CN101830971A - 一种新型抗肿瘤血管生成多肽 - Google Patents

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陈鲤翔
吴东栋
高艳锋
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本发明公开了一种新型抗肿瘤血管生成多肽，分子量为1683，氨基酸序列为ATWLPPRAANLLMAAS。该V3肽由V1肽和V2肽通过柔性连接子Ala-Ala构建而成；V1肽的序列为ATWLPPR；V2肽的序列为NLLMAAS。本发明的优点在于首次将两条具有抗血管生成活性的多肽连接成新的多肽V3。V3肽能够显著抑制移植瘤的生长，随着浓度的提高，抑瘤效果逐渐增强，呈现出明显的剂量依赖性。且随着V3肽浓度的升高，裸鼠移植瘤中的微血管数目逐渐减少，表现出一定的剂量依赖性。在相同浓度下，V3肽能够表现出更强的抗肿瘤生长与抗肿瘤血管生成能力。同时，V3肽对裸鼠免疫系统及重要脏器无明显毒性，为进一步的临床研究与应用奠定坚实的基础。

Description

一种新型抗肿瘤血管生成多肽
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物的研究，尤其是涉及一种新型抗肿瘤血管生成多肽。
背景技术
血管生成是在原有血管内皮细胞基础上形成新血管的自然过程。血管生成在肿瘤生长和转移过程中起着非常重要的作用，不仅可以为肿瘤生长和转移提供必需的氧气和营养物质，而且还可以带走所产生的代谢废物。许多与肿瘤血管生成相关的生长因子已经被鉴定出来，包括碱性呈纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、以及血管生成素(Ang)等。目前肿瘤血管生成相关因子的研究主要集中于VEGF家族和Ang家族。
VEGF家族及其受体VEGFR在生理及病理性的血管与淋巴管的形成过程中起着非常重要的作用。VEGF家族包括六个成员，即VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E和PIGF。在肿瘤血管生成的过程中，VEGF-A是最重要的调节者。VEGF-A是一个同源二聚体蛋白，能够被选择性地切割成为分别含有121、145、165、189和206个氨基酸残基的片段。研究表明VEGF165在内皮细胞增殖、迁移和管状形成过程中起着关键作用，VEGF165产生的信号优先通过酪氨酸激酶受体VEGFR-2(KDR)进行转导，并且能够通过与内皮细胞膜上的NRP-1相互作用形成包含VEGF165、KDR和NRP-1的三聚体复合物，从而使其信号转导作用显著增强。
血管内皮细胞上另一个重要的特异性酪氨酸激酶受体是Tie-2，其通过与配体Ang-1和Ang-2结合来调节血管生成的功能。Ang-1是一个活性配体，它不仅能够诱导Tie-2磷酸化，而且可以促进内皮细胞生存、迁移和血管稳定。Ang-2是Ang-1的天然拮抗剂，能够抑制Tie-2的作用，从而导致血管去稳定。此外，研究表明同时抑制由VEGFR-2和Tie-2介导的信号通路比单独抑制其中一条通路有更强的维持正常血管及肿瘤相关血管完整和稳定的能力。因此，理想的抗血管生成疗法可能需要同时抑制VEGFR-2和Tie-2介导的信号通路，从而能够显著抑制肿瘤的生长和转移。
近年来，通过噬菌体展示文库技术已经鉴定出许多内源性多肽，这些多肽在血管生成过程中起着重要的作用，其中包括两条七肽，即ATWLPPR(V1)和NLLMAAS(V2)。ATWLPPR通过与NRP-1特异性结合并选择性抑制VEGF 165与NRP-1结合来实现其体内外抗血管生成活性，从而抑制肿瘤的生长和转移。而NLLMAAS则能够以剂量依赖的方式来抑制Ang-1和Ang-2与Tie-2的结合并抑制Ang-1诱导的ERK活性，体内试验表明NLLMAAS能够抑制鸡胚尿囊膜上的血管生成。因此，ATWLPPR、NLLMAAS及其它们的衍生物可能成为发展新型抗肿瘤血管生成和治疗其他血管疾病的良好药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够显著抑制移植瘤生长和转移的新型抗肿瘤血管生成多肽。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的新型抗肿瘤血管生成多肽，由17个氨基酸残基组成，分子量为1683，氨基酸序列为
Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser。
所述多肽(V3肽)由V1肽和V2肽通过柔性连接子Ala-Ala构建而成；所述V1肽的氨基酸序列为Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，分子量为840；所述V2肽的氨基酸序列为Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser，分子量为717。
本发明的优点在于首次将两条具有抗血管生成活性的多肽，即V1肽(ATWLPPR)和V2肽(NLLMAAS)通过柔性连接子Ala-Ala连接起来，从而构建一条新的多肽V3(ATWLPPRAANLLMAAS)。研究表明V3肽能够显著抑制S180和H22移植瘤的生长，并且随着浓度的提高，抑瘤效果逐渐增强，呈现出明显的剂量依赖性。此外，随着V3肽浓度的升高，裸鼠移植瘤中的微血管数目逐渐减少，亦表现出一定的剂量依赖性。在相同浓度下，与V1、V2及V1+V2组相比，V3肽能够表现出更强的抗肿瘤生长与抗肿瘤血管生成能力。同时，V3肽对裸鼠免疫系统及重要脏器无明显毒性，给药期间对裸鼠的体重增加没有明显影响。提示V3肽能够成为一种有效的抗肿瘤候选药物，从而为进一步的临床研究与应用奠定坚实的基础。
附图说明
图1、图2、图3分别是V1、V2、V3肽的质谱鉴定图。
图4a1、图4a2、图4b1、图4b2分别为裸鼠接种S180肉瘤与H22肝癌细胞前后对比图。
图5a1、图5a2、图5b1、图5b2、图5c1、图5c2分别为V1、V2、V1+V2、V3肽对BALB/c裸鼠S180和H22移植瘤生长的影响示意图。
图6a1、图6a2为BALB/c裸鼠皮下给药V1、V2、V1+V2、V3肽7天的体重变化曲线图。
图6b1、图6b2为各组裸鼠在试验开始和第七天的体重图。
图7为显微镜下各组裸鼠肿瘤组织HE染色结果图。
图8a为显微镜下各组移植瘤CD34免疫组化染色结果图。
图8b1、图8b2为各组移植瘤中的微血管密度图。
具体实施方式
本发明所述的新型抗肿瘤血管生成多肽，该多肽由17个氨基酸残基组成，分子量为1683，氨基酸序列为
Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser。
多肽(V3)由V1肽和V2肽通过柔性连接子Ala-Ala构建而成；V1肽的氨基酸序列为Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，分子量为840；V2肽的氨基酸序列为Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser，分子量为717；见表1。
表1 V1、V2、V3肽序列及其分子量
Figure GSA00000100461500041
实验方法和结果
1、V1、V2、V3肽采用标准Fomc固相有机合成法进行合成。首先通过树脂与目的多肽的第一位带保护基的氨基酸在一定条件下进行缩合，随后脱掉保护基，加入第二个氨基酸进行缩合。重复以上步骤，直到加入最后一个氨基酸，脱掉其保护基后，利用切割试剂把多肽从树脂上切下得到粗肽。经过脱盐处理，RP-HPLC分析纯化，其纯度大于95％，得到精肽。ESI-MS质谱分析并证实其分子量符合理论值。V1、V2、V3肽的质谱鉴定结果分别见图1、图2、图3。
2、建立裸鼠移植瘤模型。S180肉瘤与H22肝癌细胞接种于昆明小鼠腹腔，5-7天后无菌条件下抽取荷瘤小鼠乳白色腹水，0.2％台盼兰染色检测细胞成活率＞95％。用PBS洗涤3次后，常规培养于含10％胎牛血清和100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃，5％C02及饱和湿度的培养箱中进行培养，每2-3天更换新培养基。当S180与H22细胞体外培养至对数生长期时，制成细胞悬液并用生理盐水(NS)将细胞浓度调整至1×107个细胞/mL，常规消毒后将0.2mL细胞悬液(含2×106个细胞)接种于每只裸鼠右前肢腋窝皮下，持续观察皮下瘤体生长情况。
S180肉瘤与H22肝癌细胞接种裸鼠后，经过1-2天潜伏期，可见皮下移植瘤出现，呈圆形或椭圆形结节，成瘤率为100％。大约7天左右，肿瘤直径长至1.5-2.0cm。裸鼠移植瘤早期为椭圆形，表面光滑，后期呈不规则形，有的表面可见结节呈菜花样，富含血管。接种S180组裸鼠和接种H22组裸鼠相比，H22组裸鼠肿瘤生长较快，成瘤力较高。S180肉瘤与H22肝癌细胞接种前后裸鼠活动状态分别见图4a1、图4a2、图4b1、图4b2。
3.裸鼠荷瘤实验。接种后24h，分别将接种有S180肉瘤和H22肝癌细胞的裸鼠按体重随机分为7组，每组8只：阴性对照组：(生理盐水NS)，阳性对照组V1(320μg/kg/d)，阳性对照组V2(320μg/kg/d)，阳性对照组V1+V2(320μg/kg/d)，V3低剂量组(160μg/kg/d)，V3中剂量组(320μg/kg/d)，V3高剂量组(480μg/kg/d)，各组均采用皮下注射，给药体积按照0.1mL/10g进行，共给药7天，实验期间裸鼠自由进食和饮水。每日测量裸鼠体重及肿瘤的长(a)短(b)径，并按公式：体积＝π/6×a×b2计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，如图5a1、图5b1。裸鼠处死后，取出肿瘤并称重，按下列公式计算肿瘤生长抑制率，肿瘤生长抑制率(Inhibition rate，IR)＝(1-给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100％。裸鼠肿瘤体积增长曲线见图5a2、图5b2，肿瘤质量及各组药物抑瘤率见图5a3、图5b3。
结果表明，第一次给药开始前对裸鼠肿瘤体积进行测量，各组之间统计学差异不显著(P＞0.05)。实验期间，每日测量各组裸鼠肿瘤体积，实验结束后，完整取出肿瘤。与阴性对照组相比，V3肽能够显著抑制S180和H22移植瘤生长(P＜0.01)，随着V3肽浓度的提高，抑瘤作用逐渐增强，在S180移植瘤模型中，160、320、480μg/kg V3肽的抑瘤率分别为41.5％、48.0％、52.6％，而在H22移植瘤模型中，160、320、480μg/kg V3肽的抑瘤率分别为36.0％、45.5％、56.8％，均呈现出明显的剂量依赖性。在320μg/kg这一浓度下，与V1、V2和V1+V2肽相比，V3肽具有更强的抗肿瘤活性(P＜0.05)。
4.毒性评价。裸鼠接种肿瘤细胞后，每日称量各组裸鼠体重，裸鼠体重变化曲线见图6a1、图6b1，实验前后裸鼠体重对比见图6a2、图6b2。裸鼠处死前，摘眼球取血20μL，加入白细胞稀释液0.38mL，混匀，滴加到血球计数板，静置2-3分钟后进行白细胞计数。裸鼠处死后，取出裸鼠肝脏、脾脏、肾脏并称重，计算肝、脾、肾指数，计算方法如下：肝、脾、肾重量/裸鼠体重×100％。各组裸鼠白细胞计数及肝、脾、肾指数结果见表2、表3。
通过对裸鼠精神状态、活动情况、皮屑、食欲等指标的观察，评价各组多肽的毒副反应及裸鼠的生存质量。结果发现各组裸鼠精神状态良好，进食饮水正常，未出现皮屑，日常活动及大小便也未见异常。实验结束时，各组裸鼠未出现死亡现象，存活率为100％。裸鼠相对体重变化是一项检测药物毒性的指标，在整个实验过程中，每天测量各组裸鼠体重并制作裸鼠体重变化曲线以检测各组多肽的毒性大小。第一次给药前，对裸鼠体重进行测量，各组之间统计学差异不显著(P＞0.05)。在实验期间，各组裸鼠体重均缓慢增长，但在S180和H22裸鼠移植瘤模型中，V3高剂量组裸鼠体重增加值均最低。在H22裸鼠移植瘤模型中，与阴性对照组相比，V3高剂量组裸鼠体重增加值有显著性差异(P＜0.05)。由各组裸鼠白细胞计数及肝、脾、肾指数结果可知，各组之间统计学差异不显著(P＞0.05)。这些结果表明，除V3高剂量组有轻微毒性外，其余各组无明显毒性。
表2 荷S180棉植瘤裸鼠皮下给药7天后的白细胞数目和相对器官重量
Figure GSA00000100461500061
表3 荷H22移植瘤裸鼠皮下给药7天后的白细胞数目和相对器官重量
Figure GSA00000100461500062
5.病理组织学检查。裸鼠处死后取出肿瘤组织，经10％甲醛固定，做常规石蜡包埋，连续切片。切片厚度4μm，HE染色，显微镜下观察病理组织学改变并拍照，各组裸鼠肿瘤组织HE染色结果见图7：在移植瘤中出现中央坏死现象，随着V3肽浓度的提高，坏死区域逐渐增大。对心、肝、脾、肺、肾也用同样的方法进行了HE染色和病理学分析，各组药物均没有发现对这些脏器具有损伤作用。
6.微血管密度(MVD)测定。采用链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶连接法，即S-P法进行CD34免疫组化来检测肿瘤组织中的微血管密度。计数方法：每张染色切片先在低倍镜下(×40)选择微血管密度最高的肿瘤区域，即所谓的“热点”，然后在200倍视野下随机计数3个视野内微血管数，再求其平均值为微血管密度。计数时管腔直径≤50μm者判为微血管，直径＞50μm或管壁含有肌层者不作为微血管计数，另外单个染色细胞或成群无管腔的染色细胞也作为独立微血管计数。CD34免疫组化染色结果见图8a，微血管内皮细胞与CD34抗体发生特异性反应，在显微镜下可观察到其被染成棕色；移植瘤中MVD计数结果见图8b1、图8b2。
结果显示，与阴性对照组相比，V1，V2，V1+V2组中微血管密度较低(P＜0.05)，V3低、中、高剂量组微血管密度逐渐降低，呈现出剂量依赖性。在320μg/kg这一浓度下，与V1，V2，V1+V2组相比，V3组微血管密度更低，具有统计学差异(P＜0.05)，提示V3肽具有更强的抗肿瘤血管生成活性。

Claims (2)

1.一种新型抗肿瘤血管生成多肽，其特征在于：该多肽由17个氨基酸残基组成，分子量为1683，氨基酸序列为
Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser。
2.根据权利要求1所述的新型抗肿瘤血管生成多肽，其特征在于：所述多肽由V1肽和V2肽通过柔性连接子Ala-Ala构建而成；所述V1肽的氨基酸序列为Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，分子量为840；所述V2肽的氨基酸序列为Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser，分子量为717。
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