAL-aGLP-1复合物；
血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司)；
雄性健康昆明小鼠禁食过夜，分为8组，每组6只。第1组，葡萄糖对照组；第2组，aGLP-1衍生物给药组；第3-8组，本发明的复合物mPEG-MAL-aGLP-1给药组，所用复合物mPEG-MAL-aGLP-1为实施例1-6中制备得到的目的产物。本实施例中各给药组的aGLP-1衍生物和复合物mPEG-MAL-aGLP-1结构式及给药量见表4。
表4用于口服测试的aGLP-1衍生物和mPEG-MAL-aGLP-1复合物
第1组，生理盐水对照组，按体重施予18mmol/kg的葡萄糖。第2组，aGLP-1衍生物组，按体重施予18mmol/kg的葡萄糖和300nmol/kg的aGLP-1衍生物。第3-8组，mPEG-MAL-aGLP-1复合物组，按体重施予18mmol/kg的葡萄糖和300nmol/kg的mPEG-MAL-aGLP-1复合物。给药时间记为0时刻，每次测血糖前30min开始给各组补充200uL50％葡萄糖，结果见表5。结果显示，mPEG-MAL-aGLP-1复合物组在小鼠体内口服均显示了降血糖效果，口服mPEG-MAL-aGLP-1复合物组药效时间可持续至210min-300min左右。
表5mPEG-MAL-aGLP-1复合物的口服降血糖作用
实施例9包含mPEG-MAL-aGLP-1复合物的组合物
取0.4-3.2mg mPEG-MAL-aGLP-1复合物，溶解于1mL去离子水中；另取50mg甘露醇，溶解于1mL去离子水中；将二者混匀即为GLP-1衍生物的复合物与甘露醇的组合物，其中含0.2-1.6mg/mL的mPEG-MAL-aGLP-1复合物以及25mg/mL的甘露醇。甘露醇作为一种常用的制剂成分对药效并无影响，上述包含mPEG-MAL-aGLP-1复合物的组合物具有与mPEG-MAL-aGLP-1复合物相同的降血糖作用。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (3)
1.一种mPEG-MAL-aGLP-1复合物，其特征在于，由人胰高血糖素样肽-1衍生物aGLP-1与单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺mPEG-MAL通过加成反应而连接构成，所述aGLP-1的C端氨基酸的巯基-SH与所述mPEG-MAL的末端双键形成共价键而连接；其中，所述aGLP-1具有如Seq ID No.2、Seq ID No.3或Seq ID No.4之任一种结构。
2.如权利要求1所述的mPEG-MAL-aGLP-1复合物，其特征在于，所述aGLP-1的C端氨基酸为Cys。
3.如权利要求1所述的mPEG-MAL-aGLP-1复合物，其特征在于，所述mPEG-MAL的分子量为2～40KD。
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| CN105315350A (zh) * | 2015-10-30 | 2016-02-10 | 郑州大学 | 抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16 |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131002 |