WO2023277583A1 - 신규 plk1 단백질 분해 유도 화합물 - Google Patents

신규 plk1 단백질 분해 유도 화합물 Download PDF

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WO2023277583A1
WO2023277583A1 PCT/KR2022/009343 KR2022009343W WO2023277583A1 WO 2023277583 A1 WO2023277583 A1 WO 2023277583A1 KR 2022009343 W KR2022009343 W KR 2022009343W WO 2023277583 A1 WO2023277583 A1 WO 2023277583A1
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mmol
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류혜국
강금영
민임숙
김성훈
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(주) 업테라
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to a compound inducing PLK1 proteolysis, a method for preparing the same, and a use thereof.
  • PLK1 Poly-like kinase 1
  • PLK1 is a serine/threonine kinase that is known to be involved in G2/M phase conversion during cell growth and division. PLK1 is expressed and activated in a pulse form from the S phase to the G2/M phase, and is rapidly degraded upon completion of mitosis. PLK1 tends to be overexpressed in various carcinomas such as colorectal cancer, lung cancer, bladder cancer, and melanoma, and cancer cells overexpressing PLK1 tend to show resistance to various types of anticancer drugs. As PLK1 dependence has been revealed in various carcinomas, development of PLK1 inhibitor compounds such as volasertib (also known as volasertib; BI6727) has been attempted.
  • volasertib also known as volasertib; BI6727
  • PROTAC Protein-based platform technology capable of inducing proteolysis of a target protein in vivo.
  • PROTAC is a bifunctional compound in which a ligand molecule that binds to a disease-related target protein and an E3 ubiquitin ligase binding moiety are connected by a chemical linker.
  • PROTAC compounds can induce degradation of target proteins by positioning them near the E3 ubiquitin ligase.
  • a PROTAC compound targeting PLK1 Chinese Patent Publication No.
  • PROTAC compound in which a bolasultip derivative compound and a binding moiety for the E3 ubiquitin ligase CRBN are connected by a chemical linker.
  • the PROTAC compound is a compound characterized by simultaneously degrading PLK1 and BRD4 (bromodomain 4). Like PLK1 described above, BRD4 is also known as a potential therapeutic target in various carcinomas.
  • BRD4 is a protein belonging to the bromodomain and extraterminal domain (BET) family and regulates the expression of key proto-oncogenes such as c-Myc, Bcl-xL, and Bcl-2, and suppresses BRD4 to treat midline carcinoma, acute myeloid leukemia, It has been reported to be effective in multiple myeloma and pancreatic cancer.
  • BET bromodomain and extraterminal domain
  • One object of the present invention is to provide a PLK1 protein degradation inducing compound.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or neurological diseases, comprising a PLK1 proteolysis-inducing compound as an active ingredient.
  • the compounds of the present invention target PLK1 and BRD4 and degrade PLK1 and degrade BRD4 at an appropriate level within a range that does not cause side effects, they can be very useful for preventing or treating cancer or neurological diseases.
  • Figure 1 confirms the degrading activity of the compounds of the present invention on PLK1 and BRD4.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object is a compound represented by the following formula (I), a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • R 1 is -H, -CH 3 or -OCH 3 ;
  • R 2 is -H or -CH 3 ;
  • R 3 is -cyclopentyl or -cyclohexyl
  • R 4 is -C 1-3 alkyl
  • L ULM is -NH-CH 2 CH 2 - or ego
  • the compound of Formula I is a bifunctional compound in which a target protein binding moiety and an E3 ubiquitin ligase binding moiety are connected by a chemical linker.
  • the linker is composed of -L ULM -L INT -L PTM -.
  • the compound of formula I of the present invention has activity to target and degrade PLK1 and BRD4, and further degrades BRD4 at an appropriate level without completely degrading it, thereby having anticancer activity and reducing the risk of side effects.
  • the compound represented by Formula I of the present invention has strong inhibition of PLK1 and weak inhibition of BRD4, so that it can be used for the purpose of preventing or treating cancer or neurological diseases without side effects compared to previously known PROTAC substances.
  • the compound represented by Formula I may be Compound 1 to Compound 11 shown in Table 1 below.
  • the term "pharmaceutically acceptable salt” is used herein to refer to acid addition salts or base addition salts suitable or compatible for the treatment of patients.
  • exemplary inorganic acids which form suitable salts include hydrochloric, hydrobromic, sulfuric and phosphoric acids as well as metal salts such as sodium monohydrogen orthophosphate and potassium hydrogen sulfate.
  • exemplary organic acids which form suitable salts include mono-, di- and tricarboxylic acids such as glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, fumaric acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, maleic acid.
  • Mono- or di-acid salts may be formed, and such salts may exist in hydrated, solvated or substantially anhydrous form.
  • acid addition salts of the compounds of this invention are more soluble in water and various hydrophilic organic solvents and generally exhibit higher melting points compared to their free base forms. The selection of suitable salts is known to those skilled in the art.
  • non-pharmaceutically acceptable salts such as oxalates
  • exemplary inorganic bases that form suitable salts include lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, or barium hydroxides.
  • exemplary organic bases which form suitable salts include aliphatic, cycloaliphatic or aromatic organic amines such as methylamine, trimethylamine and picoline or ammonia.
  • contemplated salts of the present invention include alkyl, dialkyl, trialkyl or tetra-alkyl ammonium salts.
  • contemplated salts of the present invention include L-arginine, benentamine, benzathine, betaine, calcium hydroxide, choline, theanol, diethanolamine, diethylamine, 2-(diethylamino)ethanol, Ethanolamine, ethylenediamine, N-methylglucamine, hydrabamine, 1H-imidazole, lithium, L-lysine, magnesium, 4-(2-hydroxyethyl)morpholine, piperazine, potassium, 1-(2- hydroxyethyl)pyrrolidine, sodium, triethanolamine, tromethamine, and zinc salts.
  • the compounds of the present invention include all possible optical isomers as well as pharmaceutically acceptable salts thereof without limitation.
  • Stereoisomers of the compounds of this invention can be prepared using methods known in the art.
  • the compounds of the present invention may be prepared in crystalline or amorphous form. If the compound is prepared in crystalline form, it may optionally be hydrated or solvated.
  • the compounds of the present invention may be formulated as any therapeutic pharmaceutical composition or in a form suitable for use in any of the methods disclosed herein, such as prophylactic or therapeutic methods.
  • Another aspect of the present invention for achieving the above object is a pharmaceutical preparation for the prevention or treatment of cancer or neurological diseases comprising the compound of Formula I, a stereoisomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. is a composition
  • Another aspect of the present invention is a method for preventing or treating cancer or neurological disease comprising the step of administering the compound represented by Formula I, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof to be.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the compound represented by Formula I, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the prevention or treatment of cancer or neurological diseases.
  • the compound of the present invention can degrade the target protein PLK1 at the source, it achieves an excellent PLK1 inhibitory effect compared to conventional PLK1 small molecule inhibitors that inhibit the simple activity of PLK1, and shows excellent pharmacological effects according to PLK1 inhibition.
  • the compound of the present invention can achieve a desired pharmacological effect by degrading another target protein, BRD4, at an appropriate level, and can minimize side effects due to excessive inhibition of BRD4. Therefore, the pharmaceutical composition comprising the compound represented by Formula I, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention inhibits PLK1 and BRD4, and thus is very useful for preventing or treating cancer or neurological diseases. can be used
  • the term “subject” or “patient” includes human and non-human animals.
  • Non-human animals include vertebrates such as mammals and non-mammals such as non-human primates, sheep, cats, horses, cows, chickens, dogs, mice, rats, goats, rabbits, and pigs.
  • the subject is a human.
  • the terms "patient” or “subject” are used interchangeably herein.
  • the terms “treat”, “treating” or “treatment” of any disease, condition or disorder means alleviating or ameliorating the disease, condition or disorder (i.e., the condition or clinical symptoms thereof). delaying or preventing the occurrence of at least one of them); or alleviating or ameliorating at least one somatic parameter or biomarker associated with a disease, condition or disorder, including one not perceptible to the patient.
  • the terms “prevent”, “preventing” or “prevention” of any disease, condition or disorder means prophylactic treatment of the disease, condition or disorder; or delaying the onset or progression of a condition or disorder.
  • cancer includes all cancers that can exhibit preventive or therapeutic effects due to inhibition of PLK1 and BRD4 activity, and may be solid cancer or hematological cancer.
  • the cancer is squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, peritoneal cancer, skin cancer, skin or intraocular melanoma, rectal cancer, perianal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer Adenocarcinoma, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, hepatocellular carcinoma, gastrointestinal cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, liver tumor, breast cancer, colon cancer , colorectal cancer, endometrial or uterine
  • neurological diseases include all neurological diseases that can exhibit preventive or therapeutic efficacy due to the inhibition of PLK1 and BRD4 activity, and specifically include central nervous system diseases, degenerative neurological diseases, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis, and Huntington's disease. , senile dementia, epilepsy, Lou Gehrig, stroke, and brain or spinal cord injury followed by nerve damage and axonal degeneration-related disorders, but may be one or more selected from, but is not limited thereto.
  • composition or “pharmaceutical composition” may further include one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the compound of the present invention to facilitate administration of the compound to a patient or subject, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is a non-active ingredient, that is, a pharmaceutically acceptable excipient, and can be appropriately selected by a person skilled in the art by referring to [Handbook of Pharmaceutical Excipients] and the like.
  • Suitable routes of administration include, but are not limited to, oral administration, parenteral administration, such as intramuscular, intravenous, or subcutaneous administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain at least one active ingredient exhibiting the same or similar efficacy in addition to the compound represented by Formula I, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Embodiments of the present invention may be modified in various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below.
  • embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.
  • "include” a certain component throughout the specification means that other components may be further included without excluding other components unless otherwise stated.
  • Example 1 4-(((R)-8-cyclopentyl-7-ethyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N-(2 -(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)- Preparation of 3-methoxybenzamide (Compound 1)
  • Step 4 4-(((R)-8-Cyclopentyl-7-ethyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N-(2- (2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl)-3 -Synthesis of methoxybenzamide (Compound 1)
  • Example 2 4-(((R)-8-cyclopentyl-5-methyl-6-oxo-7-propyl-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)- N-(2-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)ethoxy)ethoxy Preparation of )ethyl)-3-methoxybenzamide (Compound 2)
  • Step 7 4-(((R)-8-Cyclopentyl-5-methyl-6-oxo-7-propyl-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N -(2-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)ethoxy)ethoxy) Synthesis of ethyl)-3-methoxybenzamide (Compound 2)
  • the filtrate was prepared by prep-HPLC (column: Phenomenex luna C 18 150 * 25 mm * 10 ⁇ m; mobile phase: [water (0.225% FA) - ACN]; B%: 19% - 55%, 12 min ) was purified. After adjusting pH > 7 by adding NaHCO 3 solution, the mixture was extracted with DCM (20 mL x 3). The organic phase was dried over Na 2 SO 4 and concentrated. The residue was diluted with H 2 O (10 mL) and ACN (10 mL) and lyophilized.
  • Example 3 4-(((R)-8-cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)- N-(2-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)ethoxy)ethoxy Preparation of )ethyl)-3-methylbenzamide (Compound 3)
  • Step 3 4-(((R)-8-Cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N -(2-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)ethoxy)ethoxy) Synthesis of ethyl)-3-methylbenzamide (Compound 3)
  • prep-HPLC column: Phenomenex Synergi C 18 150*25 mm * 10 ⁇ m; mobile phase: [water(0.225%FA)-ACN]; B%: 14%-53%, 13 min
  • MS(M+H) + 796.5
  • Example 4 4-(((R)-8-cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)- N-(2-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)ethoxy)ethoxy Preparation of )ethyl)benzamide (Compound 4)
  • Step 3 4-(((R)-8-Cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N -(2-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)ethoxy)ethoxy) Synthesis of ethyl)benzamide (Compound 4)
  • prep-HPLC column: Phenomenex Synergi C 18 150*25 mm * 10 ⁇ m; mobile phase: [water(0.225%FA)-ACN]; B%: 17%-53%, 12 min
  • purified and lyophilized to form a yellow solid Compound (30.4 mg, 38.10 ⁇ mol, 21.53 % yield, 98 % purity) was obtained.
  • MS(M+H) + 782.7
  • Example 5 4-(((R)-8-cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)- N-(14-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)-3,6,9,12-tetraoxa Preparation of tetradecyl)-3-methoxybenzamide (Compound 5)
  • Step 3 4-(((R)-8-Cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N -(14-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)-3,6,9,12-tetraoxatetra Synthesis of decyl)-3-methoxybenzamide (Compound 5)
  • prep-HPLC column: Phenomenex Synergi C 18 150*25 mm * 10 ⁇ m; mobile phase: [water(0.225% FA)-ACN]; B%: 19%-55%, 12 min
  • MS(M+H) + 900.8
  • Example 6 4-(((R)-8-cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)- N-((3S)-1-(4-(4-(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)piperazine-1 Preparation of -yl) -4-oxobutanoyl) pyrrolidin-3-yl) -3-methoxybenzamide (Compound 6)
  • Step 1 4-(((R)-8-Cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N -((3S)-1-(4-(4-(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)piperazine-1- Synthesis of yl)-4-oxobutanoyl)pyrrolidin-3-yl)-3-methoxybenzamide (Compound 6)
  • Example 7 4-(((R)-8-cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)- N-(1-(3-(4-(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)piperazin-1-yl)pro Preparation of Panoyl)piperidin-4-yl)-3-methoxybenzamide (Compound 7)
  • Step 1 4-(((R)-8-Cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N -(1-(3-(4-(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)piperazin-1-yl)propano Synthesis of yl)piperidin-4-yl)-3-methoxybenzamide (Compound 7)
  • Example 8 4-(((R)-8-cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)- N-(1-(4-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)butanoyl)piperidin-4 Preparation of -yl)-3-methoxybenzamide (Compound 8)
  • Step 5 4-(((R)-8-Cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N -(1-(4-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)butanoyl)piperidin-4- Synthesis of yl)-3-methoxybenzamide (Compound 8)
  • Example 9 4-(((R)-8-cyclohexyl-5,7-dimethyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N- (2-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl Preparation of )-3-methoxybenzamide (Compound 9)
  • Step 6 4-(((R)-8-Cyclohexyl-5,7-dimethyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N-( 2-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)ethoxy)ethoxy)ethyl) Synthesis of -3-methoxybenzamide (Compound 9)
  • Example 10 4-(((R)-8-cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)- N-((1r,4R)-4-(4-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindoline-4- Preparation of yl)amino)ethoxy)ethyl)piperazin-1-yl)cyclohexyl)-3-methoxybenzamide (Compound 10)
  • Step 1 4-(((R)-8-Cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N -((1r,4R)-4-(4-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl Synthesis of )amino)ethoxy)ethyl)piperazin-1-yl)cyclohexyl)-3-methoxybenzamide (Compound 10)
  • Example 11 4-(((R)-8-cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)- N-((1r,4R)-4-(4-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino Preparation of )ethyl)piperazin-1-yl)cyclohexyl)-3-methoxybenzamide (Compound 11)
  • Step 4 4-((2-(4-((1r,4r)-4-aminocyclohexyl)piperazin-1-yl)ethyl)amino)-2-(2,6-dioxopiperidin-3 Synthesis of -yl)isoindoline-1,3-dione (7)
  • Step 5 4-(((R)-8-Cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-5,6,7,8-tetrahydropteridin-2-yl)amino)-N -((1r,4R)-4-(4-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino) Synthesis of ethyl) piperazin-1-yl) cyclohexyl) -3-methoxybenzamide (Compound 11)
  • HeLa and HEK293T cell lines were transfected with the LgBit vector to construct stable expression cell lines.
  • gRNA and donor were prepared to express the HiBit amino acid sequence behind the C-terminus of the PLK1 and BRD4 proteins in each cell, and then inserted into the cell together with a vector capable of expressing CRISPR/Cas9. Only cells in which knock-in was performed after insertion was completed were selected and then passaged and used.
  • Thermo's cell counter (Catalog # AMQAX1000) and 0.4% trypan blue solution were used.
  • DMEM For cell culture, DMEM (Gibco, Cat. No. 11995-065; Lot. No. 2307627), FBS (Gibco, Cat. No. 16000-044; Lot. No. 2351176P), penicillin/streptomycin (Gibco, Cat. No. 15140-122; Lot. No. 2321150), 100 mm2 cell culture dish (SPL, Cat. No. 20100), 150 mm2 cell culture dish (SPL, Cat. No. 20150), 96 well white plate ( SPL, Cat. No. 30196), PBS pH 7.4 (Gibco, Cat. No. 10010-023; Lot. No. 2085080), TrypLE TM Express (Gibco, Cat. No. 12605-010; Lot. No. 2070638) , a counting chamber (Hirschmann, Cat. No. 8100204), and a 0.4% trypan blue solution (DYNEBIO, Cat. No. CBT3710; Lot. No. 20190723) were used.
  • HEK293T LgBit (BRD4-HiBit KI)
  • 4 ⁇ 10 4 cells were seeded in each well of a 96-well white plate (SPL), and the cells were cultured in a culture medium volume of 150 ⁇ l.
  • the comparative example which is a known PROTAC, decomposed both PLK1 and BRD4 at a level of 80% or more. It showed a relatively weak decomposition activity compared to the comparative example at the % level.

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Abstract

본 발명은 PLK1 단백질 분해 유도 화합물, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물들은 PLK1 및 BRD4를 표적으로 하여 PLK1을 분해하고, BRD4를 부작용이 유발되지 않는 범위 내에서 적정 수준으로 분해하므로, 암 또는 신경질환의 예방 또는 치료 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 PLK1 단백질 분해 유도 화합물
본 발명은 PLK1 단백질 분해 유도 화합물, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
PLK1 (Polo-like kinase 1)은 세린/트레오닌 인산화효소로서 세포 성장 및 분열 중에 G2/M 기의 전환에 관여하는 것으로 알려져 있다. PLK1은 S 기부터 G2/M 기까지 펄스 형태로 발현되고 활성화되었다가, 유사분열이 종료되면서 빠르게 분해된다. PLK1은 대장암, 폐암, 방광암, 흑색종 등 다양한 암종에서 과발현 되는 양상을 띄며, PLK1이 과발현된 암세포는 여러 종류의 항암제에 대해 저항성을 나타내는 경향을 보인다. 이와 같이 다양한 암종에서 PLK1 의존성이 밝혀짐에 따라, 볼라설팁 (volasertib; BI6727로도 알려짐) 등 PLK1 억제제 화합물들의 개발이 시도된 바 있다.
그러나, 기존 PLK1 억제제들은 임상적으로 안전성이 확보된 농도에서 PLK1 활성을 충분히 억제하지 못하는 결과를 보였다. 즉, 암세포의 세포 주기를 일시적으로 지연시키더라도 결국 일부 암세포에서 세포 주기가 재개시되어, 충분한 임상적 효과를 거두지 못하는 문제가 있었다 (Gheghiani et al., Cell Reports, 2017, 19: 2060 등). 실제로 베링거잉겔하임, GSK 등 다수 제약사들이 저분자화합물 기반의 PLK1 억제제 개발을 시도하였으나 대부분 임상시험 단계에서 실패하거나 중단되어 현재까지 상용화된 PLK1 억제제는 전무한 상태이다. 이는 저분자화합물 억제제와 같이 PLK1의 활성부위에 결합하여 효소 활성을 억제하는 방식으로는 충분히 효과적이지 않음을 시사하며, 따라서 저분자화합물이 아닌 새로운 방식의 PLK1 표적 치료제 개발의 필요성이 대두되고 있다.
한편 최근 들어, 표적 단백질의 체내 단백질 분해 (proteolysis)를 유도할 수 있는 저분자 화합물 기반 플랫폼 기술로서 PROTAC (Proteolysis targeting chimera)이 제시된 바 있다. PROTAC이란 질환 관련 표적 단백질에 결합하는 리간드 분자와 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티가 화학적 링커로 연결된 이기능성 화합물이다. PROTAC 화합물은 질환 관련 표적 단백질을 E3 유비퀴틴 라이게이즈 근처에 위치시킴으로써, 표적 단백질의 분해를 유도할 수 있다. PLK1을 타겟 단백질로 하는 PROTAC 화합물의 경우, 중국 공개특허 제106543185호는 볼라설팁 유도체 화합물과 E3 유비퀴틴 라이게이즈 CRBN에 대한 결합 모이어티를 화학적 링커로 연결한 PROTAC 화합물을 일부 개시한다. 상기 PROTAC 화합물은 PLK1 및 BRD4 (bromodomain 4)를 동시에 분해하는 것에 특징이 있는 화합물이다. 상술한 PLK1과 마찬가지로 BRD4 역시 다양한 암종에서 잠재성이 높은 치료 표적으로 알려져 있다. BRD4는 BET (bromodomain and extraterminal domain) 패밀리에 속하는 단백질로 c-Myc, Bcl-xL, Bcl-2와 같은 핵심 원암 유전자 발현을 조절하며, BRD4를 억제함으로써 중간선암 (midline carcinoma), 급성골수성백혈병, 다발성 골수종, 췌장암 등에 효과가 있는 것으로 보고되었다. 또한, 최근 급성골수성백혈병과 췌장암 환자에서 PLK1과 BRD4 억제의 시너지 효과가 보고된 바 있어 (Mu et al., Biochem Biophys Res Commun., 2020, 521(4): 833), PLK1과 BRD4를 동시에 분해할 수 있는 PROTAC 개발에 대한 기대감이 높은 상황이다.
그러나 BRD4의 활성을 너무 강하게 억제하면 약리 효과와 함께 혈액 독성 및 위장관 독성 같은 온 타겟 부작용 (on target toxicity)이 필연적으로 동반된다는 사실이 보고된 바 있다 (Bolden et al., Cell Reports, 2014, 8(6): 1919). 따라서 PLK1과 BRD4를 동시에 표적으로 하는 PROTAC을 개발하는데 있어서 BRD4의 분해 수준을 적절히 조절하는 것이 부작용 발생 가능성을 최소화할 수 있다는 점에서 상당히 중요하다.
본 발명자들은 PLK1 및 BRD4를 동시에 표적으로 하면서도 독성을 나타내지 않는 신규 PROTAC 화합물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, PLK1에 대해서는 강한 분해 활성을 가지면서도 BRD4는 적정 수준으로 분해하는 신규 PROTAC 화합물을 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 PLK1 단백질 분해 유도 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 PLK1 단백질 분해 유도 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 또는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 화합물들은 PLK1 및 BRD4를 표적으로 하여 PLK1을 분해하고, BRD4를 부작용이 유발되지 않는 범위 내에서 적정 수준으로 분해하므로, 암 또는 신경질환의 예방 또는 치료 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 화합물들의 PLK1 및 BRD4에 대한 분해 활성을 확인한 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염이다:
[화학식 I]
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000001
상기 화학식 I에서,
R1은 -H, -CH3 또는 -OCH3이고,
R2는 -H 또는 -CH3이고,
R3는 -시클로펜틸 또는 -시클로헥실이고,
R4는 -C1-3알킬이고,
LULM은 -NH-CH2CH2- 또는
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000002
이고,
LINT는 -(OCH2CH2)n-, -(C=O)-CH2CH2-(C=O)-, -CH2CH2-(C=O)-, -CH2-(C=O)-,
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000003
또는
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000004
이고 (여기서, n은 2 내지 4의 정수임), 및
LPTM은 -NH-(C=O)-,
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000005
,
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000006
또는
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000007
이다.
상기 화학식 I의 화합물은 표적 단백질 결합 모이어티와 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티가 화학적 링커로 연결된 이기능성 화합물이다. 화학식 I에서 링커는 -LULM-LINT-LPTM-으로 구성된다. 본 발명의 화학식 I의 화합물은 PLK1 및 BRD4를 표적으로 하여 이들을 분해하는 활성을 가지며, 나아가 BRD4를 완전히 분해하지 않고 적정한 수준으로 분해함으로써 이로 인한 항암 활성을 갖는 동시에 부작용에 대한 위험성이 감소된 것을 특징으로 한다. 기존 연구에서 BRD4 넉다운 마우스에서 상피 과형성 (epidermal hyperplasia), 탈모, 세포 다양성 감소 및 소장 내 줄기세포 감소 현상이 관찰되었으며, 방사선 조사 후 장 재생 능력이 손상된 것으로 보고된 바 있다 (Bolden et al., Cell Reports, 2014, 8(6): 1919). 따라서 BRD4를 과하게 억제할 경우 다양한 장기에 걸쳐 상당히 부정적인 영향을 미칠 것으로 예상되며, BRD4에 대한 억제 활성이 적정 수준인 본 발명의 화합물들은 임상적으로 부작용을 감소시킨다는 점에서 유리한 효과를 갖는다.
본 발명의 구체적 일 실시예에서는 본원 발명의 화합물들을 PLK1 또는 BRD4를 안정적으로 발현하는 세포에 처리하여 PLK1 단백질은 거의 대부분 분해하고 BRD4 단백질은 상대적으로 약한 수준으로 분해하는 것을 확인하였다 (도 1 및 표 2). 따라서 본 발명의 화학식 I로 표시되는 화합물은 PLK1에 대해서는 강한 수준의 억제, BRD4에 대해서는 약한 수준의 억제를 함으로써 종래 알려진 PROTAC 물질에 비해 부작용 없이 암 또는 신경질환의 예방 또는 치료 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 화학식 I로 표시되는 화합물은 하기 표 1에 기재된 화합물 1 내지 화합물 11일 수 있다.
화합물 구 조
1
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2
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3
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4
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5
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6
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7
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8
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9
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10
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11
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본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본원에서 환자의 치료에 적합한 또는 상용성이 있는 산부가염 또는 염기부가염을 지칭하는데 사용된다. 적합한 염을 형성하는 예시적 무기산으로는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산뿐만 아니라 금속 염, 예컨대 오르토인산 일수소 나트륨 및 황산수소칼륨을 들 수 있다. 적합한 염을 형성하는 예시적 유기산으로는 모노-, 디- 및 트리카르복실산, 예컨대 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 벤조산, 페닐아세트산, 신남산 및 살리실산뿐만 아니라 술폰산, 예컨대 p-톨루엔술폰산 및 메탄술폰산을 들 수 있다. 일산 또는 이산 염이 형성될 수 있으며, 이러한 염은 수화, 용매화 또는 실질적으로 무수 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 화합물의 산부가염은 이의 유리 염기 형태와 비교하여 물 및 다양한 친수성 유기 용매에 더욱 가용성이고, 일반적으로 더 높은 융점을 나타낸다. 적절한 염의 선택은 당업자에게 공지되어 있다. 다른 비-제약상 허용되는 염, 예를 들어 옥살레이트는 예를 들어, 실험실용으로 또는 약학적으로 허용가능한 산부가염으로의 후속 전환용으로 본 발명의 화합물의 단리에서 사용될 수 있다. 적합한 염을 형성하는 예시적 무기 염기로는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 또는 바륨 히드록시드를 들 수 있다. 적합한 염을 형성하는 예시적 유기 염기로는 지방족, 지환족 또는 방향족 유기 아민, 예컨대 메틸아민, 트리메틸아민 및 피콜린 또는 암모니아를 들 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 본 발명의 고려되는 염으로는 알킬, 디알킬, 트리알킬 또는 테트라-알킬 암모늄 염을 들 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 고려되는 염으로는 L-아르기닌, 베넨타민, 벤자틴, 베타인, 수산화칼슘, 콜린, 데아놀, 디에탄올아민, 디에틸아민, 2-(디에틸아미노)에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 히드라바민, 1H-이미다졸, 리튬, L-리신, 마그네슘, 4-(2-히드록시에틸)모르폴린, 피페라진, 칼륨, 1-(2-히드록시에틸)피롤리딘, 나트륨, 트리에탄올아민, 트로메타민, 및 아연 염을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 화합물은 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라 모든 가능한 광학 이성질체를 제한 없이 포함한다. 본 발명의 화합물의 입체이성질체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 결정질 형태 또는 비결정질 형태로 제조될 수 있다. 화합물이 결정질 형태로 제조되면, 임의로 수화 또는 용매화 될 수 있다.
본 발명의 화합물은 임의의 치료용 약학 조성물로서 제제화하거나, 또는 본원에 개시된 임의의 방법, 예컨대 예방 또는 치료 방법에서 사용하기에 적합한 형태로 제제화될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 화학식 I의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 또는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 신경질환의 예방 또는 치료 방법이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 암 또는 신경질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다.
화학식 I의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염은 상술한 바와 같다.
본 발명의 화합물은 타겟 단백질인 PLK1를 원천 분해할 수 있으므로, PLK1의 단순 활성을 억제하는 종래 PLK1 저분자 억제제와 비교하여서도 우수한 PLK1 억제 효과를 달성하며, PLK1 억제에 따른 우수한 약리효과를 보여준다. 또한, 본 발명의 화합물은 또 다른 타겟 단백질인 BRD4를 적정 수준으로 분해하여 원하는 약리효과를 달성할 수 있으며, BRD4의 과다 억제에 따른 부작용을 최소화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물은 PLK1 및 BRD4를 억제함으로써 암 또는 신경질환의 예방 또는 치료 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물에는 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 고양이, 말, 소, 닭, 개, 마우스, 래트, 염소, 토끼, 및 돼지가 포함된다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 언급된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 질병, 병태 또는 장애를 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 질병, 병태 또는 장애를 완화 또는 개선하는 것 (즉, 병태 또는 이의 임상 증상들 중 적어도 하나의 발생을 지연 또는 저지하는 것); 또는 환자가 인식할 수 없는 것을 포함하여, 질병, 병태 또는 장애와 관련된 적어도 하나의 신체적 파라미터 또는 바이오마커를 완화 또는 개선하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 질병, 병태 또는 장애를 "예방하다", "예방하는" 또는 "예방"이라는 용어는 질병, 병태 또는 장애의 예방적 처치; 또는 병태 또는 장애의 발병 또는 진행을 지연시키는 것을 지칭한다.
본 발명에서　암은 PLK1 및 BRD4의 활성 억제로 인해 예방 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 모든 암을 포함하며, 고형암　또는 혈액암일 수 있다. 예컨대, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기　암은 원발성　암뿐 아니라 전이성　암도 포함한다.
본 발명에서 신경질환은 PLK1 및 BRD4의 활성 억제로 인해 예방 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 모든　신경질환을 포함하며, 구체적으로 중추 신경계 질환, 퇴행성　신경질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성경화증, 헌팅톤병, 노인성 치매, 간질, 루게릭, 뇌졸증, 및 뇌 또는 척수 손상에 이은 신경손상과 축삭 변성 관련 장애 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 "조성물" 또는 "약학 조성물"은 본 발명의 화합물 외에도 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 더 포함하여 환자 또는 대상체에게 화합물의 투여를 용이하게 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제약상 허용되는 담체는, 비유효 성분, 즉, 제약상 허용되는 부형제로서, 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients] 등을 참고하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다. 적합한 투여 경로는 경구 투여, 비경구 투여, 예를 들면, 근육내, 정맥내, 또는 피하내 투여 등을 비제한적으로 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 외에 동일 또는 유사한 약효를 나타내는 유효성분을 1 종 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 1)의 제조
합성 계획:
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000019
실험 과정:
단계 1. (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (4)의 합성
H2O (9 mL) 및 EtOH (3 mL) 내 (7R)-2-클로로-8-시클로펜틸-7-에틸-5,7-디히드로프테리딘-6-온 (500 mg, 1.78 mmol) 및 4-아미노-3-메톡시-벤조산 (446.55 mg, 2.67 mmol) 용액에 HCl (12 M, 371.03 μL)을 첨가한 후 100 ℃에서 12 시간 동안 질소 기체 하에서 교반하였다. LCMS로 미량의 반응물질과 35 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 감압 증류 후 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (ISCO®; 40 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 5~20 % Ethyl acetate/MeOH @ 100 mL/min)로 정제하였다. 생성물을 H2O (20 mL)로 희석하였고 Na2CO3 용액을 첨가하여 pH > 8로 조정 후 EtOAc (20 mL x 2)로 추출하였다. 물층에 HCl 용액 (1 M)을 첨가 후 pH < 5로 조정 후 EtOAc (20 mL x 2)로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (40 mL)로 세척하였고 Na2SO4로 건조 후 여과 및 감압 농축하였다. 갈색 고체의 표제 화합물 (57 mg, 138.53 μmol, 10.36 % yield)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 412.4
단계 2. tert-부틸 (2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (2)의 합성
DMSO (50 mL) 내 2-(2,6-디옥소-3-피페리딜)-4-플루오로-이소인돌린-1,3-디온 (3 g, 10.86 mmol) 및 tert-부틸 N-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸]카바메이트 (2.70 g, 10.86 mmol) 용액에 TEA (2.20 g, 21.72 mmol, 3.02 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 90 ℃에서 16 시간 동안 교반 하였다. TLC (PE/EtOAc = 10/1)에서 하나의 메인 스팟이 생성되었다. 반응물을 상온으로 식힌 후 H2O (200 mL)로 희석하였고 EtOAc (200 mL x 3)로 추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4로 건조 후 여과 및 감압 농축하였다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, PE/EtOAc:30%~50%)로 정제하였고 황색 오일의 표제 화합물 (2.8 g, 4.22 mmol, 38.83 % yield, 76 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 505.1
단계 3. 4-((2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (3)의 합성
디옥산 (20 mL) 내 tert-부틸 (2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (2.8 g, 4.22 mmol, 76 % purity) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 20 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 20 ℃에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 질량의 하나의 피크 (72 %)가 검출되었다. 혼합물을 감압 농축하였고 황색 오일의 표제 화합물 (2.9 g, crude, HCl 염)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 405.1
단계 4. 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 1)의 합성
DMF (3 mL) 내 (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (57 mg, 138.53 μmol) 용액에 DIEA (107.43 mg, 831.20 μmol, 144.78 μL) 및 HATU (79.01 mg, 207.80 μmol)를 첨가 후 20 ℃에서 15 분 동안 교반하였다. 이후 혼합물을 4-((2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (73.29 mg, 166.24 μmol, HCl 염)에 첨가 후 20 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. LCMS 상에서 반응물이 완전히 소모되었고 61 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 여과 후 여액을 prep-HPLC (column: Waters Xbridge 150*25 mm * 5 ㎛; mobile phase: [water (10 mM NH4HCO3)-ACN]; B%: 30%-60%, 9 min)로 정제 및 동결건조하였다. 황색 고체의 표제 화합물 (41.1 mg, 46.88 μmol, 33.84 % yield, 91 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 798.3
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.09 (s, 1H), 10.54 (s, 1H), 8.44 - 8.28 (m, 2H), 7.60 - 7.50 (m, 3H), 7.50 - 7.40 (m, 2H), 7.10 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.59 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.06 (dd, J 1 = 12.8 Hz, J 2 = 5.4 Hz, 1H), 4.30 (q, J = 8.4 Hz, 1H), 4.13 (dd, J 1 = 7.3 Hz, J 2 = 3.4 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.65 - 3.60 (m, 2H), 3.60 - 3.50 (m, 6H), 3.47 - 3.39 (m, 4H), 2.93 - 2.83 (m, 1H), 2.63 - 2.52 (m, 2H), 2.07 - 1.97 (m, 2H), 1.91 - 1.88 (m, 2H), 1.85 - 1.73 (m, 4H), 1.71 - 1.65 (m, 1H), 1.65 - 1.54 (m, 2H), 0.81 (t, J = 7.4 Hz, 3H)
실시예 2: 4-(((R)-8-시클로펜틸-5-메틸-6-옥소-7-프로필-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 2)의 제조
합성 계획:
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000020
실험 과정:
단계 1. (R)-메틸 2-아미노펜타노에이트 (2)의 합성
MeOH (80 mL) 내 (R)-2-아미노펜탄산 (15 g, 128.05 mmol)용액에 SOCl2 (30.47 g, 256.09 mmol, 18.58 mL)를 적가 후 70 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. TLC (Petroleum ether/Ethyl acetate=5/1)에서 출발물질이 완전히 소모되었고 하나의 새로운 스팟이 낮은 극성에서 검출되었다. 혼합물을 감압 농축하여 무색 오일의 표제 화합물 (24.3 g, crude)을 수득하였고 추가 정제 없이 다음 단계에 사용되었다.
단계 2. (R)-메틸 2-(시클로펜틸아미노)펜타노에이트 (3)의 합성
THF (300 mL) 내 (R)-메틸 2-아미노펜타노에이트 (24.3 g, 185.25 mmol) 및 사이클로펜타논 (15.58 g, 185.25 mmol, 16.40 mL) 용액에 NaOAc (15.20 g, 185.25 mmol)를 첨가하였고 NaBH(OAc)3 (54.97 g, 259.35 mmol)를 천천히 첨가 후 20 ℃에서 4 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 H2O (500 mL)로 희석 후 EtOAc (300 mL x 4)로 추출하였다. 합친 유기상을 brine (500 mL)으로 세척 후 Na2SO4 로 건조 및 여과하였다. 여액을 감압 농축 후 22.03 g의 조 생성물을 얻었다. 21.5 g의 조 생성물을 H2O (50 mL)로 희석 후 포화 NaHCO3 용액을 사용하여 pH > 7로 조정하였다. 혼합물을 EtOAc (150 mL x 3)로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (150 mL)로 세척 후 Na2SO4 로 건조 및 여과, 감압 농축하였다. 갈색 오일의 표제 화합물 (17.05 g)을 수득하였고 추가 정제 없이 다음 단계에 사용되었다. MS(M+H)+ = 200.2
단계 3. (R)-메틸 2-((2-클로로-5-니트로피리미딘-4-일)(시클로펜틸)아미노)펜타노에이트 (4)의 합성
아세톤 (250 mL) 내 메틸 (R)-메틸 2-(시클로펜틸아미노)펜타노에이트 (16.5 g, 82.79 mmol) 용액에 K2CO3 (40.05 g, 289.78 mmol)를 첨가 후 아세톤 (50 mL) 내 2,4-디클로로-5-니트로-피리미딘 (27.30 g, 140.75 mmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 20 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS로 미량의 출발물질 및 45 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 H2O (300 mL)로 희석하고 EtOAc (400 mL x 4)로 추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4로 건조 후 여과 및 감압 농축하였다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, Petroleum ether/Ethyl acetate=100/1 to 70/1)로 정제하여 밝은 황색의 표제 화합물 (10.3 g, 28.87 mmol, 34.87 % yield)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 356.9
단계 4. (R)-2-클로로-8-시클로펜틸-7-프로필-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (5)의 합성
AcOH (60 mL) 내 (R)-메틸 2-((2-클로로-5-니트로피리미딘-4-일)(사이클로펜틸)아미노)펜타노에이트 (10.3 g, 28.87 mmol) 용액에 Fe (6.45 g, 115.47 mmol) 및 HCl (12 M, 14.43 mL)를 첨가 후 70 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. TLC (Petroleum ether:Ethyl acetate = 3:1)에서 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 높은 극성의 스팟 하나가 관찰되었다. 혼합물을 얼음물 (500 mL)로 켄칭 후 Na2CO3 용액을 첨가하여 pH > 7로 조정하였고 EtOAc (300 mL x 3)로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (400 mL)로 세척하였고 Na2SO4로 건조 후 여과, 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카겔 크로마토그래피 (ISCO®; 40g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 9~60% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 100 mL/min)로 정제 후 갈색 고체의 표제 화합물 (6.5 g, 22.05 mmol, 76.39 % yield)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 295.8
단계 5. (R)-2-클로로-8-시클로펜틸-5-메틸-7-프로필-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (6)의 합성
DMF (20 mL) 내 (R)-2-클로로-8-시클로펜틸-7-프로필-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (2 g, 6.78 mmol) 용액에 K2CO3 (2.81 g, 20.35 mmol)를 첨가 후 요오드메탄 (1.44 g, 10.18 mmol, 633.56 μL)을 0 ℃에서 적가하였다. 혼합물을 20 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. LCMS로 미량의 출발물질 및 원하는 질량의 하나의 피크 (89 %)가 검출되었다. 반응물을 H2O (150 mL)로 희석 후 EtOAc (100 mL x 2)로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (150 mL x 5)로 세척 후 Na2SO4로 건조 및 여과, 감압 농축하였다. 갈색 고체의 표제 화합물 (2.2 g, crude)을 수득하였고 추가 정제 없이 다음 단계에 사용되었다. MS(M+H)+ = 309.8
단계 6. (R)-4-((8-시클로펜틸-5-메틸-6-옥소-7-프로필-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (7)의 합성
t-BuOH (5 mL) 내 (R)-2-클로로-8-사이클로펜틸-5-메틸-7-프로필-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (500 mg, 1.62 mmol), 4-아미노-3-메톡시벤조산 (270.66 mg, 1.62 mmol), K2CO3 (671.33 mg, 4.86 mmol) 및 XPhos (92.62 mg, 194.30 μmol) 용액에 Pd2(dba)3 (148.27 mg, 161.91 μmol)를 첨가 후 질소 기체 하 100 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 55 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 감압 농축 후 잔여물을 H2O (80 mL)로 희석 후 EtOAc (60 mL x 2)로 세척하였다. 물층에 HCl 용액 (1 M)을 첨가하여 pH < 5로 조정 후 EtOAc (20 mL x 2)로 추출하였고, 합친 유기상을 Na2SO4로 건조 후 여과, 감압 농축하였다. 갈색 고체의 표제 화합물 (550 mg, 1.25 mmol, 77.29 % yield)을 수득하였고 추가 정제 없이 다음 단계에 사용되었다. MS(M+H)+ = 440.0
단계 7. 4-(((R)-8-시클로펜틸-5-메틸-6-옥소-7-프로필-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 2)의 합성
DMF (3 mL) 내 (R)-4-((8-시클로펜틸-5-메틸-6-옥소-7-프로필-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (129.60 mg, 294.87 μmol) 용액에 DIEA (175.89 mg, 1.36 mmol, 237.05 μL) 및 HATU (129.37 mg, 340.23 μmol)를 첨가 후 20 ℃에서 15 분 동안 교반하였다. 이후 혼합물에 4-((2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (100 mg, 226.82 μmol, HCl 염)을 첨가 후 20 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. LCMS로 45 %의 원하는 질량이 검출되었다. 반응물을 추가 정제를 위해 다른 배치 (50 mg scale)와 합쳤다. 합친 혼합물을 여과 후 여액을 prep-HPLC (column: Phenomenex luna C18 150*25 mm * 10 ㎛; mobile phase: [water (0.225% FA) - ACN]; B%: 19% - 55%, 12 min)로 정제하였다. 이후 NaHCO3 용액을 첨가하여 pH > 7로 조정 후 혼합물을 DCM (20 mL x 3)으로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조 후 농축하였다. 잔여물을 H2O (10 mL) 및 ACN (10 mL)으로 희석 후 동결건조 하였다. 생성물을 prep-TLC (SiO2, Petroleum ether/Ethyl acetate=10/1)로 재정제 후 황색 고체의 표제 화합물 (22.0 mg, 0.02584 mmol, 11.39 % yield, 97 % purity)을 수득하였다. MS (M+H)+ = 826.7
1HNMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.09 (s, 1H), 8.51 - 8.27 (m, 2H), 7.85 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.55 (dd, J = 8.4, 7.3 Hz, 1H), 7.52 - 7.43 (m, 2H), 7.10 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.59 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.06 (dd, J = 12.8, 5.4 Hz, 1H), 4.35 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.28 - 4.25 (m, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.65 - 3.60 (m, 2H), 3.59 - 3.53 (m, 5H), 3.46 - 3.39 (m, 4H), 3.24 (s, 3H), 2.94 - 2.82 (m, 1H), 2.61 - 2.55 (m, 2H), 2.06 - 1.98 (m, 2H), 1.94 - 1.84 (m, 2H), 1.81 - 1.77 (m, 2H), 1.70 - 1.56 (m, 4H), 1.30 - 1.13 (m, 4H), 0.82 (t, J = 7.3 Hz, 3H)
실시예 3: 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)-3-메틸벤즈아미드 (화합물 3)의 제조
합성 계획:
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000021
실험 과정:
단계 1. (R)-2-클로로-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (2)의 합성
DMF (20 mL) 내 (R)-2-클로로-8-시클로펜틸-7-에틸-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (3.36 g, 11.97 mmol) 및 K2CO3 (4.96 g, 35.91 mmol) 용액에 요오드메탄 (2.55 g, 17.96 mmol, 1.12 mL)을 적가 후 혼합물을 15 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 82 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 0 ℃에서 H2O (200 mL)를 첨가하여 켄칭하였고 EtOAc (150 mL x 3)로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (150 mL x 5)로 세척 후 Na2SO4로 건조, 여과 및 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카겔 크로마토그래피 (20 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 9~50% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 100 mL/min)로 정제 후 백색 고체의 표제 화합물 (2.67 g, 9.06 mmol, 75.67 % yield)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 295.1
단계 2. (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메틸벤조산 (3)의 합성
EtOH (3 mL) 및 H2O (10 mL) 내 (R)-2-클로로-8-시클로펜틸-7-에틸-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (200 mg, 678.47 μmol) 및 4-아미노-3-메틸벤조산 (123.07 mg, 814.17 μmol) 용액에 HCl (12 M, 119.86 μL)을 첨가 후 혼합물을 100 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS로 14 %의 출발물질 및 33 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 감압 농축하였다. 잔여물을 EtOAc (10 mL) 및 ACN (10 mL)으로 5 분 동안 분쇄 후 현탁액을 여과하였다. 고체 부분을 EtOAc (10 mL)로 세척 후 건조하여 상아색의 표제 화합물 (100 mg, 244.21 μmol, 35.99 % yield)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 410.2
단계 3. 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)-3-메틸벤즈아미드 (화합물 3)의 합성
DMF (1.5 mL) 내 (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메틸벤조산 (90 mg, 219.79 μmol) 용액에 HATU (125.36 mg, 329.69 μmol) 및 DIEA (113.63 mg, 879.16 μmol, 153.13 μL)를 첨가 후 15 ℃에서 15 분간 교반하였다. 혼합물에 4-((2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (116.28 mg, 263.75 μmol, HCl 염)을 첨가 후 15 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 53 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물에 CH3COOH를 추가하여 pH < 7로 조정하였다. prep-HPLC (column: Waters Xbridge 150*25 mm * 5 ㎛; mobile phase: [water(10 mM NH4HCO3)-ACN]; B%: 38%-68%, 10 min) 및 prep-HPLC (column: Phenomenex Synergi C18 150*25 mm * 10 ㎛; mobile phase: [water(0.225%FA)-ACN]; B%: 14%-53%, 13 min)로 정제 후 동결 건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (31.5 mg, 38.79 μmol, 17.65 % yield, 98 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 796.5
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.08 (s, 1H), 8.29 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.84 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.66 - 7.61 (m, 1H), 7.60 - 7.48 (m, 1H), 7.11 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.06 (dd, J = 5.4, 12.8 Hz, 1H), 4.32 - 4.05 (m, 2H), 3.62 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 3.60 - 3.48 (m, 6H), 3.47 - 3.38 (m, 4H), 3.23 (s, 3H), 2.93 - 2.82 (m, 1H), 2.69 - 2.63 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 2.07 - 1.97 (m, 1H), 1.93 - 1.90 (m, 1H), 1.86 - 1.78 (m, 2H), 1.76 - 1.73 (m, 2H), 1.68 - 1.56 (m, 3H), 1.54 - 1.40 (m, 2H), 0.77 (t, J = 7.5 Hz, 3H)
실시예 4: 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)벤즈아미드 (화합물 4)의 제조
합성 계획:
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000022
실험 과정:
단계 1. (R)-2-클로로-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (2)의 합성
t-BuOH (6 mL) 내 (R)-2-클로로-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (200 mg, 678.47 μmol), 메틸 4-아미노벤조에이트 (123.07 mg, 814.17 μmol), Pd2(dba)3 (62.13 mg, 67.85 μmol), XPhos (48.52 mg, 101.77 μmol) 및 K2CO3 (375.08 mg, 2.71 mmol) 용액을 질소 기체 하 100 ℃에서 6 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 73 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 감압 농축 후 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (20 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 17~60% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 60 mL/min)로 정제하여 적색 고체의 표제 화합물 (240 mg, 586.11 μmol, 86.39 % yield)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 410.2
단계 2. (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)벤조산 (3)의 합성
MeOH (2 mL) 및 THF (2 mL) 내 (R)-메틸 4-((8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)벤조에이트 (230 mg, 561.69 μmol)용액에 H2O (2 mL) 내 NaOH (112.33 mg, 2.81 mmol) 용액을 첨가하고 혼합물을 15 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS로 미량의 출발물질 및 93 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 감압 농축하여 대부분의 용매를 제거하였고 HCl 용액 (12 M)을 첨가하여 pH < 4로 조정하였다. 혼합물을 여과하여 여액을 감압 농축 후 잔여물을 EtOAc (10 mL)를 첨가하여 5 분간 분쇄하였다. 현탁액을 여과 후 고체부분을 EtOAc (5 mL)로 세척 후 건조하여 상아색의 표제 화합물 (220 mg, 556.32 μmol, 99.04 % yield)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 396.0
단계 3. 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)벤즈아미드 (화합물 4)의 합성
DMF (2 mL) 내 (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)벤조산 (70 mg, 177.01 μmol) 용액에 HATU (100.96 mg, 265.52 μmol) 및 DIEA (114.39 mg, 885.06 μmol, 154.16 μL)를 첨가 후 15 ℃에서 15 분간 교반하였다. 혼합물에 4-((2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (109.26 mg, 247.82 μmol, HCl 염)을 첨가 후 15 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 23 %의 출발물질 및 40 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물에 CH3COOH를 첨가하여 pH < 7로 조정하였다. prep-HPLC (column: Waters Xbridge 150*25 mm * 5 ㎛; mobile phase: [water(10 mM NH4HCO3)-ACN]; B%: 35%-65%, 10 min) 및 prep-HPLC (column: Phenomenex Synergi C18 150*25 mm * 10 ㎛; mobile phase: [water(0.225%FA)-ACN]; B%: 17%-53%, 12 min)로 정제 후 동결 건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (30.4 mg, 38.10 μmol, 21.53 % yield, 98 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 782.7
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.21 - 10.93 (m, 1H), 9.33 (s, 1H), 8.26 (br t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.76 (q, J = 9.0 Hz, 4H), 7.55 (dd, J = 7.3, 8.3 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.59 (br t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.04 (dd, J = 5.0, 12.6 Hz, 1H), 4.47 - 4.37 (m, 1H), 4.22 (dd, J = 3.5, 7.8 Hz, 1H), 3.60 (br d, J = 5.4 Hz, 2H), 3.57 (br d, J = 1.8 Hz, 4H), 3.52 (br t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.45 - 3.38 (m, 4H), 3.25 (s, 3H), 2.91 - 2.81 (m, 1H), 2.59 (br d, J = 2.6 Hz, 2H), 2.08 - 1.98 (m, 2H), 1.96 - 1.89 (m, 1H), 1.85 - 1.71 (m, 5H), 1.66 - 1.55 (m, 3H), 0.77 (t, J = 7.5 Hz, 3H)
실시예 5: 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(14-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 5)의 제조
합성 계획:
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000023
실험 과정:
단계 1. tert-부틸 (14-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)카바메이트 (3)의 합성
DMSO (8 mL) 내 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-플루오로이소인돌린-1,3-디온 (800 mg, 2.90 mmol), tert-부틸 (14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)카바메이트 (1.07 g, 3.19 mmol) 및 DIPEA (748.64 mg, 5.79 mmol, 1.01 mL) 용액을 80 ℃에서 24 시간 동안 교반하였다. LCMS로 30 %의 출발물질 및 51 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 H2O (80 mL)로 희석 후 EtOAc (80 mL x 3)로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (150 mL x 5)로 세척 및 Na2SO4로 건조, 여과 후 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 20~75% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 100 mL/min)로 정제하여 황색 오일의 표제 화합물 (860 mg, 1.45 mmol, 50.10 % yield)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 593.5
단계 2. 4-((14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사트트라데실)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (4)의 합성
디옥산 (5 mL) 내 tert-부틸 (14-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)카르바메이트 (860 mg, 1.45 mmol) 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 15 mL)을 첨가 후 15 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 99 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물을 감압 농축하여 녹색 오일의 표제 화합물 (760 mg, HCl 염)을 수득하였고 다음 반응에 바로 사용되었다. MS(M+H)+ = 493.5
단계 3. 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(14-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 5)의 합성
DMF (2 mL) 내 (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (80 mg, 188.02 μmol) 용액에 HATU (107.24 mg, 282.03 μmol) 및 DIEA (145.80 mg, 1.13 mmol, 196.50 μL)를 첨가 후 15 ℃에서 15 분 동안 교반하였다. 혼합물에 4-((14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (99.46 mg, 188.02 μmol, HCl 염)을 첨가 후 15 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 69 %의 원하는 질량이 검출되었다. 혼합물에 CH3COOH를 첨가하여 pH < 7로 조정하였다. prep-HPLC (column: Waters Xbridge 150*25 mm * 5 ㎛; mobile phase: [water(10 mM NH4HCO3)-ACN]; B%: 40%-70%, 9 min) 및 prep-HPLC (column: Phenomenex Synergi C18 150*25 mm * 10 ㎛; mobile phase: [water(0.225% FA)-ACN]; B%: 19%-55%, 12 min)로 정제 후 동결 건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (45.0 mg, 48.00 μmol, 25.53 % yield, 96 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 900.8
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.09 (s, 1H), 8.49 - 8.32 (m, 2H), 7.84 (s, 1H), 7.62 - 7.53 (m, 2H), 7.53 - 7.44 (m, 2H), 7.12 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.58 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 5.3, 12.8 Hz, 1H), 4.38 - 4.30 (m, 1H), 4.24 (dd, J = 3.5, 7.5 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.61 - 3.57 (m, 2H), 3.56 - 3.49 (m, 10H), 3.48 - 3.46 (m, 4H), 3.46 - 3.39 (m, 5H), 3.24 (s, 3H), 2.92 - 2.83 (m, 1H), 2.62 - 2.58 (m, 1H), 2.06 - 1.97 (m, 2H), 1.94 - 1.84 (m, 2H), 1.83 - 1.71 (m, 4H), 1.68 - 1.55 (m, 3H), 0.76 (t, J = 7.4 Hz, 3H)
실시예 6: 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-((3S)-1-(4-(4-(2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)피페라진-1-일)-4-옥소부타노일)피롤리딘-3-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 6)의 제조
합성 계획:
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000024
실험 과정:
단계 1. 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-((3S)-1-(4-(4-(2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)피페라진-1-일)-4-옥소부타노일)피롤리딘-3-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 6)의 합성
DMF (2 mL) 내 (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (77.78 mg, 182.81 μmol) 용액에 HATU (139.02 mg, 365.63 μmol) 및 DIPEA (94.51 mg, 731.26 μmol, 127.37 μL)를 첨가 후 25 ℃에서 10 분 동안 교반하였다. 혼합물에 4-(4-(4-((S)-3-아미노피롤리딘-1-일)-4-옥소부타노일)피페라진-1-일)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (100 mg, 182.81 μmol, HCl 염)을 첨가 후 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크(61 %)가 검출되었다. 혼합물을 prep-HPLC (column: Phenomenex Synergi C18 150*25 mm * 10 ㎛; mobile phase: [water (0.225% FA) - ACN]; B%: 16% - 46%, 10 min) 및 prep-HPLC (column: Waters Xbridge 150*25 mm * 5 ㎛; mobile phase: [water (10 mM NH4HCO3) - ACN]; B%: 34% - 64%, 10 min)로 정제 후 동결 건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (39.2 mg, 42.40 μmol, 55.61 % yield, 99.3 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 918.1
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.23 - 10.84 (s, 1H), 8.46 - 8.32 (m, 2H), 7.85 (s, 1H), 7.75 - 7.69 (m, 1H), 7.61 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.53 - 7.47 (m, 2H), 7.42 - 7.33 (m, 2H), 5.13 - 5.05 (m, 1H), 4.56 - 4.31 (m, 2H), 4.27 - 4.20 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.89 - 3.75 (m, 1H), 3.72 - 3.39 (m, 7H), 3.37-3.28 (m, 1H), 3.28 - 3.17 (m, 5H), 2.93 - 2.81 (m, 1H), 2.65 - 2.52 (m, 7H), 2.28 - 2.07 (m, 1H), 2.06 - 1.86 (m, 5H), 1.83 - 1.72 (m, 4H), 1.68 - 1.57 (m, 3H), 0.76 (t, J = 7.4 Hz, 3H)
실시예 7: 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 7)의 제조
합성 계획:
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000025
실험 과정:
단계 1. 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(1-(3-(4-(2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)피페라진-1-일)프로파노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 7)의 합성
DMF (2 mL) 내 (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (68 mg, 159.82 μmol) 용액에 HATU (91.15 mg, 239.73 μmol) 및 DIPEA (61.97 mg, 479.46 μmol, 83.51 μL)를 첨가 후 30 ℃에서 10 분 동안 교반하였다. 혼합물에 4-(4-(3-(4-아미노피페리딘-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-1-일)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (95.23 mg, 191.78 μmol)을 첨가 후 30 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 메인 피크 질량이 검출되었다. 용액을 감압 농축 후 prep-HPLC (column: Waters Xbridge 150*25 mm * 5 ㎛; mobile phase: [water (10 mM NH4HCO3) - ACN]; B%: 36%-66%, 10 min) 및 동결건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (29.2 mg, 29.39 μmol, 18.39 % yield, 91 % purity)을 수득하였다. MS (M+H)+ = 904.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.18 - 10.93 (m, 1H), 8.42 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.70 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.52 - 7.45 (m, 2H), 7.35 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 5.09 (dd, J = 5.3, 12.9 Hz, 1H), 4.48 - 4.30 (m, 2H), 4.24 (dd, J = 3.5, 7.6 Hz, 1H), 4.13 - 3.96 (m, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.31 - 3.30 (m, 4H), 3.25 (s, 3H), 3.19 - 3.04 (m, 1H), 2.93 - 2.80 (m, 1H), 2.70 - 2.54 (m, 12H), 2.11 - 1.97 (m, 2H), 1.95 - 1.72 (m, 8H), 1.65 - 1.58 (m, 2H), 1.54 - 1.31 (m, 2H), 0.76 (t, J = 7.5 Hz, 3H)
실시예 8: 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(1-(4-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)부타노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 8)의 제조
합성 계획:
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000026
실험 과정:
단계 1. tert-부틸 N-[1-[4-(벤질옥시카르보닐아미노)부타노일]-4-피페리딜]카르바메이트 (3)의 합성
DCM (20 mL) 내 4-(((벤질옥시)카보닐)아미노)부탄산 (1.5 g, 6.32 mmol) 및 tert-부틸 피페리딘-4-일카바메이트 (1.39 g, 6.95 mmol) 용액에 HOBt (1.03 g, 7.59 mmol), EDCI (1.45 g, 7.59 mmol) 및 TEA (1.92 g, 18.97 mmol, 2.64 mL)를 첨가 후 25 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 질량의 피크 (80 %)가 검출되었다. 혼합물을 감압 농축 후 에틸 아세테이트 (50 mL)를 첨가하여 1 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과 후 고체 부분을 모아 감압 농축하여 백색 고체의 표제 화합물 (3.1 g, crude)을 수득하였고 다음 반응에 바로 사용되었다. MS(M+H)+ = 420.2
단계 2. tert-부틸 (1-(4-아미노부타노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (4)의 합성
2,2,2-트리플루오로에탄올 (10 mL) 내 N-[1-[4-(벤질옥시카르보닐아미노)부타노일]-4-피페리딜]카르바메이트 (0.2 g, 476.74 μmol) 용액에 질소 기체 하 Pd/C (100 mg, 476.74 μmol, 10 % purity)를 첨가하였다. 혼합물을 수소 기체 하 30 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 한 개의 피크 (53 %)가 검출되었다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과 후 여액을 농축하여 백색 고체의 표제 화합물 (130 mg, crude)를 수득하였고 다음 반응에 바로 사용되었다. MS(M+H)+ = 286.2
단계 3. tert-부틸 (1-(4-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)부타노일)피페리딘-4-일)카르바메이트 (5)의 합성
DMSO (3 mL) 내 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-플루오로이소인돌린-1,3-디온 (125.83 mg, 455.53 μmol), tert-부틸(1-(4-아미노부타노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (130 mg, 455.53 μmol) 및 TEA (138.29 mg, 1.37 mmol, 190.21 μL) 용액을 100 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 한 개의 피크 (33 %)가 검출되었다. 혼합물을 물 (20 mL)에 붓고 에틸 아세테이트 (20 mL x 3)로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (10 mL x 3)로 세척 후 Na2SO4로 건조, 여과 및 감압 농축하였다. 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (4 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 0~100% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 65 mL/min)로 정제 후 황색 오일의 표제 화합물 (83 mg, 151.72 μmol, 33.31 % yield, 99 % purity)을 수득하였고 다음 반응에 바로 사용되었다. MS(M+H)+ = 542.1
단계 4. 4-((4-(4-아미노피페리딘-1-일)-4-옥소부틸)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (6)의 합성
디옥산 (1 mL) 내 tert-부틸 (1-(4-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)부타노일)피페리딘-4-일)카바메이트 (83 mg, 153.25 μmol) 용액에 25 ℃에서 HCl/디옥산 (4 M, 5 mL)을 첨가 후 혼합물을 25 ℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 한 개의 피크 (92 %)가 검출되었다. 혼합물을 감압 농축 후 황색 고체의 표제 화합물 (73 mg, 145.10 μmol, 94.68 % yield, 95 % purity, HCl 염)을 수득하였고 다음 반응에 바로 사용되었다. MS(M+H)+ = 442.3
단계 5. 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(1-(4-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)부타노일)피페리딘-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 8)의 합성
DMF (2 mL) 내 (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (68 mg, 159.82 μmol) 용액에 HATU (91.15 mg, 239.73 μmol) 및 DIPEA (61.97 mg, 479.46 μmol, 83.51 μL)를 첨가 후 25 ℃에서 10 분 동안 교반하였다. 혼합물에 4-[[4-(4-아미노-1-피페리딜)-4-옥소-부틸]아미노]-2-(2,6-디옥소-3-피페리딜)이소인돌린-1,3-디온 (70 mg, 146.46 μmol, HCl 염)를 첨가 후 25 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 메인 피크가 검출되었다. 혼합물을 감압 농축 후 prep-HPLC (column: Waters Xbridge 150*25 mm * 5 ㎛; mobile phase: [water (10 mM NH4HCO3) - ACN]; B%: 40% - 70%, 10 min)로 정제 후 동결 건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (34.1 mg, 38.96 μmol, 24.38 % yield, 98 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 849.3
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.21 - 10.95 (m, 1H), 8.43 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.65 - 7.56 (m, 2H), 7.53 - 7.43 (m, 2H), 7.20 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.69 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 5.06 (dd, J = 5.4, 12.9 Hz, 1H), 4.47 - 4.31 (m, 2H), 4.24 (dd, J = 3.5, 7.5 Hz, 1H), 4.12 - 4.00 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.92 - 3.85 (m, 1H), 3.41 - 3.33 (m, 1H), 3.33 - 3.28 (m, 1H), 3.26 (s, 3H), 3.13 (br t, J = 12.3 Hz, 1H), 2.99 - 2.82 (m, 1H), 2.78 - 2.64 (m, 1H), 2.64 - 2.53 (m, 2H), 2.44 (br t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.09 - 1.97 (m, 2H), 1.95 - 1.71 (m, 10H), 1.70 - 1.55 (m, 3H), 1.53 - 1.33 (m, 2H), 0.77 (t, J = 7.4 Hz, 3H)
실시예 9: 4-(((R)-8-시클로헥실-5,7-디메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 9)의 제조
합성 계획:
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000027
실험 과정:
단계 1. (R)-메틸 2-(시클로헥실아미노)프로파노에이트 (2)의 합성
DCM (200 mL) 내 (R)-메틸 2-아미노프로파노에이트 (25 g, 179.11 mmol, HCl 염) 및 사이클로헥사논 (19.34 g, 197.02 mmol, 20.42 mL) 용액에 0 ℃에서 NaOAc (14.69 g, 179.11 mmol) 및 NaBH(OAc)3 (56.94 g, 268.66 mmol)를 첨가 후 20 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 질량이 형성되었다. 혼합물을 포화 Na2CO3 (100 mL)로 희석 후 DCM (100 mL x 3)으로 추출하였다. 합친 유기상을 Na2SO4로 건조 후 여과하였다. 여액을 감압 농축하여 황색 고체의 표제 화합물 (31 g, crude)를 수득하였고 다음 반응에 바로 사용되었다. MS(M+H)+ = 186.3
단계 2. (R)-메틸 2-((2-클로로-5-니트로피리미딘-4-일)(시클로헥실)아미노)프로파노에이트 (3)의 합성
MTBE (400 mL) 내 (R)-메틸 2-(사이클로헥실아미노)프로파노에이트 (23.4 g, 126.31 mmol) 용액에 -10 ℃에서 천천히 2,4-디클로로-5-니트로피리미딘 (39.20 g, 202.09 mmol)을 첨가하였다. 이후 온도를 0 ℃ 아래로 유지하면서 H2O (200 mL) 내 K2CO3 (26.19 g, 189.46 mmol) 용액을 적가 하였다. 이후 혼합물 온도를 15 ℃로 승온 후 16 시간 동안 교반하였다. LCMS로 21 %의 출발물질과 원하는 질량의 피크 (34 %)가 검출되었다. 다른 부분의 2,4-디클로로-5-니트로피리미딘 (19.60 g, 101.05 mmol)을 -10 ℃에서 첨가하였다. 이후 온도를 0 ℃ 아래로 유지하면서 H2O (50 mL) 내 K2CO3 (13.97 g, 101.05 mmol) 용액을 적가 후 35 ℃에서 24 시간 동안 교반하였다. LCMS로 16 %의 출발물질 및 원하는 질량의 피크 (56 %)가 검출되었다. 혼합물을 여과 후 고체 부분을 모아 진공건조 하였다. 여액을 에틸 아세테이트 (100 mL x 3)로 추출 후 모은 유기상을 Na2SO4로 건조 및 농축하였다. 모은 여액을 석유 에테르:에틸 아세테이트 (10:1, 100 mL)에서 1 시간 동안 교반 후 여과하였다. 고체 부분을 모아 건조 후 황색 고체의 표제 화합물 (23 g, 67.10 mmol, 53.12 % yield)을 수득하였고 다음 반응에 바로 사용되었다. MS(M+H)+ = 343.0
단계 3. (R)-2-클로로-8-시클로헥실-7-메틸-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (4)의 합성
AcOH (250 mL) 내 (R)-메틸 2-((2-클로로-5-니트로피리미딘-4-일)(시클로헥실)아미노)프로파노에이트 (22 g, 64.18 mmol) 용액에 Fe (21.51 g, 385.09 mmol) 및 con.HCl (39.00 g, 385.09 mmol, 38.24 mL, 36 % purity)를 첨가 후 85 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 메인 피크가 검출되었다. 혼합물을 여과 후 여액을 H2O (50 mL)로 희석 후 재여과하여 고체부분을 모아 건조하였다. 합친 잔여물을 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 1:1 (100 mL)에서 1 시간 동안 교반 후 여과하였다. 고체 부분을 모아 건조 후 회색 고체의 표제 화합물 (16.3 g, 57.48 mmol, 89.55 % yield, 99 % purity)을 수득하였고 다음 반응에 바로 사용되었다. MS(M+H)+ = 281.1
단계 4. (R)-2-클로로-8-시클로헥실-5,7-디메틸-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (5)의 합성
DMF (5 mL) 내 (R)-2-클로로-8-시클로헥실-7-메틸-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (0.5 g, 1.78 mmol) 용액에 MeI (278.06 mg, 1.96 mmol, 121.96 μL) 및 K2CO3 (492.27 mg, 3.56 mmol)를 첨가 후 25 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 메인 피크가 검출되었다. 혼합물을 물 (20 mL)에 붓고 10 분 동안 교반하였고, 여과 후 고체 부분을 모아 진공 건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (550 mg, crude)을 수득하였고 다음 반응에 바로 사용되었다. MS(M+H)+ = 295.1
단계 5. (R)-4-((8-시클로헥실-5,7-디메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (7)의 합성
EtOH (3.5 mL) 및 H2O (12.5 mL) 내 4-아미노-3-메톡시벤조산 (467.84 mg, 2.80 mmol) 및 (R)-2-클로로-8-시클로헥실-5,7-디메틸-7,8-디히드로프테리딘-6(5H)-온 (550 mg, 1.87 mmol) 용액에 25 ℃에서 HCl (12 M, 342.06 μL)을 첨가 후 100 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 메인 피크가 검출되었다. 혼합물을 농축하여 EtOH를 제거하였다. H2O (20 mL)로 희석 및 10 분 동안 교반 후 여과하여 고체 부분을 진공 건조하여 갈색 고체의 표제 화합물 (500 mg, 1.07 mmol, 57.31 % yield, 91 % purity)을 수득하였고 다음 반응에 바로 사용되었다. MS(M+H)+ = 426.1
단계 6. 4-(((R)-8-시클로헥실-5,7-디메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 9)의 합성
DMF (2 mL) 내 (R)-4-((8-시클로헥실-5,7-디메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (70 mg, 164.52 μmol) 용액에 HATU (93.83 mg, 246.78 μmol) 및 DIPEA (63.79 mg, 493.56 μmol, 85.97 μL)를 첨가 후 30 ℃에서 10 분 동안 교반 하였다. 이후 4-((2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (87.04 mg, 197.42 μmol, HCl)을 첨가 후 30 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크 (60 %)가 검출되었다. 혼합물을 감압 농축 후 prep-HPLC (column: Waters Xbridge 150*25 mm * 5 ㎛; mobile phase: [water (10 mM NH4HCO3) - ACN]; B%: 40% - 70%, 10 min)로 정제하여 황색 고체의 표제 화합물 (64.3 mg, 72.86 μmol, 44.29 % yield, 92 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 812.2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.28 - 10.85 (m, 1H), 8.44 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.40 (br t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.54 (dd, J = 7.3, 8.4 Hz, 1H), 7.51 - 7.45 (m, 2H), 7.09 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.58 (br t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 5.5, 12.8 Hz, 1H), 4.34 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 4.29 - 4.19 (m, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.66 - 3.50 (m, 8H), 3.46 - 3.38 (m, 4H), 3.33 - 3.28 (m, 1H), 3.23 (s, 3H), 2.93 - 2.80 (m, 1H), 2.63 - 2.53 (m, 2H), 2.11 - 1.95 (m, 2H), 1.93 - 1.51 (m, 6H), 1.50 - 1.32 (m, 2H), 1.23 (d, J = 6.6 Hz, 3H)
실시예 10: 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-((1r,4R)-4-(4-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에틸)피페라진-1-일)시클로헥실)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 10)의 제조
합성 계획:
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000028
실험 과정:
단계 1. 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-((1r,4R)-4-(4-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에틸)피페라진-1-일)시클로헥실)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 10)의 합성
DMF (2 mL) 내 (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (80 mg, 188.02 μmol) 용액에 HATU (78.64 mg, 206.83 μmol) 및 DIPEA (48.60 mg, 376.05 μmol, 65.50 μL)를 첨가 후 20 ℃에서 10 분 동안 교반하였다. 이후 혼합물에 DMF (2 mL) 내 4-((2-(2-(4-((1r,4r)-4-아미노시클로헥실)피페라진-1-일)에톡시)에틸)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (158.81 mg, 282.03 μmol, HCl 염) 및 DIPEA (48.60 mg, 376.05 μmol, 65.50 μL) 용액을 20 ℃에서 적가 후 1시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 모두 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크가 검출되었다. 혼합물을 H2O (8 mL)로 희석 후 EtOAc (8 mL x 3)로 추출하였다. 합친 유기상을 염수 (8 mL x 3)로 세척 후 Na2SO4로 건조 후 여과하였고 여액을 감압 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC (column: Phenomenex Gemini-NX C18 75*30 mm * 3 ㎛; mobile phase: [water (10 mM NH4HCO3) -ACN]; B%: 30% - 60%, 8 min)로 정제 후 동결 건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (46.9 mg, 46.69 μmol, 24.83 % yield, 93 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 934.2
1H NMR (DMSO-d 6) δ: 11.02 - 11.18 (m, 1H), 8.41 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.02 (br d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.56 - 7.62 (m, 2H), 7.47 (dd, J = 4.4, 2.6 Hz, 2H), 7.15 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.03 - 5.10 (m, 1H), 4.31 - 4.41 (m, 1H), 4.23 (dd, J = 7.6, 3.5 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.65 - 3.77 (m, 1H), 3.58 - 3.62 (m, 2H), 3.54 (br t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.44 - 3.50 (m, 2H), 3.25 (s, 3H), 2.84 - 2.98 (m, 1H), 2.60 - 2.64 (m, 1H), 2.54 - 2.59 (m, 2H), 2.52 (br d, J = 2.0 Hz, 2H), 2.43 - 2.46 (m, 6H), 1.98 - 2.07 (m, 2H), 1.85 - 1.94 (m, 4H), 1.71 - 1.84 (m, 7H), 1.58 - 1.69 (m, 3H), 1.20 - 1.45 (m, 5H), 0.76 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
실시예 11: 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-((1r,4R)-4-(4-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에틸)피페라진-1-일)시클로헥실)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 11)의 제조
합성 계획:
Figure PCTKR2022009343-appb-img-000029
실험 과정:
단계 1. 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-((2-히드록시에틸)아미노)이소인돌린-1,3-디온 (3)의 합성
DMSO (50 mL) 내 2-(2,6-디옥소-3-피페리딜)-4-플루오로-이소인돌린-1,3-디온 (5 g, 18.10 mmol) 및 2-아미노에탄올 (1.33 g, 21.72 mmol, 1.31 mL) 용액에 20 ℃에서 한 번에 TEA (5.50 g, 54.30 mmol, 7.56 mL)를 첨가 후 80 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크가 검출되었다. 혼합물을 H2O (100 mL)로 희석 후 EtOAc (100 mL x 5)로 추출하였다. 유기상을 염수 (100 mL x 3)로 세척 후 Na2SO4로 건조 및 여과하여 녹색 오일의 표제 화합물 (5.8 g, crude)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 318.1
단계 2. 2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에틸 4-메틸벤젠술포네이트 (4)의 합성
DCM (60 mL) 내 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-((2-히드록시에틸)아미노)이소인돌린-1,3-디온 (5.7 g, 17.96 mmol) 용액에 20 ℃에서 TEA (5.45 g, 53.89 mmol, 7.50 mL) 및 TosCl (5.14 g, 26.95 mmol)을 한 번에 첨가 후 16 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크가 검출되었다. 혼합물을 감압 농축 후 잔여물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 0~100% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 100 mL/min)로 정제하여 LCMS상 39 %의 순도를 갖는 4.1 g의 생성물을 수득하였다. 생성물을 역상 MPLC (method: FA; Column 330 g Flash Column Welch MLtimate XB_C18 20-40 μm; 120 A; Solvent for sample dissolution about 4.10 grams of sample dissolved in 50 mL of DMF; Flow rate 100 mL/min; Mobile phase MeCN/H2O; Gradient B% 5-50% 25 min; 50% 20 min; Instrument TELEDYNE ISCO CombiFlashRf150)로 정제 후 동결 건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (320 mg, 665.14 μmol, 3.70 % yield, 98 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 472.1
단계 3. tert-부틸 ((1r,4r)-4-(4-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에틸)피페라진-1-일)사이클로헥실)카바메이트 (6)의 합성
디옥산 (6 mL) 내 2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에틸 4-메틸벤젠술포네이트 (320 mg, 678.71 μmol) 및 tert-부틸 ((1r,4r)-4-(피페라진-1-일)사이클로헥실)카바메이트 (211.59 mg, 746.58 μmol) 용액에 20 ℃에서 NaI (20.35 mg, 135.74 μmol) 및 DIPEA (263.16 mg, 2.04 mmol, 354.66 μL)를 한 번에 투입 후 80 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크가 검출되었다. 혼합물을 감압 농축 후 플래시 실리카 겔 크로마토그래피 (10 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 0~100% Ethyl acetate/Petroleum ether to 0~20% Dichloromethane/Methanol gradient @ 80 mL/min)로 정제하여 생성물 A (556 mg)를 LCMS상 98 %의 순도로 수득하였다. 생성물 A를 EtOAc (5 mL)로 희석 후 유기상을 H2O (5 mL x 3)로 세척 후 Na2SO4로 건조, 여과, 감압 농축하여 황색 고체의 표제 화합물 (196 mg, 312.83 μmol, 46.09 % yield, 93 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 583.3
단계 4. 4-((2-(4-((1r,4r)-4-아미노시클로헥실)피페라진-1-일)에틸)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (7)의 합성
디옥산 (4 mL) 내 tert-부틸 ((1r,4r)-4-(4-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에틸)피페라진-1-일)사이클로헥실)카바메이트 (195 mg, 334.66 μmol) 용액에 20 ℃에서 한 번에 HCl/디옥산 (4 M, 8 mL)을 첨가 후 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크가 검출되었다. 혼합물을 감압 농축 후 황색 고체의 표제 화합물 (190 mg, crude, HCl)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 483.3
단계 5. 4-(((R)-8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-N-((1r,4R)-4-(4-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에틸)피페라진-1-일)시클로헥실)-3-메톡시벤즈아미드 (화합물 11)의 합성
DMF (2 mL) 내 (R)-4-((8-시클로펜틸-7-에틸-5-메틸-6-옥소-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-2-일)아미노)-3-메톡시벤조산 (80 mg, 188.02 μmol) 용액에 HATU (78.64 mg, 206.83 μmol) 및 DIPEA (48.60 mg, 376.05 μmol, 65.50 μL)를 첨가 후 20 ℃에서 10 분 동안 교반하였다. 이후 20 ℃에서 혼합물에 DMF (2 mL) 및 DIPEA (48.60 mg, 376.05 μmol, 65.50 μL, 2 eq) 내 4-((2-(4-((1r,4r)-4-아미노시클로헥실)피페라진-1-일)에틸)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (107.35 mg, 206.83 μmol, HCl) 용액을 적가하고 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발물질이 완전히 소모됨을 확인하였고 원하는 질량의 피크가 검출되었다. 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석 후 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 염수 (10 mL x 3)로 세척 후 Na2SO4로 건조, 여과 및 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC (column: Unisil 3-100 C18 Ultra 150*50 mm * 3 ㎛; mobile phase: [water (0.225% FA)-ACN]; B%: 10%-40%, 10min)로 정제 후 동결 건조하여 HPLC 순도 98 %의 60.1 mg 생성물을 수득하였다. 생성물을 prep-HPLC (column: Waters Xbridge 150*25 mm * 5 ㎛; mobile phase: [water (10 mM NH4HCO3)-ACN]; B%: 47%-77%, min)로 재정제 후 동결 건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (30.2 mg, 30.88 μmol, 16.42 % yield, 91 % purity)을 수득하였다. MS(M+H)+ = 890.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 11.08 (br s, 1H), 8.44 - 8.36 (m, 1H), 8.03 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.63 - 7.55 (m, 2H), 7.51 - 7.43 (m, 2H), 7.09 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.73 (s, 1H), 5.06 (dd, J = 5.4, 12.9 Hz, 1H), 4.35 (q, J = 8.4 Hz, 1H), 4.23 (dd, J = 3.4, 7.6 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.77 - 3.68 (m, 1H), 3.24 (s, 3H), 2.93 - 2.83 (m, 1H), 2.59 - 2.53 (m, 6H), 2.46 - 2.35 (m, 4H), 2.30 - 2.15 (m, 2H), 2.05 - 1.98 (m, 2H), 1.94 - 1.71 (m, 11H), 1.68 - 1.57 (m, 3H), 1.50 - 1.17 (m, 6H), 0.76 (t, J = 7.4 Hz, 3H)
실험예 1: HeLa LgBit (Plk1-HiBit KI), HEK293T LgBit (BRD4-HiBit KI) 세포주의 제작 및 배양
HeLa, HEK293T 세포주에 LgBit 벡터를 형질주입하여 안정하게 발현시킨 세포주를 제작하였다. 그 다음 각 세포 내 가지고 있는 PLK1, BRD4 단백질의 C-말단 뒤에 HiBit 아미노산 서열을 발현할 수 있도록 gRNA와 donor를 제작한 후 CRISPR/Cas9을 발현할 수 있는 벡터와 함께 세포 내 삽입하였다. 삽입이 완료되어 넉-인 (Knock in)이 진행된 세포만을 선별한 뒤 계대하여 사용하였다.
세포 계수를 위해, Thermo 사의 세포 계수기 (Catalog # AMQAX1000) 및 0.4 % 트립판 블루 용액을 사용하였다.
세포 배양을 위해, DMEM (Gibco, Cat. No. 11995-065; Lot. No. 2307627), FBS (Gibco, Cat. No. 16000-044; Lot. No. 2351176P), 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, Cat. No. 15140-122; Lot. No. 2321150), 100　㎟　세포배양 디쉬 (SPL, Cat. No. 20100), 150　㎟　세포배양 디쉬 (SPL, Cat. No. 20150), 96 웰 화이트 플레이트 (SPL, Cat. No. 30196), PBS pH 7.4 (Gibco, Cat. No. 10010-023; Lot. No. 2085080), TrypLETM　Express (Gibco, Cat. No. 12605-010; Lot. No. 2070638), 카운팅 챔버 (Hirschmann, Cat. No. 8100204), 및 0.4 % 트립판 블루 용액 (DYNEBIO, Cat. No. CBT3710; Lot. No. 20190723)을 사용하였다.
실험예 2: 본 발명의 화합물 처리 및 루시퍼라제 분석
비교예 내지 실시예 화합물은 DMSO (Sigma-Aldrich Cat. No. D2438, Lot. No. RNBJ6524)에 완전 용해시켜 실험에 사용하였다. 비교예 화합물은 본 발명의 화합물들과 마찬가지로 PLK1 및 BRD4를 표적으로 하는 Mu et al., Biochem Biophys Res Commun., 2020, 521(4): 833에 개시된 HBL-4 화합물을 사용하였고, DMSO 단독 처리군을 대조군으로 사용하였다.
HeLa LgBit (Plk1-HiBit KI)의 경우 티미딘 블록 후 방출한 후 화합물을 처리하였고 그 과정은 아래와 같다. 티미딘 (Sigma-Aldrich Cat. No. T9250-5G)은 DW에 완전 용해시켜 실험에 사용하였다. 티미딘 블록을 위해, 티미딘 2 mM 처리 후 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 방출 및 화학적 처리를 위해, 배지를 석션한 후 1× PBS로 세척하였다. TyppLETM을 넣고 37 ℃ CO2 인큐베이터에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 완전 배지를 넣어 중화된 세포를 계수기를 통해 카운팅 하였다. 96 웰 화이트 플레이트 (SPL 사)의 각 웰마다 3.3 x 104 개의 세포를 배지 총 부피 150 ㎕로 하여 시딩한 후 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.
HEK293T LgBit (BRD4-HiBit KI)의 경우 96 웰 화이트 플레이트 (SPL사)의 각 웰마다 4 x 104 개의 세포를 시딩하였고, 배양 배지 부피를 총 150 ㎕로 하여 세포를 배양하였다.
각각의 세포주를 CO2 인큐베이터에서 18 시간 인큐베이션 한 뒤 Endurazine을 총 부피의 4 %가 될 수 있도록 각 웰에 첨가하였다. 각 화합물의 농도가 HeLa LgBit (Plk1-HiBit KI)에는 300 nM이 되도록, HEK293T LgBit (BRD4-HiBit KI)에는 100 nM이 되도록 넣어준 뒤 플레이트 리더의 파장을 470 - 480 nm로 설정 후 발광을 실시간으로 추적하였다. HeLa LgBit (Plk1-HiBit KI)의 경우 9 시간, HEK293T LgBit (BRD4-HiBit KI)의 경우 8 시간에서의 발광값을 구한 뒤 엑셀 프로그램을 통해 막대 그래프로 표시하였다. 그 결과는 하기 표 2와 도 1에 나타내었다.
No. PLK1 BRD4
비교예 1 0.148 0.223
화합물 4 0.208 0.692
화합물 5 0.140 0.491
화합물 6 0.313 0.731
화합물 7 0.120 0.488
화합물 8 0.204 0.394
화합물 9 0.207 0.484
화합물 10 0.343 0.629
실험 결과, 공지된 PROTAC인 비교예의 경우 PLK1과 BRD4를 모두 80 % 이상의 수준으로 분해하는 것으로 확인되었으나, 본 발명의 화합물들은 모두 비교예와 유사한 수준으로 PLK1을 분해하는 반면, BRD4는 약 30 ~ 60 % 수준으로 비교예 대비 상대적으로 약한 분해활성을 보였다. 이러한 결과는 본 발명의 화합물들이 PLK1과 BRD4를 동시에 표적으로 하여 암과 신경질환에 효과를 보이며 BRD4를 과도하게 분해함으로써 나타날 수 있는 부작용이 상대적으로 적다는 것을 시사한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (3)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 I]
    Figure PCTKR2022009343-appb-img-000030
    상기 화학식 I에서,
    R1은 -H, -CH3 또는 -OCH3이고,
    R2는 -H 또는 -CH3이고,
    R3는 -시클로펜틸 또는 -시클로헥실이고,
    R4는 -C1-3알킬이고,
    LULM은 -NH-CH2CH2- 또는
    Figure PCTKR2022009343-appb-img-000031
    이고,
    LINT는 -(OCH2CH2)n-, -(C=O)-CH2CH2-(C=O)-, -CH2CH2-(C=O)-, -CH2-(C=O)-,
    Figure PCTKR2022009343-appb-img-000032
    또는
    Figure PCTKR2022009343-appb-img-000033
    이고 (여기서, n은 2 내지 4의 정수임), 및
    LPTM은 -NH-(C=O)-,
    Figure PCTKR2022009343-appb-img-000034
    ,
    Figure PCTKR2022009343-appb-img-000035
    또는
    Figure PCTKR2022009343-appb-img-000036
    이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물은 하기 표에 기재된 화합물 1 내지 화합물 11로 구성된 군에서 선택된 것인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure PCTKR2022009343-appb-img-000037
    Figure PCTKR2022009343-appb-img-000038
    Figure PCTKR2022009343-appb-img-000039
  3. 제1항 또는 제2항의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 또는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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