CN105315350A - 抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16 - Google Patents

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CN105315350A CN201510720425.4A CN201510720425A CN105315350A CN 105315350 A CN105315350 A CN 105315350A CN 201510720425 A CN201510720425 A CN 201510720425A CN 105315350 A CN105315350 A CN 105315350A
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本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16。该肽包含有17个氨基酸，具体氨基酸序列为：mPEG-Mal-CATWLPPRAANLLMAAS。本发明通过采用聚乙二醇对AS16进行适当的化学修饰，即可达到延长其在生物体内半衰期的目的。实验证明，本发明所提供地化学修饰后多肽mPEG-Mal-Cys-AS16，相较于原始多肽AS16，其生物活性得到了较好的保持，但能较好地避免被生物体内多种酶的酶解或被肾小球过滤，即较好地延长了其在生物体内半衰期，因而在将其用于抑制肿瘤时具有较好地应用价值。

Description

抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16。
背景技术
血管生成是在原有血管内皮细胞的基础上形成新血管的自然过程。研究表明，实体瘤的生长依赖于新生血管生成，血管生成在肿瘤生长和转移过程中起着非常重要的作用，不仅可以为肿瘤生长和转移提供必需的氧气和营养物质，而且可以排泄代谢产物。抗肿瘤血管生成疗法具有很多优点：①具有高效性，破坏少量的血管可使依靠其生长的大量的肿瘤细胞发生缺血性坏死；②血管细胞无或少突变，不易产生耐药性，可长期用药；③广泛的抑瘤谱，不同肿瘤的血管内皮细胞往往表达相同的特异性蛋白分子，针对这种蛋白分子的一种疗法就可能适用于多种肿瘤；④药物易于到达靶细胞，血管内皮细胞直接暴露于血液中，药物能直接发挥作用。
内皮细胞受体酪氨酸激酶VEGF-R2和Tie-2，及其配体血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素Ang1和Ang2，在血管生成中起着重要作用。通过封闭VEGF受体途径或者封闭Tie-2受体途径，都能抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长，并且抑制VEGF受体传导途径不能被Tie-2传导途径所补偿，反之亦然，两个途径相对独立，且同样重要；即同时抑制由VEGFR-2和Tie-2介导的信号通路比单独抑制其中一条通路有更强的维持正常血管及肿瘤相关血管完整和稳定的能力。
AS16是一种由VEGFR2受体拮抗剂ATWLPPR（V1肽）和Tie2受体拮抗剂NLLMAAS（V2肽）通过柔性连接子（A—A）连接的多肽。但是作为一种多肽类药物，由于其分子量较小，在生物体内容易被酶降解，半衰期短，因而治疗效果容易受到较大影响，同时其对于抑制肿瘤新生血管生成的作用效果也存在进一步提升的空间。
发明内容
在对现有多肽AS16结构深入研究基础上，本发明主要目的是提供一种新的抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16，相较于现有多肽AS16，本发明所提供多肽的半衰期得到了有限延长，同时其在抗肿瘤方面的效果也得到一定程度提升。
本发明所采取的技术方案如下。
抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16，包含有17个氨基酸，如序列表SEQIDNO.1所示，具体氨基酸序列为：
mPEG-Mal-Cys-Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser；
即：mPEG-Mal-CATWLPPRAANLLMAAS；
所述mPEG-Mal，为甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺，其分子量范围为5000~20000，其结构式如下：
；
其中mPEG结构式为：CH3O（CH2CH2O）n-CH2-CH2，其中n=5~1000；
半胱氨酸（Cys）通过其侧链巯基与mPEG-Mal中的Mal基团共价相连；
所述多肽AS16为现有专利中已公开的（申请号：2010101722261，公开号：CN101830971A，一种新型抗肿瘤血管生成多肽，在该专利中成为V3肽）多肽序列，与现有多肽序列相比，本申请所提供多肽与其主要区别在于可以通过在现有多肽AS16的N端引入半胱氨酸，并在半胱氨酸上偶联上聚乙二醇马来酰亚胺来实现。
所述抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16，所述mPEG-Mal的分子量为5000或20000，优选为20000，即对应mPEG结构式中n=450。
抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）化学修饰前体物质Cys-AS16的制备，按现有技术制备前体物质多肽Cys-AS16，即前体物质序列为：CATWLPPRAANLLMAAS；
（2）进行化学修饰；
首先将步骤（1）中多肽溶于20mMpH=6.0~8.0的磷酸缓冲液中，多肽的浓度为1mg/mL；
以摩尔比计，多肽：mPEG-Mal修饰剂=1：1~10，具体例如，1：2、1：3、1：5、1：7等，优选1：1比例；
按比例加入mPEG-Mal修饰剂，4-25℃反应1~24h，得化学修饰后多肽粗品；
（3）修饰产物分离纯化；
对步骤（2）中所得多肽粗品，进行纯化；将所收集的纯化后产物冷冻干燥后保存备用。
所述抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16作为抗肿瘤血管生成药剂的应用，溶于生理盐水后直接注射使用即可，所述肿瘤具体例如S180肉瘤。
肽类物质由于其分子量较小，因而在其直接作为药剂使用时，在生物体内极易被多种生物酶降解，或者迅速被肾小球过滤，因而半衰期普遍较短，严重影响肽类物质作为药剂效用的发挥。为确保肽类物质的作用效果，因而常用做法是连续性给药，或者在不影响肽类物质活性（作用效果）基础上对其进行化学结构修饰，从而避免被酶降解或被肾小球过滤。
就现有多肽AS16而言，由于其只有16个氨基酸，属于一种典型的小分子量肽类物质。在将其作为药物用于抑制肿瘤时，已有研究认为其在生物体内半衰期很短，因而其作用效果面临着较大不确定性。为确保多肽AS16作为药剂使用的效果，常规做法之一是通过连续性给药来确保作用效果，但这种做法存在明显地使用不便、药剂用量大等弊端，因而实际应用中首选仍然是在确保多肽活性基础上对多肽类物质结构进行适当修饰改造，以便于其在生物体内发挥相应效用。
本发明在对现有多肽AS16结构研究基础上，认为通过采用聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）对其进行适当的化学修饰，即可达到延长其在生物体内半衰期的目的。具体而言，本发明首先通过在AS16肽的N端引入一个半胱氨酸，然后用聚乙二醇马来酰亚胺对其进行定点修饰。实验证明，本发明所提供地化学修饰后多肽mPEG-Mal-Cys-AS16，相较于原始多肽AS16，其生物活性得到了较好的保持，但能较好地避免被生物体内多种酶的酶解或被肾小球过滤，即较好地延长了其在生物体内半衰期，因而在将其用于抑制肿瘤时具有较好地应用价值。
附图说明
图1为HPLC检测PEG5K-AS16修饰反应产物；
图2为HPLC检测PEG20K-AS16修饰反应产物；
图3为HPLC分析PEG5K-AS16纯度分析；
图4为HPLC分析PEG20K-AS16纯度分析；
图5为PBS、AS16、PEG5k-AS16、PEG20K-AS16划痕实验对比图；
图6为划痕实验HUVEC细胞迁移率对比图，其中a、b、c分别为AS16、PEG5K-AS16、PEG20K-AS16不同时间点HUVEC细胞的迁移率，d为AS16、PEG5K-AS16、PEG20K-AS16在24小时HUVEC细胞迁移率对比图；
图7为体外酶降解实验结果图，其中a、b、c分别为AS16、PEG5K-AS16、PEG20K-AS16体外酶降解情况，d为AS16、PEG5K-AS16、PEG20K-AS16三者体外酶降解对比图；
图8为体内药代动力学结果，其中a、b、c分别代表AS16、PEG5K-AS16、PEG20K-AS16在大鼠体内血药浓度-时间曲线，d为AS16、PEG5K-AS16、PEG20K-AS16在大鼠体内血药浓度-时间曲线对比图；
图9为荷S180肉瘤的Balb/c小鼠尾静脉给药14天的体重变化曲线图；
图10为荷S180肉瘤的Balb/c小鼠尾静脉给药14天后解剖的肿瘤图；
图11为荷瘤小鼠给药期间S180移植瘤生长曲线图；
图12为各组Balb/c小鼠瘤重对比图；
图13为各组Balb/c小鼠抑瘤率对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，首先对本发明所用部分物料样品及实验仪器设备简要介绍如下。
实验样品
分子量5000、分子量20000的甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺（mPEG5k-Mal、mPEG20K-Mal），均为天津红日金博达生物技术有限公司产品；
实施例中所用化学修饰前的多肽Cys-AS16及现有技术中的多肽AS16均由上海科肽生物技术有限公司合成提供；
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购自于ATCC；
胎牛血清购于杭州四季青生物有限公司；
RPMI1640购于北京Solarbio公司；
血浆通过分离自愿者所提供血液获得；
SD大鼠，清洁级（CL），250g左右，由河南省实验动物中心提供；
Balb/c小鼠，无特定病原体级（SPF），雌性，18~20g，北京华阜康生物医药科技有限公司提供。
Balb/c小鼠移植瘤模型
实施例中所用Balb/c小鼠移植瘤模型通过以下步骤建立：S180肉瘤（由河南省医学科学研究院惠赠）接种于昆明小鼠（购于河南省实验动物中心）腹腔，5~7天后无菌条件下抽取荷瘤小鼠乳白色腹水，0.2%台盼兰染色，显微镜下观察细胞成活率>95%后，调整细胞浓度至1×107个/mL；经过常规消毒后，吸取0.1mL（含1.0×106个细胞）肿瘤细胞悬液注射入Balb/c小鼠右前肢腋下，观察肿瘤的生长情况。
实验仪器
实施例中所用高效液相色谱仪均为Agilent有限公司产品（Agilent1200）。
实施例1
本发明所提供的抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16，按以下步骤制备获得：
（1）化学修饰前体物质Cys-AS16的制备，按现有技术制备前体物质多肽Cys-AS16，即前体物质序列为：CATWLPPRAANLLMAAS；
本实施例中所用前体物质多肽Cys-AS16由上海科肽生物技术有限公司合成提供。
（2）进行化学修饰
在本实施例中分别采用5000分子量、20000分子量的mPEG5k-Mal、mPEG20K-Mal进行化学修饰，过程如下：
首先将步骤（1）中多肽溶于20mM的磷酸缓冲液中，多肽的终浓度为1mg/mL，调节pH值为6；
以摩尔比计，按1：1比例加入mPEG-Mal修饰剂，4℃反应1h，得化学修饰后多肽粗品，即mPEG5K-Mal-Cys-AS16或mPEG20k-Mal-Cys-AS16。
（3）修饰产物分离纯化
对步骤（2）中所得mPEG5K-Mal-Cys-AS16或mPEG20k-Mal-Cys-AS16粗品，用高效液相（HPLC，Agilent1200）进行纯化，纯化条件为：
流动相A：水+0.1%TFA；
流动相B：乙腈+0.1%TFA；
流动相B的线性梯度：20~60%；
流速：5min/mL；运行时间：30min；上样量：5mL；检测波长：228nm；
将所收集的产物首先于-80℃低温冰箱冷冻过夜，然后用冷冻干燥机冻干成白色粉末后于-20℃冰箱保存备用。
对本实施例所制备的化学修饰后多肽粗品mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16的液相色谱图分别如图1、图2所示。
进一步地，采用高效液相色谱对上述步骤中所制备的纯化后的mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16样品纯度进行了进一步地分析，分析条件为：
流动相A：水+0.1%TFA；
流动相B：乙腈+0.1%TFA；
流动相B的线性梯度：0~5min，20~40%；
5~15min，40~50%；
15~20min，50~60%；
上样量：20uL；
检测波长：228nm；
分析型色谱柱：郑州英诺生物有限公司，250mm×4.6mm(5μm)。
纯度检测结果如图3、图4所示。
从图中可以看出，mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16样品的纯度均大于95%，完全满足进一步的应用实验。
实施例2
对实施例1所制备的mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16，发明人分别进行了体外生物活性和体外生物酶解实验，简要介绍如下。
体外生物活性实验
体外生物活性实验主要是利用划痕试验检测修饰后多肽mPEG5K-Mal-Cys-AS16或mPEG20k-Mal-Cys-AS16对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移的影响，具体实验过程如下：
（1）取生长状态良好的HUVEC细胞，0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI1640制成单层细胞悬液；
（2）细胞计数，稀释，调整细胞浓度，以1×105每孔接种于24孔板中，以含10%胎牛血清的RPMI1640常规培养24h；
（3）24h后，细胞富集度约90%，已形成连续的单层细胞，移去培养液，用20~200μL移液器吸头在细胞层上划痕；然后用PBS清洗板孔，去除脱落漂浮细胞，加入无血清的RPMI1640培养液；
（4）相应的孔中分别加入不同浓度（5μM、25μM、100μM）的AS16、mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16；
（5）在倒置显微镜下观察划痕，选取位点拍照记录为零点；此后，每12h显微镜下观察各孔内细胞向划痕中央迁移情况，并拍照记录。
实验结果如图5、图6所示。
从图中可以看出，AS16、mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16实验组与阴性对照组PBS均有显著差异，能够抑制内皮细胞HUVEC的迁移；并且mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16与AS16组之间差异不明显，因此可得出结论：化学修饰后mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16相较于AS16生物活性得到了较好地保持。
体外酶降解稳定性试验
具体实验过程如下：
（1）分别配制AS16（4mg/mL）、mPEG5K-Mal-Cys-AS16（16mg/mL）、mPEG20k-Mal-Cys-AS16（51.8mg/mL）的母液，即制备成等摩尔浓度（2.4umol/L)的生理盐水溶液；
（2）分别取步骤（1）中100μL的AS16、mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16母液，分别加入900μL血浆中，迅速震荡混匀；
（3）将步骤（2）中混有多肽的血浆于37℃下孵育，将步骤（1）中多肽母液加入血浆中的时点计为0h，分别在不同时间点取100μL样品测定。
对所取样品加入50μL10%的高氯酸，涡旋1min，12000r/min离心10min，取上清-80℃保存或直接用反相高效液相色谱（RP-HPLC）测定样品浓度。
测定结果如图7所示。图7分别为AS16、mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16在体外血浆中随时间变化的峰面积曲线，根据不同时间主峰的峰面积，横坐标为时间，纵坐标为当前时间剩余肽的百分比含量。
从图中可以看出，AS16在人血浆中5h后基本降解完全，而mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16在人血浆中200h后大约才降解20%左右。此结果表明，本发明所提供的化学修饰后多肽mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16在生物体内被酶解速度大大下降，具有较长的半衰期，因而有可能发挥更好地抑制肿瘤效果。
实施例3
实施例2主要是对本发明所提供的化学修饰mPEG-Mal-Cys-AS16多肽的部分体外实验，本实施例则着重介绍本发明所提供多肽在生物体内具体应用效果实验，主要包括大鼠体内药代动力学实验和荷瘤实验，实验过程介绍如下。
药代动力学实验
取7周龄清洁级SD大鼠9只（雄性，体重250—280g），随机分成3组，每组均为3只。分别为AS16实验组、PEG5K-AS16实验组、PEG20K-AS16实验组。
给药前12小时及给药后4小时内禁食，试验期间自由饮水。
药代动力学实验过程如下：
（1）给药溶液配制，
分别准确称量AS-1640mg、实施例1所制备mPEG5K-Mal-Cys-AS16144mg、mPEG20k-Mal-Cys-AS16465mg，生理盐水（0.9%）溶解，分别配制成8mg/mL、28.8mg/mL、93mg/mL的药液；即浓度同为4.75μmol/mL；
（2）药剂注射，
AS16肽按照40mg/kg剂量，mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16按照相同摩尔浓度用量（即4.75μmol/mL），尾静脉注射。
给药前、后不同时间点分别于大鼠眼底静脉丛取血100μL，至肝素化试管中，6000rpm离心3min,，分离出血浆，-80℃保存备用供检测。
检测结果如图8所示。
从图中可以看出，AS16在大鼠体内代谢的很快，5min后基本检测不到了；mPEG5K-Mal-Cys-AS16在体外检测时具有较好的抵抗酶降解的效果，但体内检测时其延长半衰期效果并不明显，20min也已基本检测不到；mPEG20k-Mal-Cys-AS16在体内的半衰期则最长，静脉给药24h后，用HPLC仍然可以检测到。
荷瘤实验
以荷S180肉瘤后Balb/c小鼠为例，对多肽AS16及实施例1所制备修饰后多肽mPEG5K-Mal-Cys-AS16、mPEG20k-Mal-Cys-AS16，进行了实际的抑瘤实验，实验过程简要介绍如下。
实验分组：
将荷S180肉瘤Balb/c小鼠按体重随机分为6组，每组6只，6个具体组别为：阴性对照组（生理盐水NS）、AS16组（0.3μmol/kg/d)、mPEG5K-Mal-Cys-AS16高剂量组(0.3μmol/kg/d)、mPEG5K-Mal-Cys-AS16低剂量组(0.15μmol/kg/d)、mPEG20k-Mal-Cys-AS16高剂量组(0.3μmol/kg/d)、mPEG20k-Mal-Cys-AS16低剂量组(0.15μmol/kg/d)。
实验过程：
尾静脉注射给药，给药量按0.1mL/10g标准进行计算。荷瘤后第三天即开始给药，连续给药14天，试验期间，小鼠自由进食进水。
实验期间每天测量小鼠体重及肿瘤的长（a）短（b)径，按如下公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤体积增长曲线，
肿瘤体积=（π/6）×a×b2。
给药14天后处死小鼠，剥除肿瘤并称瘤重，抑瘤率（肿瘤生长抑制率，Inhibitionrate，IR）按如下公式计算，
肿瘤生长抑制率=（1－给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重）×100%。
实验结果如图9~13所示。
从图中可以看出，AS16组、mPEG5K-Mal-Cys-AS16高剂量组、mPEG20k-Mal-Cys-AS16高剂量组、mPEG20k-Mal-Cys-AS16低剂量组均表现出较好地抑制肿瘤的作用。其中AS16组、mPEG5K-Mal-Cys-AS16高剂量组、mPEG5K-Mal-Cys-AS16低剂量组、mPEG20k-Mal-Cys-AS16高剂量组、mPEG20k-Mal-Cys-AS16低剂量组各组抑瘤率分别为：36.5%、40.2%、29.4%、55.9%、60.4%。从此结果可以看出，经过化学修饰后的mPEG20k-Mal-Cys-AS16多肽在相同剂量情况下，对于肿瘤抑制效果有所增强，表现出较好地应用前景。
现有技术中，为解决肽类物质半衰期较短、需连续给药的弊端，化学修饰是其中最为常用方法之一，常用的化学修饰剂有聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG)、葡聚糖、聚酸酐等。PEG作为一类具有独特理化性质的大分子聚合物，因其无毒、水溶性好、无免疫原性、分子量可选择等特点，因而常是化学修饰药剂首选。一般而言，经PEG修饰后蛋白质类药物，其分子量增加，肾小球的滤过减少，同时PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解，因而可有效延长蛋白质类药物的半衰期。但PEG修饰同时也可能影响蛋白质的生物学活性，其影响大小与修饰剂种类、分子量、修饰条件及蛋白质本身的性质有关，因而依据蛋白质类药物不同，具体化学修饰条件需要慎重选择并对修饰后蛋白质类药物活性进行重新检测验证。
如前所述，经PEG修饰后蛋白类药物虽然能表现出溶解度增加、稳定性增强、半衰期延长、毒副作用降低、免疫原性降低等优点，但考虑到生物活性需要保持地前提，因而对于不同类型的蛋白质类药物，对于PEG分子量选择、化学修饰条件的设定等是其重点内容，也是其难点与核心内容。
本发明首先通过在AS16肽的N端引入一个半胱氨酸，然后用聚乙二醇马来酰亚胺对其进行定点修饰，获得了新的化学修饰后多肽mPEG-Mal-Cys-AS16，进一步地以具体分子量的mPEG为例，制备了多肽mPEG5k-Mal-Cys-AS16和多肽mPEG20k-Mal-Cys-AS16，通过体外实验和实际荷瘤实验，证明了化学修饰后多肽mPEG-Mal-Cys-AS16较好了保留了多肽AS16的生物活性，且生物体内半衰期得到了有效延长，而且表现出了较好地抑瘤效果，因而具有较好地推广应用前景。
SEQUENCELISTING
<110>郑州大学
<120>抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16
<130>none
<160>1
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
CysAlaThrTrpLeuProProArgAlaAlaAsnLeuLeuMetAlaAla
151015
Ser

Claims (5)

1.抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16，其特征在于，包含有17个氨基酸，其如SEQIDNO.1所示，具体氨基酸序列为：
mPEG-Mal-Cys-Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser；
即：mPEG-Mal-CATWLPPRAANLLMAAS；
所述mPEG-Mal，为甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺，其分子量范围为5000~20000；半胱氨酸通过其侧链巯基与mPEG-Mal中的Mal基团共价相连；
mPEG结构式为：CH3O（CH2CH2O）n-CH2-CH2，其中n=5~1000。
2.如权利要求1所述抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16，其特征在于，所述mPEG-Mal的分子量为5000或20000。
3.权利要求1所述抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）化学修饰前体物质Cys-AS16的制备：按现有技术制备前体物质多肽Cys-AS16，即前体物质序列为：CATWLPPRAANLLMAAS；
（2）进行化学修饰；
首先将步骤（1）中多肽溶于20mMpH=6.0~8.0的磷酸缓冲液中，多肽的浓度为1mg/mL；
以摩尔比计，多肽：mPEG-Mal修饰剂=1：1~10，按比例加入mPEG-Mal修饰剂，4~25℃反应1~24h，得化学修饰后多肽粗品；
（3）修饰产物分离纯化；
对步骤（2）中所得多肽粗品，进行纯化；将所收集的纯化后产物冷冻干燥后保存备用。
4.权利要求1所述抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16作为抗肿瘤血管生成药剂的应用。
5.如权利要求4所述抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16作为抗肿瘤血管生成药剂的应用，其特征在于，将多肽溶于生理盐水后直接注射使用。
CN201510720425.4A 2015-10-30 2015-10-30 抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16 Active CN105315350B (zh)

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