WO2010054575A1 - 苊并杂环类化合物、其环糊精包合物和环糊精配结物以及它们在制备BH3类似物Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用 - Google Patents

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WO2010054575A1
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吴桂叶
宋婷
谢飞博
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    • C08B37/0015—Inclusion compounds, i.e. host-guest compounds, e.g. polyrotaxanes

Definitions

  • the present invention relates to a novel class of heterocyclic compounds and cyclodextrin inclusion complexes or complexes of such compounds prepared by nanotechnology; and to the in vivo and in vitro simulation of BH3-only proteins by these compounds, Competitively binds and antagonizes Bcl-2, Bcl-xL and Mcl-1 proteins, thereby inducing apoptosis and its application as an anti-cancer compound.
  • the Bd-2 protein is the most important molecular target for antagonism and reversal of the immortality of malignant tumors. Therefore, a drug that specifically antagonizes Bcl-2 protein will finally achieve the goal of high selectivity, safety, high efficiency, low pain and anti-cancer by specifically inducing apoptosis of tumor cells.
  • the BH3 analogue (BH3mimeti CS ) has the most anti-tumor effect, the pharmacodynamic activity is the best, and the toxic side effect is the lowest.
  • it must also have the ability to broadly antagonize anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins, including Bcl-2, Bcl-xL and Mcl-1 proteins.
  • anti-tumor drugs targeting Bcl-2 have not been marketed so far.
  • Bcl-2 inhibitors three are the best in clinical stage I, II, III. . They are: ABT-737 developed by Abbott Laboratories, Illinois, Obatoclax (G 15-070) developed by Gemin X, and AT-101 by Ascenta, USA. They are all BH3 analogues, and the competition binding constant with Bcl-2 protein reaches nM level, which is much higher than the other 15 similar molecules.
  • the present invention aims to obtain a more targeted indole heterocyclic compound which can act as a BH3 analog Bcl-2 family protein (including Bcl-2, Bcl-xL and Mcl-1 proteins) inhibitors; On the basis of this, in combination with modern nanotechnology, the water solubility of the compound is improved by means of cyclodextrin inclusion or binding, and the bioavailability is improved to fully exploit the use of such a compound as a targeted antitumor agent.
  • Bcl-2 family protein including Bcl-2, Bcl-xL and Mcl-1 proteins
  • the indenocyclic heterocyclic compound of the present invention has the following molecular structural formula:
  • x o, S, carbonyl, ester or amide
  • R 6 CH 3 or C 2 H 5 ;
  • R 7 C3 ⁇ 4, C 2 3 ⁇ 4 or Ar.
  • R 2 , R 3 and R 4 are each a substituent at the 3, 4, 6, and 9 positions on the 8-oxo-8H-indeno[1,2-b]pyrrole parentheterocycle.
  • the synthesis of the compounds of the invention is largely divided into two routes.
  • the first synthetic route is based on 8-oxo-8H-indolo[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile with good rigid coplanarity and strong electron deficient, with nucleophile alcohol and sulfur.
  • esterification, amidation to obtain the corresponding acid, ester, amide
  • the reaction formula is as follows:
  • the second synthetic route is based on hydrazine as a raw material, using concentrated sulfuric acid as a solvent, and adding liquid bromine to reflux for 2 hours to obtain bromo hydrazine.
  • the bromo hydrazine is first reacted with an alcohol, a thiol, a phenol or a thiophenol to obtain a corresponding substituted hydrazine.
  • the second synthetic route differs from the first one by the conditions of substitution and subsequent ring formation, so that two or more isomers of 3, 4 are obtained instead of the previous 3 and 6 positions.
  • the reaction formula is as follows:
  • the compounds obtained by the above methods we examined their degree of BH3 similarity by various means, and their inhibitory effects on Mcl-1 and Bcl-2. As a result, it was revealed that the above-described indenocyclic heterocyclic compound of the present invention has an extremely high degree of BH3 similarity and can effectively inhibit Mcl-1 and Bcl-2 proteins. Based on this, the compounds can be used to prepare BH3 analog Bcl-2 family protein inhibitors, and further used to prepare highly targeted antitumor drugs.
  • the cyclodextrin inclusion complex of the above indenocyclic heterocyclic compound of the present invention is prepared by the following method:
  • cyclodextrin is ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin. Refined, methyl- ⁇ -cyclodextrin or hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin;
  • the indole heterocyclic compound to be encapsulated is dissolved in acetone at a concentration of 5 to 10 mg/mL, and the obtained solution is added dropwise to the aqueous solution of cyclodextrin in a linear form, 40 to 65 ° C, and heated and stirred. 1 to 6 days, precipitation occurs;
  • the cyclodextrin complex of the above indenocyclic heterocyclic compound of the present invention is prepared by the following method:
  • the molar ratio of the cyclodextrin to the compound is 1: 1.5 ⁇ 3;
  • the cyclodextrin is ⁇ -cyclodextrin, ⁇ - cyclodextrin, 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, methyl- ⁇ -cyclodextrin or hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin;
  • the hydrazine heterocyclic compound to be conjugated is mixed with hydrazine, ⁇ '-carbonyldiimidazole in a molar ratio of 1:1 to 2, and dissolved in DMSO to make the hydrazine heterocyclic compound to be conjugated in DMSO.
  • concentration in the solution is 0.2 ⁇ 0.5mmol /mL, and the mixture is stirred at room temperature for 30 ⁇ 60 minutes;
  • the purification can be carried out using an ion exchange column, using the conditions Diai On TM HP-20 ion-exchange resin as an adsorbent, resolved using a mixed solvent of methanol and water. Gradually increase the proportion of methanol in the mixed solvent, and the leaching process is detected by thin layer chromatography. When the proportion of methanol in the eluent reaches 40 to 55%, the part of the compound is rinsed. After the methanol in the obtained eluent was spin-dried under reduced pressure, the remaining solution was freeze-dried to obtain a mixture.
  • the invention adopts phase solubility method, fluorescence spectroscopy, circular dichroism, infrared spectroscopy, thermogravimetric analysis, scanning electron microscopy and H-nuclear magnetic, mass spectrometry and X-single-crystal diffraction to obtain the obtained fluorene heterocyclic compound.
  • the cyclodextrin inclusion complex or the complex was characterized, and the solubility of the heterocyclic compound before and after inclusion or binding and the inhibition of Mcl-1 and Bcl-2 were compared.
  • the results showed that:
  • the treatment of inclusion or binding of dextrin greatly improves the solubility of the indole heterocyclic compound in water and, to some extent, the ability to inhibit Bcl-2 and Mcl-1 proteins.
  • the preparation can also be used to prepare BH3 analog Bcl-2 family protein inhibitors, and is further used to prepare targeted anti-tumor drugs.
  • Another object of the present invention is to disclose the above-described indenocyclic heterocyclic compound, cyclodextrin inclusion complex of the indenocyclic compound, and the preparation of the BH3 analog Bcl-2 family protein. Application in inhibitors.
  • the above Bcl-2 family protein inhibitor or the corresponding antitumor drug may be a simple preparation of the compound, a cyclodextrin inclusion compound or a formulation of the compound, or an effective amount of the anthraquinone heterocyclic compound or A composition formed by mixing a cyclodextrin clathrate, a complex, and an appropriate amount of a pharmaceutically acceptable adjuvant. And can According to the pharmaceutical needs, it is prepared into a desired dosage form according to the formulation method of the prior art.
  • 1 is a kinetic curve of a fluorescent polarization method for detecting a compound that competes with a FAM-Bid peptide for binding to a Bcl-2 protein;
  • Figure 2 is a graph showing the results of the interaction between compounds at the cellular level of Bcl-2/Bax (different concentrations);
  • Figure 3 is a graph showing the results of interaction between compounds at the cellular level of Bcl-2/Bax (different time of action);
  • Figure 4 is a graph showing the positive results of BH3 similarity between Bax protein and mitochondrial colocalization detecting compound;
  • Figure 5 is a negative result of BH3 similarity of Bax protein and mitochondria colocalization detecting compound;
  • Figure 6 is a compound dependent BAX/ BAK cytotoxicity test results (Gossypol is a non-specific control);
  • Figure 7 is a diagram showing the inhibition of Mcl-1 by a compound on Western blotting
  • Figure 8 is a diagram showing the inhibition of Bcl-2 by a compound on the Western blot
  • Figure 9 is a semi-quantitative curve of the inhibition of Mcl-1 protein by the compound 3-thiomorpholine 8-oxo-8H-indolo[l,2-b]pyrrole-9-carbonitrile;
  • Figure 10 is a semi-quantitative curve of the compound 3-thiomorpholine 8-oxo-8H-indolo[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile inhibiting Bcl-2 protein;
  • Figure 11 is a Western blot detection electropherogram showing the inhibition of Mcl-1 and Bcl-2 by an indole heterocyclic compound and its cyclodextrin inclusion complex and complex;
  • Figure 12 is a semi-quantitative curve of inhibition of Mcl-1 protein by 3-thiomorpholine 8-oxo-8H-indeno[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile and its inclusion complex;
  • Figure 13 is a semi-quantitative curve of inhibition of Bcl-2 protein by 3-thiomorpholine 8-oxo-8H-indeno[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile and its inclusion complex;
  • Figure 14 is a Western blot detection electrophoresis pattern of the inhibitory effect of the actual compound and the package on the Mcl-1 and Bcl-2 in the tumor model animal, wherein: 1. a blank control group; 2. a control group 1; Control group 2, 4, experimental group 1; 5, experimental group 2; 6, experimental group 3; 7, experimental group 4.
  • Part I Preparation and characterization of an indenocyclic compound
  • Example 1 Synthesis and characterization of 8-oxo-8H-indolo[l,2-b]pyrrole-9-carbonitrile
  • 0.1 mol of hydrazine, Ol lmol of malononitrile, 150 mL of acetonitrile were sequentially added, and the mixture was heated to reflux for 4 hours.
  • the reaction mixture was changed from pale yellow turbid to orange-red transparent, cooled to room temperature, filtered, and collected. An orange-red filter cake gave 1-dicyanomethylidene-2-oxo-oxime.
  • Example 6 Synthesis and characterization of 6-(thienyl-2-methoxy)-8-oxo-8H-indolo[l,2-b]pyrrole-9-carbonitrile
  • Example 7 3-(3-Fluorobenzoyl)-8-oxo-8H-indeno[l,2-blpyrrole-9-carbonitrile (A) and 4-(3-fluorobenzoyl) Synthesis and characterization of 8-(8-oxo-8H-indolo[l,2-b]pyrrole-9-carbonitrile (B)
  • Example 9 3-(tetrahydro-2H-pyranyl-4-oxy)-8-oxo-8H-indolo[l,2-b]pyrrole-9-carbonitrile (A) and 4- (four Hydrogen-2H-pyranyl-4-oxy)-8-oxo-8H-indolo[l,2-b]pyrrole-9-carbonitrile (Synthesis and Characterization of B) 1.0 g 3- (4-F Hydrogen pyryloxy) oxime, 0.4 g of malononitrile was dissolved in dichloromethane, added to a silica gel column, rinsed rapidly, and after completion of the column, it was dried to a dark red solid.
  • Example 12 Synthesis and characterization of 3-phenoxy-8-oxo-8H-indolo[1,2-b]pyrrole-9-N-tert-butylamide
  • O.Olmol was added in that order.
  • the reaction was completed to give a yellow solid (yield: 85%).
  • Phase solubility diagram The phase solubility diagram is plotted according to the method of J. Agric. Food Chem., 2007, 55 (9), 3535-3539.
  • Circular dichroism spectrum J-810 (Japan); Test method reference J. Phys. Chem. B, 2006, 1 10 (13), 7044-7048.
  • UV absorption test results show that as the concentration of ⁇ -cyclodextrin increases, the UV absorption value of the compound increases gradually, and its solubility gradually increases, indicating the formation of inclusion complex.
  • the solubility of the compound increased from 0.21 ⁇ to 0.36 ⁇ , which was 1.5 times higher.
  • thermogravimetric analysis showed that ⁇ -cyclodextrin showed an inflection point at 298 °C and began to degrade.
  • the inclusions showed an inflection point at 269 ° C and began to degrade, unlike ⁇ -cyclodextrin, indicating the formation of inclusion complexes.
  • the SEM results showed that the 3-thiomorpholinyl-8-oxo-8H-indeno[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile compound was in the shape of a needle, and the ⁇ -cyclodextrin was a larger brick.
  • the SEM image of the physical mixture of the compound and ⁇ -cyclodextrin is a mixed shape of needle-like and tile-like, and the surface morphology of the compound- ⁇ -cyclodextrin inclusion compound is obviously different from the above three, and its shape is a regular diamond shape. .
  • the formation of the inclusion complex can be seen from the apparent difference in the outer shape structure.
  • the obtained precipitate was purified by an ion exchange column, and the obtained product was washed with a mixed solvent of methanol and water, and the solution was lyophilized to obtain 0.42 g of 3-thiomorpholine-8-oxo-8H-indole[1,2-b]pyrrole- 9-formic acid / ⁇ -cyclodextrin formulation.
  • the yield was 25%.
  • ⁇ -cyclodextrin has a series of peaks between 12° and 15 ⁇ 23°
  • the compound 3-thiomorpholine-8-oxo-8H-indole[ 1 ,2-b Pyrrole-9-carboxylic acid has a sharp peak only at 11° and 7°. While the peak of the compound disappears at 11°, there is a new sharp at 6°, and a series of peaks appear at 14 ⁇ 18° and 20 ⁇ 25°. Relative to the compound and the cyclodextrin, new peaks appear in the complex, indicating the formation of the complex.
  • Part III Physicochemical activity detection of indenocyclic heterocyclic compounds, cyclodextrin inclusion complexes, and complexes
  • Example 19 Detection of ⁇ 3 similarity of compounds by fluorescence polarization analysis
  • a 21-amino acid Bid BH3 peptide (amino acid: 79-99: QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR) was synthesized, and a 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester (FAM) was labeled as a fluorescent label (FAM-Bid) at the N-terminus.
  • the reaction system used in the competition binding experiment was GST-Bcl-2 protein (40nM) or Mcl-1 protein, and FAM-Bid polypeptide (5nM) was dissolved in the reaction buffer (100 mM K 3 PO 4 , pH 7.5; ⁇ g /mL bovine gamma albumin; 0.02% sodium azide).
  • a ⁇ reaction system was added to each well, and then 1 ⁇ of different concentrations of the compound to be detected dissolved in DMSO, 3-thiomorpholine-8-oxo-8H-indole[1,2-b]pyrrole, was added. The final concentration of -9-nitrile mother liquor to the experimental design.
  • two control groups were established. One control group contained only Bcl-2 or Mcl-1 and FAM-Bid (equivalent to 0% inhibition rate), and the reaction system in the other control group contained only FAM-Bid peptide. segment.
  • the % well plate was incubated on the microplate after 4 hours of incubation in the dark.
  • the fluorescence polarization value (mP) was measured at an emission wavelength of 485 nm generated by excitation at a wavelength of 530 nm.
  • the Ki value root calculation formula is derived.
  • the test results are shown in Figure 1.
  • the competitive binding constant of this compound to the Bcl-2 protein was 310 nM.
  • Example 20 Intracellular fluorescence polarization energy transfer (FRET) detection BH3 similarity of compounds 2 g of Bcl-2-CFP and Bax-YFP plasmids were transfected into Hda cells separately or simultaneously using calcium phosphate coprecipitation. After 24 hours of staining, the cells were seeded in 6-well culture plates (2 ⁇ 10 5 /well), and the compound to be detected, 3-thiomorpholine 8-oxo-8H-indole and [1,2-b] dissolved in DMSO was added.
  • FRET Fluorescence polarization energy transfer
  • the 527 nm emission wavelength value was recorded in a cell group transfected only with the Bax-YFP plasmid at an excitation wavelength of 505 nm.
  • the experimental group of cells co-transfected with Bcl-2-CFP and Bax-YFP plasmids recorded emission wavelength values of 527 nm and 475 nm with an excitation wavelength of 433 nm.
  • the value of the 527 nm emission fluorescence compared with the 475 nm emission fluorescence was FRET, and the FRET value of the control group alone was set to 1.0, indicating that the two proteins did not undergo fluorescence polarization energy transfer.
  • the FRET value increased to 2.0 due to the interaction between Bcl-2 protein and Bax protein, and the interference of the two protein interactions increased with the increase of drug concentration and time, and FRET decreased.
  • Cell viability was determined by the MTT method. The test results are shown in Fig. 2 and Fig. 3. The compound interferes with the interaction between Bcl-2/Bax at a concentration of 2 ⁇ for 3 hours, showing a concentration-dependent trend.
  • concentration and time indicate the time at which the test compound interferes with the interaction between Bcl-2/Bax at this concentration.
  • Example 21 Detection of BH3 similarity of compounds by colocalization of Bax protein with mitochondria
  • the 5 ⁇ 8 Bax-YFP plasmid was transfected into MCF-7 cells by phospho-co-precipitation method. After transfection for 24 hours, the cells were seeded in 6-well culture plates (0.2 ⁇ 10 wells), and ⁇ was added to detect the compound 3- Thiomorph 8-oxo-8H-indolo[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile, after 6 hours of action, washed with PBS and incubated with 50 nM Mito Tracker Red CMXRos (mitochondria specific probe; red) for 10 min in the dark After washing three times with PBS, a Radiance 2000 laser confocal microscope (Bio-Rad, USA) was used to scan the fluorescence image.
  • a two-channel scan is performed, one channel scans the green fluorescence of Bax-YFP, and the other channel scans the red fluorescence of the CMXRos probe of the mitochondria, and the two channel images superimpose each other to show co-localization.
  • the Bax protein was localized on the mitochondria, the green fluorescence and the red fluorescence were superimposed in orange, as shown in Figure 4; Figure 5 shows the results of the test that failed to drive BAX to mitochondrial shift and colocalization failure.
  • Example 22 Compound-dependent ⁇ / ⁇ cytotoxicity assay to verify the characteristics of its ⁇ 3 analogues.
  • Calcium co-precipitation was transfected with 3 g BAX/BAK interference plasmid into MCF-7 cells. After 24 hours of transfection, cells were harvested, Western Detection of BAX and BAK protein expression after RNA interference, same treatment The cell group without plasmid transfection was set as a control group.
  • Example 23 Western blot detection of compounds inhibiting Mcl-1 and Bcl-2
  • the cells were lysed with 1 ⁇ 10 6 /50 ⁇ cell lysate (62.5 mM Tris-HCl pH 6.8; 2% SDS; 10% gan; 50 mM DTT; 0.01% bromophenol blue), centrifuged, and the protein supernatant was taken.
  • the sample was boiled at 100 ° C for 5 minutes, and subjected to 12% SDS-PAGE electrophoresis and transferred to the membrane.
  • the corresponding antibody was used to detect the target protein, and the horseradish peroxidase-labeled secondary antibody was combined with ECL chromogenic assay to detect the expression level of the target protein in the cells.
  • Figure 7 and Figure 8 show the inhibition of Mcl-1 and Bcl-2 by the compound to be detected, 3-thiomorpholine 8-oxo-8H-indolo[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile, respectively. It can be seen from the figure that the protein bands of Bcl-2 and Mcl-1 gradually become shallower as the time of the test compound is applied to the tumor cells, indicating that the compound has the effect of inhibiting these two proteins.
  • the protein band concentration in the Western image was semi-quantitatively analyzed using the KODAK Gel Logic 1500 Imaging System software. After normalization, the concentration of the protein bands is shown in Figures 9 and 10.
  • Example 24 Western blotting assay for inhibition of Mcl-1 and Bcl-2 by indole heterocyclic compounds and their cyclodextrin inclusion complexes and complexes
  • the cells were seeded in a 6-well culture plate (2 ⁇ 10 5 cells/well), and the compound group was added to the compound 3-thiomorpholine 8-oxo-8H-indole[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile dissolved in DMSO. To the final concentration ⁇ , the package and the group were added to the ⁇ -cyclodextrin package corresponding to the ⁇ compound dissolved in the aqueous solution. After the drug was applied for 24 hours, the cells were washed 3 times with PBS, and after collecting the cell sample, 1 ⁇ 10 6 /50 ⁇ cell lysate (62.5mM Tris-HCl pH 6.8; 2% SDS; 10% glycine; 50mM DTT; 0.01°/.
  • ⁇ -cyclodextrin, 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, methyl- ⁇ -cyclodextrin and hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin were also detected by the same method as above.
  • These compounds include:
  • Example 25 Western blotting assay for inhibition of Mcl-1 and Bcl-2 by contrast compounds and inclusions in tumor model animals
  • Test compound 3-thiomorpholine 8-oxo-8H-indolo[1,2-b]pyrrole-9-carbonitrile, ⁇ -cyclodextrin-incorporated test compound, and oral ⁇ -cyclodextrin pack and package Compounds to be tested.
  • Test conditions include:
  • mice under subcutaneous tumor-bearing without any treatment mice under subcutaneous tumor-bearing without any treatment
  • Control group 1 After subcutaneous tumor-bearing, the mice were intraperitoneally injected with DMSO solution every other day for 10 days.
  • Control group 2 After subcutaneous tumor implantation, the mice were intraperitoneally injected with cyclodextrin solution every other day for 10 days.
  • Experimental group 1 subcutaneous After the tumor, the mice were intraperitoneally injected with 0.03 mg/kg body weight compound every other day.
  • mice were intraperitoneally injected with 0.3 mg/kg body weight compound in DMSO every other day for 10 days;
  • mice were intraperitoneally injected with an aqueous solution of a compound equivalent to 0.3 mg/kg body weight every other day for 10 days;
  • mice were intragastrically administered with an aqueous solution of a compound equivalent to 0.3 mg/kg body weight every other day for 10 days.
  • the tumor long diameter (a) and the short diameter (b) perpendicular thereto were measured twice a week during the experiment, and the tumor volume was calculated according to the formula l/2ab 2 . Observe the survival time of the animals. On the 40th day of the experiment, the tumor inhibition rate was calculated from the tumor volume. The results show:
  • Experimental group 2 (compound DMSO solution injection group) tumor inhibition rate 22.3%;
  • Experimental group 3 (package and inclusion compound injection group) tumor inhibition rate 61.5%;
  • the tumor inhibition rate was 43.7%.
  • the average survival time of the control group was 28 ⁇ 2.1 days, the average lifespan of the compound group was 33 ⁇ 3.1 days, the average survival time of the bag and inclusion compound injection group was 48 ⁇ 5.1 days, and the average survival time of the inclusion compound group was 42 ⁇ 1.1. day.
  • Statistical analysis showed P ⁇ 0.05.
  • the subcutaneous tumors of the mice were excised, and the tissue suspension was prepared by homogenizing the tissue with a saline volume of 1:3.
  • the same western detection method as in Example 24 was used to detect the tumor cells Bcl-2 and Mcl. -1 protein expression.
  • the results are shown in Fig. 14, in which the protein band of the electrophoresis channel 6 is shallower than the band of the electrophoresis channel 5, indicating that the ability of the inclusion complex to inhibit Bcl-2 and Mcl-1 in vivo is higher than that of the compound itself.
  • the inhibition rate of other compounds is between 30 and 50%.
  • the inhibition rate of their cyclodextrin inclusion complexes was generally higher than that of the compounds themselves ( ⁇ .05).

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Abstract

本发明涉及一类苊并杂环类化合物、其环糊精包合物和环糊精配结物以及 它们在制备 BH3类似物 Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用。 该苊并杂环类化合物是 在8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈的3，4，6位引入多种氧代物和硫代物， 羰基化 合物，酯基化合物以及酰基化合物，或进一步将9-腈取代为酸，酯，酰胺基所 得到的化合物。它模拟 BH3-only蛋白，在体外和细胞内竞争性结合和拮抗 Bcl-2, Bcl-x L 和 Mcl-1蛋白，从而诱导细胞凋亡作用，其环糊精包合物和配结物能提高 其作用，它们均可被用于制备抗癌化合物。

Description

苊并杂环类化合物、 其环糊精包合物和环糊精配结物以及
它们在制备 BH3类似物 Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用 技术领域
本发明涉及一类新的苊说并杂环类化合物以及利用纳米技术制备的这类化合 物的环糊精包合物或者配结物；并涉及这些化合物在体内、体外的模拟 BH3-only 蛋白， 竞争性结合和拮抗 Bcl-2, Bcl-xL和 Mcl-1蛋白， 从而诱导细胞凋亡作用 和作为抗癌化合物的应用。
背景技术
分子靶向抗肿瘤药物正在成为继细胞毒剂类抗肿瘤药物之后， 新药研发的 热点和市场化的新生代产品。 Bd-2蛋白， 是拮抗书和逆转恶性肿瘤永生性的最重 要的分子靶点。 所以， 特异性拮抗 Bcl-2蛋白的药物， 将通过专一诱导肿瘤细胞 凋亡， 终于实现高选择性、安全、高效、低痛苦抗癌的目标。在 Bcl-2抑制剂中， 以 BH3 类似物 （BH3mimetiCS) 的抗肿瘤效果最为显著， 药效学活性最好， 毒 副作用最低。此外， 也必须同时具备广谱拮抗 Bcl-2家族蛋白的抗凋亡成员 （包 括 Bcl-2, Bcl-xL和 Mcl-1蛋白） 的能力。
但到目前为止， 以 Bcl-2为靶点的抗肿瘤药物尚无上市产品， 仅有的 19个 临床前 Bcl-2抑制剂中， 有三个效果最优的分别处于临床 I, II, III期。 分别是： 由美国伊利诺州阿伯特实验室研发的 ABT-737, Gemin X公司研发的 Obatoclax (G 15-070 ) , 和美国 Ascenta公司的 AT-101。 它们都是 BH3类似物， 与 Bcl-2 蛋白的竞争结合常数达到 nM级， 远远高于其它 15个同类分子。 但是它们都存 在不足： Gossypol, Obatoclax的 BH3类似程度不足， 不是绝对的 BH3类似物， 也就是具有不依赖 BAX BAK的细胞毒性， 说明存在其他的作用靶点， 因此具 有毒副作用。 Obatoclax正因此面临淘汰。 ABT-737虽然是绝对的 BH3类似物， 但是不能与 Mcl-1作用， 不能广谱抑制 Bcl-2家族蛋白， 因而严重限制了其使用 范围。
本发明人既往研究的成果中公开了一系列 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈的 苊并杂环类化合物， 并且这类化合物具有通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长的活 性 （中国专利， 授权公告号 CN1304370C)。 然而， 作为潜在的以凋亡为基础的 抗肿瘤药物， 其开发同样面对此类药物开发的难点： 凋亡信号通路复杂及潜在 的强烈的细胞毒性及其所必然导致的用药的盲目性， 而这是导致该类药物的开 发失败的重要原因。 因此， 研究中需要突出强调药物作用的靶向性。
另一方面， 药物的理化性状是影响药效发挥的重要原因， 也可能影响药物 开发过程中对药效的准确评估。 本发明的前期研究中就注意到此类问题。 既往 研究中的这些化合物的水溶性较差， 严重的限制其研究和应用。
发明内容
本发明旨在获得靶向性更强的可作为 BH3类似物类 Bcl-2家族蛋白 （包括 Bcl-2, Bcl-xL和 Mcl-1蛋白） 抑制剂的苊并杂环类化合物； 并进而在此基础上， 结合现代纳米技术通过环糊精包合或者配结的手段， 改善化合物的水溶性， 提 高生物利用度， 以充分地开发此类化合物在作为靶向性抗肿瘤制剂方面的用途。
本发明所述的苊并杂环类化合物具有如下的分子结构通式：
Figure imgf000004_0001
其中：
(D R^XR5 ,噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫吗啉基， R2=H, R3 =H， R4=CN、
COOH、 COOR6或 CONHR7 ；
( ID ^H, R2=X 5、 噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫吗啉基， R3=H， 4=CN、
COOH、 COOR6或 CONHR7;
( III ) R^H , R2=H， R3=H、 XR5、 四氢吡喃 -4-氧基、 四氢噻喃 -4-氧基、 噻 吩甲氧基、 噻吩甲氨基或硫吗啉基， R4=CN;
( IV) R =XR5 , R2=H， R3=XR5， R4=CN;
其中： x = o、 S、 羰基、 酯基或酰胺；
R5= a、 (CH2)nAr - ( o，m，p ) Y, Y = C¾、 N02、 Ph、 F、 Cl、 Br、 CF3、 OCH3、 SCH3或 NH2 ; n=0〜4 ;
B、 四氢吡喃基或四氢噻喃基；
R6 = CH3或 C2H5;
R7 = C¾、 C2¾或 Ar。
上述的取代基 、 R2、 R3和 R4分别是 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯母核杂环上 3、 4、 6、 9位的取代基。 本发明的化合物合成主要分为两种途径。
第一种合成途径是以具有很好的刚性共平面性并且强缺电子的 8-氧 -8H-苊 并 [1,2-b]吡咯 -9-腈为原料， 与亲核试剂醇、硫醇或酚、硫酚类发生芳香氢亲核取 代反应， 得到 3-取代， 4取代或 6-取代的 8-氧 -SH-苊并 [1 ,2-b]吡咯 -9-腈， 腈基再 经过水解， 酯化， 酰胺化得到相应的酸， 酯， 酰胺， 反应式如下：
Figure imgf000005_0001
8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈在溶剂 （四氢呋喃， 乙腈， 吡啶， 二甲基甲酰 胺或二甲基亚砜） 中， 与适量的醇， 硫醇， 酚， 硫酚类亲核试剂反应， 温度为 20〜10(TC， 反应时间 0.5〜24小时。 冷却后减压蒸出部分溶剂后， 过滤或直接 柱层析即可得产品 3或 6-单取代氧基 -8-氧代 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈。
3 或 6-单取代氧基 -8-氧代 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈在浓硫酸的条件下水解 可以得到其对应的酸类， 在与相应的醇或者胺反应即可得到相应的酯类及酰胺 类化合物。
第二种合成途径是以苊醌为原料， 以浓硫酸作溶剂， 加入液溴回流 2小时， 得到溴代苊醌。 先用溴代苊醌与醇， 硫醇， 酚， 硫酚反应得到相应的取代苊醌。 取代苊醌与乙腈在硅胶弱酸性催化的条件下反应得到 3- (2-氧代 -2氢 -苊） - 丙 二腈之后， 在 03催化， 乙腈回流 0.5〜6小时冷却后减压蒸除部分溶剂后， 过滤或直接柱层析即可制得相应的 3或 4-单取代氧基 -8-氧代 -SH-苊并 [1,2-b]吡 咯 -9-腈。 之后的水解， 酯化， 酰胺化条件同第一条合成路径。
第二条合成路径不同于第一条的条件在于先取代，后成环，这样可以得到 3， 4位两种同分异构体而不是以前的 3 , 6位。 反应式如下：
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000006_0001
对通过上述方法获得的化合物， 我们通过多种手段检测了它们的 BH3类似 程度， 以及它们对 Mcl-l和 Bcl-2的抑制作用。 结果表明， 本发明的上述苊并杂 环类化合物具有极高的 BH3类似程度， 可以有效抑制 Mcl-l和 Bcl-2蛋白。 基 于此， 该类化合物可用于制备 BH3类似物 Bcl-2家族蛋白抑制剂， 并进一步用 于制备靶向性高的抗肿瘤药物。
研究中还发现， 水溶性较差是本发明的上述苊并杂环类化合物的突出问题， 严重限制其研究及应用。 参考现代药物制剂技术 （环糊精化学一制备与应用. 化学工业出版社， 2009； β-环糊精包合技术及应用.医学创新研究, 2006, 3 (3 )： 31-33； Chem. Pharm. Bull, 2006, 54(1) 26-32) , 本发明的另一项内容在于利用 环糊精包合或配结此类化合物， 形成包合物或配结物， 从而改善其水溶性， 提 高生物利用度。
本发明所述的上述苊并杂环类化合物的环糊精包合物是由下述方法制备：
①称取一定质量的环糊精， 加入水中， 加热搅拌使其成为饱和溶液， 所述 的环糊精为 β-环糊精、 γ-环糊精、 2-羟丙基 -β-环糊精、甲基 -β-环糊精或羟丙基 -γ- 环糊精；
②称取待包合的苊并杂环类化合物， 该化合物与环糊精的摩尔比为 1 : 3〜
10；
③将待包合的苊并杂环类化合物以 5〜10 mg/mL的浓度溶于丙酮，将所得 溶液以线状逐滴加入到环糊精的水溶液中， 40〜65 °C， 加热搅拌 1〜6天， 有沉 淀析出；
④将上述溶液过滤， 用少量蒸馏水洗涤滤饼， 再用少量的丙酮洗去游离状 态的化合物， 50〜70°C真空干燥， 24〜48小时后得到权利要求 1的苊并杂环类 化合物的环糊精包合物。
本发明所述的上述苊并杂环类化合物的环糊精配结物是由下述方法制备：
①称取干燥的环糊精及待配结的苊并杂环类化合物， 环糊精与该化合物的 摩尔比为 1 : 1.5〜3； 所述的环糊精为 β-环糊精、 γ-环糊精、 2-羟丙基 -β-环糊精、 甲基 -β-环糊精或羟丙基 -γ-环糊精；
②将待配结的苊并杂环类化合物与 Ν,Ν'-羰基二咪唑以 1 : 1〜2的摩尔比混 合后溶解到 DMSO中，使待配结的苊并杂环类化合物在 DMSO溶液中的浓度为 0.2〜0.5mmol /mL, 常温搅拌 30〜60分钟；
③往上述 DMSO溶液中加入歩骤①所称取的环糊精及 0.1〜0.3 mmol/mL 的三乙醇胺， 常温反应 18〜24小时；
④往步骤③的反应体系中加入 0.50〜1.0mg/mL的丙酮， 减压析出沉淀；
⑤过滤， 沉淀经纯化得权利要求 1的苊并杂环类化合物的环糊精配结物。 该纯化可以采用离子交换柱进行，条件为采用 DiaiOn TM HP-20离子交换树脂 做吸附剂， 解析采用甲醇与水的混合溶剂。 逐渐增大混合溶剂中甲醇的比例， 淋洗过程用薄层色谱检测。 当洗脱剂中甲醇所占比例达到 40〜55%时配结物部 分被淋洗得到。 将所得淋洗液中的甲醇减压旋干之后， 剩余溶液冷冻干燥得到 配结物。
本发明采用相溶解度法、 荧光光谱法、 圆二色谱法、 红外光谱法、 热重分 析、 扫描电镜和 H核磁、 质谱以及 X单晶衍射等表征手段对所得到的苊并杂环 类化合物的环糊精包合物或配结物进行表征， 并对比检测了包合或配结前后苊 并杂环类化合物的溶解度以及对 Mcl-1和 Bcl-2的抑制作用的对比， 结果表明： 环糊精包合或配结的处理方法大大提高了苊并杂环类化合物在水中的溶解度， 并且在一定程度上提高了抑制 Bcl-2和 Mcl-1蛋白的能力。该制剂也可用于制备 BH3类似物类 Bcl-2家族蛋白抑制剂， 并进一步用于制备靶向性髙的抗肿瘤药 物。
因此， 本发明的另一目的是公开上文所述的苊并杂环类化合物、 该苊并杂 环类化合物的环糊精包合物以及配结物在制备 BH3类似物 Bcl-2家族蛋白抑制 剂中的应用。
上述的 Bcl-2 家族蛋白抑制剂或相应的抗肿瘤药物可以是化合物的单质制 剂、 化合物的环糊精包合物或配结物制剂， 或者是有效量的所述苊并杂环类化 合物或其环糊精包合物、 配结物与适量的药用辅剂混合形成的组合物。 并可以 根据药用需要， 根据现有技术中的制剂方法将其制成需要的剂型。
附图说明
本发明附图 14幅：
附图 1是荧光偏振方法检测化合物与 FAM-Bid肽段竞争结合 Bcl-2蛋白的 动力学曲线；
附图 2是化合物在细胞水平上干扰 Bcl-2/Bax之间相互作用结果示图（不同 浓度）；
附图 3是化合物在细胞水平上干扰 Bcl-2/Bax之间相互作用结果示图（不同 作用时间）；
附图 4是 Bax蛋白与线粒体共定位检测化合物的 BH3类似度阳性结果示图； 附图 5是 Bax蛋白与线粒体共定位检测化合物的 BH3类似度阴性结果示图； 附图 6是化合物依赖 BAX/BAK的细胞毒性实验结果 （Gossypol为非特异 性对照）；
附图 7是化合物对 Mcl-1抑制作用 Western 印记检测电泳图；
附图 8是化合物对 Bcl-2抑制作用 Western 印记检测电泳图；
附图 9是化合物 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈抑制 Mcl-1蛋白作用 半定量曲线；
附图 10是化合物 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈抑制 Bcl-2蛋白作 用半定量曲线；
附图 11 是比较苊并杂环类化合物及其环糊精包合物和配结物对 Mcl-1 和 Bcl-2的抑制作用的 Western印记检测电泳图；
附图 12是 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈及其包合物对 Mcl-1蛋白 抑制作用的半定量曲线；
附图 13是 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈及其包合物对 Bcl-2蛋白 抑制作用的半定量曲线；
附图 14是实对比化合物和包和物在肿瘤模型动物体内对 Mcl-1和 Bcl-2的抑 制作用的 Western印记检测电泳图， 其中： 1、 空白对照组； 2、 对照组①； 3、 对 照组②， 4、 实验组①； 5、 实验组②； 6、 实验组③； 7、 实验组④。
具体实施方式
下面以具体实施例的方式对本发明的内容做进一步的说明。
第一部分： 苊并杂环类化合物制备及其表征实施例；
实施例 1： 8-氧 -8H-苊并 [l,2-b】吡咯 -9-腈的合成及表征 在 500mL单口烧瓶中， 依次加入 O.lmol苊醌， O.l lmol丙二腈， 150mL乙 腈， 加热至回流， 反应 4小时， 反应混合物由淡黄色浑浊变为橙红透明， 冷至 室温后， 过滤， 收集橙红色滤饼， 得到 1-二氰基亚甲基 -2-氧 -苊。 在 500mL单 口烧瓶中，依次加入 1-二氰基亚甲基 -2-氧-苊 0.05mol，碳酸钾 lg， 200mL乙腈， 加热至回流， 反应 4 小时， 大量土黄色固体产析出。 过滤， 收集滤饼。 将滤饼 用大量温水洗涤后干燥， 称重， 产率 95%。
M.p. 275-277 °C； ¾ NM (400M, DMSO): δ 8.705(d, J=8.0Hz, IH), 8.662 (d, J=8.8Hz, IH), 8.631 (d, J=8.0Hz, IH), 8.411 (d, J=8.0Hz, IH), 8.06 (t, J=8.0Hz, 1H),7.984 (t,J=8.0Hz,lH)。
实施例 2: 3- (4-甲基苯氧基) -8-氧-8 苊并[1，2-1)】吡咯-9-腈的合成及表征
50mL乙腈中加入 lg 8-氧 -8H苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， 0.47g对甲基苯酚， 回 流搅拌 3小时， 蒸出部分溶剂， 层析柱分离得产品 3- (4-甲基苯氧基) -8-氧 -8H- 苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， 收率 40%。
结构测定： M.p. 232-233 °C ; 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.916 (dd, J=8.8Hz, IH), 8.623 (d, J=8.8Hz, IH), 8.447 (d, J=6.4Hz, IH), 7.859 (t, J=8.0Hz, IH), 8.324 (d， J=8.4Hz， 2H), 7.101 (d， J=8.4Hz, 2H)， 7.016 (d， J=8.4Hz, IH) ,3.256 (s, 3H)。 实施例 3： 3-苯氧基 -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈 (A) 和 4-苯氧基 -8-氧 -8H- 苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈 （B) 的合成及表征
称取 0.93g 3-苯氧基苊醌， 0.3g丙二腈用二氯甲垸溶解之后，加入硅胶柱中， 快速淋洗， 过柱完毕之后旋干得红色固体。 称重 10.1g， 产率 92%。 取 0.6g 3- 苯氧基- (2-氧代 -2氢 -苊） - 丙二腈， 加入 0.08g K2CO3， 20mL乙腈加热回流 3 小时， 反应完毕之后旋干反应液。 层析柱分离 （CH2C12 : 石油醚 =2: 1 ) 得到橙 红色固体， 核磁检验同分异构体比例 1 : 0.3。 利用制备液相分离的到两种同分 异构体。
第一组分 A: M.p. 265-267 °C； ¾ NMR (400M, CDC13): δ 8.927 (d, J=8.0Hz, IH), 8.630 (d, J=8.8Hz, IH), 8.450 (d, J=7.2Hz, IH), 7.876 (t, J=8.0Hz, lH),7.754 (t, J=8.0Hz,2H), 7.392 (t, J=7.6Hz, IH), 7.233 (d, J=7.6Hz, 2H), 7.028 (d, J=8.4Hz,lH)。
第二组分 B: M.p. 282-283 °C； 1H NMR (400M, CDC13): δ 9.047 (dd, J=8.0Hz， IH), 8.850 (dd, J=7.6Hz, IH), 8.213 (d， J=8.2Hz， IH), 7.999 (t， J=8.0Hz,lH)，7.561 (t J=8,0Hz，2H)， 7.410 (t, J=7,0Hz, 1H)， 7.251 (d, J=8,8Hz, 2H)， 6.899 (d, J=8.4Hz,lH)。 实施例 4: 3- (对甲基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈（A)和 4- (对甲 基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈（B) 的合成及表征
称取 1.0g 3-对甲苯氧基苊醌， 0.3g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅胶柱 中， 快速淋洗， 过柱完毕之后旋干得红色固体。 称重 11.2g， 产率 93%。 取 0.7g 3-苯氧基- (2-氧代 -2氢 -苊） - 丙二腈， 加入 0.08g K2CO3， 20mL乙腈加热回流 4 小时， 反应完毕之后旋干反应液。 层析柱分离 （CH2C12 : 石油醚 =1 : 1 ) 得到橙 红色固体， 核磁检验同分异构体比例 1 :0.4。 利用制备液相分离的到两种同分异 构体。
第一组分 A: M.p. 232-233 °C ; !H NM (400M, CDC13): δ 8.916 (dd, J=8.8Hz, 1H), 8.623 (d, J=8.8Hz, 1H), 8.447 (d, J=6.4Hz, 1H), 7.859 (t, J=8.0Hz, 1H), 8.324 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.101 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.016 (d, J=8.4Hz, 1H), 2.351(s, 3H)。
第二组分 B: M.p. 258-260°C； 1H NMR (400M， CDC13): δ 8.987 (dd, J=8.8Hz， 1H), 8.858 (d, J=8.8Hz, 1H), 8.208 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.986 (t, J=8.0Hz, 1H), 8.333 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.112 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.889 (d, J=8.4Hz, 1H)， 2.349(s, 3H)。 实施例 5: 3- (间甲基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈（A)和 4- (间甲 基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈（B) 的合成及表征
称取 1.0g 3-间甲苯巯基苊醌， 0.3g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅胶柱 中， 快速淋洗， 过柱完毕之后旋干得红色固体。 称重 12.2g， 产率 91%。 取 0.7g 2-苯巯基- (2-氧代 -2氢 -苊） - 丙二腈， 力口入 0.08 g K2CO3， 20mL乙腈加热回流 4小时， 反应完毕之后旋干反应液。 层析柱分离 （CH2C12 : 石油醚 =1 : 1 ) 得到 红色固体， 核磁检验同分异构体比例 1 : 0.25。 利用制备液相分离的到两种同分 异构体。
第一组分 A: M.p. 255-257°C； 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.826 (dd, J=8.8Hz， 1H), 8.513 (d, J=8.8Hz, 1H), 8.327 (d, J=6.4Hz, 1H), 7.659 (t, J=8.0Hz, 1H), 8.014 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.901 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.896 (d, J=8.4Hz, lH),2.353(s, 3H)。
第二组分 B: M.p. 269-271 °C； 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.877 (dd, J=8.8Hz， 1H), 8.748 (d， J=8.8Hz， 1H), 8.108 (d, J=8.4Hz， 1H), 7.856 (t, J=8.0Hz， 1H)， 8.123 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.892 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.679 (d, J=8.4Hz, lH),2.355(s, 3H)。 实施例 6： 6- (噻吩基 -2-甲氧基 )-8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈的合成及表征
50mL乙腈中加入 lg 8-氧 -8H苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， 0.5g噻吩甲醇， 回流搅 拌 6小时， 蒸发部分溶剂， 层析柱分离得产品 6- (2-噻吩甲氧基） -8-氧 -8H-苊 并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， 收率 45%。 M.p. 241-243。C ; 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.685 (dd, J=8.7Hz, IH), 8.433 (d, J=8.7Hz, IH), 8.014 (d, J=6.4Hz, IH), 7.75 (t, J=8.0Hz, IH), 7.251 (t, J=8.4Hz, IH), 7.181 (d, J=8.4Hz, IH), 6.985 (d, J=8.4Hz, IH), 6.232 (d, J=8.4Hz, IH) , 3.454(s, 2H)。
实施例 7： 3- (3-氟代苯甲酰基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-bl吡咯 -9-腈 (A) 和 4- (3- 氟代苯甲酰基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈 (B) 的合成及表征
称取 1.0g 3-间氟苯羰基苊醌， 0.4g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅胶柱 中，快速淋洗，过柱完毕之后旋干得深红色固体。称重 10.5g，产率 85%。取 0.8g 2-氟羰基- (2-氧代 -2氢 -苊） - 丙二腈， 加入 0.08g K2CO3， 20mL乙腈加热回流 3 小时， 反应完毕之后旋干反应液。 层析柱分离 （CH2C12 : 石油醚 =2: 1 ) 得到深 红色固体， 核磁检验同分异构体比例 1 : 0.2。 利用制备液相分离得到两种同分 异构体。
第一组分 A: M.p. 285-287°C； NM (400M, CDC13): δ 8.726 (dd, J=8.8Hz, IH), 8.423 (d, J=8.8Hz, IH), 8.015 (d, J=6.4Hz, IH), 7.598 (t, J=8.0Hz, IH), 8.003 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.853 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.756 (d, J=8.4Hz, 1H)。
第二组分 B: M.p. 269-271 °C； 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.568 (dd, J=8.8Hz， IH), 8.478 (d, J=8.8Hz, IH), 8.006 (d, J=8.4Hz, IH), 7.568 (t, J=8.0Hz, IH), 8.045 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.908(d, J=8.4Hz, 2H), 6.596 (d, J=8.4Hz, 1H)。
实施例 8： 3- (N-苯基甲酰基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈 (A) 和 4- (N- 苯基甲酰基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈 (B) 的合成及表征
称取 1.0g 3-苯基酰胺苊醌， 0.4g丙二腈用二氯甲垸溶解之后，加入硅胶柱中， 快速淋洗， 过柱完毕之后旋干得深红色固体。称重 11.2g， 产率 86%。取 0.8g 苯 酰胺- (2-氧代 -2氢 -苊) - 丙二腈， 加入議 g K2C03， 20mL乙腈加热回流 3小 时， 反应完毕之后旋干反应液。 层析柱分离 （CH2C12 : 石油醚 =2: 1 )得到深红 色固体， 核磁检验同分异构体比例 1 : 0.4。 利用制备液相分离得两种同分异构 体。
第一组分 A: M.p. 281-283 °C ; ¾ NMR (400M, CDC13): δ 9.112 (d, J=8.0Hz, IH), 8.945 (d, J=8.8Hz, IH), 8.682 (d, J=7.2Hz, IH), 8.452 (t, J=8.0Hz,lH), 8.312 (s, 1H),7.986 (t, J=8.0Hz,2H), 7.627 (t, J=7.6Hz, IH), 7.433 (d, J=7.6Hz, 2H), 7.241 (d, J=8.4Hz，lH)。
第二组分 B: M.p. 293 -294 °C； 1H NMR (400M， CDC13): δ 9.213 (dd, J=8.0Hz， IH), 9.012 (dd, J=7.6Hz, IH), 8.685 (d, J=8.2Hz, IH), 8.428 (t, J=8.0Hz,lH), 8.320 (s, 1H),7.896 (t, J=8.0Hz,2H), 7.675 (t, J=7.0Hz, 1H), 7.531 (d, J=8.8Hz, 2H), 7.015 (d, J=8.4Hz, lH)0
实施例 9: 3- (四氢 -2H-吡喃基 -4-氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈 (A)和 4- (四氢 -2H-吡喃基 -4-氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈 （B的合成及表征 称取 1.0g 3- (4-四氢吡喃氧基）苊醌， 0.4g丙二腈用二氯甲烷溶解之后， 加 入硅胶柱中，快速淋洗，过柱完毕之后旋干得深红色固体。称重 11.2g，产率 86%。 取 0.8g 4-四氢吡喃- (2-氧代 -2氢 -苊） - 丙二腈， 加入 0.08g K2CO3， 20mL乙腈 加热回流 9小时， 反应完毕之后旋干反应液。 层析柱分离 （CH2C12 : 石油醚 =2: 1 ) 得到深红色固体， 核磁检验同分异构体比例 1 : 0.4。 利用制备液相分离的到 两种同分异构体。
第一组分 A: M.p. 230-231 °C； ¾ NMR (400M, CDC13): δ 8.601 (d, J=8.0Hz, 1H), 8.134 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.945 (dd, J=8.0Hz, 1H), 7.452 (d, J=8.4Hz,lH), 3.822 (t, J=4.8Hz ,4H),3.815(t, J=5.0Hz ,4H),3.766 (t, J=5.2Hz, lH)。
第二组分 B: M.p. 242-244 °C； 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.568 (d, J=8.0Hz, 1H), 8.115 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.856 (dd, J=8.0Hz, 1H), 7.326 (d, J=8.4Hz,lH), 3.796 (t， J=4.8Hz，4H),3.807(t， J=5.0Hz ,4H),3.791 (t， J=5.2Hz,lH)。
实施例 10： 3-苯氧基 -8-氧 -8H-苊并 [l，2-bj吡咯 -9-甲酸的合成及表征
在 50mL单口烧瓶中,加入 60mL浓硫酸或者 25mL发烟硫酸,在 0〜5°C下, 分批加入 0.05mol的 3-苯氧基 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， 1小时内加完,加完 后在室温继续反应 16小时,反应混合物为粘稠的深棕红色。然后小心缓慢的将其 滴入碎冰中,同时剧烈搅拌,滴完后静置,滤饼用大量水洗涤,直至滤饼呈中性,滤饼 干燥后得深黄色产品。 产率 96%。
M.p. 248 °C ; 1H NMR (400M, CDC13): δ 11.42 (s,lH),8.965 (dd, J=8.0Hz, 1H), 8.750 (dd, J=7.8Hz, 1H), 8.313 (d, J=8.2Hz, 1H), 7.999 (t, J=8.2Hz,lH),7.561 (t, J=8.2Hz,2H), 7.410 (t, J=7.0Hz, 1H), 7.251 (d, J=8.8Hz, 2H), 6.963 (d, J=8.4Hz,lH)。
实施例 11： 3-苯氧基 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-bj吡咯 -9-甲酸甲酯的合成及表征
在 lOOmL单口烧瓶中,依次加入 O.Olmol 3-苯氧基 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-11, 50mL乙腈做溶剂, 0.02mmol的碳酸钾做缚酸剂,过量 10倍的碘甲烷，氮气 保护下， 加热至 40°C反应 15小时。减压蒸去乙腈， 加入二氯甲烷使反应物充分 溶解， 过滤之后旋干滤液， 得黄棕色粗产品。 硅胶柱层析分离， 展开剂： 二氯 甲烷 -甲醇 （40: 1 ) ， 得深黄色产品。 产率 92%。 M.p. 213 °C ; 1H NM (400M, CDC13): δ 9.102 (d, J=7.2Hz,lH), 8.965 (dd, J=8.0Hz， IH), 8.850 (dd, J=7.8Hz, IH), 8.233 (d, J=8.2Hz, IH), 7.856(t, J=8.2Hz,lH),7.453 (t, J=8.2Hz,2H), 7.350 (t, J=7.2Hz, IH), 7.325 (d, J=8.4Hz, 2H), 3.213 (s, 3H) o
实施例 12： 3-苯氧基 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-N-叔丁基酰胺的合成及表征 在 lOOmL单口烧瓶中,依次加入 O.Olmol 3-甲氧基 -8-氧 -8H -苊并 [1,2-b]吡咯 -9-酸， 50mL DMF做溶齐 lj, 0.02mmol的三乙胺, O.Olmmol的 (EtO)2P(=0)CN,过量 10 倍的叔丁胺,常温反应 1小时。 反应完毕得到黄色固体， 产率 85%。 M.p. 237°C ; ¾ NMR (400M, CDC13): 68.746 (dd, J=8.0Hz, IH), 8.650 (dd, J=7.8Hz, IH), 8.213 (d, J=8.2Hz, IH), 7.846 (t, J=8.0Hz,lH),7.352 (t, J=8.0Hz,2H), 7.210 (t, J=7.4Hz, IH), 7.051 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.963 (d, J=8.4Hz,lH), 3.721(s, 3H)， 3.113 (m, 2H), 1.568(dd, J=5.6Hz ,2H), 1.421(m, J=5.7Hz ,2H), 0.968(t, J=6.2Hz ,3H)。
实施例 13： 3- (4-溴代苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈的合成及表征
50mL乙腈中加入 lg 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， 3.2g对溴苯硫酚， 常 温反应 2小时 ， 蒸出部分溶剂， 层析柱分离得化合物 3- (4-溴代苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， 收率 40%。
M.p. 262-263 °C ; 1H NM (400M, CDC13): δ 8.852 (dd, J=8.8Hz, IH), 8.813 (d J=8.8Hz, IH), 8.015 (d, J=6.4Hz, IH), 7.945 (t, J=8.0Hz, IH), 7.560 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.096 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.006 (d, J=8.4Hz, 1H)0
实施例 14： 3，6-二（4-溴代苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-bl吡咯 -9-腈的合成及表征
50mL乙腈中加入 lg 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， 6.5g对溴苯硫酚， 常 温反应 36 小时， 蒸出部分溶剂， 层析柱分离得化合物 3,6-二 （4-溴代苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， 收率 20%。
M.p. 262-263 °C ; 1H NM (400M, CDC13): δ 8.815 (dd, J=8.8Hz, IH), 8.671 (d J=8.8Hz, IH), 7.881 (t, J=6.4Hz, IH), 7.551(q, J=8.0Hz, 4H), 7.215 (q, J=8.4Hz, 4H): 6.472 (s, 1H)。
实施例 15： 6- (4-氨基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈的合成及表征
50mL乙腈中加入 lg S-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 2.5g对氨基苯硫酚， 常温反应 2小时 ， 蒸出部分溶剂， 层析柱分离得化合物 6- (4-氨基苯硫基） -8- 氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈，收率 30%。M.p. 255-257°C； IH NMR (400M, CDC13): δ 8.832 (dd, J=8.8Hz， IH), 8.801 (d, J=8.8Hz, IH), 7.985 (d, J=6.4Hz, IH), 7.925 (t, J=8.0Hz, 1H), 7.570 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.997 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.006 (d, J=8.4Hz, 1H), 6.271 (s, 2H) =
实施例 16： 3,6-- (4-氨基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-bj吡咯 -9-腈的合成及表征
50mL乙腈中加入 lg 8-氧 -8H-苊并 [1 ,2-b]吡咯 -9-腈， 5.0g对氨基苯硫酚， 常温反应 30 小时， 蒸出部分溶剂， 层析柱分离得化合物 3,6-二（4-氨基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， 收率 25%。 M.p. 288-290°C； 1Η NMR (400M, CDC13): δ 8.835 (dd, J=8.8Hz， 1H), 8.682 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.973 (t, J=6.4Hz, 1H), 7.581(q, J=8.0Hz, 4H), 7.234 (q, J=8.4Hz, 4H), 6.651 (s, 1H) , 6.269 (s, 4H)。 第二部分： 苊并杂环类化合物环糊精包合物、 配结物的制备及其表征实施例； 本部分内容包括苊并杂环类化合物环糊精包合物、 配结物的制备及对产物 的表征， 所采用的表征手段包括紫外光谱、 荧光光谱、 圆二色光谱、 红外光谱、 热失重分析及 SEM。 如无特殊说明， 本部分涉及的仪器及其检测方法参考来源 如下：
相溶解度图： 按照文献 J. Agric. Food Chem.， 2007, 55 (9)， 3535-3539的方法 绘制相溶解度图。
紫外光谱： HP8453 (美国）；检测方法参考文献 Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 173 (2005) 319— 327。
荧光光谱： PTI-700 (美国） ； 检测方法参考文献 J Fluoresc (2008) 18: 1 103-1 114=
圆二色光谱： J-810 (日本）； 检测方法参考文献 J. Phys. Chem. B, 2006, 1 10 (13), 7044-7048。
红外光谱： FT/IR-430 (日本）；检测方法参考文献 Mol. Pharmaceutics, 2008, 5 (2), 358-363
热失重分析： TGA/SDT851e (瑞士）；检测方法参考文献 Mol. Pharmaceutics, 2008, 5 (2), 358-363
SEM: JSM-5600LV (日本) ； 检测方法参考文献 J. Med. Chem. 2003, 46, 4634-4637
H核磁： Bruker Avance II 400M (瑞士）；检测条件为：（溶剂 CDC13， 400M)。 质谱： GC-Tof MS (英国） ； 检测方法参考文献 J. Org. Chem. 2000， 65, 9013-9021
X单晶衍射： XD-3A (日本） ； 检测方法参考文献 J. Org. Chem. 2008, 73, 8305-8316 8305。 实施例 17： 3-硫吗啉 -8-氧 -8H-苊并 [1, 2-b]吡咯 -9-腈 β-环糊精包合物的制备及 表征
首先称取将经过二次重结晶并充分干燥的 β-环糊精 1.85g ( 1.63 mMol ), 加 入 lOOmL水， 加热并搅拌使其溶解。 称取待测化合物 0.179g (0.54 mMol ), 用 35mL丙酮溶解之后， 以线状逐滴加入到 β-环糊精的水溶液中， 60°C加热搅拌 3 天后， 有沉淀析出， 过滤， 用少量蒸馏水洗涤滤饼之后， 再用少量的丙酮洗去 游离状态的化合物， 真空下 50°C干燥 24小时， 得到淡紫色固体。
紫外吸收检测结果表明， 随着 β-环糊精浓度的逐渐增大化合物的紫外吸收 值逐渐增大， 其溶解度逐渐增大， 表示包合物的形成。
由相溶解度图结果可知： 化合物的溶解度由原来的 0.21μΜ增加到 0.36μΜ， 提高了 1.5倍。
荧光光谱检测结果显示： 固定待测化合物的浓度不变， 荧光值随着 β-环糊 精浓度的逐渐增大而增大。 荧光发射波长不变， 但是强度增大， 原因化合物进 入环糊精空腔之后， 空腔环境的变化， 保护了处于激发态的化合物分子， 使之 不与大体积分子和淬灭剂接触， 这种荧光光谱的变化表明了化合物与 β-环糊精 生成了包合物。
圆二色光谱检测结果显示： 在 β-环糊精存在的情况下， 待测化合物的诱导 圆二色在 260 nm到 375 nm有一个强的正 Cotton效应的峰， 以及在 400 nm到 500 nm处有一个弱的 Cotton效应的正峰， 这说明化合物进入环糊精的手性空腔 之后， 产生了诱导圆二色效应， 表明了包合物的形成。
红外光谱检测结果显示： β-环糊精在 3410.18 和 1029.22 cm 有强的吸收带， 同时在 579〜911cm— 1处有一系列的指紋区特征峰。 化合物在 2218.55 cm—1和 1625.08 cm 有两个尖锐的特征吸收峰。红外谱图中 2219.13 cm 和 1625.48 em 征吸收峰强度变小， 及轻微的位移， 同时在 1706 cm 出现的一个新的尖峰， 表 明了包合物的形成。
热失重分析检测结果显示： β-环糊精在 298°C出现拐点， 开始降解。 而包合 物在 269°C即出现拐点， 开始降解， 不同于 β-环糊精， 表明了包合物的形成。
SEM结果显示： 3-硫吗啉基 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈化合物为针状外 形， β-环糊精为较大的方砖状， 化合物与 β-环糊精物理混合 SEM图是针状与方砖 状的混合外形， 而化合物 -β-环糊精包合物的表面形貌明显不同于以上三者， 其 外形为规整的菱形。 从外形结构的明显不同可以看出包合物的形成。 其他包合物的制备及表征: 采用与实施例 17相同的方法， 利用不同类型环糊精包合同系列的其他化合 物； 同样采用紫外、 荧光光谱、 圆二色光谱、 红外光谱、 热失重分析及 SEM对 产物进行了表征， 证明了包合物的形成， 并通过相溶解度实验检测对比包合前 后化合物与其包合物溶解度的变化。 具体结果如表 1所示。
从表 1 的检测结果可以看出， 不同类型的环糊精包合的苊并杂环类化合物 在水中的溶解度较化合物本身均大大提高。
表 1
化合物 包合物 被包合苊并杂环类化合物名称 环糊精 溶解度 溶解度 (μΜ) (μΜ)
3-硫吗啉 -8-氧 -8/-苊并 [1, 2-b]吡咯 -9-腈 β-环糊精 0.21 0.36
3-(4-氨基苯硫基）-8-氧-8 /-苊并[1,2 ]吡咯-9-腈 β-环糊精 0.25 0.60
4- (噻吩基 -2-甲氧基）-8-氧 苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈 β-环糊精 0.28 0.52
4- (噻吩基 -2-甲氨基）-8-氧 -8 /-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 β-环糊精 0.39 0.81
3-(4-溴代苯硫基）-8-氧-8 /-苊并[1,2-1:]吡咯-9-腈 β-环糊精 0.18 0.62
8-氧 -8//-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 β-环糊精 0.12 0.41
3,6-二（4-溴代苯硫基） -8-氧 -8 -苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 β-环糊精 0.16 0.63
3-硫吗啉 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 γ-环糊精 0.21 0.78
3-(4-氨基苯硫基）-8-氧-8//-苊并[1,2-13]吡咯-9-腈 γ-环糊精 0.25 0.70
4- (噻吩基 -2-甲氧基）-8-氧 -8 /-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 γ-环糊精 0.28 0.62
4- (噻吩基 -2-甲氨基）-8-氧 -8 -苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 γ-环糊精 0.39 0.92
3- (4-溴代苯硫基） -8-氧 -8 /-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 γ-环糊精 0.18 0.80
6-(4-氨基苯硫基）-8-氧-8//-苊并[1,2七]吡咯-9-腈 γ-环糊精 0.28 0.70
3,6-二（4-氨基苯硫基） -8-氧 -8 -苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 γ-环糊精 0.31 0.95
3- (对甲基苯氧基） -8-氧 苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 2-羟丙基 -Ρ-环糊精 0.25 0.96
3- (4-氨基苯硫基） -8-氧 -8 /-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 2-羟丙基 -β-环糊精 0.25 0.90
3-苯氧基 -8-氧 -8ίί-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酸甲酯 2-羟丙基 -β-环糊精 0.15 0.62
3-(4-甲氧基苯氧基）-8-氧 苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 2-羟丙基 -β-环糊精 0.32 0.92
4- (4-异丙基苯氧基）-8-氧 -8 /-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 2-羟丙基 -β-环糊精 0.12 0.60
3-(4-溴代苯硫基）-8-氧-8 -苊并[1,2-13]吡咯-9-腈 2-羟丙基 -β-环糊精 0.18 0.91
6- (噻吩基 -2-甲氧基）-8-氧 -8 -苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 甲基 -β-环糊精 0.35 0.52
6- (四氢 -2H-吡喃基 -4-氧基） -8-氧 -8 -苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 甲基 -(3-环糊精 0.25 0.58
6- (噻吩基 -2-基-甲氨基） -8-氧 -8 /-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 甲基 -β-环糊精 0.37 0.78
3-(4-溴代苯硫基）-8-氧-8//-苊并[1,2-1:]吡咯-9-腈 甲基 -β—环糊精 0.18 0.35
3- (4-氨基苯硫基） -8-氧 -8 /-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 甲基 -β-环糊精 0.25 0.61
6-(4-氨基苯硫基）-8-氧-8//-苊并[1,2-13]吡咯-9-腈 甲基 -β-环糊精 0.28 0.85
3- (4-溴代苯硫基） -8-氧 -8//-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 羟丙基 -γ-环糊精 0.18 0.72
3-苯硫基 -8-氧 -8 /-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 羟丙基 -γ-环糊精 0.22 0.58 3- (4-溴代苯氧基）-8-氧-8 -苊并[1 ,2-13]吡咯-9-腈 羟丙基 -γ-环糊精 0.39 0.98
3- (4-溴代苯硫基） -8-氧 -8/ -苊并 [1 ,2-b]吡咯 -9-腈 羟丙基 -γ-环糊精 0.18 0.48
3- (4-氨基苯硫基）-8-氧-8/ -苊并[1 ,2 ]吡咯-9-腈 羟丙基 -γ-环糊精 0.25 0.81
6- (4-氨基苯硫基） -8-氧 -8 /-苊并 [1 ,2-b]吡咯 -9-腈 羟丙基 -γ-环糊精 0.28 0.96 实施例 18： γ-环糊精与 3 吗啉 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酸配结物的制备 及表征：
将 3-硫吗啉 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酸 (0.263g， 0.75 mmol) 禾 Ρ Ν,Ν'- 羰基二咪唑 （0.179 g)溶解到 3 mL 的 DMSO中， 然后常温搅拌 30分钟之后， 加入 γ-环糊精 (0.6485 g， 0.5 mmol)及 4 mL的三乙醇胺。 常温反应 18小时。 反 应完毕之后， 加入约 200 mL的丙酮于反应液， 减压使析出沉淀。 所得沉淀用离 子交换柱提纯， 所得产品再用甲醇与水的混合溶剂洗涤， 溶液冻干得到 0.42g的 3—硫吗啉—8-氧 -8H-苊并 [1 ,2-b]吡咯 -9-甲酸 /γ-环糊精配结物。 产率 25%。
Η核磁及质谱检测结果显示： 1Η NMR (400Μ, D20-d6) δ (ppm) 8.87 (d, J = 8.5 Hz, 1H) ， 8.58-8.55 (m, 2H), 7.91 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.03(m， 8H)， 3.83(m， 8H),3.80(m， 8H )， 3.74(m， 8H ) , 3.72-3.70 (m, 3-N(CH2*)2(CH2)2S， 4H)， 3.59(m， 8H )， 3.52 (m， 8H)， 2.98-2.96 (m, 3-N(CH2)2(CH2)2*S , 4H); (ESI) m/z (M+H)- (1629 m/z)。
X单晶衍射表征结果显示： γ-环糊精在 12°和 15〜23°之间有一系列的尖峰出 现， 化合物 3-硫吗啉 -8-氧 -8H-苊并 [ 1 ,2-b]吡咯 -9-甲酸只在 11°和 7°处有尖峰。 而 配结物在 11°处的尖峰消失， 在 6°有一个新的尖锋， 在 14〜18°以及 20〜25°出现 一系列的尖峰。 相对于化合物与环糊精而言， 配结物中有新的尖峰出现， 表明 了配结物的形成。
化合物 3-硫吗啉 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酸与 γ-环糊精配结之后， 在 水中的溶解度明显增大。 相溶解度曲线拟合曲线方程为 Υ = 0.68 + 0.14 χ Χ。 3- 硫吗啉 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酸在水中的溶解度由原来的 0.68μΜ 增加 到 11.2μΜ， 提高了 16.5 倍。 其他配结物的制备及表征：
采用与实施例 18相同的方法， 利用不同类型环糊精配结同系列的其他化合 物； 同样采用 Η核磁、 质谱和 X单晶衍射对产物进行了表征， 证明了配结物的 形成， 并通过相溶解度实验检测对比配结前后化合物与其配结物溶解度的变化。 具体结果如表 2所示。
从表 2 的检测结果可以看出， 不同类型的环糊精配结的苊并杂环类化合物 在水中的溶解度较化合物本身均大大提高。
表 2
Figure imgf000018_0001
第三部分： 苊并杂环类化合物、 其环糊精包合物、 配结物的理化活性检测 实施例 19： 通过荧光偏振分析法检测化合物的 ΒΗ3类似程度
合成一个带有 21 个氨基酸的 Bid BH3 肽段 （氨基酸： 79-99 : QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR) ， 并在 N端标记上 6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 ( FAM ) 作为荧光标签 （FAM-Bid ) 。 竞争结合实验中所用的反应体系为 GST-Bcl-2蛋白 （40nM) 或 Mcl-l 蛋白， 和 FAM-Bid多肽 （5nM) 溶于反应缓 冲液中 （ lOOmM K3PO4, pH 7.5; ΙΟΟμ g/mL 牛 γ白蛋白； 0.02%叠氮化钠） 。 在 96孔板中， 每孔加入 ΙΟΟμΙ^反应体系， 然后加入 1μ∑不同浓度的溶于 DMSO的 待检测化合物 3-硫吗啉 -8-氧 -8H-苊并 [1 ,2-b]吡咯 -9-腈母液至实验设计所需终浓 度。 同时设立两个对照组， 一个对照组为反应体系中只含有 Bcl-2 或 Mcl-l 和 FAM-Bid (相当于 0%抑制率)， 另一对照组中的反应体系只含有 FAM-Bid肽段。 %孔板经过 4个小时的避光孵育后， 进行酶标仪上检测。 荧光极化值 （mP)在 由 530nm波长激发产生的 485nm发射波长下测量。 Ki值根计算公式推导得出。 试验结果如附图 1所示。 该化合物与 Bcl-2蛋白的竞争结合常数为 310nM。
按照上述相同的试验方法检测其他 9 个化合物的 BH3 类似程度， 它们与 Bcl-2和 Mcl-l蛋白的结合常数 （表 3中简称结合常数） 在也是 nM级， 具体结 果如表 3所示。
表 3
结合常数
化合物名称
(nM)
8-氧 苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 0.3
3- (4-溴代苯硫基） —8-氧 -8/ -苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 17.0
6- (4-氨基苯硫基） -8-氧 苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 20.0
3,6-二 （4-溴代苯硫基） -8-氧 苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 5.0 3,6-二 （4-氨基苯硫基） -8-氧 -8/ -苊并 [1 ,2-b]吡咯 -9-腈 7.0
3- (四氢 -2/ -吡喃基 -4-氧基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 600.0
4-苯氧基 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 890.0
6- (噻吩基- 2-甲氧基 )-8-氧- 8//-苊并 [1 ,2- b]吡咯- 9-腈 560.0
3-苯氧基 -8-氧 苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酸甲酯 790.0
实施例 20: 活细胞内荧光偏振能量转移（FRET)检测化合物的 BH3类似性 利用磷酸钙共沉淀的方法将 2 gBcl-2-CFP和 Bax-YFP质粒分别或同时转染 至 Hda细胞中， 转染 24小时后， 将细胞接种于 6孔培养板（2x l05个 /孔）， 加入 溶于 DMSO的待检测化合物 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈至终浓度（2， 5， 10和 15μΜ)，药物作用 24小时后（如附图 2)， PBS清洗细胞 3次，用 GENIOS 荧光酶标仪 （TECAN, Swiss) 检测荧光值。 在时间依赖的实验中， 转染后的细 胞接种于 6孔板后， 加入 40μΜ化合物， 药物作用 3、 6和 24小时 （附图 3 )， 读板检测荧光。 在只转染 Bcl-2-CFP质粒的细胞组中记录 475nm发射波长值， 激 发波长为 433nm。在只转染 Bax-YFP质粒的细胞组中记录 527nm发射波长值，激 发波长为 505nm。 对共转染 Bcl-2-CFP和 Bax-YFP质粒的细胞实验组记录 527nm 和 475nm发射波长值，激发波长为 433nm。 527nm发射荧光与 475nm发射荧光相 比值即为 FRET, 将单独转染对照组的 FRET值设为 1.0, 表示两蛋白未发生荧光 偏振能量转移。 在共转染的细胞中， 由于 Bcl-2 蛋白和 Bax蛋白的相互作用使得 FRET值增加至 2.0， 而随着加药浓度和时间的增加， 对两蛋白相互作用的干扰 增强， FRET随之减弱。 细胞活力由 MTT法进行测定。 试验结果如附图 2和附图 3所示， 该化合物在 2μΜ， 作用 3小时即可干扰 Bcl-2/Bax之间的相互作用， 呈 浓度时间依赖趋势。
按照上述相同的试验方法检测其他 7个化合物， 试验证明这些化合物在不 同作用浓度和作用时间的条件下， 均具有细胞内模拟 BH3-only蛋白的作用， 能 明显干扰 Bcl-2/Bax之间的相互作用。 具体结果如表 4所示。
其中浓度和时间表示测试化合物在该浓度下干扰 Bcl-2/Bax之间的相互作用 发生的时间。
表 4
浓度 吋间
化合物名称
( μΜ) (小吋）
8-氧 -8 /-苊并 [1 ,2-b]吡咯 -9-腈 0.1 2
3- (4-溴代苯硫基） -8-氧 -8//-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 0.5 2
6- (4-氨基苯硫基） -8-氧 -8//-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 0.2 2
3,6-二 （4-溴代苯硫基） -8-氧 -8 -苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 1.0 2 3,6-二 （4-氨基苯硫基） - 8-氧 苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 1.0 2
3- (3-氟代苯甲酰基） -8-氧 -8//-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 10.0 6
4-苯氧基 -8-氧 苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈 10.0 6
6- (噻吩基 -2-甲氧基 )-8-氧 -8//-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈 10.0 6
3-苯氧基 -8-氧 -8ff-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-甲酸甲酯 10.0 6
实施例 21： 通过 Bax蛋白与线粒体共定位检测化合物的 BH3类似度
利用磷酸^共沉淀方法将 5μ8 Bax-YFP质粒转染至 MCF-7细胞中， 转染 24 小时后， 将细胞接种于 6孔培养板 （0.2X 10 孔） ， 加入 ΙΟμΜ待检测化合物 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈，作用 6小时后， PBS清洗并同 50nM Mito Tracker Red CMXRos (线粒体特异探针； 红色 ）避光孵育 10min， PBS清洗三次 后， Radiance2000激光共聚焦显微镜（Bio-Rad， USA)扫描荧光图像。 同时进 行双通道扫描， 一个通道扫描 Bax-YFP的绿色荧光， 另一通道扫描指示线粒体的 CMXRos探针红色荧光， 两通道图像相互叠加显示共定位情况。 当 Bax蛋白定位 于线粒体上， 绿色荧光与红色荧光叠加成橘色， 如附图 4所示； 对照附图 5显 示不能驱动 BAX向线粒体移位， 共定位失败的试验结果。
按照上述相同的试验方法检测其他 8个化合物， 结果显示他们在不同作用 浓度和作用时间的条件下，均具有驱动 BAX 向线粒体移位的作用，说明具有细 胞内模拟 BH3-only蛋白的作用。 具体结果如表 5所示， 其中浓度和时间表示测 试化合物在该浓度下模拟 BH3-only蛋白驱动 BAX 向线粒体移位的作用发生的 时间。
表 5
Figure imgf000020_0001
实施例 22： 化合物依赖 ΒΑΧ/ΒΑΚ的细胞毒性实验验证其 ΒΗ3类似物的特性 磷酸钙共沉淀转染 3 g BAX/BAK干扰质粒至 MCF-7细胞中， 转染 24小时 后， 收集细胞， Western检测 RNA干扰后 BAX 和 BAK蛋白表达情况， 相同处理 无质粒转染的细胞组设为对照组。转染后的细胞接种于 96孔板中（Ι χΙΟ5个 /孔）， 平行进行未转染质粒细胞组的对照实验， 按实验设计浓度梯度加入待检测化合 物 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈，作用 48小时后， MTT检测细胞活力， 结果如附图 6所示， Gossypol作为非特异性 BH3类似物与本发明的化合物对比平 行处理， 可见 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈具有绝对依赖 BAX/BAK的 细胞毒性。
按照上述相同的试验方法检测其他 8个化合物 （如下所述化合物①〜⑧） ， 结果显示所检测化合物也均具有绝对依赖 BAX/BAK 的作用特点。 这些化合物 包括：
① 8—氧 -8 -苊并 [w—b]吡咯 -9—腈；
② 3- (4-溴代苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
③ 6- (4-氨基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
④ 3,6-二 （4-溴代苯硫基） —8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
⑤ 3,6—二 （4-氨基苯硫基） —8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
⑥ 4- (3-氟代苯甲酰基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
⑦ 6- (噻吩基 -2-甲氧基 )-8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
⑧ 3-苯氧基 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酸。
实施例 23: Western印记检测化合物对 Mcl-1和 Bcl-2的抑制作用
收集细胞样品后， 以 1χ 106/50μί细胞裂解液 （62.5mM Tris-HCl pH 6.8； 2%SDS; 10%甘； 50mM DTT; 0.01%溴酚蓝） 低温裂解， 离心， 取蛋白上清， 100°C煮沸样品 5分钟， 12% SDS-PAGE电泳并转膜， 相应抗体检测目的蛋白， 辣根过氧化酶标记二抗并结合 ECL显色法检测目的蛋白在细胞中的表达量。附图 7 和附图 8 分别显示待检测化合物 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈对 Mcl-1和 Bcl-2的抑制作用。 从图中可以看出， 随着待测化合物作用于肿瘤细胞 时间的延长， Bcl-2和 Mcl-1 的蛋白条带逐渐变浅， 说明化合物具有抑制这两个 蛋白的作用。 利用 KODAK Gel Logic 1500成像系统软件对 Western图片中蛋白 条带浓度进行半定量分析，归一化处理后，蛋白条带的浓度如附图 9和 10所示。
经同样方法对检测下述 8个化合物，它们均具有抑制 Bcl-2和 Mcl-1蛋白的 作用， 这些化合物包括：
① 8-氧 -8 -苊并 [w-b]吡咯 -9-腈；
② 3- (4-溴代苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
③ 6- (4-氨基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈； ④ 3,6-二 （4-溴代苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
⑤ 3,6-二 （4-氨基苯硫基） —8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
⑥ 3-苯氧基 -8-氧 -8H-苊并 [1 ,2-b]吡咯 -9-N-叔丁基酰胺；
⑦ 6- (噻吩基 -2-甲氧基 )-8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
⑧ 4- (四氢 -2H-吡喃基 -4-氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
这些化合物下调 Mcl-1蛋白和 Bcl-2蛋白的半定量分析结果分别如表 6和表 7所示：
表 6: 化合物①一⑧下调 Mcl-1蛋白的半定量分析就结果
Figure imgf000022_0001
表 7 化合物①一⑧下调 Bcl-2蛋白的半定量分析结果
Figure imgf000022_0002
实施例 24： Western印记检测比较苊并杂环类化合物及其环糊精包合物和配结 物对 Mcl-1和 Bcl-2的抑制作用
将细胞接种于 6孔培养板 （2χ 105个 /孔）， 化合物组加入溶于 DMSO的化合 物 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1 ,2-b]吡咯 -9-腈至终浓度 ΙΟμΜ,包和物组加入溶于水 溶液的相当于 ΙΟμΜ化合物的 γ-环糊精包和物， 药物作用 24小时后， PBS清洗细 胞 3次， 收集细胞样品后， 以 1 χ 106/50μί细胞裂解液（62.5mM Tris-HCl pH 6.8; 2%SDS ; 10%甘； 50mM DTT; 0.01°/。溴酚蓝） 低温裂解， 离心， 取蛋白上清， 10CTC煮沸样品 5分钟， 12% SDS-PAGE电泳并转膜， 相应抗体检测目的蛋白， 辣根过氧化酶标记二抗并结合 ECL显色法检测目的蛋白在细胞中的表达量。检测 结果如咐图 11所示。 可以看出： 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1 ,2-b]吡咯 -9-腈的 γ-环 糊精包和物对 Mcl- 1 和 Bcl-2 蛋白的抑制作用明显高于该化合物本身。 即 γ-环糊 精包和物明显提高了抑制 Bcl-2和 Mcl-1蛋白的能力。
利用 KODAK Gel Logic 1500成像系统软件对 Western图片中蛋白条带浓度 进行半定量分析， 归一化处理后， 蛋白条带的浓度如附图 12， 13所示。
本实施例还采用上述同样方法检测了 β-环糊精、2-羟丙基 -β-环糊精、甲基 -β- 环糊精和羟丙基 -γ-环糊精包和的 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， 以及 下述化合物，均比化合物本身具有更高的细胞内抑制 Bcl-2和 Mcl-1蛋白的能力。 这些化合物包括：
① 8—氧 -8 -苊并 [u—b]吡咯 -9-腈；
② 3- (4-溴代苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
③ 6- (4-氨基苯硫基） —8 -氧 -8H -苊并 [1,2-b]吡咯 -9 -腈；
④ 3,6-二 （4-溴代苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
⑤ 3,6-二 （4-氨基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
⑥ 4- (四氢 -2H-吡喃基 -4-氧基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈；
这些化合物及其包合物下调 Mcl-1蛋白和 Bcl-2蛋白的半定量分析结果分别 如表 8和表 9所示：
表 8: 化合物①一⑥和它们的包和物下调 Mcl-1蛋白的半定量分析结果
Figure imgf000023_0001
表 9: 化合物①一⑥和它们的包和物下调 Bcl-2蛋白的半定量分析结果
Figure imgf000023_0002
本实施例还采用上述同样方法检测了 γ-环糊精、2-羟丙基 -β-环糊精、甲基 -β- 环糊精或羟丙基 -γ-环糊精配结的其他同类化合物， 如： 3- (对甲基苯氧基） -8- 氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-甲酰胺、 3- (4-溴代苯硫基） —8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酸、 3-硫吗啉基 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酰胺。 试验表明： 这些化合 物的环糊精配结物均比化合物本身具有更高的细胞内抑制 Bcl-2 和 Mcl-1 蛋白 的能力。
实施例 25:Western印记检测对比化合物和包和物在肿瘤模型动物体内对 Mcl-1 和 Bcl-2的抑制作用
选择饲养的中国昆明小鼠， 随机分组， 每组 10只。 培养的肝癌细胞 Η22, 按 200μΙ7只接种于小鼠腋下皮下。 于荷瘤 5天后， 皮下瘤块形成。 开始腹腔注射待 测化合物 3-硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈， γ-环糊精包合的待测化合物， 和口服 γ-环糊精包和包合的待测化合物。 测试条件包括：
空白对照组： 皮下荷瘤后小鼠不经任何处理；
对照组①： 皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射 DMSO溶液， 共计 10天； 对照组②： 皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射环糊精溶液， 共计 10天； 实验组①： 皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射 0.03 mg/kg体重化合物的
DMSO溶液， 共计 10天；
实验组②： 皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射 0.3 mg/kg体重化合物的 DMSO 溶液， 共计 10天；
实验组③： 皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射相当于 0.3 mg/kg体重化合物的 包和物水溶液， 共计 10天；
实验组④： 皮下荷瘤后给小鼠隔日灌胃相当于 0.3 mg/kg体重化合物的包和 物水溶液， 共计 10天。
实验期间每周两次测定肿瘤长径 （a) 及与之相垂直的短径 （b) ， 按公式 l/2ab2计算肿瘤体积。 观察动物存活时间。 实验第 40 天， 按肿瘤体积计算抑瘤 率。 结果显示：
实验组② （化合物 DMSO溶液注射组） 抑瘤率 22.3%;
实验组③ （包和包合物注射组） 抑瘤率 61.5%;
实验组④ （包和包合物口服组） 抑瘤率 43.7%。
对照组动物平均生存时间为 28±2.1天， 化合物组的平均寿命 33±3.1天， 包和 包合物注射组平均生存时间为 48±5.1天， 包合物口服组平均生存时间为 42±1.1 天。 统计学处理结果显示 P<0.05。
小鼠死亡或处死后， 剥取小鼠皮下肿瘤， 按 1:3体积用生理盐水将组织匀浆 制备细胞悬液， 采用与实施例 24相同的 western检测方法， 检测肿瘤细胞 Bcl-2、 Mcl-1蛋白的表达情况。 结果如附图 14所示， 其中， 电泳道 6的蛋白条带比电泳 道 5的条带浅， 表明包合物的体内抑制 Bcl-2、 Mcl-1的能力高于化合物本身。 β-环糊精、 2-羟丙基 -β-环糊精、 甲基 -β-环糊精和羟丙基 -γ-环糊精包和的 3- 硫吗啉 8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-腈、以及下述化合物，均有同样的体内抗肿瘤 的作用。 包括：
① 在相同于实验组②的条件下， S-氧 -8H-危并 [1,2-b]吡咯 -9-腈的抑瘤率约 60%； 在相同于实验组③的条件下， 羟丙基 γ-环糊精包合的化合物 29-1的抑瘤 率约 80%; ② 在相同于实验组②的条件下， 3- (4-溴代苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b] 吡咯 -9-腈的抑瘤率约 40%左右； 在相同于实验组③的条件下， 2-羟丙基 - β -环糊 精包合的化合物 29-2的抑瘤率约 60%;
③ 在相同于实验组②的条件下， 6- (4-氨基苯硫基） -8-氧 -8Η-苊并 [1,2-b] 吡咯 -9-腈的抑瘤率约 30%; 在相同于实验组③的条件下， γ-环糊精包合的化合 物 29-3抑瘤率约 40%;
④在相同于实验组②的条件下， 3,6-二（4-溴代苯硫基） -8-氧 -8Η-苊并 [1,2-b] 吡咯 -9-腈抑瘤率达到 78%;在相同于实验组③的条件下， 甲基 - β -环糊精包合的 化合物 29-4的抑瘤率约 85%;
⑤在相同于实验组②的条件下， 3,6-二（4-氨基苯硫基） -8-氧 -8Η-苊并 [1,2-b] 吡咯 -9-腈的抑瘤率为 50%; 在相同于实验组③的条件下， γ-环糊精包合的化合 物 29-5的抑瘤率约为 60%;
⑥在相同于实验组②的条件下， 4- (四氢 -2Η-吡喃基 -4-氧基） -8-氧 -8Η-苊 并 [1,2-b]吡咯 -9-腈的抑瘤率在 40%左右；在相同于实验组③的条件下， β-环糊精 包合的化合物 29-6的抑瘤率约 55%。
其它化合物的抑瘤率在 30〜50%之间。 它们的环糊精包合物组的抑瘤率普 遍高于化合物本身 （ΡΟ.05 ) 。
γ-环糊精、 2-羟丙基 -β-环糊精、 甲基 -β-环糊精、 和羟丙基 -γ-环糊精配结的 下述化合物， 相对于这些化合物本身也具有更强的体内抑制 Bcl-2、 Mcl-1的能 力， 和更高的抑瘤率。 其中：
3- (对甲基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酰胺的抑瘤率为 30%, 甲 基 -β-环糊精配结后抑瘤率达到 38%左右；
3- (4-溴代苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酸抑瘤率为 45% , 羟丙基 -γ-环糊精配结后的产物抑瘤率为 55%;
3-硫吗啉基 -8-氧 -8H-苊并 [1,2-b]吡咯 -9-甲酰胺的抑瘤率为 45%, 2-羟丙基 -β- 环糊精配结后达到 60%。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一类苊并杂环类化合物， 其分子结构通式为:
Figure imgf000026_0001
其中：
(DR^XR5,噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫吗啉基， R2=H, R3=H， R4=CN、
COOH、 COOR6或 CONHR7 ；
(ID ^H, R2=XR5、 噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫吗啉基， R3=H, R4=CN、
COOH、 COOR6或 CONHR7;
(III) R^H, R2=H， R3=H、 XR5、 四氢吡喃 -4-氧基、 四氢噻喃 -4-氧基、 噻 吩甲氧基、 噻吩甲氨基或硫吗啉基， R4=CN;
(IV) R =XR5, R2=H， R3=XR5， R4=CN;
其中： x = o、 S、 羰基、 酯基或酰胺；
R5=a、 (CH2)nAr - ( ,m,p) Y， Y = CH3、 N02、 Ph、 F、 Cl、 Br、 CF3、 OC¾、 SC¾或 NH2; n =0〜4;
b、 四氢吡喃基或四氢噻喃基；
R6 = CH3或 C2H5;
R7 = C¾、 C2H5或 Ar。
2、 权利要求 1的苊并杂环类化合物的环糊精包合物， 其特征在于由下述方 法制备：
①称取一定质量的环糊精， 加入水中， 加热搅拌使其成为饱和溶液， 所述 的环糊精为 β-环糊精、 γ-环糊精、 2-羟丙基 -β-环糊精、甲基 -β-环糊精或羟丙基 -γ- 环糊精；
②称取待包合的苊并杂环类化合物， 该化合物与环糊精的摩尔比为 1:3〜
10；
③将待包合的苊并杂环类化合物以 5〜10mg/mL的浓度溶于丙酮，将所得 溶液以线状逐滴加入到环糊精的水溶液中， 40〜65°C， 加热搅拌 1〜6天， 有沉 淀析出；
④将上述溶液过滤， 用少量蒸馏水洗涤滤饼， 再用少量的丙酮洗去游离状 态的化合物， 50〜70°C真空干燥， 24〜48小时后得到权利要求 1的苊并杂环类 化合物的环糊精包合物。
3、 权利要求 1的苊并杂环类化合物的环糊精配结物， 其特征在于由下述方 法制备：
①称取干燥的环糊精及待配结的苊并杂环类化合物， 环糊精与该化合物的 摩尔比为 1 : 1.5〜3； 所述的环糊精为 β-环糊精、 γ-环糊精、 2-羟丙基 -β-环糊精、 甲基 -β-环糊精或羟丙基 -γ-环糊精；
②将待配结的苊并杂环类化合物与 Ν,Ν'-羰基二咪唑以 1 : 1〜2的摩尔比混 合后溶解到 DMSO中，使待配结的苊并杂环类化合物在 DMSO溶液中的浓度为 0.2〜0.5mmol /mL, 常温搅拌 30〜60分钟；
③往上述 DMSO溶液中加入步骤①所称取的环糊精及 0.1〜0.3 mmol/mL 的三乙醇胺， 常温反应 18〜24小时；
④往步骤③的反应体系中加入 0.50〜1.0mg/mL的丙酮， 减压析出沉淀；
⑤过滤， 沉淀经纯化得权利要求 1的苊并杂环类化合物的环糊精配结物。
4、权利要求 1的苊并杂环类化合物在制备 BH3类似物 Bcl-2家族蛋白抑制 剂中的应用。
5、权利要求 2的苊并杂环类化合物的环糊精包合物在制备 BH3类似物 Bcl-2 家族蛋白抑制剂中的应用。
6、权利要求 3的苊并杂环类化合物的环糊精配结物在制备 BH3类似物 Bcl-2 家族蛋白抑制剂中的应用。
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