WO2012012941A1 - Bcl-2家族蛋白抑制剂，其环糊精包合物、配结物及其在制备bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用 - Google Patents

Bcl-2家族蛋白抑制剂，其环糊精包合物、配结物及其在制备bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用 Download PDF

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宋婷
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Definitions

  • Bcl-2 family protein inhibitors cyclodextrin inclusion complexes, complexes thereof and their use in the preparation of Bcl-2 family protein inhibitors
  • the invention relates to a new class of Bcl-2 Family protein inhibitors and cyclodextrin inclusion complexes or complexes of such compounds prepared using nanotechnology; and involving these compounds in vivo, in vitro, mimicking BH3-only proteins, competitive binding and antagonism Bcl-2 and Mcl-1 proteins, which induce apoptosis and serve as anticancer compounds.
  • Bcl-2 Protein is the most important molecular target for antagonizing and reversing the immortality of malignant tumors. Therefore, specific antagonism of Bcl-2 The protein drug will specifically induce tumor cell apoptosis, and finally achieve the goal of high selectivity, safety, high efficiency, and no toxic side effects against cancer.
  • Highly specific BH3 analogues (BH3) in Bcl-2 inhibitors Mimetics has the most significant anti-tumor effect, with the best pharmacodynamic activity and the lowest toxic side effects.
  • BH3 analogues (BH3) in Bcl-2 inhibitors Mimetics has the most significant anti-tumor effect, with the best pharmacodynamic activity and the lowest toxic side effects.
  • a broad spectrum of anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins including Bcl-2 and The ability of the Mcl-1 protein to achieve a single dose of efficacy and low drug resistance.
  • anti-tumor drugs targeting Bcl-2 have not been marketed, and only 19 preclinical Bcl-2 Among the inhibitors, there are three optimal effects in clinical stages I, II, and III. They are: ABT-737, developed by Gemin X, developed by Abbott Laboratories, Illinois, USA. Obatoclax (GX15-070), and AT-101 from Ascenta, USA. They are all BH3 analogs, and the competitive binding constant with Bcl-2 protein is reached. nM grade, much higher than the other 15 similar molecules.
  • the present invention aims to obtain a more targeted Bcl-2 family of proteins (including Bcl-2 and Mcl-1) which are BH3 analogs.
  • a compound of a protein inhibitor on the basis of this, combined with modern nanotechnology to improve the water solubility of the compound by means of cyclodextrin inclusion or binding, to improve the bioavailability, in order to fully develop such compounds as a target Uses for sexual anti-tumor preparations.
  • the Bcl-2 family protein inhibitor of the present invention has the following molecular structural formula:
  • R 5 (CH 2 ) n Y or (CH 2 ) n Ar - ( o, m, p ) Y
  • R 5 (CH 2 ) n Y or (CH 2 ) n Ar - ( o, m, p ) Y
  • R 7 (CH 2 ) n X ;
  • III series Bcl-2 family protein inhibitors whose molecular structure is:
  • R 7 (CH 2 ) n X
  • R 8 (CH 2 ) n Y or (CH 2 ) n Ar - ( o, m, p ) Y
  • R 9 ZR 8 , tetrahydrothiopyran - 4-oxy, thiophenemethoxy, thiophenemethylamino, pyridylmethylamino or thiomorpholinyl
  • R 7 (CH 2 ) n X
  • R 8 (CH 2 ) n Y or (CH 2 ) n Ar - ( o, m, p ) Y
  • R 9 H
  • X H, CN, NO 2 , NH 2 , COOH , CHO , OH or SO 3 H ;
  • Y CN, NO 2 , Ph , CF 3 , OCH 3 , SCH 3 , NH 2 , NHCH 3 , N(CH 3 ) 2 , C 2 -C 8 linear alkyl, C 2 -C 8 branched alkyl , C 1 -C 8 linear haloalkane, C 1 -C 8 branched haloalkane, C 1 -C 8 linear amine, C 1 -C 8 branched chain amine, C 1 -C 8 linear alcohol, C 1 -C 8- branched alcohol, C 1 -C 8 linear ester, C 1 -C 8 branched ester, C 1 -C 8 linear carboxylic acid or C 1 -C 8 branched carboxylic acid;
  • Z O, S, N, carbonyl, ester, amide or sulfonamide
  • the first synthetic route is based on 8-oxo-8 H -indole[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile and reacts with nucleophilic alcohols, phenols, esters and amides at a temperature of 20 to 100.
  • reaction time 0.5 ⁇ 24 hours, after the reaction is completed, the solvent is distilled off, and column chromatography is carried out to obtain 3-substituted, 4-substituted, 6-substituted or 3,6-substituted disubstituted 8-oxo-8 H - fluorene [ 1,2-b] pyrrole-9-carbonitrile, the nitrile group is further hydrolyzed, esterified, and amidated to obtain a series I Bcl-2 family protein inhibitor, the reaction formula is as follows:
  • the second synthetic route uses hydrazine as a raw material and refluxed with liquid bromine for 2 hours to obtain bromo hydrazine.
  • the bromo hydrazine is reacted with an alcohol, a phenol, an ester or an amide to obtain a corresponding substituted hydrazine.
  • the substituted hydrazine and acetonitrile are reacted under the weak acid catalysis of silica gel to obtain 3-(2-oxo-2-hydrogen-indole)-malononitrile
  • the catalyst is catalyzed by K 2 CO 3 , and the acetonitrile is refluxed for 0.5 to 6 hours.
  • the corresponding product can be obtained by filtration or direct column chromatography; then the first series of synthetic routes are used for hydrolysis, esterification and amidation conditions to obtain I series Bcl-2 family protein inhibitors.
  • the reaction formula is as follows :
  • the third synthetic route is based on a class I compound, using acetonitrile as a solvent, adding 5 times the molar amount of the corresponding primary amine, stirring at a constant temperature of 0.5-8 Hours. After the reaction is completed, the solvent is distilled off, and column chromatography is carried out to obtain a series II Bcl-2 family protein inhibitor.
  • the fourth synthetic route uses hydrazine as a raw material and refluxed with liquid bromine for 2 hours to obtain bromo hydrazine.
  • the bromo hydrazine is reacted with an alcohol, a phenol, an ester or an amide to obtain a corresponding substituted hydrazine.
  • the substituted hydrazine is further reacted with R 7 CH 2 R 8 , catalyzed by piperidine, and ethanol is used as a solvent, and reacted at 60 ° C for 1 to 20 hours.
  • the solvent was distilled off, and column chromatography was carried out to obtain a III series Bcl-2 family protein inhibitor.
  • the reaction formula is as follows:
  • the cyclodextrin inclusion complex of the above indenocyclic heterocyclic compound of the present invention is prepared by the following method:
  • the cyclodextrin is ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, 2- Hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin or methyl- ⁇ -cyclodextrin;
  • the cyclodextrin complex of the above-described indenocyclic heterocyclic compound of the present invention is prepared by the following method:
  • the cyclodextrin is ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin or methyl- ⁇ -cyclodextrin;
  • the anthracene heterocyclic compound to be compounded is mixed with N,N'-carbonyldiimidazole in a molar ratio of 1: 1 to 2 and dissolved.
  • concentration of the hydrazine heterocyclic compound to be conjugated in the DMSO solution is 0.2 to 0.5 mmol / mL, and the mixture is stirred at room temperature for 30 to 60 minutes;
  • step 3 Add the cyclodextrin and the 0.1 to 0.3 mmol/mL weighed in step 1 to the above DMSO solution. Triethanolamine, reacting at room temperature for 18 to 24 hours;
  • the purification can be carried out using an ion exchange column, using the conditions Diaion TM HP-20 ion-exchange resin as an adsorbent, resolved using a mixed solvent of methanol and water.
  • the proportion of methanol in the mixed solvent was gradually increased, and the leaching process was examined by thin layer chromatography.
  • the proportion of methanol in the eluent reaches 40 to 55%, the part of the compound is rinsed. After the methanol in the obtained eluent was spin-dried, the remaining solution was freeze-dried to obtain a compound.
  • the invention adopts phase solubility method, fluorescence spectroscopy, circular dichroism, infrared spectroscopy, thermogravimetric analysis, scanning electron microscopy and 1 H nuclear magnetic resonance, mass spectrometry and X single crystal diffraction to obtain the obtained fluorene heterocyclic compound.
  • the cyclodextrin inclusion complex or the complex was characterized, and the solubility of the heterocyclic compound before and after inclusion or binding and the inhibition of Mcl-1 and Bcl-2 were compared.
  • the results showed that:
  • the cyclodextrin inclusion or formulation treatment greatly enhances the solubility of the hydrazine heterocyclic compound in water and, to some extent, the ability to inhibit Bcl-2 and Mcl-1 proteins.
  • the preparation can also be used to prepare BH3 analog Bcl-2 family protein inhibitors, and is further used to prepare highly targeted antitumor drugs.
  • Another object of the present invention is to disclose the above-mentioned Bcl-2 The use of family protein inhibitors, cyclodextrin inclusion complexes of such compounds, and complexes in the preparation of BH3 analog Bcl-2 family protein inhibitors.
  • the family protein inhibitor or the corresponding anti-tumor drug may be a simple preparation of the compound, a cyclodextrin inclusion compound or a formulation of the compound, or an effective amount of the Bcl-2 family protein inhibitor A composition formed by mixing a compound or a cyclodextrin inclusion compound thereof, and an appropriate amount of a pharmaceutically acceptable adjuvant. It can be formulated into a desired dosage form according to the formulation method of the prior art according to the needs of medicinal use.
  • Figure 1 is a graph showing the results of the interaction between compounds at the cellular level of Bcl-2/Bax (different concentrations);
  • Figure 2 is a graph showing the results of the interaction between compounds at the cellular level of Bcl-2/Bax (different time of action);
  • Figure 3 is a result of a compound-dependent BAX/BAK cytotoxicity experiment ( Gossypol Non-specific control);
  • Figure 4 is an electropherogram of Western blotting detection of compound inhibition of Mcl-1;
  • Figure 5 is an electrophoresis pattern of Western blotting detection of compounds inhibiting Bcl-2;
  • Figure 6 is a comparison of the inhibitory effects of anthraquinone heterocyclic compounds and their cyclodextrin inclusion complexes and complexes on Mcl-1 and Bcl-2. Western imprint detection electropherogram;
  • Figure 7 is a graph showing the inhibitory effects of comparative compounds and inclusion complexes on Mcl-1 and Bcl-2 in tumor model animals.
  • Part I Bcl-2 family protein inhibitors Compound preparation and characterization examples thereof;
  • Bcl-2 family protein inhibitors Preparation of compound cyclodextrin inclusion complexes, complexes and their characterization examples;
  • This part includes the preparation of the indole heterocyclic compound cyclodextrin inclusion compound, the preparation of the complex and the characterization of the product.
  • the characterization methods include ultraviolet spectrum, fluorescence spectrum, circular dichroism spectrum, infrared spectrum, nuclear magnetic, Thermal weight loss analysis and SEM. Unless otherwise specified, the reference sources for the instruments and their detection methods involved in this section are as follows:
  • Phase solubility map according to the literature J. Agric. Food Chem., 2007, 55 (9), The method of 3535-3539 plots the phase solubility map.
  • Circular dichroism J-810 (Japan); Test method reference J. Phys. Chem. B, 2006, 110 (13), 7044-7048.
  • Mass Spectrometry GC-Tof MS (UK); Test Methods Reference J. Org. Chem. 2000, 65, 9013-9021.
  • UV absorption test results show that with ⁇ - Gradual increase in cyclodextrin concentration The UV absorption value of the compound gradually increases, and its solubility gradually increases, indicating the formation of the clathrate.
  • Fluorescence spectroscopy results show that the concentration of the fixed test compound is constant, and the fluorescence value follows ⁇ - The concentration of cyclodextrin increases with increasing gradual increase. The fluorescence emission wavelength is constant, but the intensity is increased. After the compound enters the cyclodextrin cavity, the change of the cavity environment protects the compound molecules in the excited state from contact with the bulky molecules and the quencher. Changes in fluorescence spectra indicate compounds and The ⁇ -cyclodextrin formed a clathrate.
  • thermogravimetric analysis showed that ⁇ -cyclodextrin showed an inflection point at 298 °C and began to degrade.
  • the inclusion compound is at 271 °C That is, an inflection point occurs and degradation begins, unlike ⁇ -cyclodextrin, indicating the formation of the inclusion complex.
  • the content of cyclodextrin is 75.9%, so its inclusion mode is 1:1.
  • Adoption and embodiment 12 The same method, using other compounds of different types of cyclodextrin package series; the same product was characterized by UV, fluorescence spectroscopy, circular dichroism spectroscopy, infrared spectroscopy, nuclear magnetic, thermogravimetric analysis and SEM. The formation of the inclusion complex was tested and the change in solubility of the compound and its inclusion complex before and after inclusion was tested by phase solubility test. The specific results are shown in Table 1. From the table below 1 It can be seen from the test results that the solubility of different types of cyclodextrin-containing indenocyclic heterocyclic compounds in water is much higher than that of the compounds themselves.
  • Example 13 Preparation and characterization of ⁇ -cyclodextrin with 3-hexyloxy-8-oxo-8 H -indolo[1,2-b]pyrrole-9-carboxylic acid complex:
  • the resulting precipitate was purified by ion exchange column, and then the resulting product was washed with a mixed solvent of methanol and water, the solution was lyophilized to give 3-hexyl-8-oxo 0.281g of -8 H - acenaphtho [1,2-b] pyrrole -9- Formic acid/ ⁇ -cyclodextrin formulation.
  • the yield is 35%.
  • ⁇ -cyclodextrin has a series of peaks between 12 ° and 15 ⁇ 23 °
  • the compound 3-hexyloxy-8-oxo-8 H - ⁇ [1,2- b] Pyrrole-9-formic acid has peaks only at 11 ° and 7 ° .
  • the spike at the 11 ° disappears, a new spike at 6 ° , and a series of spikes at 14-18 ° and 20-25 ° .
  • Relative to the compound and the cyclodextrin new peaks appeared in the complex, indicating the formation of the complex.
  • the solubility of the compound 3-hexyloxy-8-oxo-8 H -indolo[1,2-b]pyrrole-9-carboxylic acid in ⁇ -cyclodextrin significantly increased in water.
  • the solubility of 3-hexyloxy-8-oxo-8 H -indolo[1,2-b]pyrrole-9-carboxylic acid in water increased from 0.69 ⁇ M to 12.5 ⁇ M, an increase of 18.1 times.
  • Example 13 In the same manner as in Example 13, different types of cyclodextrin were used to match other compounds in the same series; the product was also characterized by 1 H nuclear magnetic resonance, mass spectrometry and X single crystal diffraction, which proved the formation of the complex, and The phase solubility test was used to detect changes in the solubility of the compound and its complex before and after the compounding. The specific results are shown in Table 2.
  • Part III Physicochemical activity detection of Bcl-2 family protein inhibitor compounds, cyclodextrin inclusion complexes and complexes
  • Example 14 Detection of BH3 similarity of compounds by fluorescence polarization analysis
  • the similarity of BH3 of the other 9 compounds was tested according to the same test method as above, and they were combined with Bcl-2 and Mcl-1.
  • the binding constant of the protein (abbreviated as the binding constant in Table 3) is also in the nM grade, and the specific results are shown in Table 3 below.
  • Example 15 Detection of BH3 similarity of compounds by fluorescence polarization energy transfer (FRET) in living cells
  • the transfected cells were seeded in 6-well plates, 40 ⁇ M of compound was added, and the drug was administered for 3, 6 and 24 hours (Fig. 2), and the plate was read for fluorescence.
  • the 475 nm emission wavelength was recorded in a cell group transfected only with the Bcl-2-CFP plasmid at an excitation wavelength of 433 nm.
  • the 527 nm emission wavelength was recorded in a cell group transfected only with the Bax-YFP plasmid at an excitation wavelength of 505 nm.
  • the cell experiments of co-transfected Bcl-2-CFP and Bax-YFP plasmids recorded emission wavelengths at 527 nm and 475 nm with an excitation wavelength of 433 nm.
  • the 527 nm emission fluorescence is FRET compared to the 475 nm emission fluorescence, and the FRET value of the individually transfected control group is set to 1.0.
  • the FRET value increased to 2.0 due to the interaction of Bcl-2 protein and Bax protein, and the interference of the two protein interactions increased with the increase of drug concentration and time, and FRET decreased.
  • Cell viability was determined by the MTT method. The results of the test are shown in Figure 2 and Figure 3. The compound interferes with the interaction between Bcl-2/Bax at 2 ⁇ M for 3 hours, showing a concentration-dependent trend.
  • concentration and time indicate the time at which the test compound interferes with the interaction between Bcl-2/Bax at this concentration.
  • Example 16 Detection of BH3 similarity of compounds by Bax protein co-localization with mitochondria
  • a two-channel scan is performed, one channel scans the green fluorescence of Bax-YFP, and the other channel scans the red fluorescence of the mitochondrial CMXRos probe, and the two channel images superimpose each other to show co-localization. Under the action of this compound, the superimposed picture shows orange fluorescence, indicating Bax shift to mitochondria.
  • Example 17 Compound-dependent BAX/BAK cytotoxicity assay to verify the properties of BH3 analogs
  • Calcium phosphate coprecipitation was transfected with 3 ⁇ g BAX/BAK interference plasmid into MCF-7 cells. After transfection for 24 hours, cells were harvested. Western blot was used to detect the expression of BAX and BAK protein after RNA interference, and the same cells were transfected without plasmid transfection. For the control group. The transfected cells were seeded in a 96-well plate (1 ⁇ 10 5 cells/well), and the control experiments of the untransfected plasmid cell group were performed in parallel, and the compound to be detected 3-(4-isopropyl group was added according to the experimentally designed concentration gradient.
  • Phenoxy)-8-oxo-8H-indeno[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile cell viability was measured by MTT after 48 hours of action. The results are shown in Figure 3, and Gossypol is similar to non-specific BH3. Parallel treatment with the compound of the present invention, it can be seen that 3-(4-isopropylphenoxy)-8-oxo-8H-indolo[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile has an absolute dependence on BAX/BAK Cytotoxicity.
  • Example 18 Western blot detection of compound versus Mcl-1 and Bcl-2 Inhibition
  • the cells were lysed with 1 ⁇ 10 6 /50 ⁇ l of cell lysate (62.5 mM Tris-HCL pH 6.8; 2% SDS; 10% glycine; 50 mM DTT; 0.01% bromophenol blue), centrifuged, and the protein supernatant was taken.
  • the sample was boiled at 100 °C for 5 minutes, 12% SDS-PAGE electrophoresis and membrane transfer, the corresponding antibody was used to detect the target protein, and the horseradish peroxidase-labeled secondary antibody was combined with ECL chromogenic assay to detect the expression level of the target protein in the cells.
  • Figure 4 and Figure 5 show the compound to be tested, 3-(4-isopropylphenoxy)-8-oxo-8H-indolo[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile, respectively, for Mcl-1 and Inhibition of Bcl-2. It can be seen from the figure that the protein bands of Bcl-2 and Mcl-1 become lighter as the time of the test compound acts on the tumor cells, indicating that the compound has the effect of inhibiting these two proteins. The protein bands in the Western image were semi-quantitatively analyzed using the KODAK Gel Logic 1500 Imaging System software. After normalization, the concentration of the protein bands is shown in Figures 9 and 10.
  • Example 19 Western Imprint Detection Comparison Bcl-2 Inhibition of Mcl-1 and Bcl-2 by Family Protein Inhibitor Compounds and Their Cyclodextrin Inclusion Complexes and Complexes
  • the cells were seeded in a 6-well culture plate (2 ⁇ 10 5 /well), and the compound group was added to the compound DMSO dissolved in DMSO 3-(4-isopropylphenoxy)-8-oxo-8 H - hydrazine and [1 , 2-b] pyrrole-9-nitrile to a final concentration of 10 ⁇ M, and the inclusion complex was added with a ⁇ -cyclodextrin inclusion compound equivalent to 10 ⁇ M compound dissolved in an aqueous solution. After 24 hours of drug treatment, the cells were washed 3 times with PBS.
  • the cells were lysed with 1 ⁇ 10 6 /50 ⁇ L of cell lysate (62.5 mM Tris-HCL pH 6.8; 2% SDS; 10% glycine; 50 mM DTT; 0.01% bromophenol blue), centrifuged, and the protein supernatant was taken.
  • the sample was boiled at 100 °C for 5 minutes, 12% SDS-PAGE electrophoresis and transferred to the membrane, and the corresponding antibody was used to detect the target protein, horseradish peroxidase-labeled secondary antibody and ECL chromogenic assay to detect the expression level of the target protein in the cells.
  • Protein band analysis was the same as in Example 18.
  • Figure 6 shows: ⁇ -cyclodextrin inclusion complex of 3-(4-isopropylphenoxy)-8-oxo-8 H -indolo[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile to Mcl
  • the inhibition of -1 and Bcl-2 proteins was significantly higher than that of the compound itself. That is, the ⁇ -cyclodextrin inclusion complex significantly enhanced the ability to inhibit Bcl-2 and Mcl-1 proteins.
  • ⁇ -cyclodextrin, 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, and methyl- ⁇ - were also detected by the same method as described above.
  • Cyclodextrin and hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin-encapsulated 3-(4-isopropylphenoxy)-8-oxo-8H-indeno[1,2-b]pyrrole-9- Nitriles, as well as the following compounds, have higher intracellular inhibition of Bcl-2 and Mcl-1 proteins than the compounds themselves. These compounds include:
  • Example 20 Western blot detection of contrast compounds and inclusion complexes in tumor model animals versus Mcl-1 and Inhibition of Bcl-2
  • mice under subcutaneous tumor-bearing without any treatment mice under subcutaneous tumor-bearing without any treatment
  • Control group 1 mice were injected intraperitoneally with DMSO solution every other day for 10 days after subcutaneous tumor implantation;
  • Control group 2 The mice were intraperitoneally injected with cyclodextrin solution every other day for 10 days after subcutaneous tumor implantation;
  • mice were intraperitoneally injected with DMSO solution of 0.03 mg/kg body weight every other day. 10 days;
  • mice After subcutaneous tumor implantation, the mice were intraperitoneally injected with 0.3 mg/kg body weight of DMSO solution every other day for a total of 10 Day
  • mice After subcutaneous tumor implantation, the mice were intraperitoneally injected with an aqueous solution of a clathrate equivalent to 0.3 mg/kg body weight every other day. 10 days;
  • mice After subcutaneous tumor-bearing, the mice were intragastrically administered with an aqueous solution of the inclusion compound of 0.3 mg/kg body weight every other day, for a total of 10 Day.
  • the tumor long diameter (a) and the short diameter (b) perpendicular to it were measured twice a week during the experiment, and the tumor volume was calculated according to the formula 1/2ab 2 . Observe the survival time of the animals. On the 40th day of the experiment, the tumor inhibition rate was calculated from the tumor volume. The results show:
  • the inhibition rate of experimental group 2 (compound DMSO solution injection group) was 24.3%;
  • the tumor inhibition rate was 50.1%.
  • the average survival time of the control group was 28 ⁇ 2.1 days, and the average life span of the compound group was 30 ⁇ 3.1.
  • the mean survival time of the inclusion compound injection group was 49 ⁇ 3.2 days, and the average survival time of the inclusion compound oral group was 46 ⁇ 1.4 days.
  • Statistical analysis showed P ⁇ 0.05.
  • 3-(4-isopropylphenoxy)-8-oxo-8H-indole [1,2-b] pyrrole-9-carbonitrile has a tumor inhibition rate of about 65%; under the same conditions as experimental group 3, the inhibition rate of the compound containing hydroxypropyl ⁇ -cyclodextrin is about 70%. ;
  • 3-(p-isopropylphenylthio)-8-oxo-8H-indole [1,2-b] pyrrole-9-carbonitrile has a tumor inhibition rate of about 30%; under the same conditions as experimental group 3, the inhibition rate of the compound encapsulated by ⁇ -cyclodextrin is about 42%;
  • the inhibition rate of 3-hexyloxy-8-oxo-8H-indeno[1,2-b]pyrrole-9-carboxamide was 30%.
  • the inhibition rate of methyl- ⁇ -cyclodextrin is about 38%.

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Abstract

本发明涉及一类新的Bcl-2家族蛋白抑制剂、其环糊精包合物和环糊精配结物以及它们在制备BH3类似物Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用。该苊并杂环类化合物是在8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的3，4，6位引入各种氧代物、硫代物、羰基、酯基、酰基化合物，或进一步将9-腈取代为酸、酯、胺、酰胺基化合物，以及苊醌与亚甲基衍生物反应所得到的化合物。它模拟BH3-only蛋白，在体外和细胞内竞争性结合和拮抗Bcl-2和Mcl-1蛋白，从而诱导细胞凋亡作用，其环糊精包合物和配结物能提高其作用，它们均可被用于制备抗癌化合物。

Description

Bcl-2家族蛋白抑制剂，其环糊精包合物、配结物及其在制备 Bcl-2 家族蛋白抑制剂中的应用
技术领域
本发明涉及一类新的 Bcl-2 家族蛋白抑制剂以及利用纳米技术制备的这类化合物的环糊精包合物或者配结物；并涉及这些化合物在体内、体外的模拟 BH3-only 蛋白，竞争性结合和拮抗 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白，从而 诱导细胞凋亡作用和作为抗癌化合物的应用。
背景技术
分子靶向抗肿瘤药物正在成为继细胞毒剂类抗肿瘤药物之后，新药研发的热点和市场化的新生代产品。 Bcl-2 蛋白，是拮抗和逆转恶性肿瘤永生性的最重要的分子靶点。所以，特异性拮抗 Bcl-2 蛋白的药物，将通过专一诱导肿瘤细胞凋亡，最终实现高选择性、安全、高效、无毒副作用抗癌的目标。在 Bcl-2 抑制剂中，以高特异的 BH3 类似物（ BH3 mimetics ）的抗肿瘤效果最为显著，药效学活性最好，毒副作用最低。此外，还必须具备广谱拮抗 Bcl-2 家族蛋白的抗凋亡成员（包括 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白）的能力，才能实现单剂有效和低耐药。
但到目前为止，以 Bcl-2 为靶点的抗肿瘤药物尚无上市产品，仅有的 19 个临床前 Bcl-2 抑制剂中，有三个效果最优的分别处于临床 I, II, III 期。分别是：由美国伊利诺州阿伯特实验室研发的 ABT-737 ， Gemin X 公司研发的 Obatoclax （ GX15-070 ），和美国 Ascenta 公司的 AT-101 。它们都是 BH3 类似物，与 Bcl-2 蛋白的竞争结合常数达到 nM 级，远远高于其它 15 个同类分子。但是它们都存在不足： Gossypol ， Obatoclax 的 BH3 类似程度不足，不是绝对的 BH3 类似物，也就是具有不依赖 BAX/BAK 的细胞毒性，说明存在其他的作用靶点，因此具有毒副作用。 ABT-737 虽然是特异性最高的 BH3 类似物，但是不能拮抗和结合 Mcl-1 蛋白，不是广谱的 Bcl-2 家族蛋白抑制剂，因而严重限制了其适用的病种。
本发明人既往研究的成果中公开了一系列 8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈的苊并杂环类化合物，并且这类化合物具有通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长的活性（中国专利，授权公告号 CN1304370C ）。然而，作为潜在的以凋亡为基础的抗肿瘤药物，其开发同样面对此类药物开发的难点：凋亡信号通路复杂及潜在的强烈的细胞毒性及其所必然导致的用药的盲目性，而这是导致该类药物的开发失败的重要原因。因此，研究中需要突出强调药物作用的靶向性。
另一方面，药物的理化性状是影响药效发挥的重要原因，也可能影响药物开发过程中对药效的准确评估。本发明的前期研究中就注意到此类问题。既往研究中的这些化合物的水溶性较差，严重的限制其研究和应用。
发明内容
本发明旨在获得靶向性更强的可作为 BH3 类似物的 Bcl-2 家族蛋白（包括 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白）抑制剂的化合物；在此基础上，结合现代纳米技术通过环糊精包合或者配结的手段，改善化合物的水溶性，提高生物利用度，以充分地开发此类化合物在作为靶向性抗肿瘤制剂方面的用途。
本发明所述的 Bcl-2 家族蛋白抑制剂具有如下的分子结构通式：
1 、 I 系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂，其分子结构通式为：
Figure PCTCN2010075521-appb-I000001
其中：
（ I ） R1= 吡啶甲氨基或 XR5 ， R2=H ， R3 =H ， R4=CN 、 COOH 、 COOR6 或 CONHR6 ；
（ II ） R1=H ， R2=XR5 ， R3=H ， R4=CN 、 COOH 、 COOR6 或 CONHR6 ；
（ III ） R1=H ， R2=H ， R3=XR5 ， R4=CN ；
（ IV ） R1=XR5 ， R2=H ， R3=XR5 ， R4=CN ；
（ V ） R1=H ， R2=H ， R3=H ， R4= CONHR6 ；
其中：当 X = O 、羰基、酯基、酰胺或磺酰胺时， R5= (CH2)nY 或 (CH2)nAr - （ o,m,p ） Y, Y = C2-C8 直链烷基、 C2-C8 支链烷基、 C1-C8 直链卤代烷、 C1-C8 支链卤代烷、 C1-C8 直链胺、 C1-C8 支链胺、 C1-C8 直链醇、 C1-C8 支链醇、 C1-C8 直链 酯 、 C1-C8 支链 酯、 C1-C8 直链 羧酸 或 C1-C8 支链 羧酸， n ＝ 0-4 ；
当 X = O 、羰基、酯基、酰胺或磺酰胺时， R6 = C1-C6 直链烷基、 C1-C6 支链烷基、 C1-C6 直链卤代烷、 C1-C6 支链卤代烷、 C1-C6 直链胺、 C1-C6 支链胺、 C1-C6 直链醇、 C1-C6 支链醇、 C1-C6 直链 酯 、 C1-C6 支链 酯、 C1-C6 直链 羧酸 、 C1-C6 支链 羧酸或 (CH2)n Ar - （ o,m,p ） Z ； Z = CH3 、 C2H5 、 NO2 、 Ph 、 F 、 Cl 、 Br 、 CF3 、 OCH3 、 SCH3 、 NH2 或 N(CH3)2 ， n ＝ 0 ～ 4 。
当 X=S 时， R5= (CH2)nY 或 (CH2)nAr - （ o,m,p ） Y, Y = C7-C8 直链烷基、 C7-C8 支链烷基、 C7-C8 直链卤代烷、 C7-C8 支链卤代烷、 C7-C8 直链胺、 C7-C8 支链胺、 C7-C8 直链醇、 C7-C8 支链醇、 C7-C8 直链 酯 、 C7-C8 支链 酯、 C1-C8 直链 羧酸 或 C1-C8 支链 羧酸， n ＝ 0-4 ；
当 X=S 时， R6 = C1-C6 直链烷基、 C1-C6 支链烷基、 C1-C6 直链卤代烷、 C1-C6 支链卤代烷、 C1-C6 直链胺、 C1-C6 支链胺、 C1-C6 直链醇、 C1-C6 支链醇、 C1-C6 直链 酯 、 C1-C6 支链 酯、 C1-C6 直链 羧酸 、 C1-C6 支链 羧酸或 (CH2)n Ar - （ o,m,p ） Z ； Z = CH3 、 C2H5 、 NO2 、 Ph 、 F 、 Cl 、 Br 、 CF3 、 OCH3 、 SCH3 、 NH2 或 N(CH3)2 ， n ＝ 0 ～ 4 。
2 、 II 系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂，其分子结构通式为：
Figure PCTCN2010075521-appb-I000002
其中 ： R7= (CH2)n X ； X=H 、 CN 、 NO2 、 NH2 、 COOH 、 CHO 、 OH 或 SO3H ， n=0-4 ；
R8= (CH2)nY 或 (CH2)nAr - （ o,m,p ） Y ； Y =NO2 、 Ph 、 CF3 、 OCH3 、 SCH3 、 NH2 、 NHCH3 、 N(CH3)2 、 C1-C8 直链烷基、 C1-C8 支链烷基、 C1-C8 直链卤代烷、 C1-C8 支链卤代烷、 C1-C8 直链胺、 C1-C8 支链胺、 C1-C8 直链醇、 C1-C8 支链醇、 C1-C8 直链 酯 、 C1-C8 支链 酯、 C1-C8 直链 羧酸 或 C1-C8 支链 羧酸 ， n ＝ 0-4 ；
R9=ZR8 、 H 、 四氢吡喃 -4- 氧基、四氢噻喃 -4- 氧基、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基、吡啶甲氨基或硫吗啉基 ， Z= O 、 S 、 N 、羰基、酯基、酰胺或磺酰胺；
3 、 III 系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂，其分子结构通式为：
Figure PCTCN2010075521-appb-I000003
（ I ） R7= (CH2)n X, R8= (CH2)nY 或 (CH2)nAr - （ o,m,p ） Y ， R9=ZR8 、 四氢噻喃 -4- 氧基、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基、吡啶甲氨基或硫吗啉基， R10=H ； n=0-4
（ II ） R7= (CH2)n X, R8= (CH2)nY 或 (CH2)nAr - （ o,m,p ） Y ， R9= H ， R10= ZR8 、 四氢噻喃 -4- 氧基、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基、吡啶甲氨基或硫吗啉基； n=0-4 ；
（ III ） R9= H ， R10=H ， R7 与 R8 不同时为 CN 。
其中： X=H 、 CN 、 NO2 、 NH2 、 COOH 、 CHO 、 OH 或 SO3H ；
Y= CN 、 NO2 、 Ph 、 CF3 、 OCH3 、 SCH3 、 NH2 、 NHCH3 、 N(CH3)2 、 C2-C8 直链烷基、 C2-C8 支链烷基、 C1-C8 直链卤代烷、 C1-C8 支链卤代烷、 C1-C8 直链胺、 C1-C8 支链胺、 C1-C8 直链醇、 C1-C8 支链醇、 C1-C8 直链 酯 、 C1-C8 支链 酯、 C1-C8 直链 羧酸 或 C1-C8 支链 羧酸 ；
Z=O 、 S 、 N 、羰基、酯基、酰胺或磺酰胺；
本发明的化合物合成主要分为四种途径。
第一种合成途径是以 8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈为原料，与亲核试剂醇，酚，酯，酰胺发生反应，温度为 20 ～ 100 ℃ ，反应时间 0.5 ～ 24 小时，反应完成后蒸出溶剂，柱层析得到 3- 取代， 4- 取代、 6- 取代或者 3,6- 位双取代的 8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈，腈基再经过水解，酯化，酰胺化得到 I 系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂 ，反应式如下：
Figure PCTCN2010075521-appb-I000004
第二种合成途径是以苊醌为原料，加入液溴回流 2 小时，得到溴代苊醌。先用溴代苊醌与醇，酚，酯，酰胺反应得到相应的取代苊醌。取代苊醌与乙腈在硅胶弱酸性催化的条件下反应得到 3- （ 2- 氧代 -2 氢 - 苊） - 丙二腈之后，在 K2CO3 催化，乙腈回流 0.5 ～ 6h 冷却后减压蒸除部分溶剂后，过滤或直接柱层析即可制得相应的产品；之后采用第一条合成路径的水解，酯化，酰胺化条件得到 I 系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂， 反应式如下：
Figure PCTCN2010075521-appb-I000005
Figure PCTCN2010075521-appb-I000006
Figure PCTCN2010075521-appb-I000007
第三种合成途径是以 I 类化合物为原料，以乙腈为溶剂，加入 5 倍摩尔量相应的伯胺，常温搅拌 0.5-8 小时。反应完成后，蒸出溶剂，柱层析即可得 II 系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂 。
Figure PCTCN2010075521-appb-I000008
反应式如下：
第四种合成途径是以苊醌为原料，加入液溴回流 2 小时，得到溴代苊醌。先用溴代苊醌与醇，酚，酯，酰胺反应得到相应的取代苊醌。取代苊醌再与 R7CH2R8 反应，加入哌啶催化，乙醇作溶剂， 60 ℃ 反应 1-20 小时。反应完成后，蒸出溶剂，柱层析分离得到 III 系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂 。反应式如下：
Figure PCTCN2010075521-appb-I000009
Figure PCTCN2010075521-appb-I000010
对通过上述方法获得的化合物，我们通过多种手段检测了它们的 BH3 类似程度，以及它们对 Mcl-1 和 Bcl-2 的抑制作用。结果表明，本发明的上述苊并杂环类化合物具有极高的 BH3 类似程度，可以有效抑制 Mcl-1 和 Bcl-2 蛋白。基于此，该类化合物可用于制备 BH3 类似物 Bcl-2 家族蛋白抑制剂，并进一步用于制备靶向性高的抗肿瘤药物。
研究中还发现，水溶性较差是本发明的上述苊并杂环类化合物的突出问题，严重限制其研究及应用。参考现代药物制剂技术（ 环糊精化学 -- 制备与应用 . 化学工业出版社， 2009 ； β- 环糊精包合技术及应用．医学创新研究， 2006 ， 3 （ 3 ）： 31-33 ； Chem. Pharm. Bull ， 2006 ， 54 (1) 26-32 ），本发明的另一项内容在于利用环糊精包合或配结此类化合物，形成包合物或配结物，从而改善其水溶性，提高生物利用度。
本发明所述的上述 苊并杂环类化合物的环糊精包合物是由下述方法制备：
① 称取环糊精，加入水中，加热搅拌使其成为饱和溶液，所述的环糊精为 β- 环糊精、 γ- 环糊精、 2- 羟丙基 -β- 环糊精或甲基 -β- 环糊精；
② 称取待包合的苊并杂环类化合物，该化合物与环糊精的摩尔比为 1 : 3 ～ 10 ；
③ 将待包合的苊并杂环类化合物以 5 ～ 10 mg/mL 的浓度溶于丙酮，将所得溶液以线状逐滴加入到环糊精的水溶液中， 40 ～ 65 ℃ ，加热搅拌，有沉淀析出；
④ 将上述溶液过滤，用蒸馏水洗涤滤饼，再用丙酮洗去游离状态的化合物，真空干燥，得到权利要求 1 的苊并杂环类化合物的环糊精包合物。
本发明所述的上述 苊并杂环类化合物的环糊精配结物是由下述方法制备：
① 称取干燥的环糊精及待配结的苊并杂环类化合物，环糊精与该化合物的摩尔比为 1 : 1.5 ～ 3 ；所述的环糊精为 β- 环糊精、 γ- 环糊精、 2- 羟丙基 -β- 环糊精或甲基 -β- 环糊精；
② 将待配结的苊并杂环类化合物与 N,N'- 羰基二咪唑以 1 : 1 ～ 2 的摩尔比混合后溶解到 DMSO 中，使待配结的苊并杂环类化合物在 DMSO 溶液中的浓度为 0.2 ～ 0.5mmol /mL ，常温搅拌 30 ～ 60 分钟；
③ 往上述 DMSO 溶液中 加入步骤 ①所称取的 环糊精及 0.1 ～ 0.3 mmol/mL 的三乙醇胺，常温反应 18 ～ 24 小时；
④ 往步骤 ③的反应体系中 加入 0.50 ～ 1.0mg/mL 的丙酮，减压析出沉淀；
⑤ 过滤，沉淀经纯化得权利要求 1 的苊并杂环类化合物的环糊精配结物。
该纯化可以采用离子交换柱进行，条件为采用 DiaionTM HP-20 离子交换树脂做吸附剂，解析采用甲醇与水的混合溶剂。逐渐增大混合溶剂中甲醇的比例，淋洗过程用薄层色谱检测。当洗脱剂中甲醇所占比例达到 40 ～ 55% 时配结物部分被淋洗得到。将所得淋洗液中的甲醇减压旋干之后，剩余溶液冷冻干燥得到配结物。
本发明采用相溶解度法、荧光光谱法、圆二色谱法、红外光谱法、热重分析、扫描电镜和 1 H 核磁、质谱以及 X 单晶衍射等表征手段对所得到的 苊并杂环类化合物的环糊精包合物或配结物进行表征，并对比检测了包合或配结前后苊并杂环类化合物的溶解度以及对 Mcl-1 和 Bcl-2 的抑制作用的对比，结果表明：环糊精包合或配结的处理方法大大提高了苊并杂环类化合物在水中的溶解度，并且在一定程度上提高了抑制 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白的能力。该制剂也可用于制备 BH3 类似物类 Bcl-2 家族蛋白抑制剂，并进一步用于制备靶向性高的抗肿瘤药物。
因此，本发明的另一目的是公开上文所述的 Bcl-2 家族蛋白抑制剂、该类化合物的环糊精包合物以及配结物在制备 BH3 类似物 Bcl-2 家族蛋白抑制剂中的应用。
上述的 Bcl-2 家族蛋白抑制剂或相应的抗肿瘤药物可以是化合物的单质制剂、化合物的环糊精包合物或配结物制剂，或者是有效量的所述 Bcl-2 家族蛋白抑制剂 化合物或其环糊精包合物、配结物与适量的药用辅剂混合形成的组合物。并可以根据药用需要，根据现有技术中的制剂方法将其制成需要的剂型。
附图说明
附图 1 是化合物在细胞水平上干扰 Bcl-2/Bax 之间相互作用结果示图（不同浓度）；
附图 2 是化合物在细胞水平上干扰 Bcl-2/Bax 之间相互作用结果示图（不同作用时间）；
附图 3 是化合物依赖 BAX/BAK 的细胞毒性实验结果（ Gossypol 为非特异性对照）；
附图 4 是化合物对 Mcl-1 抑制作用 Western 印记检测电泳图；
附图 5 是化合物对 Bcl-2 抑制作用 Western 印记检测电泳图；
附图 6 是比较苊并杂环类化合物及其环糊精包合物和配结物对 Mcl-1 和 Bcl-2 的抑制作用的 Western 印记检测电泳图；
附图 7 是对比化合物和包合物在肿瘤模型动物体内对 Mcl-1 和 Bcl-2 的抑制作用的 Western 印记检测电泳图，其中 ： 1 空白对照组； 2 对照组 = 1 \* GB3 ① ； 3 对照组 = 2 \* GB3 ② ， 4 实验组 = 1 \* GB3 ① ； 5 实验组 = 2 \* GB3 ② ； 6 实验组 = 3 \* GB3 ③ ； 7 实验组 = 4 \* GB3 ④ 。
具体实施方式
下面以具体实施例的方式对本发明的内容做进一步的说明。
第一部分： Bcl-2 家族蛋白抑制剂 化合物制备及其表征实施例；
实施例 1: 3- ( 4- 异丙基苯氧基 ) -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈的合成及表征
50 毫升乙腈中加入 1 克 8- 氧 -8H 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈， 0.54 克 对异丙基苯酚，回流 3 小时，蒸出溶剂，层析柱分离得产品 3- ( 4- 异丙基苯氧基 ) -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈，收率 30% 。
结构表征： M.p. 272-274℃；1H NMR (400M, CDCl3) ： δ 8.92 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.25 (d, J=8.8 Hz, 2H), 8.44 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.86 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.38 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.14 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.04 (d, J=8.8 Hz, 1H), 3.01 (m, 1H), 1.32 (d, J=8.0 Hz, 6H) ； TOF MS EI+(m/z): C24H16N2O2 ， 计算值 ： 364.1212 ， 实测值 ： 364.1215 。
实施例 2 ： 3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈（ A ）和 4- （ 4- 特戊基苯氧基）苯氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈（ B ）的合成及表征
称取 1.04g 对特戊基苯氧基苊醌， 0.3g 丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅胶柱中，快速淋洗，过柱完毕之后旋干得红色固体。称重 1.10g ，产率 93% 。取 0.69g 3- 苯氧基 - （ 2- 氧代 -2 氢 - 苊） - 丙二腈，加入 0.08g K2CO3 ， 20ml 乙腈加热回流 3 小时，反应完毕之后旋干反应液。层析柱分离（ CH2Cl2 ：石油醚 =1 ： 1 ）得到橙红色固体，核磁检验同分异构体比例 1 ： 0.4 。利用制备液相分离的到两种同分异构体。
第一组分 A: M.p. 268-270℃；1H NMR (400M, CDCl3): δ 8.93 (d, J=7.6 Hz, 1H), 8.61 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.42 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.87 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.48 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.16 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.04 (d, J=8.0 Hz, 1H), 1.71 (d, J=8.0 Hz, 2H), 1.35 (s, 6H), 0.75 (t, J=8.0 Hz, 3H) ； TOF MS EI+(m/z): C26H20N2O2 ， 计算值 ： 392.1525 ， 实测值 ： 392.1529 。
第二组分 B: M.p. 285-287℃；1H NMR (400M, CDCl3): δ 8.86 (d, J=7.6 Hz, 1H), 8.62 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.45 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.92 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.13 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.02 (d, J=8.0 Hz, 1H), 1.70 (d, J=8.0 Hz, 2H), 1.34 (s, 6H), 0.75 (t, J=8.0 Hz, 3H) ； TOF MS EI+(m/z): C26H20N2O2 ， 计算值 ： 392.1525 ， 实测值 ： 392.1531 。
实施例 3 ： 6- （ 4- 丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈的合成及表征
50mL 乙腈中加入 1g 8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈， 2.64g 对丙基苯硫酚，常温反应 3 小时 ，蒸出溶剂，层析柱分离得化合物 6- （ 4- 丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈，收率 32% 。
结构表征： M.p. 257-259℃ ； 1H NMR (400M, CDCl3): δ 8.32 (d, J=8.8Hz ， 1H), 8.11 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.95 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.85 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.57 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.50 (t, J=8.4Hz, 1H), 7.06 (d, J=8.4Hz, 2H), 2.62 (t, J=8.0Hz, 2H) ， 1.65 (m, 2H) ， 0.91 (t, J=8.0Hz, 3H) ； TOF MS EI+(m/z): C24H16N2OS ， 计算值 ： 380.0983 ， 实测值 ： 380.0987 。
实施例 4 ： 3-( 吡啶 -2- 甲氨基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈的合成及表征
50 毫升乙腈中加入 1 克 8- 氧 -8H 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈， 0.48 克 2- 氨甲基吡啶，回流搅拌 8 小时，蒸出部分溶剂，层析柱分离得产品 3- ( 吡啶 - 2- 基甲氨基 ) -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈，收率 50% 。
结构表征： M.p. 290-292℃；1H NMR (400M, CDCl3) ： δ 8.64 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.90 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.82 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.58 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.55 (t, J=8.4 Hz, 1H), 7.29 (t, J=8.8 Hz, 1H), 7.19 (d, 1H), 6.50 (d, J=8.0 Hz,1H),4.65(d,2H),4.0(t,1H) ； TOF MS EI+(m/z): C21H12N4O ， 计算值 ： 336.1011 ， 实测值 ： 336.3462 。
实施例 5 ： 3,6- 二（ 4- 仲丁基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈的合成及表征
50mL 乙腈中加入 1.0 克 8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈， 2.9 克 对仲丁基苯硫酚，常温反应 30 小时，蒸出部分溶剂，层析柱分离得化合物 3,6- 二（ 4- 仲丁基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈，收率 20% 。
结构表征： M.p. 268-269℃ ； 1 H NMR (400M, CDCl3): δ 8.12 (d, J=8.8Hz ， 1H), 7.60 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.51 (d, J=8.0Hz, 4H), 7.48 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.23 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.08 (d, J=8.0Hz, 4H), 2.55 (m, 2H), 1.52 (m, 4H), 1.25 (d, J=8.0Hz, 6H), 0.78 (t, J=8.0Hz, 6H) ； TOF MS EI+(m/z): C35H30N2OS2 ，计算值： 558.1800 ，实测值： 558.1803 。
实施例 6 ： 3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸的合成及表征
在 50ml 单口烧瓶中 , 加入 60ml 浓硫酸 , 在 0 ～ 5 ℃下 , 分批加入 1.15 克 的 3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈， 1 小时内加完 , 加完后在室温继续反应 18 小时 , 反应混合物为粘稠的深棕红色。然后小心缓慢的将其滴入碎冰中 , 同时剧烈搅拌 , 滴完后静置 , 滤饼用大量水洗涤 , 直至滤饼呈中性 , 滤饼干燥后得深黄色产品。产率 90% 。
结构表征： M.p. 235-237℃ ； 1 H NMR (400M, CDCl3): δ 11.0 (s,1H), 8.55 (d, J=8.0Hz ， 1H), 8.45 (d, J=8.0Hz, 1H), 8.01 (t, J=8.0Hz, 1H), 7.71 (d, J=8.4Hz,1H), 6.561 (d, J=8.4Hz, 1H), 4.10 (t, J=7.6Hz, 2H), 1.75 (m, J=7.6Hz, 2H), 1.43 (m, 2H), 1.31 (m, 2H), 1.29 (m, 2H), 0.89 (t, J=7.6Hz, 3H) ； TOF MS EI+(m/z): C21H19NO4 ， 计算值 ： 349.1314 ， 实测值 ： 349.1316 。
实施例 7 ： 3- （ 4- 异丁基 苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸乙酯的合成及表征
在 100ml 单口烧瓶中 , 依次加入 3.78 克 3- （ 4- 异丁基 苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈， 50ml 乙腈做溶剂 , 2.76克的碳酸钾做缚酸计, 过量 10 倍的碘甲烷 , 氮气保护下，加热至 42 ℃ 反应 18 小时。减压蒸去乙腈，加入二氯甲烷使反应物充分溶解，过滤之后旋干滤液，得黄棕色粗产品。硅胶柱层析分离，展开剂：二氯甲烷 - 甲醇（ 40 ： 1 ），得深黄色产品。产率 85% 。
结构表征： M.p. 215-216℃；1H NMR (400M, CDCl3): δ 8.45 (d, J=8.0Hz,1H), 8.35 (d, J=8.0Hz ， 1H), 7.85 (t, J=8.0Hz, 1H), 7.68 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.36 (d, J=8.8Hz, 2H),7.23 (d, J=8.8Hz, 2H), 6.50 (d, J=8.4Hz, 1H), 2.45 (d, J=8.4Hz, 2H), 0.93 (m, 1H) , 1.85 (d, J=8.4Hz, 6H) ； TOF MS EI+(m/z): C27H23NO4 ， 计算值 ： 425.1627 ， 实测值 ： 425.1635 。
实施例 8 ： 9- （正丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮的合成及表征
50 毫升乙腈中加入 1 克 8- 氧 -8H 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈， 2.2 毫升正丁胺，常温反应 1 小时。反应完成后，减压蒸出部分溶剂，层析柱分离得产品 9- （正丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 ，收率 25% 。
结构表征： M.p. 265-266℃；1H NMR (400M, CDCl3) ： δ 8.42 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.35 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.04 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.82 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.78 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.54 (t, J=8.4 Hz, 1H), 2.87 (t, J=8.4 Hz, 2H), 2.01 (br, 1H), 1.52 (m, J=8.4 Hz, 2H), 1.31 (m, J=8.4 Hz, 2H), 0.90 (t, 3H) ； TOF MS EI+(m/z): C18H16N2O ， 计算值 ： 276.1263 ， 实测值 ： 276.1266 。
实施例 9 ： 3- 乙氧基 - 9- （ 3- 苯基丙胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮的合成及表征
50 毫升乙腈中加入 0.82 克 3- 乙氧基 -8- 氧 -8H 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈， 2.3 毫升 3- 苯基丙胺，常温反应 2 小时。反应完成后，减压蒸出部分溶剂，层析柱分离得到产品 3- 乙氧基 -9- （ 3- 丙基丙胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 ，收率 30% 。
结构表征： M.p. 272-273℃；1H NMR (400M, CDCl3) ： δ 8.55 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.42 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.82 (t, J=8.4 Hz, 1H), 7.79 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.41 (t, J=8.4 Hz, 2H), 7.30 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.28 (t, J=8.4 Hz, 1H), 6.60 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.62 (q, J=7.6Hz, 2H),2.87 (t, J=8.4 Hz, 2H), 2.62 (t, J=8.4 Hz, 2H), 2.09 (m, J=8.4 Hz, 2H),2.01 (br, 1H), 1.31 (t, J=7.6 Hz, 3H) ； TOF MS EI+(m/z): C24H20N2O2 ， 计算值 ： 368.1525 ， 实测值 ： 368.1529 。
实施例 10 ：乙基 -2- 氰基 -2- （ 6- （ 4- 异丙基苯氧基） -2- 苊酮 -1-2H- 亚甲基） - 酯
在 25 毫升单口烧瓶中 加入 0.63 克 4- 异丙基苯氧基苊醌， 0.4 毫升氰基乙酸乙酯， 80 微升哌啶催化， 10 毫升乙醇作溶剂。 60 ℃ 反应24小时。反应完成后，旋干反应液。 层析柱分离（ CH2Cl2 ：石油醚 =1 ： 1 ）得到产品 乙基 -2- 氰基 -2- （ 6- （ 4- 异丙基苯氧基） -2- 苊酮 -1-2H- 亚甲基） - 酯 ，称重 0.58g ，产率 70% 产率。
结构表征： M.p. 222-223℃；1H NMR (400M, CDCl3) ： δ 8.45 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.22 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.86 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.46 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.31 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.71 (t, J=8.4 Hz, 1H), 6.74 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.22 (q, J=7.6Hz, 2H), 2.87 (m, J=8.4 Hz, 1H), 1.29 (t, J=8.4 Hz, 3H), 1.20 (d, J=8.4 Hz, 6H) ； TOF MS EI+(m/z): C26H21NO4 ， 计算值 ： 411.1417 ， 实测值 ： 411.1422 。
实施例 11 ： 2- （ 6- （ 4- 氨基苯氧基） -2- 苊酮 -1-2H- 亚甲基 )-N- 苯基 -3- 氧代丙酰胺
在 25 毫升单口烧瓶中 加入 0.58 克 4- 氨基苯氧基苊醌， 0.53 克 N - 苯基 -3- 氧代丙酰胺基乙酸乙酯， 80 微升哌啶催化， 10 毫升乙醇作溶剂。 60 ℃ 反应20小时。反应完成后，旋干反应液。 层析柱分离（ CH2Cl2 ：石油醚 =2 ： 1 ）得到产品 2- （ 6- （ 4- 氨基苯氧基） -2- 苊酮 -1-2H- 亚甲基 )-N- 苯基 -3- 氧代丙酰胺 ，称重 0.49g ，产率 55% 。
结构表征： M.p. 251-253℃；1H NMR (400M, CDCl3) ： δ 10.32 (s, 1H) ， 8.43 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.21 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.23 (br, 1H) ， 7.86 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.71 (t, J=8.4 Hz, 1H), 7.35 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.30 (q, J=8.0Hz, 1H), 7.20 (d, J=8.0 Hz, 2H), 6.78 (d, J=8.4 Hz, 2H) ， 6.75 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.70 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.23 (br, 2H) 4.32 (s, 2H) ； TOF MS EI+(m/z): C28H20N2O2 ， 计算值 ： 448.1423 ， 实测值 ： 448.1429 。
第二部分： Bcl-2 家族蛋白抑制剂 化合物环糊精包合物、配结物的制备及其表征实施例；
本部分内容包括苊并杂环类化合物环糊精包合物、配结物的制备及对产物的表征，所采用的表征手段包括紫外光谱、荧光光谱、圆二色光谱、红外光谱、核磁、热失重分析及 SEM 。如无特殊说明，本部分涉及的仪器及其检测方法参考来源如下：
相溶解度图：按照文献 J. Agric. Food Chem., 2007, 55 (9), 3535-3539 的方法绘制相溶解度图。
紫外光谱： HP8453 （美国）；检测方法参考文献 Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 173 (2005) 319-327 。
荧光光谱： PTI-700 （美国）；检测方法参考文献 J Fluoresc (2008) 18:1103-1114 。
圆二色光谱： J-810 （日本）；检测方法参考文献 J. Phys. Chem. B, 2006, 110 (13), 7044-7048 。
红外光谱： FT/IR-430 （日本）；检测方法参考文献 Mol. Pharmaceutics, 2008, 5 (2), 358-363 。
热失重分析： TGA/SDT851e （瑞士）；检测方法参考文献 Mol. Pharmaceutics, 2008, 5 (2), 358-363 。
SEM ： JSM-5600LV （日本）；检测方法参考文献 J. Med. Chem. 2003, 46, 4634-4637 。
1 H 核磁： Bruker AvanceⅡ400M （瑞士）；检测条件为：（溶剂 CDCl3 ， D2O ， 400MHz ）。
质谱： GC-Tof MS （英国）；检测方法参考文献 J. Org. Chem. 2000, 65, 9013-9021 。
X 单晶衍射： XD-3A （日本）；检测方法参考文献 J. Org. Chem. 2008, 73, 8305-8316 8305 。
实施例 12 ： 3- ( 4- 异丙基苯氧基 ) -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 β- 环糊精包合物的制备及表征
首先称取将经过二次重结晶并充分干燥的 β- 环糊精 1.85g （ 1.63 mMol ），加入 100mL 水，加热并搅拌使其溶解。称取待测化合物 0.196g （ 0.54 mMol ），用 30mL 丙酮溶解之后，以线状逐滴加入到 β- 环糊精的水溶液中， 60 ℃ 加热搅拌 3 天后，有沉淀析出，过滤，用少量蒸馏水洗涤滤饼之后，再用少量的丙酮洗去游离状态的化合物，真空下 50 ℃ 干燥 24 小时，得到淡红色固体。
紫外吸收检测结果表明，随着 β- 环糊精浓度的逐渐增大化合物的紫外吸收值逐渐增大，其溶解度逐渐增大，表示包合物的形成。
由相溶解度图结果可知 : 化合物的溶解度由原来的 0.35μM 增加到 0.65μM ，提高 1.8 倍。
荧光光谱检测结果显示：固定待测化合物的浓度不变，荧光值随着 β- 环糊精浓度的逐渐增大而增大。荧光发射波长不变，但是强度增大，原因化合物进入环糊精空腔之后，空腔环境的变化，保护了处于激发态的化合物分子，使之不与大体积分子和淬灭剂接触，这种荧光光谱的变化表明了化合物与 β- 环糊精生成了包合物。
圆二色光谱检测结果显示：在 β- 环糊精存在的情况下，待测化合物的诱导圆二色在 265 nm 到 385 nm 有一个强的正 cotton 效应的峰，以及在 420 nm 到 510 nm 处有一个弱的 cotton 效应的正峰，这说明化合物进入环糊精的手性空腔之后，产生了诱导圆二色效应，表明了包合物的形成。
红外光谱检测结果显示： β- 环糊精在 3410.18 和 1029.22 cm-1 有强的吸收带，同时在 579 ～ 911cm-1 处有一系列的指纹区特征峰。化合物在 2217.55 cm -1 和 1624.08 cm-1 有两个尖锐的特征吸收峰。红外谱图中 2218.13 cm -1 和 1624.48 cm -1 特征吸收峰强度变小，及轻微的位移，同时在 1706 cm -1 出现的一个新的尖峰，表明了包合物的形成。
1 H 核磁检测结果显示： β- 环糊精的特征峰在 3.32-5.85 ppm ，化合物芳香氢的特征峰在 8.92-7.04 ppm 。而包合物中出现了 β- 环糊精和化合物的特征峰，同时化合物芳香氢特征峰向高场位移了 0.11 ppm ，说明了包合物的形成。另外，化合物芳香氢与 β- 环糊精的 C1-H 的比例为 1 ： 7.2 。由于每个 β- 环糊精中含有 6 个 C1-H ，所以其包合模式为 1:1 。
热失重分析检测结果显示： β- 环糊精在 298 ℃ 出现拐点，开始降解。而包合物在 271 ℃ 即出现拐点，开始降解，不同于 β- 环糊精，表明了包合物的形成。 环糊精的含量为 75.9% ，所以其包合模式为 1:1 。
SEM 结果显示 ： 3- ( 4- 异丙基苯氧基 ) -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 化合物为针状外形， β- 环糊精为较大的方砖状，化合物与 β- 环糊精物理混合 SEM 图是针状与方砖状的混合外形 ，而 化合物 -β- 环糊精包合物的表面形貌明显不同于以上三者，其外形为规整的菱形。 从外形结构的明显不同可以看出包合物的形成。
其他 包合物的制备及表征：
采用与实施例 12 相同的方法，利用不同类型环糊精包合同系列的其他化合物；同样采用紫外、荧光光谱、圆二色光谱、红外光谱、核磁、热失重分析及 SEM 对产物进行了表征，证明 了包合物的形成，并通过相溶解度实验检测对比包合前后化合物与其包合物溶解度的变化。具体结果如表 1 所示。从下表 1 的检测结果可以看出，不同类型的环糊精包合的苊并杂环类化合物在水中的溶解度较化合物本身均大大提高。
被包合 Bcl-2 家族蛋白抑制剂化合物名称 环糊精 化合物
溶解度
（ μM ） 		包合物
溶解度
（ μM ）
3- ( 4- 异丙基苯氧基 ) -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 β- 环糊精 0.35 0.75
3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 β- 环糊精 049 0.80
3- （对异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 β- 环糊精 0.39 0.69
9- （正丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 β- 环糊精 0.68 0.81
9- （ 1- 羟基丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 β- 环糊精 0.41 0.87
3- ( 4- 异丙基苯氧基 ) -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 γ- 环糊精 0.33 0.72
3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 γ- 环糊精 0.50 0.70
3- （对异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 γ- 环糊精 0.39 0.61
9- （正丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 γ- 环糊精 0.44 0.85
9- （ 1- 羟基丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 γ- 环糊精 0.41 0.89
9- （ 1- 羟基丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 γ- 环糊精 0.45 0.90
3- ( 4- 异丙基苯氧基 ) -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 2- 羟丙基 -β- 环糊精 0.39 0.86
3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 2- 羟丙基 -β- 环糊精 0.29 0.75
3- （对异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 2- 羟丙基 -β- 环糊精 0.33 0.78
9- （正丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 2- 羟丙基 -β- 环糊精 0.39 0.90
9- （ 1- 羟基丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 2- 羟丙基 -β- 环糊精 0.41 0.90
9- （ 1- 羟基丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 甲基 -β- 环糊精 0.31 0.53
3- ( 4- 异丙基苯氧基 ) -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 甲基 -β- 环糊精 0.38 0.90
3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 甲基 -β- 环糊精 0.29 0.56
3- （对异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 甲基 -β- 环糊精 0.33 0.60
9- （正丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 甲基 -β- 环糊精 0.39 0.62
9- （ 1- 羟基丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 甲基 -β- 环糊精 0.41 0.65
实施例 13 ： γ- 环糊精与 3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸配结物的制备及表征：
将 3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸 (0.261g ， 0.75 mmol) 和 N,N'- 羰基二咪唑 (0.179 g) 溶解到 3 mL 的 DMSO 中，然后常温搅拌 30 分钟之后，加入 γ- 环糊精 (0.6485 g ， 0.5 mmol) 及 4 mL 的三乙醇胺。常温反应 20 小时。反应完毕之后，加入约 180 mL 的丙酮于反应液，减压使析出沉淀。所得沉淀用离子交换柱提纯，所得产品再用甲醇与水的混合溶剂洗涤，溶液冻干得到 0.281g 的 3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸 /γ- 环糊精配结物。产率 35% 。
1 H 核磁及质谱检测结果显示： 1 H NMR (400M, D2O-d6):δ (ppm) 8.57 (d, J = 8.4 Hz, 1H) ， 8.43 (d, J = 8.4 Hz, 1H) ， 7.85 (t, J = 8.4 Hz, 1H) ， 7.71 (d, J = 8.0 Hz, 1H) ， 6.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H) ， 4.11 (t, J = 8.4 Hz, 2H) ， 4.03(m ， 8H) ， 3.83(m ， 8H),3.80(m ， 8H ）， 3.74(m ， 8H ）， 1.76 (m, 2H) ， 3.59(m ， 8H ）， 3.52 (m ， 8H) ， 1.32-1.42 (m, (CH2)3 ， 6H) ， 0.86 (t, J = 8.4 Hz, 3H); (ESI) m/z (M+H)- (1627+1 m/z) 。
X 单晶衍射表征结果显示： γ- 环糊精在 12° 和 15 ～ 23° 之间有一系列的尖峰出现，化合物 3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸只在 11° 和 7° 处有尖峰。而配结物在 11° 处的尖峰消失，在 6° 有一个新的尖锋，在 14 ～ 18° 以及 20 ～ 25° 出现一系列的尖峰。相对于化合物与环糊精而言，配结物中有新的尖峰出现，表明了配结物的形成。
化合物 3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸与 γ- 环糊精配结之后，在水中的溶解度明显增大。相溶解度曲线拟合曲线方程为 Y = 0.69 + 0.15 × X 。 3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸在水中的溶解度由原来的 0.69μM 增加到 12.5μM ，提高了 18.1 倍。
其他 配结物的制备及表征：
采用与实施例 13 相同的方法，利用不同类型环糊精配结同系列的其他化合物；同样采用 1 H 核磁、质谱和 X 单晶衍射对产物进行了表征，证明了配结物的形成，并通过相溶解度实验检测对比配结前后化合物与其配结物溶解度的变化。具体结果如表 2 所示。
从下表 2 的检测结果可以看出，不同类型的环糊精配结的苊并杂环类化合物在水中的溶解度较化合物本身均大大提高。表 2
待配结的 Bcl-2 家族蛋白抑制剂化合物名称 环糊精 化合物
溶解度
（ μM ） 		包合物
溶解度
（ μM ）
3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酰胺 γ- 环糊精 0.53 4.42
3- （ 4- 异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸 γ- 环糊精 0.43 4.65
3- （ 4- 异丙基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酰胺 γ- 环糊精 0.50 4.82
3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酰胺 2- 羟丙基 -β- 环糊精 0.51 4.95
3- （ 4- 异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸 甲基 -β- 环糊精 0.54 2.41
第三部分： Bcl-2 家族蛋白抑制剂化合物、其环糊精包合物、配结物的理化活性检测
实施例 14 ：通过荧光偏振分析法检测化合物的 BH3 类似程度
合成一个 21 个氨基酸的 Bid BH3 肽段（氨基酸： 79-99 ： QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR) ，并在 N 端标记上 6- 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（ FAM ）作为荧光标签（ FAM-Bid ）。竞争结合实验中所用的反应体系为 GST-Bcl-2 蛋白（ 40nM ）或 Mcl-1 蛋白，和 FAM-Bid 多肽（ 5nM ）溶于反应缓冲液中（ 100mM K3PO4, pH 7.5; 100µ g/ml 牛 γ 白蛋白； 0.02% 叠氮化钠）。在 96 孔板中，每孔加入 100µL 反应体系 ， 然后加入 1µL 不同浓度的溶于 DMSO 的待检测化合物 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈母液至实验设计所需终浓度。同时设立对照组，反应体系中只含有 Bcl-2 或 Mcl-1 和 FAM-Bid( 相当于 0% 抑制率 ) 。 96 孔板经过 4 个小时的避光孵育后，进行酶标仪上检测。荧光极化值（ mP ）在由 530nm 波长激发产生的 485nm 发射波长下测量。竞争结合常数（ Ki ） 值根计算公式推导得出。该化合物与 Bcl-2 蛋白的竞争结合常数为 20nM 。
按照上述相同的试验方法检测其他 9 个化合物的 BH3 类似程度，它们与 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白的结合常数（表 3 中简称结合常数）也在 nM 级，具体结果如下表 3 所示。
化合物名称 结合常数（ nM ）
3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 20
3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 11.0
3- （对异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 23.0
6- （ 4- 丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 9.0
3-( 吡啶 -2- 甲氨基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 14.0
3,6- 二（ 4- 仲丁基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 540.0
9- （正丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮的合成及表征 89.0
3- （ 4- 异丁基 苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸乙酯 57.0
3- 乙氧基 -9- （ 3- 苯基丙胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 460.0
实施例 15 ：活细胞内荧光偏振能量转移（ FRET ）检测化合物的 BH3 类似性
利用磷酸钙共沉淀的方法将 2μg Bcl-2-CFP 和 Bax-YFP 质粒分别或同时转染至 Hela 细胞中，转染 24 小时后，将细胞接种于 6 孔培养板（ 2×105 个 / 孔），加入溶于 DMSO 的 待检测化合物 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 至终浓度（ 2 ， 5 ， 10 和 15µM ），药物作用 24 小时后（如附图 1 ）， PBS 清洗细胞 3 次，用 GENIOS 荧光酶标仪（ TECAN, Swiss ）检测荧光值。在时间依赖的实验中，转染后的细胞接种于 6 孔板后，加入 40µM 化合物 ， 药物作用 3 、 6 和 24 小时（附图 2 ），读板检测荧光。在只转染 Bcl-2-CFP 质粒的细胞组中记录 475nm 发射波长值，激发波长为 433nm 。在只转染 Bax-YFP 质粒的细胞组中记录 527nm 发射波长值，激发波长为 505nm 。 对共转染 Bcl-2-CFP 和 Bax-YFP 质粒的细胞实验组记录 527nm 和 475nm 发射波长值，激发波长为 433nm 。 527nm 发射荧光与 475nm 发射荧光相比值即为 FRET ，将单独转染对照组的 FRET 值设为 1.0 。在共转染的细胞中，由于 Bcl-2 蛋白和 Bax 蛋白的相互作用使得 FRET 值增加至 2.0 ，而随着加药浓度和时间的增加，对两蛋白相互作用的干扰增强， FRET 随之减弱。细胞活力由 MTT 法进行测定。试验结果如附图 2 和附图 3 所示，该化合物在 2 µM ，作用 3 小时即可干扰 Bcl-2/Bax 之间的相互作用，呈浓度时间依赖趋势。
按照上述相同的试验方法检测其他 9 个化合物，试验证明 这些化合物在不同作用浓度和作用时间的条件下，均具有细胞内模拟 BH3-only 蛋白的作用，能明显干扰 Bcl-2/Bax 之间的相互作用。具体结果如下表 4 所示。
其中 浓度和时间表示测试化合物在该浓度下干扰 Bcl-2/Bax 之间的相互作用 发生时间。
化合物名称 浓度
（ µM ）		 时间
（小时）
3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 0.1 2
3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 0.5 2
3- （对异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 0.2 2
6- （ 4- 丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 0.5 2
3-( 吡啶 -2- 甲氨基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 1.0 2
3,6- 二（ 4- 仲丁基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 1.0 2
9- （正丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 1.0 2
3- （ 4- 异丁基 苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸乙酯 5.0 6
乙基 -2- 氰基 -2- （ 6- （ 4- 异丙基苯氧基） -2- 苊酮 -1-2H- 亚甲基） - 酯 10.0 6
实施例 16 ：通过 Bax 蛋白与线粒体共定位检测化合物的 BH3 类似度
利用磷酸钙共沉淀方法将 5µg Bax-YFP 质粒转染至 MCF-7 细胞中，转染 24 小时后，将细胞接种于 6 孔培养板（ 0.2×106 个 / 孔），加入 10µM 待检测化合物 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈，作用 6 小时后， PBS 清洗并同 50nM Mito Tracker Red CMXRos ( 线粒体特异探针；红色 ) 避光孵育 10min ， PBS 清洗三次后， Radiance2000 激光共聚焦显微镜（ Bio-Rad ， USA ）扫描荧光图像。同时进行双通道扫描，一个通道扫描 Bax-YFP 的绿色荧光，另一通道扫描指示线粒体的 CMXRos 探针红色荧光，两通道图像相互叠加显示共定位情况。该化合物作用下，叠加图片呈现橘色荧光，表示 Bax 向线粒体位移。
按照上述相同的试验方法检测其他 8 个化合物，结果显示他们在不同作用浓度和作用时间的条件下，均具有驱动 BAX 向线粒体移位的作用，说明具有细胞内模拟 BH3-only 蛋白的作用。具体结果如下表 5 所示，其中 浓度和时间表示测试化合物在该浓度下 模拟 BH3-only 蛋白驱动 BAX 向线粒体移位的作用发生的时间。
化合物名称 浓度
（ µM ）		 时间
（小时）
3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 1.0 1
3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 1.0 3
3- （对异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 5.0 3
6- （ 4- 丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 5.0 3
2- （ 6- （ 4- 氨基苯氧基） -2- 苊酮 -1-2H- 亚甲基 )-N- 苯基 -3- 氧代丙酰胺 1.0 3
3,6- 二（ 4- 仲丁基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 1.0 3
9- （正丁胺基） -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -8- 酮 1.0 3
3- （ 4- 异丁基 苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸乙酯 5.0 3
实施例 17 ：化合物依赖 BAX/BAK 的细胞毒性实验验证其 BH3 类似物的特性
磷酸钙共沉淀转染 3µg BAX/BAK 干扰质粒至 MCF-7 细胞中，转染 24 小时后，收集细胞， Western 检测 RNA 干扰后 BAX 和 BAK 蛋白表达情况，相同处理无质粒转染的细胞组设为对照组。转染后的细胞接种于 96 孔板中（ 1×105 个 / 孔），平行进行未转染质粒细胞组的对照实验，按实验设计浓度梯度加入 待检测化合物 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 ， 作用 48 小时后， MTT 检测细胞活力，结果如附图 3 所示， Gossypol 作为非特异性 BH3 类似物与本发明的化合物对比平行处理，可见 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈具有绝对依赖 BAX/BAK 的细胞毒性。
按上述相同试验方法检测其他 8 个化合物（如所述化合物 ① ～ ⑧ ），结果显示所检测化合物也均具有绝对依赖 BAX/BAK 的作 用特点。这些化合物包括：
① 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
② 3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
③ 3- （对异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
④ 6- （ 4- 丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
⑤ 2- （ 6- （ 4- 氨基苯氧基） -2- 苊酮 -1-2H- 亚甲基 )-N- 苯基 -3- 氧代丙酰胺
⑥ 3,6- 二（ 4- 仲丁基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
⑦ 4- （ 4- 特戊基苯氧基） - 苯氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
⑧ 4- （对异丙基苯硫基） - 苯氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
实施例 18 ： Western 印记检测化合物对 Mcl-1 和 Bcl-2 的抑制作用
收集细胞样品后，以 1×106/50µl 细胞裂解液（ 62.5mM Tris-HCL pH 6.8 ； 2%SDS ； 10% 甘氨酸； 50mM DTT ； 0.01% 溴酚蓝）低温裂解，离心，取蛋白上清， 100 ℃ 煮沸样品 5 分钟， 12% SDS-PAGE 电泳并转膜，相应抗体检测目的蛋白，辣根过氧化酶标记二抗并结合 ECL 显色法检测目的蛋白在细胞中的表达量。附图 4 和附图 5 分别显示 待检测化合物 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈对 Mcl-1 和 Bcl-2 的抑制作用。从图中可以看出，随着待测化合物作用于肿瘤细胞时间的延长， Bcl-2 和 Mcl-1 的蛋白条带逐渐变浅，说明化合物具有抑制这两个蛋白的作用。利用 KODAK Gel Logic 1500 成像系统软件对 Western 图片中蛋白条带浓度进行半定量分析，归一化处理后，蛋白条带的浓度如附图 9 和 10 所示。
经同样方法对检测下述 8 个化合物，它们均具有抑制 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白的作用，这些化合物包括：
① 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
② 3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
③ 3- （对异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
④ 6- （ 4- 丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
⑤ 2- （ 6- （ 4- 氨基苯氧基） -2- 苊酮 -1-2H- 亚甲基 )-N- 苯基 -3- 氧代丙酰胺
⑥ 3,6- 二（ 4- 仲丁基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
⑦ 4- （ 4- 特戊基苯氧基） - 苯氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
⑧ 4- （对异丙基苯硫基） - 苯氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈；
这些化合物下调 Mcl-1 蛋白和 Bcl-2 蛋白的半定量分析结果如表 6 和表 7 所示：
表 6 ：化合物 = 1 \* GB3 ① - = 8 \* GB3 ⑧ 下调 Mcl-1 蛋白的半定量分析就结果
化合物 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
对照 1 1 1 1 1 1 1 1
6 小时 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99
12 小时 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99
18 小时 0.58 0.54 0.55 0.60 0.60 0.70 0.50 0.60
24 小时 0.11 0.21 0.21 0.37 0.30 0.41 0.23 0.20
表 7 化合物 ① - ⑧ 下调 Bcl-2 蛋白的半定量分析结果
化合物 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
对照 1 1 1 1 1 1 1 1
2 小时 0.79 0.77 0.74 0.68 0.71 0.60 0.60 0.70
6 小时 0.29 0.45 0.49 0.49 0.45 0.59 0.46 0.28
实施例 19 ： Western 印记检测比较 Bcl-2 家族蛋白抑制剂化合物及其环糊精包合物和配结物对 Mcl-1 和 Bcl-2 的抑制作用
将细胞接种于 6 孔培养板（ 2×105 个 / 孔），化合物组加入溶于 DMSO 的 化合物 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈 至终浓度 10µM ，包合物组加入溶于水溶液的相当于 10µM 化合物的 γ- 环糊精包合物，药物作用 24 小时后， PBS 清洗细胞 3 次， 收集细胞样品后，以 1×106/50µL 细胞裂解液（ 62.5mM Tris-HCL pH 6.8 ； 2%SDS ； 10% 甘氨酸； 50mM DTT ； 0.01% 溴酚蓝）低温裂解，离心，取蛋白上清， 100℃ 煮沸样品 5 分钟， 12% SDS-PAGE 电泳并转膜，相应抗体检测目的蛋白，辣根过氧化酶标记二抗并结合 ECL 显色法检测目的蛋白在细胞中的表达量。蛋白条带分析同于实施例 18 。附图 6 表明： 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈的 γ- 环糊精包合物对 Mcl-1 和 Bcl-2 蛋白的抑制作用明显高于该化合物本身。即 γ- 环糊精 包合物明显提高了抑制 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白的能力。
本实施例还采用上述同样方法检测了 β- 环糊精、 2- 羟丙基 -β- 环糊精、甲基 -β- 环糊精和羟丙基 -γ- 环糊精包合的 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈，以及下述化合物，均比化合物本身具有更高的细胞内抑制 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白的能力 。这些化合物包括：
①3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
②3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
③3- （对异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
④6- （ 4- 丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
⑤2- （ 6- （ 4- 氨基苯氧基） -2- 苊酮 -1-2H- 亚甲基 )-N- 苯基 -3- 氧代丙酰胺
⑥3,6- 二（ 4- 仲丁基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈
这些化合物及其包合物下调 Mcl-1 蛋白和 Bcl-2 蛋白的半定量分析结果分别如表 8 和表 9 所示：
表 8 ：化合物 ① - ⑥ 和它们的包合物下调 Mcl-1 蛋白的半定量分析结果
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
对照 1 1 1 1 1 1
化合物 0.87 0.79 0.75 0.67 0.65 0.70
包合物 0.60 0.36 0.47 0.47 0.50 0.36
表 9 ：化合物 ① - ⑥ 和它们的包合物下调 Bcl-2 蛋白的半定量分析结果
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
对照 1 1 1 1 1 1
化合物 0.69 0.77 0.74 0.69 0.65 0.79
包合物 0.57 0.45 0.49 0.35 0.47 0.60
本实施例还采用上述同样方法检测了 γ- 环糊精、 2- 羟丙基 -β- 环糊精或甲基 -β- 环糊精配结的其他同类化合物，如： 3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酰胺、 3- （ 4- 异丙基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酰胺、 3- （ 4- 异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸。试验表明：这些化合物的环糊精配结物均比化合物本身具有更高的细胞内抑制 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白的能力。
实施例 20:Western 印记检测对比化合物和包合物在肿瘤模型动物体内对 Mcl-1 和 Bcl-2 的抑制作用
选择饲养的中国昆明小鼠，随机分组，每组 10 只。培养的肝癌细胞 H22 ，按 200μL/ 只接种于小鼠腋下皮下。于荷瘤 5 天后，皮下瘤块形成。开始腹腔注射待测化合物 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈， γ- 环糊精包合的待测化合物，和口服 γ- 环糊精包合的待测化合物。测试条件包括：
空白对照组：皮下荷瘤后小鼠不经任何处理；
对照组① ：皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射 DMSO 溶液，共计 10 天；
对照组② ：皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射环糊精溶液，共计 10 天；
实验组① ：皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射 0.03 mg/kg 体重化合物的 DMSO 溶液，共计 10 天；
实验组② ：皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射 0.3 mg/kg 体重化合物的 DMSO 溶液，共计 10 天；
实验组③ ：皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射相当于 0.3 mg/kg 体重化合物的包合物水溶液，共计 10 天；
实验组④ ：皮下荷瘤后给小鼠隔日灌胃相当于 0.3 mg/kg 体重化合物的包合物水溶液，共计 10 天。
实验期间每周两次测定肿瘤长径（ a ）及与之相垂直的短径（ b ），按公式 1/2ab2 计算肿瘤体积。观察动物存活时间。实验第 40 天，按肿瘤体积计算抑瘤率。结果显示：
实验组② （化合物 DMSO 溶液注射组）抑瘤率 24.3% ；
实验组③ （包合物注射组）抑瘤率 41.5% ；
实验组④ （包合物口服组）抑瘤率 50.1% 。
对照组动物平均生存时间为 28±2.1 天，化合物组的平均寿命 30±3.1 天，包合物注射组平均生存时间为 49±3.2 天，包合物口服组平均生存时间为 46±1.4 天。统计学处理结果显示 P<0.05 。
小鼠死亡或处死后，剥取小鼠皮下肿瘤，按 1:3 体积用生理盐水将组织匀浆制备细胞悬液，采用与实施例 19 相同的 western 检测方法，检测肿瘤细胞 Bcl-2 、 Mcl-1 蛋白的表达情况。附图 7 表明，包合物的体内拮抗 Bcl-2 、 Mc-1 蛋白的能力强于化合物本身。
β- 环糊精、 2- 羟丙基 -β- 环糊精、甲基 -β- 环糊精和羟丙基 -γ- 环糊精包合的 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈、以及下述化合物，均有同样的体内抗肿瘤的作用。包括：
① 在相同于实验组 ② 的条件下， 3-(4- 异丙基苯氧基 )-8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈的抑瘤率约 65% ；在相同于实验组 ③ 的条件下，羟丙基 γ- 环糊精包合的该化合物的抑瘤率约 70% ；
② 在相同于实验组② 的条件下， 3- （ 4- 特戊基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈的抑瘤率约 40% 左右；在相同于实验组③ 的条件下， 2- 羟丙基 - β - 环糊精包合的该化合物的抑瘤率约 62% ；
③ 在相同于实验组 ② 的条件下， 3- （对异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈的抑瘤率约 30% ；在相同于实验组 ③ 的条件下， γ- 环糊精包合的该化合物抑瘤率约 42% ；
④ 在相同于实验组 ② 的条件下， 6- （ 4- 丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈的抑瘤率达到 75% ；在相同于实验组 = 3 \* GB3 ③ 的条件下，甲基 - β - 环糊精包合的该化合物的抑瘤率约 85% ；
⑤ 在相同于实验组 ② 的条件下， 2- （ 6- （ 4- 氨基苯氧基） -2- 苊酮 -1-2H- 亚甲基 )-N- 苯基 -3- 氧代丙酰胺的抑瘤率为 50% ；在相同于实验组 ③ 的条件下， γ- 环糊精包合的该化合物的抑瘤率约为 60% ；
⑥ 在相同于实验组 ② 的条件下， 3,6- 二（ 4- 仲丁基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 腈的抑瘤率在 40% 左右；在相同于实验组 ③ 的条件下， β 环糊精包合的该化合物的抑瘤率约 55% 。
其它化合物的抑瘤率在 30 ～ 50% 之间。它们的环糊精包合物组的抑瘤率普遍高于化合物本身（ P<0.05 ）。
γ- 环糊精、 2- 羟丙基 -β- 环糊精和甲基 -β- 环糊精配结的下述化合物，相对于这些化合物本身也具有更强的体内抑制 Bcl-2 、 Mcl-1 的能力，和更高的抑瘤率。其中：
3- 己氧基 -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酰胺 的抑瘤率为 30% ，甲基 -β- 环糊精配结后抑瘤率达到 38% 左右；
3- （ 4- 异丙基苯氧基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酰胺 抑瘤率为 45% ， γ- 环糊精配结后 的产物抑瘤率为 55% ；
3- （ 4- 异丙基苯硫基） -8- 氧 -8H- 苊并 [1,2-b] 吡咯 -9- 甲酸的抑瘤率为 45% ， 2- 羟丙基 -β- 环糊精配结后达到 60% 。

Claims (1)

  1. 1.I 系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂，其分子结构通式为：
    Figure PCTCN2010075521-appb-I000011
    其中：
    （ I ） R1= 吡啶甲氨基或 XR5 ， R2=H ， R3 =H ， R4=CN 、 COOH 、 COOR6 或 CONHR6 ；
    （ II ） R1=H ， R2=XR5 ， R3=H ， R4=CN 、 COOH 、 COOR6 或 CONHR6 ；
    （ III ） R1=H ， R2=H ， R3=XR5 ， R4=CN ；
    （ IV ） R1=XR5 ， R2=H ， R3=XR5 ， R4=CN ；
    （ V ） R1=H ， R2=H ， R3=H ， R4= CONHR6 ；
    其中：当 X = O 、羰基、酯基、酰胺或磺酰胺时， R5= (CH2)nY 或 (CH2)nAr - （ o,m,p ） Y, Y = C2-C8 直链烷基、 C2-C8 支链烷基、 C1-C8 直链卤代烷、 C1-C8 支链卤代烷、 C1-C8 直链胺、 C1-C8 支链胺、 C1-C8 直链醇、 C1-C8 支链醇、 C1-C8 直链 酯 、 C1-C8 支链 酯、 C1-C8 直链 羧酸 或 C1-C8 支链 羧酸， n ＝ 0-4 ；
    当 X = O 、羰基、酯基、酰胺或磺酰胺时， R6 = C1-C6 直链烷基、 C1-C6 支链烷基、 C1-C6 直链卤代烷、 C1-C6 支链卤代烷、 C1-C6 直链胺、 C1-C6 支链胺、 C1-C6 直链醇、 C1-C6 支链醇、 C1-C6 直链 酯 、 C1-C6 支链 酯、 C1-C6 直链 羧酸 、 C1-C6 支链 羧酸或 (CH2)n Ar - （ o,m,p ） Z ； Z = CH3 、 C2H5 、 NO2 、 Ph 、 F 、 Cl 、 Br 、 CF3 、 OCH3 、 SCH3 、 NH2 或 N(CH3)2 ， n ＝ 0 ～ 4 。
    当 X=S 时， R5= (CH2)nY 或 (CH2)nAr - （ o,m,p ） Y, Y = C7-C8 直链烷基、 C7-C8 支链烷基、 C7-C8 直链卤代烷、 C7-C8 支链卤代烷、 C7-C8 直链胺、 C7-C8 支链胺、 C7-C8 直链醇、 C7-C8 支链醇、 C7-C8 直链 酯 、 C7-C8 支链 酯、 C1-C8 直链 羧酸 或 C1-C8 支链 羧酸， n ＝ 0-4 ；
    当 X=S 时， R6 = C1-C6 直链烷基、 C1-C6 支链烷基、 C1-C6 直链卤代烷、 C1-C6 支链卤代烷、 C1-C6 直链胺、 C1-C6 支链胺、 C1-C6 直链醇、 C1-C6 支链醇、 C1-C6 直链 酯 、 C1-C6 支链 酯、 C1-C6 直链 羧酸 、 C1-C6 支链 羧酸或 (CH2)n Ar - （ o,m,p ） Z ； Z = CH3 、 C2H5 、 NO2 、 Ph 、 F 、 Cl 、 Br 、 CF3 、 OCH3 、 SCH3 、 NH2 或 N(CH3)2 ， n ＝ 0 ～ 4 。
    2.II 系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂，其分子结构通式为：
    Figure PCTCN2010075521-appb-I000012
    其中： R7= (CH2)n X ； X=H 、 CN 、 NO2 、 NH2 、 COOH 、 CHO 、 OH 或 SO3H ， n=0-4 ；
    R8= (CH2)nY 或 (CH2)nAr - （ o,m,p ） Y ； Y =NO2 、 Ph 、 CF3 、 OCH3 、 SCH3 、 NH2 、 NHCH3 、 N(CH3)2 、 C1-C8 直链烷基、 C1-C8 支链烷基、 C1-C8 直链卤代烷、 C1-C8 支链卤代烷、 C1-C8 直链胺、 C1-C8 支链胺、 C1-C8 直链醇、 C1-C8 支链醇、 C1-C8 直链 酯 、 C1-C8 支链 酯、 C1-C8 直链 羧酸 或 C1-C8 支链 羧酸 ， n ＝ 0-4 ；
    R9=ZR8 、 H 、 四氢吡喃 -4- 氧基、四氢噻喃 -4- 氧基、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基、吡啶甲氨基或硫吗啉基 ， Z= O 、 S 、 N 、羰基、酯基、酰胺或磺酰胺；
    3.III 系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂，其分子结构通式为：
    Figure PCTCN2010075521-appb-I000013
    （ I ） R7= (CH2)n X, R8= (CH2)nY 或 (CH2)nAr - （ o,m,p ） Y ， R9=ZR8 、 四氢噻喃 -4- 氧基、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基、吡啶甲氨基或硫吗啉基， R10=H ； n=0-4
    （ II ） R7= (CH2)n X, R8= (CH2)nY 或 (CH2)nAr - （ o,m,p ） Y ， R9= H ， R10= ZR8 、 四氢噻喃 -4- 氧基、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基、吡啶甲氨基或硫吗啉基； n=0-4 ；
    （ III ） R9= H ， R10=H ， R7 与 R8 不同时为 CN 。
    其中： X=H 、 CN 、 NO2 、 NH2 、 COOH 、 CHO 、 OH 或 SO3H ；
    Y= CN 、 NO2 、 Ph 、 CF3 、 OCH3 、 SCH3 、 NH2 、 NHCH3 、 N(CH3)2 、 C2-C8 直链烷基、 C2-C8 支链烷基、 C1-C8 直链卤代烷、 C1-C8 支链卤代烷、 C1-C8 直链胺、 C1-C8 支链胺、 C1-C8 直链醇、 C1-C8 支链醇、 C1-C8 直链 酯 、 C1-C8 支链 酯、 C1-C8 直链 羧酸 或 C1-C8 支链 羧酸 ；
    Z=O 、 S 、 N 、羰基、酯基、酰胺或磺酰胺；
    4 . 权利要求 1 、 2 或 3 所述 Bcl-2 家族蛋白抑制剂的环糊精包合物，其特征在于由下述方法制备：
    ① 称取环糊精，加入水中，加热搅拌使其成为饱和溶液，所述的环糊精为 β- 环糊精、 γ- 环糊精、 2- 羟丙基 -β- 环糊精或甲基 -β- 环糊精；
    ② 称取待包合的 Bcl-2 家族蛋白抑制剂，该化合物与环糊精的摩尔比为 1 ： 3 ～ 1 ： 10 ；
    ③ 将待包合的系列 Bcl-2 抑制剂以 5 ～ 1 0 mg/mL 的浓度溶于丙酮，将所得溶液以线状逐滴加入到环糊精的水溶液中， 40 ～ 65 ℃ ，加热搅拌，有沉淀析出；
    ④ 将上述溶液过滤，用蒸馏水洗涤滤饼，再用丙酮洗去游离状态的化合物，真空干燥，得到权利要求 1 的系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂的环糊精包合物。
    5. 根据权利要求 1 、 2 或 3 所述的系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂的环糊精配结物，其特征在于由下述方法制备：
    ① 称取干燥的环糊精及待配结的 Bcl-2 家族蛋白抑制剂，环糊精与该化合物的摩尔比为 1 : 1.5 ～ 1 ： 3 ；所述的环糊精为 β- 环糊精、 γ- 环糊精、 2- 羟丙基 -β- 环糊精、甲基 -β- 环糊精或羟丙基 -γ- 环糊精；
    ② 将待配结的系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂与 N,N'- 羰基二咪唑以 1 : 1 ～ 1 ： 2 的摩尔比混合后溶解到 DMSO 中，使待配结的抑制剂在 DMSO 溶液中的浓度为 0.2 ～ 0.5 mmol /mL ，常温搅拌 30 ～ 60 分钟；
    ③ 往上述 DMSO 溶液中 加入步骤 ①所称取的 环糊精及 0.1 ～ 0.3 mmol/mL 的三乙醇胺，常温反应 18 ～ 24 小时；
    ④ 往步骤 ③的反应体系中 加入 0.50 ～ 1.0mg/mL 的丙酮，减压析出沉淀；
    ⑤ 过滤，沉淀经纯化得到权利要求 1 的系列 Bcl-2 家族蛋白抑制剂的环糊精配结物。
    6. 权利要求 1 、 2 或 3 所述的系列 Bcl-2 抑制剂，其特征在于，其在制备 BH3 类似物 Bcl-2 家族蛋白抑制剂中的应用。
    7. 权利要求 4 所述的化合物的环糊精包合物在制备 BH3 类似物 Bcl-2 家族蛋白抑制剂中的应用。
    8. 权利要求 5 所述的化合物的环糊精配结物在制备 BH3 类似物 Bcl-2 家族蛋白抑制剂中的应用。
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