WO2014129874A1 - 봄베신 수용체 아형-3 조절제로서의 파이퍼 아미드 계열 화합물 - Google Patents

봄베신 수용체 아형-3 조절제로서의 파이퍼 아미드 계열 화합물 Download PDF

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김상희
임채민
김수민
강건욱
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서울대학교산학협력단
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    • C07D319/18—Ethylenedioxybenzenes, not substituted on the hetero ring

Definitions

  • the present invention is a novel ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compound represented by the formula (1); Selecting a compound exhibiting a prophylactic or therapeutic effect from obesity from a compound library comprising at least one ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compound and preparing a composition for preventing or treating obesity containing the selected compound A method for producing a composition for preventing or treating phosphorus obesity; And an ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compound represented by Formulas 2 to 4 below.
  • Compound libraries are an important tool for the discovery of hit compounds in the early stages of drug development.
  • High-throughput synthesis techniques have evolved, but building compound libraries consumes a lot of by-products and energy. Therefore, there is a need to synthesize compound libraries in an economical and environmentally friendly manner.
  • Piperamide natural products are known to exhibit various physiological activities such as anti-inflammatory, antifungal, insecticidal, analgesic, antidepressant, anticancer activity.
  • the structure of the piper amide is characterized by having an ⁇ , ⁇ -unsaturated amide group as a mother nucleus, which has been developed as a drug or a drug candidate.
  • AMG-9810 and SB-355791 are known as very potent vanilloid receptor TRPV1 antagonists, and Tranilast is an antiallergic agent used in practice.
  • N-phenylalkylcinamides N- (phenylalkyl) cinnamides
  • HWE Horner-Wadsworth-Emmons
  • obesity or obesity is a term used to refer to an overweight of a person.
  • Pathologically refers to a case in which a so-called standard body weight index (BMI) set by the World Health Organization (WHO) is 30 or more.
  • BMI body weight index
  • WHO World Health Organization
  • over 25 diagnoses obesity. In most cases, it means that your weight is higher than normal, but even if you don't weigh too much, your body's constituents are high in fat and are said to be obese.
  • Obesity may not be an issue on its own, but the social complications caused and the secondary complications caused by excess fat are severe. For example, obesity can significantly increase the incidence of hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, diabetes, fatty liver, joint abnormalities, and the like.
  • obesity causes various adult diseases. If you gain weight, you will not be able to process your blood sugar, which can lead to diabetes and high blood pressure. If your weight is 20% higher than your normal weight, your chances of developing diabetes are 10 times higher than normal.
  • heart and lung function may be weakened, shortening the lifespan. Complications such as high blood pressure, diabetes, hypercholesterolemia, and atherosclerosis can put pressure on the heart function, lead to heart failure, and lead to sudden death.
  • the incidence of endometrial cancer increases and the likelihood of developing gallstones. In men, the incidence of colorectal and prostate cancer increases.
  • the present inventors have developed a method for efficiently synthesizing a piperamide-based compound library using a solution phase parallel synthesis to implement an economical and environmentally friendly chemistry.
  • combinatorial chemistry it is expected that many compounds will be obtained in one synthesis, and only byproducts that are soluble in water will be made, thus improving efficiency by eliminating the column chromatography purification process.
  • An object of the present invention is to provide an ⁇ , ⁇ -unsaturated amides compound represented by the following formula (1).
  • Another object of the present invention is to select a compound exhibiting a prophylactic or therapeutic effect of obesity from a compound library comprising at least one compound represented by the following formula (1); And it provides a method for producing a composition for preventing or treating obesity characterized in that it comprises the step of preparing a composition for preventing or treating obesity containing the selected compound.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating obesity, including an ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compound.
  • the ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compound of the present invention may have various pharmacological activities as a compound having a parental nucleus structure that mimics piperamide, a natural product showing various activities, and may be ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinic acid as an intermediate product. Since soluble by-products are generated using an imidyl ester ( ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester), a pure compound can be obtained without performing a commonly used column chromatography purification process. In addition, by testing the pharmacological activity from the compound library thus synthesized can be useful as a composition for preventing or treating obesity by screening compounds that are agents for BRS-3.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a solution phase synthesis process for preparing a piperamide compound library.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of a compound having activity as a BRS-3 agonist.
  • 3 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 5 ⁇ 1,5 ⁇ according to the present invention.
  • 5 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 5 ⁇ 3,6 ⁇ according to the present invention.
  • 6 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 5 ⁇ 4,4 ⁇ according to the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 5 ⁇ 7,14 ⁇ according to the present invention.
  • 10 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 5 ⁇ 8,2 ⁇ according to the present invention.
  • 11 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 5 ⁇ 8,3 ⁇ according to the present invention.
  • 13 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 5 ⁇ 10,3 ⁇ according to the present invention.
  • 15 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 5 ⁇ 11,7 ⁇ according to the present invention.
  • 16 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 11 ⁇ 1,11 ⁇ according to the present invention.
  • 17 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 11 ⁇ 3,4 ⁇ according to the present invention.
  • 18 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 11 ⁇ 5,7 ⁇ according to the present invention.
  • 19 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 11 ⁇ 6,4 ⁇ according to the present invention.
  • FIG. 21 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 11 ⁇ 10,5 ⁇ according to the present invention.
  • FIG. 21 is a diagram showing 1 H and 13 C NMR spectra of compound 11 ⁇ 10,5 ⁇ according to the present invention.
  • FIG. 22 is a diagram showing the effect of inhibiting the fat production of compound 5 ⁇ 10,3 ⁇ according to the present invention.
  • A is a diagram showing the inhibition of differentiation of adipocytes 3T3-L1 to adipocytes by the compound through oil-red-O staining
  • B is a spectrophotometer to measure the fat accumulation in the differentiated adipocytes It is a figure shown by the numerical value measured.
  • the present invention provides an ⁇ , ⁇ -unsaturated amides compound represented by the following formula (1).
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, alkyl of C1 to C10, alkylphenyl, 2,3-dihydrobenzo [b] [1,4] dioxin (2,3-dihydrobenzo [ b] [1,4] dioxine), benzyl, alkoxybenzyl, phenylalkyl, phenylalkyl or hydroxyphenylalkyl substituted with one or more alkoxy groups, or containing nitrogen from the amide group to form a ring
  • R 3 is C1 to C10 alkyl, C1 to C10 alkenyl, furanyl, phenyl, phenyl substituted with one or more alkyl groups, halogen substituted phenyl, hydroxyphenyl, nitrophenyl, phenyl substituted with one or more alkoxy, alkoxyalkylphenyl , Halogenalkoxyphenyl or benzo [d] [1,3] dioxole
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, 2-methylpropyl, 2-methylbutyl, 4-methylphenyl, 2,3-dihydrobenzo [b] [1,4] dioxine, benzyl, p-methoxybenzyl, 2-phenylethyl, 2- (4'-methoxyphenyl) ethyl, 2- (3 ', 4'-dimethoxyphenyl) ethyl, 2-p-hydroxyphenylethyl, or It may be to form a pyrrolidine ring including the nitrogen of the amide group of.
  • R 3 is n-heptyl, 1-heptenyl, 2-furanyl, phenyl, 4-methylphenyl, 2,5-dimethylphenyl, 4-bromophenyl, 4-t-butylphenyl, 3-hydrate Oxyphenyl, 3-nitrophenyl, 3,4-dimethoxyphenyl, 4-methoxy-2-methylphenyl, 2-fluoro-4-methoxyphenyl or benzo [d] [1,3] dioxol.
  • R 4 may be a hydrogen atom or methyl.
  • Compounds comprising a series of ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compounds can be prepared by synthesizing each of R 1 to R 4 described above in combination.
  • the ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compound according to the present invention can be prepared by the solution-phase synthesis shown in FIG. 1.
  • the solution phase synthesis produces soluble by-products, so that pure compounds can be obtained without the need for performing commonly used column chromatography purification procedures.
  • the reaction was carried out by the use of ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester as an intermediate product, N-hydroxysuccinimide (N-soluble in water as a by-product after the final reaction. -hydroxysuccinimide (NHS) and phosphoric acid.
  • the extra ⁇ -phosphono ester ( 1 ) used as the intermediate is converted to an aqueous hydrazine derivative by treating Girard's reagent T, which is used as a carbonyl compound remover, to give an aqueous work-up. Can be removed
  • Girard's reagent T which is used as a carbonyl compound remover
  • the ⁇ -phosphono amides obtained through the above process were subjected to a series of aldehydes and a HWE reaction (Horner-Wadsworth-Emmons reaction) to obtain a series of soluble phosphoric acid and a final product of ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compounds.
  • the excess aldehyde can be removed by treating Girard's reagent T as a remover.
  • Such intermediates may utilize commercially available ⁇ -phosphono esters.
  • ⁇ -phosphono esters by using a three-dimensional isopropyl-substituted ⁇ -phosphono ester can significantly improve the (E) -selectivity in the HWE reaction.
  • the present invention is the first step of selecting a compound exhibiting a prophylactic or therapeutic effect of obesity from a compound library comprising at least one compound represented by the formula (1); And it provides a method for producing a composition for the prevention or treatment of obesity, characterized in that it comprises a second step of preparing a composition for preventing or treating obesity containing the selected compounds.
  • R 1 to R 4 are the same as defined in claim 1.
  • the first step may be achieved by selecting a compound that exhibits a BRS-3 activating effect.
  • BRS-3 is an abbreviation of bombesin receptor subtype-3 (also abbreviated as BB 3 ) and is a protein encoded by the BRS3 gene in humans.
  • the protein In mammals, the protein is widely distributed in the central nervous system and gastrointestinal tract to regulate smooth muscle contraction, endocrine and exocrine processes, behavior and metabolism.
  • BRS-3 only interacts with low affinity with naturally occurring bombesin-related peptides known as G-protein associated receptors. Thus, there is no natural high affinity ligand and is classified as an orphan receptor. It was confirmed that the protein is involved in metabolism and energy homeostasis, obesity in the animal model lacking the protein, and the BRS-3 agonist has an anti-obesity effect.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating obesity, comprising an ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compound represented by the following Chemical Formulas 2 to 4.
  • the compound is (E) -N- (3,4-dimethoxyphenethyl-3- (furan-2-yl) acrylamide ((E) -N- (3,4-dimethoxyphenethyl) -3- ( furan-2-yl) acrylamide), N- (3,4-dimethoxyphenethyl) cinamide (N- (3,4-dimethoxyphenethyl) cinnamamide) and (E) -3- (furan-2-yl)- N-phenethylacrylamide ((E) -3- (furan-2-yl) -N-phenethylacrylamide).
  • the compound is a composition characterized by activating a bombesin receptor subtype-3 (BRS-3), a compound having an activating effect on BRS-3 from a compound library containing at least one ⁇ , ⁇ -unsaturated amide as described above Through the screening process it was confirmed that the compounds exhibit this activity.
  • BRS-3 bombesin receptor subtype-3
  • the term "obesity" of the present invention refers to an excessive state of body fat, and clinically means a body mass index of 25 or more in Korea and 30 or more according to the World Health Organization (WHO).
  • the body mass index (BMI) is calculated as the body weight (kg / m2) of the height squared. In general, it means that the weight is higher than normal, but even if the weight does not go much, if the ratio of body fat among the components of the body is diagnosed as obesity, a disease that occurs in both adults and children. Obesity can shorten your life and put you at risk for diseases such as high blood pressure, diabetes, heart disease and some cancers. Obesity is more likely to cause health problems, and as obesity increases, the risk increases.
  • anti-obesity is used to mean all of the prevention, treatment or improvement of obesity. Accordingly, the term “anti-obesity composition” used in the present invention means the pharmaceutical composition for preventing or treating obesity.
  • prevention means any action that inhibits or delays the development of obesity by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention
  • treatment means suspicion of obesity by administration of the pharmaceutical composition and Any action that improves or beneficially alters the symptoms of the affected individual.
  • the prevention or treatment of obesity may be achieved by activation of a bombesin receptor subtype-3 (BRS-3).
  • BRS-3 bombesin receptor subtype-3
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable in the present invention means to exhibit properties that are not toxic to cells or humans exposed to the composition.
  • the carrier can be used without limitation so long as it is known in the art such as buffers, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients, lubricants.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, and the like, oral formulations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method. have.
  • compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose in the compound. ) Or lactose, gelatin and the like are mixed.
  • lubricants such as magnesium styrate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used to include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • administration means introducing a predetermined substance into an individual in an appropriate manner and the route of administration of the composition can be administered via any general route as long as it can reach the target tissue. Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, nasal administration, pulmonary administration, rectal administration, but is not limited thereto.
  • the term "individual” refers to all animals, including rats, mice, livestock, and the like, including humans who may or may have developed obesity. Preferably, it may be a mammal including a human.
  • the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to the medical treatment and not causing side effects, wherein the effective dose level is the sex, age and weight of the patient.
  • Well-known factors such as health status, type of disease, severity, drug activity, drug sensitivity, method of administration, time of administration, route of administration, and rate of release, duration of treatment, combination or drug used, and other medical fields. It can be easily determined by those skilled in the art according to known factors.
  • the compound of the present invention may be administered at 0.0001 to 100 mg / kg body weight per day, preferably at 0.001 to 100 mg / kg body weight, based on solids. Dosing may include administering the recommended dose once daily, or in divided doses.
  • the present invention may provide a method for treating obesity, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising the compound as an active ingredient.
  • the term "individual” means all animals, including humans, who have or may develop obesity as described above, and can effectively prevent or treat the obesity by administering the pharmaceutical composition of the present invention to an individual.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in parallel with existing obesity treatments.
  • the present invention provides a method for preparing a phospho-N-hydroxysuccinimidyl ester compound, comprising: a first step of reacting a ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester compound with an amine compound; And it provides a method for producing the ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compound comprising a second step of obtaining an organic layer from the first step and reacting with the aldehyde compound.
  • the product may be obtained from the organic layer by simply separating the aqueous layer and the organic layer.
  • the amine compound may be reacted with the ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester compound in the first step.
  • the amine compound when an equivalent amount or less of the amine compound is reacted with the ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester compound, most of the amine compounds react with the ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester compound.
  • a water-soluble N-hydroxy succinimide is formed with ⁇ -phosphono amide and an excess of ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester compound remains in the reaction solution.
  • the excess ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester compound is preferably removed by further treating Girard's reagent T to the reaction solution.
  • the excess ester compound reacts with Girard Reagent T to form a water soluble hydrazine derivative. Therefore, the excess ester compound can be removed simply by separating the aqueous layer from the reaction solution of the first step. Therefore, the excess reactant and the water-soluble product N-hydroxy succinimide are prepared by using an excess ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester compound in the reaction of the first step and treating Girard reagent T after the reaction.
  • the aqueous layer containing is removed and an organic layer comprising ⁇ -phosphono amide as product can be used in the second step without further purification.
  • the aldehyde compound in the second step may be reacted with 1.3 to 1.8 equivalents to the ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester compound of the first step.
  • the aldehyde compound when used in excess in the reaction of the second step, most of the product of the first step is reacted with the aldehyde compound to form the product, the ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compound and the water-soluble phosphoric acid, and the excess aldehyde compound It remains in this reaction solution.
  • the excess aldehyde compound is preferably removed by further treatment of the Girard reagent T.
  • the excess aldehyde compound reacts with the Girard reagent T to form a water-soluble salt, so that the excess aldehyde compound can be simply removed by separating the aqueous layer from the reaction solution of the second step.
  • Girard reagent T by using an excess aldehyde compound in the reaction of the second step and treating Girard reagent T after the reaction, the aqueous layer containing the excess reactant and the water-soluble product phosphoric acid is removed and the final product contains the ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compound. To obtain an organic layer can be obtained without further purification.
  • each step provides a product that is soluble in organic solvents and insoluble in aqueous solutions, and together with water soluble by-products, thus requiring no further purification of the product.
  • the ester or aldehyde compound which is the reactant used in excess
  • the Girard reagent T is added to the reaction solution to convert the excess reactant to the water-soluble salt.
  • the organic layer and the aqueous layer can be separated and the aqueous layer can be removed to remove both water-soluble by-products and excess reactants at the same time.
  • a library comprising two or more ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compounds is carried out independently for each combination of two or more ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester compounds, amine compounds and aldehyde compounds.
  • a library containing an ⁇ , ⁇ -unsaturated amide compound in which the substituents are variously changed may be prepared by combining two or more of each reactant to perform an independent reaction. The library thus prepared may be usefully used for discovering new small molecule drugs by applying them to activity tests on various drugs.
  • the HWE reaction (Horner-Wadsworth-Emmons reaction) was performed using a combinatorial chemical synthesis machine (model name: Argonaut Technologies Quest 210 Synthesizer). The reaction was confirmed by thin layer chromatography (TLC) analysis, and silica gel 60 F-254 TLC plate was used. Purity was confirmed by HPLC peak area analysis (ZORBRAX Eclipse plus C18 column, 4.6 mm x 150 mm, 5 ⁇ m; UV absorption detector at 250 nm wavelength; gradient, 20-100% MeOH / H 2 O, 40 or 60 minutes ).
  • FIG. 1 A solution phase synthesis method in which the compound can be obtained purely without column chromatography purification is shown in FIG. 1.
  • the key intermediate here is ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester 1 .
  • the intermediate is characterized in that it produces N-hydroxysuccinimide (NHS) and phosphoric acid, which are well soluble in water after the reaction. 1 was condensed with 0.85 equivalents of amine to obtain ⁇ -phosphono amides 2 and N-hydroxysuccinimide in water.
  • the remaining ⁇ -phosphono ester 1 is treated with Girard's reagent T (3) , a carbonyl compound scavenger , to form a hydrazine derivative 4 that is soluble in water, and then Removed.
  • the ⁇ -phosphonoamide 2 thus obtained is subjected to HWE reaction with 1.5 equivalents of aldehyde (Horner-Wadsworth-Emmons reaction) to form water-soluble phosphoric acid and to generate ⁇ , ⁇ -unsaturated amide 5 .
  • the remaining aldehyde was removed by treatment with Girard's reagent T, a remover.
  • Core intermediate 1a was readily synthesized from commercially available ⁇ -phosphono ester 6 over two steps without column chromatography purification (Scheme 1).
  • Scheme 1 In order to increase the (E) -selectivity in the HWE reaction, a three-dimensional isopropyl phosphonate group was selected. 1N NaOH was added to 6 in ethanol solvent to hydrolyze and phosphoryl acetic acid 7 was obtained.
  • the obtained intermediate 1a was condensed with 11 various amines 8 ⁇ 1-11 ⁇ (0.85 equivalents) under methylene chloride solvent conditions to obtain 11 kinds of amides 2 (Scheme 2).
  • the reaction of 1a with alkylamines 8 ⁇ 1-3 ⁇ and 8 ⁇ 6-11 ⁇ was terminated within 4 hours at room temperature.
  • the reaction with low nucleophilic arylamines 8 ⁇ 4 ⁇ , 8 ⁇ 5 ⁇ was terminated under the catalytic amount of triethylamine and 4-dimethylaminopyridine (DMAP), and at high temperatures without the addition of such additives. 40 ° C.) in 12 hours.
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • Girard's reagent T (3) was treated to make the remaining succinimidyl ester 1a a soluble derivative 4a .
  • the condensation reaction between 1a and Girard's reagent T was slightly slow but was terminated after 12 hours at room temperature, and ⁇ -phosphonoamide 2a ⁇ 1-11 ⁇ with good yield and purity was obtained after aqueous work-up.
  • ⁇ -methyl ⁇ -phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester 1b with a substituent at the ⁇ position was designed to give diversity to the piperamide backbone (Scheme 4). ).
  • 1b was synthesized by the same method as the synthesis of 1a from the known ⁇ -methyl ⁇ -phosphono ester 10 . Condensation reactions of six amines ( 8 ⁇ 1 ⁇ , 8 ⁇ 3 ⁇ , 8 ⁇ 5 ⁇ , 8 ⁇ 6 ⁇ , 8 ⁇ 8 ⁇ and 8 ⁇ 10 ⁇ ) with 1b resulted in six ⁇ -phosphonoamide 2b Obtained.
  • the 2b and 14 aldehydes 9 ⁇ 1-14 ⁇ were chemically HWE reacted to obtain 11 . 11 was separated only by aqueous work-up without column chromatography purification.
  • Adipocyte 3T3-L1 cells were differentiated into adipocytes in order to confirm anti-obesity activity at the cellular level with respect to the 5 ⁇ 10,3 ⁇ compound showing the best activity as the BRS-3 receptor agonist in Example 3. After oil-red-O staining, the effect of inhibiting the differentiation of adipocytes and the accumulation of fat in adipocytes was confirmed. Specifically, 3T3-L1 cells, which are progenitor cells, were dispensed in 12-well plates and cultured until confluence, followed by adipose differentiation medium (10% FBS, 250 ⁇ M / ml methylisobutylxanthine).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • 5 ⁇ 10,3 ⁇ was treated to determine the effect of inhibiting adipocyte differentiation of the compound.
  • cells differentiated into adipose differentiation medium without 5 ⁇ 10,3 ⁇ treatment were used. After 3 days, it was replaced with DMEM medium containing 10% FBS, 0.25 ng / ml dexamethasone, 5 ⁇ g / ml insulin, and differentiated for 10 days with medium replacement every two days.
  • Differentiated cells were fixed in PBS containing 10% formalin for 1 hour and washed twice with PBS containing 60% isopropanol. Staining with oil-red-O solution for 15 minutes followed by washing with running water. The stained samples were observed under a microscope and photographed and then destained by treatment with 100% isopropanol for 10 minutes. The destained solution was recovered, contained 200 ⁇ l in a 96-well plate, and quantitatively analyzed for fat content by measuring OD values at 500 nm wavelength. The micrograph and the result of quantitative analysis are shown in FIG. 22.
  • a weight gain induction animal model was prepared using a high fat diet (HFD, 60% fat calorie, Research diets, D12492, USA).
  • HFD high fat diet
  • Six-week-old male C57BL / 6J mice Central Laboratory Animals, Seoul) were adapted to the laboratory environment for 1 week with solid feed, and then randomly placed into a high fat diet control group and experimental group according to the randomized block design.
  • mice Five weeks after the high fat diet was administered to the mice, the experimental group was suspended in 5 ⁇ 10,3 ⁇ (20 mg / kg) and 60% PEG400, a control solvent, showing the best activity as a BRS-3 receptor agonist.
  • the weight gain inhibition and / or weight loss is induced by 5 ⁇ 10,3 ⁇ administration in the model of induction of weight gain by high fat diet was observed.
  • blood, liver and visceral adipose tissue were collected under anesthesia with diethyl ether, washed with 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.4), and weighed. Blood collected from the abdominal aorta was centrifuged at 3000 x rpm for 20 minutes using an SST tube to separate serum.
  • Serum total cholesterol and glucose concentrations were measured using blood samples collected from the subjects for 10 weeks. Serum total cholesterol and glucose concentrations were measured twice each time using a commercially available measurement kit (Bio Clinical system). The amount of alanine aminotransferase (ALT) used as a liver function index was also measured using a commercially available analysis kit (Bio Clinical System).
  • ALT alanine aminotransferase
  • the collected liver tissue was fixed with 10% neutral formalin solution, and the tissue was embedded with paraffin after the usual fixation procedure and dehydration process.
  • the embedded tissue was sectioned to 4 ⁇ m thickness and subjected to H & E staining, followed by optical microscopy.
  • ⁇ -phosphonoamide 2a or 2b (0.15 mmol) was added to a reaction vessel, and tetrahydrofuran (1.5 mL) distilled under nitrogen stream was injected.
  • t-BuOK (0.3 mL, 0.30 mmol, 1.0 M solution in THF) was added and stirred for 5 minutes, followed by aldehyde 9 (0.23 mmol).
  • aldehyde 9 (0.23 mmol).
  • 3-hydroxybenzaldehyde 9 ⁇ 9 ⁇ 95% NaH (12.6 mg, 0.50 mmol) was added instead of t-BuOK.
  • Girard's reagent T (0.45 ml, 0.45 mmol, 1.0 M solution in MeOH) was added and stirred at room temperature for 12 hours.

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Abstract

본 발명은 신규한 α,β-불포화 아미드 화합물; 하나 이상의 α,β-불포화 아미드 화합물을 포함하는 화합물 라이브러리로부터 비만 예방 또는 치료효과를 나타내는 화합물을 선별하는 단계 및 상기 선별된 화합물을 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것이 특징인 비만 예방 또는 치료용 조성물 제조 방법; 및 α,β-불포화 아미드 화합물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 α,β-불포화 아미드 화합물은 다양한 활성을 나타내는 천연물인 파이퍼 아미드를 모방하는 모핵구조를 가지는 화합물로서 다양한 약리활성을 나타낼 수 있을 것이며, 중간 산물로서 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르(β-phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester)를 이용하여 가용성 부산물(by-products)을 생성하므로 통상적으로 이용되는 컬럼 크로마토그래피 정제과정을 수행할 필요없이 순수한 화합물을 획득할 수 있다. 또한 이렇게 합성된 화합물 라이브러리로부터 약리활성을 테스트하여 BRS-3에 대한 작용제인 화합물들을 스크리닝하여 비만 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

봄베신 수용체 아형-3 조절제로서의 파이퍼 아미드 계열 화합물
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 α,β-불포화 아미드 화합물; 하나 이상의 α,β-불포화 아미드 화합물을 포함하는 화합물 라이브러리로부터 비만 예방 또는 치료효과를 나타내는 화합물을 선별하는 단계 및 상기 선별된 화합물을 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것이 특징인 비만 예방 또는 치료용 조성물 제조 방법; 및 하기 화학식 2 내지 4로 표시되는 α,β-불포화 아미드 화합물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000003
[화학식 4]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000004
화합물 라이브러리는 약물 개발의 초기 단계에서 hit compound를 발굴하기 위한 중요한 도구이다. 대용량(high-throughput) 합성 기술이 발전하였지만 화합물 라이브러리를 제작하는 것은 많은 부산물과 에너지를 소비한다. 따라서 화합물 라이브러리를 경제적이고 환경친화적인 방법으로 합성하는 필요성이 대두되고 있다.
화합물 라이브러리 합성법에 대한 연구 중에 라이브러리의 핵심 모핵으로 천연물 파이퍼(Piper) 속에서 주로 발견되는 파이퍼 아미드(piper amide) 구조를 주목하였다. 파이퍼 아미드 천연물은 항염증, 항진균, 살충, 진통, 항우울, 항암 작용과 같은 다양한 생리 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 일반적으로 파이퍼 아미드의 구조는 α,β-불포화 아미드기(α,β-unsaturated amide group)를 모핵으로 갖는 것을 특징으로 하며 상기 모핵은 약물이나 약물 후보 물질로서 개발된 바 있다. 예를 들면 AMG-9810과 SB-355791은 매우 강력한 바닐로이드 수용체 TRPV1 길항제(vanilloid receptor TRPV1 antagonist)로 알려져 있으며, Tranilast는 실제 임상에서 사용되는 항알레르기제이다.
상기한 바와 같이 의약화학적으로 유용한 모핵인만큼 α,β-불포화 아미드의 합성법을 보고한 예가 많이 있다. 대부분 α,β-불포화산을 아미드화(amidation) 하거나 올레핀화(olefination)를 통해 이중 결합을 만든다. 알데하이드, 아민, 케테닐리덴트리페닐포스포란(ketenylidenetriphenylphosphorane; Ph3P=C=C=O)을 one-pot으로 반응시켜 α,β-불포화 아미드를 얻는 방법도 있으나 수율이 낮고 크로마토그래피를 이용한 정제를 해야 하는 단점이 있다. 한편, 고분자에 결합된 Horner-Wadsworth-Emmons(HWE) 시약을 이용하여 N-페닐알킬시나마이드(N-(phenylalkyl)cinnamides)를 고체상(solid-phase)으로 합성한 예도 있다. 이 방법은 라이브러리 제작에 적합하지만, 레진에 아민기가 직접 연결되어 있어 다양한 구조로의 확장이 어렵다. 또한, 고체상 합성법은 많은 부분이 레진과 연결 부위를 다루는 데 소요되기 때문에, 용액상(solution-phase) 합성법이 좀 더 경제적일 뿐만 아니라 합성 범위에 대한 제약이 적다.
한편, 비만(obesity) 또는 비만증은 사람의 몸무게가 지나치게 많이 나가는 것을 통틀어 부르는 말로서 병리학적으로는 세계보건기구(WHO)에서 정한 이른바 표준 몸무게 기준치(body mass index; BMI)가 30 이상인 경우를 일컫지만 한국에서는 25 이상이면 비만으로 진단한다. 대부분의 경우 체중이 정상치보다 많이 나가는 것을 뜻하지만 체중이 그다지 많이 나가지 않더라도 몸의 구성성분 중 지방의 비율이 높은 경우 비만이라고 한다. 비만은 그 자체로서는 문제가 되지 않을 수도 있으나, 이로 인해 야기되는 사회적 장애 및 과다한 지방으로 유발되는 2차 합병증이 심각하다. 예를 들어 비만은 고지혈증, 고혈압, 동맥경화, 당뇨병, 지방간, 관절이상 등의 발생비율을 현저하게 증가시킬 수 있다.
이와 같이 비만은 각종 성인병의 원인이 된다. 체중이 늘면 혈당처리 능력이 떨어져 당뇨병을 일으키기 쉬우며 고혈압도 발생할 수 있다. 체중이 정상체중보다 20% 증가되면 당뇨병 발병 가능성은 정상인의 10배로 증가한다. 또한 심장 및 폐기능이 약해져서 수명이 단축될 수도 있다. 고혈압, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화증 등의 복합적인 요인들이 심장기능에 압박을 주어 심부전증에 빠지고 돌발사를 유발하기도 한다. 여성의 경우는 여기에 더해 자궁내막암의 발병률이 높아지며 담석증이 생길 가능성도 높아진다. 남성에게는 대장암과 전립선암의 발병확률이 높아진다. 뿐만 아니라, 체중이 증가하면 남들이 자신을 바라보는 시선을 의식하지 않을 수 없고 이에 대한 강박관념이 심해지면 사람들을 기피하고 혼자만 지내려는 증상이 생긴다. 또 신체에서 오는 열등감이 자신의 삶에 대한 자신감을 잃게 하여 자아에까지 영향을 미친다.
이러한 비만을 예방하고 건강 체중을 유지하기 위해서는 균형잡힌 식사와 규칙적인 운동으로 평생동안 꾸준히 관리해야 한다. 특히 지방세포는 한번 만들어지면 크기는 줄일 수 있지만 자연적으로 제거하는 것은 불가능하여 영구적으로 인체에 남아있게 되므로 처음부터 비만이 되지 않도록 예방하는 것이 중요하다. 따라서, 일차적으로는 섭취하는 칼로리의 양을 줄이고 활동 및 운동량을 증가시키는 방법으로 체중을 줄일 수 있다.
그러나 상기한 바와 같이 일단 형성된 지방세포는 제거가 불가능하므로, 다이어트 식이 섭취와 더불어 지방흡수를 감소시키는 등의 약물을 복용하는 경우가 있다. 그러나, 이러한 다이어트 약은 고혈압 등의 심혈관계질환 및 뇌졸중과 같은 부작용을 유발할 수 있으며, 복용을 중단할 경우 다시 체중이 증가하는 경우가 빈번하다. 중증 비만의 경우 수술요법을 시행할 수 있으며, 이러한 수술요법으로는 지방을 제거하는 수술이나 몸이 소화할 수 있는 음식량을 제한하기 위한 위성형술 또는 위밴드삽입술 등이 시행되고 있다.
본 발명자들은 파이퍼 아미드 계열 화합물 라이브러리를 용액상 병렬 합성법(parallel synthesis)을 이용해 효율적으로 합성하는 방법을 개발하여 경제적이고 환경 친화적인 케미스트리를 구현하고자 한다. 조합화학을 응용하여 한 번의 합성으로 많은 화합물을 얻으며, 물에 녹는 부산물만 만들어 컬럼 크로마토그래피 정제 과정을 생략하여 효율성을 높일 것이라 예상하였다.
본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 α,β-불포화 아미드(α,β-unsaturated amides) 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 하나 이상 포함하는 화합물 라이브러리로부터 비만 예방 또는 치료효과를 나타내는 화합물을 선별하는 단계; 및 상기 선별된 화합물을 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것이 특징인 비만 예방 또는 치료용 조성물 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 α,β-불포화 아미드 화합물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 α,β-불포화 아미드 화합물은 다양한 활성을 나타내는 천연물인 파이퍼 아미드를 모방하는 모핵구조를 가지는 화합물로서 다양한 약리활성을 나타낼 수 있을 것이며, 중간 산물로서 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르(β-phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester)를 이용하여 가용성 부산물(by-products)을 생성하므로 통상적으로 이용되는 컬럼 크로마토그래피 정제과정을 수행할 필요없이 순수한 화합물을 획득할 수 있다. 또한 이렇게 합성된 화합물 라이브러리로부터 약리활성을 테스트하여 BRS-3에 대한 작용제인 화합물들을 스크리닝하여 비만 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 파이퍼 아미드 계열 화합물 라이브러리 제조를 위한 용액상 합성과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 BRS-3 작용제로서의 활성을 갖는 화합물의 구조를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 화합물 5{1,5}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 화합물 5{2,7}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 화합물 5{3,6}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 화합물 5{4,4}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 화합물 5{5,13}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 화합물 5{6,9}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 화합물 5{7,14}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 화합물 5{8,2}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 화합물 5{8,3}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 화합물 5{9,8}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 화합물 5{10,3}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명에 따른 화합물 5{10,4}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명에 따른 화합물 5{11,7}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명에 따른 화합물 11{1,11}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명에 따른 화합물 11{3,4}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명에 따른 화합물 11{5,7}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명에 따른 화합물 11{6,4}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명에 따른 화합물 11{8,6}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명에 따른 화합물 11{10,5}의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 22는 본 발명에 따른 화합물 5{10,3}의 지방생성 억제효과를 나타낸 도이다. (A)는 오일-레드-O 염색을 통해 상기 화합물에 의한 지방전구세포 3T3-L1로부터 지방세포로의 분화억제를 나타낸 도이며, (B)는 상기 분화된 지방세포에서의 지방축적도를 분광광도계로 측정하여 수치로 나타낸 도이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 α,β-불포화 아미드(α,β-unsaturated amides) 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000005
상기 화학식 1에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, C1 내지 C10의 알킬, 알킬페닐, 2,3-디히드로벤조[b][1,4]디옥신(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxine), 벤질, 알콕시벤질, 페닐알킬, 하나 이상의 알콕시기로 치환된 페닐알킬 또는 히드록시페닐알킬이거나, 상기 아미드기의 질소를 포함하여 고리를 형성하는 것이고, R3은 C1 내지 C10의 알킬, C1 내지 C10의 알케닐, 퓨라닐, 페닐, 하나 이상의 알킬기가 치환된 페닐, 할로겐이 치환된 페닐, 히드록시페닐, 니트로페닐, 하나 이상의 알콕시가 치환된 페닐, 알콕시알킬페닐, 할로겐알콕시페닐 또는 벤조[d][1,3]디옥솔(benzo[d][1,3]dioxole)이며, R4는 수소원자 또는 C1 내지 C10의 알킬인 화합물이다.
바람직하게, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 2-메틸프로필, 2-메틸부틸, 4-메틸페닐, 2,3-디히드로벤조[b][1,4]디옥신, 벤질, p-메톡시벤질, 2-페닐에틸, 2-(4'-메톡시페닐)에틸, 2-(3',4'-디메톡시페닐)에틸, 2-p-히드록시페닐에틸이거나, 화학식 1의 아미드기의 질소를 포함하여 피롤리딘 고리를 형성하는 것일 수 있다.
바람직하게, 상기 R3은 n-헵틸, 1-헵테닐, 2-퓨라닐, 페닐, 4-메틸페닐, 2,5-디메틸페닐, 4-브로모페닐, 4-t-부틸페닐, 3-히드록시페닐, 3-니트로페닐, 3,4-디메톡시페닐, 4-메톡시-2-메틸페닐, 2-플루오로-4-메톡시페닐 또는 벤조[d][1,3]디옥솔일 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 R4는 수소원자 또는 메틸일 수 있다.
상기 기술된 R1 내지 R4를 각각 조합하여 합성함으로써 일련의 α,β-불포화 아미드 화합물을 포함하는 화합물 라이브러리를 제작할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 α,β-불포화 아미드 화합물은 도 1에 나타난 용액상(solution-phase) 합성법에 의해 제조할 수 있다. 상기 용액상 합성법을 이용하면 가용성 부산물(by-products)을 생성하므로 통상적으로 이용되는 컬럼 크로마토그래피 정제과정을 수행할 필요없이 순수한 화합물을 획득할 수 있다. 상기 반응은 중간 산물로서 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르(β-phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester)를 이용함으로써 최종 반응 후 부산물로 물에 잘 녹는 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)와 인산을 생성하는 것이 특징이다. 한편, 상기 중간체로 사용된 여분의 β-포스포노 에스테르(β-phosphono ester; 1)는 카보닐 화합물 제거제로 사용되는 Girard's reagent T를 처리하여 수용성 히드라진(hydrazine) 유도체로 전환시켜 aqueous work-up으로 제거할 수 있다. 상기 과정을 통해 수득한 β-포스포노 아미드(β-phosphono amides)는 일련의 알데하이드와 HWE 반응(Horner-Wadsworth-Emmons reaction)을 통해 가용성 인산 및 최종 생성물인 일련의 α,β-불포화 아미드 화합물을 제조할 수 있으며, 여분의 알데하이드는 제거제로서 Girard's reagent T를 처리하여 제거할 수 있다.
상기 중간체는 상업적으로 이용가능한 β-포스포노 에스테르를 이용할 수 있다. 이때, 입체적으로 크기가 큰 이소프로필이 치환된 β-포스포노 에스테르를 이용하면 HWE 반응에서 (E)-선택성을 현저히 향상시킬 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 하나 이상 포함하는 화합물 라이브러리로부터 비만 예방 또는 치료효과를 나타내는 화합물을 선별하는 제1단계; 및 상기 선별된 화합물을 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 제2단계를 포함하는 것이 특징인 비만 예방 또는 치료용 조성물 제조 방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000006
상기 R1 내지 R4는 제1항에 정의된 바와 동일하다.
바람직하게 상기 제1단계는 BRS-3 활성화 효과를 나타내는 화합물을 선택함으로써 달성될 수 있다.
상기 본 발명에서, 용어 "BRS-3"은 봄베신 수용체 아형 3(bombesin receptor subtype-3)의 약자로 BB3일라고도 약칭하며 인간에서 BRS3 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. 포유류에서 상기 단백질은 중추신경계 및 위장관에 널리 분포하여 평활근의 수축, 내분비 및 외분비 과정, 행동 및 대사를 조절한다. BRS-3은 G-단백질 연관 수용체로 공지의 자연적으로 발생하는 봄베신-관련 펩티드와 낮은 친화력으로 상호작용할 뿐이다. 따라서, 자연적인 높은 친화도의 리간드가 없어 희귀 수용체(orphan receptor)로 분류된다. 상기 단백질은 대사작용 및 에너지 항상성에 관여하는 것으로 상기 단백질이 결여된 동물모델에서 비만이 나타났으며, 상기 BRS-3 작용제(agonist)는 항비만 효과를 나타내는 것이 확인되었다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 2 내지 4로 표시되는 α,β-불포화 아미드 화합물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000007
[화학식 3]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000008
[화학식 4]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000009
바람직하게 상기 화합물은 (E)-N-(3,4-디메톡시펜에틸-3-(퓨란-2-일)아크릴아미드((E)-N-(3,4-dimethoxyphenethyl)-3-(furan-2-yl)acrylamide), N-(3,4-디메톡시펜에틸)시나마이드(N-(3,4-dimethoxyphenethyl)cinnamamide) 및 (E)-3-(퓨란-2-일)-N-펜에틸아크릴아미드((E)-3-(furan-2-yl)-N-phenethylacrylamide)일 수 있다.
상기 화합물은 BRS-3(bombesin receptor subtype-3)을 활성화시키는 것이 특징인 조성물로서, 전술한 바와 같이 α,β-불포화 아미드를 하나 이상 포함하는 화합물 라이브러리로부터 BRS-3에 대한 활성화 효과를 갖는 화합물을 선별하는 과정을 통해 상기 화합물들이 이러한 활성이 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 용어 "비만(obesity)"은 체지방이 과도한 상태를 말하는 것으로, 임상적으로 체질량지수가 한국의 경우 25, 세계보건기구(WHO)에 의하면 30 이상인 경우를 의미한다. 이때 체질량지수(body mass index; BMI)는 신장의 제곱에 대한 체중(kg/m2)으로 계산된다. 일반적으로 체중이 정상치보다 높은 경우를 의미하지만 체중이 많이 나가지 않더라도 몸의 구성성분 중 체지방의 비율이 높은 경우 비만이라고 진단하며, 성인과 어린이 모두에서 발병하는 질환이다. 비만은 생명을 단축시키며, 고혈압, 당뇨, 심장질환 및 일부 암과 같은 질환에 걸릴 위험에 처하게 할 수 있다. 비만인 경우 건강에 문제가 생길 확률이 높으며 비만의 정도가 증가할수록 위험성 또한 높아진다. 비만이 생기는 이유는 매우 다양하며 여러 가지 원인이 복합적으로 작용하는 경우가 많다. 이 중 가장 빈번한 원인은 유전적 영향, 생리적 영향, 음식섭취 및 섭식장애, 생활방식, 체중력, 임신 또는 약물 등이다. 비만의 첫번째 징후는 평균을 웃도는 체중이상이며 증상은 하기와 같다: 수면문제, 수면무호흡, 호흡짧아짐, 정맥류, 피부문제, 담석 또는 체중부하로 인한 골관절염 등. 비만은 또한 고혈압을 비롯한 고혈당(당뇨), 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증 등의 질환과 관련이 있다. 한번 과체중이 되면 그 상태를 벗어나기가 쉽지 않으므로 비만은 대부분 평생 겪게 된다. 하지만 비만에 의해 생긴 질병이나 문제는 체중이 감소되면 호전될 수 있다.
이하 본 발명에서는 "항비만(anti-obesity)"라는 용어를 비만 예방, 치료 또는 개선을 모두 포함하는 의미로 사용한다. 이에 따라, 본 발명에서 사용되는 "항비만 조성물"이라는 용어는 상기 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 비만의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 비만의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 상기 비만 예방 또는 치료는 BRS-3(bombesin receptor subtype-3)의 활성화에 의해 달성되는 것일 수 있다. 본 발명의 α,β-불포화 아미드 중 (E)-N-(3,4-디메톡시펜에틸-3-(퓨란-2-일)아크릴아미드((E)-N-(3,4-dimethoxyphenethyl)-3-(furan-2-yl)acrylamide), N-(3,4-디메톡시펜에틸)시나마이드(N-(3,4-dimethoxyphenethyl)cinnamamide) 및 (E)-3-(퓨란-2-일)-N-펜에틸아크릴아미드((E)-3-(furan-2-yl)-N-phenethylacrylamide)는 에너지 항상성 조절에 관여하는 것으로 알려진 BRS-3 작용제의 역할을 하는 소분자임을 확인하였다.
상기 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 용어 "개체"란 비만이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 화합물은 고형분을 기준으로 1일 0.0001 내지 100 mg/체중 kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/체중 kg으로 투여할 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
따라서, 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만의 치료방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "개체"란 상기한 바와 같이 비만이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 비만을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 비만 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르(β-phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester) 화합물을 아민(amine) 화합물과 반응시키는 제1단계; 및 상기 제1단계로부터 유기층을 수득하여 알데하이드 화합물과 반응시키는 제2단계를 포함하는, 상기 α,β-불포화 아미드 화합물의 제조방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 제2단계의 반응이 완료된 후 단순히 수층과 유기층을 분리하여 유기층으로부터 생성물을 수득할 수 있다.
바람직하게, 제1단계에서 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 화합물에 대해 0.7 당량 내지 1 당량의 아민 화합물을 반응시킬 수 있다. 이와 같이, β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 화합물에 대해 동등량 이하의 아민 화합물을 반응시키면 대부분의 아민 화합물은 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 화합물와 반응하여 생성물로서 β-포스포노 아미드(phosphono amide)와 수용성 N-히드록시 숙신이미드를 형성하고 이와 함께 과량의 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 화합물이 반응 용액에 남는다.
상기 제1단계 반응 후 여분의 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 화합물은 지라드 시약 T(Girard's reagent T)를 반응액에 추가로 처리하여 제거하는 것이 바람직하다. 여분의 에스테르 화합물은 지라드 시약 T와 반응하여 수용성 히드라진 유도체를 형성한다. 따라서, 상기 제1단계의 반응액으로부터 수층을 분리함으로써 간단히 여분의 에스테르 화합물을 제거할 수 있다. 따라서, 제1단계의 반응에 과량의 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 화합물을 사용하고 반응 후 지라드 시약 T를 처리함으로써 여분의 반응물 및 수용성 생성물인 N-히드록시 숙신이미드를 포함하는 수층을 제거하고 생성물로서 β-포스포노 아미드를 포함하는 유기층을 수득하여 추가적인 정제과정 없이 제2단계에 사용할 수 있다.
바람직하게, 상기 제2단계에서 알데하이드 화합물은 제1단계의 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 화합물에 대해 1.3 내지 1.8 당량으로 반응시킬 수 있다. 전술한 바와 같이, 제2단계의 반응에서 알데하이드 화합물을 과량으로 사용하면 제1단계의 생성물의 대부분은 알데하이드 화합물과 반응하여 생성물인 α,β-불포화 아미드 화합물 및 수용성 인산을 형성하고 과량의 알데하이드 화합물이 반응액에 남는다.
상기 제2단계 반응 후 여분의 알데하이드 화합물은 지라드 시약 T를 추가로 처리하여 제거하는 것이 바람직하다. 여분의 알데하이드 화합물은 지라드 시약 T와 반응하여 수용성 염을 형성하므로 상기 제2단계의 반응액으로부터 수층을 분리함으로써 간단히 여분의 알데하이드 화합물을 제거할 수 있다. 따라서, 제2단계의 반응에 과량의 알데하이드 화합물을 사용하고 반응 후 지라드 시약 T를 처리함으로써 여분의 반응물 및 수용성 생성물인 인산을 포함하는 수층을 제거하고 최종 생성물인 α,β-불포화 아미드 화합물을 포함하는 유기층을 수득하여 추가적인 정제과정 없이 얻을 수 있다.
전술한 바와 같이, 각 단계는 유기용매에 가용성이며 수용액에 불용성인 생성물을 제공하며, 이와 함께 수용성 부산물을 제공하므로, 생성물에 대한 추가적인 정제과정을 필요로 하지 않는 것이 특징이다. 특히, 과량으로 사용된 반응물인 에스테르 또는 알데하이드 화합물은 지라드 시약 T를 첨가하여 수용성 염의 형태로 전환할 수 있으므로, 각 단계의 반응이 완료된 후 반응액에 지라드 시약 T를 첨가하여 과량의 반응물을 수용성 염의 형태로 전환한 후 유기층과 수층을 분리하여 수층을 제거함으로써 수용성 부산물과 여분의 반응물을 동시에 제거할 수 있다.
바람직하게, 2종 이상의 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 화합물, 아민 화합물 및 알데하이드 화합물의 조합에 대해 각각 독립적으로 수행하여 2종 이상의 α,β-불포화 아미드 화합물을 포함하는 라이브러리를 제공할 수 있다. 예컨대, 2종 이상의 각 반응물을 조합하여 독립적인 반응을 수행함으로서 치환기가 다양하게 변화된 α,β-불포화 아미드 화합물을 포함하는 라이브러리를 제조할 수 있다. 이렇게 제조된 라이브러리는 다양한 약물에 대한 활성 테스트 등에 적용하여 신규한 소분자 약물 발굴에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 시약 및 기기
모든 시약은 구입하여 사용하였으며, 모든 실험은 질소 기류 하에서 증류한 용매 조건에서 수행하였다. HWE 반응(Horner-Wadsworth-Emmons reaction)은 조합화학적 합성기계를 이용하였다(모델명 : Argonaut Technologies Quest 210 Synthesizer). 반응은 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC) 분석을 통하여 확인하였고, 실리카겔 60 F-254 TLC 플레이트를 사용하였다. 순도는 HPLC 피크 면적 분석을 통해 확인하였다(ZORBRAX Eclipse plus C18 컬럼, 4.6 mm x 150 mm, 5μm; 250 nm 파장에서의 자외선흡수 검출기; 구배, 20-100% MeOH/H2O, 40 또는 60 분). 녹는점은 Buchi melting point B-540 장치로 측정하였으며, IR 스펙트럼은 Agilent 5500a FT-IR 분광계로 확인하였다. 1H 또는 13C NMR(nuclear magnetic resonance) 스펙트럼은 JEOL LNM-LA 300, JEOL JNM-GCX 400, Bruker AMX-500 분광계를 이용하여 CDCl3에 잔류하는 CHCl3 를 내부 기준(internal standard)으로 하여 측정하였으며, 화학적 이동(chemical shift)은 δ 단위로, 커플링 상수(coupling constant)는 Hz 단위로 나타내었다. 질량 스펙트럼은 FAB(fast atom bombardment) 또는 화학적 이온화(chemical ionization; CI)를 이용하여 측정하였으며 고해상도 질량 스펙트럼(High-resolution mass spectra; HRMS)도 같은 방법을 이용하였다.
실시예 2: α,β-불포화 아미드(α,β-unsaturated amides; 5)의 용액상(solution-phase) 합성법
컬럼 크로마토그래피 정제 과정 없이 화합물을 순수하게 얻을 수 있는 용액상 합성법은 도 1에 나타내었다. 이때 핵심 중간체는 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르(β-phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester) 1이다. 상기 중간체의 특징은 반응 후 물에 잘 녹는 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)와 인산(phosphoric acid)을 생성한다는 점이다. 1을 0.85 당량의 아민과 축합반응하여 β-포스포노 아미드(β-phosphono amides) 2와 물에 녹는 N-히드록시숙신이미드를 얻었다. 남아있는 β-포스포노 에스테르(β-phosphono ester) 1은 카보닐 화합물 제거제(scavenger)인 Girard’s reagent T (3)를 처리하여 물에 녹는 히드라진(hydrazine) 유도체 4로 만든 후 aqueous work-up을 통해 제거하였다. 이렇게 얻은 β-포스포노 아미드 2는 1.5 당량의 알데하이드와의 HWE 반응(Horner-Wadsworth-Emmons reaction)을 통해, 물에 녹는 인산을 만들고 α,β-불포화 아미드 5를 생성한다. 남아있는 알데하이드는 제거제인 Girard's reagent T를 처리하여 제거하였다.
핵심 중간체 1a는 상업적으로 이용가능한 β-포스포노 에스테르 6로부터 두 스텝에 걸쳐 컬럼 크로마토그래피 정제 과정 없이 쉽게 합성하였다(반응식 1). HWE 반응에서 (E)-선택성을 높이기 위해 입체적으로 크기가 큰 이소프로필 포스포네이트기(isopropyl phosphonate group)를 선택하였다. 에탄올 용매 조건에서 6에 1 N NaOH을 가하여 가수분해 한 후 포스포릴아세트산(phosphoryl acetic acid) 7을 얻었다. 추가적인 정제 과정 없이 aqueous work-up만으로 얻은 7에 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 용매 조건에서 EDCI(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)와 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 처리하여 반응성이 좋은 숙신이미딜 에스테르 1a를 얻었다. 상기 반응도 aqueous work-up만으로 좋은 순도의 화합물을 얻었으며 얻은 화합물은 바로 다음 반응에 사용하였다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000010
상기 수득한 중간체 1a를 메틸렌클로라이드 용매 조건에서 11 종의 다양한 아민 8{1-11}(0.85 당량)과 축합반응하여 11 종의 아미드 2를 얻었다(반응식 2). 1a와 알킬아민 8{1-3}, 8{6-11}의 반응은 상온에서 4시간 안에 종결되었다. 하지만, 친핵성이 낮은 아릴아민 8{4}, 8{5}와의 반응은 트리에틸아민(triethylamine)과 DMAP(4-Dimethylaminopyridine) 촉매량 하에서 종결되었고 이와 같은 첨가제(additives)를 넣지 않는 조건에서는 고온(40℃)에서 12시간 만에 종결되었다. TLC로 아민 8이 사라졌음을 확인한 후, 남아있는 숙신이미딜 에스테르 1a를 가용성 유도체 4a로 만들기 위해 Girard's reagent T (3)을 처리하였다. 1a와 Girard's reagent T의 축합반응이 다소 느리지만 상온에서 12시간 만에 종결되었으며, aqueous work-up 후 좋은 수율과 순도의 β-포스포노 아미드 2a{1-11}를 수득하였다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000011
β-포스포노 아미드 2a와 약간 과량의 알데하이드(1.5 당량)의 HWE 반응은 t-BuOK가 가장 적절한 염기로 작용하였다(반응식 3). 대부분의 알데하이드는 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran; THF) 용매 조건에서 t-BuOK를 처리한 β-포스포노 아미드 2a와 반응하여 α,β-불포화 아미드 5를 높은 수율로 생성하였으며 상기 생성물들은 높은 (E)-선택성을 보였다. 하지만, 3-히드록시벤즈알데하이드(3-hydroxy benzaldehyde) 9{9}의 경우 NaH가 더 적절한 염기로 작용하였다.
[반응식 3]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000012
14종의 알데하이드 9{1-14}를 조합화학적으로 11종의 β-포스포노 아미드 2a{1-11}와 HWE 반응시켰다. 반응 종결 후, 남아있는 알데하이드 9는 Girard's reagent T를 처리하여 aqueous work-up을 통해 제거하였다. 5{11,9}의 경우, 두 개의 페놀성 히드록시기(phenolic hydroxyl group)을 갖고 있어 α,β-불포화 아미드를 얻지 못하고 출발 물질인 β-포스포노 아미드를 다시 획득하였다. 이 경우를 제외하고 HPLC로 측정한 순도가 평균 95%인 153개의 파이퍼 아미드 계열 화합물 라이브러리를 합성하였다(표 1).
표 1
Figure PCTKR2014001521-appb-T000001
Figure PCTKR2014001521-appb-I000013
Figure PCTKR2014001521-appb-I000014
파이퍼 아미드 골격에 다양성을 주기 위하여 α 위치에 치환체가 있는 α-메틸 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르(α-methyl β-phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester) 1b를 고안하였다(반응식 4). 알려진 α-메틸 β-포스포노 에스테르 10으로부터 1a의 합성과 동일한 방법으로 1b를 합성하였다. 6종의 아민(8{1}, 8{3}, 8{5}, 8{6}, 8{8} 및 8{10})을 1b와 축합반응하여 6종의 β-포스포노 아미드 2b를 수득하였다. 상기 2b와 14종의 알데하이드 9{1-14}를 조합화학적으로 HWE 반응하여 11을 수득하였다. 상기 과정에서도 컬럼 크로마토그래피 정제 과정 없이 aqueous work-up만으로 11을 분리하였다.
[반응식 4]
Figure PCTKR2014001521-appb-I000015
표 2에 나타난 바와 같이, 84개의 α-메틸 파이퍼 아미드 화합물을 성공적으로 합성하였으며 대부분의 경우 높은 수율과 (E)-선택성을 나타내었다. 하지만, 1b와 이차 아민인 피롤리딘(pyrrolidine) 8{3}의 축합반응으로 얻어진 β-포스포노 아미드 2b{3}가 HWE 반응을 할 때 입체선택성이 낮아지거나 역전되었다(표 2, 엔트리 15-28). 상기 α-메틸 파이퍼 아미드의 제조에도 컬럼 크로마토그래피 정제 과정이 없는 합성법이 효과적으로 적용되었으므로, 본 발명에 따른 용액상 합성법은 α 위치에 다른 치환체가 있는 파이퍼 아미드 계열 화합물 라이브러리 제조에 확장하여 적용할 수 있다.
표 2
Figure PCTKR2014001521-appb-T000002
Figure PCTKR2014001521-appb-I000016
실시예 3: 파이퍼 아미드 계열 화합물 라이브러리의 활성 평가
합성한 파이퍼 아미드 계열 화합물 라이브러리를 평가하기 위해, LG 생명과학의 신약 스크리닝 프로그램에서 무작위로 선택된 60종의 화합물의 활성 테스트를 진행하였다. 다수의 화합물들이 G-단백질 연관 수용체(G-protein coupled receptor; GPCR)와 활성효소(kinase) 표적화에 대한 중간 이상의 활성을 나타냄을 확인하였다. 특히 FLIPR 칼슘 4 활성 검색 키트를 이용하여 재조합 봄베신 수용체 아형-3(bombesin receptor subtype-3; BRS-3)이 과발현된 CHO-K1 세포에서 효능제에 의해 증가된 세포 내 칼슘이온(Ca2+) 농도를 측정한 결과, BRS-3 수용체에 대해 주목할 만한 활성을 보이는 화합물들이 검색되었다. 상기 BRS-3 에 대한 활성 화합물들의 EC50 값은 나노몰랄(nanomolar) 범위까지 측정되었으며 구조적으로 페닐에틸아민기(phenethylamine group)를 공통적으로 포함하였다(도 2). 이는 상기 페닐에틸아민기를 포함하는 파이퍼 아미드 계열 화합물들이 BRS-3 작용제(agonist)로 활용될 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 5{10,3} 화합물(화학식 2)에 의한 시험관 내(in vitro) 항비만 활성 평가
상기 실시예 3에서 BRS-3 수용체 효능제로서 가장 우수한 활성을 나타낸 5{10,3} 화합물에 대한 세포수준에서의 항비만 활성을 확인하기 위하여 지방전구세포 3T3-L1 세포를 지방세포로 분화시킨 후 오일-레드-O 염색하여 지방세포로의 분화억제 및 지방세포에서의 지방축적 억제효과를 확인하였다. 구체적으로, 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 12-웰 플레이트에 분주하고 컨플루언스 상태가 될 때까지 배양한 후, 지방분화용 배지(10% FBS, 250 μM/ml 메틸이소부틸크산텐(methylisobutylxanthine), 0.25 ng/ml 덱사메타손(dexamethasone), 5 μg/ml 인슐린을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium))로 배양하면서 지방세포로의 분화를 유도하였다. 이때, 5{10,3}을 처리하여 상기 화합물의 지방세포 분화억제 효과를 확인하였다. 대조군으로는 5{10,3}을 처리하지 않고 지방분화용 배지로 분화시킨 세포를 이용하였다. 3일 후 10% FBS, 0.25 ng/ml 덱사메타손, 5 μg/ml 인슐린을 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, 이틀 간격으로 배지를 교체하면서 10일간 분화시켰다. 분화된 세포는 10% 포르말린(formalin)을 포함하는 PBS에 1시간 동안 고정시키고 60% 이소프로판올(isopropanol)을 포함하는 PBS로 2회 세척하였다. 오일-레드-O 용액으로 15분 동안 염색한 후 흐르는 물로 세척하였다. 염색이 완료된 시료는 현미경 하에서 관찰하며 사진을 찍은 후, 100% 이소프로판올로 10분 동안 처리하여 탈염색시켰다. 상기 탈염색한 용액을 회수하여 96-웰 플레이트에 200 μl씩 담고 500 nm 파장에서 OD 값을 측정하여 지방함유량을 정량적으로 분석하였다. 상기 현미경 사진과 정량분석 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타난 바와 같이, 대조군인 비처리군에 비해 5{10,3}을 처리한 세포에서 지방세포로의 분화가 현저히 억제되었음을 육안으로(도 22A) 확인하였다. 구체적으로 세포 내에 함유된 지방 함량을 정량적으로 측정한 결과 육안으로 확인한 바와 같이 대조군에 비해 5{10,3} 처리군에서 지방축적도가 현저히 낮음을 확인하였다(도 22B). 이러한 결과로부터 신규한 화합물인 5{10,3}의 지방분화 억제효과를 최초로 확인하였다.
실시예 5: 고지방식이에 의한 체중증가 유도 동물모델에서 5{10,3}의 효과
상기 실시예 4에 의해 지방세포로의 분화억제 및 세포 내 지방축적 감소효과가 확인된 5{10,3}의 생체 내 항비만 효과를 확인하기 위하여 체중증가 유도 동물모델을 이용하였다. 고지방 대조 식이(high fat diet; HFD, 60% 지방 칼로리(fat calorie), Research diets, D12492, USA)를 이용하여 체중증가 유도 동물모델을 제조하였다. 6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(중앙실험동물, 서울)를 고형사료로 1주일 간 실험실 환경에 적응시킨 후, 난괴법(randomized block design)에 따라 고지방 식이 대조군과 실험군으로 임의 배치하여, 고지방 식이를 총 10주간 투여하여 체중증가 동물모델을 확립하였다. 마우스에 고지방 식이를 투여하기 시작한지 5주 후, 실험군에 BRS-3 수용체 효능제로서 가장 우수한 활성을 나타낸 5{10,3}(20 mg/kg)과 대조용매인 60% PEG400에 현탁하여 고지방 식이와 병행하면서 1일 1회 매주 5일씩 5주간 경구로 투여하고, 실험 종료 시 고지방 식이에 의한 체중증가 유도 모델에서 5{10,3} 투여에 의한 체중증가 억제 및/또는 체중감소가 유발되는 지를 관찰하였다. 또한, 실험동물을 디에틸에테르로 마취한 상태에서 혈액, 간 및 내장 지방조직(부고환지방, 신장주변지방)을 채취하여 0.1 M 인산완충용액(pH 7.4)으로 세척한 후 무게를 측정하였다. 복부 대동맥으로부터 채혈한 혈액은 SST 튜브를 사용하여 3000× rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다.
상기 10주간 사육된 실험동물을 대상으로부터 채취한 혈액시료를 이용하여 혈청 총 콜레스테롤, 포도당 농도를 하기와 같이 측정하였다. 혈청 총 콜레스테롤 및 포도당 농도는 상용되는 측정키트(Bio Clinical system)를 이용하여 각각 2회 반복하여 측정하였다. 간기능지표로 사용되는 혈중 ALT(alanine aminotransferase)의 양 또한 상용되는 분석키트(Bio Clinical System)를 사용하여 측정하였다.
또한 상기 채취한 간 조직을 10% 중성포르말린 용액으로 고정하고 통상적인 고정절차 및 탈수과정을 거친 후 파라핀으로 조직을 포매하였다. 포매한 조직을 4 μm 두께로 절편하여 H&E 염색을 실시한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
제조예 1: β-포스포노-N-숙신이미딜 에스테르(β-phosphono-N-succinimidyl esters)의 합성(1a 및 1b)
Figure PCTKR2014001521-appb-I000017
둥근 바닥 플라스크에 디이소프로필 에톡시카보닐메틸 포스포네이트(diisopropyl (ethoxycarbonylmethyl) phosphonate; 6) 또는 알려진 에틸 2-디이소프로폭시포스포릴 프로파노에이트(ethyl 2-(diisopropoxyphosphoryl) propanoate; 10) (51.54 mmol)를 넣고 질소 기류 하에 에탄올(100 ml)을 주입하였다. 실온에서 1.0 N NaOH(62.00 mL, 61.85 mmol) 수용액을 천천히 가한 뒤 5시간 동안 교반하였다. 에탄올 일부를 감압 농축한 후, pH가 1.0이 될 때까지 2.0 N HCl 수용액을 가하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 2회 추출한 후, 유기 추출물을 염수(brine)로 세척하고 MgSO4로 건조하였다. 여액을 감압 농축하여 2-디이소프로폭시포스포릴 아세트산(2-(diisopropoxyphosphoryl) acetic acid; 7a)과 2-디이소프로폭시포스포릴 프로판산(2-(diisopropoxyphosphoryl) propanoic acid; 7b)을 무색 오일로 얻었다. 얻어진 포스포노아세트산(phosphonoacetic acid, 48.45 mmol)을 둥근 바닥 플라스크에 넣은 후 질소 기류 하에서 CH2Cl2(90 ml)를 주입하였다. 0℃에서 EDCI(11.28 g, 72.68 mmol)와 NHS(8.36 g, 72.68 mmol)를 가한 뒤 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 H2O로 quenching 하고 CH2Cl2로 2번 추출하였다. 유기 추출물을 염수로 세척하고 MgSO4로 건조한 후 여액을 감압 농축하였다. β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르(β-phosphono-N-hydroxysuccinimidyl ester) 1a와 1b를 컬럼 크로마토그래피 정제 과정 없이 무색 오일로 얻었다.
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 2-(diisopropoxyphosphoryl)acetate (1a): 수율 84%; 무색 오일; FT-IR (neat) νmax/cm-1 2984, 1740, 1202, 982; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.29-1.36 (12H, m, (CH3)4), 2.82-2.86 (4H, m, CH2CH2), 3.16 (2H, d, J H,P = 21.4 Hz, CH2COO), 4.70-4.85 (2H, m, (OCH)2); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 23.5 (2C, J C,P = 5.1 Hz), 23.7 (2C, J C,P = 4.0 Hz), 25.4 (2C), 31.0 (J C,P = 134.9 Hz), 72.3 (2C, J C,P = 6.5 Hz), 161.3 (J C,P = 6.6 Hz), 168.5 (2C); MS (CI) m/z 322 ([M+H]+, 12%) 225 (100), 116 (58); HRMS (CI) calcd for C12H21NO7P 322.1056 found 322.1050.
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 2-(diisopropoxyphosphoryl) propanoate (1b): 수율 89%; 흰색 고체; m.p. 61-63℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 2984, 1741, 1211, 976; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ H 1.30-1.34 (12H, m, (CH3)4), 1.54 (3H, dd, J H,P = 17.2, J = 7.1 Hz, CH3), 2.75-2.83 (4H, m, CH2CH2), 3.21 (1H, qd, J H,P = 19.3, J = 7.2 Hz, CH), 4.69-4.83 (2H, m, (OCH)2); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 11.9 (J C,P = 6.0 Hz), 23.62 (J C,P = 5.1 Hz), 23.65 (J C,P = 5.1 Hz), 23.83 (J C,P = 3.8 Hz), 23.85 (J C,P = 4.1 Hz), 25.5 (2C), 37.4 (J C,P = 135.4 Hz), 72.12 (J C,P = 7.0 Hz), 72.16 (J C,P = 7.3 Hz), 165.6 (J C,P = 4.8 Hz), 168.4 (2C); MS (FAB) m/z 336 ([M+H]+, 100%) 252 (76), 137 (75); HRMS (FAB) calcd for C13H23NO7P 336.1212 found 336.1213.
제조예 2: β-포스포노 아미드(β-phosphono amides)의 합성(2a 및 2b)
둥근 바닥 플라스크에 상기 실시예 2에서 합성한 β-포스포노-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 1a 또는 1b(5.00 mmol)를 넣고 질소 기류 하에서 CH2Cl2(25 ml)를 가한 후 아민 8(4.25 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 4시간 동안 교반한 후, Girard's reagent T(15 ml, 15.00 mmol, 1.0 M solution in MeOH)를 가하고 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 H2O로 반응을 종결하고 CH2Cl2로 추출하였다. 유기 추출물을 염수로 세척하고 MgSO4로 건조한 후 여액을 감압 농축하였다. 조 β-포스포노 아미드 2a와 2b는 추가적인 정제 과정 없이 HWE 반응에 이용되었다.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000018
Diisopropyl (2-(isobutylamino)-2-oxoethyl)phosphonate (2a{1}): 수율 99%; 흰색 고체; m.p. 93-95℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3270, 2957, 1662, 1222, 988; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ H 0.92 (6H, d, J = 6.6 Hz, (CH3)2), 1.31 (12H, dd, J = 5.5, 5.6 Hz, (CH3)4), 1.74-1.81 (1H, m, CH), 2.78 (2H, d, J H,P = 20.3 Hz, CH2CO), 3.08 (2H, t, J = 6.3 Hz, NHCH2), 4.65-4.73 (2H, m, (OCH)2), 6.90 (1H, br s, NH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 19.9 (2C), 23.7 (2C, J C,P = 4.9 Hz), 23.8 (2C, J C,P = 4.0 Hz), 28.2, 35.9 (J C,P = 130.6 Hz), 47.0, 71.4 (2C, J C,P = 6.6 Hz), 164.0; MS (FAB) m/z 280 ([M+H]+, 80%), 196 (100); HRMS (FAB) calcd for C12H27NO4P 280.1678 found 280.1676.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000019
Diisopropyl (2-((2-methylbutyl)amino)-2-oxoethyl) phosphonate (2a{2}): 수율 87%; 흰색 고체; m.p. 83-85℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3270, 2972, 1662, 1222, 985; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 0.88 (3H, t, J = 7.3 Hz, CH2CH3), 0.90 (3H, d, J = 6.6 Hz, CHCH3), 1.08-1.19 (1H, m), 1.30 (6H, d, J = 6.0 Hz, (CH3)2), 1.31 (6H, d, J = 6.2 Hz, (CH3)2), 1.36-1.60 (2H, m), 2.78 (2H, d, J H,P = 20.3 Hz, CH2CO), 3.03-3.23 (2H, m, NHCH2), 4.63-4.74 (2H, m, (OCH)2), 6.89 (1H, br s, NH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 10.8, 16.7, 23.5 (2C, J C,P = 4.9 Hz), 23.6 (2C, J C,P = 3.7 Hz), 26.5, 34.4, 35.7 (J C,P = 131.0 Hz), 45.0, 71.1 (2C, J C,P = 6.5 Hz), 163.9 (J C,P = 3.2 Hz); MS (FAB) m/z 294 ([M+H]+, 73%), 210 (97); HRMS (FAB) calcd for C13H29NO4P 294.1834 found 294.1827.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000020
Diisopropyl (2-oxo-2-(pyrrolidin-1-yl)ethyl)phosphonate (2a{3}): 수율 59%; 무색 오일; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3478, 2980, 1633, 1243, 1211, 979; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.33 (6H, d, J = 6.6 Hz, (CH3)2), 1.34 (6H, d, J = 6.0 Hz, (CH3)2), 1.83-1.99 (4H, m, CH2CH2), 2.94 (2H, d, J H,P = 22.2 Hz, CH2CO), 3.47 (2H, t, J = 6.0 Hz, NCH2), 3.60 (2H, t, J = 6.6 Hz, NCH2), 4.69-4.80 (2H, m, (OCH)2); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 23.1 (2C, J C,P = 4.8 Hz), 23.3 (2C, J C,P = 3.7 Hz), 23.8, 25.3, 35.1 (J C,P = 133.2 Hz), 45.3, 46.8, 70.6 (2C, J C,P = 6.5 Hz), 162.5 (J C,P = 5.7 Hz); MS (CI) m/z 278 ([M+H]+, 100%); HRMS (CI) calcd for C12H25NO4P 278.1521 found 278.1517.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000021
Diisopropyl (2-oxo-2-(p-tolylamino)ethyl)phosphonate (2a{4}): 수율 92%; 옅은 갈색 고체; m.p. 120-122℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3260, 2981, 1685, 1235, 1220, 987; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.32 (12H, t, J = 5.9 Hz, (CH3)4), 2.28 (3H, s, OCH3), 2.93 (2H, d, J H,P = 20.3 Hz, CH2CO), 4.65-4.80 (2H, m, (OCH)2), 7.08 (2H, d, J = 8.4 Hz, Ph), 7.38 (2H, d, J = 8.4 Hz, Ph), 8.82 (1H, br s, NH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 20.7, 23.8 (2C, J C,P = 4.9 Hz), 23.9 (2C, J C,P = 4.0 Hz), 37.1 (J C,P = 130.1 Hz), 71.9 (2C, J C,P = 6.9 Hz), 119.8 (2C), 129.2 (2C), 133.7, 135.3, 162.1 (J C,P = 3.7 Hz); MS (FAB) m/z 314 ([M+H]+, 90%) 230 (84); HRMS (FAB) calcd for C15H25NO4P 314.1521 found 314.1513.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000022
Diisopropyl (2-((2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)amino)-2-oxoethyl)phosphonate (2a{5}): 수율 99%; 갈색 납질 고체; m.p. 106-108℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3267, 2980, 1673, 1505, 1210, 976; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.31 (6H, d, J = 6.1 Hz, (CH3)2), 1.33 (6H, d, J = 6.1 Hz, (CH3)2), 2.91 (2H, d, J H,P = 20.3 Hz, CH2CO), 4.18-4.23 (4H, m, CH2CH2), 4.64-4.79 (2H, m, (OCH)2), 6.76 (1H, d, J = 8.8 Hz, Ph), 6.87 (1H, dd, J = 8.7, 2.5 Hz, Ph), 7.15 (1H, d, J = 2.6 Hz, Ph), 8.69 (1H, br s, NH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 23.8 (2C, J C,P = 4.8 Hz), 23.9 (2C, J C,P = 4.0 Hz), 37.0 (J C,P = 130.1 Hz), 64.2, 64.3, 71.9 (2C, J C,P = 6.8 Hz), 109.6, 113.4, 117.0, 131.6, 140.3, 143.3, 162.0 (J C,P = 3.4 Hz); MS (CI) m/z 358 ([M+H]+, 32%), 151 (100), 169 (54); HRMS (CI) calcd for C16H25NO6P 358.1411 found 358.1420.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000023
Diisopropyl (2-(benzylamino)-2-oxoethyl)phosphonate (2a{6}): 수율 81%; 흰색 고체; m.p. 92-94℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3265, 2980, 1663, 1212, 992; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.23 (12H, t, J = 6.8 Hz, (CH3)4), 2.79 (2H, d, J H,P = 20.5 Hz, CH2CO), 4.40 (2H, d, J = 5.9 Hz, CH2Ph), 4.53-4.68 (2H, m, (OCH)2), 7.12 (1H, br s, NH), 7.16-7.28 (5H, m, Ph); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 23.7 (2C, J C,P = 4.9 Hz), 23.8 (2C, J C,P = 4.0 Hz), 36.1 (J C,P = 130.9 Hz), 43.6, 71.7 (2C, J C,P = 6.8 Hz), 127.3, 127.6 (2C), 128.5 (2C), 137.9, 164.0 (J C,P = 3.7 Hz); MS (FAB) m/z 314 ([M+H]+, 70%) 230 (96), 91 (100); HRMS (FAB) calcd for C15H25NO4P 314.1521 found 314.1523.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000024
Diisopropyl (2-((4-methoxybenzyl)amino)-2-oxoethyl) phosphonate (2a{7}): 수율 99%; 흰색 고체; m.p. 84-86℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3267, 2981, 1660, 1212, 984; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.29 (12H, t, J = 6.6 Hz, (CH3)4), 2.83 (2H, d, J H,P = 20.7 Hz, CH2CO), 3.78 (3H, s, OMe), 4.38 (2H, d, J = 5.7 Hz, CH2Ph), 4.60-4.71 (2H, m, (OCH)2), 6.84 (2H, d, J = 8.7 Hz, Ph), 7.10 (1H, br s, NH), 7.22 (2H, d, J = 9.0 Hz, Ph); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 23.7 (2C, J C,P = 4.5 Hz), 23.8 (2C, J C,P = 4.0 Hz), 36.0 (J C,P = 131.0 Hz), 43.1, 55.2, 71.6 (2C, J C,P = 6.6 Hz), 113.9 (2C), 129.0 (2C), 130.1, 158.8, 163.9; MS (FAB) m/z 344 ([M+H]+, 51%) 169 (25), 136 (30); HRMS (FAB) calcd for C16H27NO5P 344.1627 found 344.1623.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000025
Diisopropyl (2-oxo-2-(phenethylamino)ethyl)phosphonate (2a{8}): 수율 99%; 흰색 고체; m.p. 105-107℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3267, 2980, 1662, 1234, 1213, 989; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.29 (12H, t, J = 6.6 Hz, (CH3)4), 2.78 (2H, d, J H,P = 20.7 Hz, CH2CO), 2.83 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2Ph), 3.53 (2H, td, J = 7.2, 5.7 Hz, NHCH2), 4.59-4.70 (2H, m, (OCH)2), 6.88 (1H, br s, NH), 7.21-7.33 (5H, m, Ph); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 23.8 (2C, J C,P = 4.6 Hz), 23.9 (2C, J C,P = 3.7 Hz), 35.5, 36.1 (J C,P = 130.7 Hz), 41.1, 71.5 (2C, J C,P = 6.6 Hz), 126.4, 128.5 (2C), 128.6 (2C), 138.7, 164.2; MS (FAB) m/z 328 ([M+H]+, 85%) 154 (63), 105 (32); HRMS (FAB) calcd for C16H27NO4P 328.1678 found 328.1687.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000026
Diisopropyl (2-((4-methoxyphenethyl)amino)-2-oxoethyl) phosphonate (2a{9}): 수율 99%; 흰색 고체; m.p. 112-114℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3268, 2977, 1660, 1513, 1238, 985; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.27 (12H, t, J = 6.2 Hz, (CH3)4), 2.75 (2H, t, J = 7.3 Hz, CH2Ph), 2.75 (2H, d, J H,P = 20.3 Hz, CH2CO), 3.47 (2H, td, J = 7.0, 5.9 Hz, NHCH2), 3.76 (3H, s, OMe), 4.57-4.68 (2H, m, (OCH)2), 6.82 (2H, d, J = 8.6 Hz, Ph), 6.83 (1H, br s, NH), 7.12 (2H, d, J = 8.4 Hz, Ph); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 23.6 (2C, J C,P = 4.9 Hz), 23.7 (2C, J C,P = 3.8 Hz), 34.4, 35.95 (J C,P = 130.9 Hz), 41.1, 55.0, 71.4 (2C, J C,P = 6.5 Hz), 113.8 (2C), 129.4 (2C), 130.6, 158.0, 164.0; MS (FAB) m/z 358 ([M+H]+, 73%) 274 (97), 169 (42); HRMS (FAB) calcd for C17H29NO5P 358.1783 found 358.1784.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000027
Diisopropyl (2-((3,4-dimethoxyphenethyl)amino)-2-oxoethyl)phosphonate (2a{10}): 수율 96%; 옅은 노란색 고체; m.p. 79-81℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3267, 2976, 1659, 1516, 1234, 985; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.26 (6H, d, J = 6.2 Hz, (CH3)2), 1.28 (6H, d, J = 6.2 Hz, (CH3)2), 2.75 (2H, d, J H,P = 20.3 Hz, CH2CO), 2.76 (2H, t, J = 7.1 Hz, CH2Ph), 3.49 (2H, td, J = 7.1, 5.9 Hz, NHCH2), 3.84 (3H, s, OMe), 3.86 (3H, s, OMe), 4.57-4.67 (2H, m, (OCH)2), 6.72-6.80 (3H, m, Ph) 6.89 (1H, br s, NH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 23.4 (2C, J C,P = 4.6 Hz), 23.5 (2C, J C,P = 3.7 Hz), 34.7, 35.7 (J C,P = 131.2 Hz), 40.9, 55.38, 55.43, 71.1 (2C, J C,P = 6.5 Hz), 111.0, 111.5, 120.2, 131.0, 147.2, 148.5, 163.9 (J C,P = 3.2 Hz); MS (FAB) m/z 388 ([M+H]+, 56%) 164 (100); HRMS (FAB) calcd for C18H31NO6P 388.1889 found 388.1888.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000028
Diisopropyl (2-((4-hydroxyphenethyl)amino)-2-oxoethyl) phosphonate (2a{11}): 수율 89%; 옅은 노란색 고체; m.p. 97-99℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3279, 3229, 2984, 1641, 1219, 980; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.28 (12H, t, J = 6.8 Hz, (CH3)4), 2.71 (2H, t, J = 7.0 Hz, CH2Ph), 2.76 (2H, d, J H,P = 20.5 Hz, CH2CO), 3.46 (2H, td, J = 6.8, 5.9 Hz, NHCH2), 4.57-4.70 (2H, m, (OCH)2), 6.73 (2H, d, J = 8.6 Hz, Ph), 6.84 (1H, br s, NH), 7.01 (2H, d, J = 8.4 Hz, Ph), 7.09 (1H, br s, OH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 23.7 (2C, J C,P = 4.9 Hz), 23.8 (2C, J C,P = 4.0 Hz), 34.4, 36.0 (J C,P = 131.7 Hz), 41.4, 71.9 (2C, J C,P = 6.8 Hz), 115.4 (2C), 129.3, 129.5 (2C), 155.4, 164.3 (J C,P = 3.4 Hz); MS (FAB) m/z 344 ([M+H]+, 76%) 260 (100); HRMS (FAB) calcd for C16H27NO5P 344.1627 found 344.1640.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000029
Diisopropyl (1-(isobutylamino)-1-oxopropan-2-yl)phosphonate (2b{1}): 수율 83%; 흰색 납질 고체; m.p. 54-56℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3265, 2982, 1666, 1226. 985; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 0.90 (6H, d, J = 6.6 Hz, (CH3)2), 1.27-1.32 (12H, m, (CH3)4), 1.36 (3H, dd, J H,P = 19.1, J = 8.0 Hz, CH3), 1.71-1.80 (1H, m), 2.73 (1H, qd, J H,P = 18.8 , J = 7.4 Hz, CHCO), 2.97-3.16 (2H, m, NHCH2), 4.63-4.73 (2H, m, (OCH)2), 6.95 (1H, br s, NH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 11.6 (J C,P = 6.4 Hz), 20.1 (2C), 23.77 (J C,P = 4.8 Hz), 23.80 (J C,P = 4.8 Hz), 24.0 (2C, J C,P = 3.5 Hz), 28.4, 39.8 (J C,P = 131.6 Hz), 47.2, 71.2 (J C,P = 7.0 Hz), 71.3 (J C,P = 7.0 Hz), 167.8; MS (FAB) m/z 294 ([M+H]+, 100%) 210 (92); HRMS (FAB) calcd for C13H29NO4P 294.1834 found 294.1840.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000030
Diisopropyl (1-oxo-1-(pyrrolidin-1-yl)propan-2-yl)phosphonate (2b{3}): 수율 86%; 옅은 노란색 오일; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3479, 2979, 1640, 1244, 976; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.27 (6H, d, J = 6.1 Hz, (CH3)2), 1.31 (6H, d, J = 6.4 Hz, (CH3)2), 1.36 (3H, dd, J H,P = 18.4, J = 7.1 Hz, CH3), 1.71-1.97 (4H, m, CH2CH2), 3.05 (1H, qd, J H,P = 21.6, J = 7.1 Hz, CHCO), 3.35 (1H, td, J = 9.8, 6.9 Hz, NCH), 3.41-3.47 (2H, m, NCH2), 3.81 (1H, td, J = 9.8, 6.5 Hz, NCH), 4.60-4.75 (2H, m, (OCH)2); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 12.3 (J C,P = 6.8 Hz), 23.7 (J C,P = 5.6 Hz), 23.9 (J C,P = 5.0 Hz), 24.0 (J C,P = 4.3 Hz), 24.2 (J C,P = 3.1 Hz), 24.4, 26.0, 38.6 (J C,P = 133.9 Hz), 46.2, 47.0, 70.7 (J C,P = 6.8 Hz), 71.5 (J C,P = 6.2 Hz), 167.4 (J C,P = 3.7 Hz); MS (FAB) m/z 292 ([M+H]+, 100%) 208 (61); HRMS (FAB) calcd for C13H27NO4P 292.1678 found 292.1685.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000031
Diisopropyl (1-((2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)amino)-1-oxopropan-2-yl)phosphonate (2b{5}): 수율 73%; 갈색 납질 고체; m.p. 110-112℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3271, 2984, 1689, 1504, 1216, 984; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.21-1.34 (12H, m, (CH3)4), 1.43 (3H, dd, J H,P = 17.3, J = 7.2 Hz, CH3), 2.89 (1H, qd, J H,P = 19.4, J = 7.6 Hz, CHCO), 4.19-4.24 (4H, m, CH2CH2), 4.63-4.78 (2H, m, (OCH)2), 6.76 (1H, d, J = 8.6 Hz, Ph), 6.89 (1H, dd, J = 8.7, 2.5 Hz, Ph), 7.16 (1H, d, J = 2.6 Hz, Ph), 8.78 (1H, br s, NH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 11.3 (J C,P = 6.4 Hz), 23.8 (J C,P = 5.1 Hz), 23.9 (J C,P = 4.8 Hz), 24.00 (J C,P = 3.8 Hz), 24.05 (J C,P = 3.5 Hz), 40.6 (J C,P = 131.0 Hz), 64.2, 64.4, 71.6 (J C,P = 7.0 Hz), 71.9 (J C,P = 7.1 Hz), 109.5, 113.3, 117.0, 131.8, 140.2, 143.3, 165.7; MS (FAB) m/z 371 (M+, 100%) 288 (42) 154 (41); HRMS (FAB) calcd for C17H26NO6P 371.1498 found 371.1497.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000032
Diisopropyl (1-(benzylamino)-1-oxopropan-2-yl)phosphonate (2b{6}): 수율 95%; 흰색 납질 고체; m.p. 51-53℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3286, 2983, 1637, 1238, 976; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.16-1.26 (12H, m, (CH3)4), 1.35 (3H, dd, J H,P = 17.4, J = 7.2 Hz, CH3), 2.75 (1H, qd, J H,P = 19.1, J = 7.3 Hz, CHCO), 4.39 (2H, dq, J = 13.7, 5.7 Hz, CH2Ph), 4.49-4.66 (2H, m, (OCH)2), 7.16-7.26 (5H, m, Ph); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 11.4 (J C,P = 6.1 Hz), 23.6 (J C,P = 5.1 Hz), 23.7 (J C,P = 4.8 Hz), 23.80 (J C,P = 4.1 Hz), 23.81 (J C,P = 2.9 Hz), 39.8 (J C,P = 131.9 Hz), 43.6, 71.1 (J C,P = 6.7 Hz), 71.3 (J C,P = 7.1 Hz), 127.1, 127.5 (2C), 128.3 (2C), 138.1, 167.8 (J C,P = 1.3 Hz); MS (FAB) m/z 328 ([M+H]+, 100%) 91 (72) 244 (69); HRMS (FAB) calcd for C16H27NO4P 328.1678 found 328.1689.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000033
Diisopropyl (1-oxo-1-(phenethylamino)propan-2-yl)phosphonate (2b{8}): 수율 94%; 옅은 노란색 납질 고체; m.p. 58-60℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3260, 2983, 1659, 1223, 979; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.19-1.31 (12H, m, (CH3)4), 1.34 (3H, dd, J H,P = 17.7, J = 7.2 Hz, CH3), 2.71 (1H, qd, J H,P = 18.5, J = 7.3 Hz, CHCO), 2.81 (2H, t, J = 7.4 Hz, CH2Ph), 3.50 (2H, td, J = 6.3, 12.0 Hz, NHCH2), 4.54-4.69 (2H, m, (OCH)2), 6.92 (1H, br s, NH), 7.16-7.21 (3H, m, Ph), 7.25-7.30 (2H, m, Ph); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 11.6 (J C,P = 6.2 Hz), 23.7 (J C,P = 4.9 Hz), 23.8 (J C,P = 4.4 Hz), 23.9 (J C,P = 3.7 Hz), 24.0 (J C,P = 3.7 Hz), 35.6, 40.0 (J C,P = 131.4 Hz), 41.1, 71.3 (J C,P = 6.8 Hz), 71.4 (J C,P = 6.8 Hz), 126.4, 128.5 (2C), 128.7 (2C), 138.9, 168.1; MS (FAB) m/z 342 ([M+H]+, 100%) 258 (63) 154 (44); HRMS (FAB) calcd for C17H29NO4P 342.1834 found 342.1839.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000034
Diisopropyl (1-((3,4-dimethoxyphenethyl)amino)-1-oxopropan-2-yl)phosphonate (2b{10}): 수율 99%; 흰색 납질 고체; m.p. 107-109℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3284, 2977, 1637, 1515, 1238, 977; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.20-1.31 (12H, m, (CH3)4), 1.34 (3H, dd, J H,P = 17.7, J = 7.2 Hz, CH3), 2.71 (1H, qd, J H,P = 18.8, J = 7.5 Hz, CHCO), 2.75 (2H, t, J = 7.4 Hz, CH2Ph), 3.47 (2H, td, J = 6.5, 12.7 Hz, NHCH2), 3.82 (3H, s, OMe), 3.85 (3H, s, OMe), 4.55-4.66 (2H, m, (OCH)2), 6.72-6.79 (3H, m, Ph), 6.97 (1H, br s, NH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 11.6 (J C,P = 6.1 Hz), 23.67 (J C,P = 5.1 Hz), 23.73 (J C,P = 5.1 Hz), 23.9 (2C, J C,P = 3.5 Hz), 35.1, 39.9 (J C,P = 131.9 Hz), 41.3, 55.7, 55.8, 71.2 (J C,P = 7.0 Hz), 71.4 (J C,P = 6.7 Hz), 111.2, 111.8, 120.5, 131.3, 147.5, 148.8, 168.0; MS (FAB) m/z 402 ([M+H]+, 99%) 164 (100) 318 (67); HRMS (FAB) calcd for C19H33NO6P 402.2046 found 402.2056.
제조예 3: α,β-불포화 아미드의 합성(5 및 11)
반응용기(reaction vessel)에 β-포스포노 아미드 2a 또는 2b(0.15 mmol)를 넣고 질소 기류 하에 증류한 테트라히드로퓨란(1.5 mL)을 주입하였다. t-BuOK(0.3 mL, 0.30 mmol, 1.0 M solution in THF)를 첨가하고 5분 동안 교반한 후, 알데하이드 9(0.23 mmol)를 가하였다. 3-히드록시벤즈알데하이드(3-hydroxybenzaldehyde) 9{9}의 경우, t-BuOK 대신 95% NaH(12.6 mg, 0.50 mmol)를 가하였다. 상온에서 6시간 동안 교반한 후, Girard's reagent T(0.45 ml, 0.45 mmol, 1.0 M solution in MeOH)를 가하고 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 H2O로 반응을 종결하고 EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물은 염수로 세척하고 MgSO4로 건조한 후 여액을 감압 농축하였다. 조 α,β-불포화 아미드 5와 11은 1H NMR과 FAB-MS로 확인하였다. 모든 화합물의 순도는 HPLC 피크 면적 분석을 확인하였다.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000035
(E)-N-isobutyl-3-(p-tolyl)acrylamide (5{1,5}): 수율 74%; 노란색 고체; m.p. 113-115℃(lit.21 m.p. 111-112℃); FT-IR (neat) νmax/cm-1 3246, 2961, 1651, 1607, 988, 809; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 0.95 (6H, d, J = 6.9 Hz, (CH3)2), 1.79-1.88 (1H, m), 2.35 (3H, s, PhCH3), 3.21 (2H, t, J = 6.3 Hz, NHCH2), 5.76 (1H, br s, NH), 6.38 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH), 7.16 (2H, d, J = 8.1 Hz, Ph), 7.39 (2H, d, J = 8.1 Hz, Ph), 7.60 (1H, d, J = 15.9 Hz, CH=CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 20.1 (2C), 21.4, 28.6, 47.0, 119.8, 127.7 (2C), 129.4 (2C), 132.1, 139.7, 140.7, 166.1; MS (FAB) m/z 218 ([M+H]+, 100%) 154 (80) 136 (59); HRMS (FAB) calcd for C14H20NO 218.1545 found 218.1543.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000036
(E)-3-(4-bromophenyl)-N-(2-methylbutyl)acrylamide (5{2,7}): 수율 99%; 노란색 고체; m.p. 76-78℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3290, 2962, 1651, 1616, 1007, 970, 815; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 0.83-0.92 (6H, m, (CH3)2), 1.09-1.23 (1H, m), 1.34-1.48 (1H, m), 1.54-1.65 (1H, m), 3.13-3.22 (1H, m), 3.26-3.35 (1H, m), 5.76 (1H, br s, NH), 6.37 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH), 7.32 (2H, d, J = 8.6 Hz, Ph), 7.45 (2H, d, J = 8.6 Hz, Ph), 7.53 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 11.2, 17.2, 27.0, 35.0, 45.4, 121.5, 123.6, 128.5, 129.1, 131.4, 131.9, 133.7, 139.4, 165.8; MS (FAB) m/z 296 ([M+H]+, 7%) 154 (100) 136 (68); HRMS (FAB) calcd for C14H19BrNO 296.0650 found 296.0655.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000037
(E)-3-(2,5-dimethylphenyl)-1-(pyrrolidin-1-yl)prop-2-en-1-one (5{3,6}): 수율 97%; 노란색 고체; m.p. 102-104℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 2968, 1648, 1598, 1427, 806; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.88-2.05 (4H, m, CH2CH2), 2.33 (3H, s, PhCH3), 2.39 (3H, s, PhCH3), 3.57?3.66 (4H, m, N(CH2)2), 6.62 (1H, d, J = 15.3 Hz, CH=CH), 7.06?7.10 (2H, m, Ph), 7.34 (1H, s, Ph), 7.95 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 19.3, 20.9, 24.3, 26.1, 46.0, 46.6, 119.7, 126.6, 130.1, 130.5, 134.1, 134.5, 135.4, 139.6, 164.8; MS (FAB) m/z 230 ([M+H]+, 41%) 154 (100) 136 (70); HRMS (FAB) calcd for C15H20NO 230.1545 found 230.1532.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000038
N-(p-tolyl)cinnamamide (5{4,4}): 수율 99%; 흰색 고체; m.p. 160-162℃(lit. m.p. 164-165℃); FT-IR (neat) νmax/cm-1 3251, 1659, 1620, 1536; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 2.31 (3H, s, PhCH3), 6.52 (1H, d, J = 15.0 Hz, CH=CH), 7.14 (2H, d, J = 8.4 Hz, Ph), 7.35-7.37 (3H, m, Ph), 7.46-7.56 (4H, m, Ph), 7.73 (1H, d, J = 15.3 Hz, CH=CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 20.8, 120.3, 121.2, 127.9 (2C), 128.7 (2C), 129.5 (2C), 129.7 (2C), 134.0, 134.7, 135.5, 141.9, 164.3; MS (FAB) m/z 238 ([M+H]+, 21%) 154 (100) 136 (64); HRMS (FAB) calcd for C16H16NO 238.1232 found 238.1225.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000039
(E)-N-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)-3-(2-fluoro-4-methoxyphenyl)acrylamide (5{5,13}): 수율 100%; 갈색 고체; m.p. 156-158℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3265, 2936, 1656, 1614, 1502, 1211; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 3.81 (3H, s, OMe), 4.15-4.29 (4H, m, CH2CH2), 6.51 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH), 6.62 (1H, dd, J = 2.5, 12.7 Hz, Ph), 6.68 (1H, dd, J = 2.7, 8.7 Hz, Ph), 6.79 (1H, d, J = 8.6 Hz, Ph), 6.98 (1H, d, J = 7.5 Hz, Ph), 7.23-7.24 (1H, m, Ph), 7.31 (1H, br s, NH), 7.40 (1H, t, J = 8.7 Hz, Ph), 7.70 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH); 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ C 57.1, 66.3, 66.5, 103.5 (J C,F = 25.8 Hz), 111.4, 112.8 (J C,F = 2.9 Hz), 115.3, 117.2 (J C,F = 11.8 Hz), 118.8, 122.9 (J C,F = 6.4 Hz), 131.8 (J C,F = 5.0 Hz), 134.4, 135.6, 142.6, 145.5, 164.4 (J C,F = 250.1 Hz), 164.7 (J C,F = 11.5 Hz), 167.3; MS (FAB) m/z 330 ([M+H]+, 63%) 154 (100) 136 (71); HRMS (FAB) calcd for C18H17FNO4 330.1142 found 330.1144.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000040
(E)-N-benzyl-3-(3-hydroxyphenyl)acrylamide (5{6,9}): 수율 75%; 노란색 고체; m.p. 160-162℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3297, 1647, 1590; 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ H 4.48 (2H, s, CH1Ph), 6.58 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH), 6.79 (1H, ddd, J = 0.9, 2.4, 8.1 Hz, Ph), 6.96 (1H, t, J = 2.0 Hz, Ph), 7.02 (1H, d, J = 7.7 Hz, Ph), 7.19 (1H, t, J = 7.7 Hz, Ph), 7.27-7.22 (1H, m, Ph), 7.31-7.33 (4H, m, Ph), 7.49 (1H, d, J = 15.8 Hz, CH=CH); 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ C 45.1, 115.9, 118.7, 121.2, 122.3, 129.0, 129.4 (2C), 130.3 (2C), 131.7, 138.3, 140.6, 143.0, 159.7, 169.3; MS (FAB) m/z 254 ([M+H]+, 94%) 154 (100) 91 (82); HRMS (FAB) calcd for C16H16NO2 254.1136 found 254.1180.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000041
(E)-3-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(4-methoxybenzyl) acrylamide (5{7,14}): 수율 78%; 노란색 고체; m.p. 120-122℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3311, 2899, 1651, 1611, 1500, 1233, 1025, 924, 820; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 4.05 (3H, s, OMe), 4.75 (2H, d, J = 5.5 Hz, CH2Ph), 6.12 (1H, br s, NH), 6.24 (2H, s, OCH2O), 6.47 (1H, d, J = 15.4 Hz, CH=CH), 7.05 (1H, J = 8.4 Hz, Ph), 7.13 (2H, J = 8.4 Hz, Ph), 7.23 (1H, J = 8.4 Hz, Ph), 7.49-7.52 (3H, m, Ph), 7.83 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 43.2, 55.2, 102.0, 106.3, 108.4, 114.0 (2C), 118.5, 123.8, 129.1, 129.2 (2C), 130.3, 140.8, 148.1, 148.9, 158.9, 165.8; MS (FAB) m/z 312 ([M+H]+, 9%) 154 (100) 136 (73); HRMS (FAB) calcd for C18H18NO4 312.1236 found 312.1231.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000042
(2E,4E)-N-phenethyldeca-2,4-dienamide (5{8,2}): 수율 68%; 노란색 고체; m.p. 90-92℃(lit. m.p. 96-98℃); FT-IR (neat) νmax/cm-1 3293, 2924, 1653, 1627, 1609, 993, 698; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 0.88 (3H, t, J = 6.9 Hz, CH3), 1.20-1.43 (6H, m), 2.10-2.16 (2H, m), 2.84 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2Ph), 3.59 (2H, td, J = 6.3, 6.9 Hz, NHCH2), 5.58 (1H, br s, NH), 5.68 (1H, d, J = 15.0 Hz), 6.05-6.10 (2H, m), 7.14-7.33 (6H, m); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ C 13.9, 22.4, 28.4, 31.3, 32.8, 35.7, 40.7, 121.6, 126.4, 128.2, 128.5 (2C), 128.7 (2C), 138.9, 141.3, 143.2, 166.4; MS (FAB) m/z 272 ([M+H]+, 100%) 105 (66); HRMS (FAB) calcd for C18H26NO 272.2014 found 272.2008.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000043
(E)-3-(furan-2-yl)-N-phenethylacrylamide(5{8,3}): 수율 84%; 노란색 고체; m.p. 119-121℃(lit. m.p. 124-125℃); FT-IR (neat) νmax/cm-1 3304, 2923, 1656, 1617, 742; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 2.88 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2Ph), 3.64 (2H, td, J = 6.3, 6.6 Hz, NHCH2), 5.63 (1H, br s, NH), 6.22 (1H, d, J = 15.3 Hz, CH=CH), 6.44 (1H, dd, J = 1.8, 3.3 Hz), 6.53 (1H, d, J = 3.3 Hz), 7.20-7.35 (5H, m, Ph), 7.40 (1H, d, J = 15.3 Hz, CH=CH), 7.41 (1H, d, J = 1.8 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 35.7, 40.8, 112.1, 113.7, 118.3, 126.6, 128.0, 128.7 (2C), 128.8 (2C), 138.9, 143.9, 151.3, 165.7; MS (FAB) m/z 242 ([M+H]+, 57%) 205 (100); HRMS (FAB) calcd for C15H16NO2 242.1181 found 242.1190.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000044
(E)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)-N-(4-methoxyphenethyl) acrylamide (5{9,8}): 수율 100%; 노란색 고체; m.p. 131-133℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3293, 2961, 1652, 1613, 1514, 1243, 820; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.31 (9H, s, (CH3)3), 2.83 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2Ph), 3.61 (2H, td, J = 6.5, 6.8 Hz, NHCH2), 3.78 (3H, s, OMe), 5.89 (1H, br s, NH), 6.33 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH), 6.85 (2H, d, J = 8.7 Hz, Ph), 7.13 (2H, d, J = 8.4 Hz, Ph), 7.36 (2H, d, J = 8.7 Hz, Ph), 7.42 (2H, d, J = 8.7 Hz, Ph), 7.61 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ C 31.1 (4C), 34.7, 41.0, 55.2, 114.1 (2C), 119.9, 125.7 (2C), 127.6 (2C), 129.7 (2C), 130.9, 132.0, 140.7, 153.0, 158.3, 166.1; MS (FAB) m/z 338 ([M+H]+, 10%) 57 (100) 276 (65); HRMS (FAB) calcd for C22H28NO2 338.2120 found 338.2125.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000045
(E)-N-(3,4-dimethoxyphenethyl)-3-(furan-2-yl)acrylamide (5{10,3}): 수율 87%; 갈색 고체; m.p. 106-108℃(lit. m.p. 108-109℃); FT-IR (neat) νmax/cm-1 3293, 2937, 1652, 1614, 1514, 1228, 1140, 1022, 730; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 2.80 (2H, t, J = 7.0 Hz, CH2Ph), 3.60 (2H, td, J = 6.2, 6.6 Hz, NHCH2), 3.85 (6H, s, OMe), 5.56 (1H, br s, NH), 6.20 (1H, d, J = 15.4 Hz, CH=CH), 6.42 (1H, dd, J = 1.7, 3.4 Hz), 6.52 (1H, d, J = 3.3 Hz), 6.71-6.74 (2H, m, Ph), 6.80 (1H, d, J = 8.0 Hz, Ph), 7.35-7.40 (2H, m); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 35.2, 40.9, 55.8, 55.9, 111.3, 111.9, 112.1, 113.7, 118.3, 120.6, 127.9, 131.3, 143.9, 147.7, 149.0, 151.2, 165.8; MS (FAB) m/z 302 ([M+H]+, 8%) 154 (100) 136 (70); HRMS (FAB) calcd for C17H20NO4 302.1392 found 302.1394.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000046
N-(3,4-dimethoxyphenethyl)cinnamamide(5{10,4}): 수율 96%; 노란색 고체; m.p. 124-126℃(lit. m.p. 132℃); FT-IR (neat) νmax/cm-1 3344, 2939, 1656, 1621, 1514, 1222, 1138, 1024, 967, 762, 700; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH 2.82 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2Ph), 3.62 (2H, td, J = 6.1, 6.6 Hz, NHCH2), 3.85 (6H, s, OMe), 5.65 (1H, br s, NH), 6.31 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH), 6.72-6.76 (2H, m, Ph), 6.81 (1H, d, J = 7.9 Hz, Ph), 7.32-7.37 (3H, m, Ph), 7.43-7.48 (2H, m, Ph), 7.60 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH=CH); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC 35.2, 40.9, 55.85, 55.87, 111.5, 112.0, 120.6 (2C), 127.7 (2C), 128.8 (2C), 129.6, 131.4, 134.8, 141.0, 147.7, 149.1, 165.9; MS (FAB) m/z 312 ([M+H]+, 12%) 154 (100) 136 (68); HRMS (FAB) calcd for C19H22NO3 312.1600 found 312.1598.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000047
(E)-3-(4-bromophenyl)-N-(4-hydroxyphenethyl)acrylamide (5{11,7}): 수율 66%; 노란색 고체; m.p. 179-180℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3289, 2452, 1649, 1609, 816; 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ H 2.75 (2H, t, J = 7.3 Hz, CH2Ph), 3.46 (2H, t, J = 7.3 Hz, NHCH2), 6.57 (1H, d, J = 15.9 Hz, CH=CH), 6.71 (2H, d, J = 8.6 Hz, Ph), 7.05 (2H, d, J = 8.6 Hz, Ph), 7.46 (2H, d, J = 8.4 Hz, Ph), 7.50 (1H, d, J = 16.3 Hz, CH=CH), 7.54 (2H, d, J = 8.6 Hz, Ph); 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ C 35.7, 42.5, 116.3 (2C), 122.8, 124.6, 130.4 (2C), 130.7 (2C), 131.2, 133.1 (2C), 135.5, 140.2, 156.9, 168.3; MS (FAB) m/z 346 ([M+H]+, 11%) 154 (100) 136 (70); HRMS (FAB) calcd for C17H17BrNO2 346.0443 found 346.0456.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000048
(E)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-N-isobutyl-2-methylacryl amide (11{1,11}): 수율 83%; 노란색 고체; m.p. 89-91℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3329, 2959, 1651, 1606, 1512, 1241, 1136, 1022; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 0.95 (6H, d, J = 6.9 Hz, (CH3)2), 1.79-1.92 (1H, m), 2.12 (3H, d, J = 1.5 Hz, CH=CCH3), 3.20 (2H, t, J = 6.8 Hz, NHCH2), 3.87 (3H, s, OMe), 3.89 (3H, s, OMe), 5.94 (1H, br s, NH), 6.84-6.95 (3H, m, Ph), 7.26 (1H, s, CH=CCH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ C 14.4, 20.1 (2C), 28.5, 47.2, 55.8 (2C), 110.9, 112.7, 122.3, 128.9, 130.7, 133.3, 148.6, 148.7, 169.8; MS (FAB) m/z 278 ([M+H]+, 100%) 277(66) 154 (56) ; HRMS (FAB) calcd for C16H24NO3 278.1756 found 278.1753.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000049
2-Methyl-3-phenyl-1-(pyrrolidin-1-yl)prop-2-en-1-one (11{3,4}): 수율 87%; 노란색 오일; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3459, 2970, 1609, 1417, 698; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.59-1.73 (1H, m, CH2CH2, Z), 1.88-1.93 (4H, m, CH2CH2, E), 2.06 (0.75H, d, J = 1.5 Hz, CH=CCH3, Z), 2.10 (3H, t, J = 1.5 Hz, CH=CCH3, E), 2.98-3.03 (0.5H, m, NCH2, Z), 3.45 (0.5H, t, J = 6.9 Hz, NCH2, Z), 3.53 (4H, t, J = 6.9 Hz, N(CH2)2, E), 6.33 (0.25H, d, J = 1.8 Hz, CH=CCH3, Z), 6.63 (1H, s, CH=CCH3, E), 7.20-7.37 (5H, m, Ph); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 15.6 (E), 21.6, 24.2 (E), 24.5, 25.6 (E), 26.1, 45.2 (E), 45.8, 46.6 (E), 48.8, 127.2, 127.3 (E), 127.4, 128.2 (2C, E), 128.3, 129.0 (2C, E), 130.2 (E), 134.3, 134.4 (E), 136.1 (E), 171.9 (E), CO and Cqu (Z isomer) not detectable; MS (FAB) m/z 216 ([M+H]+, 39%) 154 (100) 136 (64); HRMS (FAB) calcd for C14H18NO 216.1388 found 216.1389.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000050
(E)-3-(4-bromophenyl)-N-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)-2-methylacrylamide (11{5,7}): 수율 84%; 노란색 고체; m.p. 133-135℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3267, 1644, 1601, 1503, 1282, 1201, 1067, 886, 800; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 2.14 (3H, d, J = 1.3 Hz, CH=CCH3), 4.22-4.25 (4H, m, CH2CH2), 6.81 (1H, d, J = 8.8 Hz, Ph), 6.95 (1H, dd, J = 2.5, 8.7 Hz, Ph), 7.19-7.22 (3H, m), 7.30 (1H, s, CH=CCH3), 7.39 (1H, br s, NH), 7.51 (2H, m); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ C 14.5, 64.2, 64.4, 110.1, 113.9, 117.1, 122.0, 130.8 (2C), 131.5, 131.6 (2C), 132.9, 133.4, 134.7, 140.5, 143.4, 167.4; MS (FAB) m/z 374 ([M+H]+, 3%) 154 (100) 136 (64); HRMS (FAB) calcd for C18H17BrNO3 374.0392 found 374.0393.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000051
(E)-N-benzyl-2-methyl-3-phenylacrylamide (11{6,4}): 수율 90%; 노란색 고체; m.p. 69-71℃(lit. m.p. 63-64℃); FT-IR (neat) νmax/cm-1 3283, 1638, 1613, 1536, 694; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 2.10 (3H, d, J = 1.5 Hz, CH=CCH3), 4.56 (2H, d, J = 5.4 Hz, CH2Ph), 6.12 (1H, br s, NH), 7.21-7.38 (11H, m); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ C 14.3, 44.0, 127.5, 127.8, 127.9 (2C), 128.3 (2C), 128.7 (2C), 129.3 (2C), 131.9, 134.0, 136.0, 138.3, 169.4; MS (FAB) m/z 252 ([M+H]+, 100%) 154 (62); HRMS (FAB) calcd for C17H18NO 252.1388 found 252.1391.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000052
(E)-3-(2,5-dimethylphenyl)-2-methyl-N-phenethylacryl amide (11{8,6}): 수율 80%; 노란색 오일; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3313, 2922, 1650, 1614, 1525, 730, 698; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 1.87 (3H, d, J = 0.9 Hz, CH=CCH3), 2.17 (3H, s, PhCH3), 2.29 (3H, s, PhCH3), 2.89 (2H, t, J = 7.1 Hz, CH2Ph), 3.63 (2H, td, J = 6.0, 6.9 Hz, NHCH2), 5.84 (1H, br s, NH), 6.92 (1H, s, Ph), 6.99 (1H, d, J = 7.8 Hz, Ph), 7.07 (1H, d, J = 7.5 Hz, Ph), 7.22-7.24 (3H, m), 7.25-7.34 (3H, m); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ C 13.9, 19.3, 20.9, 35.6, 40.9, 126.5, 128.5, 128.7 (2C), 128.8 (2C), 129.3, 129.9, 132.2, 133.4, 133.5, 134.8, 135.2, 139.0, 169.2; MS (FAB) m/z 294 ([M+H]+, 100%) 173 (42); HRMS (FAB) calcd for C20H24NO 294.1858 found 294.1854.
Figure PCTKR2014001521-appb-I000053
(E)-N-(3,4-dimethoxyphenethyl)-2-methyl-3-(p-tolyl) acrylamide (11{10,5}): 수율 86%; 노란색 고체; m.p. 87-89℃; FT-IR (neat) νmax/cm-1 3320, 2916, 1641, 1608, 1513, 1232, 1144, 1026, 809; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ H 2.03 (3H, d, J = 1.3 Hz, CH=CCH3), 2.34 (3H, s, PhCH3), 2.83 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2Ph), 3.60 (2H, td, J = 5.9, 7.0 Hz, NHCH2), 3.85 (6H, s, OMe), 5.84 (1H, br s, NH), 6.73-6.83 (3H, m, Ph), 7.14-7.22 (5H, m); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ C 14.1, 21.1, 35.1, 41.1, 55.8, 55.9, 111.5, 112.0, 120.6, 129.0 (2C), 129.2 (2C), 131.2, 131.5, 133.1, 133.6, 137.7, 147.7, 149.1, 169.7; MS (FAB) m/z 340 ([M+H]+, 6%) 154 (100) 136 (67); HRMS (FAB) calcd for C21H26NO3 340.1913 found 340.1915.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 α,β-불포화 아미드(α,β-unsaturated amides) 화합물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014001521-appb-I000054
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, C1 내지 C10의 알킬, 알킬페닐, 2,3-디히드로벤조[b][1,4]디옥신(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxine), 벤질, 알콕시벤질, 페닐알킬, 하나 이상의 알콕시기로 치환된 페닐알킬 또는 히드록시페닐알킬이거나, 상기 아미드기의 질소를 포함하여 고리를 형성하는 것이고;
    R3은 C1 내지 C10의 알킬, C1 내지 C10의 알케닐, 퓨라닐, 페닐, 하나 이상의 알킬기가 치환된 페닐, 할로겐이 치환된 페닐, 히드록시페닐, 니트로페닐, 하나 이상의 알콕시가 치환된 페닐, 알콕시알킬페닐, 할로겐알콕시페닐 또는 벤조[d][1,3]디옥솔(benzo[d][1,3]dioxole)이며;
    R4는 수소원자 또는 C1 내지 C10의 알킬인 화합물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 2-메틸프로필, 2-메틸부틸, 4-메틸페닐, 2,3-디히드로벤조[b][1,4]디옥신, 벤질, p-메톡시벤질, 2-페닐에틸, 2-(4'-메톡시페닐)에틸, 2-(3',4'-디메톡시페닐)에틸, 2-p-히드록시페닐에틸이거나, 화학식 1의 아미드기의 질소를 포함하여 피롤리딘 고리를 형성하는 것인 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 R3은 n-헵틸, 1-헵테닐, 2-퓨라닐, 페닐, 4-메틸페닐, 2,5-디메틸페닐, 4-브로모페닐, 4-t-부틸페닐, 3-히드록시페닐, 3-니트로페닐, 3,4-디메톡시페닐, 4-메톡시-2-메틸페닐, 2-플루오로-4-메톡시페닐 또는 벤조[d][1,3]디옥솔인 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 R4는 수소원자 또는 메틸인 화합물.
  5. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 하나 이상 포함하는 화합물 라이브러리로부터 비만 예방 또는 치료효과를 나타내는 화합물을 선별하는 제1단계; 및
    상기 선별된 화합물을 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 제2단계를 포함하는 것이 특징인 비만 예방 또는 치료용 조성물 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014001521-appb-I000055
    상기 R1 내지 R4는 제1항에 정의된 바와 동일하다.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1단계는 BRS-3 활성화 효과를 나타내는 화합물을 선택하는 것인 방법.
  7. 하기 화학식 2 내지 4 중 어느 하나의 화학식으로 표시되는 α,β-불포화 아미드 화합물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2014001521-appb-I000056
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2014001521-appb-I000057
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2014001521-appb-I000058
  8. 제7항에 있어서,
    상기 화합물은 (E)-N-(3,4-디메톡시펜에틸-3-(퓨란-2-일)아크릴아미드((E)-N-(3,4-dimethoxyphenethyl)-3-(furan-2-yl)acrylamide), N-(3,4-디메톡시펜에틸)시나마이드(N-(3,4-dimethoxyphenethyl)cinnamamide) 및 (E)-3-(퓨란-2-일)-N-펜에틸아크릴아미드((E)-3-(furan-2-yl)-N-phenethylacrylamide)인 것인 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 화합물은 BRS-3(bombesin receptor subtype-3)을 활성화시키는 것이 특징인 조성물.
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