WO2023014006A1 - Ras의 표적 분해를 위한 화합물 - Google Patents

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WO2023014006A1
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cancer
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kras
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권용태
문수란
김현태
성기운
고을비
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    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond

Definitions

  • RAS is a small GTPase protein that regulates various signaling pathways including cell cycle progression, transcription, cell survival, vesicular transport and calcium signaling.
  • the RAS state cycles between a GDP-bound inactive state and a GTP-bound active state.
  • the switch between GDP and GTP binding is mediated by guanine nucleotide exchange factor proteins (GEF), which exchange GDP for GTP, and GTPase activating proteins (GAP), which exchange GTP and GDP.
  • GEF and GAP proteins bind to the binding pocket of RAS, called Switch I (residues 30–38) for GAP and Switch II (residues 59–76) for GEF, to switch between GDP- or GTP-bound states.
  • the RAS protein composed of an N-terminal G domain with 90% homology and a C-terminal hypervariable region with 8% homology, results in variability between the four RAS subtypes (HRAS, NRAS, KRAS4A and KRAS4B) .
  • RAS is the most common mutated oncogene in cancer, occurring in 27% of all cancers (Hobbs et al., 2016).
  • KRAS is the most frequently mutated oncogene (85%) in human cancer, followed by NRAS (11%) and HRAS (4%).
  • RAS oncogene mutations are primarily located at residues G12, G13 and Q61 of the GTP binding domain. RAS mutations disrupt GAP-mediated metastasis, resulting in accumulation of active RAS bound to GTP, resulting in sustained activation of downstream signaling and uncontrolled cell proliferation.
  • G12C of KRAS A small pocket was found in G12C of KRAS, and an inhibitor that binds to this pocket was developed (Ostrem et al., 2013).
  • This G12C-specific inhibitor covalently binds GDP-bound G12C KRAS, preventing its conversion to a GTP-bound active state.
  • modified G12C inhibitors among which ARS-1620 showed tumor regression in a mouse xenograft model, and Amgen's AMG510 and Mirati Therapeutics' MRTX849 were developed. It is in clinical trials (Canon et al., 2019; Fell et al., 2020; Janes et al., 2018).
  • G12C mutations were restricted to only 15% of RAS-mutant cancers, suggesting that inhibitors targeting other forms of mutant KRAS should be investigated (Ryan and Corcoran, 2018).
  • the UPS the core of PROTAC
  • E3 ligase types that limit substrate-E3 ligase combinations
  • narrow proteasome pore size and substrate size limitations due to the requirement of lysine residues in the target protein to be ubiquitinated.
  • protein homeostasis is systematically maintained through protein quality control (PQC). Misfolded and unfolded proteins that can develop into pathological proteins must be properly degraded or modified (Chen et al., 2011).
  • UPS protein quality control
  • autophagy To avoid pathogenic proteins from developing into disease, two degradation systems, UPS and autophagy, complementarily regulate protein degradation (Ji and Kwon, 2017; Kocaturk and Gozuacik, 2018).
  • soluble, short-lived proteins are ubiquitinated by E1, E2 and E3 ligases, and the proteasome recognizes ubiquitinated substrates and is digested by the proteasome into short peptides.
  • autophagy In macroautophagy, substrates are sequestered into autophagosomes and fuse with lysosomes, resulting in lysosomal degradation (Dikic and Elazar, 2018). Unlike UPS, limited substrate size or E3 ligase specificity, autophagy does not limit substrate size and can degrade relatively larger substrates such as organelles or aggregates.
  • N-degron a specific type of N-terminal amino acid in the C-terminal fragment, called the N-degron, serves as a determinant of degradation and is recognized by N-recognin. to induce protein degradation.
  • the N-terminal amino acids Arg, Lys, His (type 1), Phe, Tyr, Trp, Leu, and Ile (type 2) function as N-degrons.
  • Arg/N-degron can be generated through ATE1 R-transferase-mediated conjugation of L-Arg to Asp, Glu or oxidized Cys (Kwon et al., 1999).
  • the Arg/N-degron pathway has been identified as a divergence of N-lycognins, such as UBR1, 2, 4 and 5, N-degron recognized by E3 ligase, UPS, and induces proteasomal degradation (Tasaki et al. al., 2005).
  • the present inventors discovered that the autophage adapter protein p62/SQSTM1/sequestosome-1 acts as N-lycognin (Cha-Molstad et al., 2015).
  • binding of N-terminal arginylation to the ZZ domain of p62 induces p62 oligomerization and autophagy (autophagy) activation, promoting lysosomal degradation. Therefore, we developed a p62 ligand that mimics Nt-Arg, which binds to and activates p62 and consequently activates autophagy. The use of this ligand shows selective autophagic degradation of pathogenic proteins such as misfolded proteins and proteotoxic aggregates (Cha-Molstad et al., 2017; Yoo et al., 2018).
  • the present inventors have developed AUTOTAC (Autophagy-Targeting Chimera) as a target degradation platform for degradation of misfolded proteins by linking p62 ZZ ligand (ATL, autophagy ligand) to target binding ligand (TBL) (Ji el al, 2021 ).
  • ATL p62 ZZ ligand
  • TBL target binding ligand
  • AUTOTACs target binding ligand
  • AUTOTACs are based on the ability of selective autophagy through p62 and ATL domains that specifically bind to and activate autophagy (Ji el al, 2021).
  • AUTOTACs as a degradation platform, the advantages of a targeted degradation system can be applied, such as improved degradation capacity while negliging drug resistance compared to conventional drugs or PROTACs.
  • the problem to be solved by the present disclosure is to provide a novel compound capable of treating RAS mutation-derived cancer.
  • the problem to be solved by the present disclosure is to provide a targeted degradation system that exhibits tumor suppression in an in vivo mouse xenograft model.
  • the present disclosure includes an autophagy-targeting ligand (ATL) having a structure of Formula 1 and a target-binding ligand (TBL) having a structure of Formula 2, wherein the A conjugate compound in which the —OH group of the autophage-targeting ligand and the carbon of 1,4-dioxane of the target-binding ligand are directly or through a linker are bonded, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, and a hydrate thereof. or a solvate thereof;
  • R 1 and R 2 are, independently, hydrogen or fluoro
  • R 3 is -(CH 2 )- or -O-(CH 2 )-CH(OH)-(CH 2 )-, wherein -O-(CH 2 )-CH(OH)-(CH 2 )- O is bonded to the benzene ring.
  • the present disclosure is for preventing, improving or treating cancer, comprising the conjugate compound according to the above aspect, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof as an active ingredient.
  • composition is provided.
  • the target-binding ligand binds to RAS and the auto-phagy-targeting ligand binds to p62 to induce p62 oligomerization and targeted autophagosome, and finally to lysosome.
  • Degradation allows targeted degradation of RAS. Since targeted degradation of RAS through autophagy results in inhibition of downstream signaling, unlike traditional targeted degradation systems, RAS is inactivated and inhibition of downstream signaling is observed at the p62 aggregation stage, an early stage of autophagy. The effect can be maintained with RAS degradation.
  • the conjugate compound can inhibit tumor growth in a mouse xenograft model, which is the first in vivo experiment showing tumor suppression through a targeted degradation system.
  • the present disclosure provides possibilities and new approaches to treat cancers resulting from RAS mutations.
  • Figure 1a shows that the TBL region of the conjugate compound according to an embodiment of the present disclosure binds to RAS and the ATL region binds to p62 to induce p62 oligomerization and targeting to autophagosome, thereby fusion with lysosome to form RAS. It is a schematic diagram showing the mechanism that induces autophagy degradation.
  • Figure 1b is a diagram showing the results of immunoblotting analysis in Hela cells treated with Comparative Example 1 (Compound A ATL alone) or Example 1 (Compound A).
  • Figure 1c is a comparison of the relative amount of LC3 II among the results of immunoblotting analysis in Hela cells treated with Comparative Example 1 (Compound A alone) or Example 1 (Compound A) of Figure 1b, 1 on the x-axis to 9 means that the treatment concentrations of Example 1 are 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, and 2 ⁇ M and the treatment concentrations of Comparative Example 1 are 0, 0.5, and 2 ⁇ M, respectively.
  • Figure 1d is a diagram showing the results of confirming the dose-dependent autophagy activation of Example 1 (Compound A) in a KRAS mutant cell line (H23).
  • Figure 1e is a diagram showing the result of confirming the dose-dependent autophagy activation of Example 1 (Compound A) in a KRAS mutant cell line (DLD1).
  • Figure 1f is a diagram showing the results of confirming the dose-dependent autophagy activation of Example 1 (Compound A) in a KRAS mutant cell line (A549).
  • Figure 1g is a diagram comparing the relative amount of LC3 II among the results of immunoblotting analysis of Example 1 (Compound A) in the KRAS mutant cell line (A549) of Figure 1f.
  • Figure 1h is a diagram showing the result of confirming the dose-dependent autophagy activation of Example 2 (Compound B) in a KRAS mutant cell line (H23).
  • FIG. 1i is a diagram comparing the relative amount of LC3 II among the results of immunoblotting analysis of Example 2 (Compound B) in the KRAS mutant cell line (H23) of FIG. 1h.
  • Figure 1j is a diagram showing an immunocytochemical analysis image of Example 1 (compound A) inducing p62 aggregate formation in a KRAS mutant cell line (H23) (Scale bars, 10 ⁇ m.)
  • Figure 2a is a diagram showing the results of immunoblotting analysis for confirming RAS protein degradation of Example 1 (Compound A) in KRAS mutant human cancer cell line (H23).
  • Figure 2b is a diagram comparing the relative amount of KRAS among the results of immunoblotting analysis of Example 1 (Compound A) in the KRAS mutant cell line (H23) of Figure 2a.
  • Figure 2c is a diagram comparing the relative amount of NRAS among the results of immunoblotting analysis of Example 1 (Compound A) in the KRAS mutant cell line (H23) of Figure 2a.
  • Figure 2d is a diagram showing the results of immunoblotting analysis for confirming RAS protein degradation of Example 1 (Compound A) in KRAS mutant human cancer cell line (DLD1).
  • Figure 2e is a diagram comparing the relative amount of KRAS among the results of immunoblotting analysis of Example 1 (Compound A) in the KRAS mutant cell line (DLD1) of Figure 2d.
  • Figure 2f is a diagram comparing the relative amount of NRAS among the results of immunoblotting analysis of Example 1 (Compound A) in the KRAS mutant cell line (DLD1) of Figure 2d.
  • Figure 2g is a diagram showing the results of immunoblotting analysis for confirming RAS protein degradation of Example 1 (Compound A) in KRAS mutant human cancer cell line (A549).
  • FIG. 2i is a diagram comparing the relative amount of NRAS among immunoblotting analysis results of Example 1 (Compound A) in the KRAS mutant cell line (A549) of FIG. 2g.
  • Figure 2j is a diagram showing the results of immunoblotting analysis for confirming RAS protein degradation of Example 2 (Compound B) in KRAS mutant human cancer cell line (H23).
  • FIG. 2k is a diagram comparing the relative amount of KRAS among the results of immunoblotting analysis of Example 2 (Compound B) in the KRAS mutant cell line (H23) of FIG. 2j.
  • FIG. 2l is a diagram comparing relative amounts of NRAS among immunoblotting analysis results of Example 2 (Compound B) in the KRAS mutant cell line (H23) of FIG. 2j.
  • Figure 2m is a diagram showing the results of confirming the RAS degradation efficacy induced by Example 1 (Compound A) for each culture time period.
  • Figure 2n is a diagram showing the results of confirming the induced RAS decomposition efficiency of Comparative Example 1 (ATL) for each culture time period.
  • Figure 2o is a diagram showing the results of confirming the RAS decomposition efficiency induced by Comparative Example 2 (Abd-7) by culture time period.
  • Figure 2p is a diagram showing the results of confirming the cell viability of Example 1 (Compound A), Comparative Example 1 (ATL of Compound A), and Comparative Example 2 (TBL of Compound A) in the MRC5 cell line.
  • Figure 2q is a diagram showing the results of confirming the cell viability of Example 1 (Compound A), Comparative Example 1 (ATL of Compound A), and Comparative Example 2 (TBL of Compound A) in DLD1 cell line.
  • Figure 2r is a diagram showing the results of confirming the cell viability of Example 1 (Compound A), Comparative Example 1 (ATL of Compound A), and Comparative Example 2 (TBL of Compound A) in A549 cell line.
  • Figure 3a is a diagram showing the results of confirming whether RAS degradation induced by Example 1 (Compound A) regulates ERK signaling in A549 cell line.
  • Figure 3b is a diagram showing the results of confirming whether RAS degradation induced by Example 2 (Compound B) regulates ERK signaling in H23 cell line.
  • Figure 3c is a diagram showing the results of confirming whether RAS degradation induced by Example 1 (Compound A) regulates ERK signaling in A549 cell line over time.
  • Figure 3d is a diagram showing the results of confirming whether RAS degradation induced by Comparative Example 2 (TBL of Compound A) regulates ERK signaling in A549 cell line over time.
  • Figure 3e is a diagram showing the results of confirming whether RAS degradation induced by Comparative Example 1 (ATL of Compound A) regulates ERK signaling in A549 cell line over time.
  • Figure 4a is a diagram showing the results of confirming whether Example 1 (Compound A), Comparative Example 1 (ATL of Compound A) or Comparative Example 2 (TBL of Compound A) forms RAS-p62 aggregates for RAS degradation. (Scale bars, 10 ⁇ m).
  • Figure 4b is a diagram showing the results of confirming whether Example 1 (Compound A), Comparative Example 1 (ATL of Compound A) or Comparative Example 2 (TBL of Compound A) decomposes RAS through autophagy (Scale bars , 10 ⁇ m).
  • Figure 4c is a view showing the results confirming that Example 1 (Compound A)-induced inhibition of RAS downstream signaling was blocked by HCQ treatment, but restored by phosphorylation of ERK and phosphorylation of AKT.
  • Figure 4d is a diagram showing the results of immunoblotting analysis confirming whether Example 1 (Compound A) degrades RAS through autophagy.
  • Figure 5a is a diagram showing the results of confirming the KRAS G12S tumor growth inhibition of Example 1 (Compound A) in a mouse model through comparison of tumor sizes.
  • Figure 5b is a diagram showing the results of confirming the KRAS G12S tumor growth inhibition of Example 1 (Compound A) in a mouse model through comparison of tumor volume.
  • Figure 5c is a diagram showing the results of confirming the KRAS G12S tumor growth inhibition of Example 1 (Compound A) in a mouse model through comparison of tumor weight.
  • Figure 5d is a view showing the results of confirming the KRAS G12S tumor growth inhibition of Comparative Example 2 (TBL of Compound A) in a mouse model through comparison of tumor sizes.
  • Figure 5e is a diagram showing the result of confirming the KRAS G12S tumor growth inhibition of Comparative Example 2 (TBL of Compound A) in a mouse model through comparison of tumor volume.
  • Figure 5f is a diagram showing the result of confirming the KRAS G12S tumor growth inhibition of Comparative Example 2 (TBL of Compound A) in a mouse model through comparison of tumor weight.
  • Figure 5g is a diagram showing the results of confirming the KRAS G12S tumor growth inhibition of Comparative Example 1 (ATL of Compound A) in a mouse model through comparison of tumor sizes.
  • Figure 5h is a diagram showing the results of confirming the KRAS G12S tumor growth inhibition of Comparative Example 1 (ATL of Compound A) in a mouse model through comparison of tumor weight.
  • Figure 5i is a diagram showing the results of immunoblotting analysis to confirm whether RAS degradation of Example 1 (Compound A) is inhibited in tumors.
  • Figure 5j is a diagram showing the results of immunoblotting analysis to confirm whether RAS downstream signaling of Example 1 (Compound A) is inhibited in tumors.
  • Figure 5k is a diagram showing the results of immunohistochemical analysis to confirm that RAS degradation and downstream signaling of Example 1 (Compound A) are inhibited in tumors.
  • Figure 6a is a diagram showing an experimental plan for examining the tumor growth inhibitory effect of Example 2 (Compound B) in a mouse model.
  • Figure 6b is a diagram showing the results of confirming the KRAS G12S tumor growth inhibition of Example 2 (Compound B) in a mouse model through comparison of tumor sizes.
  • Figure 6c is a diagram showing the result of confirming the KRAS G12S tumor growth inhibition of Example 2 (Compound B) in a mouse model through comparison of tumor volume.
  • Figure 6d is a diagram showing the results of confirming the KRAS G12S tumor growth inhibition of Example 2 (Compound B) in a mouse model through comparison of tumor weight.
  • An embodiment of the present disclosure includes an autophagy-targeting ligand (ATL) having a structure of Formula 1 below and a target-binding ligand (TBL) having a structure of Formula 2 below.
  • R 1 and R 2 are, independently, hydrogen or fluoro
  • R 3 is -(CH 2 )- or -O-(CH 2 )-CH(OH)-(CH 2 )-, wherein -O-(CH 2 )-CH(OH)-(CH 2 )- O is bonded to the benzene ring.
  • the "salt” may be a pharmaceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable means approval by the government or a regulatory agency equivalent thereto that can be used in animals, more specifically in humans, by avoiding significant toxic effects when used in normal medicinal dosages. Received, approved, or recognized as being listed in a pharmacopeia or other general pharmacopeia.
  • the salt may include, for example, an acid addition salt, a base addition salt, and an amino acid salt.
  • inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate and phosphate
  • organic acid salts such as citrate, oxalate, acetate, formate, propionate, benzoate, trifluoroacetate, maleate, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate and p-toluenesulfonate
  • inorganic base salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, copper salt, zinc salt, aluminum salt and ammonium salt
  • organic base salts such as triethylammonium salt, triethanolammonium salt, pyridinium salt, and diisopropylammonium salt
  • amino acid salts such as lysine salt, arginine salt, histidine salt, aspartate, and glutamate.
  • Steps as used herein means in particular optical isomers (eg, essentially pure enantiomers, essentially pure diastereomers or mixtures thereof), as well as conformational isomers. Conformation isomers (i.e. isomers that differ only in the angle of one or more chemical bonds), position isomers (particularly tautomers) or geometric isomers (e.g. cis-trans isomers) include As used herein, "essentially pure”, e.g., when used in reference to enantiomers or diastereoisomers, contains at least about 90%, preferably at least about 95%, of the specific compound exemplified by the enantiomer or diastereomer. , more preferably at least about 97% or at least about 98%, even more preferably at least about 99%, even more preferably at least about 99.5% (w/w).
  • hydrate means a compound in which water is bound, and is a broad concept including an inclusion compound having no chemical bonding force between water and the compound.
  • solvate refers to a higher order compound formed between solute molecules or ions and solvent molecules or ions.
  • the linker is P-(CH 2 CH 2 O) x -(CH 2 ) 4 -CONH-CH 2 -Q, wherein P is bonded to -OH of the autophagy-targeting ligand (ATL). And, the Q is bonded to the carbon of 1,4-dioxane of the target-binding ligand (TBL), and the x may be an integer of 2 or 3.
  • the conjugate compound may have a structure of Formula 3 below.
  • R 1 and R 2 are, independently, hydrogen or fluoro
  • R 3 is -(CH 2 )- or -O-CH 2 -CH(OH)-CH 2 -, wherein O in -O-CH 2 -CH(OH)-CH 2 - is bonded to the benzene ring;
  • the conjugate compound is 1-(3,4-bis(benzyloxy)phenyl) -N -((8-(5-((4-((dimethylamino)methyl represented by Formula 4 below) )phenyl)amino)-6-methoxypyridin-2-yl)-2,3-dihydrobenzo[ b ][1,4]dioxin-2-yl)methyl)-5,8,11-trioxa- 2-Azahexadecane-16-amide (1-(3,4-bis(benzyloxy)phenyl) -N -((8-(5-((4-((dimethylamino)methyl)phenyl)amino)-6- methoxypyridin-2-yl)-2,3-dihydrobenzo[ b ][1,4]dioxin-2-yl)methyl)-5,8,11-trioxa-2-azahexadecan-16-amide, compound A) or Represente
  • the compound in which the autophagy-targeting ligand and the target-binding ligand are conjugated a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof target cleavage of active RAS.
  • RAS can be a RAS target degrader that can
  • the autophagy targeting ligand when RAS binds to the target-binding ligand, another ligand of the conjugate compound, the autophagy targeting ligand, binds to the ZZ domain of p62 and induces p62 oligomerization to induce autophagy degradation.
  • p62 forms an oligomerization with RAS, RAS is biologically inactivated and sequestered in autophagosomes.
  • RAS-AUTOTACs can inhibit downstream signaling activation from the p62 aggregate formation step to autophagic degradation of RAS.
  • the RAS-AUTOTAC is a compound that first demonstrated efficacy in an animal model using a target degradation platform, and the present disclosure uses RAS as a 'druggable target' to prevent and improve RAS mutation-derived cancer Or it may provide a new approach to treatment.
  • the present disclosure can provide a composition for target decomposition of active RAS, comprising the above-described conjugate compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof as an active ingredient. there is.
  • the present disclosure provides a composition for preventing, improving or treating cancer, comprising the above-described conjugate compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof as an active ingredient. can do.
  • the present disclosure provides the use of the above-described conjugate compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof for the preparation of a composition for target degradation of active RAS.
  • the present disclosure provides the use of the above-described conjugate compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof for the preparation of a composition for preventing, improving or treating cancer. can provide
  • the present disclosure provides an active RAS comprising administering an effective amount of the above-described conjugate compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof to a subject in need thereof. It is possible to provide a target degradation method of As yet another embodiment, the present disclosure provides an effective amount of the above-described conjugate compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof for cancer treatment comprising administering to a subject in need thereof. Preventive, ameliorative or therapeutic methods may be provided.
  • the present disclosure provides the use of the above-described conjugate compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof as an active ingredient for target degradation of oncogenically active RAS. can do.
  • the present disclosure provides the use of the above-described conjugate compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof as an active ingredient for preventing, improving or treating cancer. can do.
  • the composition may be for targeted cleavage of an oncogene.
  • the cancer may be a cancer derived from a RAS mutation.
  • the RAS may be one or more of KRAS, NRAS, and HRAS.
  • the cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC), colon cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, ovarian cancer, prostate cancer, breast cancer, lymphoma, leukemia, melanoma, thyroid cancer, multiple It may include at least one selected from the group consisting of myeloma, cervical cancer, bladder cancer, urethral cancer, renal cancer, and hepatocellular carcinoma.
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • colon cancer cancer
  • colorectal cancer pancreatic cancer
  • gastric cancer gastric cancer
  • ovarian cancer prostate cancer
  • breast cancer breast cancer
  • lymphoma leukemia
  • melanoma thyroid cancer
  • multiple It may include at least one selected from the group consisting of myeloma, cervical cancer, bladder cancer, urethral cancer, renal cancer, and hepatocellular carcinoma.
  • the cancer may include one or more selected from the group consisting of KRAS G12C lung cancer, KRAS G13D colon cancer, and KRAS G12S lung cancer.
  • the conjugate compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof may be 0.01 to 100 ⁇ M based on the total volume of the composition.
  • the conjugate compound, its pharmaceutically acceptable salt, its stereoisomer, its hydrate or its solvate is 0.01 ⁇ M or more, 0.1 ⁇ M or more, 0.5 ⁇ M or more, 0.6 ⁇ M or more, or 0.7 ⁇ M based on the total volume of the composition.
  • the dosage of the composition will vary depending on the age, sex, and weight of the subject to be treated, the specific disease or pathological condition to be treated, the severity of the disease or pathological condition, the route of administration, and the prescriber's judgment. Determination of dosage based on these factors is within the skill of the art. As an example, the dosage of the active ingredient, the conjugate compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof may be 0.1 to 1000 mg/kg/day.
  • the dosage of the active ingredient, the conjugate compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a hydrate thereof, or a solvate thereof is 0.1 mg/kg/day or more, 0.5 mg/kg/day or more, 1 mg/kg/day or more, 2 mg/kg/day or more, 3 mg/kg/day or more, 4 mg/kg/da or more, 5 mg/kg/day or more, 6 mg/kg/day or more, 7 mg /kg/day or more, 8 mg/kg/day or more, 9 mg/kg/day or more, 10 mg/kg/day or more, 11 mg/kg/day or more, 12 mg/kg/day or more, 13 mg/kg /day or more, 14 mg/kg/day or more, 15 mg/kg/day or more, 20 mg/kg/day or more, 30 mg/kg/day or more, 40 mg/kg/day or more, 50 mg/kg/day More than 60 mg/kg/day, more than 70 mg/kg/day,
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain pharmaceutical adjuvants such as preservatives, stabilizers, hydration or emulsification accelerators, salts and/or buffers for osmotic pressure control, and other therapeutically useful substances.
  • the pharmaceutical composition may be an oral administration agent, for example, tablets, pills, hard and soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, powders, powders, fine granules, There are granules, pellets, etc.
  • These formulations contain, in addition to the active ingredient, surfactants, diluents (e.g.
  • Tablets may also contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and polyvinylpyrrolidine, optionally starch, agar, alginic acid or its sodium salt. It may contain pharmaceutical additives such as disintegrants, absorbents, colorants, flavoring agents, and sweeteners.
  • the tablets may be prepared by conventional mixing, granulation or coating methods.
  • the pharmaceutical composition may be a parenteral administration agent
  • the parenteral administration agent may be a formulation for rectal, topical, subcutaneous, or transdermal administration.
  • it may be a formulation such as an injection, drops, ointment, lotion, gel, cream, spray, suspension, emulsion, suppository, patch, etc., but is not limited thereto.
  • the composition may be a food composition.
  • it can be processed into functional foods such as fermented milk, cheese, yogurt, juice, probiotics and health food containing the active ingredient, and can be used in the form of various other food additives.
  • the composition may be a composition for health food.
  • the health food composition may be formulated into a pill, capsule, tablet, granule, caramel or drink.
  • it may be processed in the form of a liquid, powder, granule, tablet or tea bag.
  • the composition may be administered in a variety of ways, such as simple drinking, injection, spray, or squeeze.
  • the composition may contain other components and the like that can give a synergistic effect to the main effect within a range that does not impair the main effect of the present disclosure.
  • additives such as fragrances, pigments, bactericides, antioxidants, preservatives, moisturizers, thickeners, inorganic salts, emulsifiers, and synthetic polymers may be further included to improve physical properties.
  • auxiliary components such as water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, high-molecular peptides, high-molecular polysaccharides, and seaweed extract may be further included.
  • the components may be appropriately selected and blended by a person skilled in the art according to the formulation or purpose of use, and the amount of addition may be selected within a range that does not impair the purpose and effect of the present disclosure.
  • the amount of the components added may be 0.0001 wt% to 99.99 wt% based on the total weight of the composition.
  • Nt-Arginylation mediates protein degradation through autophagy, and the UPS is specific to the type of N-lycognin.
  • Nt-arginylation binds to p62, the autophagy N-lycognin, through the ZZ domain of p62, leading to p62 oligomerization and activation of autophagy.
  • the present inventors have developed a p62 ZZ ligand capable of mimicking Nt-Arg that binds to the ZZ domain of p62 and activates autophagy.
  • the autophagy-targeting ligand included in the RAS-AUTOTAC is a variable p62 ligand exhibiting further improved autophagy activating efficacy and cell cytotoxicity, and is 2-((3, 4-bis(benzyloxy)benzyl)amino)ethan-1-ol (2-((3,4-bis(benzyloxy)benzyl)amino)ethan-1-ol) and (R)-1, the ATL of compound B -(3,4-bis((4)-fluorobenzyl)oxy)phenoxy)-3-((2-hydroxyethyl)amino)propan-2-ol((R)-1-(3,4 -bis((4)-fluorobenzyl)oxy)phenoxy)phenoxy
  • the target-binding ligand included in the RAS-AUTOTAC is specifically for RAS by van der Waals interaction near the switch I region having an in vitro Kd of 50 nM and high affinity.
  • the target-binding ligand according to the above embodiment can prevent RAS effector interaction and RAS-dependent signaling through reversible binding to RAS (Quevedo et al., 2018).
  • Lumakras Food and Drug Administration (FDA) approved Lumakras as the first treatment for KRAS G12C mutant NSCLC patients, but KRAS G12C mutations account for only 15% of KRAS mutant cancers, and the G12C ligand is bound to GDP. Other ligands with affinity for KRAS mutations should be investigated as they can bind in an inactive state.
  • FDA Food and Drug Administration
  • PROTACs PROteolysis-TArgeting Chimeras
  • the following study demonstrated endogenous RAS degradation and downstream regulation using protac compounds, but this was limited to cancer cell lines only in vitro and did not extend to in vivo experiments (Bond et al., 2020).
  • these studies use the G12C ligand, which has limited use in 15% of KRAS mutant arms with TBL.
  • PROTACs showed technical difficulties in forming the substrate-PROTAC-E3 ternary complex and variable E3 ligase showed tissue-selective expression.
  • UPS the base of PROTAC
  • AUTOTAC is based on an autophagy degradation system, but autophagy has large-scale degradation and does not require substrate-p62 or LC3 complex formation for degradation.
  • RAS-AUTOTAC a bifunctional ligand in which ATL and TBL regions are conjugated using p62 ZZ ligand as ATL and Abd-7 as TBL according to an embodiment of the present disclosure, is a novel approach to the treatment of RAS mutant cancer
  • p62 binds to the ATL domain, it exposes the PB1 domain for aggregate formation with RAS bound to the TBL domain and exposes the LIR domain for targeting RAS to the autophagic membrane.
  • RAS-AUTOTACs can inhibit tumor growth as well as in vitro, which is the first result of an animal model using a micromolecule-based targeted degradation platform.
  • ATL ATL compound A for compound A
  • TBL TBL
  • Example ID chemical name One compound A 1-(3,4-bis(benzyloxy)phenyl) -N -((8-(5-((4-((dimethylamino)methyl)phenyl)amino)-6-methoxypyridin-2-yl) -2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-2-yl)methyl)-5,8,11-trioxa-2-azahexadecane-16-amide (1-(3, 4-bis(benzyloxy)phenyl) -N -((8-(5-((4-((dimethylamino)methyl)phenyl)amino)-6-methoxypyridin-2-yl)-2,3-dihydrobenzo[ b ] [1,4]dioxin-2-yl)methyl)-5,8,11-trioxa-2-azahexadecan-16-amide) 2 compound B ( 2R )-1-(3,4-bis((4
  • T5 (1 g, 2.37 mmol) in DCM (20 mL) was added TEA (479 mg, 4.74 mmol) and MsCl (326 mg, 2.84 mmol) dropwise at 0 °C.
  • TEA 479 mg, 4.74 mmol
  • MsCl 326 mg, 2.84 mmol
  • the reaction mixture was stirred at 0 °C for 2 hours.
  • the solution was quenched with water at 0 °C and extracted with DCM.
  • the combined organic layers were washed with brine, dried over Na 2 SO 4 and concentrated to give T6 (1.1 g) as a yellow solid.
  • T8 (6-(3-(aminomethyl)-2,3-dihydrobenzo[ b ][1,4]dioxin-5-yl) -N- (4-((dimethylamino) in DMF (10 mL)
  • DIEA diisopropylethylamine
  • HATU 1-[ Bis(dimethylamino)methylene] -1H -1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate, CAS number: 148893-10-1, 346 mg, 0.91 mmol ) was added.
  • HeLa cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; ThermoFisher, 11995073, Carlsbad, CA, USA, www.thermofisher.com) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, -), MRC-5 cells were cultured in Eagle's minimum essential medium supplemented with 10% FBS, and A549, DLD-1, H23 and H358 cells were cultured in RPMI supplemented with 10% FBS in a standard 5% CO 2 incubator.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • MRC-5 cells were cultured in Eagle's minimum essential medium supplemented with 10% FBS
  • A549, DLD-1, H23 and H358 cells were cultured in RPMI supplemented with 10% FBS in a standard 5% CO 2 incubator.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the membrane was prepared in standard PBST (phosphate buffered saline) with 5% skim milk (Becton Dickinson, 232100, Franklin Lakes, NJ, USA, www.bd.com) or 5% BSA (Biosesang, AC1025, Seongnam-si, Gyeonggi-do, Korea, biosesang.com). (PBS) and 0.1% Tween 20) wash buffer for 1 hour, then incubated with primary antibodies in skim milk or BSA for 1 hour at room temperature or overnight at 4°C, washed three times for 10 minutes in PBST buffer and incubated for 1 hour with the secondary antibody in PBST.
  • PBST phosphate buffered saline
  • skim milk Becton Dickinson, 232100, Franklin Lakes, NJ, USA, www.bd.com
  • BSA Biosesang, AC1025, Seongnam-si, Gyeonggi-do, Korea, biosesang.com
  • Cells were cultured on coverslips coated with poly-L-lysine (Sigma) to observe cellular localization of proteins. Cells were fixed for 15 minutes at room temperature using 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7.4) and washed three times with PBS. After fixation, cells were permeabilized with 0.5% Triton X-100 in PBS solution for 15 minutes and washed three times with PBS. The cells were blocked in a PBS solution containing 2% BSA for 1 h at room temperature. Then, the cells were incubated overnight at 4° C.
  • the present inventors found that the TBL region of the conjugate compound according to an embodiment of the present disclosure, namely RAS-AUTOTACs, binds to RAS and the ATL region binds to p62 to induce p62 oligomerization and targeting to autophagosomes, thereby inducing lysosomes. It was hypothesized that autophagy degradation of RAS was induced through fusion with (Fig. 1a). First, immunoblotting analysis was performed to investigate whether RAS-AUTOTACs activate autophagy in normal cells. HeLa cells were cultured for 24 hours with Comparative Example 1 (Compound A ATL alone) or Example 1 (Compound A).
  • MRC5 cells were cultured for 24 hours in FBS-free medium with Example 1 (Compound A) and cultured for 10 minutes in EGF 50 ng/ml condition. At this time, the content of Example 1 was 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 or 3 ⁇ M, respectively.
  • Immunoblotting analysis in Hela cells treated with Comparative Example 1 (ATL of Compound A alone) or Example 1 (Compound A) showed that Compound A stabilized p62 and increased LC3 lipidation in a dose-dependent manner. It was shown to form moths (Figs. 1b and 1c).
  • Example 1 Compared to Comparative Example 1 (ATL of Compound A alone), Example 1 (Compound A) has a more enhanced autophagy activation potency that promotes active autophagosome formation by resulting in RAS-AUTOTACs recruit cargo RAS. showed up
  • the dose-dependent autophagy activation of Example 1 (Compound A) was also observed in various KRAS mutant human cell lines, H23 (KRAS G12C lung cancer), DLD1 (KRAS G13D colon cancer) and A549 (KRAS G12S lung cancer) cells (FIG. 1d to FIG. 1g).
  • Example 1 Compound A
  • Fig. 1j Figure 1j is an image of H23 cells cultured for 24 hours in a medium supplemented with Example 1 (Compound A).
  • Example 1 (Compound A) induced endogenous KRAS degradation in H23 G12C KRAS mutant human lung cancer cells, DLD1 G13D KRAS mutant human colorectal cancer cells and A549 G12S KRAS mutant human lung cancer cells with a DC 50 of 0.7 - 1.2 ⁇ M (Fig. 2a). to Figure 2i).
  • Fig. 2a Compound A
  • Figure 2i Compound 2a
  • degradation of other RAS subtypes of the target-binding ligand used as an example in this disclosure was confirmed.
  • Example 1 degraded NRAS as well as KRAS in various KRAS mutant cell lines with a DC 50 of 0.7 - 1.5 ⁇ M.
  • Example 2 also showed KRAS and NRAS degradation with a DC 50 of 0.6 ⁇ M for KRAS and 1.2 ⁇ M for NRAS ( FIGS. 2J-2L ).
  • Example 1 Comparative Example 1
  • Comparative Example 2 TBL alone of Compound A; Abd-7
  • KRAS and NRAS degradation reached their peak within 24 hours, and RAS protein levels were recovered within 48 hours (FIG. 2m).
  • Example 1 In order to investigate whether RAS degradation is induced by Example 1 (Compound A), RAS degradation was compared with ATL and TBL treatment alone (Comparative Example 1 and Comparative Example 2), and as a result, ATL and TBL treatment alone It did not induce degradation (Figs. 2n and 2o). As a result of checking cell viability in various cell lines to determine whether RAS degradation causes cytotoxicity, treatment with ATL or TBL alone showed relatively high IC 50 in MRC5, DLD1 and A549 cell lines and compared with normal cell lines, KRAS mutant cell lines.
  • Example 1 shows higher cytotoxicity than ATL or TBL in MRC5 (3.9 ⁇ M), DLD1 (2.0 ⁇ M), and A549 (2.6 ⁇ M) within 72 hours (FIGS. 2p to 2r and Table 2). 2), which also showed slightly higher toxicity against KRAS mutant cell lines.
  • Example 1 has relatively high toxicity to normal cells, this toxicity needs to be investigated in a future study.
  • Example 1 Comparative Example 1 (ATL alone of Compound A) Comparative Example 2 (Compound A alone in TBL) MRC5 3.9 6.4 10.5 DLD1 2.0 17.1 13.2 A549 2.6 18.3 19.8
  • Example 1 Compound A
  • Example 2 Compound B
  • Example 1 completely inhibited Akt phosphorylation and ERK and MEK phosphorylation at 2.5 ⁇ M treatment for 4 hours (FIG. 3c), which was shown in Comparative Example 2 (Compound A alone in TBL) at 20 ⁇ M. was (Fig. 3d). That is, the efficacy of Example 1 (Compound A) for inhibiting RAS signaling lasted up to 24 hours, but Comparative Example 2 (Compound A alone in TBL) did not (FIGS. 3c and 3d). In the case of Comparative Example 2, inhibition was not seen only at high concentration for 4 hours, and when treated at low concentration and for a long time, this is because TBL itself has low in vivo activity or problems such as tolerance. Comparative Example 1 (ATL alone of Compound A) did not affect the downstream signal of RAS (FIG. 3e). These data demonstrate that RAS target degradation has a further improved RAS signaling inhibition potency.
  • the present inventors confirmed that the autophagy-targeting ligand binds to the ZZ domain of p62, forms aggregates through the PB1 domain, and targets the autophagosome through the LIR domain.
  • Data in the present disclosure showed that RAS was degraded within 24 hours after Example 1 (Compound A) treatment, whereas the downstream was inhibited for 4 hours prior to degradation (FIGS. 2M and 3C).
  • FIGS. 2M and 3C To examine whether p62 aggregate formation induces RAS inhibition, immunocytochemistry was performed using RAS and p62 antibodies.
  • A549 cell line cultured for 24 hours in a medium excluding FBS was treated with Example 1 (Compound A), cultured for 4 hours, and 50 ng/ml of EGF was added and further cultured for 10 minutes, followed by immobilization.
  • Example 1 Comparative Example 1 (Compound A alone with ATL) or Comparative Example 2 (Compound A with TBL alone) in the same manner, p62 did not form aggregates well and was not colocalized with RAS.
  • RAS-AUTOTAC a conjugate compound according to an embodiment of the present disclosure, induces p62 oligomerization with RAS and that RAS is biologically inactivated prior to degradation.
  • Example 1 (Compound A) degrades RAS through autophagy.
  • Example 1 Compound A
  • HCQ hydroxychloroquine
  • Example 1 (Compound A) induced RAS aggregation and was colocalized with autophagosomes, whereas Comparative Example 1 (Compound A alone with ATL) or Comparative Example 2 (Compound A with TBL alone) treated It was not (Fig. 4b). Immunoblotting analysis showed that RAS degradation was blocked upon treatment with the autophagy inhibitor hydroxychloroquine (HCQ) (FIG. 4c). In addition, Example 1 (Compound A)-induced inhibition of RAS downstream signaling was blocked upon treatment with HCQ It was shown that phosphorylation of ERK and phosphorylation of AKT were restored again (Fig. 4c). When autophagy flux was inhibited, Example 1 (Compound A) induced RAS aggregation did not degrade and colocalized with p62 aggregation (Fig. 4d).
  • HCQ hydroxychloroquine
  • RAS-AUTOTAC a conjugate compound according to an embodiment of the present disclosure, degrades RAS through autophagy.
  • Example 1 Compound A or vehicle (DMSO) was treated by intravenous (IV) injection for 3 weeks and sacrificed one day after the final injection.
  • Example 1 Compound A
  • Example 1 inhibited G12S KRAS tumor growth, indicating changes in tumor volume and tumor weight (FIGS. 5a to 5c).
  • Example 1 Compound A
  • RAS protein was newly expressed during one day, which correlated with the recovery of RAS degradation shown in FIG. 2M.
  • signaling proteins there were no differences in RAS levels.
  • the present inventors subcutaneously inoculated A549 KRAS G12S cells (5 ⁇ 10 6 ) into 10-week-old SCID mice, and injected on the 12th day after inoculation. started (Fig. 6a).
  • Example 2 (Compound B) or vehicle (DMSO) 5 times a week for 4 weeks and sacrificed 6 hours after the final injection.
  • Example 2 (Compound B) inhibited G12S KRAS tumor growth as indicated by tumor volume and tumor weight (FIG. 6B-D).
  • conjugate compound according to one embodiment of the present disclosure inhibits tumor growth, which is the first result showing in vivo efficacy using a small molecule-based RAS targeted degradation platform.

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Abstract

본 명세서는 p62 올리고머화 및 표적화된 오토파고좀(autophagosome)을 유도하고 최종적으로 리소좀 분해를 통해 RAS를 표적 분해할 수 있는 신규 콘쥬게이트 화합물을 제공한다. 본 개시에 따른 콘쥬게이트 화합물은 표적 분해 시스템을 통한 종양 억제를 보여주는 최초의 생체 내 실험인 마우스 이종이식 모델(mouse Xenograft model)에서 종양 성장을 억제할 수 있다. 따라서, 본 개시는 RAS 돌연변이 유래 암을 치료할 수 있는 가능성과 새로운 접근법을 제공한다.

Description

RAS의 표적 분해를 위한 화합물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 8월 2일자로 출원된 미국 임시특허출원 제63/228,199호에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원 내용 전체가 본 출원에 참조로서 통합된다.
국가지원 연구개발에 대한 설명
본 연구는 한국과학기술정보통신부의 지원으로 서울대학교의 주관 하에 수행되었으며, 연구명은 N-데그론 경로의 기능 및 메커니즘이다(연구관리기관: 한국연구재단, 연구과제번호: 2021R1A2B5B03002614, 총 연구 기간: 2021.03.01 ~ 2026.02.28, 현재 연구 기간: 2021.03.01 ~ 2022.02.28).
기술분야
본 명세서는 종양유전자 활성 RAS의 표적 분해를 위한 신규 화합물에 관하여 기술한다.
RAS는 세포 주기 진행, 전사, 세포 생존, 소포 수송 및 칼슘 신호 전달을 포함한 다양한 신호 전달 경로를 조절하는 작은 GTPase 단백질이다. 일반적으로 RAS 상태는 GDP 결합 비활성 상태와 GTP 결합 활성 상태 사이에서 순환된다. GDP와 GTP 결합 사이의 전환은 GDP를 GTP와 교환하는 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 단백질(guanine nucleotide exchange factor proteins; GEF) 및 GTP와 GDP를 교환하는 GTPase 활성화 단백질(GTPase activating proteins; GAP)에 의해 매개된다. GEF 및 GAP 단백질은 GAP의 경우 스위치 I(잔기 30-38)이라고 하는 RAS의 결합 포켓에 결합하고 GEF의 경우 스위치 II(잔기 59-76)에 결합하여 GDP- 또는 GTP- 결합 상태 사이의 전환을 초래한다. 90%의 상동성을 갖는 N-말단 G 도메인과 8%의 상동성을 갖는 C-말단 초가변 영역으로 구성된 RAS 단백질은 4개의 RAS 아형(HRAS, NRAS, KRAS4A 및 KRAS4B) 사이의 가변성을 초래한다.
RAS는 모든 암의 27%에서 발생하는 암에서 가장 일반적인 돌연변이 종양유전자(oncogene)이다(Hobbs et al., 2016). RAS 아형(isoform) 중에서 KRAS는 인간 암에서 가장 빈번한 돌연변이 종양유전자(85%)이며, 그 다음으로는 NRAS(11%) 및 HRAS(4%)가 있다. RAS 종양유전자 돌연변이는 주로 GTP 결합 도메인의 잔기 G12, G13 및 Q61에 위치한다. RAS 돌연변이는 GAP 매개 전이를 방해하여 GTP에 결합된 활성 RAS가 축적되어 다운스트림 신호 전달 및 제어되지 않는 세포 증식의 지속적인 활성화를 초래한다. RAS는 약물을 결합하는 홈(groove)이 없기 때문에 RAS가 종양유전자로 발견된 후 RAS를 표적으로 하는 약물을 개발하려는 시도는 많이 있었지만 RAS는 불가능한 표적으로 여겨졌다(Cox et al., 2014; Khan et al., 2020). RAS 신호 전달 경로의 업스트림에서 다운스트림으로의 지속적으로 유도된 RAS 신호 전달을 억제하는 치료적 접근과 함께 RAS의 직접적인 억제도 제안되었다(Moore et al., 2020). 전통적 약물에 의한 RAS 억제가 계속해서 임상시험에서 실패하면서 많은 과학자들이 RAS 돌연변이에서 암 원인을 치료하는 다른 방법을 찾고 있다. KRAS의 G12C에서 약간의 포켓(pocket)을 발견하고 이 포켓에 결합하는 억제제가 개발되었다(Ostrem et al., 2013). 이 G12C 특이적 억제제는 GTP 결합 활성 상태로의 전환을 방해하는 GDP가 결합된 G12C KRAS에 공유 결합한다. G12C 포켓의 발견으로 변형된 G12C 억제제가 발명되었으며, 그 중 ARS-1620은 마우스 이종이식 모델에서 종양 퇴행을 보였고, 암젠(Amgen)의 AMG510과 미라티 테라퓨틱스(Mirati Therapeutics)의 MRTX849가 개발되어 임상 시험 중이다(Canon et al., 2019; Fell et al., 2020; Janes et al., 2018). G12C 특이적 억제제에 관한 발견에도 불구하고 G12C 돌연변이는 RAS 돌연변이 암의 15%만으로 제한되었으며, 이는 다른 형태의 돌연변이 KRAS를 표적으로 하는 억제제가 조사되어야 함을 의미한다(Ryan and Corcoran, 2018).
최근 PROTAC(PROteolysis-TArgeting Chimeras)를 통한 표적 분해에 기반한 새로운 접근 방식이 발명되어 RAS 표적 분해에 사용되었다. PROTAC은 유비퀴틴 프로테아좀 시스템(Ubiquitin Proteasome System; UPS)을 사용하여 표적 결합제를 E3 리가아제 결합제에 연결하는 표적 분해 플랫폼이다(Zou et al., 2019). PROTAC은 유비퀴틴화된 표적 기질에 결합하고, 유비퀴틴화된 단백질은 프로테아좀에 의해 인식되고 분해된다. 여러 연구는 PROTAC이 세포 수준에서 RAS 분해를 매개하며, 이는 몇 가지 제한이 있고 생체 내 실험을 나타내지 않았음을 보고하였다(Bond et al., 2020; Zeng et al., 2020). 따라서 PROTAC의 핵심인 UPS는 제한된 분해 능력, 기질-E3 리가아제 조합을 제한하는 E3 리가아제 유형, 좁은 프로테아좀 기공 크기 및 유비퀴틴화되는 표적 단백질의 라이신 잔기의 요구로 인한 기질의 크기 제한을 보여준다(Schapira et al., 2019). 따라서 PROTAC를 사용하여 RAS를 분해하는 이전 연구는 RAS 돌연변이 암에서 암 원인의 단지 15%만을 제한하는 G12C 돌연변이 KRAS로 제한되었다(Ryan and Corcoran, 2018).
진핵생물에서 단백질 항상성은 단백질 품질 관리(Protein Quality Control; PQC)를 통해 체계적으로 유지된다. 병리학적 단백질로 발전될 수 있는 잘못 접히고(misfolded) 펴지지 않은(unfolded) 단백질은 적절하게 분해되거나 변형되어야 한다(Chen et al., 2011). 병원성 단백질이 질병으로 발전하는 것을 피하기 위하여, 두 가지 분해 시스템인 UPS와 오토파지(autophagy)가 상보적으로 단백질 분해를 조절한다(Ji and Kwon, 2017; Kocaturk and Gozuacik, 2018). UPS에서, 가용성이면서 수명이 짧은 단백질은 E1, E2 및 E3 리가아제에 의해 유비퀴틴화되고, 프로테아좀은 유비퀴틴화된 기질을 인식하고 프로테아좀을 통해 짧은 펩티드로 분해된다. 매크로오토파지(macroautophagy)에서, 기질은 자가포식소체(autophagosome)로 격리되고 리소좀과 융합하여 리소좀 분해를 일으킨다(Dikic and Elazar, 2018). UPS, 제한된 기질 크기 또는 E3 리가제 특이성과 달리, 오토파지는 기질 크기를 제한하지 않으며 세포 소기관 또는 응집체와 같은 상대적으로 더 큰 기질을 분해할 수 있다.
N-데그론(N-degron) 경로에서, N-데그론이라고 하는 C-말단 단편의 특정 유형 N-말단 아미노산은 분해의 결정인자로 작용하며, N-리코그닌(N-recognin)에 의해 인식되어 단백질 분해를 유도한다. 아르기닐화 매개 N-데그론 경로의 분기(branch)에서 N-말단 아미노산들인 Arg, Lys, His(1형), Phe, Tyr, Trp, Leu 및 Ile(2형)은 N-degron으로 기능한다(Tasaki et al., 2012). 그 중 Arg/N-데그론은 L-Arg의 Asp, Glu 또는 산화된 Cys로의 ATE1 R-전이효소(transferase)-매개 접합을 통해 생성될 수 있다(Kwon et al., 1999). Arg/N-데그론 경로는 UBR1, 2, 4 및 5와 같은 N-리코그닌, E3 리가아제에 의해 인식되는 N-데그론, UPS의 분기로 확인되었으며 프로테아좀 분해를 유도한다(Tasaki et al., 2005). 최근 본 발명자는 오토파지 어댑터 단백질 p62/SQSTM1/세퀴스토좀(sequestosome)-1이 N-리코그닌으로 작용한다는 것을 발견했다(Cha-Molstad et al., 2015). N-말단 아르기닐화와 p62의 ZZ 도메인의 결합은 p62 올리고머화 및 자가포식(오토파지) 활성화를 유도하여 리소좀 분해를 촉진한다. 따라서 본 발명자는 p62에 결합하고 활성화하여 결과적으로 오토파지를 활성화하는 Nt-Arg를 모방하는 p62 리간드를 개발했다. 상기 리간드의 사용은 잘못 접힌 단백질(misfolded proteins) 및 단백질 독성 응집체(proteotoxic aggregates)와 같은 병원성 단백질의 선택적 오토파지 분해를 보여준다(Cha-Molstad et al., 2017; Yoo et al., 2018).
본 발명자는 p62 ZZ 리간드(ATL, 오토파지 리간드)를 타겟 결합 리간드(TBL)에 연결하여 잘못 접힌 단백질의 분해를 위한 표적 분해 플랫폼으로 AUTOTAC(Autophagy-Targeting Chimera)를 개발했다(Ji el al, 2021). 표적 단백질이 AUTOTAC 화합물(AUTOTACs)의 TBL 영역에 결합하면 ATL 영역이 p62에 결합하여 표적 단백질이 오토파지를 표적으로 하여, 리소좀 분해를 촉진한다. 다른 리소좀 표적 분해 시스템과 달리, AUTOTACs는 p62 및 오토파지에 특이적으로 결합하고 활성화하는 ATL 영역을 통한 선택적 오토파지 능력을 기반으로 한다(Ji el al, 2021). AUTOTACs를 분해 플랫폼으로 사용하면, 일반 약물이나 PROTACs과 비교하여 약물 내성을 무시함과 동시에 분해 능력을 향상시키는 등 표적 분해 시스템의 이점을 적용할 수 있다.
일 관점에서, 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 RAS 돌연변이 유래 암을 치료할 수 있는 신규 화합물을 제공하는 것이다.
일 관점에서, 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 생체 내 실험인 마우스 이종이식 모델(mouse Xenograft model)에서 종양 억제를 보여주는 표적 분해 시스템을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 개시는 화학식 1의 구조를 갖는 오토파지-타겟팅 리간드(autophagy-targeting ligand; ATL) 및 화학식 2의 구조를 갖는 타겟-결합 리간드(target-binding ligand; TBL)를 포함하고, 상기 오토파지-타겟팅 리간드의 -OH기와 상기 타겟-결합 리간드의 1,4-다이옥산의 탄소가 직접적으로, 또는 링커를 통하여 결합된 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 제공한다;
[화학식 1]
Figure PCTKR2022011268-appb-img-000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2022011268-appb-img-000002
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는, 독립적으로, 수소 또는 플루오로이고,
R3는 -(CH2)- 또는 -O-(CH2)-CH(OH)-(CH2)-이며, 여기서 -O-(CH2)-CH(OH)-(CH2)-의 O는 벤젠 고리에 결합된다.
다른 일 측면에서, 본 개시는 상기 일 측면에 따른 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
일 관점에서, 본 개시에 따른 상기 콘쥬게이트 화합물은 타겟-결합 리간드가 RAS에 결합하고 오토파지-타겟팅 리간드는 p62에 결합하여 p62 올리고머화 및 표적화된 오토파고좀(autophagosome)을 유도하고 최종적으로 리소좀 분해를 통해 RAS를 표적 분해할 수 있다. 오토파지를 통한 RAS의 표적화된 분해는 다운스트림 신호전달의 억제를 초래하므로, 전통적인 표적 분해 시스템과 달리 RAS는 비활성화되고 오토파지의 초기 단계인 p62 응집 단계에서 다운스트림 신호 전달 억제가 관찰되며, 이러한 효과는 RAS 분해로 유지될 수 있다. 또한 상기 콘쥬게이트 화합물은 표적 분해 시스템을 통한 종양 억제를 보여주는 최초의 생체 내 실험인 마우스 이종이식 모델(mouse Xenograft model)에서 종양 성장을 억제할 수 있다. 따라서, 본 개시는 RAS 돌연변이 유래 암을 치료할 수 있는 가능성과 새로운 접근법을 제공한다.
도 1a는 본 개시의 일 실시예에 따른 콘쥬게이트 화합물의 TBL 영역이 RAS에 결합하고 ATL 영역이 p62에 결합하여 p62 올리고머화 및 오토파고좀에 대한 표적화를 유도하여 리소좀과의 융합을 통해 RAS의 오토파지 분해를 유도하는 매커니즘을 도시한 모식도이다.
도 1b는 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독) 또는 실시예 1(화합물 A)로 처리된 Hela 세포에서의 면역블롯팅 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 도 1b의 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독) 또는 실시예 1(화합물 A)로 처리된 Hela 세포에서의 면역블롯팅 분석 결과 중 LC3 II의 상대량을 비교한 도로, x축의 1부터 9는 차례로 실시예 1의 처리농도 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2μM 및 비교예 1의 처리농도 0, 0.5, 2μM인 것을 의미한다.
도 1d는 KRAS 돌연변이 세포주(H23)에서의 실시예 1(화합물 A)의 용량 의존적 오토파지 활성화 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 1e는 KRAS 돌연변이 세포주(DLD1)에서의 실시예 1(화합물 A)의 용량 의존적 오토파지 활성화 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 1f는 KRAS 돌연변이 세포주(A549)에서의 실시예 1(화합물 A)의 용량 의존적 오토파지 활성화 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 1g는 도 1f의 KRAS 돌연변이 세포주(A549)에서의 실시예 1(화합물 A)의 면역블롯팅 분석 결과 중 LC3 II의 상대량을 비교한 도이다.
도 1h는 KRAS 돌연변이 세포주(H23)에서의 실시예 2(화합물 B)의 용량 의존적 오토파지 활성화 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 1i는 도 1h의 KRAS 돌연변이 세포주(H23)에서의 실시예 2(화합물 B)의 면역블롯팅 분석 결과 중 LC3 II의 상대량을 비교한 도이다.
도 1j는 KRAS 돌연변이 세포주(H23)에서 실시예 1(화합물 A)이 p62 응집 형성을 유도하는 것을 관찰한 면역세포화학 분석 이미지를 나타낸 도이다(Scale bars, 10μm.)
도 2a는 KRAS 돌연변이 인간 암 세포주(H23)에서 실시예 1(화합물 A)의 RAS 단백질 분해를 확인하기 위한 면역 블롯팅 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 도 2a의 KRAS 돌연변이 세포주(H23)에서의 실시예 1(화합물 A)의 면역블롯팅 분석 결과 중 KRAS 상대량을 비교한 도이다.
도 2c는 도 2a의 KRAS 돌연변이 세포주(H23)에서의 실시예 1(화합물 A)의 면역블롯팅 분석 결과 중 NRAS 상대량을 비교한 도이다.
도 2d는 KRAS 돌연변이 인간 암 세포주(DLD1)에서 실시예 1(화합물 A)의 RAS 단백질 분해를 확인하기 위한 면역 블롯팅 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2e는 도 2d의 KRAS 돌연변이 세포주(DLD1)에서의 실시예 1(화합물 A)의 면역블롯팅 분석 결과 중 KRAS 상대량을 비교한 도이다.
도 2f는 도 2d의 KRAS 돌연변이 세포주(DLD1)에서의 실시예 1(화합물 A)의 면역블롯팅 분석 결과 중 NRAS 상대량을 비교한 도이다.
도 2g는 KRAS 돌연변이 인간 암 세포주(A549)에서 실시예 1(화합물 A)의 RAS 단백질 분해를 확인하기 위한 면역 블롯팅 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2h는 도 2g의 KRAS 돌연변이 세포주(A549)에서의 실시예 1(화합물 A)의 면역블롯팅 분석 결과 중 KRAS 상대량을 비교한 도이다.
도 2i는 도 2g의 KRAS 돌연변이 세포주(A549)에서의 실시예 1(화합물 A)의 면역블롯팅 분석 결과 중 NRAS 상대량을 비교한 도이다.
도 2j는 KRAS 돌연변이 인간 암 세포주(H23)에서 실시예 2(화합물 B)의 RAS 단백질 분해를 확인하기 위한 면역 블롯팅 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2k는 도 2j의 KRAS 돌연변이 세포주(H23)에서의 실시예 2(화합물 B)의 면역블롯팅 분석 결과 중 KRAS 상대량을 비교한 도이다.
도 2l는 도 2j의 KRAS 돌연변이 세포주(H23)에서의 실시예 2(화합물 B)의 면역블롯팅 분석 결과 중 NRAS 상대량을 비교한 도이다.
도 2m은 실시예 1(화합물 A)의 유도된 RAS 분해 효능을 배양 시간대별로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2n은 비교예 1(ATL)의 유도된 RAS 분해 효능을 배양 시간대별로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2o은 비교예 2(Abd-7)의 유도된 RAS 분해 효능을 배양 시간대별로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2p는 MRC5 세포주에서 실시예 1(화합물 A), 비교예 1(화합물 A의 ATL) 및 비교예 2(화합물 A의 TBL)의 각 세포 생존력을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2q는 DLD1 세포주에서 실시예 1(화합물 A), 비교예 1(화합물 A의 ATL) 및 비교예 2(화합물 A의 TBL)의 각 세포 생존력을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2r은 A549 세포주에서 실시예 1(화합물 A), 비교예 1(화합물 A의 ATL) 및 비교예 2(화합물 A의 TBL)의 각 세포 생존력을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 A549 세포주에서 실시예 1(화합물 A)에 의해 유도된 RAS 분해가 ERK 신호전달을 조절하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는 H23 세포주에서 실시예 2(화합물 B)에 의해 유도된 RAS 분해가 ERK 신호전달을 조절하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 A549 세포주에서 실시예 1(화합물 A)에 의해 유도된 RAS 분해가 ERK 신호전달을 조절하는지 여부를 시간대 별로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3d는 A549 세포주에서 비교예 2(화합물 A의 TBL)에 의해 유도된 RAS 분해가 ERK 신호전달을 조절하는지 여부를 시간대 별로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3e는 A549 세포주에서 비교예 1(화합물 A의 ATL)에 의해 유도된 RAS 분해가 ERK 신호전달을 조절하는지 여부를 시간대 별로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 실시예 1(화합물 A), 비교예 1(화합물 A의 ATL) 또는 비교예 2(화합물 A의 TBL)가 RAS 분해를 위한 RAS-p62 응집체를 형성하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다(Scale bars, 10μm).
도 4b는 실시예 1(화합물 A), 비교예 1(화합물 A의 ATL) 또는 비교예 2(화합물 A의 TBL)가 오토파지를 통해 RAS를 분해하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다(Scale bars, 10μm).
도 4c는 실시예 1(화합물 A) 유도 RAS 다운스트림 신호전달 억제가 HCQ 처리시 차단되었다 ERK의 인산화 및 AKT의 인산화로 다시 회복되었음을 확인한 결과를 나타낸 도다.
도 4d는 실시예 1(화합물 A)이 오토파지를 통해 RAS를 분해하는지 여부를 확인한 면역 블롯팅 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 마우스 모델에서 실시예 1(화합물 A)의 KRASG12S 종양 성장 억제를 종양의 크기 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5b는 마우스 모델에서 실시예 1(화합물 A)의 KRASG12S 종양 성장 억제를 종양의 부피 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5c는 마우스 모델에서 실시예 1(화합물 A)의 KRASG12S 종양 성장 억제를 종양의 중량 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5d는 마우스 모델에서 비교예 2(화합물 A의 TBL)의 KRASG12S 종양 성장 억제를 종양의 크기 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5e는 마우스 모델에서 비교예 2(화합물 A의 TBL)의 KRASG12S 종양 성장 억제를 종양의 부피 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5f는 마우스 모델에서 비교예 2(화합물 A의 TBL)의 KRASG12S 종양 성장 억제를 종양의 중량 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5g는 마우스 모델에서 비교예 1(화합물 A의 ATL)의 KRASG12S 종양 성장 억제를 종양의 크기 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5h는 마우스 모델에서 비교예 1(화합물 A의 ATL)의 KRASG12S 종양 성장 억제를 종양의 중량 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5i는 실시예 1(화합물 A)의 RAS 분해가 종양에서 억제되었는지 확인하기 위한 면역블롯팅 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5j는 실시예 1(화합물 A)의 RAS 다운스트림 신호전달이 종양에서 억제되었는지 확인하기 위한 면역블롯팅 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5k는 실시예 1(화합물 A)의 RAS 분해 및 다운스트림 신호전달이 종양에서 억제되었는지 확인하기 위한 면역조직화학 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6a는 마우스 모델에서의 실시예 2(화합물 B)의 종양 성장 억제 효능을 조사하기 위한 실험 계획을 나타낸 도이다.
도 6b는 마우스 모델에서 실시예 2(화합물 B)의 KRASG12S 종양 성장 억제를 종양의 크기 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6c는 마우스 모델에서 실시예 2(화합물 B)의 KRASG12S 종양 성장 억제를 종양의 부피 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6d는 마우스 모델에서 실시예 2(화합물 B)의 KRASG12S 종양 성장 억제를 종양의 중량 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 출원의 실시예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 출원에 개시된 기술은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 출원의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 또한, 설명의 편의를 위하여 구성요소의 일부만을 도시하기도 하였으나, 당업자라면 구성요소의 나머지 부분에 대하여도 용이하게 파악할 수 있을 것이다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 출원의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다", "함유하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성성분 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것으로, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성성분 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제하지 않는다.
본 개시의 일 실시예는 아래의 화학식 1의 구조를 갖는 오토파지-타겟팅 리간드(autophagy-targeting ligand; ATL) 및 아래의 화학식 2의 구조를 갖는 타겟-결합 리간드(target-binding ligand; TBL)를 포함하고, 상기 오토파지-타겟팅 리간드의 -OH기와 상기 타겟-결합 리간드의 1,4-다이옥산의 탄소가 직접적으로, 또는 링커를 통하여 결합된 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022011268-appb-img-000003
[화학식 2]
Figure PCTKR2022011268-appb-img-000004
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는, 독립적으로, 수소 또는 플루오로이고,
R3는 -(CH2)- 또는 -O-(CH2)-CH(OH)-(CH2)-이며, 여기서 -O-(CH2)-CH(OH)-(CH2)-의 O가 벤젠 고리에 결합된다.
일 실시예로서 상기 "염"은 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기관의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전에 기재된 것으로 인지되는 것을 의미한다. 일 실시예로서, 상기　염은 예를 들어, 산 부가염,　염기 부가염　및 아미노산염을 들 수 있다. 그 구체예로서는,　염산염, 취화수소산염, 황산염, 요오드화수소산염, 질산염, 인산염　등의 무기산염; 구연산염, 옥살산염, 아세트산염, 포름산염, 프로피온산염, 안식향산염, 트리플루오로아세트산염, 말레인산염, 주석산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염　등의 유기산염; 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 구리염, 아연염, 알루미늄염, 암모늄염　등의 무기염기염; 트리에틸암모늄염, 트리에탄올암모늄염, 피리디늄염, 디이소프로필암모늄염　등의 유기염기염; 리신염, 아르기닌염, 히스티딘염, 아스파라긴산염, 글루타민산염　등의 아미노산염을 들 수 있다.
본 명세서에서 "입체 이성질체"는 특히 광학 이성질체(optical isomers)(예를 들면, 본래 순수한 거울상 이성질체(essentially pure enantiomers), 본래 순수한 부분 입체 이성질체(essentially pure diastereomers) 또는 이들의 혼합물)뿐만 아니라, 형태 이성질체(conformation isomers)(즉, 하나 이상의 화학 결합의 그 각도만 다른 이성질체), 위치 이성질체(position isomers)(특히, 호변이성체(tautomers)) 또는 기하 이성질체(geometric isomers)(예컨대, 시스-트랜스 이성질체)를 포함한다. 본 명세서에서 "본래 순수(essentially pure)"란, 예컨대 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체와 관련하여 사용한 경우, 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체를 예로 들 수 있는 구체적인 화합물이 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상 또는 약 98% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 99% 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 약 99.5% 이상(w/w) 존재하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "수화물(hydrate)"은 물이 결합되어 있는 화합물을 의미하며, 물과 화합물 사이에 화학적인 결합력이 없는 내포 화합물을 포함하는 광범위한 개념이다.
본 명세서에서 "용매화물"은 용질의 분자나 이온과 용매의 분자나 이온 사이에 생긴 고차의 화합물을 의미한다.
일 실시예에서, 상기 링커는 P-(CH2CH2O)x-(CH2)4-CONH-CH2-Q이며, 상기 P는 상기 오토파지-타겟팅 리간드(ATL)의 -OH에 결합되고, 상기 Q는 상기 갖는 타겟-결합 리간드(TBL)의 1,4-다이옥산의 탄소에 결합되며, 상기 x는 2 또는 3의 정수일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 컨쥬게이트 화합물은 아래의 화학식 3의 구조를 갖는 것일 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2022011268-appb-img-000005
상기 화학식 3에서,
R1 및 R2는, 독립적으로, 수소 또는 플루오로이고,
R3는 -(CH2)- 또는 -O-CH2-CH(OH)-CH2-이고, 여기서 -O-CH2-CH(OH)-CH2-에서 O는 벤젠 고리에 결합되며,
M은 -CH2-NHC(=O)-(CH2)4-(OCH2CH2)y-이고, 여기서 y는 2 또는 3의 정수이다.
일 실시예에서, 상기 컨쥬게이트 화합물은 하기 화학식 4로 표현되는 1-(3,4-비스(벤질옥시)페닐)-N-((8-(5-((4-((디메틸아미노)메틸)페닐)아미노)-6-메톡시피리딘-2-일)-2,3-디하이드로벤조[b][1,4]다이옥신-2-일)메틸)-5,8,11-트리옥사-2-아자헥사데칸-16-아마이드(1-(3,4-bis(benzyloxy)phenyl)-N-((8-(5-((4-((dimethylamino)methyl)phenyl)amino)-6-methoxypyridin-2-yl)-2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-2-yl)methyl)-5,8,11-trioxa-2-azahexadecan-16-amide, 화합물 A) 또는 하기 화학식 4로 표현되는 ((2R)-1-(3,4-비스((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-N-((8-(5-((4-((디메틸아미노)메틸)페닐)아미노)-6-메톡시피리딘-2-일)-2,3-디하이드로벤조[b][1,4]다이옥신-2-일)메틸)-2-하이드록시-7,10,13,16-테트라옥사-4-아자헤니코산-21-아미드((2R)-1-(3,4-bis((4-fluorobenzyl)oxy)phenoxy)-N-((8-(5-((4-((dimethylamino)methyl)phenyl)amino)-6-methoxypyridin-2-yl)-2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-2-yl)methyl)-2-hydroxy-7,10,13,16-tetraoxa-4-azahenicosan-21-amide, 화합물 B)일 수 있다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2022011268-appb-img-000006
[화학식 5]
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RAS는 암에서 가장 빈번하게 변이되며 특히 KRAS 돌연변이는 췌장암의 95%, 결장암(45%) 및 폐암(20%)의 주요 원인이다. RAS는 결합 리간드를 위한 포켓(pocket)이 없기 때문에, RAS는 종양원(oncogene)으로 발견된 이후 약 30년 동안 RAS를 표적으로 하려는 노력에도 불구하고 '약물이 불가능한 표적(undruggable target)'으로 여겨졌다. 본 개시에서, 본 발명자는 오토파지 타겟팅 리간드(autophagy targeting ligand; ATL)에 연결된 타겟-결합 리간드(target binding ligand; TBL)의 이중 기능 리간드를 포함하는 AUTOTAC(AUTOphagy-TArgeting Chimera) 기반 신규 화합물을 개발했다. 본 명세서에서 본 발명자는 상기 콘쥬게이트된 화합물을 "RAS-AUTOTAC"로 명명하였다.
상기 관점에서, 일 실시예에서, 상기 오토파지-타겟팅 리간드와 타겟-결합 리간드가 콘쥬게이트된 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물은 활성 RAS을 표적 분해할 수 있는 RAS 표적 분해제일 수 있다. 일 실시예에서, RAS가 상기 타겟-결합 리간드에 결합하면 콘쥬게이트 화합물의 또다른 리간드인 오토파지 타겟팅 리간드가 p62의 ZZ 도메인에 결합하고 p62 올리고머화를 유도하여 오토파지 분해를 유도할 수 있다. p62가 RAS와 올리고머화를 형성할 때, RAS는 생물학적으로 비활성화되고 오토파고좀에 격리된다. PROTACs(PROteolysis-TArgeting Chimeras)와 달리 RAS-AUTOTAC은 p62 응집 형성 단계에서 RAS의 자가포식 분해까지 다운스트림 신호전달 활성화를 억제할 수 있다. 일 실시예에 따른 상기 RAS-AUTOTAC은 표적 분해 플랫폼을 이용한 동물 모델에서 효능을 최초로 입증한 화합물로, 본 개시는 RAS를 '약물가능한 표적(druggable target)'으로 하여 RAS 돌연변이 유래 암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 새로운 접근법을 제공할 수 있다.
본 개시는 일 실시예로서, 상술된 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 활성 RAS의 표적 분해용 조성물을 제공할 수 있다.
본 개시는 일 실시예로서, 상술된 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 개시는 또 다른 일 실시예로서, 활성 RAS의 표적 분해용 조성물의 제조를 위한 상술된 콘쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 사용을 제공할 수 있다. 본 개시는 또 다른 일 실시예로서, 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조를 위한 상술된 콘쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 사용을 제공할 수 있다.
본 개시는 또 다른 일 실시예로서, 상술된 콘쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 활성 RAS의 표적 분해 방법을 제공할 수 있다. 본 개시는 또 다른 일 실시예로서, 상술된 콘쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 개시는 또 다른 일 실시예로서, 종양원성 활성 RAS의 표적 분해를 위한 유효성분으로서 상술된 콘쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 사용을 제공할 수 있다. 본 개시는 또 다른 일 실시예로서, 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 유효성분으로서 상술된 콘쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 사용을 제공할 수 있다.
일 실시예로서, 상기 조성물은 종양 유전자의 표적 분해용일 수 있다.
일 실시예로서, 상기 암은 RAS 돌연변이 유래 암일 수 있다.
일 실시예로서, 상기 RAS는 KRAS, NRAS 및 HRAS 중 하나 이상일 수 있다.
다른 일 실시예로서, 상기 암은 비소세포폐암(Non-small cell lung cancer; NSCLC), 결장암, 대장암, 췌장암, 위암, 난소암, 전립선암, 유방암, 림프종, 백혈병, 흑색종, 갑상선암, 다발성 골수종, 자궁경부암, 방광암, 요도암, 신장암 및 간세포암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예로서, 상기 암은 KRAS G12C 폐암, KRAS G13D 결장암 및 KRAS G12S 폐암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예로서, 상기 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물은 조성물 총 부피 기준으로 0.01 내지 100 μM인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물은 조성물 총 부피 기준으로 0.01 μM 이상, 0.1 μM 이상, 0.5 μM 이상, 0.6 μM 이상, 0.7 μM 이상, 0.8 μM 이상, 0.9 μM 이상, 1 μM 이상, 1.1 μM 이상, 1.2 μM 이상, 1.3 μM 이상, 1.4 μM 이상, 1.5 μM 이상, 1.6 μM 이상, 1.7 μM 이상, 1.8 μM 이상, 1.9 μM 이상, 2 μM 이상, 2.1 μM 이상, 2.2 μM 이상, 2.3 μM 이상, 2.4 μM 이상, 2.5 μM 이상, 3 μM 이상, 4 μM 이상, 5 μM 이상, 6 μM 이상, 7 μM 이상, 8 μM 이상, 9 μM 이상, 10 μM 이상, 20 μM 이상, 30 μM 이상, 40 μM 이상, 50 μM 이상, 60 μM 이상, 70 μM 이상, 80 μM 이상, 90 μM 이상 또는 99 μM 이상일 수 있으며, 100 μM 이하, 90 μM 이하, 80 μM 이하, 70 μM 이하, 60 μM 이하, 50 μM 이하, 40 μM 이하, 30 μM 이하, 20 μM 이하, 10 μM 이하, 9.9 μM 이하, 9.8 μM 이하, 9.7 μM 이하, 9.6 μM 이하, 9.5 μM 이하, 9 μM 이하, 8.5 μM 이하, 8 μM 이하, 7.5 μM 이하, 7 μM 이하, 6.5 μM 이하, 6 μM 이하, 5.5 μM 이하, 5 μM 이하, 4.5 μM 이하, 4 μM 이하, 3.5 μM 이하, 3 μM 이하, 2.9 μM 이하, 2.8 μM 이하, 2.7 μM 이하, 2.6 μM 이하, 2.5 μM 이하, 2 μM 이하, 1.5 μM 이하, 1 μM 이하, 0.5 μM 이하 또는 0.1 μM 이하일 수 있다.
일 실시예로서 상기 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일 실시예로서, 상기 유효성분인 상기 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 투여량은 0.1 내지 1000mg/kg/day일 수 있다. 구체적으로, 상기 유효성분인 상기 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 투여량은 0.1 mg/kg/day 이상, 0.5 mg/kg/day 이상, 1 mg/kg/day 이상, 2 mg/kg/day 이상, 3 mg/kg/day 이상, 4 mg/kg/da 이상, 5 mg/kg/day 이상, 6 mg/kg/day 이상, 7 mg/kg/day 이상, 8 mg/kg/day 이상, 9 mg/kg/day 이상, 10 mg/kg/day 이상, 11 mg/kg/day 이상, 12 mg/kg/day 이상, 13 mg/kg/day 이상, 14 mg/kg/day 이상, 15 mg/kg/day 이상, 20 mg/kg/day 이상, 30 mg/kg/day 이상, 40 mg/kg/day 이상, 50 mg/kg/day 이상, 60 mg/kg/day 이상, 70 mg/kg/day 이상, 80 mg/kg/day 이상, 90 mg/kg/day 이상, 100 mg/kg/day 이상, 200 mg/kg/day 이상, 300 mg/kg/day 이상, 400 mg/kg/day 이상, 500 mg/kg/day 이상 또는 900 mg/kg/day 이상일 수 있으며, 1000 mg/kg/day 이하, 900 mg/kg/day 이하, 800 mg/kg/day 이하, 700 mg/kg/day 이하, 600 mg/kg/day 이하, 500 mg/kg/day 이하, 400 mg/kg/day 이하, 300 mg/kg/day 이하, 200 mg/kg/day 이하, 100 mg/kg/day 이하, 90 mg/kg/day 이하, 80 mg/kg/day 이하, 70 mg/kg/day 이하, 60 mg/kg/day 이하, 50 mg/kg/day 이하, 40 mg/kg/day 이하,30 mg/kg/day 이하, 20 mg/kg/day 이하, 10 mg/kg/day 이하 또는 1 mg/kg/day 이하일 수 있다.
일 실시예로서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있다. 일 실시예로서, 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제일 수 있으며, 상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있다. 이들 제형은 유효 성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅방법에 의해 제조될 수 있다. 일 실시예로서, 상기 약제학적 조성물은 비경구 투여제일 수 있으며, 상기 비경구 투여제는 직장, 국소, 피하, 경피 투여형 제형일 수 있다. 예를 들어 주사제, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패취 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 일 실시예로서, 상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 유효성분을 포함하는 발효유, 치즈, 요구르트, 주스, 생균제제 및 건강식품 등과 같은 기능성 식품으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다. 일 실시예로서, 조성물은 건강 식품용 조성물일 수 있다. 일 실시예로서, 상기 건강 식품용 조성물은 환제, 캅셀제, 정제, 과립제, 캬라멜제 또는 드링크제 등으로 제형화할 수 있다. 다른 일 실시예로서, 액제, 분말, 과립, 정제 또는 티백 등의 형태로 가공될 수도 있다. 상기 조성물은 단순 음용, 주사 투여, 스프레이 방식 또는 스퀴즈 방식 등의 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 본 개시의 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 개시의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은, 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.0001 중량% 내지 99.99 중량%일 수 있다.
Nt-아르기닐화(Nt-Arginylation)는 오토파지를 통해 단백질 분해를 매개하고, UPS는 N-리코그닌의 유형에 따라 다르다. 오토파지의 한 지점에서, Nt-아르기닐화는 p62의 ZZ 도메인을 통해 오토파지 N-리코그닌인 p62에 결합하여 p62 올리고머화 및 오토파지 활성화를 유도한다. 본 발명자는 p62의 ZZ 도메인에 결합하고 오토파지를 활성화하는 Nt-Arg를 모방할 수 있는 p62 ZZ 리간드를 개발했다. 상기 p62 리간드는 세포독성 물질과 잘못 접힌(misfolded) 단백질과 같은 유비퀴틴화된 단백질을 제거하는 오토파지를 유도할 수 있다(Cha-Molstad et al., 2017; Yoo et al., 2018). 본 개시의 일 실시예에 따르면, 상기 RAS-AUTOTAC에 포함되는 오토파지 타겟팅 리간드는 더 개선된 오토파지 활성화 효능 및 세포 세포독성을 나타내는 가변 p62 리간드로, 화합물 A의 ATL인 2-((3,4-비스(벤질록시)벤질)아미노)에탄-1-올(2-((3,4-bis(benzyloxy)benzyl)amino)ethan-1-ol) 및 화합물 B의 ATL인 (R)-1-(3,4-비스((4)-플루오로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올((R)-1-(3,4-bis((4)-fluorobenzyl)oxy)phenoxy)-3-((2-hydroxyethyl)amino)propan-2-ol)일 수 있다. 또한, 본 개시의 일 실시예에 따르면, 상기 RAS-AUTOTAC에 포함되는 타겟-결합 리간드는 50nM의 시험관 내 Kd와 높은 친화성을 갖는 스위치 I 영역 근처에서 반데르발스 상호작용으로 RAS에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 일 실시예에 따른 타겟-결합 리간드는 RAS에 대하여 가역적 결합을 통해 RAS 효과기 상호작용 및 RAS 의존적 신호전달을 방지할 수 있다(Quevedo et al., 2018). "Quevedo, C.E., Cruz-Migoni, A., Bery, N., Miller, A., Tanaka, T., Petch, D., Bataille, C.J.R., Lee, L.Y.W., Fallon, P.S., Tulmin, H., et al. (2018) 세포내 항체 단편을 사용하여 유도된 RAS-효과기 단백질 상호작용의 소분자 억제제(Small molecule inhibitors of RAS-effector protein interactions derived using an intracellular antibody fragment), Nat Commun 9, 3169"는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로서 통합된다.
1984년 이후 RAS 돌연변이는 인간 폐암에서 발견되었으며, RAS는 RAS를 표적으로 하는 약물을 개발하려는 많은 시도에도 불구하고 약물이 불가능한 표적으로 여겨졌다. RAS를 타겟으로 하는 전통적인 접근 방식은 계속하여 실패 했으므로 다른 접근 방식이 개발되어야 한다. 케반 쇼캇(Kevan Shokat) 팀이 2013년 KRAS G12C의 작은 포켓(pocket)을 발견하면서 RAS 표적 전략은 KRAS G12C 포켓에 집중되었다(Ostrem et al., 2013). 최근에는 미라티 테라퓨틱스의 아다그라십(adagrasib, MRTX849), JNJ-74699157(존슨 앤 존슨) 및 JDQ443(노바티스)을 비롯한 여러 KRAS G12C 리간드가 임상 시험 중이다(Fell et al., 2020). 2021년 미국 식품의약국(FDA)은 루마크라스(Lumakras)를 KRAS G12C 돌연변이 NSCLC 환자의 첫 치료제로 승인했지만, KRAS G12C 돌연변이는 KRAS 돌연변이 암의 단지 15%에 한하며, 상기 G12C 리간드는 GDP에 결합된 불활성 상태에 결합할 수 있으므로 그외 KRAS 돌연변이에 친화성을 갖는 다른 리간드도 조사되어야 한다. 이러한 한계에도 루마크라스의 발견은 RAS는 더 이상 약물을 사용할 수 없는 표적이 아니며 다른 방식을 통한 RAS의 표적화 가능성을 시사한다. 최근에는 질병을 치료하기 위한 새로운 전략으로 단백질 표적 분해가 제안되었다. Zeng. et al은 외인성 RAS의 분해를 보인 반면 내인성 돌연변이 KRAS는 분해하지 않는 PROTACs(PROteolysis-TArgeting Chimeras)를 사용한 RAS 분해를 처음으로 제안했다(Zeng et al., 2020). 다음 연구는 protac 화합물을 사용한 내인성 RAS 분해 및 다운스트림 조절을 보여주었지만, 이는 시험관 내 암 세포주만으로 제한되며 생체 내 실험으로는 확장되지 않았다(Bond et al., 2020). 제한된 효능 외에도, 이러한 연구는 TBL로 KRAS 돌연변이 암의 15%로 제한된 사용을 갖는 G12C 리간드를 사용한다. 또한, PROTACs는 기질-PROTAC-E3 3원 복합체를 형성하는데 기술적 어려움을 보였고 가변 E3 리가아제는 조직 선택적 발현을 보였다. 따라서 PROTAC의 베이스인 UPS는 분해능이 제한되어 프로테아좀 내부가 좁고 원통형이 되었다. AUTOTAC은 오토파지 분해 시스템을 기반으로 하지만 오토파지는 대량 분해 능력을 가지고 있으며, 분해를 위해 기질-p62 또는 LC3 복합체 형성이 필요하지 않았다.
본 개시의 일 실시예에 따른 p62 ZZ 리간드를 ATL로 사용하고 Abd-7을 TBL로 사용하여 ATL과 TBL 영역이 콘쥬게이트된 이기능성 리간드인 RAS-AUTOTAC은 RAS 돌연변이 암의 치료에 대한 새로운 접근 방식으로, p62가 ATL 영역에 결합하면, TBL 영역과 결합된 RAS와의 응집체 형성을 위한 PB1 도메인을 노출시키고, 오토파지 멤브레인(autophagic membrane)에 RAS를 표적화하기 위한 LIR 도메인을 노출시킨다. p62 폼(form)이 RAS와 응집함에 따라, RAS는 억제되고 다운스트림 신호전달을 활성화하지 않으며, 다운스트림 억제는 RAS 분해로 이어질 수 있다. 또한, RAS-AUTOTACs는 시험관 내 실험에서뿐만 아니라 종양 성장을 억제할 수 있는데, 이는 마이크로 분자 기반 표적 분해 플랫폼을 사용한 동물 모델의 최초의 결과이다.
이하, 실시예, 비교예 및 시험예를 참조하여 본 개시를 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 개시를 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 개시의 범위가 이 실시예, 비교예 및 시험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.
본 발명자는 RAS의 표적 분해를 위한 RAS-AUTOTAC 화합물들의 일 실시예로서 표 1에 나타난 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 링커를 통해 오토파지 타겟팅 리간드인 ATL(화합물 A의 경우 ATL 화합물 A, 화합물 B의 경우 ATL 화합물 B)와 타겟-결합 리간드인 TBL(Abd-7)가 콘쥬게이트된 이기능성 리간드를 제조하였다.
실시예 ID 화학명
1 화합물 A 1-(3,4-비스(벤질옥시)페닐)-N-((8-(5-((4-((디메틸아미노)메틸)페닐)아미노)-6-메톡시피리딘-2-일)-2,3 -디히드로벤조[b][1,4]디옥신-2-일)메틸)-5,8,11-트리옥사-2-아자헥사데칸-16-아미드 (1-(3,4-bis(benzyloxy)phenyl)-N-((8-(5-((4-((dimethylamino)methyl)phenyl)amino)-6-methoxypyridin-2-yl)-2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-2-yl)methyl)-5,8,11-trioxa-2-azahexadecan-16-amide)
2 화합물 B (2R)-1-(3,4-비스((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-N-((8-(5-((4-((디메틸아미노)메틸)페닐)아미노)-6-메톡시피리딘 -2-일)-2,3-디히드로벤조[b][1,4]디옥신-2-일)메틸)-2-히드록시-7,10,13,16-테트라옥사-4-아자헤니코산-21-아미드 ((2R)-1-(3,4-bis((4-fluorobenzyl)oxy)phenoxy)-N-((8-(5-((4-((dimethylamino)methyl)phenyl)amino)-6-methoxypyridin-2-yl)-2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-2-yl)methyl)-2-hydroxy-7,10,13,16-tetraoxa-4-azahenicosan-21-amide)
아래 실험에서, 1H NMR 스펙트럼은 브루커 어밴스(Bruker Avance) III 400MHz 및 브루커 푸리에(Bruker Fourier) 300MHz에서 기록되었으며 TMS가 내부 표준으로 사용되었다.
LCMS는 ES(+) 또는 (-) 이온화 모드에서 작동하는 애질런트(Agilent) 1260HPLC 및 6120MSD(컬럼: C18(50 Х 4.6 mm, 5 μm)에서 측정되었다; T = 30℃, 유속 = 1.5 mL/min; 검출 파장: 220 nm 및 254 nm.
[실시예 1] 화합물 A (1-(3,4-비스(벤질옥시)페닐)- N -((8-(5-((4-((디메틸아미노)메틸)페닐)아미노)-6-메톡시피리딘-2-일)-2,3-디하이드로벤조[ b ][1,4]디옥신-2-일)메틸)-5,8,11-트리옥사-2-아자헥사데칸-16-아미드)의 제조
[화학식 6]
Figure PCTKR2022011268-appb-img-000008
[화학식 7]
Figure PCTKR2022011268-appb-img-000009
단계 1) T2의 합성
DMF(200mL) 중 T1(20g, 106.4mmol)의 용액에 에피클로로히드린(8.16g, 88.67mmol) 및 K2CO3(14.7g, 106.4mmol)를 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 물에 붓고 EA로 추출하였다. 그 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질(crude)을 분취-HPLC(prep-HPLC)로 정제하여 갈색 오일인 T2(12g)를 얻었다.
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.11 (d, 1H), 6.90 (d, 1H), 6.78(t, 1H), 5.11 (s, 1H), 4.20-4.16 (m, 1H), 4.10-4.05 (m, 1H), 3.68-3.34 (m, 2H).
단계 2) T3의 합성
1,4-디옥산(30mL) 중 T3(1.4g, 5.74mmol)의 용액에 비스(피나콜라토)디보론(2.9g, 11.5mmol), KOAc(1.69g, 17.22mmol) 및 Pd(dppf)Cl2 (143 mg, 0.172 mmol)를 N2하에서 첨가하였디. 그 반응 혼합물을 100℃에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 물에 붓고 EA로 추출하였다. 그 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 분취-HPLC로 정제하여 황색 고체인 T4(600 mg)를 수득하였다.
LCMS 화학식: C15H21BO5, 산출된 질량: 292.1; 발견된 MS: 293.2 [MS+1].
단계 3) T4의 합성
1,4-디옥산(160mL) 및 물(40mL) 중 T3(8g, 27.4mmol)의 용액에 6-브로모-2-메톡시피리딘-3-아민(6.64g, 32.88mmol), K2CO3 (7.56 g, 54.8 mmol) 및 Pd(PPh3)4 (1.58 g, 1.37 mmol)를 N2 하에서 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 100℃에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 물에 붓고 EA로 추출하였다. 그 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(PE/EA=2:1)로 정제하여 황색 고체인 T4(8g)를 수득하였다.
LCMS 화학식: C15H16N2O4, 산출된 질량: 288.3; 발견된 MS: 289.1 [MS+1].
단계 4) T5의 합성
톨루엔(70mL) 중 T4(5.1g, 17.7mmol)의 용액에 (4-브로모벤질)디메틸아민, 4-(N,N-디메틸아미노메틸)브로모벤젠(5.28g, 24.78mmol), BINAP (330 mg, 0.53 mmol), NaOtBu (3.4 g, 35.4 mmol) 및 Pd2(dba)3 (162 mg, 0.177 mmol)을 N2하에서 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 100℃에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 물에 붓고 EA로 추출하였다. 그 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH=10:1)로 정제하여 황색 고체인 T5(2.2g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.59 (d, 1H), 7.52 (d, 1H), 7.36-7.27 (m, 3H), 7.17 (m, 2H), 6.95-6.89 (m, 2H), 6.21 (s, 1H), 4.43-4.33 (m, 2H), 4.19 (m, 1H), 4.11 (s, 3H), 4.09-3.88 (m, 2H), 3.45 (s, 2H), 2.30 (s, 6H).
단계 5) T6의 합성
DCM(20mL) 중 T5(1g, 2.37mmol)의 용액에 TEA(479mg, 4.74mmol) 및 MsCl(326mg, 2.84mmol)을 0℃에서 적가하였다. 그 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 0℃에서 물로 퀜칭하고 DCM으로 추출하였다. 그 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축시켜 황색 고체인 T6(1.1g)을 수득하였다.
LCMS 화학식: C25H29N3O6S; 산출된 질량: 499.5; 발견된 MS: 500.1 [MS+1].
단계 6) T7의 합성
DMF(10mL) 중 T6(1.1g, 2.37mmol)의 용액에 칼륨 프탈이미드(877mg, 4.74mmol)를 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 80℃에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 상온으로 냉각하고 물에 붓고 EA로 추출하였다. 그 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH=50:1)로 정제하여 황색 고체인 T7(700 mg)을 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.92-7.90 (m, 2H), 7.78-7.76 (m, 2H), 7.59 (d, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.28-7.26 (m, 2H), 7.15 (m, 2H), 6.96 (m, 1H), 6.84 (d, 1H), 6.20 (s, 1H), 4.60-4.58 (m, 1H), 4.42-4.40 (m, 1H), 4.19-4.11 (m, 5H), 3.99-3.95 (m, 1H), 3.41 (s, 2H), 2.26 (s, 6H).
LCMS 화학식: C32H30N4O5, 산출된 질량: 550.6; 발견된 MS: 552.2 [MS+2].
단계 7) T8의 합성
EtOH(14mL) 중 T7(700mg, 1.27mmol)의 용액에 N2H4.H2O(636mg, 12.7mmol)를 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 90℃에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 감압 여과하였다. 여액을 농축하고 EA로 희석하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켜 황색 고체인 T8(500 mg)을 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.59 (d, 1H), 7.57 (m, 2H), 7.28-7.25 (m, 2H), 7.16-7.14 (m, 2H), 6.98-6.89 (m, 2H), 6.21 (s, 1H), 4.38 (d, 1H), 4.22-4.20 (m, 1H), 4.12-4.06 (m, 4H), 3.40 (s, 2H), 3.04 (t, 2H), 2.27 (s, 6H).
LCMS 화학식: C24H28N4O3, 산출된 질량: 420.5; 발견된 MS: 422.1 [MS+2].
단계 8) A2의 합성
MeOH(20mL) 중 Al(1g, 3.14mmol)의 용액에 2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에탄올(468mg, 3.14mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 교반하였다. 그 다음 0℃로 냉각시키고 NaBH4(179 mg, 4.71 mmol)를 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 퀜칭하고 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 농축시켜 황색 오일인 A2(1.4g)를 수득하였다.
LCMS 화학식: C27H33NO5, 산출된 질량: 451.5; 발견된 MS: 452.9 [MS+1].
단계 9) A3의 합성
DCM(20mL) 중 A2(1.3g, 2.88mmol)의 용액에 TEA(0.8mL, 5.76mmol) 및 Boc2O (754mg, 3.46mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 물에 부었다. 용액을 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조 물질을 실리카겔상에서 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH=100:1)로 정제하여 무색 오일인 A3(1.1g)를 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.47-7.45 (m, 4H), 7.39-7.30 (m, 6H), 6.90-6.85 (m, 2H), 6.76 (s, 1H), 5.16 (s, 4H), 4.42-4.40 (m, 2H), 3.75-3.73 (m, 2H), 3.65-3.48 (m, 8H), 3.35-3.25 (m, 2H), 1.55-1.45 (m, 9H).
LCMS 화학식: C32H41NO7, 산출된 질량: 551.6; 발견된 MS: 454.2 [MS-101].
단계 10) A4의 합성
THF(40mL) 중 A3(2g, 3.63mmol)의 용액에 NaH(2.2g, 54.45mmol)를 0℃에서 나누어서 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 5-브로모발레르산(985 mg, 5.44 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 1N HCl에 붓고 EA로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH=50:1)로 정제하여 황색 오일인 A4(560 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.47-7.45 (m, 4H), 7.39-7.30 (m, 6H), 6.91-6.85 (m, 2H), 6.76 (s, 1H), 5.16 (s, 4H), 4.42-4.40 (m, 2H), 3.65-3.57 (m, 8H), 3.50-3.43 (m, 4H), 3.35 (m, 1H), 3.23 (m, 1H), 2.39 (t, 2H), 1.74-1.63 (m, 4H), 1.50-1.44 (m, 9H).
LCMS 화학식: C37H49NO9, 산출된 질량: 651.7; 발견된 MS: 551.8 [MS-100].
단계 11) A5의 합성
DCM(10mL) 중 A4(500mg, 0.768mmol)의 용액에 화합물 T8(387mg, 0.922mmol), TEA(233mg, 2.3mmol), EDCI(221mg, 1.15mmol) 및 HOBT(155.5 mg, 1.15 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 물에 붓고 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH=20:1)로 정제하여 황색 고체인 A5(600 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.62-7.56 (m, 1H), 7.49 (s, 2H), 7.48-7.43 (m, 4H), 7.38-7.27 (m, 10H), 7.17-7.14 (m, 2H), 7.00-6.84 (m, 4H), 6.75 (m, 1H), 6.30 (s, 1H), 6.21 (s, 1H), 5.14 (s, 4H), 4.42-4.30 (m, 4H), 4.10 (s, 3H), 4.01-3.96 (m, 1H), 3.70-3.44 (m, 16H), 3.33-3.31 (m, 1H), 3.22 (m, 1H), 2.30-2.25 (m, 8H), 1.79-1.54 (m, 6H), 1.50-1.44 (m, 9H)
LCMS 화학식: C61H75N5O11, 산출된 질량: 1054.2; 발견된 MS: 1055.5 [MS+1].
단계 12) 화합물 A의 합성
1,4-디옥산(2 mL) 중 A5(200 mg, 0.19 mmol)의 용액에 HCl/1,4-디옥산(2 mL)을 실온에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하고 잔류물을 EA에 용해시키고, 포화 NaHCO3로 pH를 8로 조정하였다. 합쳐진 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 농축시켰다. 조 물질을 분취용 HPLC로 정제하여 흰색 고체인 화합물 A (1-(3,4-비스(벤질옥시)페닐)-N-((8-(5-((4-((디메틸아미노)메틸)페닐)아미노)-6-메톡시피리딘-2-일)-2,3-디히드로벤조[b][1,4]디옥신-2-일)메틸)-5,8,11-트리옥사-2-아자헥사데칸-16-아미드, 30 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.62-7.56 (m, 1H), 7.55-7.40 (m, 6H), 7.39-7.30 (m, 6H), 7.16-7.14 (m, 2H), 7.05 (m, 1H), 6.97-6.84 (m, 4H), 6.52 (m, 1H), 6.22 (s, 1H), 5.18-5.15 (m, 4H), 4.40-4.30 (m, 2H), 4.10 (s, 3H), 4.02-3.97 (m, 1H), 3.76 (s, 2H), 3.67-3.46 (m, 16H), 2.80 (t, 2H), 2.33 (s, 6H), 2.27 (t, 2H), 1.79-1.67 (m, 2H), 1.65-1.54 (m, 2H).
LCMS 화학식: C56H67N5O9, 산출된 질량: 954.1; 발견된 MS: 954.8 [MS], 955.8 [MS+1].
[실시예 2] 화합물 B((2 R )-1-(3,4-비스((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)- N -((8-(5-((4-((디메틸아미노)메틸))페닐)아미노)-6-메톡시피리딘-2-일)-2,3-디히드로벤조[ b ][1,4]디옥신-2-일)메틸)-2-히드록시-7,10,13,16-테트라옥사-4-아자헤니코산-21-아미드)의 제조
[화학식 8]
Figure PCTKR2022011268-appb-img-000010
[화학식 9]
Figure PCTKR2022011268-appb-img-000011
단계 1) L2의 합성
DCM(1.5L) 중 L1(75g, 0.39mol)의 용액에 1H-이미다졸(27.6g, 0.4mol) 및 TBDPSCl(tert-부틸(클로로)디페닐실란, CAS 번호: 58479-61-1, 74.2g, 651mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물에 붓고 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH=50:1)로 정제하여 황색 오일인 L2(65g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.71-7.69 (m, 4H), 7.46-7.38 (m, 6H), 3.85-3.82 (m, 2H), 3.74-3.60 (m, 12H), 2.15-2.10 (m, 2H), 1.07 (s, 9H)
단계 2) L3의 합성
DCM(200mL) 중 L2(20g, 46.3mmol)의 용액에 30% NaOH(80mL), TBAB(3g, 9.26mmol) 및 tert-부틸 아크릴레이트(29.4g, 231.5mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물에 붓고 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH=200:1)로 정제하여 황색 오일인 L3(14g)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.75-7.69 (m, 4H), 7.46-7.37 (m, 6H), 3.84-3.81 (m, 2H), 3.74-3.61 (m, 14H), 2.54-2.50 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.07 (s, 9H).
단계 3) L4의 합성
THF(200mL) 중 L3(10g, 21.7mmol)의 용액에 LiAlH4(1.35g, 43.5mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 Na2SO4.10H2O로 퀜칭하고 여과하였다. 여액을 농축하고 EA로 희석하였다. 합쳐진 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켜 황색 오일인 L4(8g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.71-7.69 (m, 4H), 7.44-7.38 (m, 6H), 3.84-3.77 (m, 4H), 3.70-3.61 (m, 16H), 1.85-1.83 (m, 2H), 1.07 (s, 9H).
단계 4) L5의 합성
DCM(300mL) 중 DMSO(7.96g, 102mmol)의 용액에 N2하에 -70℃에서 (COCl)2(10.36g, 81.6mmol)을 첨가하였다. 1시간 후, DCM(100mL) 중 L4(20g, 40.8mmol)의 용액을 첨가하였다. 1시간 후, TEA(33g, 326.4mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 퀜칭하고 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켜 황색 오일인 L5(20g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 9.80 (s, 1H), 7.71-7.68 (m, 4H), 7.44-7.38 (m, 6H), 3.84-3.82 (m, 3H), 3.68-3.61 (m, 15H), 2.71-2.68 (m, 2H), 1.07 (s, 9H).
단계 5) L6의 합성
THF(600mL) 중 트리에틸 포스포노아세테이트(33.1g, 147.6mmol)의 용액에 N2하에 -30℃에서 NaH(5.9g, 147.6mmol)를 첨가하였다. 1시간 후, THF(300mL) 중 L5(60g, 123mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 -30℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 얼음물에 붓고 EA로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(PE/EA=5:1)로 정제하여 황색 오일인 L6(40g)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.71-7.69 (m, 4H), 7.46-7.37 (m, 6H), 7.01-6.94 (m, 1H), 5.92-5.88 (d, 1H), 4.23-4.17 (m, 2H), 3.84-3.81 (m, 2H), 3.70-3.58 (m, 16H), 2.51 (q, 2H), 1.31 (t, 3H), 1.07 (s, 9H).
단계 6) L7의 합성
THF(150mL) 중의 L6(10g, 17.9mmol) 및 Pd/C(1.5g)의 혼합물을 H2(50Psi) 하에 40℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 여과하였다. 여액을 농축하여 조물질 L7을 황색 오일로서 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.71-7.69 (m, 4H), 7.46-7.37 (m, 6H), 4.17-4.11 (m, 2H), 3.84-3.81 (m, 2H), 3.69-3.57 (m, 14H), 3.50-3.47 (m, 2H), 2.33 (q, 2H), 1.73-1.61 (m, 4H), 1.31 (t, 3H), 1.07 (s, 9H).
단계 7) L8의 합성
THF(200mL) 중 L7(조물질, 17.9mmol)의 용액에 1M TBAF(테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드, CAS 번호: 429-41-4, 71.7mL, 71.7mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 물로 희석하고, DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켜 조물질 L8을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS 화학식: C15H30O7, 산출된 질량: 322.3; 발견된 MS: 323.2 [MS+1].
단계 8) L9의 합성
DCM(100mL) 중 L8(조물질, 17.9mmol)의 용액에 TEA(5.42g, 53.7mmol), 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine; DMAP, 218mg, 1.79mmol) 및 p-톨루엔설포닐클로라이드(TsCl, 3.75g, 19.7mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물에 붓고 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH=50:1)로 정제하여 황색 오일인 L9(5g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.83-7.80 (m, 2H), 7.37-7.35 (m, 2H), 4.19-4.13 (m, 4H), 3.71-3.57 (m, 14H), 3.50-3.46 (m, 2H), 2.46 (s, 3H), 2.32 (q, 2H), 1.72-1.60 (m, 4H), 1.24 (t, 3H)
LCMS 화학식: C22H36O9S, 산출된 질량: 476.5; 발견된 MS: 477.2 [MS+1].
단계 9) B2의 합성
아세토니트릴(300mL) 중 B1(30g, 217mmol)의 용액에 1-(브로모메틸)-4-플루오로벤젠(90g, 478mmol) 및 K2CO3(90g, 651mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 물에 붓고 EA로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 농축시켜 백색 고체인 B2(45g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 9.85 (s, 1H), 7.51-7.41 (m, 6H), 7.12-7.03 (m, 5H), 5.22 (s, 2H), 5.18 (s, 2H).
단계 10) B3의 합성
DCM(550mL) 중 B2(55g, 155mmol)의 용액에 m-CPBA(40g, 233mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물에 붓고 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 농축시켜 백색 고체인 B3(20g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.43-7.36(m, 2H), 7.10-7.02 (m, 4H), 6.81 (d, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.34 (d, 1H), 5.07 (s, 2H), 5.02 (s, 2H).
단계 11) B4의 합성
EtOH(200mL) 및 물(10mL) 중 B3(20g, 58.5mmol)의 용액에 KOH(7.5g, 134mmol) 및 (R)-에피클로로히드린(16g, 175mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물에 붓고 EA로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(PE/EA=5:1)로 정제하여 백색 고체인 B4(10g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.43-7.37 (m, 2H), 7.10-7.02 (m, 4H), 6.86 (d, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.41 (d, 1H), 5.09 (s, 2H), 5.03 (s, 2H), 4.20-4.16 (m, 1H), 3.90-3.86 (m, 1H), 3.35-3.33 (m, 1H), 2.93-2.70 (m, 1H), 2.76-2.74 (m, 1H).
LCMS 화학식: C23H20F2O4, 산출된 질량: 398.4; 발견된 MS: 399.9 [MS+1].
단계 12) B5의 합성
MeOH(230mL) 중 B4(23g, 58mmol)의 용액에 NH3.H2O(230mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 여과하였다. 여액을 농축하여 백색 고체로서 B5(19g)를 얻었다.
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.51-7.43 (m, 4H), 7.25-7.17 (m, 4H), 6.93 (d, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.45-6.42 (m, 1H), 5.10 (s, 2H), 5.00 (s, 2H), 3.89-3.67 (m, 3H), 2.67 (m, 2H).
LCMS 화학식: C23H23F2NO4, 산출된 질량: 415.4; 발견된 MS: 416.9 [MS+1].
단계 13) B6의 합성
DMF(50mL) 중 L9(5g, 10.5mmol)의 용액에 B5(4.35g, 10.5mmol) 및 K2CO3(14.5g, 105mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 물로 희석하고, EA로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켜 조물질 B6을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS 화학식: C38H51F2NO10, 산출된 질량: 719.8; 발견된 MS: 720.5 [MS+1].
단계 14) B7의 합성
DCM(50 mL) 중 B6(조물질, 10.5 mmol)의 용액에 트리에틸아민(TEA, 2.1g, 21mmol) 및 Boc2O(2.75g, 12.6mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물로 희석하고 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조 물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH=100:1)로 정제하여 황색 오일인 B7(2g)을 수득하였다.
LCMS 화학식: C43H59F2NO12, 산출된 질량: 819.9; 발견된 MS: 720.5 [MS-100].
단계 15) B8의 합성
MeOH(100mL) 및 물(20mL) 중 B7(10g, 12.2mmol)의 용액에 LiOH·H2O(1.02g, 24.4mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 0.5N HCl로 pH=2로 조정하고, DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조 물질을 분취용-HPLC로 정제하여 황색 오일인 B8(5g)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.44-7.36 (m, 4H), 7.09-7.02 (m, 4H), 6.85 (d, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.43-6.41 (m, 1H), 5.07 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.20 (m, 1H), 3.91-3.48 (m, 22H), 2.41-2.37 (m, 2H), 1.77-1.63 (m, 4H), 1.48 (s, 9H).
LCMS 화학식: C41H55F2NO12, 산출된 질량: 791.8; 발견된 MS: 692.3 [MS-100].
단계 16) B9의 합성
DMF(10mL) 중 T8(6-(3-(아미노메틸)-2,3-디히드로벤조[b][1,4]디옥신-5-일)-N-(4-((디메틸아미노)메틸)페닐)-2-메톡시피리딘-3-아민, 420mg, 1.0mmol)의 용액에 B8(720mg, 0.91mmol), 디이소프로필에틸아민(DIEA, 352mg, 2.73mmol) 및 HATU(1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트, CAS 번호: 148893-10-1, 346 mg, 0.91 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 물에 붓고 EA로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조물질을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH=20:1)로 정제하여 황색 고체인 B9(600 mg)를 수득하였다.
LCMS 화학식: C65H81F2N5O14, 산출된 질량: 1194.3; 발견된 MS: 1194.5 [MS], 1196.4 [MS+2].
단계 17) 화합물 B의 합성
DCM(50mL) 중 B9(2.4g, 2.0mmol)의 용액에 HCl/MTBE(10mL)를 실온에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 포화 NaHCO3로 pH=8로 조정하고 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 농축시켰다. 조물질을 분취용 HPLC로 정제하여 표적 화합물을 얻었다. 이를 DCM에 용해시키고 포화 NaHCO3로 pH=8로 조정하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 농축시키고, 동결 건조시켜 황색 고체인 화합물 B ((2R)-1-(3,4-비스((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-N-((8-(5-((4-((디메틸아미노)메틸)페닐)아미노)-6-메톡시피리딘-2-일)-2,3-디히드로벤조[b][1,4]디옥신-2-일)메틸)-2-히드록시-7,10,13,16-테트라옥사-4-아자헤니코산-21-아미드, 1g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.58 (d, 1H), 7.48 (s, 2H), 7.41-7.34 (m, 4H), 7.27-7.25 (m, 2H), 7.15-7.13 (m, 2H), 7.07-7.00 (m, 4H), 6.94 (t, 1H), 6.84 (t, 2H), 6.59 (s, 1H), 6.52 (m, 1H), 6.39 (d, 1H), 6.21 (s, 1H), 5.05 (s, 2H), 5.00 (s, 2H), 4.40-4.32 (m, 2H), 4.09 (s, 3H), 4.02-3.98 (m, 2H), 3.91-3.89 (m, 2H), 3.66-3.49 (m, 18H), 3.40 (s, 2H), 2.88-2.82 (m, 3H), 2.77-2.72 (m, 1H), 2.32-2.27 (m, 8H), 1.77-1.71 (m, 2H), 1.66-1.61 (m, 2H).
LCMS 화학식: C60H73F2N5O12, 산출된 질량: 1093.5; 발견된 MS: 1094.8 [MS+1].
재료 및 방법
세포 배양
HeLa 세포는 10% 소태아혈청(FBS; Gibco, -)가 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; ThermoFisher, 11995073, Carlsbad, CA, USA, www.thermofisher.com)에서 배양하였으며, MRC-5 세포는 10% FBS가 보충된 이글 최소 필수 배지에서 배양하였고, A549, DLD-1, H23 및 H358 세포들은 표준 5% CO2 인큐베이터에서 10% FBS가 보충된 RPMI에서 배양했다.
면역 블롯팅
A549 (1.0x10^5), DLD1 (2.0x10^5), H23 (1.0x10^5), H358 (3.0*10^5) 및 HeLa (1.0x10^5) 세포를 12웰 플레이트에서 20시간 동안 배양하여 붙였다. RAS 신호 전달 경로를 활성화하기 위해 세포를 준비하기 전에 FBS가 없는 배지에서 24시간 동안 RAS-AUTOTAC와 함께 배양하고 10분 동안 EGF 50ng/ml를 배양했다. 세포를 SDS 샘플 버퍼에서 직접 용해하고 95℃에서 10분 동안 끓였다. 전체 세포 용해물(5μg)을 SDS-PAGE로 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride; PVDF) 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인은 5% 탈지유(Becton Dickinson, 232100, Franklin Lakes, NJ, USA, www.bd.com) 또는 5% BSA(Biosesang, AC1025, 경기도 성남시, 한국, biosesang.com)로 표준 PBST(인산염 완충 식염수(PBS) 및 0.1% Tween 20) 세척 완충액에서 1시간 동안 차단된 후, 탈지유 또는 BSA에서 1차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 배양하고, PBST 완충액으로 10분동안 3회 세척하며, PBST에서 이차 항체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 면역반응성 단백질은 제조업체의 지침에 따라 수퍼시그널 웨스트 피코 화학발광 기판(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, ThermoFisher, 34080)를 사용하여 시각화되었다. 이미지J 소프트웨어(NIH)가 면역블롯의 밴드 강도의 정량화에 사용되었다.
면역세포화학법
세포를 폴리-L-리신(Sigma)으로 코팅된 커버슬립에서 배양하여 단백질의 세포 국소화를 관찰하였다. PBS(pH 7.4)에 4% 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 실온에서 15분 동안 고정하고 PBS로 3회 세척하였다. 고정 후, 세포를 PBS 용액에 0.5% Triton X-100으로 15분 동안 투과화시키고 PBS로 3회 세척하였다. 상기 세포는 실온에서 1h 동안 2% BSA를 포함하는 PBS 용액에서 차단되었다. 이어서, 상기 세포를 2% BSA/PBS 용액에 희석한 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양한 후, PBS로 세포를 10분 동안 3회 세척하고, 2% BSA/PBS에 희석된 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)-컨쥬게이트 이차 항체와 함께 실온에서 30분 동안 배양하였다. DAPI 함유 봉입제(Vector Laboratories)를 사용하여 커버슬립을 유리 슬라이드에 장착했다. 공초점 이미지는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 510 Meta(Zeiss)로 촬영하고 자이스(Zeiss) LSM 이미지 브라우저 (버전 4.2.0.121)로 분석했다.
[시험예 1] 활성 RAS의 표적 분해 확인
본 발명자는 본 개시의 일 실시예에 따른 콘쥬게이트 화합물, 즉 RAS-AUTOTACs의 상기 TBL 영역이 RAS에 결합하고 상기 ATL 영역이 p62에 결합하여 p62 올리고머화 및 오토파고좀에 대한 표적화를 유도하여 리소좀과의 융합을 통해 RAS의 오토파지 분해를 유도한다고 가정했다(도 1a). 먼저, 정상세포에서 RAS-AUTOTACs가 오토파지를 활성화하는지 여부를 조사하기 위해 면역 블롯팅(Immunoblotting) 분석을 수행했다. HeLa 세포는 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독) 또는 실시예 1(화합물 A)과 함께 24시간 동안 배양하였다. MRC5 세포는 실시예 1(화합물 A)과 함께 FBS가 없는 배지에서 24시간 동안 배양하고 EGF 50 ng/ml 조건에서 10분 동안 배양하였다. 이때 실시예 1의 함량은 각각 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 또는 3 μM였다. 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독) 또는 실시예 1(화합물 A)로 처리된 Hela 세포에서의 면역블롯팅 분석은 화합물 A가 p62를 안정화하고 용량 의존적 방식으로 LC3 지질화가 증가된 것으로 나타나는 오토파고좀을 형성함을 보여주었다(도 1b 및 도 1c). 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독)과 비교하여, 실시예 1(화합물 A)은 RAS-AUTOTACs 리쿠르트 카고(recruit cargo) RAS를 초래하여 활성 오토파고좀 형성을 촉진하는 더 향상된 오토파지 활성화 효능을 나타내었다. 실시예 1(화합물 A)의 용량 의존적 오토파지 활성화는 다양한 KRAS 돌연변이 인간 세포주, H23(KRAS G12C 폐암), DLD1(KRAS G13D 결장암) 및 A549(KRAS G12S 폐암) 세포들에서도 관찰되었다(도 1d 내지 도 1g). 이때, 상기 각 KRAS 돌연변이 인간 세포주들은 실시예 1(화합물 A)이 용량 의존적으로 포함되고 FBS가 제외된 배지에서 24시간 동안 배양 후 EGF 50 ng/ml를 처리하여 10분 동안 배양하여 준비하였다. 동일한 방법으로 실험할 결과, 실시예 2(화합물 B)도 용량 의존적 오토파지 활성화 효능을 나타냈다(도 1h 및 도 1i). 또한, 본 발명자는 실시예 1(화합물 A)이 면역세포화학 분석에서 p62 응집 형성을 유도하는 것을 관찰했다(도 1j). 도 1j는 실시예 1(화합물 A)이 첨가된 배지에서 24시간 동안 배양된 H23 세포의 이미지이다. 이러한 결과는 본 개시의 일 실시예에 따른 콘쥬게이트 화합물인 RAS-AUTOTAC이 p62와의 결합을 통해 오토파지를 활성화하며, 오토파지 활성화 효능이 ATL보다 더 효율적임을 시사한다.
RAS-AUTOTACs가 RAS를 분해하는지 확인하기 위해, 다양한 KRAS 돌연변이 인간 암 세포주에서 면역 블롯팅 분석을 수행했다. 실시예 1(화합물 A)은 H23 G12C KRAS 돌연변이 인간 폐암 세포, DLD1 G13D KRAS 돌연변이 인간 결장직장암 세포 및 A549 G12S KRAS 돌연변이 인간 폐암 세포에서 0.7 - 1.2 μM의 DC50으로 내인성 KRAS 분해를 유도했다(도 2a 내지 도 2i). 또한, 본 개시에서 일 실시예로 사용된 타겟-결합 리간드의 다른 RAS 아형들의 분해를 확인했다. 그 결과, 실시예 1(화합물 A)은 0.7 - 1.5 μM의 DC50으로 다양한 KRAS 돌연변이 세포주에서의 KRAS뿐만 아니라 NRAS도 분해하였다. 실시예 2(화합물 B)는 또한 KRAS에서 0.6μM, NRAS에서 1.2μM의 DC50으로 KRAS 및 NRAS 분해를 보여주었다(도 2j 내지 도 2l).
실시예 1(화합물 A)에 의해 유도된 RAS 분해 효능을 검증하기 위해, 상이한 시점에서 RAS 분해를 확인하였다. 이때 A549 세포를 FBS가 제외된 배지에서 24시간 동안 배양하고, 실시예 1(화합물 A), 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독) 또는 비교예 2(화합물 A의 TBL 단독; Abd-7)를 처리한 후 4, 24 또는 48시간 동안 배양하였으며, 이후 EGF 50 ng/ml 첨가 후 10 분간 더 배양하여 준비하였다. 상기 배양된 세포로부터 각 시간대의 RAS 분해 효능을 확인한 결과, KRAS 및 NRAS 분해는 24시간 내에서 피크게 도달하였고 RAS 단백질 수준은 48시간 내에 회복되었다(도 2m). RAS 분해가 실시예 1(화합물 A)에 의해 유도되는지 여부를 조사하기 위해, RAS 분해를 ATL 및 TBL 단독 처리(비교예 1 및 비교예 2)와 비교하여 확인한 결과, ATL 및 TBL 단독 처리는 RAS 분해를 유도하지 않았다(도 2n 및 도 2o). RAS 분해가 세포 독성을 유발하는지 확인하기 위해 다양한 세포주에서 세포 생존력을 확인한 결과, ATL 또는 TBL의 단독 처리는 MRC5, DLD1 및 A549 세포주에서 상대적으로 높은 IC50을 나타내었고 정상 세포주와 비교하여 KRAS 돌연변이 세포주에 대한 유의한 독성은 없었다. 그러나, 실시예 1(화합물 A)은 72시간 내에 MRC5(3.9μM), DLD1(2.0μM), A549(2.6μM)에서 ATL 또는 TBL보다 더 높은 세포독성을 나타내었고(도 2p 내지 도 2r 및 표 2), 이는 또한 KRAS 돌연변이 세포주에 대해 약간 더 높은 독성을 나타내었다. 그러나, 실시예 1(화합물 A)은 정상 세포에 대한 독성이 상대적으로 높기 때문에, 이 독성에 대해서는 추후 연구에서 조사가 필요하다. 이들 결과는 실시예 1(화합물 A)이 KRAS 돌연변이 세포주에서 RAS 표적화된 분해를 유도했음을 입증한다.
처리 72시간 경과 후 세포 생존량, IC50(μM)
실시예 1(화합물 A) 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독) 비교예 2(화합물 A의 TBL 단독)
MRC5 3.9 6.4 10.5
DLD1 2.0 17.1 13.2
A549 2.6 18.3 19.8
[시험예 2] RAS 신호전달 억제 확인
RAS 다운스트림 신호 전달 경로 중 RAS 의존성 종양원성 활성과 연결된 MAPK 경로(RAF-MEK-ERK 신호 전달) 및 PI3K 경로(PI3K-AKT-mTOR 신호 전달)가 확인되었다(Simanshu et al., 2017). 실시예 1(화합물 A) 또는 실시예 2(화합물 B)에 의해 유도된 RAS 분해가 RAS의 다운스트림을 억제하는지 여부를 검증하기 위해 AKT의 인산화, ERK 및 MEK의 인산화를 지칭하는 AKT, ERK 및 MEK의 활성화를 조사했다. 실험에 앞서 H23, A549 또는 DLD1 세포를 각각 FBS가 제외되고 실시예 1(화합물 A) 또는 실시예 2(화합물 B)를 첨가한 배지에서 24시간 동안 배양한 후 EGF 50 ng/ml 첨가 후 10분 동안 배양하여 준비하였다. 상기 준비된 A549 세포에서, 실시예 1(화합물 A)은 ERK의 인산화 감소 및 MEK의 인산화를 나타내는 MAPK 경로를 하향 조절하고 AKT의 인산화 감소를 나타내는 PI3K 경로의 억제를 나타냈다(도 3a). 또한 실시예 2(화합물 B)가 RAS 의존적 다운스트림 신호전달을 억제한다는 것을 확인했다(도 3b). 이전 연구에서는 3시간 동안의 Abd-7(실시예 1 및 2의 TBL) 처리가 10μM에서 AKT 및 ERK의 인산화를 50% 억제하고 20μM에서 완전히 억제하는 것으로 보고했다(Quevedo et al., 2018). 실시예 1(화합물 A)의 RAS 다운스트림 신호전달 억제 효능을 비교예 2(화합물 A의 TBL 단독)과 비교하기 위해, 본 발명자들은 시간 의존적 및 용량 의존적 방식으로 면역블롯팅 분석을 수행하였다. 실시예 1(화합물 A)에 의한 RAS 분해는 24시간부터 보이나, 4시간부터 다운스트림 억제효과를 보였다. 즉, 실시예 1(화합물 A)은 4시간 동안 2.5μM 처리에서 Akt의 인산화 및 ERK 및 MEK의 인산화를 완전히 억제했으며(도 3c), 이는 비교예 2(화합물 A의 TBL 단독)의 20μM에서 나타난 것이었다(도 3d). 즉, 실시예 1(화합물 A)의 RAS 신호전달 억제의 효능은 24시간까지 지속되었지만 비교예 2(화합물 A의 TBL 단독)는 그렇지 않았다(도 3c 및 도 3d). 비교예 2의 경우 고농도의 4시간에서만 보이고 저농도, 오랫동안 처리하였을 때에는 억제가 보이지 않는데, 이는 TBL 자체의 생체 내에서의 활성이 낮거나 내성 등의 문제가 있기 때문이다. 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독)은 RAS의 다운스트림 신호에 영향을 미치지 않았다(도 3e). 이러한 데이터는 RAS 표적 분해가 더 개선된 RAS 신호전달 억제 효능을 갖는다는 것을 입증한다.
[시험예 3] P62 응집의 RAS 비활성화 유도 확인
본 발명자는 오토파지 타겟팅 리간드가 p62의 ZZ 도메인에 결합하고, p62가 PB1 도메인을 통해 응집체를 형성하고 LIR 도메인을 통해 오토파고좀을 표적화한다는 것을 확인하였다. 본 개시의 데이터는 RAS가 실시예 1(화합물 A) 처리 후 24시간 내에 분해되는 반면, 다운스트림은 분해 전인 4시간 동안 억제된다는 것을 보여주었다(도 2m 및 도 3c). p62 응집체 형성이 RAS 억제를 유도하는지 여부를 조사하기 위해 RAS 및 p62 항체를 사용하여 면역세포화학을 수행하였다. FBS가 제외된 배지에서 24시간 동안 배양된 A549 세포주에 실시예 1(화합물 A)를 처리하고 4시간 배양 후 EGF 50 ng/ml를 첨가하여 10분 동안 더 배양하여 준비하였으며, 이를 고정화시켰다. 그 결과, 실시예 1(화합물 A) 처리 4시간 후, RAS는 응집체를 형성하고 p62 응집체에 국소화되었다(도 4a). 동일한 방법으로 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독) 또는 비교예 2(화합물 A의 TBL 단독) 처리시에는 p62는 응집체를 잘 형성하지 못하고 RAS와 함께 국소화되지 않았다.
이러한 데이터는 본 개시의 일 실시예에 따른 콘쥬게이트 화합물인 RAS-AUTOTAC이 RAS와 함께 p62 올리고머화를 유도하고 RAS가 분해 전에 생물학적으로 비활성화된다는 것을 보여준다.
[시험예 4] 오토파지를 통한 RAS 분해
위 실험에서 본 발명자는 실시예 1(화합물 A)이 오토파지를 통해 RAS를 분해하는지 여부를 확인했다. 오토파고좀에서 RAS의 세포 위치를 확인하기 위해, 본 발명자는 RAS와 LC3를 사용하여 면역 세포 화학을 수행했다. 먼저, A549 세포주에 오토파지 억제제인 히드록시클로로퀸(hydroxychloroquine; HCQ)가 처리되거나 처리되지 않은 FBS가 제외된 배지에서 실시예 1(화합물 A)를 처리하고 24시간 동안 배양한 후 EGF 50 ng/ml를 첨가하여 10분 동안 더 배양하여 준비하였으며, 이를 고정화시켰다. 면역세포화학 분석 결과, 실시예 1(화합물 A) 유도 RAS 응집을 나타내며 오토파고좀과 공동 국소화된 반면 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독) 또는 비교예 2(화합물 A의 TBL 단독) 처리시에는 그렇지 않았다(도 4b). 면역블롯팅 분석은 RAS 분해가 오토파지 억제제인 히드록시클로로퀸(hydroxychloroquine; HCQ) 처리시 차단되었음을 보여준다(도 4c) 또한, 실시예 1(화합물 A) 유도 RAS 다운스트림 신호전달 억제가 HCQ 처리시 차단되었다 ERK의 인산화 및 AKT의 인산화로 다시 회복되었음을 보여준다(도 4c). 오토파지 플럭스가 억제되었을 때, 실시예 1(화합물 A) 유도 RAS 응집은 p62 응집과 함께 분해되지 않고 공동 국소화되었다(도 4d).
이는 본 개시의 일 실시예에 따른 콘쥬게이트 화합물인 RAS-AUTOTAC이 오토파지를 통해 RAS를 분해한다는 것을 증명한다.
[시험예 5] 마우스 이종이식 모델에서 종양 성장 억제
본 개시의 일 실시예에 따른 콘쥬게이트 화합물인 RAS-AUTOTAC이 이종이식 마우스 모델에서 효율적일 수 있는지 여부를 결정하기 위해 SCID 마우스에 A549 KRAS G12S 세포를 피하 접종했다. 실시예 1(화합물 A) 또는 비히클(DMSO)을 3주 동안 정맥내(IV) 주사로 처리하고 최종 주사 후 하루에 희생시켰다. 그 결과 실시예 1(화합물 A)은 종양 부피 변화 및 종양 중량을 나타내는 G12S KRAS 종양 성장을 억제하였다(도 5a 내지 도 5c). 상기 종양 성장 억제 효과가 실시예 1(화합물 A)에 의존적임을 확인하기 위해, 종양 성장 억제를 나타내지 않은 마우스 이종이식 모델에서 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독) 또는 비교예 2(Abd-7 단독) 처리시와 비교하였다(도 5d 내지 도 5h). 비교예 1(화합물 A의 ATL 단독)와 비히클(도 5g 및 도 5h) 사이의 종양 부피 변화에는 유의한 차이가 없었지만, 비교예 2(화합물 A의 TBL 단독)는 비히클과 비교하여 증가된 종양 중량 및 종양 부피 변화를 나타냈다(도 5d, 도 5e 및 도 5f). 그러나 비교예 2(화합물 A의 TBL 단독)에 의해 증가된 종양 부피 변화는 비히클에 비해 비교예 2가 종양 성장을 자극하고, 이는 비교예 2인 Abd-7이 RAS를 타겟하여 영향을 미치는 것으로 간주되지만, 종양 성장을 억제하기에는 충분하지 않거나 생체내 Abd-7의 수명이 너무 짧고 불안정하여, 상기 Abd-7의 효과가 생체 내가 아닌 세포 수준으로 제한되는 것으로 나타났다(도 5d, 도 5e 및 도 5f). RAS 분해 및 다운스트림 신호전달이 종양에서 억제되었는지 확인하기 위해 면역블롯팅 분석 및 면역조직화학을 수행한 결과(도 5i, 도 5j 및 도 5k), 종양 성장이 실시예 1(화합물 A) 처리 시 유의한 억제를 나타내었음에도 불구하고, 시험관내 실험에서 나타난 바와 같이 RAS 분해 및 다운스트림 신호전달 변경을 확인하지 못했다. 최종 주사 후 하루에 마우스를 희생함에 따라 마우스에 투여된 실시예 1(화합물 A)의 수명은 비교적 짧거나 하루 동안 RAS 단백질이 새로 발현되어, 도 2m에 나타난 RAS 분해 회복과 상관관계가 있는 다운스트림 신호 전달 단백질과 마찬가지로 RAS 수준에 차이가 없었다. 다음으로, 실시예 2(화합물 B)의 종양 성장 억제 효능을 조사하기 위해, 본 발명자들은 10주령 SCID 마우스에 A549 KRAS G12S 세포(5 Х 106)를 피하 접종하였으며, 접종 후 12일째에 주사를 시작하였다(도 6a). 실시예 2(화합물 B) 또는 비히클(DMSO)을 4주 동안 주 5회 복강내(IP) 주사하여 처리하고 최종 주사 후 6시간 뒤 희생시켰다. 실시예 2(화합물 B)는 종양 부피 및 종양 중량으로 나타난 G12S KRAS 종양 성장을 억제했다(도 6b 내지 도 6d).
이러한 결과들은 본 개시의 일 실시예에 따른 콘쥬게이트 화합물이 종양 성장을 억제한다는 것을 시사하며, 이는 소분자 기반의 RAS 표적화 분해 플랫폼을 사용한 생체 내 효능을 보여주는 최초의 결과이다.

Claims (14)

  1. 화학식 1의 구조를 갖는 오토파지-타겟팅 리간드(autophagy-targeting ligand; ATL); 및
    화학식 2의 구조를 갖는 타겟-결합 리간드(target-binding ligand; TBL);
    를 포함하고, 상기 오토파지-타겟팅 리간드의 -OH기와 상기 타겟-결합 리간드의 1,4-다이옥산의 탄소가 직접적으로, 또는 링커를 통하여 결합된 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물;
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022011268-appb-img-000012
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2022011268-appb-img-000013
    상기 화학식 1에서,
    R1 및 R2는, 독립적으로, 수소 또는 플루오로이고,
    R3는 -(CH2)- 또는 -O-(CH2)-CH(OH)-(CH2)-이며, 여기서 -O-(CH2)-CH(OH)-(CH2)-의 O가 벤젠 고리에 결합된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 링커는 P-(CH2CH2O)x-(CH2)4-CONH-CH2-Q이며, 상기 P는 상기 오토파지-타겟팅 리간드의 -OH에 결합되고, 상기 Q는 상기 타겟-결합 리간드의 1,4-다이옥산의 탄소에 결합되며, 상기 x는 2 또는 3의 정수인, 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 화합물은 화학식 3의 구조를 갖는 것인, 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물:
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2022011268-appb-img-000014
    상기 화학식 3에서,
    R1 및 R2는, 독립적으로, 수소 또는 플루오로이고,
    R3는 -(CH2)- 또는 -O-CH2-CH(OH)-CH2-이고, 여기서 -O-CH2-CH(OH)-CH2-에서 O는 벤젠 고리에 결합되며,
    M은 -CH2-NHC(=O)-(CH2)4-(OCH2CH2)y-이고, 여기서 y는 2 또는 3의 정수이다.
  4. 제1항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 화합물은 1-(3,4-비스(벤질옥시)페닐)-N-((8-(5-((4-((디메틸아미노)메틸)페닐)아미노)-6-메톡시피리딘-2-일)-2,3-디하이드로벤조[b][1,4]다이옥신-2-일)메틸)-5,8,11-트리옥사-2-아자헥사데칸-16-아마이드(1-(3,4-bis(benzyloxy)phenyl)-N-((8-(5-((4-((dimethylamino)methyl)phenyl)amino)-6-methoxypyridin-2-yl)-2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-2-yl)methyl)-5,8,11-trioxa-2-azahexadecan-16-amide) 또는 ((2R)-1-(3,4-비스((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-N-((8-(5-((4-((디메틸아미노)메틸)페닐)아미노)-6-메톡시피리딘-2-일)-2,3-디하이드로벤조[b][1,4]다이옥신-2-일)메틸)-2-하이드록시-7,10,13,16-테트라옥사-4-아자헤니코산-21-아미드((2R)-1-(3,4-bis((4-fluorobenzyl)oxy)phenoxy)-N-((8-(5-((4-((dimethylamino)methyl)phenyl)amino)-6-methoxypyridin-2-yl)-2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-2-yl)methyl)-2-hydroxy-7,10,13,16-tetraoxa-4-azahenicosan-21-amide)인, 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 종양 유전자의 표적 분해용인, 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 암은 RAS 돌연변이 유래 암인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 RAS는 KRAS, NRAS 및 HRAS 중 하나 이상인, 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 암은 비소세포폐암(Non-small cell lung cancer; NSCLC), 결장암, 대장암, 췌장암, 위암, 난소암, 전립선암, 유방암, 림프종, 백혈병, 흑색종, 갑상선암, 다발성 골수종, 자궁경부암, 방광암, 요도암, 신장암 및 간세포암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  10. 제5항에 있어서, 상기 암은 KRAS G12C 폐암, KRAS G13D 결장암 및 KRAS G12S 폐암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  11. 제5항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물은 조성물 총 부피 기준으로 0.01 내지 100 μM로 포함되는, 조성물.
  12. 제5항에 있어서, 상기 상기 컨쥬게이트 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 투여량은 0.1 내지 1000mg/kg/day인, 조성물.
  13. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물인, 조성물.
  14. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인, 조성물.
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