CN109627289B - 一种具有抗肿瘤活性的bh3多肽类似物 - Google Patents

一种具有抗肿瘤活性的bh3多肽类似物 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的BH3多肽类似物。本发明基于生物信息学手段，通过计算机辅助设计方式获得与Bcl‑2蛋白亲和力更高的BH3类似物分子，然后通过分子生物学实验验证并筛选出亲和力较高的BH3多肽类似物，经体外细胞实验和体内动物实验表明，所述多肽类似物具有较BH3更高的肿瘤抑制活性，并且在长期毒性实验中展示了较低的毒副作用，为了进一步开发治疗性肿瘤药物提供了可能。

Description

一种具有抗肿瘤活性的BH3多肽类似物
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种具有抗肿瘤作用的BH3多肽类似物。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类健康，由于遗传因素、自身免疫失调、环境污染、不良生活习惯等因素的影响，恶性肿瘤的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，根据2018年2月，中国国家癌症中心发布的中国癌症统计报告显示，全国恶性肿瘤发病病例达到380.4万例，其中胃癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、食管癌等恶性肿瘤的发病率位于前列。尽管研究人员对于各种恶性肿瘤的发明机理、治疗技术进行了长期的研究，但是截至目前并未形成有效的治疗方法，恶性肿瘤的死亡率仍然居高不下。临床上常用的肿瘤治疗手段包括手术切除、化学药物治疗、放射治疗等等，其中手术治疗仅适用于肿瘤组织相对较大而集中的肿瘤，而且复发率较高，化学药物治疗和放射治疗特异性不强，往往会对正常细胞产生不利影响，从而导致乏力、恶心、呕吐、脱发、胃肠道反应、免疫系统破坏、心肺功能下降等副作用，严重影响患者生活治疗。因此，研制新型的具有高度特异性和低毒副作用的肿瘤治疗药物和手段成为抗肿瘤药物开发的重点，也成为了新型生物技术的重点投资领域。
多肽类物质是指少于100个氨基酸脱水所形成的化合物，一般从动植物和微生物体内得到或者由蛋白质经过酶解、人工合成等三种方式获得。多肽类物质广泛的存在生物体当中，也是组成蛋白质结构的片段，属于蛋白质发挥作用活性集团，也是机体进行代谢与调控的重要物质。该类物质的分子结构相对简单、种类繁多、容易得到改进，性质也相对稳定，并且毒副作用小，生物利用度高，目前已经成为肿瘤的抗肿瘤药物研发领域，研究人员已经开发出了多种具有抗肿瘤活性的多肽，Xie等(Xie X,ZhouW,HuY,et al.A dual-function epidermal growth factor receptor pathway substrate 8(Eps8)-derivedpeptide exhibits a potent cytotoxic T lymphocyte-activating effect and aspecific inhibitory activity[J].Cell Death Dis,2018,9(3): 379-395.)通过HLA结合预测算法搜索来自Eps8蛋白的新型人类白细胞抗原(HLA)-A2402限制性表位，获得了肽327(EFLDCFQKF)、534(KYAKSKYDF)和755(LFSLNKDEL)，可通过抑制Eps8/EGFR相互作用发挥抗肿瘤活性；Wang等(WangKR，ZhangBZ，ZhangW，etal.Antitumor effects，cellselectivity and structure-activity relationship ofanovelantimicrobialpeptidepolybia-MPI[J].Peptides，2008，29(6): 963-968.)从黄蜂毒液中提取得到一种阳离子抗肿瘤多肽MPI(其序列为IDWKKLLDAAKQIL)，可作用于前列腺癌细胞、膀胱癌细胞以及内皮细胞，但对正常纤维组织母细胞无明显作用；李懿等(专利申请号CN201510919825.8)获得了一种源自于肿瘤抗原SAGE1的短肽，该短肽与MHC分子形成的复合物，可用于肿瘤的治疗。
Bcl-2家族蛋白是线粒体途径细胞凋亡的一类关键调节蛋白，Bcl-2家族蛋白功能失调是肿瘤发生的一个重要因素，因此Bcl-2家族蛋白成为抗肿瘤药物开发的重要靶点之一。到目前为止，已经至少有25种 Bcl-2家族蛋白被发现，Bcl-2家族蛋白按功能可分为抗凋亡成员和促凋亡成员，其中抗凋亡成员主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1、Bfl1/A-1和Bcl-B，这些功能代表在结构上均含有4个短的保守的同源结合域(Bcl-2homologydomains，BH)，即BH1-BH4，其中BH3结构域是促凋亡蛋白发挥凋亡诱导活性的必需结构。
研究人员基于BH3结构域已经开发出了多种具有抗肿瘤活性的化合物，包括棉子酚(gossypol)、短肽类似物、奥巴克拉(obatoclax)等。目前，BH3类似物以小分子化合物居多，如专利WO2012012941A1、 WO2012013147A1、CN102731285A等公开了可与Bcl-2蛋白的竞争结合BH3类似物，但是这些小分子化合物往往仅从化学结构上近似于BH3结构域，难以从生理功能上进行模拟，进而导致抗肿瘤活性不佳，且常伴有难以接受的副作用。虽然也有人提出并共了多肽类BH3类似物，如CN106565835A公开了多肽类 BH3类似物，具体为SM-1、SM-2、SM-3、SM-4、SM-5、SM-6、SM-7等7条多肽，并验证了上述多肽与Bcl-2的亲和力、二级结构以及对某些肿瘤细胞的抑制活性，但是该研究仍处于实验室研究阶段，仅在细胞水平上验证了初步的抗肿瘤活性，没有进行动物水平的有效性和安全性实验，难以作为有效的抗肿瘤药物进行开发和利用，并且该专利也没有进一步对BH3类似物的结构特征、活性中心进行深入探讨和研究，难以给出继续进行BH3多肽类似物开发更多的启示。
本发明中，通过生物信息学方法和计算机辅助设计研究BH3结构域与Bcl-2的分子结构，设计并获得与Bcl-2结合活性强的多肽类似物，以便具有抗肿瘤获得的新型多肽分子，为抗肿瘤药物的研发提供新的研究方向。
发明内容
本发明的主要目的是基于BH3结构域分子结构，设计、筛选并获得可与Bcl-2蛋白进行特异性结合，并具有抗肿瘤活性的新型多肽分子，所述多肽分子与Bcl-2蛋白的结合能力更强，抗肿瘤效果也得到了提升。
本发明的详细技术方案如下：
通过生物信息学手段，基于计算机辅助设计获得了新型多肽分子LP01-LP10，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2-11所示，根据以往研究成果认为BH3分子中的“L-(X)3-GD”序列对其生物活性的发挥至关重要，但是我们的实验中发现L-(X)3-GD后的DV氨基酸对其活性也是似乎是相当重要的，实验结果表明，在 DV氨基酸突变的LP02、LP03、LP06、LP07等变体与Bcl-2的结合能力明显下降，而包含L-(X)3-GDDV 结构的LP01、LP04、LP05、LP08、LP10等变体与Bcl-2的结合能力得到不同程度的提高。
进一步，本发明提供了一种BH3多肽类似物在制备肿瘤治疗药物中的应用，在细胞学实验和动物实验中均证明，LP01、LP04、LP05、LP08、LP10等多肽分子能够抑制肿瘤细胞的生长，在体内动物实验中能够抑制肿瘤发生过程，并且在长期毒性实验中表明所述多肽分子未对实验动物的正常生理活动产生不利影响，提示上述多肽分子能够作为治疗肿瘤的药物。
进一步，所述肿瘤优选前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌或胰腺癌。
进一步，所述肿瘤优选肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌。
进一步，本发明提供了一种包括BH3多肽类似物的药物组合物。
进一步，所述药物组合物，被制备为注射剂或粉针剂。
进一步，所述药物组合物，还包括其他具有抗肿瘤活性的药物，所述药物可以为化学治疗药物或生物治疗药物。研究人员知晓，抗肿瘤药物的联合应用，通常会产生协同作用，从而抑制耐药性的产生，在抗肿瘤疗法中也十分常见，本发明所述的BH3多肽类似物可与紫杉醇、长春花碱、顺铂、丝裂霉素、环磷酰胺等化学治疗药物联用，更可与抗肿瘤抗体、蛋白联用，尤其是可以与PD-1抗体等免疫检查点抑制剂联合应用，综合利用体内抗肿瘤免疫机制杀死或抑制癌细胞的生长或增殖。
本发明所提供的新型BH3多肽类似物，相较于野生型BH3或其他类似物具有不同的氨基酸结构，并且具有L-(X)3-GDDV等活性中心，筛选获得的新型多肽分子可以以更强的亲和力与Bcl-2蛋白结合，从而介导更强的抗肿瘤活性，实验结果表明，所述新型多肽分子可以抑制A549、HepG-2、MCF-7、HT-29 等肿瘤细胞的增殖，并且在BALB/C小鼠模型中抑制肿瘤的形成过程，提高小鼠的存活率。此外，长期毒理实验结果表明，本发明中所述的新型多肽对实验动物的生理状态并不明显不利影响，尽管诸如钾离子浓度、AST等个别生化指标出现异常，但是这推测为正常的药理反应，总体而言，本发明中所述新型多肽分子在未来肿瘤治疗药物的应用中仍具有较好的发展前景。
附图说明
图1为BH3及其多肽类似物与Bcl-2结合情况Western blot图；
图2为Western blot灰度扫描分析图；
图3为BH3多肽类似物抑制肿瘤细胞增殖图，其中图3A为肺癌细胞A549抑制增殖图，图3B为肝癌细胞 HepG-2抑制增殖图，图3C为乳腺癌细胞MCF-7抑制增殖图，图3D为结肠癌细胞HT-29抑制增殖图；
图4为动物模型抑瘤实验，其中图4A为A549细胞荷瘤小鼠模型抑瘤实验肿瘤体积变化图，图4B为HT-29 细胞荷瘤小鼠模型抑瘤实验肿瘤体积变化图；
图5为A549细胞荷瘤小鼠生存率；
图6为HT-29细胞荷瘤小鼠生存率。
具体实施方式
实施例1BH3多肽类似物的设计
由于基因多态性和分散性的存在，BH3结构域的氨基酸序列并未完全确定，据研究表明L-(X)3-GD (X代表任意氨基酸)为其活性中心(Abdel Aouacheria,Valentine Rechde Laval,Christophe Combet,and J. Marie Hardwick，Evolution of Bcl-2 homology(BH)motifs–homology versus homoplasy[J]，Trends Cell Biol. 2013March；23(3):103–111.)，Young等(Young Jin,Long You,Hye Jeong Kim,and Han-Woong Lee，Telomerase Reverse Transcriptase Contains a BH3-Like Motif and Interacts withBCL-2 Family Members[J]，Mol. Cells 2018；41(7):684-694)在研究人端粒酶蛋白(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)时提出人BH3的氨基酸序列可能如SEQ ID NO.1所示。本发明采用生物信息学的方法，依照Bcl2-BH3蛋白结合模式，以Bcl2-BH3相互作用位点为基础，设计多肽分子，采用蛋白模拟软件Discovery Studio2.5/3.5对Bcl2-BH3结合活性进行模拟，获得亲和力较高的多肽序列，如表1中所述，SEQ ID NO.1为人BH3的氨基酸序列，SEQ ID NO.2-11为计算机设计所得到的多肽序列。
表1 BH3及其类似物氨基酸序列
Figure BDA0001955480670000041
Figure BDA0001955480670000051
实施例2BH3多肽类似物的合成
采用固相合成法制备BH3多肽类似物，具体方法如下：
(1)称取500mg(载样量为0.5mmol/g)Wang树脂置固相合成反应管中，加入10mL二氯甲烷浸泡溶胀 15min，用DMF冲洗3次，抽干待用。
(2)向树脂中加入含有156mg(0.5mmol)Fmoc-氨基酸、90mg(0.5mmol)HOBt、200mg(0.5mmol) DMAP、100μL(0.8mmol)DIC的5mL DMF溶液，置气浴恒温振荡器中，在常温下反应2.5h，反应后抽干反应液，用二氯甲烷、DMF洗涤Wang树脂各3次，取少量树脂，用乙醇茚三酮溶液检测显无色，加入5mL 20％哌啶/DMF溶液反应10min，脱去丙氨酸上N端的Fmoc保护，用二氯甲烷、DMF洗涤Wang 树脂各3次，取少量树脂，用乙醇茚三酮溶液检测显色。
(3)重复上述缩合方法，按照预定氨基酸序列将Fmoc-氨基酸(0.5mmol)、HOBt(0.5mmol)和DIC(100 μL)溶解于5mLNMP中，依次偶联，进而获得具有特定氨基酸序列的多肽粗品。
(4)所述粗品经RP-HPLC纯化(流动相A为0.2％TFA-乙腈、B为0.15％TFA-水，线性梯度洗脱(90％-20％ B、35-50min)，流速5.0-6.7mL/min)，获得纯化后的多肽序列。
(5)经HPLC-质谱鉴定各个多肽纯度均达98％以上。
实施例3BH3多肽类似物与Bcl-2蛋白亲和力鉴定
采用Western blot鉴定实施例2中获得的BH3多肽类似物与Bcl-2蛋白的亲和力，具体步骤如下：
1)连接生物素：在上述BH3多肽类似物的C端添加连接肽GGGS，在连接肽的左端(5’端)添加长链生物素。
2)蛋白孵育：取各BH3多肽类似物溶于PBS溶液中，使得其终浓度为25μg/ml，与浓度为50μg/ml的Bcl-2 蛋白在4℃下孵育3h。
3)蛋白电泳：取20-40μg蛋白样品，加等体积2×SDS样品缓冲液，95℃煮沸5min，于SDS-PAGE胶中电泳，电压80V，待样品进入分离胶后将电压调为120V。
4)电转移：电转液于4℃预冷，切好胶后将同样大小的甲醇预处理的PVDF膜以及滤纸浸于电转液中；PVDF 膜贴于胶后，两面覆盖滤纸，赶尽气泡，安装于电转槽中，于-20℃电转(90V，60min)。
5)抗原抗体反应：封闭液室温封闭1h；封闭后膜与相应抗体于室温孵育1-3h。
6)显示反应及检测：TBST洗3次，每次10min。ECL的A液和B液以1:1(V/V)混和，于暗室中滴加于膜表面，孵育1min后曝光。
7)采用IPP6.0软件对Western blot图片进行灰度扫描分析。
如图1所述，在Western blot实验中，不同的BH3多肽类似物显示出与Bcl-2蛋白不同的亲和力，其中LP01、LP04、LP05、LP08、LP10的条带亮度明显大于人BH3，而LP02、LP03、LP06、LP07、LP09 的条带亮度却明显小于人BH3，其中LP03条带更加不明显，说明上述多肽与Bcl-2的亲和力明显降低。为了各个进一步明确BH3多肽类似物与Bcl-2蛋白亲和力大小，对Western blot图片进行灰度扫描，并进行统计分析，如图2所示，LP08的亲和力最高，LP01、LP04、LP05、LP10的亲和力水平也明显高于天然 BH3。
从实验结果来看，仅保留L-(X)3-GD似乎难以保留、甚至提高BH3多肽类似物与Bcl-2的结合能力，以及抗肿瘤活性，本发明的研究结果显示含有L-(X)3-GDDV结构域，对于BH3多肽类似物抗肿瘤活性更为重要，在仅保留L-(X)3-GD的LP02、LP03、LP06、LP07并未展现出更高的亲和力，相反其结合力有所下降。此外，第17位的亮氨酸似乎对于抗肿瘤活性也较为重要，LP03中第17位的亮氨酸突变为蛋氨酸，其亲和力大为降低。
实施例4BH3多肽类似物抑制肿瘤细胞增殖
选取与Bcl-2亲和力较高的LP01、LP04、LP05、LP08、LP10多肽进行细胞学实验，以便筛选并获得抗癌活性高的新型多肽类物质，通过MTT比色法分析各多肽组分对肺癌细胞A549、肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7、和结肠癌细胞HT-29的生长抑制作用。具体操作步骤如下：
4.1BH3多肽类似物抑制肺癌细胞A549增殖
1)从液氮中取出冻存的A549细胞，迅速放入37℃温水中，期间不断轻轻摇动，使得细胞液迅速溶解。
2)1500rpm离心5min，收集细胞，弃去上清，加入1mL含10％FBS的DMEM培养基，重悬细胞，将细胞转移至25mL培养瓶中，再加入4mL含10％FBS的DMEM培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
3)取对数生长期的细胞，经0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，血球平板计数后，调整细胞悬液的浓度至5×104个/mL，加至96孔板中，每孔100μL,于37℃、 5％CO2培养箱中培养。
4)培养24h后，吸出废旧培养液，加入终体积为200μL的含有浓度为2.5mg/ml的不同的BH3多肽类似物的新鲜基础培养基，以人BH3为阳性对照，PBS为阴性对照，于37℃、5％CO2培养箱中孵育48h。
5)孵育后吸出药液，用PBS洗涤3次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鲜基础培养基180μL，于37℃、 5％CO2培养箱中继续培养4h；
6)弃去含有MTT的培养液，加入150μLDMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率：
癌细胞生长抑制率＝((对照组OD-空白组OD)-(给药组OD-空白组OD))/((对照组OD-空白组OD))×100％ 4.2BH3多肽类似物抑制肝癌细胞HepG-2增殖
1)从液氮中取出冻存的HepG-2细胞，迅速放入37℃温水中，期间不断轻轻摇动，使得细胞液迅速溶解。
2)1500rpm离心5min，收集细胞，弃去上清，加入1mL含10％FBS的RPMI1640培养基，重悬细胞，将细胞转移至25mL培养瓶中，再加入4mL含10％FBS的DMEM培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
3)取对数生长期的细胞，经0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，血球平板计数后，调整细胞悬液的浓度至5×104个/mL，加至96孔板中，每孔100μL,于37℃、 5％CO2培养箱中培养。
4)培养24h后，吸出废旧培养液，加入终体积为200μL的含有浓度为2.5mg/ml的不同的BH3多肽类似物的新鲜基础培养基，以人BH3为阳性对照，PBS为阴性对照，于37℃、5％CO2培养箱中孵育48h。
5)孵育后吸出药液，用PBS洗涤3次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鲜基础培养基180μL，于37℃、 5％CO2培养箱中继续培养4h；
6)弃去含有MTT的培养液，加入150μLDMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率：
癌细胞生长抑制率＝((对照组OD-空白组OD)-(给药组OD-空白组OD))/((对照组OD-空白组OD))×100％
4.3BH3多肽类似物抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖
1)从液氮中取出冻存的MCF-7细胞，迅速放入37℃温水中，期间不断轻轻摇动，使得细胞液迅速溶解。
2)1500rpm离心5min，收集细胞，弃去上清，加入1mL含10％FBS的MEM培养基，重悬细胞，将细胞转移至25mL培养瓶中，再加入4mL含10％FBS的DMEM培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
3)取对数生长期的细胞，经0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，血球平板计数后，调整细胞悬液的浓度至5×104个/mL，加至96孔板中，每孔100μL,于37℃、 5％CO2培养箱中培养。
4)培养24h后，吸出废旧培养液，加入终体积为200μL的含有浓度为2.5mg/ml的不同的BH3多肽类似物的新鲜基础培养基，以人BH3为阳性对照，PBS为阴性对照，于37℃、5％CO2培养箱中孵育48h。
5)孵育后吸出药液，用PBS洗涤3次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鲜基础培养基180μL，于37℃、 5％CO2培养箱中继续培养4h；
6)弃去含有MTT的培养液，加入150μLDMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率：
癌细胞生长抑制率＝((对照组OD-空白组OD)-(给药组OD-空白组OD))/((对照组OD-空白组OD))×100％
4.4BH3多肽类似物抑制结肠癌细胞HT-29增殖
1)从液氮中取出冻存的HT-29细胞，迅速放入37℃温水中，期间不断轻轻摇动，使得细胞液迅速溶解。
2)1500rpm离心5min，收集细胞，弃去上清，加入1mL含10％FBS的RPMI1640培养基，重悬细胞，将细胞转移至25mL培养瓶中，再加入4mL含10％FBS的DMEM培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
3)取对数生长期的细胞，经0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，血球平板计数后，调整细胞悬液的浓度至5×104个/mL，加至96孔板中，每孔100μL,于37℃、 5％CO2培养箱中培养。
4)培养24h后，吸出废旧培养液，加入终体积为200μL的含有浓度为2.5mg/ml的不同的BH3多肽类似物的新鲜基础培养基，以人BH3为阳性对照，PBS为阴性对照，于37℃、5％CO2培养箱中孵育48h。
5)孵育后吸出药液，用PBS洗涤3次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鲜基础培养基180μL，于37℃、 5％CO2培养箱中继续培养4h；
6)弃去含有MTT的培养液，加入150μLDMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率：
癌细胞生长抑制率＝((对照组OD-空白组OD)-(给药组OD-空白组OD))/((对照组OD-空白组OD))×100％
4.5肿瘤细胞增殖抑制分析
对于上述细胞增殖的数据，进行统计分析，如图3所示，BH3及其多肽类似物均可抑制肿瘤细胞的生长，但是对于不同种类的细胞呈现出不同的抑制活性，具体为：对于肺癌细胞A549，如图3A所示，待测多肽类似物的抑制活性均高于BH3，其中LP08和LP04的抑制能力最强，其次依次为LP10、LP01和LP05；对于肝癌细胞HepG-2，如图3B所示，待测多肽类似物的抑制活性却与BH3类似，并未显示出明显差异，仅其中 LP08抑制活性略高于野生型BH3；对于乳腺癌细胞MCF-7，如图3C所示，BH3及其多肽类似物均显示出了抑制活性，但是LP01、LP04、LP10的抑制活性似乎低于野生型BH3，LP08、LP05的抑制活性高于野生型 BH3；对于结肠癌细胞HT-29，如图3D所示，待测多肽类似物的抑制活性均高于BH3，其中LP04的抑制能力最强，其次依次为LP08、LP10、LP01和LP05。
实施例5BH3类似物对裸鼠肿瘤模型的作用
本实施例以Balb/c小鼠移植瘤模型(负载肺癌细胞A549、结肠癌细胞HT-29)为生物体材料进行的相关药剂实验，包括有抑瘤率实验、小鼠生存期实验等检测指标，从而反映BH3多肽类似物在抗肿瘤形成方面的治疗效果，具体的实验步骤和结果如下：
5.1动物模型制备
1)取5-6周龄BALB/C小鼠，SPF级，适应饲养一周。
2)收集对数生长期A549细胞、HT-29细胞(培养方法同4.1、4.4节)，在显微镜下计数，调整细胞浓度为5×106个/mL。
3)小鼠分别皮下注射A549细胞、HT-29细胞，1×106/只，正常饲养一周。
4)每天观察其生长情况。
5)第7天时，瘤块己经鼓起约5mm大小，表明肿瘤小鼠模型建立成功。
5.2动物模型抑瘤实验
5.2.1A549细胞荷瘤小鼠抑瘤实验
1)A549细胞荷瘤小鼠模型构建成功后，按体重随机分为6组，每组20只，雌雄对半分，具体6个组别为：空白对照组(生理盐水NS)、BH3组(5mg/kg/d)、LP01组(5mg/kg/d)、LP04组(5mg/kg/d)、LP05 组(5mg/kg/d)、LP08组(5mg/kg/d)、LP10组(5mg/kg/d)。
2)采用尾静脉给药，每3天给药一次。
3)每次给药前测定小鼠体重及肿瘤大小，连续给药3周。
4)给药结束后颈椎脱位法处死小鼠，剥取肿瘤，测量大小。
肿瘤体积计算公式:体积＝(a2xb)/2，a为肿瘤最宽部分长度，b为肿瘤最长部分长度。
如图4A所示，在A549细胞荷瘤小鼠模型中，BH3及其多肽类似物实验组的小鼠肿瘤体积，相对于生理盐水对照组明显减小，且生长缓慢，并且在治疗后期LP04、LP08、LP10组出现了小幅度的肿瘤体积下降情况，说明上述多肽类似物均可以有效抑制肿瘤在动物体内的生长过程。
5.2.2HT-29细胞荷瘤小鼠抑瘤实验
1)HT-29细胞荷瘤小鼠模型构建成功后，按体重随机分为6组，每组20只，雌雄对半分，具体6个组别为：空白对照组(生理盐水NS)、BH3组(5mg/kg/d)、LP01组(5mg/kg/d)、LP04组(5mg/kg/d)、LP05 组(5mg/kg/d)、LP08组(5mg/kg/d)、LP10组(5mg/kg/d)。
2)采用尾静脉给药，每3天给药一次。
3)每次给药前测定小鼠体重及肿瘤大小，连续给药3周。
4)给药结束后颈椎脱位法处死小鼠，剥取肿瘤，测量大小。
肿瘤体积计算公式:体积＝(a2xb)/2，a为肿瘤最宽部分长度，b为肿瘤最长部分长度。
如图4B所示，在HT-29细胞荷瘤小鼠模型中，BH3及其多肽类似物实验组的小鼠肿瘤体积，相对于生理盐水对照组明显减小，且生长缓慢，并且在治疗后期LP01、LP10组出现了小幅度的肿瘤体积下降情况，与BH3相比，LP04、LP08、LP10组肿瘤体积明显减小，说明上述多肽类似物均可以有效抑制肿瘤在动物体内的生长过程，并且某些类似物的抗肿瘤效果好于野生型BH3。
5.3小鼠生存期实验
5.3.1A549细胞荷瘤小鼠生存期实验
1)A549细胞荷瘤小鼠模型构建成功后，按体重随机分为6组，每组20只，雌雄对半分，具体6个组别为：空白对照组(生理盐水NS)、BH3组(5mg/kg/d)、LP01组(5mg/kg/d)、LP04组(5mg/kg/d)、LP05 组(5mg/kg/d)、LP08组(5mg/kg/d)、LP10组(5mg/kg/d)。
2)采用尾静脉给药，每3天给药一次，连续给药3周。
3)记录各组小鼠的死亡情况，共记录90天。
如图5所示，BH3及其多肽类似物可明显延长A549细胞荷瘤小鼠的生存期，其中LP01组的治疗效果与BH3类似，LP04组、LP05组、LP08组、LP10组小鼠的生存期优于BH3组，其中LP08组的治疗效果最为明显。
5.3.2HT-29细胞荷瘤小鼠生存期实验
1)HT-29细胞肿瘤小鼠模型构建成功后，按体重随机分为6组，每组20只，雌雄对半分，具体6个组别为：空白对照组(生理盐水NS)、BH3组(5mg/kg/d)、LP01组(5mg/kg/d)、LP04组(5mg/kg/d)、LP05 组(5mg/kg/d)、LP08组(5mg/kg/d)、LP10组(5mg/kg/d)。
2)采用尾静脉给药，每3天给药一次，连续给药3周。
3)每记录各组小鼠的死亡情况，共记录90天。
如图6所示，BH3及其多肽类似物可明显延长HT-29细胞荷瘤小鼠的生存期，其中LP04组的治疗效果与BH3类似，LP01组、LP05组、LP08组、LP10组小鼠的生存期优于BH3组，其中LP08、LP10组的治疗效果更为明显。
实施例6长期毒性实验
为了检测BH3多肽类似物LP01、LP04、LP05、LP08、LP10的生物安全性，本发明中以SD大鼠样品作为实验对象，进行药物的长期毒性实验，具体的步骤和结果如下：
1)将SD大鼠按体重随机分为6组，每组30只，雌雄对半分，具体6个组别为：阴性对照组(生理盐水 NS)、BH3组(5mg/kg/d)、LP01组(5mg/kg/d)、LP04组(5mg/kg/d)、LP05组(5mg/kg/d)、LP08组(5mg/kg/d)、 LP10组(5mg/kg/d)。
2)尾静脉注射给药，每周一次，给药期限为8周。
3)给药结束之后，恢复4周。
4)每4周测量大鼠体重变化情况。
5)恢复期结束后，处死大鼠，取大鼠血液进行血液学检测和血生化检测。
6)血液学检测指标包括：白细胞数量、红细胞数量、血小板数量、血红蛋白含量、凝血时间等。
7)血生化检测指标包括：谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，碱性磷酸酶(ALP)，血糖(GLU)，总胆固醇(CHO)，甘油三酯(TG)，钾离子浓度，钠离子浓度等。
8)处死大鼠后，称量大鼠体重并记录，然后取大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、卵巢等主要脏器，称重并记录。
9)计算心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、卵巢等脏器的脏器系数。
表2BH3及其多肽类似物对SD大鼠体重影响
组别 给药前 第4周 第8周 第12周
NS 162.30±6.75 237.88±15.32 278.55±23.32 320.15±21.36
BH3 158.56±7.85 219.35±21.34 264.32±19.89 325.32±18.85
LP01 167.29±9.15 222.28±19.84 285.62±22.57 332.17±22.63
LP04 161.77±8.21 245.12±25.63 282.18±26.78 315.33±24.53
LP05 165.62±7.17 232.38±14.63 271.92±24.51 327.24±25.37
LP08 159.82±8.55 225.41±17.75 269.77±21.30 318.79±21.53
LP10 164.96±7.37 231.23±20.36 273.53±24.52 326.39±20.09
表2中，大鼠体重单位为克，采用平均值±标准差形式表示。
如表2所示，与生理盐水对照组相比，虽然LP04组和LP08组平均体重略轻与生理盐水对照组，但是BH3及其多肽类似物对SD大鼠体重并无明显影响，未显示出统计学差异(P>0.05)。
表3BH3及其多肽类似物对SD大鼠血液学指标影响
组别 白细胞(×10<sup>9</sup>/L) 红细胞(×10<sup>9</sup>/L) 血小板(×10<sup>9</sup>/L) 血红蛋白(g/L) 凝血时间(s)
NS 10.23±2.18 6.56±0.58 289.45±47.58 142.57±23.96 81.7±15.2
BH3 9.58±1.87 6.26±0.43 275.35±51.96 153.27±19.03 78.5±12.3
LP01 9.63±1.79 6.23±0.63 282.32±43.58 155.87±22.19 77.6±16.2
LP04 10.09±1.94 7.15±0.54 275.66±40.25 138.39±25.85 75.3±17.0
LP05 9.66±2.31 6.38±0.44 292.03±43.21 147.80±24.10 80.2±14.8
LP08 9.85±1.77 6.35±0.39 280.30±56.88 150.78±17.73 83.5±15.3
LP10 9.92±2.03 6.77±0.66 274.11±58.20 145.45±21.29 75.2±12.7
表3中数值采用平均值±标准差形式表示。
如表3所示，与生理盐水对照组相比，BH3及其多肽类似物对SD大鼠血液中的白细胞数量、红细胞数量、血小板数量、血红蛋白含量和凝血时间等血液学指标并无明显影响(P>0.05)。
表4BH3及其多肽类似物对SD大鼠血生化指标影响
组别 ALT(U/L) AST(U/L) ALP(U/L) GLU(mmol/L)
NS 45.32±6.77 123.32±11.47 150.17±50.81 14.62±2.97
BH3 41.56±5.15 114.64±17.36 165.34±64.35 13.68±2.34
LP01 43.26±7.28 145.54±12.32* 172.45±62.85 14.14±1.89
LP04 52.4±7.53 132.16±16.57 142.37±72.34 14.58±2.03
LP05 40.23±6.35 118.86±13.47 151.33±67.82 13.57±2.77
LP08 50.33±5.87 126.84±13.87 157.67±48.89 14.03±1.74
LP10 44.93±7.05 130.70±15.82 163.27±55.27 14.47±2.13
组别 CHO(mmol/L) TG(mmol/L) K(mmol/L) Na(mmol/L)
NS 0.95±0.25 1.57±0.34 4.13±0.83 123.12±16.75
BH3 0.89±0.31 1.43±0.27 4.25±0.97 112.78±15.54
LP01 0.92±0.24 1.65±0.42 5.54±1.12* 118.94±17.60
LP04 0.87±0.30 1.61±0.37 4.62±1.23 133.56±21.37
LP05 0.98±0.35 1.52±0.38 3.86±1.07 127.12±16.58
LP08 0.93±0.26 1.63±0.39 4.46±0.93 130.42±22.18
LP10 0.96±0.27 1.48±0.40 4.78±1.24 125.48±19.51
表4中数值采用平均值±标准差形式表示，*表示P<0.05。
如表4所示，与生理盐水对照组相比，除在个别实验组中的钾离子浓度、AST等个别指标存在显著差异(P<0.05)之外，BH3及其多肽类似物对SD大鼠大多血生化指标并无明显影响(P>0.05)。血液学指标是衡量药物毒性反应的重要指标之一，本发明中各个治疗组并未见没有的血液学指标变化，说明BH3及其多肽类似物的生物安全性较高。
表5SD大鼠各主要脏器系数
Figure BDA0001955480670000121
Figure BDA0001955480670000131
脏器系数是毒理实验中衡量药物对机体影响的重要指标之一，通常来讲，脏器系数增大，表明脏器可能存在充血、水肿、增生等症状，而脏器系数减小，表明脏器可能萎缩或呈现退行性变化，因此脏器系数的异常，表明毒性反应严重。本发明中如表5所示，不同治疗组的脏器系数与生理盐水对照组相比，并无统计学差异(P>0.05)，说明BH3及其多肽类似物对SD大鼠脏器不明显影响，在长期用药情况下大鼠表现为正常生理体征。
序列表
<110> 苏州立豪生物科技有限公司
<120> 一种具有抗肿瘤活性的BH3多肽类似物
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Ala Trp Arg Leu Leu Leu Asn Leu Val Gly Asp Asp Val Met Gln Cys
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
Ala Trp Gly Leu Leu Leu Met Lys Val Gly Asp Met Val Cys Trp Pro
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
Ser Trp Trp Leu Leu Leu Trp Leu Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys
1 5 10 15
Met Leu
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
Ala Trp Thr Trp Leu Leu Asp Asp Gly Gly Asp Asp Val Thr Val Tyr
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
Ser Trp Ser Asn Leu Leu Ala Asn Thr Gly Asp Asp Val Phe Asp Val
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
Gly Trp Val Leu Leu Leu Arg Met Val Gly Asp Tyr Val Asp Trp Phe
1 5 10 15
Leu Lys
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
His Trp Gly Leu Leu Leu Asn Asp Cys Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ala
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
Ala Trp Tyr Pro Leu Leu Met Leu Lys Gly Asp Asp Val Phe Val His
1 5 10 15
Leu Trp
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
Pro Trp Met Gly Leu Leu Cys Gly Asp Gly Asp Asp Val Cys Asp His
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 11
Ala Trp Gly Leu Leu Leu Phe Pro Cys Gly Asp Asp Val Asn Met His
1 5 10 15
Leu Leu

Claims (7)

1.一种具有抗肿瘤活性的BH3多肽类似物，其特征在于，所述多肽类似物能够与Bcl-2蛋白进行结合，所述多肽类似物的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1的基础上进行点突变获得的，所述多肽类似物的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.11所示。
2.如权利要求1所述BH3多肽类似物在制备肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌或直肠癌。
3.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的BH3多肽类似物。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，还包括有药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物被制备为注射剂或粉针剂。
6.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，还包括其他具有抗肿瘤活性的化学治疗药物或生物治疗药物。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述生物治疗药物包括PD-1抗体。
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