CN105330724B - 一种抗血管生成多肽[D-Ala1]AS16 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种具有抗血管生成作用的多肽[D‑Ala¹]AS16。该多肽结构中含有16个氨基酸，分子量为1683.0，具体氨基酸序列为D‑ATWLPPRAANLLMAAS。相较于现有AS16多肽，表现出较好地通过抑制肿瘤新生血管生成从而抑制肿瘤的生长的效果，而且肿瘤抑制率及生物体存活期也得到了较为明显地改善；长期毒理实验结果表明，本发明所提供的多肽[D‑Ala¹]AS16能够减慢大鼠的体重增长速度；恢复期后，大鼠体重恢复正常。因而总体而言，多肽[D‑Ala¹]AS16在未来肿瘤治疗药物的应用中表现出了较好地前景。

Description

一种抗血管生成多肽[D-Ala1]AS16

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种具有抗血管生成作用的多肽[D-Ala¹]AS16。

背景技术

血管生成是在原有血管内皮细胞的基础上形成新血管的自然过程。研究表明，实体瘤的生长依赖于新生血管生成，血管生成在肿瘤生长和转移过程中起着非常重要的作用，不仅可以为肿瘤生长和转移提供必需的氧气和营养物质，而且可以排泄代谢产物。抗肿瘤血管生成疗法具有很多优点：①具有高效性，破坏少量的血管可使依靠其生长的大量的肿瘤细胞发生缺血性坏死；②血管细胞无或少突变，不易产生耐药性，可长期用药；③广泛的抑瘤谱，不同肿瘤的血管内皮细胞往往表达相同的特异性蛋白分子，针对这种蛋白分子的一种疗法就可能适用于多种肿瘤；④药物易于到达靶细胞，血管内皮细胞直接暴露于血液中，药物能直接发挥作用。

内皮细胞受体酪氨酸激酶VEGF-R2和Tie-2，及其配体血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素Ang1和Ang2，在血管生成中起着重要作用。通过封闭 VEGF受体途径或者封闭Tie-2受体途径，都能抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长，并且抑制VEGF受体传导途径不能被Tie-2传导途径所补偿，反之亦然，两个途径相对独立，且同样重要；即同时抑制由VEGFR-2和Tie-2介导的信号通路比单独抑制其中一条通路有更强的维持正常血管及肿瘤相关血管完整和稳定的能力。

AS16作为一种由VEGFR2受体拮抗剂ATWLPPR（V1肽）和Tie2受体拮抗剂NLLMAAS（V2肽）通过柔性连接子（A-A）连接的多肽，在现有专利中已得到较为充分公开（CN101830971，一种新型抗肿瘤血管生成多肽）。但是作为一种多肽类药物，由于其分子量较小，在生物体内容易被酶降解，半衰期短，因而治疗效果容易受到较大影响，同时其对于抑制肿瘤新生血管生成的作用效果也存在进一步提升的空间。

发明内容

本发明主要目的是在现有AS16多肽基础上，通过对其研究改造，获得了一种新的多肽[D-Ala¹]AS16，相较于原有的AS16多肽，新的多肽[D-Ala¹]AS16在生物体内的半衰期得到了明显延长，而且抗肿瘤血管生成作用效果得到了明显提升。

下面对本发明的技术方案详细介绍如下。

一种抗血管生成多肽[D-Ala¹]AS16，含有16个氨基酸，分子量为1683.0，序列如序列表SEQ ID NO.1所示，具体氨基酸序列为：

D-Ala -Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser；即

D-ATWLPPRAANLLMAAS；

其中所述D-Ala、D-A代表该多肽序列中第一个氨基酸丙氨酸为D-构型；

所述AS16为现有专利中已公开的（申请号：2010101722261，公开号：CN101830971A，一种新型抗肿瘤血管生成多肽，在该专利中为V3肽）多肽序列，与现有多肽序列相比，其主要区别在于在本申请中第一个氨基酸丙氨酸由L-构型替换为D-构型。

所述抗血管生成多肽[D-Ala¹]AS16的制备方法，采用Fomc固相多肽合成法制备而成，过程为：

首先将第一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；

其次将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基发生脱水缩合反应，形成肽键；

重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割合成的多肽，经过乙醚沉淀与洗涤，得到粗肽；

经HPLC纯化后即可制得较高纯度的多肽样品。

具体包括以下步骤：

（1）溶胀树脂，于多肽合成仪中溶胀Wang树脂；

（2）第一个氨基酸的添加，计算称取丝氨酸，同时按比例加入HOBT(1-羟基苯丙三唑）、DIC（N,N-二异丙基二亚胺）反应，反应结束后加封头液封头，洗涤；

（3）第二个氨基酸即丙氨酸的添加，合成是从肽链的C端到N端方向进行，对步骤（2）中第一个氨基酸添加后树脂脱保护，洗涤，然后茚检，按比例加入第二个氨基酸丙氨酸、HOBT、DIC，反应，洗涤；

（4）后续氨基酸的添加，添加的方法同上述第二个氨基酸的添加过程，直至加完所有氨基酸；除了最后一个氨基酸改为D型丙氨酸，其他的氨基酸均为L型氨基酸；

（5）多肽的切割，向步骤（4）中装有树脂的多肽合成仪中加入适量的脱保护液，洗涤；然后在通风橱中将配置好的切割试剂倒入合成仪中进行切割反应；切割完毕后，用旋转蒸发仪将切割液中的TFA去除；由于多肽序列中含有精氨酸，需再进行冰切；冰切完成后获得粗肽；粗肽烘干后利用RPHPLC纯化，纯化后产物首先于-80℃低温冰箱冷冻过夜，然后用冷冻干燥机冻干成白色粉末后于-20℃冰箱保存备用，即为所合成的多肽成品。

所述抗血管生成多肽[D-Ala¹]AS16，在肿瘤治疗药物中的应用，所述肿瘤例如H22肝癌所导致肿瘤。

现有技术中，为延长多肽药物在生物体内半衰期，常用思路之一是以D构型氨基酸替换天然L构型氨基酸，从而降低酶对肽的降解作用，延长其半衰期。但不同构型氨基酸替换后，其生物活性的保留度及相应的作用效果则是未知的。

本发明所提供的新的多肽[D-Ala¹]AS16，相较于现有的AS16多肽，其结构差异主要在于第一个氨基酸构型的不同，而正是这一构型差异，使得本申请所提供的多肽[D-Ala¹]AS16在进入生物体内时，不易被酶降解，具有更长的半衰期。同时，进一步的生物体活性实验证明，[D-Ala¹]AS16多肽相较于现有的AS16多肽，同样地表现出了较好地通过抑制肿瘤新生血管生成从而抑制肿瘤的生长的效果，而且肿瘤抑制率及生物体存活期也得到了较为明显地改善；同时长期毒理实验结果表明，本发明所提供的多肽[D-Ala¹]AS16虽然具有延缓动物体重增长的作用，但在恢复期结束后，动物体重恢复正常，对体重的影响只是该多肽药理效应的结果 ；因而总体而言，多肽[D-Ala¹]AS16在未来肿瘤治疗药物的应用中表现出了较好地前景。

附图说明

图1为多肽AS16的质谱鉴定图；

图2为多肽[D-Ala¹]AS16的质谱鉴定图；

图3为多肽AS16、多肽[D-Ala¹]AS16对Balb/c小鼠的生长曲线图；

图4为多肽AS16、多肽[D-Ala¹]AS16对Balb/c小鼠的H22瘤重；

图5为多肽AS16、多肽[D-Ala¹]AS16对Balb/c小鼠的抑瘤率；

图6为多肽AS16、多肽[D-Ala¹]AS16尾静脉注射对Balb/c小鼠的生长曲线图；

图7为多肽AS16、多肽[D-Ala¹]AS16尾静脉注射对Balb/c小鼠H22瘤重；

图8为多肽AS16、多肽[D-Ala¹]AS16尾静脉注射对Balb/c小鼠的抑瘤率；

图9为H22肿瘤HE染色；

图10为H22肿瘤CD31染色；

图11为多肽AS16（b）、多肽[D-Ala¹]AS16（a）对Balb/c小鼠生存期的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，对本发明中所用部分样品、药剂及仪器设备简要说明如下。

实验试剂

Fomc固相多肽合成中，Wang树脂和Fmoc保护的L型氨基酸及D型氨基酸均购于吉尔生化（上海）有限公司；

细胞培养中，RPMI-1640培养基（500mL/瓶）购于北京Solarbio公司；FBS（胎牛血清，100mL/瓶）购于杭州四季青生物有限公司。

小鼠样品及癌细胞

Balb/c小鼠，无特定病原体动物（SPF）级，雌性，18-20g，购自北京华阜康生物医药科技有限公司；

SD大鼠，清洁（CL）级，250g左右，河南省实验动物中心提供；

昆明小鼠，清洁级，18-20g,河南省实验动物中心提供；

H22小鼠肝癌细胞，来自于河南省医学科学研究院。

小鼠移植瘤模型的建立

具体步骤如下：

（1）取出在培养瓶中培养的H22小鼠肝癌细胞，调整细胞浓度至1×10⁷个/mL，常规消毒；用1mL注射器吸取0.2mL（含2×10⁶个细胞）肿瘤细胞（H22小鼠肝癌细胞）悬液，注射入昆明小鼠的腹腔内。

（2）将H22小鼠肝癌细胞经过两次以上腹腔传代之后，取出腹水， 800r/min离心8min，弃上清，生理盐水重悬，吸取重悬液用0.2%台盼兰染色，显微镜下观察确认细胞成活率＞95%时可以进一步应用。调整细胞浓度至1×10⁷个/mL，常规消毒备用。

（3）吸取0.2mL（含2×10⁶个细胞）肿瘤细胞（H22小鼠肝癌细胞）悬液注射入Balb/c小鼠右上肢腋下，建立Balb/c小鼠移植瘤模型，并观察记录肿瘤的生长情况。

实施例1

本申请所提供的抗血管生成多肽[D-Ala¹]AS16，含有16个氨基酸，分子量为1683.0，具体氨基酸序列为：

D-Ala -Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser；即

D-ATWLPPRAANLLMAAS；

其中所述D-Ala、D-A代表该多肽序列中第一个氨基酸丙氨酸为D-构型。

多肽[D-Ala¹]AS16采用Fomc固相多肽合成法制备而成，具体制备过程如下：

（1）溶胀树脂，称取0.3g的Wang树脂，再将称量好的Wang树脂倒入洗干净且干燥的多肽合成仪中，之后加入DMF 5 mL，溶胀树脂30min，待溶胀后，用真空泵将多肽合成仪中的DMF抽出；

（2）第一个氨基酸的添加，

按公式Ⅰ计算称取丝氨酸316.5mg、HOBT(1-羟基苯丙三唑）111.5mg、DIC（N,N-二异丙基二亚胺）104.2µL，

所述公式Ⅰ为：ｍ=树脂质量×2.5倍当量×对应物质的相对分子质量；

按公式Ⅱ计算称取DMAP（对二甲基吡啶）9.162mg，

所述公式Ⅱ为：DMAP的质量=树脂质量×0.25倍当量×DMAP的相对分子质量；

首先向烧杯中加入DMF来溶解氨基酸和HOBT，待氨基酸和HOBT溶解后，将其倒入装有溶胀好的树脂的多肽合成仪中，然后直接在合成仪中加入DIC，摇床上搅拌10min；再加入DMAP，摇床搅拌2.5h；

然后按以下顺序及次数进行洗涤，DMF两次→MeOH(甲醇)三次→DCM（二氯甲烷）三次→DMF两次，摇床中振荡洗涤，每次洗涤2min，洗涤结束时用真空泵将液体抽干；

用分光光度计测定波长为290nm处第一个氨基酸与树脂结合的情况，根据公式计算取代值，加封头液封头两次，每次20min，在摇床中振荡，然后洗涤，洗涤方法同步骤（2）中的洗涤要求；

取代值计算公式为：取代值=样品OD值/（1.65×树脂质量）；

（3）第二个氨基酸即丙氨酸的添加，

合成是从肽链的C端到N端方向进行，对步骤（2）中第一个氨基酸添加后树脂脱保护两次，脱保护是在合成仪中加入3~5mL脱保护液（哌啶与DMF的体积比为1:3），在摇床中搅拌反应20min，真空泵抽干；

然后洗涤，洗涤方法及步骤同步骤（2）中洗涤；

洗涤后，挑取树脂进行茚检，待茚检呈红棕色时（若前一个氨基酸是脯氨酸、丝氨酸和组氨酸时则茚检呈红棕色，其他氨基酸则为蓝色），按公式Ⅲ计算称取第二个氨基酸丙氨酸、HOBT、DIC的量，分别为162.67mg、70.60mg、65.6µL，

所述公式Ⅲ为：ｍ=树脂质量×2.5倍当量×对应物质的相对分子质量×取代值；

首先向烧杯中加入DMF来溶解氨基酸和HOBT，待氨基酸和HOBT溶解后，将其倒入装有溶胀好的树脂的多肽合成仪中，然后直接在合成仪中加入DIC，摇床上搅拌反应2.5h；

反应结束后按步骤（2）的方法洗涤树脂，洗涤结束后挑取树脂茚检呈无色；

（4）后续氨基酸的添加，

添加的方法同上述第二个氨基酸的添加过程，直至加完所有氨基酸；

除了最后一个氨基酸改为D型丙氨酸，其他的氨基酸均为L型氨基酸；

（5）多肽的切割，

步骤（4）中所制备的多肽仍然附着结合于树脂上，因而尚需进一步的切割，提纯；

切割试剂的配比如下：TFA 4.95mL、三蒸水 0.3mL、苯甲硫醚 0.3mL、1,2-乙二硫醇0.3mL、苯酚 0.3mL；

具体过程如下：

向装有树脂的多肽合成仪中加入适量的脱保护液，脱保护两次；再按以下顺序进行洗涤，DMF两次→MeOH三次→DCM三次→DMF一次→DCM两次，每次两分钟；

在通风橱中，将配置好的切割试剂倒入合成仪中，再将搅拌器放入合成仪中开始进行切割反应3h；

切割完毕后，用真空抽滤泵抽滤出切割液至球形烧瓶中，并用DCM冲洗至抽滤出的液体颜色透明为止；

用旋转蒸发仪将切割液中的TFA去除，旋转蒸发仪温度调整为65℃，旋转蒸发10~20min；

由于多肽序列中含有精氨酸，需再进行冰切，向瓶中加入5mL TFA，置于冰中，摇床上震摇30min；在球形烧瓶中加入乙醚再蒸发4~6次，最后加入冰乙醚在冰上静置30min，白色沉淀即为析出的粗肽；

沉淀完全后，用吸管吸取沉淀乙醚混合液置于15mL离心管中，之后2000r/min，离心2min；离心后弃上清收集沉淀，之后继续吸取沉淀乙醚混合液重悬离心管中的沉淀，然后继续离心；直至收集全部沉淀，之后在吸取冰乙醚重悬洗涤沉淀，重复洗涤离心5-7次；

将得到的粗肽在37℃烘箱中烘干；

利用RPHPLC纯化粗肽，纯化条件为：

流动相A：水+0.1%TFA；

流动相B：乙腈+0.1%TFA；

流动相B的线性梯度：20~60%；流速：5min/mL；运行时间：40min；上样量：4mL；检测波长：228nm；

将所收集的产物首先于-80℃低温冰箱冷冻过夜，然后用冷冻干燥机冻干成白色粉末后于-20℃冰箱保存备用。

AS16为现有专利中已公开的（申请号：2010101722261，公开号：CN101830971A，一种新型抗肿瘤血管生成多肽，在该专利中为V3肽）多肽序列，与现有多肽序列相比，其主要区别在于在本申请中第一个氨基酸丙氨酸由L-构型替换为D-构型，参考现有技术（申请号：2010101722261，公开号：CN101830971A，一种新型抗肿瘤血管生成多肽，在该专利中为V3肽）同样采用Fomc固相多肽合成法进行合成制备。

对所制备的多肽AS16、多肽[D-Ala¹]AS16的质谱鉴定结果分别参见图1、图2。

从其质谱鉴定结果分析可以看出，采用Fomc固相多肽合成法所制备的多肽[D-Ala¹]AS16、多肽AS16均符合理论值，说明制备成功。

实施例2

本实施例主要介绍以Balb/c小鼠移植瘤模型（负载H22小鼠肝癌细胞）为生物体材料进行的相关药剂实验，包括有抑瘤率实验、尾静脉注射实验、小鼠生存期实验等多项，从而较为全面的反应多肽[D-Ala¹]AS16在抗肿瘤血管生成方面的效果。对相关实验情况详细介绍如下。

抑瘤率实验

取6~8周龄的Balb/c小鼠移植瘤模型中的雄鼠，随机分为6组，每组6只。6个组别具体为：阴性对照组（生理盐水NS）、[D-Ala¹]AS16高剂量组（2mg/kg/d）、[D-Ala¹]AS16低剂量组（0.5mg/kg/d）、AS16高剂量组（2mg/kg/d）、AS16低剂量组（0.5mg/kg/d）、阳性对照5-Fu（1mg/kg/d）组。

各组均采用皮下注射给药，给药体积按照0.1mL/10g进行。荷瘤后第3天开始给药，共给药7天。实验期间小鼠自由进食进水。

从给药第一天开始测量肿瘤长径（a）和短径（b），按如下公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤体积增长曲线，

肿瘤体积=（π/6）×a×b²。

给药7天后处死小鼠，剥除肿瘤并称瘤重，抑瘤率（肿瘤生长抑制率，Inhibitionrate，IR）按如下公式计算，

肿瘤生长抑制率=（1－给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重）×100%。

肿瘤体积增长曲线如图3所示，肿瘤瘤重及各组抑瘤率如图4、图5所示。

结果显示：与阴性对照组相比，小鼠给药后，几乎所有的给药组的肿瘤体积增长都有所放缓，多肽AS16和多肽[D-Ala¹]AS16均表现出较好的抑瘤效果。其中AS16(2mg/kg）组、AS16(0.5mg/kg）组、[D-Ala¹]AS16（2mg/kg）组、[D-Ala¹]AS16(0.5mg/kg)组以及5Fu组的抑瘤率分别为34.29%、32.33%、36.99%、46.02%、32.78%。从实验结果可知，多肽[D-Ala¹]AS16低剂量（0.5mg/kg）的抑瘤效果最好，其抑瘤率可达46.02%。总体而言，多肽[D-Ala¹]AS16的抑瘤效果比母肽AS16好。

尾静脉注射法药效实验

取Balb/c小鼠移植瘤模型中的雌鼠，随机分为8组，每组6只。8个组别具体为：阴性对照组（生理盐水NS）、[D-Ala¹]AS16高剂量组（1mg/kg/d）、[D-Ala¹]AS16中剂量组（0.5mg/kg/d）、[D-Ala¹]AS16低剂量组（0.25mg/kg/d）、AS16高剂量组（1mg/kg/d）、AS16中剂量组（0.5mg/kg/d）、AS16低剂量组（0.25mg/kg/d）、阳性对照环磷酰胺（20mg/kg/d）组。

静脉注射是临床中常用的一种给药方法，而且肿瘤实际临床治疗中，静脉注射也是较为普遍和常用的给药方式，因而通过静脉注射方式评价药物在生物体内的作用效果也是具有积极的意义的。

在本实验中，通过尾静脉注射给各小组给药，给药量按0.1 mL/10g的标准计算。荷瘤后第一天即开始给药，连续给药14天。试验期间，小鼠自由进食进水。

荷瘤后第一天即开始给药，从给药第一天开始测量肿瘤长径（a）和短径（b），按如下公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤体积增长曲线，

肿瘤体积=（π/6）×a×b²。

给药14天后处死小鼠，剥除肿瘤并称瘤重，抑瘤率（肿瘤生长抑制率，Inhibitionrate，IR）按如下公式计算，

肿瘤生长抑制率=（1－给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重）×100%。

称重后肿瘤用福尔马林固定后做HE染色和CD31免疫组化染色实验。

肿瘤体积增长曲线如图6所示，肿瘤瘤重及各组抑瘤率如图7、图8所示，HE染色结果如图9所示；CD31免疫组化染色结果如图10所示。

从肿瘤的生长曲线图6可知，与阴性对照组相比，小鼠给药后，几乎所有的给药组的肿瘤体积增长都有所放缓，药物组的抑瘤效果比较明显。AS16(1mg/kg）组、AS16(0.5mg/kg）组、AS16(0.25mg/kg）组、[D-Ala¹]AS16（1mg/kg）组、[D-Ala¹]AS16(0.5mg/kg)组、[D-Ala¹]AS16(0.25mg/kg)组以及CTX组的抑瘤率分别为75.45%、77.17%、77.17%、58.81%、56.33%、66.53%、67.22%。从结果可得[D-Ala¹]AS16肽的抑瘤效果最好，且明显优于AS16肽和环磷酰胺的效果。

通过HE染色我们可以看出和阴性对照NS组的肿瘤组织相比，给药组的肿瘤组织内部坏死区面积都很大，其坏死程度基本与剂量的关系基本与抑瘤率的结果相类似，并且[D-Ala¹]AS16肽给药组的肿瘤坏死面积大于母体肽AS16组。

通过CD31免疫组化染色结果，进一步明确观察到小鼠肿瘤内部血管数量的情况，从其结果我们可以看到药物组的肿瘤血管数量要明显少于阴性对照NS组，而且[D-Ala¹]AS16肽组的肿瘤血管密度也低于AS16组。

综合抑瘤情况、肿瘤组织坏死情况以及肿瘤内血管密度情况这三个结果，我们可以得到以下结论，[D-Ala¹]AS16肽比母体肽AS16具有较明显的抑制肿瘤血管生成的能力。这可能是由于经过N端D构象氨基酸取代的改造后，[D-Ala¹]AS16肽的稳定性以及在动物体内的半衰期相比于母体肽AS16有了明显的改善，从而具有较好的抑瘤效果。

生存期实验

取6~8周龄的Balb/c小鼠移植瘤模型中的小鼠（雌性对半），随机分为8组，每组10只。8个组别具体为：阴性对照组（生理盐水NS）、[D-Ala¹]AS16高剂量组（1mg/kg/d）、[D-Ala¹]AS16中剂量组（0.5mg/kg/d）、[D-Ala¹]AS16低剂量组（0.25mg/kg/d）、AS16高剂量组（1mg/kg/d）、AS16中剂量组（0.5mg/kg/d）、AS16低剂量组（0.25mg/kg/d）、阳性对照环磷酰胺（CTX）（20mg/kg/d）组。

采用尾静脉注射方式给药，给药量按0.1 mL/10g的标准进行计算。连续给药14天，之后为每两天给一次药。试验期间，小鼠自由进食进水。

待任何一组小鼠死光后即停止给药，进入观察期，记录小鼠的死亡情况。观察期间，如果发现有小鼠的瘤长破，即视为该小鼠死亡。

生存期记录情况作图如图11所示。

从图中可以看出，与阴性对照NS组相比，多肽[D-Ala¹]AS16给药组和多肽AS16给药组都能有效的改善延长荷瘤小鼠的生存率，而且多肽[D-Ala¹]AS16给药组的效果整体上优于多肽AS16给药组的结果。具体而言，多肽[D-Ala¹]AS16的低剂量和高剂量组均能将小鼠的存活时间延长到84天，中剂量组也将小鼠的存活时间延续到了74天，而多肽AS16只有高剂量组能将小鼠的存活时间延长至81天，而中剂量组和低剂量组荷瘤小鼠的存活时间分别为66天和64天。从这个实验结果可知由于多肽[D-Ala¹]AS16比AS16具有较好的抑瘤效果，从而能更好的延长小鼠的生存期。

长期毒性实验

为检测多肽[D-Ala¹]AS16作为药物的安全性，发明人以SD大鼠样品为对象，进行了多肽[D-Ala¹]AS16的长期毒性实验。具体实验过程及结果简要介绍如下。

将SD大鼠样品按体重随机分为4组，每组20只，雌雄对半分，具体4个组别为：阴性对照组（生理盐水NS）、[D-Ala¹]AS16高剂量组（2mg/kg/d）、[D-Ala¹]AS16中剂量组（1mg/kg/d）、[D-Ala¹]AS16低剂量组（0.25mg/kg/d）。

尾静脉注射给药，给药量按0.1 mL/10g标准计算。给药期限为3个月。

给药结束之后，对部分SD大鼠进行全面的大体解剖，取出并称量主要脏器并做病理学切片。剩余大鼠则停止给药，进入恢复观察期，以了解毒性反应的可逆程度以及可能会出现的延迟性毒性反应，待观察期结束后（1个月）处死所有大鼠，并取血、取脏器做病理学切片，其中病理学检查采用盲法检查。

长期毒性试验检测的指标包括有如下项目：

血液学指标：红细胞计数，血红蛋白，红细胞容积，平均红细胞容积，平均红细胞血红蛋白，平均红细胞血红蛋白浓度，网织红细胞计数，白细胞计数及其分类，血小板计数，凝血酶原时间等；

血液生化学指标：谷丙转氨酶，谷氨酰转肽酶，谷草转氨酶，碱性磷酸酶，肌酸激酶，血尿素氮，肌酐，总蛋白，白蛋白，血糖，总胆红素，总胆固醇，甘油三酯，钾离子浓度，氯离子浓度，钠离子浓度等；

脏器系数：脏器系数又称脏体比，是实验动物某脏器的重量与其体重之比值（《毒理学》）；具体操作为：组织病理学检查的脏器组织、称重并计算脏器系数的有脑、心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、胸腺、脾脏、睾丸、附睾、卵巢、子宫、肺脏等。

实验结果包括大鼠用药期间生物学表观结果、血液学指标结果、生化学指标结果、脏器系数结果等多个方面，详细介绍如下。

生物学表观结果

生物学表观结果可以分为外观特征和体重差别两个方面，其中外观特征主要用来反应所用药剂及剂量对于生物体日常活动的外在影响表现，而体重差别则用来反应所用药剂及剂量对于生物体内在新陈代谢方面的影响。具体结果如下。

服药期间大鼠外观特征

观察记录表明，多肽药物施用期间，各组大鼠均毛色白而具光泽、反应性好、耳色红润、粪尿正常；在给药过程中，只有高剂量组和中剂量组的大鼠出现了一定的厌食反应，其他各组的大鼠没有异常，饮食进水情况良好；各组大鼠无明显的精神萎靡态或过度兴奋肽，未见体表溃疡、糜烂或肿大的包块等；处死前无大鼠异常死亡。

体重差别

对各组SD大鼠的体重具体测量记录如下表所示。

上表中，大鼠体重单位为g，记录形式为平均值±标准差（±S.D.），表中“*”表示具有统计学意义上的P<0.05的差别。

从上表体重统计结果可以看出，给药后高剂量组的体重和生理盐水组相比有明显统计学的差异（P<0.05），而中剂量组只在给药期的第一个月内和生理盐水组有明显统计学差异（P<0.05），而低剂量组和生理盐水组相比则无明显统计学差异。因而，总体而言，长期使用时，中低剂量情况下，多肽[D-Ala¹]AS16对于大鼠新陈代谢不具有明显影响。

血液学指标结果

对生物体血液学各项目进行进一步检测，以期观察长期用药后药物对生物体的内在影响，从而合理和准确的评价药物的毒性。

对处死后大鼠SD血液指标各项检测结果具体如下表所示。

说明，上述表格中各项指标结果表示形式为：平均值±方差（±S.D.）。

从上述常规血液检测结果可以看出，各项指标检测结果和NS组相比都无明显差异（P>0.05），此结果表明，即使长期用药情况下，多肽[D-Ala¹]AS16对于生物体内在的常规血液指标并无明显影响。

血液生化指标检测结果

一般而言，对血液中各项生化指标的分析可以预测、反应相应组织器官的内在变化，因而为对药物长期用药后对生物体各项组织器官的影响有较为全面的评价，常需对血液中多项生化指标进行测定分析。

对处死后SD大鼠的各项血液生化指标的具体检测结果如下表所示。

上述表格中各项指标的结果表达形式为：平均值±方差（±S.D.），表中的“*”表示统计学意义上的P＜0.05。

从上述数据可以看出，长期用药情况下，无论高、中、低剂量情况下，绝大多数生化指标与生理盐水对照组相比均无明显差别，仅肌酐检测项目中，高剂量组和低剂量组雄鼠的检测结果与生理盐水组相比有明显差异（P<0.05）。此结果表明，长期用药情况下，多肽[D-Ala¹]AS16对生物体各器官影响较小甚至是无影响。

凝血四项检测结果:

凝血酶时间（TT）：在肝病、肾病及系统性红斑狼疮时，会出现异常；FIB：肝脏疾病、肾病综合征时，出现异常；APTT：是内源凝血系统较敏感和最为常用的筛选试验；PT：反映肝脏合成功能、储备功能、病变严重程度及预后的一个非常重要的指标。

对处死后SD大鼠的凝血四项的检测结果具体如下表所示。

上述表格中各项指标的结果表达形式为：平均值±方差（±S.D.）。

从上述结果可以看出，各剂量组与生理盐水组相比无明显统计学差异（P＞0.05）。此结果表明长期用药情形下，药剂对于生物体不会导致肝脏、肾脏的损伤及血凝系统病变情况发生。

电解质检测结果

电解质检测的临床意义，主要是观察血液内各种电解质的浓度变化，来反映与电解质变化相关的脏器病变。

对处死后SD大鼠的电解质的检测结果具体如下表所示。

上述表格中各项指标的结果表达形式为：平均值±方差（±S.D.）。

从上述结果可以看出，各剂量组与生理盐水组相比无明显统计学差异（P＞0.05）。此结果表明长期用药情形下，药剂对于生物体内的电解质无明显影响。

脏器系数计算结果

脏器系数可以较为直观和较为敏感的反应出药剂对于生物体内脏器官的影响，因而是药剂毒性实验中常用指标。

对处死后大鼠SD的脏器系数计算结果如下表所示。

上述表格中各项指标的结果表达形式为：平均值±方差（±S.D.），表中的“*”表示统计学意义上的P＜0.05。

从上表数据可以看出，不同剂量组的多数脏器系数的计算结果与生理盐水对照组相比，均无明显统计学差异（P>0.05），仅在肝脏的脏器系数上，高、中剂量组与对照组表现出一定差别。该结果表明，长期用药情况下，多数脏器均生长正常，仅肝脏在中、高剂量情况下会出现一定程度的肿大，这也与肝脏是药物的主要代谢器官相关，也是长期用药情况下的较为正常的生理体现。

恢复期SD大鼠的生理状况

停药后对于大鼠的各项生理状况持续进行观察、记录，以了解药剂毒性反应的可逆程度以及可能会出现的延迟性毒性反应，该部分检测指标与前述刚停药时检测项目均相同。

生物学表观结果

恢复期大鼠的外观表征结果与对照组已无明显差别，因而可以认为是一致的，因此主要统计了体重差别。

对各组SD大鼠的体重具体测量记录如下表所示。

上表中，大鼠体重单位为g，记录形式为平均值±标准差（±S.D），表中“*”表示具有统计学意义上的P<0.05的差别。

从上表体重统计结果可以看出，经过一个月的恢复期后，各给药组的大鼠体重均能够恢复正常水平。雄鼠组体重数据显示，高剂量组和低剂量组的雄鼠体重明显高于对照生理盐水组，这可能与药剂的药理作用有关，而与药剂的毒性无关。

血液常规指标

恢复期的SD大鼠的血液常规检测结果具体如下表所示。

说明，上述表格中各项指标结果表示形式为：平均值±方差（±S.D.）。

从上述常规血液检测结果可以看出，经过一个月恢复期后，各项指标检测结果和NS组相比都无明显差异（P>0.05）。此结果表明，多肽[D-Ala¹]AS16对于大鼠血液无潜在的遗留性影响。

血液生化指标检测

恢复期的SD大鼠的血液生化指标检测结果具体如下表所示。

上述表格中各项指标的结果表达形式为：平均值±方差（±S.D.）。

从上述数据可以看出，经过一个月恢复期后，各项生化指标与生理盐水对照组相比均无明显差别。其中肌酐检测项目，在停药初期表现出一定的统计差异，而经过恢复期后，肌酐水平也基本恢复至正常。此结果表明，多肽[D-Ala¹]AS16对生物体器官的遗留性影响可自行恢复，不存在残留性影响。

凝血四项检测

恢复期的SD大鼠的凝血四项检测结果具体如下表所示。

上述表格中各项指标的结果表达形式为：平均值±方差（±S.D.）。

从上述数据可以看出，经过一个月恢复期后，各给药组与生理盐水对照组相比均无明显差别。此结果与前述停药初期对大鼠的凝血四项检测结果一致，表明长期用药情况下，多肽[D-Ala¹]AS16对生物体血液无残留性影响。

电解质检测

恢复期的SD大鼠的电解质检测结果具体如下表所示。

上述表格中各项指标的结果表达形式为：平均值±方差（±S.D.）。

从上述数据可以看出，经过一个月恢复期后，各给药组与生理盐水对照组相比均无明显差别。此结果与前述停药初期对大鼠的电解质检测结果一致，表明长期用药情况下，多肽[D-Ala¹]AS16对生物体内电解质无残留性影响。

脏器系数计算结果

恢复期的SD大鼠的脏器系数计算结果具体如下表所示。

上述表格中各项指标的结果表达形式为：平均值±方差（±S.D.）。

从上表数据可以看出，经过一个月恢复期后，给药组脏器系数的计算结果与生理盐水对照组相比，均无明显统计学差异（P>0.05）。其中在停药初期，表现出明显差异的肝脏脏器，在经过恢复期后，与对照组相比，其脏器系数也均未再表现出明显差别。此结果表明，长期用药情况下，药剂对于肝脏的影响在停药后可自行恢复，无残留毒性影响。

对上述长期毒理实验结果总结可以得出，长期用药情况下，多肽[D-Ala¹]AS16对雌性大鼠的毒性并不明显，仅在对于雄鼠应用时表现出一定的毒副作用，而且主要是影响到肝脏器官。但在停药并经一定的恢复期后，大鼠生长均恢复至正常状态，表明多肽[D-Ala¹]AS16的毒性是可逆的。因而总体而言，多肽[D-Ala¹]AS16作为药剂应用与生物体时是具有较好的安全性的。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

<120> 一种抗血管生成多肽[D-Ala¹]AS16

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Thr Trp Leu Pro Pro Arg Ala Ala Asn Leu Leu Met Ala Ala Ser

1 5 10 15

Claims (3)

1.一种抗血管生成多肽[D-Ala¹]AS16，其特征在于，该多肽结构中含有16个氨基酸，分子量为1683.0，序列如SEQ ID NO.1所示，具体氨基酸序列为：

D-Ala -Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser；即

D-ATWLPPRAANLLMAAS；

其中所述D-Ala、D-A代表该多肽序列中第一个氨基酸丙氨酸为D-构型。

2.权利要求1所述抗血管生成多肽[D-Ala¹]AS16的制备方法，其特征在于，采用Fomc固相多肽合成法制备而成。

3.权利要求1所述抗血管生成多肽[D-Ala¹]AS16在肿瘤治疗药物中的应用。