KR102666372B1 - 백혈병 세포 증식 억제 작용을 갖는 폴리펩티드 - Google Patents
백혈병 세포 증식 억제 작용을 갖는 폴리펩티드 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102666372B1 KR102666372B1 KR1020217016964A KR20217016964A KR102666372B1 KR 102666372 B1 KR102666372 B1 KR 102666372B1 KR 1020217016964 A KR1020217016964 A KR 1020217016964A KR 20217016964 A KR20217016964 A KR 20217016964A KR 102666372 B1 KR102666372 B1 KR 102666372B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- polypeptide
- lys
- leukemia
- asn
- ala
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 118
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 115
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 114
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 11
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 230000000199 inhibitory effect on leukemia Effects 0.000 claims abstract description 8
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 21
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 15
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 15
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 13
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims description 13
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 12
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 9
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 8
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 5
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 claims description 4
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 102100036685 Growth arrest-specific protein 2 Human genes 0.000 description 17
- 101001072710 Homo sapiens Growth arrest-specific protein 2 Proteins 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 102000003900 Calpain-2 Human genes 0.000 description 7
- 108090000232 Calpain-2 Proteins 0.000 description 7
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 6
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 5
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 102000007590 Calpain Human genes 0.000 description 2
- 108010032088 Calpain Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 2
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIQCDTKOIPUDSG-GARJFASQSA-N Asn-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)O GIQCDTKOIPUDSG-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N Asp-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- MXZYQNJCBVJHSR-KATARQTJSA-N Cys-Lys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CS)N)O MXZYQNJCBVJHSR-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N Leu-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- VEGLGAOVLFODGC-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VEGLGAOVLFODGC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IZJGPPIGYTVXLB-FQUUOJAGSA-N Lys-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IZJGPPIGYTVXLB-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 1
- UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- JKJSIYKSGIDHPM-WBAXXEDZSA-N Phe-Phe-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(O)=O JKJSIYKSGIDHPM-WBAXXEDZSA-N 0.000 description 1
- BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N Ser-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N Ser-Gln-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000009701 normal cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
Abstract
본 발명은 백혈병 세포 증식 억제 작용을 갖는 폴리펩티드를 개시하며, 구체적으로 백혈병 치료 약물에서 폴리펩티드의 응용에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 37개 아미노산으로 구성되며, 아미노산 서열은 Lys-Glu-Ser-Met-Asp-Ala-Asn-Lys-Pro-Thr-Lys-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Lys-Ile-Pro-Cys-Lys-Thr-Ser-Ala-Pro-Ser-Gln-Ser-Phe-Phe-Ala-Arg-Asp-Asn-Thr-Ala-Asn이다. 상기 폴리펩티드의 N 말단은 미리스트산(myristic acid)과 연결되며, 본 발명에서 제조된 폴리펩티드는 미리스트산과의 연결을 통해 백혈병 세포로 진입하여 백혈병 세포의 증식 억제 효과를 구현한다.
Description
본 발명은 생화학에서 폴리펩티드 약물의 기술 분야에 속하며, 더욱 상세하게는 백혈병 치료 약물에서 폴리펩티드의 응용에 관한 것이다.
백혈병은 일종의 조혈 줄기 세포 악성 종양이다. 이는 임상적으로는 그 발병의 완급과 병변 세포에 따라 분류한다. 백혈병의 발병 유형과 예후 계층화가 비교적 복잡하기 때문에 종합적인 치료 계획 수립이 필요하다. 최근 의료 기술의 발달로 상당수의 환자가 치료를 받을 수 있으나 여전히 일부 사람들은 치료를 받을 수 없거나 치료 약물에 대한 약물 내성, 치료 부작용 및 예후로 인해 잔병을 앓고 있다. 화학 요법 약물은 개별 유형의 백혈병을 치료할 수 있으나 다른 유형의 백혈병 치료에는 여전히 많은 어려움이 있다. 예를 들어 급성 골수성 백혈병 세포주(AML)와 급성 T 림프구성 백혈병 세포주(T-All)는 현재 상응하는 표적 약물이 없으며 화학 요법 효과도 상당히 이상적이지 않다. 따라서 새로운 치료 수단을 찾는 것이 시급하다.
Schneider는 혈청 기아(serum starvation)의 방법으로 NIH-3T3(마우스 섬유아세포)를 처리하여 한 세트의 특이성 고발현 유전자를 감정하였다. 이는 Growth-arrest Specific Genes(성장 특이 억제성 유전자)로 불리며, GAS2는 그 중 하나이다.
문헌에 따르면, GAS2는 다양한 악성 혈액 종양 및 결장암에서 비정상적으로 고발현되며, 결장암 세포 및 BCR-ABL+조혈 세포에서 표적으로 하여 모두 그 증식을 효과적으로 억제할 수 있다. 이는 GAS2가 종양 세포 증식을 촉진/유지할 수 있는 기능이 있음을 의미한다. GAS2는 주로 그 N-말단을 통해 Calpain2(칼파인)과 결합하며, C-말단은 Calpain2(칼파인)의 활성을 억제하는 기능을 발휘하여 종양 세포의 증식을 촉진한다.
GAS2의 절단형 돌연변이체 GAS2Δ171-313도 N-말단을 통해 Calpain2(칼파인)와 결합할 수 있으나, C-말단 결실로 인해 Calpain2(칼파인)의 활성을 억제하는 기능이 없으므로, GAS2의 우성 음성 돌연변이체(GAS2DN)이다. 그러나 Calpain2가 세포 내에 존재하기 때문에, 외인성 GAS2DN은 세포막을 관통하여 세포 내로 들어가 Calpain2(칼파인)와 결합할 수 없다.
많은 연구에서 GAS2(growth-arrest-specific 2)가 다양한 백혈병에서 비정상적으로 고발현되는 것으로 나타났다. 또한 GAS2가 CML의 CD34+세포를 유지하는 새로운 조절 인자임을 발견하였다. 이는 GAS2 표적이 다양한 유형의 백혈병 치료를 개선하고 백혈병 줄기/전구 세포를 제거하는 데 도움이 될 수 있음을 시사한다. 결과는 이미 발표되었다(Zhou X, PloS One, 2014; 9:e86195；Sun L, Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2015; 47:795.).
이 연구는 RNA 간섭 및 GAS2DN 발현이 모두 CML 세포주 K562의 IM 민감성을 강화시킬 수 있다는 것도 발견하였다. 이는 GAS2 표적이 백혈병 세포의 화학 요법 민감성을 강화시킬 수 있음을 시사한다.
전술한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 GAS2DN에서 Calpain2(칼파인)과 특이적으로 결합하는 핵심 폴리펩티드를 연구 및 개발하여 유사 GAS2 소펩티드 서열을 확정하고 백혈병 세포 증식 억제 작용을 갖는 폴리펩티드를 제공하였다. 이는 GAS2DN 단백질 억제 기능이 있으며 백혈병 환자가 치료 효과를 얻을 수 있도록 GAS2 억제제 역할을 한다.
백혈병 세포 증식 억제 작용을 갖는 폴리펩티드에 있어서, 상기 폴리펩티드는 37개 아미노산으로 구성되며, 아미노산 서열은 하기와 같다.
Lys-Glu-Ser-Met-Asp-Ala-Asn-Lys-Pro-Thr-Lys-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Lys-Ile-Pro-Cys-Lys-Thr-Ser-Ala-Pro-Ser-Gln-Ser-Phe-Phe-Ala-Arg-Asp-Asn-Thr-Ala-Asn.
상기 폴리펩티드의 N 말단은 미리스트산(myristic acid)과 연결되며, 미리스트산 변형을 통해 백혈병 세포로 진입하여 백혈구의 증식을 억제하고 백혈병 치료 약물 제조에 사용된다.
상기 폴리펩티드의 제조 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
1) 폴리펩티드의 합성
a. Fmoc-Asn(trt)wang Resin 수지를 반응 칼럼에 붓고 DCM을 첨가하여 함침시키며 흡입 건조한다.
b. 적절한 양의 탈보호 용액을 첨가하고, 질소 가스를 유통시켜 교반하며 흡입 건조한다.
c. 유리 반응 칼럼에 적절한 양의 DMF를 첨가하고, 질소 가스를 유통시켜 교반하며 흡입 건조한다.
d. 아미노산 혼합 용액 또는 보호 아미노산 및 HBTU를 반응 칼럼에 첨가한 다음 NMM을 첨가하며 질소 가스를 유통시켜 교반하며 흡입 건조한다.
e. 적절한 양의 DMF를 첨가하여 세척하고, 질소 가스를 유통시켜 교반하며 흡인 건조하여 입자상 물질을 수득한다.
f. 적절한 양의 입자상 물질을 취하여 작은 시험관에 담고, Kaiser test 시약 A, B, C 액체를 각각 2방울 점적하며, 건식 가열기에 넣고 가열한다. 용액 색깔이 약간 노랗고 입자상 물질이 무색투명하면 반응이 완료된 것이다. 상기 단계 b-e를 반복하여 마지막 아미노산 및 미리스트산이 연결될 때까지 다음 아미노산을 연결한다.
g. 단계 f)를 완료한 반응 칼럼에 적절한 양의 메탄올을 첨가하고 질소 가스로 교반하여 흡입 건조한다. 그 다음 적절한 양의 DCM을 첨가하고 질소 가스로 교반하여 흡입 건조하여 합성된 폴리펩티드 수지를 수득한다. 적절한 용기에 담고 진공 건조기 내에서 진공 건조한다.
2) 폴리펩티드의 절단
폴리펩티드 수지에 폴리펩티드 절단액을 첨가하고 항온 환경 하에 거치하여 진탕한다. 그 다음 여과하며 여과액에 무수 에틸에테르를 첨가하고 교반한 후 백색 고체를 석출한다. 백색 고체에 무수 에틸에테르를 첨가하고 원심 분리하여 세척하며 진공 건조하여 백색 분말, 즉 폴리펩티드의 조생성물을 수득한다.
3) 폴리펩티드의 정제
적절한 양의 폴리펩티드 조생성물을 취하고, 순수(pure water)와 ACN을 첨가하여 초음파 용해하고, 여과막으로 여과한 후 여과액을 취한다. 고성능 액체 크로마토그래피를 이용해 순방향 크로마토그래피 칼럼으로 구배 검출 분석을 수행한다. 크로마토그래피 칼럼을 제조하여 흡착 및 용출하여 분획을 수집한다. 수집된 분획을 검출하며, 순도가 통과되면 냉동 건조를 수행하여 정제된 폴리펩티드를 수득한다.
더 나아가, 상기 탈보호 용액은 20% 헥사히드로피리딘(hexahydropyridine)과 80% DMF로 구성된다.
더 나아가, 상기 보호 아미노산은 Fmoc-Aa-oh 형태의 보호 아미노산이고, 상기 아미노산 혼합 용액은 보호 아미노산을 DMF에 용해시켜 만든다.
더 나아가, 상기 Kaiser test 시약의 A 액체는 80% 페놀과 20% 무수 에탄올이고, B 액체는 재증류된 피리딘이고, C 액체는 5g 닌히드린(ninhydrin)과 100ML 무수 에탄올이다.
더 나아가, 상기 폴리펩티드 절단액의 구성 성분은 87.5% TFA, 5% 티오아니솔(thioanisole), 2.5% 페놀, 2.5% EDT 및 2.5% H2O이다.
더 나아가, 상기 3) 폴리펩티드의 정제 단계는 하기와 같다.
제조 조건:
파장 길이: 220nm
유속: 0.5-1.5ml/min
제조 칼럼: Gemini-NX 5μ C18 110A, 4.6*250mm
유동상: A 액체: 0.1%Trifluoroacetic in 100% Acetonitrile
B 액체: 0.1%Trifluoroacetic in 100% Water
a) 비커에 적당량의 폴리펩티드 조생성물을 계량하고, 순수와 ACN을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 완전히 용해되면 0.45μ의 여과막으로 여과한다.
b) 적정량의 폴리펩티드 조생성물을 원심분리관에 취하여 넣고 순수로 초음파 용해하여 정화 여과(clarification filtration)하며, 10 내지 100% 구배 검출로 분석한다.
c) 제조 조건 하에서 약 6분 동안 기기 균형을 맞춘 후 모든 펌프를 정지하며, a) 단계에서 여과된 여과액을 샘플 주입 밸브를 이용해 주입한다. 먼저 30 내지 90% 구배를 20분 동안 실행한 다음 100 내지 0% 구배를 실행하여 분획을 수집한다.
d) 수집된 분획을 검출하고, 순도가 통과되면 냉동 건조를 수행하여 정제된 폴리펩티드를 수득한다.
(1) 본 발명에 의해 제조된 폴리펩티드는 GAS2DN 단백질 억제 기능이 있고, GAS2 억제 작용을 발휘하여 백혈병 세포의 증식을 억제할 수 있다. 그러나 GAS2DN은 세포막을 관통하여 세포로 진입할 수 없기 때문에 , 백혈병 세포 증식 억제 기능이 있어도 백혈병 세포의 증식을 억제하는 효과를 구현하지 못한다. 그러나 본 발명에 의해 제조된 폴리펩티드는 미리스트산과 결합함으로써 백혈병 세포에 진입하여 백혈병 세포 증식 억제 효과를 구현할 수 있다. (2) 본 발명에 의해 제조된 폴리펩티드는 백혈병 세포 증식 억제 효과가 있는 동시에 정상 세포에 대해서는 억제 작용을 나타내지 않는다. 상기 폴리펩티드를 핵심 성분으로 백혈병을 치료하는 신규한 표적 치료 약물을 개발할 수 있고, 새로운 치료법을 제공하여 부작용을 줄여 환자의 고통을 완화하고 백혈병의 치료율과 생존율을 향상시킨다. 특히 급성 T 림프구성 백혈병 세포주(T-All)와 급성 골수성 백혈병 세포주(AML)와 같은 특정 백혈병 아형의 경우, 현재의 화학 요법 효과가 바람직하지 않으며 적합한 표적 약물도 없다. 본 발명의 폴리펩티드는 상기 2가지 유형의 백혈병 세포를 효과적으로 억제할 수 있으며, 이는 상기 폴리펩티드를 핵심 성분으로 백혈병을 치료하는 신규한 표적 치료 약물을 개발할 수 있으며, 이러한 백혈병 치료 분야의 표적 치료 약물 부재의 공백을 채울 수 있음을 시사한다. (3) 이 연구는 RNA 간섭 및 GAS2DN 발현이 모두 CML 세포주 K562의 IM 민감성을 강화시킬 수 있다는 것도 발견하였다. 이는 GAS2 표적이 백혈병 세포의 화학 요법 민감성을 강화시킬 수 있음을 시사한다. 따라서 상기 폴리펩티드를 핵심 성분으로 개발된 백혈병 치료의 신규한 표적 치료 약물은 화학 요법 약물과 병행 사용할 경우 치료 효능을 강화시킬 수 있다.
본 발명의 목적은 GAS2DN에서 핵심 폴리펩티드를 개발하고 유사 GAS2 소펩티드 서열을 확정하며 백혈병 세포 증식 억제 작용을 갖는 폴리펩티드를 제공하며, GAS2DN 단백질 억제 기능을 갖추어 백혈병 환자가 치료 효과를 얻을 수 있도록 GAS2 억제제 역할을 하는 데에 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 37개 아미노산으로 구성되며, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기와 같다.
Lys-Glu-Ser-Met-Asp-Ala-Asn-Lys-Pro-Thr-Lys-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Lys-Ile-Pro-Cys-Lys-Thr-Ser-Ala-Pro-Ser-Gln-Ser-Phe-Phe-Ala-Arg-Asp-Asn-Thr-Ala-Asn.
상기 폴리펩티드의 N 단말은 미리스트산으로 변형하며, 상기 폴리펩티드는 미리스트산 변형을 통해 세포에 진입하여 그 억제 기능을 발휘하고 백혈병 세포 증식을 억제할 수 있다.
실시예 1
폴리펩티드의 제조 방법:
원료 및 필요한 시약의 배치
보호 아미노산: 상기 폴리펩티드에 포함된 다양한 아미노산을 Fmoc-Aa-oh 형태의 보호 아미노산으로 만든다.
아미노산 혼합 용액: 상기 다양한 보호 아미노산 1mmol을 칭량하여 63.4ml DMF 용액에 각각 용해하여 0.3mmol/ml의 아미노산 혼합 용액을 준비한다.
출발 수지: Fmoc-Asn(trt)wang 수지.
축합제 및 유기염: HBTU, NMM.
용매: DMF, DCM, 메탄올, 헥사히드로피리딘.
Kaiser test 시약의 배합 제조:
A 액체: 80%의 페놀+20%의 무수 에탄올
B 액체: 재증류 피리딘
C 액체: 5g 닌히드린+100ML 무수 에탄올
탈보호 용액의 배합 제조:
20%의 헥사히드로피리딘+80%의 DMF
폴리펩티드 절단액의 배합 제조:
87.5% TFA+5% 티오아니솔+2.5% 페놀+2.5% EDT+2.5% H2O
1) 폴리펩티드의 합성
a. 수지 팽윤: Fmoc-Asn(trt)wang Resin 수지를 반응 칼럼에 붓고 DCM을 첨가하여 30분간 함침시키며 흡입 건조한다.
b. 탈보호: 유리 반응 칼럼에 적정량의 탈보호 용액을 첨가하고, 질소 가스를 유통시켜 30분간 교반하여 흡입 건조한다.
c. 탈보호 세척: 유리 반응 칼럼에 적정량의 DMF를 첨가하고 질소 가스로 2분간 교반하여 흡입 건조하고 작업을 6회 반복한다.
d. 재료 투입: 수지 3배 몰량의 아미노산 혼합 용액 또는 동일한 양의 보호 아미노산과 2.85배 몰량의 HBTU를 칭량하여 유리 반응 칼럼에 첨가한 다음, 수지 6배 몰량의 NMM을 첨가하며, 질소 가스로 30분 동안 교반한다.
e. 반응 후 세척: 유리 반응 칼럼 중의 용액을 흡입 건조하고, 적정량의 DMF를 첨가하여 세척하며, 질소 가스로 2분간 교반하여 흡입 건조한다. 작업을 3회 반복하여 입자상 물질을 수득한다.
f. 검출: 적정량(10 내지 20입자)의 입자상 물질을 작은 시험관에 넣고 A, B, C 액체를 각각 두 방울 점적한다. 건식 가열기에 넣고 3분간(섭씨 110도) 가열한다.
꺼낸 다음 용액이 청색이고 입자상 물질이 얼룩덜룩하며 투명하지 않으면 반응이 완료되지 않았음을 의미하므로 다시 1회 반응시켜야 한다.
용액의 색이 약간 노랗고 입자상 물질이 무색투명하면 반응이 완료된 것이며, 다음 아미노산이 연결될 수 있다. 구체적으로 마지막 아미노산이 연결될 때까지 b-f의 5단계를 반복한다.
h. 합성 완료 후 세척 및 건조: 마지막 아미노산 및 미리스트산을 연결하여 검출을 통과한 후, 흡입 건조하고, 유리 반응 칼럼에 적정량의 메탄올을 첨가한다. 질소 가스로 2분 동안 교반하고 흡입 건조한 다음 적정량의 DCM을 첨가하고 질소 가스로 2분간 교반하며 흡입 건조하고 작업을 3회 반복한다. 마지막으로 유리 반응 칼럼에 적정량의 메탄올을 넣고 질소 가스로 2분간 교반한 후 흡입 건조하며 작업을 2회 반복하여 폴리펩티드 수지를 수득한다. 상기 폴리펩티드 수지를 적당한 용기에 담아 절단을 위해 진공 건조기 내에서 12시간 동안 진공 건조한다.
2) 폴리펩티드의 절단
절단: 상기 건조된 폴리펩티드 수지를 적당한 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 적당량의 준비된 폴리펩티드 절단액(1g/10ml)을 첨가하며, 항온 진탕기에서 25℃ 항온으로 2시간 동안 흔들어 준다.
여과: 50ml의 샌드 코어 깔때기를 사용하여 용해되지 않은 폴리펩티드 수지를 여과한 후, 여과액을 100ml의 원심분리관에 붓고, 6 내지 8배 체적량의 무수 에틸에테르를 첨가하면서 교반한다. 석출된 백색 고체가 바로 필요한 폴리펩티드 조생성물이다.
세척: 원심분리관을 밀봉한 후 원심분리기에서 4000rpm의 속도로 3분간 원심분리한다. 꺼내어 상층액을 버리고 다시 무수 에틸에테르를 첨가하며, 유리 막대로 균일하게 저어 준 다음 다시 원심분리한다. 여기에서 세척을 5회 반복한다.
건조: 상기 5회 세척한 백색 고체를 진공 건조기에 넣고 24시간 동안 진공 건조한다. 마지막으로 수득한 백색 분말이 필요한 폴리펩티드의 조생성물이며, 정제를 위해 칭량한다.
3) 폴리펩티드의 정제
제조 조건:
기기: 고성능 액체 크로마토그래피, 자외선 검출기
파장 길이: 220nm
유속: 1.0ml/min
제조 칼럼: Gemini-NX 5μ C18 110A, 4.6*250mm
유동상: A 액체: 0.1%Trifluoroacetic in 100% Acetonitrile
B 액체: 0.1%Trifluoroacetic in 100% Water
조생성물 분석:
소량의 폴리펩티드 조생성물을 취하여 0.5ml 원심분리관에서 초순수로 맑아질 때까지 초음파 용해하며, 여과하여 샘플을 넣고 구배 10 내지 100%로 분석한다.
분리 정제:
a) 용해
200mg 폴리펩티드 조생성물을 칭량하여 10ml 비커에서 7.5ml 순수와 2.5ml ACN을 첨가하여 초음파로 용해시키고 완전히 용해된 후 0.45μ의 여과막으로 여과한다.
b. 제조
고성능 액체 크로마토그래피는 제조 조건에서 약 6분 동안 기기 균형을 맞춘 후 모든 펌프를 정지하며, a) 단계에서 여과된 여과액을 샘플 주입 밸브를 이용해 주입한다. 제조 구배를 운행하며, 먼저 30 내지 90% 구배를 20분 동안 실행한 다음 100 내지 0% 구배를 실행하여 분획을 수집한다. 수집 종료 후 펌핑을 정지한다. 수집된 분획은 분석기 상에서 순도를 검사하며, 순도가 통과된 분획은 동결 건조한다.
c. 냉동 건조
수집된 분획은 회전 증발기 중의 유기 용매로 회전 증발시켜 제거한 후 냉동 건조기에서 냉동 건조한다.
d. 칭량 검출
동결 건조 2일 후 동결 건조기를 열고 칭량한 중량을 취하여 정품관에 넣고 QC 검출로 보내 합격되어 입고될 때까지 기다린다.
실시예 2
실험 데이터를 이용해 백혈병 세포 증식에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 억제 효과를 증명한다.
선택된 실험 세포는 하기와 같다.
K562 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주(CML)
Jurkat 세포, 급성 T 림프구성 백혈병 세포주(T-ALL)
THP-1 세포, 급성 골수성 백혈병 세포주(AML)
BAF-3 세포, 정상 마우스 조혈 줄기 세포
본 실험은 정상 대조군, 폴리펩티드 대조군 및 실험 폴리펩티드군으로 나뉜다.
먼저 본 발명의 폴리펩티드와 5*103개 백혈병 종양 세포를 함께 38시간 동안 배양하고, 세포의 증식(CCK-8) 검출 및 세포 계수의 2가지 방법으로 세포의 증식 속도를 검출하여, 종양 세포에 대한 폴리펩티드의 억제 작용을 관찰한다.
둘째, 폴리펩티드와 세포를 24시간 함께 배양한 후 다시 수집 계수하고 약을 첨가하여 38시간 배양한 다음 세포의 증식(CCK-8) 속도를 검출한다.
셋째, 우리는 정상적인 마우스 조혈 세포를 이용하여 상기와 동일한 실험을 수행하여 정상 세포에 대한 폴리펩티드의 영향을 관찰하였다.
각 그룹에는 블랭크 1개(Control), 대조 펩티드 1개(C-p), 표적 펩티드 3개(P-t, 결과는 평균값을 취함)가 포함된다.
(1) K562 세포와 폴리펩티드를 38h/24+38h 공동 배양
제1차 실험
표 2.1.A K562 세포와 10uM 폴리펩티드 공동 배양 38시간(%)
표 2.1.B K562 세포와 10uM 폴리펩티드 공동 배양 24+38시간(%)
표 2.1.C K562 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 38시간(%)
*control과 비교해 p<0.01, **control과 비교해 p<0.01
제2차 실험
표 2.1.D K562 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 38시간(%)
표 2.1.E K562 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 24+38시간(%)
*control과 비교해 p<0.01, **control과 비교해 p<0.01
(2) Jurkat 세포와 폴리펩티드를 38h/24+38h 공동 배양
제1차 실험
표 2.2.A Jurkat 세포와 10uM 폴리펩티드 공동 배양 38시간(%)
표 3.2.B Jurkat 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 38시간(%)
표 2.2.C Jutkat 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 24+38시간(%)
*control과 비교해 p<0.01, **control과 비교해 p<0.01
제2차 실험
표 2.2.D Jurkat 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 38시간(%)
표 2.2.E Jurkat 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 24+38시간(%)
*control과 비교해 p<0.01, **control과 비교해 p<0.01
(3) Thp-1 세포와 폴리펩티드를 38h/24+38h 공동 배양
제1차 실험
표 2.3.A Thp-1 세포와 10uM 폴리펩티드 공동 배양 38시간(%)
표 2.3.B Thp-1 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 38시간(%)
표 2.3.C Thp-1 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 24+38시간(%)
제2차 실험
표 2.3.D Thp-1 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 38시간(%)
*control과 비교해 p<0.01, **control과 비교해 p<0.01
표 2.3.E Thp-1 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 24+38시간(%)
*control과 비교해 p<0.01, **control과 비교해 p<0.01
(4) Baf-3 세포와 폴리펩티드를 38h/24+38h 공동 배양
제1차 실험
표 2.4.A Baf-3 세포와 10uM 폴리펩티드 공동 배양 38시간(%)
표 2.4.B Baf-3 세포와 10uM 폴리펩티드 공동 배양 24+38시간(%)
제2차 실험
표 2.4.C Baf-3 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 38시간(%)
표 2.4.D Baf-3 세포와 15uM 폴리펩티드 공동 배양 24+38시간(%)
*control과 비교해 p<0.01, **control과 비교해 p<0.01
상기 세 가지 백혈병 세포로 대표되는 백혈병 아형은 백혈병 환자 수의 약 70% 이상을 차지하고 있다. 상기 실험을 통해 상기 폴리펩티드가 다양한 백혈병 세포의 증식을 현저히 억제할 수 있으며, 투여량 및 투여 횟수와 양의 상관관계가 있음을 알 수 있다. 동시에 정상적인 세포 증식에 대한 억제 작용은 없었다.
SEQUENCE
<110> Nanjing Fengrui Biotechnology Co., LTD
<120> POLYPEPTIDE HAVING EFFECT OF INHIBITING PROLIFERATION OF LEUKEMIA CELLS
<150> CN2019100362109
<151> 2019-03-05
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Lys Glu Ser Met Asp Ala Asn Lys Pro Thr Lys Asn Leu Pro Leu Lys
1 5 10 15
Lys Ile Pro Cys Lys Thr Ser Ala Pro Ser Gln Ser Phe Phe Ala Arg
20 25 30
Asp Asn Thr Ala Asn
35
Claims (10)
- 백혈병 세포 증식 억제 작용을 갖는 폴리펩티드에 있어서,
상기 폴리펩티드는 37개 아미노산으로 구성되며, 아미노산 서열은 하기 서열인 것을 특징으로 하는 백혈병 세포 증식 억제 작용을 갖는 폴리펩티드.
Lys-Glu-Ser-Met-Asp-Ala-Asn-Lys-Pro-Thr-Lys-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Lys-Ile-Pro-Cys-Lys-Thr-Ser-Ala-Pro-Ser-Gln-Ser-Phe-Phe-Ala-Arg-Asp-Asn-Thr-Ala-Asn - 제1항에 있어서,
상기 폴리펩티드의 N 말단은 미리스트산(myristic acid)과 연결되며, 미리스트산 변형을 통해 백혈병 세포로 진입하는 것을 특징으로 하는 백혈병 세포 증식 억제 작용을 갖는 폴리펩티드. - 폴리펩티드의 제조 방법에 있어서,
하기 단계,
1) 폴리펩티드의 합성
a. Fmoc-Asn(trt)wang Resin 수지를 반응 칼럼에 붓고 DCM을 첨가하여 함침시키며 흡입 건조하는 단계;
b. 탈보호 용액을 첨가하고, 질소 가스를 유통시켜 교반하며 흡입 건조하는 단계;
c. 유리 반응 칼럼에 DMF를 첨가하고, 질소 가스를 유통시켜 교반하며 흡입 건조하는 단계;
d. 아미노산 혼합 용액 또는 보호 아미노산 및 HBTU를 반응 칼럼에 첨가한 다음 NMM을 첨가하며 질소 가스를 유통시켜 교반하며 흡입 건조하는 단계;
e. DMF를 첨가하여 세척하고, 질소 가스를 유통시켜 교반하며 흡인 건조하여 입자상 물질을 수득하는 단계;
f. 입자상 물질을 취하여 시험관에 담고, Kaiser test 시약 A, B, C 액체를 각각 점적하며, 건식 가열기에 넣고 가열하고, 용액 색깔이 노랗고 입자상 물질이 무색투명하면 반응이 완료된 것이며, 상기 단계 b-e를 반복하여 마지막 아미노산 및 미리스트산이 연결될 때까지 다음 아미노산을 연결하는 단계;
g. 단계 f)를 완료한 반응 칼럼에 메탄올을 첨가하고 질소 가스로 교반하여 흡입 건조하고, 그 다음 DCM을 첨가하고, 질소 가스로 교반하여 흡입 건조하여 합성된 폴리펩티드 수지를 수득하고, 용기에 담고 진공 건조기 내에서 진공 건조하는 단계;
2) 폴리펩티드의 절단
폴리펩티드 수지에 폴리펩티드 절단액을 첨가하고 항온 환경 하에 거치하여 진탕하고; 그 다음 여과하며 여과액에 무수 에틸에테르를 첨가하고 교반한 후 백색 고체를 석출하고; 백색 고체에 무수 에틸에테르를 첨가하고 원심 분리하여 세척하며 진공 건조하여 백색 분말의 폴리펩티드의 조생성물을 수득하는 단계;
3) 폴리펩티드의 정제
폴리펩티드 조생성물을 취하고, 순수(pure water)와 ACN을 첨가하여 초음파 용해하고, 여과막으로 여과한 후 여과액을 취하고; 고성능 액체 크로마토그래피를 이용해 순방향 크로마토그래피 칼럼으로 구배 검출 분석을 수행하고; 크로마토그래피 칼럼을 제조하여 흡착 및 용출하여 분획을 수집하고; 수집된 분획을 검출하며, 순도가 통과되면 냉동 건조를 수행하여 정제된 폴리펩티드를 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 폴리펩티드의 제조 방법. - 제3항에 있어서,
상기 탈보호 용액은 20% 헥사히드로피리딘(hexahydropyridine)과 80% DMF로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법. - 삭제
- 제3항에 있어서,
상기 Kaiser test 시약의 A 액체는 80% 페놀과 20% 무수 에탄올이고, B 액체는 재증류된 피리딘이고, C 액체는 5g 닌히드린(ninhydrin)과 100ML 무수 에탄올인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법. - 제3항에 있어서,
상기 폴리펩티드 절단액의 구성 성분은 87.5% TFA, 5% 티오아니솔(thioanisole), 2.5% 페놀, 2.5% EDT 및 2.5% H2O인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법. - 제3항에 있어서,
상기 3) 폴리펩티드의 정제 단계는,
제조 조건이,
파장 길이: 220nm
유속: 1ml/min
제조 칼럼: 크로마토그래피 칼럼
유동상: A 액체: 0.1%Trifluoroacetic in 100% Acetonitrile
B 액체: 0.1%Trifluoroacetic in 100% Water
이고,
a) 비커에 폴리펩티드 조생성물을 계량하고, 순수와 ACN을 첨가하여 초음파로 용해시킨 후, 완전히 용해되면 0.45μ의 여과막으로 여과하는 단계;
b) 폴리펩티드 조생성물을 원심분리관에 취하여 넣고 순수로 초음파 용해하여 정화 여과(clarification filtration)하며, 10 내지 100% 구배 검출로 분석하는 단계;
c) 제조 조건 하에서 6분 동안 기기 균형을 맞춘 후 모든 펌프를 정지하며, a) 단계에서 여과된 여과액을 샘플 주입 밸브를 이용해 주입하고, 먼저 30 내지 90% 구배를 20분 동안 실행한 다음 100 내지 0% 구배를 실행하여 분획을 수집하는 단계;
d) 수집된 분획을 검출하고, 순도가 통과되면 냉동 건조를 수행하여 정제된 폴리펩티드를 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법. - 백혈병 세포의 증식을 억제하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩티드.
- 백혈병을 치료하는 약물을 제조하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩티드.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910036210.9A CN109651500B (zh) | 2019-01-15 | 2019-01-15 | 一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽 |
| CN201910036210.9 | 2019-01-15 | ||
| PCT/CN2019/077271 WO2020147176A1 (zh) | 2019-01-15 | 2019-03-07 | 一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210114930A KR20210114930A (ko) | 2021-09-24 |
| KR102666372B1 true KR102666372B1 (ko) | 2024-05-17 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008021290A2 (en) | 2006-08-09 | 2008-02-21 | Homestead Clinical Corporation | Organ-specific proteins and methods of their use |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008021290A2 (en) | 2006-08-09 | 2008-02-21 | Homestead Clinical Corporation | Organ-specific proteins and methods of their use |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PLOS ONE, 9(1), page e86195(2014.01.21.) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100590130C (zh) | 抗癌活性肽 | |
| CN112386678B (zh) | 多肽或其衍生物的应用 | |
| US11680106B2 (en) | Bispecific antigen-binding construct and preparation method and use thereof | |
| BR112020004567A2 (pt) | polipeptídeos para o tratamento de doenças | |
| WO2013026334A1 (zh) | 阻止细胞dna合成、抑制细胞增殖的多肽及其用途 | |
| CN110317245B (zh) | Lag-3蛋白亲和环肽及其应用 | |
| CN114835781B (zh) | Wtn多肽及其在检测、治疗癌症中的用途 | |
| CN103897036A (zh) | 一种pd-1蛋白胞外段亲和肽l8及其应用 | |
| CN105315350B (zh) | 抗肿瘤血管生成多肽mPEG-Mal-Cys-AS16 | |
| CN111793134A (zh) | 一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂 | |
| CN109111506A (zh) | 一种用于治疗骨质疏松的多肽及其制备方法和应用 | |
| KR102666372B1 (ko) | 백혈병 세포 증식 억제 작용을 갖는 폴리펩티드 | |
| JP7103702B2 (ja) | 白血病細胞の増殖を抑制する作用を有するポリペプチド | |
| Li et al. | Liraglutide promotes apoptosis of HepG2 cells by activating JNK signaling pathway. | |
| CN109627289B (zh) | 一种具有抗肿瘤活性的bh3多肽类似物 | |
| CN116715723A (zh) | 一种抑制血管生成的小分子短肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| Chen et al. | A Transformable Supramolecular Bispecific Cell Engager for Augmenting Natural Killer and T Cell‐Based Cancer Immunotherapy | |
| WO2021068879A1 (zh) | 一种靶向功能分子修饰的抗体复合物、组合物及其用途 | |
| US11339225B2 (en) | Bispecific antigen-binding construct and preparation method and use thereof | |
| CN112294947A (zh) | 一种多肽在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用 | |
| CN114702553B (zh) | 一种多肽mdosr3及其合成方法与应用 | |
| CN110642931B (zh) | 一种多肽及其应用 | |
| CN116444616A (zh) | 一种lag-3蛋白的亲和肽、偶联肽、药剂和应用 | |
| CN106519007B (zh) | 一种单链多肽及其在制备用于预防和治疗胃癌的药物中的应用 | |
| CN112979764B (zh) | 特异结合人cd47分子的多肽及其用途 |