WO2024005506A1 - Nadph 옥시다제 2 억제 활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

Nadph 옥시다제 2 억제 활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024005506A1
WO2024005506A1 PCT/KR2023/008948 KR2023008948W WO2024005506A1 WO 2024005506 A1 WO2024005506 A1 WO 2024005506A1 KR 2023008948 W KR2023008948 W KR 2023008948W WO 2024005506 A1 WO2024005506 A1 WO 2024005506A1
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WO
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compound
formula
disease
nox2
arthritis
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PCT/KR2023/008948
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이무열
이경
박정민
고데시스리니바살루
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동국대학교 산학협력단
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a novel compound having NADPH oxidase 2 (NOX2) inhibitory activity and its use for preventing or treating NOX2-mediated diseases by inhibiting NOX2.
  • NOX2 NADPH oxidase 2
  • NADPH oxidase transfers electrons from NADPH to oxygen molecules, producing superoxide.
  • NOX NADPH oxidase
  • Each NOX isoform consists of different catalytic subunits and regulatory subunits (see Figure 1). Additionally, NOX isoforms have different distribution and expression depending on the organ or tissue, and their expression locations are different even within the same cell. Therefore, each NOX isoform has a different activity regulation mode and exhibits different bio-pathological functions.
  • NOX isoform disease
  • NOX1 Cardiovascular disease arteriosclerosis, high blood pressure, stroke, angiogenesis
  • Diabetic Vascular Complications Cancer hepatocellular carcinoma, melanoma, non-small cell lung cancer, tumor angiogenesis
  • NOX2 Most diseases related to inflammation Neuroinflammatory diseases (Alzheimer's disease, Parkinson's disease, microglial-mediated neurotoxicity) Lung disease (adult respiratory distress syndrome, asthma, fibrosis)
  • NOX3 Side effects of anticancer drugs (hearing loss)
  • NOX4 Cardiovascular disease arteriosclerosis, cardiac remodeling and fibrosis, hypertension, stroke
  • Degenerative nerve disease neuropathic pain
  • Diabetic nephropathy diabetic retinopathy
  • nephropathy renal fibrosis
  • NOX5 Cardiovascular disease hypertension, pulmonary hypertension
  • Cancer chronic B-cell malignancy, chronic lymphocytic leukemia, prostate cancer
  • novel compounds with NOX2 inhibitory activity and NOX2-mediated diseases such as inflammatory diseases, neuroinflammatory diseases, adult respiratory distress syndrome, asthma, fibrosis (liver fibrosis, pulmonary fibrosis, etc.), or non-alcoholic steatohepatitis (NASH)
  • NOX2 inhibitory activity and NOX2-mediated diseases such as inflammatory diseases, neuroinflammatory diseases, adult respiratory distress syndrome, asthma, fibrosis (liver fibrosis, pulmonary fibrosis, etc.), or non-alcoholic steatohepatitis (NASH)
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating NOX2-mediated diseases, comprising the compound of Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a novel compound useful as a NOX2 inhibitor, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a new compound useful as a NOX2 inhibitor, or an isomer thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of NOX2-mediated diseases, comprising a compound of the following formula (1), an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving NOX2-mediated diseases containing the compound of Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a compound of formula 1a or 1b:
  • step 2 Comprising the step of reacting a compound of Formula 2a or 2b with a compound of Formula 3 to obtain a compound of Formula 1a or 1b (step 2),
  • the present invention provides a composition comprising a compound of formula 1a or 1b below, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound of the present invention since the compound of the present invention, its isomer, or pharmaceutically acceptable salt thereof has the effect of inhibiting NOX2, it can be used to treat various diseases caused by NOX2, such as inflammatory diseases, neuroinflammatory diseases, adult respiratory distress syndrome, asthma, and fibrosis (liver disease). It can be useful in the prevention or treatment of fibrosis, pulmonary fibrosis, etc.) or non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
  • NOX2 inflammatory diseases
  • neuroinflammatory diseases such as inflammatory diseases, neuroinflammatory diseases, adult respiratory distress syndrome, asthma, and fibrosis (liver disease).
  • fibrosis liver disease
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • Figure 1 shows the subunit composition of seven NOX isoforms.
  • Figure 2 is a graph showing the results of separating isomers of a compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figures 3 and 4 are graphs showing the results of confirming the NOX2 inhibitory ability of a compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a graph showing the results of confirming the superoxide scavenging activity of a compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a graph showing the results of confirming the PKC inhibitory ability of a compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a graph showing the results of confirming the cytotoxicity of a compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 is a graph showing the results of confirming the bioeffectiveness of a compound according to an embodiment of the present invention.
  • Embodiments of the present invention may be modified into various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below. Additionally, the embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those with average knowledge in the relevant technical field.
  • the term “isomer” refers to a compound of the present invention or a salt thereof that has the same chemical or molecular formula but is structurally or sterically different.
  • These isomers include structural isomers such as tautomers, stereoisomers such as R or S isomers with asymmetric carbon centers, geometric isomers (trans, cis), and optical isomers (enantiomers). All these isomers and mixtures thereof are also included within the scope of the present invention.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating NOX2-mediated diseases, comprising a compound of the following formula (1), an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
  • the pharmaceutically acceptable salts should have low toxicity to humans and should not have any negative effect on the biological activity and physicochemical properties of the parent compound.
  • the pharmaceutically acceptable salt may be an acid addition salt formed with a pharmaceutically acceptable free acid.
  • the free acid may be an inorganic acid or an organic acid.
  • the inorganic acid may be hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, perchloric acid, hydrobromic acid, etc.
  • the organic acid may be acetic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluene sulfuric acid, etc. It may be fonic acid, fumaric acid, maleic acid, malonic acid, phthalic acid, succinic acid, lactic acid, citric acid, gluconic acid, tartaric acid, salicylic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, embonic acid, aspartic acid, glutamic acid, etc.
  • the acid addition salt is prepared by a conventional method, for example, by dissolving the compound of Formula 1 in an excess of acid aqueous solution and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent, such as methanol, ethanol, acetone, or acetonitrile. It can be.
  • a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, or acetonitrile. It can be.
  • the pharmaceutically acceptable salt may be an alkali metal salt (sodium salt, etc.) or an alkaline earth metal salt (potassium salt, etc.).
  • the alkali metal salt or alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving the compound of Formula 1 in an excessive amount of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and then evaporating and drying the filtrate. .
  • the compounds of the present invention may have a chiral carbon center and therefore may exist as R or S isomers, racemic compounds, individual enantiomers or mixtures, individual diastereomers or mixtures, all of which are stereoisomers. and mixtures thereof may fall within the scope of the present invention.
  • the isomer of the compound of Formula 1 may be a compound of the following Formula 1a or 1b, but is not limited thereto:
  • the isomer of the compound of Formula 1 is the compound of Formula 1b:
  • the compound of the present invention may include hydrates and solvates of the compound of Formula 1 above.
  • the hydrates and solvates can be prepared using known methods, and are preferably non-toxic and water-soluble.
  • the hydrate and solvate may be a combination of 1 to 5 molecules of water and an alcoholic solvent (particularly, ethanol, etc.), respectively.
  • the compound of Formula 1, its isomer, or its pharmaceutically acceptable salt can selectively inhibit NOX2 among NOX isoforms. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention containing the compound of Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is effective in preventing or treating NOX2-mediated diseases.
  • the “NOX2-mediated disease” may be any one selected from the group consisting of inflammatory disease, neuroinflammatory disease, adult respiratory distress syndrome, asthma, fibrosis (liver fibrosis, pulmonary fibrosis, etc.), and non-alcoholic steatohepatitis (NASH). and is not limited to this.
  • the inflammatory diseases include inflammatory skin disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, peritonitis, osteomyelitis, cellulitis, meningitis, encephalitis, pancreatitis, trauma-induced shock, bronchial asthma, allergic rhinitis, cystic fibrosis, stroke, and acute bronchitis.
  • chronic bronchitis acute bronchiolitis, chronic bronchiolitis, osteoarthritis, gout, spondyloarthropathy, ankylosing spondylitis, Reiter syndrome, psoriatic arthropathy, enteropathy spondylitis, juvenile arthropathy, juvenile ankylosing spondylitis, reactive arthropathy, infectious arthritis, Post-infectious arthritis, gonococcal arthritis, tuberculous arthritis, viral arthritis, fungal arthritis, syphilitic arthritis, Lyme disease, arthritis associated with 'vasculitis syndrome', polyarteritis nodosa, hypersensitivity vasculitis, Lougenic granulomatosis, polymyalgia rheumatica.
  • articular cell arteritis calcium crystal deposition arthropathy, pseudogout, non-articular rheumatism, bursitis, tenosynovitis, epicondylitis (tennis elbow), neuropathic joint disease (charcoal and joint), hemorrhagic arthrosis (hemarthrosic), Henoch- Schoenlein purpura, hypertrophic osteoarthropathy, multicentric reticulohistiocytoma, surcoilosis, hemochromatosis, sickle cell disease and other hemoglobinopathies, hyperlipoproteinemia, hypogammaglobulinemia, familial Mediterranean fever, Behcet's disease ), systemic lupus erythematosus, relapsing fever, psoriasis, multiple sclerosis, sepsis, septic shock, multi-organ dysfunction syndrome, acute respiratory distress syndrome, chronic obstructive pulmonary disease, rheumatoid arthritis, It may be any one selected
  • the neuroinflammatory disease refers to a disease caused by inflammation of the nervous system, such as multiple sclerosis, neuroblastoma, stroke, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, microglial-mediated neurotoxicity, Lou Gehrig disease, It may be any one selected from the group consisting of Huntington's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, post-traumatic stress disorder, depression, schizophrenia, and amyotrophic lateral sclerosis, but is not limited thereto.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the occurrence, spread, and recurrence of the disease by administering a compound or pharmaceutical composition according to the present invention
  • treatment refers to any action that inhibits or delays the occurrence, spread, and recurrence of the disease by administering a compound or pharmaceutical composition according to the present invention. It refers to all actions in which the symptoms of the disease are improved or beneficially changed by administration of the composition.
  • the present invention provides a treatment for NOX2-mediated diseases such as inflammatory diseases, neuroinflammatory diseases, adult respiratory distress syndrome, asthma, fibrosis (liver fibrosis, pulmonary fibrosis, etc.), or non-alcoholic diseases using the compounds of Formula 1, isomers thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • NOX2-mediated diseases such as inflammatory diseases, neuroinflammatory diseases, adult respiratory distress syndrome, asthma, fibrosis (liver fibrosis, pulmonary fibrosis, etc.), or non-alcoholic diseases using the compounds of Formula 1, isomers thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • NASH steatohepatitis
  • the present invention provides a use of the compound of Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof for inhibiting NOX2.
  • the present invention provides a treatment for NOX2-mediated diseases such as inflammatory diseases, neuroinflammatory diseases, adult respiratory distress syndrome, asthma, fibrosis (liver fibrosis, pulmonary fibrosis, etc.), or non-alcoholic diseases using the compounds of Formula 1, isomers thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof. It provides use for the manufacture of a drug for the prevention or treatment of steatohepatitis (NASH).
  • NOX2-mediated diseases such as inflammatory diseases, neuroinflammatory diseases, adult respiratory distress syndrome, asthma, fibrosis (liver fibrosis, pulmonary fibrosis, etc.), or non-alcoholic diseases using the compounds of Formula 1, isomers thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • NASH steatohepatitis
  • the present invention provides the use of the compound of Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the preparation of a medicament for inhibiting NOX2.
  • the present invention relates to NOX2-mediated diseases, such as inflammatory diseases, neuroinflammatory diseases, adult respiratory distress syndrome, asthma, fibrosis ( Provides a method for preventing or treating liver fibrosis, pulmonary fibrosis, etc.) or non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
  • NOX2-mediated diseases such as inflammatory diseases, neuroinflammatory diseases, adult respiratory distress syndrome, asthma, fibrosis ( Provides a method for preventing or treating liver fibrosis, pulmonary fibrosis, etc.) or non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
  • “individual” refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, refers to mammals such as human or non-human primates, mice, dogs, cats, horses, and cows. .
  • the present invention also provides a method of inhibiting NOX2, comprising administering the compound of Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual in need of NOX2 inhibition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can inhibit NOX2.
  • the term “inhibition” refers to inhibition of any step among gene transcription, mRNA processing, translation, translocation, and maturation, protein-to-protein binding, protein activation, or inhibition of signal transduction through this.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • pharmaceutically acceptable carriers are those commonly used in formulations, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, and microcrystalline cellulose. , polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. may be additionally included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally (e.g., intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) depending on the desired method, and the dosage is determined by the patient's condition and weight, and the degree of the disease. , it varies depending on the drug form, administration route and time, but can be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, activity of the drug, and the type of patient's disease. It can be determined based on factors including sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used simultaneously, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's age, gender, condition, body weight, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate and excretion rate, type of disease, and concomitant drug, and generally body weight.
  • 0.001 to 150 mg per 1 kg, preferably 0.01 to 100 mg may be administered daily or every other day, or divided into 1 to 3 times per day.
  • the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • another aspect of the present invention provides a health functional food for preventing or improving NOX2-mediated diseases, comprising the compound of Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the term “improvement” refers to any action that at least reduces the severity of a parameter, such as a symptom, related to the alleviation or treatment of a condition.
  • the term "health functional food” refers to a food manufactured and processed using specific ingredients as raw materials or specific ingredients contained in food ingredients by methods such as extraction, concentration, purification, and mixing for the purpose of health supplementation. It refers to food designed and processed to fully exert bioregulatory functions on the living body, such as biodefense, regulation of biorhythm, and prevention and recovery of disease.
  • the health functional food composition can perform functions related to preventing and improving skin damage caused by fine dust.
  • foods to which the extract can be added include formulations selected from the group consisting of powders, granules, tablets, capsules, pills, gels, jellies, suspensions, emulsions, syrups, tea bags, leached teas, gums, candies, and health drinks. and includes all health foods in the conventional sense.
  • the health drink composition may include various sweeteners, flavoring agents, or natural carbohydrates as additional ingredients, like ordinary drinks.
  • the sweetener may be a natural sweetener or a synthetic sweetener.
  • the natural sweetener may be thaumatin or stevia extract, and the synthetic sweetener may be saccharin or aspartame.
  • the natural carbohydrate may be monosaccharide, disaccharide, polysaccharide, xylitol, sorbitol, or erythritol.
  • the monosaccharide may be glucose or fructose
  • the disaccharide may be maltose or sucrose.
  • the polysaccharide may be a dextrin or cyclodextrin.
  • the proportion of the natural carbohydrate may generally be about 0.01 to 10 g, for example, about 0.01 to 0.1 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the health functional food may include food supplements that are foodologically acceptable, and may include an appropriate carrier commonly used in the manufacture of health functional foods.
  • the composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, It may include carbonating agents used in carbonated drinks. Additionally, the composition of the present invention may include pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverages, and vegetable beverages. These ingredients can be used independently or in combination. The ratio of these additives is not very important, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • Another aspect of the present invention provides a compound of formula 1a or 1b below, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • the pharmaceutically acceptable salt of the compound of Formula 1a or 1b is the same as previously described for the pharmaceutically acceptable salt of the compound of Formula 1.
  • the present invention provides a composition comprising a compound of the following formula (1a) or (1b), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the composition is useful for preventing or treating NOX2-mediated diseases, such as inflammatory diseases, neuroinflammatory diseases, adult respiratory distress syndrome, asthma, fibrosis (liver fibrosis, pulmonary fibrosis, etc.), or non-alcoholic steatohepatitis (NASH). You can.
  • step 2 Comprising the step of reacting a compound of Formula 2a or 2b with a compound of Formula 3 to obtain a compound of Formula 1a or 1b (step 2),
  • the compound of Formula 1a or 1b can be prepared by the method shown in the above reaction scheme, but is not limited to being prepared by this method.
  • the compounds of Formula 1a or 1b of the present invention can be prepared by various methods using well-known techniques in the art.
  • Step 1 is a step of separating stereoisomers of the compound of formula 2 in Scheme 1 above. Any method that can separate isomers can be used without limitation, and as an example, chiral supercritical fluid chromatography can be used.
  • Step 2 is a step of preparing a compound of Formula 1a or 1b by performing an acid-amine coupling reaction between a compound of Formula 2a or 2b and a compound of Formula 3.
  • Any method that can perform an acid-amine coupling reaction can be used without limitation, and as an example, HATU (Hexafluorophosphate Azabenzotriazole Tetramethyl Uronium) can be used.
  • Reagents and conditions (a) KOCN, H 2 O, AcOH, room temperature, 12 hours; (b) acetic anhydride, pyridine, room temperature, 12 hours; (c) ethyl acetoacetate, TMSCl, DMF, room temperature, 12 hours; (d) NaHCO 3 , MeOH, H 2 O, 40°C, 16 hours; (e) LiOH, THF, H 2 O, 40 °C, 18 h; 4M HCl, pH 1-2, 80°C, 6 hours; (f) 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline, HATU, DIPEA, DMF, room temperature, 2 hours.
  • Step B Preparation of 2-formylphenyl acetate (Compound 6)
  • Step C Ethyl 4-(2-acetoxyphenyl)-1-(3-(methoxycarbonyl)phenyl)-6-methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5 -Preparation of carboxylate (compound 7)
  • Step F 2-methyl-3-(3-(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-2-carbonyl)phenyl)-5,6-dihydro-2 H -2,6-Methanobenzo[ g ][1,3,5]oxadiazocine-4(3 H ) Preparation of -one (Compound 1)
  • Step 1 Preparation of compounds 2a and 2b (separation of enantiomers of compound 2)
  • NOX reactive oxygen species
  • a product of enzyme action a product of enzyme action
  • the inhibitory ability was tested using a NOX1 to NOX5 specific activity search system as shown in Table 2 below.
  • NOX isoform Cell line/phenotype Expressed subunit activation reagent NOX1 CHO/heterologous expression NOX1, p22phox, NOXO1, NOXA1 PMA 200 ng/mL NOX2 Natural expression after differentiation with HL-60/1.5 ⁇ M retinoic acid doesn't exist PMA 200 ng/mL NOX3 T-Rex-293/heterozygous expression NOX3, p22phox, NOXO1, NOXA1 Tetracycline 1 ⁇ g/mL 24 hours before experiment NOX4 HEK293/heterotypic expression NOX4 doesn't exist NOX5 HEK293/heterotypic expression NOX5 5 ⁇ M Ionomycin
  • HL-60 human leukemia 60
  • NOX2 activity analysis To measure NOX2 activity, HL-60 (human leukemia 60) cells, a human leukemia cell line widely used for NOX2 activity analysis, were used.
  • CHO-NOX1 cells and T-REx-NOX3 cells were used to measure the activities of NOX1 and NOX3, respectively.
  • CHO-NOX1 is a cell that expresses the NOX1 catalytic subunit and the regulatory subunits of NOX1 (p22phox, NOXO1, NOXA1) in CHO (Chinese Hamster Ovary), a Chinese hamster ovary cell line.
  • TREx-NOX3 is a cell that expresses the NOX3 catalytic subunit and regulatory subunits (p22phox, NOXO1, NOXA1) in the tetracycline-regulated expression (T-REx TM 1) cell line.
  • HEK-NOX4 cells a cell line expressing NOX4 in human embryonic kidney 293 cells (HEK293), were used. Because NOX4 does not require a separate activator, HEK293 cells were used as a control.
  • HEK-NOX5 cells which are cells expressing NOX5 in HEK293 cells, were used.
  • HL-60 was cultured using Roswell park memorial institute 1640 (RPMI 1640) medium containing 10% FBS and 1% P/S.
  • RPMI 1640 Roswell park memorial institute 1640
  • CHO-NOX1 was grown in DMEM/F12 (Dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture F-12) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin (P/S). Cultured using medium.
  • DMEM/F12 Dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture F-12
  • FBS fetal bovine serum
  • P/S penicillin-streptomycin
  • TREx-NOX3 was cultured using DMEM/F12 medium containing 10% tetracycline-free FBS and 1% P/S.
  • HEK, HEK-NOX4, and HEK-NOX5 were cultured using DMEM medium containing 10% FBS and 1% P/S.
  • NOX activity was evaluated by measuring reactive oxygen species (ROS) produced by NOX.
  • ROS reactive oxygen species
  • WST-1 water soluble tetrazolium-1
  • AR/ Three types of probes were used: HRP, hydrogen peroxide-specific fluorometric probe, and coumarin boronic acid (CBA).
  • HRP hydrogen peroxide-specific fluorometric probe
  • CBA coumarin boronic acid
  • WST-1 represents the change in absorbance at 450 nm
  • AR represents the change in fluorescence signal at excitation wavelength (Ex) and emission wavelength (Em) at 560 nm and 585 nm, respectively
  • CBA represents Ex and Em.
  • the amount of change in fluorescence signal at 360 nm and 460 nm was measured, respectively.
  • the optical signal was measured using a SpectraMax M3 microplate reader from Molecular Devices and measured at 37°C for 60 minutes.
  • NOX1 activity was evaluated as follows. CHO-NOX1 was seeded in a 96-well plate at 3 ⁇ 10 4 cells/well. After culturing overnight in an incubator at 37°C, the cells were washed twice with Hank's balanced salt solution (HBSS). The test substances were diluted with HBSS according to concentration, then treated with cells and left in an incubator at 37°C for one hour. At this time, the control group was treated with dimethyl sulfoxide (DMSO), a solvent for the test substance, to the same concentration. As a positive control, 10 ⁇ M diphenylene iodonium (DPI), a widely used NOX inhibitor, was used. 200 ng/mL of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) was used as a NOX1 activator, and the amount of ROS production induced by PMA was measured for 60 minutes.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • NOX2 activity was evaluated as follows. Differentiation was induced by treating 1 ⁇ 10 5 cells/mL of HL-60 with 1.5 ⁇ M all- trans -retinoic acid (ATRA) for 4 days. Differentiated HL-60 (diff. HL-60) was centrifuged at 200 g for 5 minutes and washed twice with HBSS. Differentiated HL-60 were seeded in a 96-well plate at 3 ⁇ 10 4 cells/well. The cells were treated with the test substance and left in an incubator at 37°C for 60 minutes. DMSO, the solvent for the test substance, was used at the same concentration as the control group, and 10 ⁇ M DPI was used as the positive control group. 200 ng/mL of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) was used as a NOX2 activator, and the amount of ROS production induced by PMA was measured for 60 minutes.
  • ATRA all- trans -retinoic acid
  • NOX3 activity was evaluated as follows. TREx-NOX3 was seeded in a 96-well plate at 3 ⁇ 10 4 cells/well. After culturing overnight in an incubator at 37°C, expression of NOX3 was induced by treatment with 1 ⁇ g/mL tetracycline for 24 hours. After washing twice with HBSS, the cells were treated with test substances and left for 60 minutes. DMSO, the solvent for the test substance, was used at the same concentration as the control group, and 10 ⁇ M DPI was used as the positive control group. ROS produced by TREx-NOX3 was measured for 60 minutes.
  • NOX4 activity was evaluated as follows. HEK-NOX4 and control HEK were seeded in a 96-well plate at 3 ⁇ 10 4 cells/well. After culturing overnight in an incubator at 37°C, the cells were washed twice with HBSS. The test material was pretreated for 60 minutes. DMSO, the solvent for the test substance, was used at the same concentration as the control group, and 10 ⁇ M DPI was used as the positive control group. ROS derived from HEK-NOX4 or HEK were measured for 60 minutes.
  • NOX5 activity was evaluated as follows. HEK-NOX5 was seeded in a 96-well plate at 3 ⁇ 10 4 cells/well. After culturing overnight in an incubator at 37°C, the cells were washed twice with HBSS. The test material was pretreated for 60 minutes. DMSO, the solvent for the test substance, was used at the same concentration as the control group, and 10 ⁇ M DPI was used as the positive control group. After activating NOX5 with 5 ⁇ M ionomycin, the generated ROS was measured for 60 minutes.
  • Compound 1 according to the present invention exhibits inhibitory activity against NOX2, and in the case of Compound 1a, which is a (R)-type stereoisomer isolated from Compound 1, and Compound 1b, which is a (S)-type stereoisomer, (R ) type Compound 1a showed weaker NOX2 inhibitory activity than racemic Compound 1, while (S) type Compound 1b was confirmed to have twice as much NOX2 inhibitory activity as racemic Compound 1 for all three probes tested. .
  • Inhibitory activity of DG401 against NOX isoforms probe NOX1 NOX3 NOX4 NOX5 NOX1-overexpressing CHO NOX3-overexpression T-REx293 NOX4-overexpressing HEK293 NOX5-overexpressing HEK293 IC 50 ( ⁇ M) IC 50 ( ⁇ M) IC 50 ( ⁇ M) amplex red/HRP >100 100 100 >100 CBA >100 >100 >100 >100 WST-1 >100 > 100 100 100
  • Compound 1 according to the present invention was shown to not substantially inhibit NOX1, NOX3, NOX4 and NOX5. That is, it was confirmed that Compound 1 according to the present invention is a selective inhibitor for NOX2.
  • a superoxide scavenging activity test was performed on the compound according to an example of the present invention by the following method.
  • the superoxide scavenging activity of the test substance was tested using a superoxide production test system by xanthine oxidase (XO) and xanthine (X).
  • XO xanthine oxidase
  • X xanthine
  • XO/X was measured by the change in absorbance of WST-1.
  • Superoxide production by 0.01 U/mL xanthine oxidase and 200 ⁇ M xanthine was measured with 500 ⁇ M WST-1 in the presence or absence of test substances.
  • the absorbance of WST-1 was measured at 450 nm, at 37°C for 5 minutes at 30 second intervals, and the results of the experiment are shown in Figure 5.
  • Compound 1 according to the present invention did not show superoxide scavenging activity in the xanthine/xanthine oxidase superoxide production system up to a concentration of 100 ⁇ M. In other words, it can be seen that Compound 1 according to the present invention is not a non-specific oxygen radical scavenger or antioxidant.
  • the main signaling molecule that mediates NOX2 activation is Protein Kinase C (PKC), and in this NOX2 activity test system, PMA, a PKC activator, was used as the NOX2 activator. Therefore, in order to determine whether the NOX2 inhibitory ability of the test substance is due to inhibition of PKC, the effect of the test substance on PKC activity was evaluated.
  • the activities of PKC ⁇ II and PKC ⁇ were performed using Promega's PKC ⁇ II Kinase Enzyme System and PKC ⁇ Kinase Enzyme System, and ADP-Glo kinase assay kit as follows.
  • Test substances were treated with 100 ng of recombinant PKC isoform for 30 minutes. 5 ⁇ M GF109203X (pan-PKC inhibitor) was used as a positive control. 1 ⁇ g of PKC substrate, CREBtide, 50 ⁇ M adenosine triphosphate (ATP), and PKC activator provided in the kit were added and reacted for 20 minutes. ADP-Glo reagent was added to this sample and left for 40 minutes to terminate the enzyme reaction. Afterwards, the kinase detection reagent was added and left at room temperature for 30 minutes, and the resulting fluorescence was measured for 0.5 seconds using Promega's GloMAX Multi Detection System 9311-011, and the results are shown in Figure 6.
  • Compound 1 according to the present invention did not inhibit PKC ⁇ and PKC ⁇ 2 up to a concentration of 100 ⁇ M. This suggests that the NOX2 inhibitory ability of Compound 1 according to the present invention is not due to inhibition of PKC, an upstream signal of NOX activated by PMA.
  • the cytotoxicity of the test substance was tested using two types of cells, primary cultured vascular smooth muscle cells (VSMC) and acute myeloid leukemia cell line PLB-985, using lactate dehydrogenase (LDH). ) was evaluated by leakage assay.
  • VSMC vascular smooth muscle cells
  • PLB-985 acute myeloid leukemia cell line
  • LDH lactate dehydrogenase
  • VSMC and PLB-985 were seeded in a 96-well plate at 2 ⁇ 10 4 cells/well and 1 ⁇ 10 5 cells/well, respectively, and cultured overnight. After exposure to the test substance for 24 hours, the activity of liberated LDH was evaluated. 100 ⁇ M menadione was used as a positive control. To induce complete cell lysis, the sample was treated with 1% Triton X-100, and the LDH activity of this sample was considered 100%. The supernatant of cells treated with the test substance was taken, centrifuged at 12,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was used as a sample.
  • Compound 1 according to the present invention does not exhibit cytotoxicity up to a concentration of about 50 ⁇ M, and is therefore expected to be useful as a pharmaceutical composition.
  • test substance 100 mg/kg was orally administered to 8-week-old C57BL/6 mice. After anesthetizing the mouse with isoflurane, inflammation was induced by subcutaneously injecting 20 ⁇ L CFA into the soles of the feet using a Hamilton syringe. Changes in sole thickness were measured as an indicator of the degree of inflammation. Changes in sole thickness were measured and recorded using digital calipers before administration (baseline), immediately after administration, and at 5, 10, 20, 40, 60, 120, 180, and 240 minutes after administration. .
  • ROS production was measured by administering L-012, a ROS indicator, to mice and then imaging chemiluminescence generated in the body.
  • Mice were anesthetized by intraperitoneal administration of 30 mg/kg Zoletil and 5 mg/kg Lumpun. Five minutes after administering the test substance, 20 ⁇ L CFA was injected subcutaneously into the soles of the feet. Subsequently, 20 mg/kg L-012 was administered intraperitoneally, and then chemiluminescence was measured for 60 minutes using the NightOWL II LB 983 In Vivo Imaging System (Berthold Technologies), and the experimental results are shown in Figure 8. A group administered the same dose of normal saline was used as a negative control, and NOX2-knockout mice were used as a positive control.

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Abstract

본 발명은 NADPH 옥시다제 2(NOX2) 억제 활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 NOX2를 억제하는 효과가 있으므로, NOX2가 원인이 되는 다양한 질환, 예컨대 염증성 질환, 신경염증성 질환, 성인 호흡곤란 증후군, 천식, 섬유증(간 섬유증, 폐 섬유증 등) 또는 비알코올성 지방간염(NASH)의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

NADPH 옥시다제 2 억제 활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 용도
본 발명은 NADPH 옥시다제 2(NOX2) 억제 활성을 갖는 신규 화합물 및 NOX2 억제에 의한 NOX2 매개 질환을 예방 또는 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
NADPH 옥시다제(NOX)는 NADPH로부터 산소 분자로 전자를 전달함으로써 슈퍼옥사이드(superoxide:
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000001
)를 생성하는 막-결합 효소 복합체(membrane-bound enzyme complex)이다. NOX는 슈퍼옥사이드를 매개로 산화 환원 신호(redox signal)를 조절하는 주요한 신호 분자이다.
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000002
NADPH 옥시다제는 현재까지 총 7가지의 아이소폼(isoform), 즉 NOX1 내지 NOX5, 듀얼 옥시다제(dual oxidase: DUOX) 1와 DUOX2가 확인되었다.
각각의 NOX 아이소폼은 서로 다른 촉매 서브유닛(catalytic subunit)과 조절 서브유닛(regulatory subunit)으로 구성되어 있다(도 1 참조). 또한 NOX 아이소폼은 장기나 조직에 따라 분포와 발현이 다르며, 동일한 세포 내에서도 발현 위치가 상이하다. 따라서, 각각의 NOX 아이소폼은 활성 조절 양식이 서로 다르며, 서로 다른 생·병리학적 기능을 나타낸다.
다양한 in vitro 실험과 유전자 변형 및 결손 동물을 이용한 연구를 통해 치료 표적(therapeutic target)으로서 NOX의 타당성이 규명되었다. 예상되는 NOX 억제제의 적응증을 하기 표 1에 간략히 기술하였다(Patrick J. Pagano, et al., Free Radic Biol Med. 2009 Nov 1; 47(9): 1254-1266).
NOX isoform 질병
NOX1 심혈관질환(동맥경화, 고혈압, 뇌졸중, 혈관신생)
당뇨병성 혈관 합병증
암(간세포암, 흑색종, 비소세포폐암, 종양혈관신생)
NOX2 염증과 관련된 대부분의 질병
신경염증성 질환(알츠하이머병, 파킨슨병, 미세아교세포 매개 신경독성)
폐 질환(성인호흡곤란증후군, 천식, 섬유증)
NOX3 항암제의 부작용(청력 상실)
NOX4 심혈관 질환(동맥경화, 심장 리모델링 및 섬유증, 고혈압, 뇌졸중)
퇴행성 신경 질환(신경병증성 통증)
당뇨병성 신병증, 당뇨병성 망막병증, 신병증(신장 섬유증)
NOX5 심혈관 질환(고혈압, 폐고혈압)
암(만성 B세포 악성종양, 만성 림프구성 백혈병, 전립선암)
DUOX1/2 갑상선 기능 저하
최근 20여 년간 NOX 억제제 개발 연구가 수행되어 왔으나 아직 치료제로 개발된 물질은 없다. 현재에도 여러 연구진이 신약 개발을 위해 NOX 억제제를 개발하고 있다. 약물 표적으로서의 NOX에 관한 개념 증명(proof of concept) 연구에 비해, 억제제 개발이 더딘 이유는 1) 아이소폼 특이적 NOX 활성 분석법(isoform-specific NOX activity assay)이 확립되어 있지 않았으며, 2) 분석에 필요한 활성산소 측정법에 결점(artifact)이 많고, 3) NOX에 관한 생화학(biochemistry)도 완전히 규명되지 않았기 때문이다.
이에, 본 발명에서는 NOX2 억제 활성을 갖는 신규 화합물과 NOX2 매개 질환, 예컨대 염증성 질환, 신경염증성 질환, 성인 호흡곤란 증후군, 천식, 섬유증(간 섬유증, 폐 섬유증 등) 또는 비알코올성 지방간염(NASH)을 예방 또는 치료하기 위한 이의 용도를 개발하고자 하였다.
본 발명의 일 목적은 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 NOX2 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 NOX2 억제제로서 유용한 신규 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 NOX2 억제제로서 유용한 신규 화합물, 또는 이의 이성질체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, NOX2 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000003
다른 측면에서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 NOX2 매개 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 1a 또는 1b의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 1a]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000004
;
[화학식 1b]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000005
.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
화학식 2의 화합물의 이성질체를 분리하여 화학식 2a 또는 2b의 화합물을 수득하는 단계(단계 1); 및
화학식 2a 또는 2b의 화합물과 화학식 3의 화합물을 반응시켜 화학식 1a 또는 1b의 화합물을 수득하는 단계(단계 2)를 포함하는,
화학식 1a 또는 1b의 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 1]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000006
.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 1a 또는 1b의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 NOX2를 억제하는 효과가 있으므로, NOX2가 원인이 되는 다양한 질환, 예컨대 염증성 질환, 신경염증성 질환, 성인 호흡곤란 증후군, 천식, 섬유증(간 섬유증, 폐 섬유증 등) 또는 비알코올성 지방간염(NASH)의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 NOX 아이소폼 7종의 서브유닛 구성을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 이성질체를 분리한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 및 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 NOX2 억제능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 슈퍼옥사이드 소거 활성(superoxide scavenging activity)을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 PKC 억제능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 생체 유효성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "이성질체(isomer)"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 구조적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 이러한 이성질체에는 호변이성질체(tautomer) 등의 구조 이성질체와, 비대칭 탄소 중심을 가지는 R 또는 S 이성체, 기하이성질체(트랜스, 시스) 등의 입체 이성질체, 광학 이성질체(enantiomer)가 모두 포함된다. 이들 모든 이성체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 한 측면은, 하기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, NOX2 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000007
.
상기 약학적으로 허용 가능한 염은 인간에 대한 독성이 낮아야 하며, 모 화합물의 생물학적 활성 및 물리화학적 특성에 임의의 부정적인 영향을 주지 않아야 한다. 예를 들어, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 유리 산(free acid)에 의해 형성된 산부가염일 수 있다.
상기 유리 산으로는 무기 산 또는 유기 산을 사용할 수 있으며, 이때 무기 산은 염산, 황산, 질산, 인산, 과염소산, 브롬산 등일 수 있고, 유기 산은 아세트산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 푸마르산, 말레산, 말론산, 프탈산, 석신산, 락트산, 시트르산, 글루콘산, 타르타르산, 살리실산, 말산, 옥살산, 벤조산, 엠본산, 아스파트산, 글루탐산 등일 수 있다.
상기 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 상기 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조될 수 있다.
또한, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 알칼리금속염(나트륨염 등) 또는 알칼리토금속염(칼륨염 등)일 수 있다.
상기 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염은, 예를 들어 상기 화학식 1의 화합물을 과량의 알칼리금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 미용해된 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발 및 건조시켜 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 키랄 탄소 중심을 가질 수 있으며, 이에 따라 R 또는 S 이성질체, 라세미 화합물, 개개의 거울상 이성질체 또는 혼합물, 개개의 부분입체 이성질체 또는 혼합물 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 입체 이성질체 및 이들의 혼합물이 본 발명의 범주에 속할 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물의 이성질체는 하기 화학식 1a 또는 1b의 화합물일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다:
[화학식 1a]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000008
[화학식 1b]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000009
.
한 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물의 이성질체는 하기 화학식 1b의 화합물이다:
[화학식 1b]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000010
.
또한, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 1의 화합물의 수화물 및 용매화물을 포함할 수 있다. 상기 수화물 및 용매화물은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 무독성 및 수용성인 것이 바람직하다. 특히, 바람직하게는 상기 수화물 및 용매화물은 각각 물 및 알코올성 용매(특히, 에탄올 등)의 1 내지 5개의 분자가 결합된 것일 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 NOX의 아이소폼 중 NOX2를 선택적으로 억제할 수 있다. 따라서, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 NOX2 매개 질환을 예방 또는 치료하는데 효과적이다.
본 발명에서 상기 "NOX2 매개 질환"은 염증성 질환, 신경염증성 질환, 성인 호흡곤란 증후군, 천식, 섬유증(간 섬유증, 폐 섬유증 등) 및 비알코올성 지방간염(NASH)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 염증성 질환은 염증성 피부질환, 크론병(Crohn's desease), 궤양성 대장염, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베체트병(Behcet's disease), 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마치스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
상기 신경염증성 질환은 신경계의 염증에 의하여 발생하는 질환을 의미하며, 예컨대 다발성 경화증, 신경모세포종, 뇌졸중(stroke), 알츠하이머 병, 파킨슨병, 미세아교세포 매개 신경독성, 루게릭병(Lou Gehrig disease), 헌팅턴병, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증, 및 근위축성 측색경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 화합물 또는 약학 조성물의 투여로 상기 질환의 발생, 확산 및 재발을 저해시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명에 따른 화합물 또는 약학 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 NOX2 매개 질환, 예컨대 염증성 질환, 신경염증성 질환, 성인 호흡곤란 증후군, 천식, 섬유증(간 섬유증, 폐 섬유증 등) 또는 비알코올성 지방간염(NASH)의 예방 또는 치료를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의, NOX2를 억제하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 NOX2 매개 질환, 예컨대 염증성 질환, 신경염증성 질환, 성인 호흡곤란 증후군, 천식, 섬유증(간 섬유증, 폐 섬유증 등) 또는 비알코올성 지방간염(NASH)의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 NOX2 억제용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 것을 포함하는, NOX2 매개 질환, 예컨대 염증성 질환, 신경염증성 질환, 성인 호흡곤란 증후군, 천식, 섬유증(간 섬유증, 폐 섬유증 등) 또는 비알코올성 지방간염(NASH)을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한 본 발명은 NOX2 억제를 필요로 하는 개체에게 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, NOX2를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 NOX2를 억제할 수 있다. 본 발명에서 용어 "억제"는 유전자의 전사, mRNA 프로세싱, 번역, 전좌 및 성숙 중 임의의 단계를 억제하거나, 단백질과 단백질간의 결합, 단백질의 활성화 또는 이를 통한 신호전달의 억제를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제화할때 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 측면은, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, NOX2 매개 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 NOX2 매개 질환은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "개선"은 상태의 완화 도는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어 "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말한다. 상기 건강기능식품 조성물은 미세먼지에 의한 피부 손상의 예방 및 개선 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 겔, 젤리, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 티백제, 침출차, 껌, 캔디류 및 건강 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형 등이 있으며 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연감미제 또는 합성 감미제일 수 있다. 천연감미제는 타우마틴(taumatin) 또는 스테비아(stevia) 추출물일 수 있고, 합성감미제는 사카린(saccharin) 또는 아스파르탐(aspartame)일 수 있다.
상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(monosaccharide), 디사카라이드(disaccharide), 폴리사카라이드(polysaccharide), 자일리톨(xylitol), 소르비톨(sorbitol) 또는 에리트리톨(erythritol)일 수 있다. 상기 모노사카라이드는 포도당 또는 과당일 수 있고, 디사카라이드는 말토오스(maltose) 또는 수크로오스(sucrose)일 수 있다. 폴리사카라이드는 덱스트린(dextrin) 또는 사이클로덱스트린(cyclodextrin)일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 예를 들면, 약 0.01 내지 0.1 g일 수 있다.
상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체를 포함할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지는 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 하기 화학식 1a 또는 1b의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 1a]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000011
;
[화학식 1b]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000012
.
상기 화학식 1a 또는 1b의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염에 대해서 앞서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1a 또는 1b의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 NOX2 매개 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하며, 예컨대 염증성 질환, 신경염증성 질환, 성인 호흡곤란 증후군, 천식, 섬유증(간 섬유증, 폐 섬유증 등) 또는 비알코올성 지방간염(NASH)을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은, 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
화학식 2의 화합물의 이성질체를 분리하여 화학식 2a 또는 2b의 화합물을 수득하는 단계(단계 1); 및
화학식 2a 또는 2b의 화합물과 화학식 3의 화합물을 반응시켜 화학식 1a 또는 1b의 화합물을 수득하는 단계(단계 2)를 포함하는,
화학식 1a 또는 1b의 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 1]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000013
.
상기 화학식 1a 또는 1b의 화합물은 상기 반응식에 도시된 방법에 의하여 제조할 수 있지만, 이러한 방법에 의해 제조되는 것으로 한정되지 않는다. 특히, 통상의 기술자라면 당해 분야에서 잘 알려진 공지의 기술을 사용하여 다양한 방법에 의하여, 본 발명의 상기 화학식 1a 또는 1b의 화합물을 제조할 수 있음을 충분히 이해할 수 있을 것이다.
이하, 본 발명에 따른 화합물의 제조방법에 대하여 각 단계별로 상세히 설명한다.
단계 1은 상기 반응식 1의 화학식 2의 화합물의 입체 이성질체를 분리하는 단계이다. 이성질체를 분리할 수 있는 방법이라면 제한없이 사용가능 하며, 일례로서 카이랄 초임계 유체 크로마토그래피(chiral supercritical fluid chromatography)를 이용할 수 있다.
단계 2는 화학식 2a 또는 2b의 화합물과 화학식 3의 화합물을 산-아민 커플링(acid-amine coupling) 반응시켜 화학식 1a 또는 1b의 화합물을 제조하는 단계이다. 산-아민 커플링 반응시킬 수 있는 방법이라면 제한없이 사용가능 하며, 일례로서 HATU(Hexafluorophosphate Azabenzotriazole Tetramethyl Uronium)을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
2-메틸-3-(3-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-2-카르보닐)페닐)-5,6-디히드로-2H-2,6-메타노벤조[g][1,3,5] 옥사디아조신-4(3H)-온 (2-methyl-3-(3-(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-2-carbonyl)phenyl)-5,6-dihydro-2H-2,6-methanobenzo[g][1,3,5]oxadiazocin-4(3H)-one)(1)의 제조
[반응식 2]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000014
시약 및 조건: (a) KOCN, H2O, AcOH, 실온, 12시간; (b) 아세트산 무수물, 피리딘, 실온, 12시간; (c) 에틸 아세토아세테이트, TMSCl, DMF, 실온, 12시간; (d) NaHCO3, MeOH, H2O, 40°C, 16시간; (e) LiOH, THF, H2O, 40°C, 18시간; 4M HCl, pH 1-2, 80°C, 6시간; (f) 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린, HATU, DIPEA, DMF, 실온, 2시간.
단계 A: 메틸 3-유레이도벤조에이트(화합물 4)의 제조
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000015
메틸 3-아미노벤조에이트(화합물 3)(1.0 당량)이 용해된 AcOH:H2O(1:1) 용액에 KOCN(2.0 당량)을 실온에서 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 고체 침전물이 될 때까지 물로 희석하고, 생성된 침전물(4)을 여과에 의해 분리하고 진공 하에 건조시켜 흰색 고체의 표제 화합물 4를 수득하였다(4.70 g, 91.6%).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) d 8.83 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 5.95 (s, 2H), 3.84 (s, 3H); HRMS (ESI): [M+H]+ C9H11N2O3 계산치 195.0770, 실측치 195.0772.
단계 B: 2-포밀페닐 아세테이트(화합물 6)의 제조
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000016
실온에서 2-히드록시벤즈알데히드(화합물 5)(1.0 당량)이 용해된 피리딘(20 당량) 용액에 아세트산 무수물(1.2 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 4N HCl(25mL)로 켄칭하고(quenched), 수성상을 에틸 아세테이트(3 x 50mL)로 추출하였다. 유기층을 합쳐서 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 무색 오일 상의 표제 화합물 6을 얻었다(1.30 g, 97.0%). 잔류물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.11 (s, 1H), 7.91 - 7.87 (m, 1H), 7.64 (ddd, J = 8.1, 7.5, 1.8 Hz, 1H), 7.44 - 7.38 (m, 1H), 7.19 (dd, J = 8.1, 1.0 Hz, 1H), 2.40 (s, 3H); HRMS (ESI): [M+H]+ C9H9O3 계산치 165.0552, 실측치 165.0544.
단계 C: 에틸 4-(2-아세톡시페닐)-1-(3-(메톡시카보닐)페닐)-6-메틸-2-옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-5-카복실레이트(화합물 7)의 제조
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000017
메틸 3-유레이도벤조에이트(화합물 4) (1.0 당량), 2-포밀페닐 아세테이트(화합물 6)(1.0 당량) 및 에틸 아세토아세테이트(1.5 당량)가 교반된 DMF(25 mL) 용액에 트리메틸실릴 클로라이드(6.0 당량)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙냉수(50mL)로 켄칭하고, 수성상을 에틸 아세테이트(3 x 50mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 15-45% EtOAc)로 정제하여 흰색 고체의 표제 화합물 7을 수득하였다(1.60 g, 11.4%).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 - 8.06 (m, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.54 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.52 - 7.47 (m, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.36 - 7.30 (m, 2H), 7.10 - 7.06 (m, 1H), 5.70 (s, 1H), 5.58 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 4.07 - 3.99 (m, 2H), 3.94 (s, 3H), 2.39 (s, 3H), 2.18 (d, J = 0.7 Hz, 3H), 1.08 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ); HRMS (ESI): [M+H]+ C24H25N2O7 계산치 453.1662, 실측치 453.1658.
단계 D, E: 3-(2-메틸-4-옥소-5,6-디히드로-2 H -2,6-메타노벤조[ g ][1,3,5]옥사디아조신-3(4 H )-일)벤조산(화합물 2)의 제조
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000018
포화 NaHCO3용액(15mL 내지 50mL)을 MeOH(20mL) 중 에틸 4-(2-아세톡시페닐)-1-(3-(메톡시카보닐)페닐)-6-메틸-2-옥소-1,2,3,4-테트라히드로피리미딘-5-카복실레이트(화합물 7) (1.0 당량)의 교반 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40℃에서 12시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 물(25mL)로 희석하고, 수성상을 에틸 아세테이트(3 x 20mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 THF:H2O(8:2)에 재용해시킨 다음, LiOH(20당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40℃에서 12시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 4M HCl을 천천히 첨가하여 pH 1-2로 산성화하고 생성된 혼합물을 80℃에서 8시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 생성된 침전물을 여과에 의해 단리하고 진공 하에 건조시켜 분홍색 고체의 표제 화합물 2를 수득하였다(0.25 g, 76.0%). 화합물 2는 정제하지 않고 다음 단계에 사용되었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 13.04 (s, 1H), 7.88 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.50 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 14.5, 7.4 Hz, 2H), 6.99 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.35 (s, 1H), 2.62 - 2.54 (m, 1H), 2.36 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 1.37 (s, 3H); HRMS (ESI): [M+H]+ C18H17N2O4 계산치 325.1188, 실측치 325.1179.
단계 F: 2-메틸-3-(3-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-2-카보닐)페닐)-5,6-디히드로-2 H -2,6-메타노벤조[ g ][1,3,5]옥사디아조신-4(3 H )-온(화합물 1)의 제조
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000019
3-(2-메틸-4-옥소-5,6-디히드로-2H-2,6-메타노벤조[g][1,3,5]옥사디아조신-3(4H)-일)벤조산(화합물 2) (1.0 당량), 테트라하이드로이소퀴놀린(1.2 당량) 및 DIPEA(3.0 당량)가 교반된 DMF(5mL) 용액에 HATU(1.2당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙냉수 25mL로 켄칭하고, 수성상을 에틸 아세테이트(3 x 30mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5-10% MeOH)로 정제하여 옅은 백색 오일상의 표제 화합물 1을 수득하였다(0.04 g, 41.6%).
SOR:
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000020
-7.65° (c 0.1, MeOH); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.71 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 7.48 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.30 - 7.09 (m, 7H), 6.97 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.90 (s, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.59 (s, 1H), 4.35 (s, 1H), 3.57 (s, 2H), 2.85 (s, 2H), 2.56 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.35 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 1.41 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 155.01, 151.30, 139.00, 136.49, 133.48, 129.74, 129.68, 129.15, 126.91, 126.67, 126.15, 121.45, 117.08, 85.89, 44.04, 34.31, 27.03; HRMS (ESI): [M+H]+ C27H26N3O3 계산치 440.1974, 실측치 440.1970; 순도 ≥98.7% (as determined by RP-HPLC, Rt = 18.2 min).
<실시예 2>
화합물 1의 (2 R , 6 R ), (2 S , 6 S ) 이성질체(화합물 1a, 1b)의 제조
[반응식 3]
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000021
단계 1: 화합물 2a 및 2b의 제조(화합물 2의 거울상 이성질체 분리)
카이랄 초임계 유체 크로마토그래피 (Chiral Supercritical Fluid Chromatography)를 이용하여 상기 실시예 1에 따라 제조된 화합물 2의 거울상 이성질체를 분리하였으며, 분리 결과는 도 2에 나타내었다.
(R,R) - 화합물 2a (피크 1, Rt = 6.020)
(S,S) - 화합물 2b (피크 2, Rt = 6.817).
3-((2 R ,6 R )-2-메틸-4-옥소-5,6-디히드로-2 H -2,6-메타노벤조[ g ][1,3,5]옥사디아조신-3(4 H )-일)벤조산 (화합물 2a)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 13.04 (s, 1H), 7.88 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.50 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 14.5, 7.4 Hz, 2H), 6.99 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.35 (s, 1H), 2.62 - 2.54 (m, 1H), 2.36 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 1.37 (s, 3H); HRMS (ESI): [M+H]+ C18H17N2O4 계산치 325.1188, 실측치 325.1179; Analytical chiral SFC: 순도 ≥99.5%, Rt = 6.045 (컬럼: Chiralpak-IE-3, 4.6 x 250mm, 3um; 이동상: Hexanes/EtOH/DEA/TFA (30/70/0.1/0.1); 유량(flow rate):1.0 mL/min; 온도: 25°C; UV: 235 nm).
3-((2 S ,6 S )-2-메틸-4-옥소-5,6-디히드로-2 H -2,6-메타노벤조[ g ][1,3,5]옥사디아조신-3(4 H )-일)벤조산 (화합물 2b)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 13.04 (s, 1H), 7.88 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.50 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 14.5, 7.4 Hz, 2H), 6.99 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.35 (s, 1H), 2.62 - 2.54 (m, 1H), 2.36 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 1.37 (s, 3H); HRMS (ESI): [M+H]+ C18H17N2O4 계산치 325.1188, 실측치 325.1176; Analytical chiral SFC: 순도 ≥99.9%, Rt = 6.859 (컬럼: Chiralpak-IE-3, 4.6 x 250mm, 3um; 이동상: Hexanes/EtOH/DEA/TFA (30/70/0.1/0.1); 유량(flow rate):1.0 mL/min; 온도: 25°C; UV: 235 nm).
단계 2: 화합물 1a 및 1b의 제조
상기 실시예 1의 단계 F와 같은 방법을 사용하여 화합물 2a 및 2b로부터 각각 옅은 백색 고체의 화합물 1a(0.04 g, 36.9%) 및 옅은 백색 고체의 화합물 1b(0.04 g, 36.9%)를 제조하였다.
(2 R ,6 R )-2-메틸-3-(3-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-2-카보닐)페닐)-5,6-디히드로-2 H -2,6-메타노벤조[ g ][1,3,5]옥사디아조신-4(3 H )-온 (화합물 1a)
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000022
SOR:
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000023
-61.05° (c 0.1, MeOH); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.51 (m, 2H), 7.37 - 7.04 (m, 7H), 7.01 - 6.77 (m, 3H), 4.62 (bs, 1H), 4.43 (bs, 1H), 3.96 (bs, 1H), 3.66 (bs, 1H), 2.91 (d, J = 50.3 Hz, 3H), 2.65 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 2.43 (dd, J = 13.3, 3.0 Hz, 1H), 1.48 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 155.00, 151.29, 139.00, 136.48, 133.48, 129.73, 129.67, 129.14, 126.91, 126.66, 126.15, 121.44, 117.07, 85.89, 44.03, 34.31, 27.03; HRMS (ESI): [M+H]+ C27H26N3O3 계산치 440.1974, 실측치 440.1969; 순도 ≥99.2% (as determined by RP-HPLC, Rt = 18.1 min); Analytical chiral SFC: 순도 ≥99.5%, Rt = 9.86 (컬럼: Chiralpak-IE-3, 4.6 x 150mm,3um; 이동상: Hexanes/EtOH/DEA/TFA (30/70/0.1/0.1); 유량(flow rate):0.8 mL/min; 온도: 25°C, UV:235 nm).
(2 S ,6 S )-2-메틸-3-(3-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-2-카보닐)페닐)-5,6-디히드로-2 H -2,6-메타노벤조[ g ][1,3,5]옥사디아조신-4(3 H )-온 (화합물 1b)
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000024
SOR:
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000025
+66.44° (c 0.1, MeOH); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.51 (m, 2H), 7.37 - 7.04 (m, 7H), 7.01 - 6.77 (m, 3H), 4.62 (bs, 1H), 4.43 (bs, 1H), 3.96 (bs, 1H), 3.66 (bs, 1H), 2.91 (d, J = 50.3 Hz, 3H), 2.65 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 2.43 (dd, J = 13.3, 3.0 Hz, 1H), 1.48 (s, 3H), (Exchangeable proton was not observed); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 155.00, 151.29, 139.00, 136.48, 133.48, 129.73, 129.67, 129.14, 126.91, 126.66, 126.15, 121.44, 117.07, 85.89, 44.03, 34.31, 27.03; HRMS (ESI): [M+H]+ C27H26N3O3 계산치 440.1974, 실측치 440.1971; 순도 ≥98.9% (as determined by RP-HPLC, Rt = 18.0 min); Analytical chiral SFC: 순도 ≥99.5%, Rt = 12.25 (컬럼: Chiralpak-IE-3, 4.6 x 150mm, 3um; 이동상: Hexanes/EtOH/DEA/TFA (30/70/0.1/0.1); 유량(flow rate):0.8 mL/min; 온도: 25°C, UV:235 nm).
<실험예 1> NOX 억제능 확인
NOX의 활성은 각각의 아이소폼을 특이적으로 발현하는 시험계에서 효소 작용 생성물인 활성산소를 측정함으로써 평가하였고, 하기 표 2와 같은 NOX1 내지 NOX5 특이적 활성 검색계를 활용하여 억제능을 시험하였다.
NOX 아이소폼 세포주/표현형 발현된 서브유닛 활성화 시약
NOX1 CHO/이형 발현(heterologous expression) NOX1, p22phox, NOXO1, NOXA1 PMA 200 ng/mL
NOX2 HL-60/1.5 μM 레틴산으로 분화 후 자연 발현(natural expression) 없음 PMA 200 ng/mL
NOX3 T-Rex-293/이형 발현 NOX3, p22phox, NOXO1, NOXA1 실험 24시간전 테트라사이클린 1 μg/mL
NOX4 HEK293/이형 발현 NOX4 없음
NOX5 HEK293/이형 발현 NOX5 5 μM 이오노마이신
구체적인 실험 방법은 다음과 같다.
세포 입수 및 배양
NADPH 옥시다제(NOX) 억제능 분석을 위한 세포들은 하기와 같이 입수하여 배양하였다.
NOX2 활성 측정에는 NOX2 활성 분석에 널리 보편적으로 이용되는 인간 백혈병 세포주인 HL-60(human leukemia 60) 세포를 사용하였다.
NOX1과 NOX3의 활성 측정에는 각각 CHO-NOX1 세포와 T-REx-NOX3 세포를 사용하였다. CHO-NOX1은 중국 햄스터 난소 세포주인 CHO(Chinese Hamster Ovary)에 NOX1 촉매 서브유닛(catalytic subunit), 그리고 NOX1의 조절 서브유닛(regulatory subunit)(p22phox, NOXO1, NOXA1)을 발현시킨 세포이다. TREx-NOX3는 테트라사이클린 조절 발현 세포주(tetracycline-regulated expression: T-REx™1)에 NOX3 촉매 서브유닛과 조절 서브유닛(p22phox, NOXO1, NOXA1)을 발현시킨 세포이다.
NOX4 활성 측정에는 인간 배아 신장 세포(human embryonic kidney 293 cell: HEK293)에 NOX4를 발현시킨 세포주인 HEK-NOX4 세포를 사용하였다. NOX4는 별도의 활성화 물질(activator)을 필요로 하지 않기 때문에, 그 대조군으로 HEK293 세포를 사용하였다.
NOX5 활성 측정에는 HEK293 세포에 NOX5를 발현시킨 세포인 HEK-NOX5 세포를 사용하였다.
HL-60은 10% FBS와 1% P/S를 포함한 Roswell park memorial institute 1640(RPMI 1640) 배지를 사용하여 배양하였다.
CHO-NOX1은 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum: FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin: P/S)이 포함된 DMEM/F12(Dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture F-12) 배지를 사용하여 배양하였다.
TREx-NOX3는 10% tetracycline-free FBS와 1% P/S가 포함된 DMEM/F12 배지를 사용하여 배양하였다.
HEK, HEK-NOX4 및 HEK-NOX5는 10% FBS와 1% P/S를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다.
NOX 활성 평가
NOX 활성은 NOX가 생성하는 활성산소종(reactive oxygen species: ROS)을 측정하여 평가하였다. ROS를 측정하기 위해 프로브(probe)로서 수용성 테트라졸륨-1 (water soluble tetrazolium-1: WST-1, 슈퍼옥사이드 특이적 색채학적 프로브(superoxide-specific colorimetric probe)), Amplex Red/horseradich peroxidase (AR/HRP, 과산화수소 특이적 형광 프로브(hydrogen peroxide-specific fluorometric probe)), 그리고 쿠마린 붕산(coumarin boronic acid: CBA) 3가지를 사용하였으며, 각 프로브의 농도는 WST-1, AR/HRP, 및 CBA가 각각 500 μM, 10 μM/0.1 unit/mL, 및 100 μM였다. WST-1은 450 nm에서의 흡광도 변화량을, AR는 여기 파장(excitation wavelength: Ex)과 방출 파장(emission wavelength: Em)이 각각 560 nm 및 585 nm에서의 형광신호 변화량을, CBA는 Ex와 Em이 각각 360 nm 및 460 nm에서의 형광신호 변화량을 측정하였다. 광학 신호 측정에는 Molecular Devices사의 SpectraMax M3 microplate reader를 이용하였으며 37℃에서 60 분간 측정하였다.
(1) NOX1 활성
NOX1 활성은 다음과 같이 평가하였다. 96-웰 플레이트에 3×104 세포/웰이 되도록 CHO-NOX1을 시딩하였다. 37℃ 배양기에서 하룻밤 배양한 후, Hank's balanced salt solution (HBSS)로 2회 세척하였다. 시험 물질을 농도 별로 HBSS로 희석한 후, 세포에 처리하고 한 시간 동안 37℃ 배양기에서 방치하였다. 이때 대조군에는 시험 물질의 용매인 디메틸설폭사이드(DMSO)를 동일 농도가 되도록 처리하였다. 양성대조군으로는 널리 이용되는 NOX 억제제인 디페닐렌 요오도늄(diphenylene iodonium: DPI)를 10 μM 사용하였다. NOX1 활성화제로는 200 ng/mL의 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)를 사용하였으며, PMA에 의해 유도되는 ROS 생성량을 60분간 측정하였다.
(2) NOX2 활성
NOX2 활성은 다음과 같이 평가하였다. 1×105 cells/mL의 HL-60에 1.5 μM all-trans-retinoic acid (ATRA)를 4일간 처리하여 분화(differentiation)를 유도하였다. 분화된 HL-60 (diff. HL-60)을 200 g에서 5분간 원심분리하고, HBSS로 2회 세척하였다. 96-웰 플레이트에 3×104 세포/웰이 되도록 분화된 HL-60을 시딩하였다. 시험 물질을 세포에 처리하고 60분간 37℃ 배양기에서 방치하였다. 대조군으로는 시험 물질의 용매인 DMSO를 동일 농도로 사용하였으며, 양성대조군으로는 10 μM DPI를 사용하였다. NOX2 활성화제로는 200 ng/mL의 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)를 사용하였으며, PMA에 의해 유도되는 ROS 생성량을 60분간 측정하였다.
(3) NOX3 활성
NOX3 활성은 다음과 같이 평가하였다. 96-웰 플레이트에 3×104 세포/웰이 되도록 TREx-NOX3를 시딩하였다. 37℃ 배양기에서 하룻밤 배양한 다음, 1 μg/mL tetracycline을 24시간 처리하여 NOX3의 발현을 유도하였다. HBSS로 2회 세척한 다음 시험 물질을 세포에 처리하고 60분간 방치하였다. 대조군으로는 시험 물질의 용매인 DMSO를 동일 농도로 사용하였으며, 양성대조군으로는 10 μM DPI를 사용하였다. TREx-NOX3가 생성하는 ROS를 60분간 측정하였다.
(4) NOX4 활성
NOX4 활성은 다음과 같이 평가하였다. 96-웰 플레이트에 3×104 세포/웰이 되도록 HEK-NOX4와 대조군 HEK을 시딩하였다. 37℃ 배양기에서 하룻밤 배양한 다음, HBSS로 2회 세척하였다. 시험 물질을 60분간 전처리하였다. 대조군으로는 시험 물질의 용매인 DMSO를 동일 농도로 사용하였으며, 양성대조군으로는 10 μM DPI를 사용하였다. HEK-NOX4 또는 HEK에서 유래하는 ROS를 60분간 측정하였다.
(5) NOX5 활성
NOX5 활성은 다음과 같이 평가하였다. 96-웰 플레이트에 3×104 세포/웰이 되도록 HEK-NOX5를 시딩하였다. 37℃ 배양기에서 하룻밤 배양한 다음, HBSS로 2회 세척하였다. 시험 물질을 60분간 전처리하였다. 대조군으로는 시험 물질의 용매인 DMSO를 동일 농도로 사용하였으며, 양성대조군으로는 10 μM DPI를 사용하였다. 5 μM 이오노마이신(ionomycin)으로 NOX5를 활성화시킨 다음, 생성되는 ROS를 60분간 측정하였다.
(6) NOX 활성 평가 결과
화합물 1, 1a 및 1b의 NOX2에 대한 활성을 평가한 결과를 도 3 및 아래 표 3에 나타내었다.
WST-1 Amplex Red/HRP CBA
IC50(μM) 변곡점(μM) IC50(μM) 변곡점(μM) IC50(μM) 변곡점(μM)
화합물 1 6.6 1.9 2.4 1.0 2.9 1.5
화합물 1a 10＜ 10＜ 10＜ 10＜ 10＜ 10＜
화합물 1b 2.2 0.8 1.2 0.7 1.4 1.0
도 3 및 표 3으로부터 본 발명에 따른 화합물 1은 NOX2에 대하여 억제 활성을 나타내며, 화합물 1로부터 분리된 (R)형 입체이성질체인 화합물 1a와 (S)형 입체이성질체인 화합물 1b의 경우, (R)형인 화합물 1a는 라세미체인 화합물 1보다 NOX2 억제 활성이 약하게 나타나는데 반해, (S)형인 화합물 1b는 시험한 3가지 프로브 모두에 대해 라세미체인 화합물 1보다 2배 정도 NOX2 억제능이 뛰어남을 확인하였다.
또한, PMA 대신 N-Formyl-Met-Leu-Phe(fMLP)를 이용하여 NOX2 활성화를 유도한 후 화합물 1의 NOX2 억제능을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 따르면, fMLP로 활성화된 NOX2에 대해 화합물 1은 IC50이 약 0.31 mM이고, 농도-효과(concentration-effective) 그래프에서 변곡점이 0.14 mM로 산출되었고, 이로부터 화합물 1의 NOX2 억제 활성이 우수함을 재차 확인하였다.
한편, NOX1, NOX3, NOX4 및 NOX5에 대한 화합물 1의 활성을 평가한 결과를 아래 표 4에 나타내었다.
NOX 아이소폼에 대한 DG401의 억제 활성
프로브
 NOX1 NOX3 NOX4 NOX5
NOX1-과발현 CHO NOX3-과발현
T-REx293		 NOX4-과발현 HEK293 NOX5-과발현 HEK293
IC50 (μM) IC50 (μM) IC50 (μM) IC50 (μM)
amplex red/HRP >100
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000026
100
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000027
100		 >100
CBA >100 >100 >100 >100
WST-1 >100 > 100
Figure PCTKR2023008948-appb-img-000028
100
표 4에 의하면, 본 발명에 따른 화합물 1은 NOX1, NOX3, NOX4 및 NOX5를 실질적으로 억제하지 않는 것으로 나타났다. 즉, 본 발명에 따른 화합물 1은 NOX2에 대하여 선택적인 억제제임을 확인하였다.
<실험예 2> 슈퍼옥사이드 소거 활성(superoxide scavenging activity)
본 발명의 일 실시예에 따른 화합물에 대하여 하기 방법으로 슈퍼옥사이드 소거 활성 실험을 수행하였다.
잔틴 옥시다제(Xanthine oxidase: XO)와 잔틴(xanthine: X)에 의한 슈퍼옥사이드 생성 시험계를 이용하여, 시험 물질의 슈퍼옥사이드 소거 활성을 시험하였다. XO/X에 의한 슈퍼옥사이드 생성은 WST-1의 흡광도 변화로 측정하였다. 시험 물질 존재 혹은 부재 하에 0.01 U/mL 잔틴 옥시다제와 200 μM 잔틴에 의한 슈퍼옥사이드의 생성을 500 μM WST-1로 측정하였다. WST-1의 흡광도는 450 nm에서 측정하였으며, 37℃에서 30초 간격으로 5분간 측정하였고, 실험 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5를 살펴보면, 본 발명에 따른 화합물 1은 100 μM의 농도까지 잔틴/잔틴 옥시다제 슈퍼옥사이드 생성계에서 슈퍼옥사이드 소거 활성을 나타내지 않았다. 즉, 본 발명에 따른 화합물 1은 비특이적 활성산소 제거제나 항산화제가 아님을 알 수 있다.
<실험예 3> 프로틴 키나아제 C 활성에 미치는 영향
NOX2 활성화를 매개하는 주요한 신호 분자는 프로틴 키나아제 C(Protein Kinase C: PKC)이며, 본 NOX2 활성 시험계에서도 NOX2 활성화제로 PKC 활성화제(activator)인 PMA를 사용하였다. 따라서, 시험 물질의 NOX2 억제능이 PKC의 억제에 기인하는지 여부를 확인하기 위하여 PKC 활성에 미치는 시험 물질의 영향을 평가하였다. PKCβII와 PKCα의 활성은 Promega사의 PKCβII Kinase Enzyme System과 PKCα Kinase Enzyme System, 그리고 ADP-Glo kinase assay kit를 사용하여 다음과 같이 수행하였다.
시험 물질을 100 ng의 재조합 PKC 아이소폼에 30분간 처리하였다. 양성 대조군으로는 5 μM GF109203X (pan-PKC 억제제)를 사용하였다. 1 μg의 PKC 기질, CREBtide와 50 μM adenosine triphosphate (ATP), 그리고 키트에서 제공되는 PKC 활성화제를 가하고 20분간 반응시켰다. 이 시료에 ADP-Glo 시약을 첨가하여 40분간 방치하여 효소의 반응을 종료시켰다. 이후에 키나아제 검출 시약을 첨가하고 30분간 상온에서 방치한 다음 생성되는 형광을 Promega사의 GloMAX Multi Detection System 9311-011을 사용하여 0.5초간 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 살펴보면, 본 발명에 따른 화합물 1은 100 μM의 농도까지 PKCα와 PKCβ2를 억제하지 않았다. 이는 본 발명에 따른 화합물 1의 NOX2 억제능이 PMA에 의해 활성화되는 NOX의 상위 신호인 PKC의 억제에 기인하지 않음을 제시한다.
<실험예 4> 세포 독성
본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1에 대하여 하기 방법으로 세포 독성을 확인하였다.
시험 물질의 세포 독성은 일차 배양한 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cells: VSMC)와 급성 골수성 백혈구 세포주(acute myeloid leukemia cell line) PLB-985의 2가지 세포를 이용하여 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase: LDH) 유출 측정(leakage assay)로 평가하였다.
VSMC와 PLB-985는 96-웰 플레이트에 각각 2×104 세포/웰 및 1×105 세포/웰이 되도록 시딩하고 하룻밤 배양하였다. 시험 물질을 24시간 노출시킨 다음 유리되는 LDH의 활성을 평가하였다. 양성대조군으로는 100 μM 메나디온(menadione)을 사용하였다. 완전한 세포 용해(cell lysis)를 유도하기 위하여 1% Triton X-100을 처리하였으며, 이 시료의 LDH 활성을 100%로 간주하였다. 시험 물질을 처리한 세포의 상등액을 취하여, 12,000×g에서 5분간 원심분리한 다음, 그 상등액을 시료로 하였다. 2.5 mM 피부르산나트륨(sodium pyruvate)와 200 μM NADH가 포함된 인산칼륨 완충액(potassium phosphate buffer)(in mM: 80 K2HPO4, 20 KH2PO4, pH 7.4)에 상등액 50 μL를 첨가하였다. 37℃에서 10분간 측정한 340 nm에서의 NADH 흡광도 감소 정도를 계산하고 그 값을 Triton X-100을 처리한 시료의 값과 비교하여 백분율로 환산한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7을 살펴보면, 본 발명에 따른 화합물 1은 약 50 μM의 농도까지 세포 독성을 나타내지 않아 약학 조성물로서 유용할 것으로 기대된다.
<실험예 5> 생체 유효성
본 발명에 따른 화합물 1이 생체에서 NOX2 활성을 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 완전 프로인트 항원보강제(complete Freund's adjuvant: CFA)를 이용한 마우스 발 염증(paw inflammation) 모델에서 염증 억제능을 시험하였다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.
8주령 C57BL/6 마우스에 100 mg/kg의 시험 물질을 경구 투여하였다. 이소플루란(Isoflurane)으로 마우스를 마취한 다음, 해밀턴 주사기(Hamilton syringe)를 이용하여 발바닥에 20 μL CFA를 피하주사함으로써 염증을 유도하였다. 염증 정도의 지표로서 발바닥 두께 변화를 측정하였다. 발바닥 두께의 변화는 투여 전(baseline)과 투여 직후, 투여 후 5분, 10분, 20분, 40분, 60분, 120분, 180분, 및 240분에 디지털 캘리퍼를 이용하여 측정하고 기록하였다.
ROS 생성은 ROS 지표(indicator)인 L-012를 마우스에 투여한 다음, 체내에서 생성되는 화학 발광(chemiluminescence)을 이미징함으로써 측정하였다. 30 mg/kg 조레틸(Zoletil)과 5 mg/kg 럼푼을 복강 투여하여 마우스를 마취하였다. 시험 물질을 투여하고 5분 후 발바닥에 20 μL CFA를 피하 주사하였다. 연이어 20 mg/kg L-012를 복강 투여한 다음 NightOWL II LB 983 In Vivo Imaging System (Berthold Technologies)을 이용하여 화학 발광을 60분간 측정하였고, 실험 결과를 도 8에 나타내었다. 음성 대조군으로는 동일한 용량의 normal saline 투여군, 양성 대조군으로는 NOX2-knockout 마우스를 이용하였다.
도 8을 살펴보면, 100 mg/kg 용량을 경구 투여할 경우 NOX2 결손 동물(NOX2-/y)과 비교하여 활성산소 생성을 80% 이상, 발 두께(paw thickness) 증가를 60% 이상 억제하였다. 즉, 정성적으로 본 발명에 따른 화합물은 경구 투여로 생체에서 NOX2를 유효하게 억제함을 알 수 있다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, NADPH oxidase 2(NOX2) 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023008948-appb-img-000029
    .
  2. 제1항에 있어서,
    화학식 1의 화합물의 이성질체가 하기 화학식 1a 또는 1b의 화합물인, 약학 조성물:
    [화학식 1a]
    Figure PCTKR2023008948-appb-img-000030
    [화학식 1b]
    Figure PCTKR2023008948-appb-img-000031
    .
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    NOX2 매개 질환은 염증성 질환, 신경염증성 질환, 성인 호흡곤란 증후군, 천식, 섬유증, 간 섬유증, 폐 섬유증 및 비알코올성 지방간염(NASH)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    염증성 질환은 염증성 피부질환, 크론병(Crohn's desease), 궤양성 대장염, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베체트병(Behcet's disease), 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마치스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    신경염증성 질환은 치매(dementia), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis;ALS), 다발성 경화증, 신경모세포종, 뇌졸중(stroke), 미세아교세포 매개 신경독성, 루게릭병(Lou Gehrig disease), 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 및 정신분열증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항의 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, NOX2 매개 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  7. 하기 화학식 1a의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1a]
    Figure PCTKR2023008948-appb-img-000032
    .
  8. 하기 화학식 1b의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1b]
    Figure PCTKR2023008948-appb-img-000033
    .
  9. 하기 화학식 2의 화합물의 이성질체를 분리하여 하기 화학식 2a 또는 2b의 화합물을 수득하는 단계(단계 1); 및
    상기 화학식 2a 또는 2b의 화합물과 하기 화학식 3의 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1a 또는 1b의 화합물을 수득하는 단계(단계 2)를 포함하는,
    화학식 1a 또는 1b의 화합물의 제조방법:
    [반응식 1]
    Figure PCTKR2023008948-appb-img-000034
    .
PCT/KR2023/008948 2022-06-28 2023-06-27 Nadph 옥시다제 2 억제 활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 용도 WO2024005506A1 (ko)

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