CN1304370C - 苊并杂环类化合物及其诱导细胞凋亡和抗肿瘤的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的氨基或卤素取代衍生物及其生物学用途，主要包括在体内、体外的诱导细胞凋亡作用和作为抗癌化合物的应用。该类化合物是3，6-二取代，3-取代或6-取代的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的衍生物。他们能够在低至0.01μM直到10μM的宽浓度范围内以剂量依赖的方式诱导培养的肿瘤细胞发生凋亡，并阻滞细胞周期。活性最高的化合物B1的IC50＝0.17μM(0.56μg)。应用于肿瘤模型动物体内能够通过诱导凋亡的方式明显抑制肿瘤生长。是一类活性很高的凋亡诱导剂和抗肿瘤化合物。
Description
技术领域
本发明涉及一类8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的氨基或卤素取代衍生物及其在体内、体外的诱导细胞凋亡作用和作为抗癌化合物的应用。
背景技术
随着对细胞死亡过程和机理不断深入的研究，细胞凋亡成为抗肿瘤药物研究的新的靶点。因为肿瘤细胞的特性是通过逃避有机体信号调控来抵制凋亡，达到“永生”。所以，有效的凋亡诱导剂将从根本上抑制肿瘤细胞的生存，和癌前病变的继续异型化。不论作为肿瘤学基础研究的工具还是临床治疗肿瘤的药物，凋亡诱导剂都具有极大的价值。目前，包括Calbiochem(German)，Merck(German)，Promage(USA)等多家生物公司都开发了并且继续开发凋亡诱导产品。有一些凋亡诱导剂已经成为临床用化疗药物，例如喜树碱(Y Pommier.Diversity ofDNA topoisomerases I and inhibitors.Biochimie，1998，80；255-270.)。这些产品全部属于维生素A，非甾体类抗炎药、多酚、香草素、和拓扑异构酶抑制剂，可见他们仍然以天然药物或其类似物的化学合成产物为主，都存在着来源不足、价格昂贵、选择性低、副反应大、效果不理想等问题。为了发现新的化疗药物，The National Cancer Institute已经随机筛选了300000个不同种类化合物的抗肿瘤活性(John N.Weinstein，Timothy G.Myers，Patrick M.O’Connor，et al.Aninformation-intensive approach to the molecular pharmacology of cancer.Science，1997，275；3430-349.)。近年来，钱旭红等也合成、检测、报道了多种抗癌化合物。这一研究领域的目标是发现新结构、更低的半数致死浓度、以诱导凋亡为作用途经、体内体外均具有抗肿瘤活性的化合物。
发明内容
本发明是在已经成功制备新的荧光发色团8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈及其衍生物(ZL021484007，钱旭红，肖义)的基础上，在母体8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈上引入新的活性基团，创制了本发明所涉及的新型细胞凋亡诱导剂和抗肿瘤化合物。
本发明是在8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的3或6位引入各种伯胺和仲胺以及卤素，生成3，6-二取代，3-取代或6-取代的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈，这是一类具有诱导细胞凋亡作用和抗肿瘤活性的化合物，其分子结构通式：
(1)R1＝NHR4，R2＝H，
a、R4＝X SR5，X＝C2-C6直链或支链烷基，R5＝CH3，C2H5；
b、R4＝YCOO(CH2)mCH3，Y＝C2-C6直链或支链烷基，m＝0-3；
c、R4＝(CH2)nAr，n＝1-3，Ar＝2’-CF3Ph-，3’-CF3Ph-，4’-CF3Ph-，2’-FPh-，3’-FPh-，4’-FPh-；
d、R4＝(CH2)xCF3，x＝2，3；
e、R4＝XS(O)R6，X＝C2-C6直链或支链烷基，R6＝CH3，C2H5；
f、R4＝XS(O2)R6，X＝C2-C6直链或支链烷基，65＝CH3，C2H5
(2)R2＝吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，N’-甲基哌嗪基，吗啉基，硫吗啉基；
(3)R1＝F，Cl，Br，R2＝H；
(4)R1＝H，R2＝F，Cl，Br；
(5)R1＝R2＝F，Cl，Br。
本发明是以具有很好的刚性共平面性并且强缺电子的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(ZL021484007)为原料，与亲核试剂伯胺或仲胺发生芳香氢亲核取代反应，得到3，6-二取代，3-取代或6-取代的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯9-腈(分子结构通式A)：
8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈在溶剂(四氢呋喃，乙腈，吡啶，二甲基甲酰胺或二甲基亚砜)中，与等摩尔量的伯胺，仲胺类亲核试剂反应，温度为20-100℃，反应时间0.5～24小时。冷却后减压蒸除部分溶剂后，过滤或直接柱层析即可制得产品3或6-单取代氨基-8-氧代-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈。
而3，6-双取代氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的合成方法则为：8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈在溶剂(四氢呋喃，乙腈，吡啶，二甲基甲酰胺或二甲基亚砜)中与过量的(4～5倍摩尔量)的仲胺长时间经6～48小时反应，温度为20-100℃，同上述同样处理后得到二取代产品。
3或6-卤素取代的8-氧-8氢-苊并[1，2-b ]吡咯-9-腈(分子通式A中的5，6，7)的合成方法为碱催化环合反应：原料2-(2-氧代-2氢-卤代苊)-丙二腈，在溶剂(四氢呋喃，丙酮，吡啶，二甲基甲酰胺，乙腈，乙醇，甲醇或二甲基亚砜)中，碱性催化剂(碳酸钾，三乙胺或吡啶)存在下，温度为40-120℃，搅拌10-100分钟。冷却后减压蒸除部分溶剂后，过滤即可制得产品。
A系列化合物，和专利ZL021484007中已经作为荧光发色团公开结构的B系列化合物：
(1)R1＝硫吗啉基，吡咯烷基，R2＝H；
(2)R1＝NHR4，R2＝H，R4＝C1-C12支链烷基；
(3)R1＝R2＝吡咯烷基，硫吗啉基；
(4)R1＝NH(CH2)yNR5，y＝2，3，R5＝CH3，C2H5，R2＝H；
(5)B1(当R1＝硫吗啉基，R2＝H时)
作为体内、体外细胞凋亡诱导剂和抗肿瘤化合物的应用。方法是：首先通过MTT法测定IC50。选择HELA细胞为靶细胞，用RPMI1640培养液将细胞稀释成密度约为5×105个/ml的细胞悬液，加入96孔细胞培养板中，每孔加入200μl肿瘤细胞悬液。分别加入化合物A、B的100％DMSO溶液，终浓度100，50，10，5，0.5，0.1，0.05，0.01μM，同时设细胞对照组和阳性药物环磷酰胺对照组。CO2温箱中孵育24hrs后每孔加入MTT溶液20μl，用酶标仪测定570nm下光密度(OD)值，根据光密度值，计算各孔肿瘤细胞的存活率。
结果表明细胞毒性最强的化合物B1的IC50＝0.17μM(0.56μg)。其它化合物IC50值在0.4-6.8μM之间。
体内抗肿瘤活性的实验方法是：首先培养肝癌细胞系H22，按200μl/只接种于小鼠右腋皮下，制备成肿瘤动物模型。于接种后5天，瘤块形成。开始按照浓度梯度每日一次静脉或局部注射化合物A、B的30％DMSO溶液。实验期间每周两次测定肿瘤长径(a)及与之相垂直的短径(b)，按公式1/2ab2计算瘤块体积。观察动物存活时间。结果表明A系列化合物和B系列化合物均有不同程度抑制肿瘤生长，延长肿瘤模型动物生存时间的作用。
本发明还通过流式细胞仪检测了A、B系列化合物在体内、体外诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期的作用。方法是体外试验中，选择HeLa细胞为靶细胞，用RPMI1640培养液将细胞稀释成密度约为5×105个/ml的细胞悬液，加入96孔细胞培养板中，每孔加入200μl肿瘤细胞悬液。按浓度梯度分别加入化合物A、B，同时设细胞对照组和阳性药物环磷酰胺对照组。CO2温箱中孵育24小时后，70％冷乙醇固定；体内试验中，取经过化合物处理的肿瘤模型动物的肿瘤组织，制备单细胞悬液，同时设定未经处理的肿瘤模型动物组为对照。70％冷乙醇固定。上机检测前洗去固定液，碘化丙啶染色，流式细胞仪检测。计算机自动对各峰的位置、峰高度、细胞周期各时相百分比进行分析。结果表明，效果最佳的化合物B1在0.01-10μM之间以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡，凋亡率在9％-31％。细胞周期阻滞在S期。其它化合物均以剂量依赖方式诱导培养细胞凋亡。
A、B系列化合物均作为抗肿瘤化合物或细胞凋亡诱导剂，以诱导细胞凋亡的方式在体内、体外抑制肿瘤的生长。
附图说明
图1：流式细胞仪检测结果。横坐标为DNA浓度，纵坐标为细胞数。化合物B1与培养细胞共孵育，终浓度0.01μM。24小时后，流式细胞仪检测，电脑分析DNA浓度和细胞周期。图示：可见凋亡峰，凋亡比例9.4％，细胞周期分析结果显示S期细胞占6.7％。
图2：流式细胞仪检测结果。化合物B1与培养细胞共孵育，终浓度0.1μM。24小时后，流式细胞仪检测。结果：可见凋亡峰，凋亡比例15.6％，细胞周期分析结果显示S期细胞占26.5％。
图3：流式细胞仪检测结果。化合物B1与培养细胞共孵育，终浓度10μM。24小时后，流式细胞仪检测。结果：可见凋亡峰，凋亡比例31.3％，细胞周期分析结果显示S期细胞占32.4％。
图4a：流式细胞仪检测结果。皮下荷瘤小鼠，经过化合物B1处理后，取瘤块制备细胞悬液，流式细胞仪检测。结果：可见凋亡峰，凋亡比例13.1％。
图4b：流式细胞仪检测结果。对照组皮下荷瘤小鼠(未经过化合物处理)，取瘤块制备细胞悬液，流式细胞仪检测。结果：没有凋亡峰。
具体实施方式
实施例1
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的50毫升乙腈中加入0.46克3-巯甲基-丙胺，常温搅拌2小时，蒸发部分溶剂，析出产品3-(3′-巯甲基-丙基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A1，收率60％。M.p.266-268℃；1H NMR(400M，DMSO)：δ9.604(br s，-NH-，1H)，8.5-8.54(d，J＝7.6Hz，1H)，8.2-8.21(d，J＝7.2Hz，1H)，7.75-79(d，J＝8.8Hz，1H)，7.57-7.6(t，J＝7.8Hz，1H)，6.9-6.92(d，J＝9.2Hz，1H)，3.24(br s，-NHCH2CH2-，2H)，2.82-2.84(m，-NHCH2CH2CH2-，2H)，2.42(br s，-SCH3-，3H)，1.89-1.91(m，-NHCH2CH2CH2-，2H)；ESI-MS：[M+H]-(334m/z)。
实施例2
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的50毫升乙腈中加入0.54克4-氨基丁酸乙酯，常温搅拌30分钟，蒸发部分溶剂，析出产品3-(3′-羧酸乙酯丙基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A2，收率65％。M.p.＞300℃；1H NMR(400M，DMSO)：δ9.20(br s，-NH-，1H)，8.84-8.86(d，J＝7.6Hz，1H)，8.64-8.66(d，J＝7.2Hz，1H)，7.95＝7.97(d，J＝8.8Hz，1H)，7.74-7.78(t，J＝7.8Hz，1H)，6.80-6.82(d，J＝9.2Hz，1H)，4.14-4.19(q，-COOCH2CH3，2H)，3.62-3.67(m，-NHCH2CH2CH2-，2H)，2.52-2.55(m，-NHCH2CH2CH2COO-，2H)，2.10-2.13(m，-NHCH2CH2CH2COO-，2H)，1.35-1.38(t，-COOCH2CH3，3H)；ESI-MS：[M+H]-(360m/z)。
实施例3
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的50毫升乙腈中加入0.45克硫吗啉，常温搅拌2小时，柱层析分离出产品3-硫吗啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯9-腈和6-硫吗啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A3，收率分别为40％和30％。A3：M.p.225℃分解；1H NMR(400M，DMSO)：8.69-8.71(d，J＝8.0Hz，1H)，8.42-8.45(d，J＝8.2Hz，1H)，7.98-7.96(d，J＝8.0Hz，1H)，7.88-7.92(t，J＝8.0Hz，1H)，7.04-7.02(d，J＝8.2Hz，1H)，3.68(br s，-N(CH2CH2)2S，4H)，3.05(br s，-N(CH2CH2)2S，4H)；ESI-MS：[M-H]-(330m/z)。
实施例4
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的50毫升乙腈中加入0.43克N-甲基哌嗪，常温搅拌2小时，柱层析分离出产品6-(N’-甲基哌嗪基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A4，收率30％。A4：M.p.240℃分解；1H NMR(400M，DMSO)：8.69-8.71(d，J＝8.0Hz，1H)，8.42-8.45(d，J＝8.2Hz，1H)，7.98-7.96(d，J＝8.0Hz，1H)，7.88-7.92(t，J＝8.0Hz，1H)，7.04-7.02(d，J＝8.2Hz，1H)，3.45(br s，-N(CH2CH2)2NCH3，4H)，2.95(br s，-N(CH2CH2)2NCH3，4H)，2.43(br s，-N(CH2CH2)2NCH3，3H)；ESI-MS：[M+H]-(329m/z)。
实施例5
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的50毫升乙腈中加入0.82克2-(4′-三氟甲基苯基)乙胺，常温搅拌30分钟，蒸发部分溶剂，析出产品3-2-(4′-三氟甲基苯基)乙氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A5，收率55％。A5：M.p.254-256℃；1H NMR(400M，DMSO)：δ9.13-9.11(d，J＝7.6Hz，-NH-，1H)，9.03-9.01(d，J＝7.6Hz，1H)，8.54-8.52(d，J＝7.2Hz，1H)，7.90-7.87(d，J＝9.2Hz，1H)，7.87-7.83(d，J＝8.0Hz，2H)，7.27-7.25(d，J＝8.0Hz，2H)，7.22-7.20(t，J＝8.0Hz，1H)，7.09-7.07(d，J＝9.2Hz，1H)，3.60-3.59(br s，-NHCH2CH2-，2H)，2.80-2.78(d，-NHCH2CH2，2H)；ESI-MS：[M+H]-(418m/z)。
实施例6
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的50毫升乙腈中加入0.50克2-三氟甲基乙胺，常温搅拌30分钟，蒸发部分溶剂，析出产品3-(2′-三氟甲基乙基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A6，收率55％。M.p.266-268℃；1H NMR(400M，DMSO)：δ9.450(br s，-NH-，1H)，8.6-8.62(d，J＝7.6Hz，1H)，8.42-8.45(d，J＝7.2Hz，1H)，7.80-7.82(d，J＝8.8Hz，1H)，7.57-7.6(t，J＝7.8Hz，1H)，7.12-7.14(d，J＝9.2Hz，1H)，3.16(br s，-NHCH2CH2-，2H)，2.32-2.34(m，-NHCH2CH2CF3-，2H)；ESI-MS：[M+H]-(342m/z)。
实施例7
1克2-(2-氧代-2氢-苊)-丙二腈，0.2克碳酸钾，10毫升二甲基亚砜，加热到100℃，搅拌15分钟，冷却析出晶体。过滤，水洗干燥，得产品黄棕色晶体8-氧代-8氢-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A7，收率，80％。1H NMR(400M，DMSO)：δ8.71-8.69(d，J＝8.0Hz，1H)，8.67-8.65(d，J＝7.6Hz，1H)，8.64-8.62(d，J＝8.0Hz，1H)，8.42-8.40(d，J＝7.6Hz，1H)，7.99-7.95(t，J＝7.8Hz，1H)；13C NMR(100M，DMSO)：δ177.48，138.26，137.73，134.40，132.72，131.82，131.37，128.91，127.94，127.37，126.13，122.22，119.72，113.82，113.38；IR(KBr)cm-1：2231，1643，1577；ESI-MS：M+Na+(331，m/z)。
实施例8
体外抗肿瘤活性实验。采用细胞培养法对A、B系列化合物进行抗肿瘤活性实验。首先通过MTT法测定IC50。选择HeLa细胞为靶细胞，用RPMI1640培养液将细胞稀释成密度约为5×105个/ml的细胞悬液，加入96孔细胞培养板中，每孔加入200μl肿瘤细胞悬液。分别加入A、B系列化合物的100％DMSO溶液，终浓度100，50，10，5，1，0.5，0.1，0.05，0.01μM，同时设立培养肿瘤细胞对照组和抗癌药物环磷酰胺阳性对照组。CO2温箱中孵育24hrs后每孔加入MTT溶液20μl，用酶标仪测定570nm下光密度(OD)值，根据光密度值，计算各孔肿瘤细胞的存活率。实验重复3次，取其平均值。根据公式logIC50-Xm-I[P-1/4(3-Pm-Pn)]计算IC50。
其中，Xm：log最大浓度，I：log(最大浓度/相对浓度)，P：阳性率之和，Pm：最大阳性率，Pn：最小阳性率。结果表明细胞毒性最强的化合物B1的IC50＝0.17μM(0.56μg)。(表1)。其它化合物IC50值在0.4-6.8μM之间。
再通过流式细胞仪检测凋亡比例和细胞周期阻滞。选择HELA细胞为靶细胞，用RPMI1640培养液将细胞稀释成密度约为5×105个/ml的细胞悬液，加入96孔细胞培养板中，每孔加入200μl肿瘤细胞悬液。分别加入化合物，同时设细胞对照组和阳性药物环磷酰胺对照组。CO2温箱中孵育24小时后，冷乙醇固定。上机前洗去固定液，取单细胞悬液，碘化丙啶染色，流式细胞仪检测。计算机自动对各峰的位置、峰高度、细胞周期各时相百分比进行分析。结果表明，效果最佳的化合物B1在0.01-10μM之间以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡，凋亡率在9％-31％。细胞周期阻滞在S期(附图1-3)。
其它化合物均以剂量依赖方式诱导培养细胞凋亡，凋亡比例在15％左右。
实施例9
体内抗肿瘤活性检测。选择饲养的中国昆明小鼠，随机分组，每组10只。培养的肝癌细胞H22，按200μl/只接种于小鼠右腋皮下。于荷瘤5天后，皮下瘤块形成。开始静脉或局部注射化合物A、B的30％DMSO溶液。以化合物B1为例，分为0.03mg/kg体重组，和0.3mg/kg体重组。实验期间每周两次测定肿瘤长径(a)及与之相垂直的短径(b)，按公式1/2ab2计算肿瘤体积.观察动物存活时间。实验第14天，按肿瘤体积计算抑瘤率。0.03mg/kg体重组抑瘤率50％，0.3mg/kg体重组抑瘤率70％。其它化合物均有不同程度抑制肿瘤生长的作用，抑制率在20-50％左右。
对照组动物平均生存时间为18天，化合物组的平均寿命26天。统计学处理结果显示P＜0.05，认为这些化合物具有延长肿瘤动物生存时间的作用。
试验7天后，剥取小鼠皮下肿瘤，按1∶3体积用生理盐水将组织匀浆制备细胞悬液，同上方法用流式细胞仪测定凋亡率。结果表明这些化合物都具有诱导肿瘤组织细胞凋亡的作用(附图4a，4b)。凋亡比例在10％-50％之间。
表1化合物B1对培养HeLa细胞的抑制
| 浓度(μM) | 0.01 | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.5 | 1 | 2 |
| 抑制率(％)(3次) | 2 | 6.7 | 31.5 | 53.5 | 68 | 78 | 83.8 | 89.8 |
| 1.2 | 6 | 31 | 52.2 | 67.5 | 76.6 | 83.4 | 87.8 | |
| 1.4 | 7.1 | 31.4 | 51.2 | 67.6 | 76.4 | 83.6 | 88.2 | |
| 平均抑制率(％) | 1.53 | 6.6 | 31.3 | 52.3 | 67.7 | 77.0 | 83.6 | 88.6 |
Claims (2)
1、一类8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的氨基或卤素取代衍生物，其特征在于该衍生物是3，6-二取代，3-取代或6-取代的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈，分子结构通式A：
通式A中，(1)R1＝NHR4，R2＝H，
a、R4＝XSR5，X＝C2-C6直链或支链烷基，R5＝CH3，C2H5；
b、R4＝YCOO(CH2)nCH3，Y＝C2-C6直链或支链烷基，n＝0-3；
c、R4＝(CH2)xAr，x＝1-3，Ar＝2’-CF3Ph-，3’-CF3Ph-，4’-CF3Ph，2’-FPh-，3’-FPh-，4’FPh-；
d、R4＝(CH2)yCF3，y＝2，3；
e、R4＝XS(O)R6，X＝C2-C6直链或支链烷基，R6＝CH3，C2H5；
f、R4＝XS(O2)R6，X＝C2-C6直链或支链烷基，R6＝CH3，C2H5；
(2)R2＝哌嗪基，N’-甲基哌嗪基，吗啉基，硫吗啉基，R1＝H；
(3)R1＝F，Cl，Br，R2＝H。
2、按照权利要求1所述的化合物A作为细胞凋亡诱导剂的应用，其特征在于：A化合物的DMSO纯溶液，与培养的哺乳动物肿瘤细胞共孵育24小时，浓度梯度为0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的条件下，经过70％(体积)乙醇固定，碘化丙啶染色后，流式细胞仪检测，结果证明它们能够以剂量依赖的方式诱导肿瘤细胞凋亡，凋亡比例在9％-31％之间，并且能够阻断细胞周期于S期。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Beijing Medconxin Pharmaceutical Technology Co., Ltd. Assignor: Dalian University of Technology Contract record no.: 2011210000059 Denomination of invention: Acenaphthene heterocyclic compound and its cell fading inducing and anti-tumor use Granted publication date: 20070314 License type: Exclusive License Open date: 20050518 Record date: 20110620 |
|
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070314 Termination date: 20130915 |