CN112110864B - 一种4-酰胺取代嘧啶类靶向ddr1抑制剂及其制备和抗肿瘤活性的应用 - Google Patents

一种4-酰胺取代嘧啶类靶向ddr1抑制剂及其制备和抗肿瘤活性的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112110864B
CN112110864B CN202010576531.0A CN202010576531A CN112110864B CN 112110864 B CN112110864 B CN 112110864B CN 202010576531 A CN202010576531 A CN 202010576531A CN 112110864 B CN112110864 B CN 112110864B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ddr1
cells
chloro
substituted
dmso
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010576531.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112110864A (zh
Inventor
王学宝
陈波
叶发青
杜宗轩
杨小娇
钱锦恒
屠思军
谢自新
张园
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wenzhou Medical University
Original Assignee
Wenzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wenzhou Medical University filed Critical Wenzhou Medical University
Priority to CN202010576531.0A priority Critical patent/CN112110864B/zh
Publication of CN112110864A publication Critical patent/CN112110864A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112110864B publication Critical patent/CN112110864B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/47—One nitrogen atom and one oxygen or sulfur atom, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种N‑取代(5‑氯‑6‑(取代苯氧基)嘧啶‑4‑基)苯甲酰胺类靶向DDR1小分子抑制剂及其制备和应用。本发明的N取代(5‑氯‑6‑(取代苯氧基)嘧啶‑4‑基)苯甲酰胺类靶向DDR1抑制剂。合成的45个化合物均对肺正常细胞毒性小，并且在10μM DDR1激酶初筛中，最好的化合物为C1，在10μM下对DDR1的抑制率显著优于先导化合物YFQ07。在细胞实验层面，C1对PC‑9GR的IC50值显著优于YFQ07。此外发现我们设计合成的化合物对PC‑9细胞(EGFR L858R突变)抑制率大部分超过了50％，并且C1能够抑制肺癌细胞集落的形成，以及能够抑制肿瘤细胞的迁移。

Description

一种4-酰胺取代嘧啶类靶向DDR1抑制剂及其制备和抗肿瘤活 性的应用
技术领域
本发明属于医药化学技术领域，尤其涉及一种N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类结靶向DDR1小分子抑制剂及其制备和抗肿瘤活性的应用。
背景技术
近十几年来，靶向治疗成为癌症治疗的研究热点之一，在靶向治疗中，酪氨酸激酶家族与肿瘤的发病有着密切的关系，蛋白激酶参与调节对细胞生长、增殖和生存至关重要的信号网络。在酪氨酸激酶家族中，表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR)备受关注。第一代EGFR抑制剂如吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)治疗NSCLC患者一段时间后，不少患者都产生了对EGFR-TKI的耐药。
在非小细胞肺癌中会出现DDR1蛋白表达异常，磷酸化失衡等现象，在肺癌治疗中，有相关研究指出，DDR1的遗传和药理抑制分别阻断了肿瘤的发生和进展。另外KarmeleValencia等报道，破坏DDR1会阻碍肿瘤细胞的存活，导致骨骼归巢过程中早期的肿瘤骨骼接触受损。此外，DDR1的抑制极大地改变了骨定殖。在肿瘤耐药方面，在肺腺癌中同时抑制DDR1和Notch信号可诱导KRAS；tp53突变患者来源的肺异种移植(PDX)的消退，其治疗效果至少可与标准化疗媲美。所有这些数据表明DDR1参与体外肿瘤抗性，但其在体内的参与需要进一步分析和确认。因此DDR1有希望成为肿瘤耐药方面的一个治疗靶点。状结构域受体1(Discoidindomainreceptor-1，DDR1)是一类受体酪氨酸激酶受体，研究中发现其在非小细胞肺癌中表达跟肿瘤细胞的增殖，侵袭等有着密切的联系，并发现DDR1在非小细胞肺癌中出现蛋白表达异常，磷酸化现象失衡等，容易对治疗非小细胞肺癌预后产生很大影响。DDR1也参与调节非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移功能。
在本课题组前期的研究中，发现YFQ07化合物(见式1)，是一个很好的靶向抑制剂，同时通过蛋白组学实验，发现PC-9细胞(EGFR外显子缺失)在吉非替尼耐药后，EGFR磷酸化的水平显著下降，DDR1的磷酸化水平显著上调，在加入YFQ07后，DDR1的磷酸化水平显著下降。但是，我们发现了YFQ07化合物尚存在不足之处，例如YFQ07虽然能够降低PC-9GR(DDR1高表达细胞)中DDR1磷酸化位点的水平，但是降低的效果不是特别显著，有待我们进一步开发出活性更高的抑制剂。
表1差异蛋白磷酸化位点定量信息
Figure GDA0003520123460000021
Figure GDA0003520123460000022
发明内容
本发明提供了一种N-取代苯甲酰胺类靶向DDR1抑制剂及其制备和抗肿瘤活性的应用，该N-取代苯甲酰胺类靶向DDR1抑制剂对DDR1具有较高的抑制活性，可以作为一种潜在的抗肿瘤药物。
本发明采用如下技术方案：
一种N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类靶向DDR1小分子抑制剂，化学结构如下：
Figure GDA0003520123460000031
其中，R1选自取代或者未取代的苯基、烷基、卤素取代的烷基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、苯乙烯基、4-苯基吗啉基或丙烯基；
所述苯基上的取代基选自卤素、甲基、甲氧基、硝基中的一种或者多种。
进一步地，所述的N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类靶向DDR1小分子抑制剂为化合物C1-C27中的一种，C1-C27中的R1如表2所示：
表2化合物C1-C27结构与产率
Figure GDA0003520123460000032
Figure GDA0003520123460000041
进一步的，所述的化合物为N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类(C1)，化学结构如下：
Figure GDA0003520123460000042
进一步的，所述的化合物为N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类(C9)，化学结构如下：
Figure GDA0003520123460000043
本发明还提供了一种所述的N取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)4-((6-氨基-5-氯嘧啶-4-基)氧基)苯酚的合成：加入取代苯酚1.2mmol(150mg)和CsCO33.0mmol(576mg)溶解于DMSO 25mL，同时加入磁石。搅拌加热80℃半小时使其充分溶解，然后加入5mL无水乙醇溶解的4-氨基-5,6-氯嘧啶(163mg)1.0mmol反应。注意要以滴加的方式加进去，以达到长时过量反应的效果，滴加时间控制在1h左右。反应15h后，EA萃取，无水硫酸除水，后制砂，柱层析分离，得N4-(取代苯基)-5,6-二氯-嘧啶二取代物。
(2)5-氯-6-(4-(甲氧基甲氧基)苯氧基)嘧啶-4-胺的合成：取N4-(取代苯基)-5,6-二氯-嘧啶二取代物1mmol(281mg)溶于无水二氯甲烷15ml，再加入100uL三乙胺(缚酸剂)并加入磁石，冰浴搅拌15min后逐滴加入1.2mmol的氯甲基甲醚(按摩尔比换算相应的质量或体积)，同时每隔半个小时点板监测，直至原料点不再变淡或消失。反应4h后，EA萃取，无水硫酸除水，后制砂，柱层析提纯。
(3)取代苯基酰氯的合成通法：称取原料取代苯甲酸3mmol(按照摩尔质量比计算相应的质量或体积)及30mL新蒸SOCl2，于105℃下回流3～5h，冷却静置，减压浓缩干燥氯化亚砜，得原料取代苯甲酰氯。
(4)5-氯-6-(4-(甲氧基甲氧基)苯氧基)嘧啶-4-苯甲酰胺的合成通法：取5-氯-6-(4-(甲氧基甲氧基)苯氧基)嘧啶-4-胺1mmol(按摩尔比换算相应的质量或体积),同时溶于无水二氯甲烷15ml，再加入100uL三乙胺(缚酸剂)加入磁石，冰浴搅拌15min,后逐滴加入1.2mmol的取代苯甲酰氯(按摩尔比换算相应的质量或体积)，同时每隔半个小时点板监测，直至原料点不再变淡或消失。反应5小时后，EA萃取，无水硫酸除水，后制砂，柱层析分离，得目标化合物。
(5)目标化合物C1-C27的合成通法：取5-氯-6-(4-(甲氧基甲氧基)苯氧基)嘧啶-4-苯甲酰胺1mmol(340mg)溶于甲醇15ml中，再加入2ml的5％HCL，室温下搅拌反应，点板监测。大概三到四个小时反应结束。将反应后的母液旋干，再加入适量的乙酸乙酯溶解。再加入50％的氯化钠溶液萃取分层，收集并旋干有机层。无水硫酸除水，后制砂，柱层析分离，得终产物。
本发明还提供了一种所述的N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类抑制剂表现出一定的抗肿瘤活性。
根据抗肿瘤活性测试结果，这些化合物对两个非小细胞肺癌细胞系，都表现出了一定的抑制活性；其中，相对较好的是化合物C1。化合物C1作用于2个癌细胞的IC50值分别为3.18±0.68μM，1.59±0.36μM。结果显示，化合物C1是一个比较有效的结肠癌抑制剂。
具体结果如下：
Figure GDA0003520123460000051
作为进一步的优选，所述的N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类抑制剂为化合物C1。
作为进一步的优选，所述的抗肿瘤药物用于治疗结肠癌或非小细胞肺癌。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明提供了一类新的靶向DDR1小分子抑制剂，该小分子抑制剂能有效抑制DDR1的磷酸化，可以作为一种有潜力的抗癌药物进行开发和研究。
附图说明
图1为实施例3中耐药细胞DDR1磷酸化的表达结果；
图2为实施例3中DDR1在A549细胞中的mRNA水平及WB表达水平；
图3为实施例3中10μM下化合物对BEAS-2B细胞的存活率；
图4为10μM下化合物对PC-9(EGFR L858R突变)细胞的抑制率；
图5为10μM下化合物对A549细胞的抑制率；
图6为化合物对PC-9GR细胞的抑制率；
图7为实施例4中化合物C1抑制A549细胞集落的形成实验图；
图8为实施例5中化合物C1抑制A549细胞的迁移实验图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例1化合物的合成
1.1化合物的具体合成路线(路线中所列的碱、溶剂和缚酸剂仅仅为示例性的，不是对本发明的限制)如下所示:
Figure GDA0003520123460000061
1.2合成步骤示例
4-((6-氨基-5-氯嘧啶-4-基)氧基)苯酚的合成：加入取代苯酚1.2mmol(150mg)和CsCO33.0mmol(576mg)溶解于DMSO 25mL，同时加入磁石。搅拌加热80℃半小时使其充分溶解，然后加入5mL无水乙醇溶解的的4-氨基-5,6-氯嘧啶(163mg)1.0mmol反应。注意要是以滴加的方式加进去，以达到长时过量反应的效果，滴加时间控制在1h左右。反应15h后，EA萃取，无水硫酸除水，后制砂，柱层析分离，得N4-(取代苯基)-5,6-二氯-嘧啶二取代物。
5-氯-6-(4-(甲氧基甲氧基)苯氧基)嘧啶-4-胺的合成：取N4-(取代苯基)-5,6-二氯-嘧啶二取代物1mmol(281mg)溶于无水二氯甲烷15ml，再加入100uL三乙胺(缚酸剂)加入磁石，冰浴搅拌15min后逐滴加入1.2mmol的氯甲基甲醚(按摩尔比换算相应的质量或体积)，同时每隔半个小时点板监测，直至原料点不再变淡或消失。反应4h后，EA萃取，无水硫酸除水，后制砂，柱层析分离。
取代苯基酰氯的合成通法：称取原料取代苯甲酸3mmol(按照摩尔质量比计算相应的质量或体积)及30mL新蒸SOCl2，于105℃下回流3～5h，冷却静置，减压浓缩干燥氯化亚砜，得原料取代苯甲酰氯。
5-氯-6-(4-(甲氧基甲氧基)苯氧基)嘧啶-4-苯甲酰胺的合成通法：取取代5-氯-6-(4-(甲氧基甲氧基)苯氧基)嘧啶-4-胺1mmol(按摩尔比换算相应的质量或体积),同时溶于无水二氯甲烷15ml，再加入100uL三乙胺(缚酸剂)加入磁石，冰浴搅拌15min,后逐滴加入1.2mmol的酰氯(按摩尔比换算相应的质量或体积)，同时每隔半个小时点板监测，直至原料点不再变淡或消失。反应5小时后，EA萃取，无水硫酸除水，后制砂，柱层析分离，得目标化合物。
目标化合物C1-C27的合成通法：取5-氯-6-(4-(甲氧基甲氧基)苯氧基)嘧啶-4-胺1mmol(340mg)溶于甲醇15ml中，再加入2ml的5％HCL，室温下搅拌反应，点板监测。大概三到四个小时反应结束。将反应后的母液旋干，再加入适量的乙酸乙酯溶解。再加入50％的氯化钠溶液萃取分层，收集并旋干有机层。无水硫酸除水，后制砂，柱层析分离，得终产物。
1.3实验结果
合成的所有目标化合物结构如下表所示；
Figure GDA0003520123460000081
Figure GDA0003520123460000091
合成的包括活性化合物在内的目标化合物的MS、1H NMR和13C NMR等理化数据如下：
3-chloro-N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)propanamide(C1)
Figure GDA0003520123460000092
Chemical Formula:C13H11Cl2N3O3Exact Mass:327.0177MP:188.4～189.2℃ESI-MS:328.013[M+H]+1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.15(s,1H,Pyrimidine-H)，7.433(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H)，7.325(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H).3.981(t,3H,Cl-C-H,)2.981(t,3H,Cl-CH2-C-H).13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):175.611,174.487,173.597,163.875,160.541,153.312,148.541,125.311,115.287,96.487.
6-chloro-N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)nicotinamide(C2)
Figure GDA0003520123460000093
Chemical Formula:C16H10Cl2N4O3Exact Mass:376.0130MP:176.4～177.2℃ESI-MS:377.01[M+H]+1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.326(s,1H，-OH),9.166(s,1H,Pyridine-H)，8.981(d,1H,J＝7.0Hz,Pyridine-H),8.056(s,1H,Pyrimidine-H),7.851(d,1H,J＝7.5Hz,Pyridine-H),7.443(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.345(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H).13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.151,162.833,161.588,154.963,154.601,151.221,150.328,147.166,140.786.
2,6-dichloro-N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)benzamide(C3)
Figure GDA0003520123460000101
Chemical Formula:C17H10Cl3N3O3Exact Mass:408.9788MP:188.4～189.2℃ESI-MS:410.78[M+H]+1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.136(s,1H,Pyrimidine-H),7.867(t,1H,Ar-H),7.594(d,2H,J＝6.5Hz,Ar-H)7.413(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.335(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H).13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):176.599,164.124,160.599,152.176,147.574,135.211,132.845,131.597,129.542,126.187,117.633,103.245.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-2,4-difluorobenzamide(C4)
Figure GDA0003520123460000102
Chemical Formula:C17H10ClF2N3O3Exact Mass:377.0379MP:167.4～168.2℃ESI-MS:378.78[M+H]+1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.119(s,1H,Pyrimidine-H),8.017(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.31(t,1H,Ar-H),7.443(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.345(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),6.936(t,1H,Ar-H)13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.254,172.347,168.699,159.466,152.341,149.451,131.412,122.677,120.451,117.687,110.784,102.196.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-3-methylbut-2-enamide(C5)
Figure GDA0003520123460000103
Chemical Formula:C15H14ClN3O3Exact Mass:319.0724MP:159.4～160.2℃ESI-MS:320.07[M+H]+1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.129(s,1H,Pyrimidine-H),7.313(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.295(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),2.213(s,3H-CH3),2.013(s,3H,-CH3).13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.266,172.541,165.541,160.858,158.612,153.321,150.215,148.541,122.451,119.847,118.451,103.215.
3-bromo-N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)benzamide(C6)
Figure GDA0003520123460000111
Chemical Formula:C17H11BrClN3O3Exact Mass:418.9672MP:193.4～194.2℃ESI-MS:420.01[M+H]+1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.169(s,1H,Pyrimidine-H),8.048(s,1H,Ar-H),7.917(d,1H,Ar-H),7.766(d,1H,Ar-H),7.494(t,1H,Ar-H)7.213(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.195(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H)13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.215,171.564,164.315,159.896,148.621,138.125,136.458,130.412,128.268,126.584,123.399,118.546,103.236.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-3,4-dimethoxybenzamide(C7)
Figure GDA0003520123460000112
Chemical Formula:C19H16ClN3O5Exact Mass:401.0778MP:183.4～184.2℃ESI-MS:404.0134[M+H]+1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.139(s,1H,Pyrimidine-H),7.711(d,J＝6.5Hz,1H,Ar-H),7.398(s,1H,Ar-H),7.213(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.195(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.111(d,J＝6.5Hz,1H,Ar-H),3.919(s,6H,-OCH3)13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.499,172.654,165.265,160.245,153.321,152.265,149.561,129.694,126.541,120.264,118.956,116.269,115.456,101.365.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-2-fluorobenzamide(C8)
Figure GDA0003520123460000113
Chemical Formula:C17H11ClFN3O3Exact Mass:359.0473MP:201.4～202.2℃ESI-MS:360.04[M+H]+1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.199(s,1H,-OH),8.117(s,1H,Pyrimidine-H),7.914(d,1H,J＝3.5Hz,Ar-H),7.61(t,1H,Ar-H),7.561(t,1H,Ar-H),7.217(d,1H,Ar-H)7.163(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.055(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.112(d,J＝6.5Hz,1H,Ar-H),13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.215,172.269,165.451,160.569,159.487,148.596,133.348,132.119,125.596,124.548,123.498,118.265,117,103.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-2,4,5-trifluorobenzamide(C9)
Figure GDA0003520123460000121
Chemical Formula:C17H9ClF3N3O3Exact Mass:395.0285 Mp℃:229.8～231.0；ESI-MS[M+H]+:397.021H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.157(s,1H,Pyrimidine-H)，7.617(s,1H,Ar-H)，7.163(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.055(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.118(d,J＝6.5Hz,1H,Ar-H),6.842(s,1H,Ar-H),13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):171.569,170.256,165.891,160.458,155.476,154.852,148.125,146.259,126.597,125.733,118.567,117.421,108.265,103.456.
2,4-dichloro-N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)benzamide(C10)
Figure GDA0003520123460000122
Chemical Formula:C17H10Cl3N3O3Exact Mass:408.9788Mp℃:213.8～214.0；ESI-MS[M+H]+:410.971H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.147(s,1H,Pyrimidine-H)，7.816(s,1H,Ar-H)，7.737(d,2H，Ar-H),7.163(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),7.055(d,J＝7.5Hz,2H,Ar-H),13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):172.369,171.564,165.412,160.356,147.598,135.459,131.485,130.589,128.412,125.523,118.687,102.326.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)benzamide(C11)
Figure GDA0003520123460000131
Chemical Formula:C17H12ClN3O3Exact Mass:341.0567Mp℃:159.8～160.0；ESI-MS[M+H]+:342.051H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.148(s,1H,Pyrimidine-H),7.931(d,2H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.628(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.546(t,2H,Ar-H)13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.231,171.653,164.234,160.265,155.231,148.269,133.231,131.125,128.561,127.561,118.512,103.256.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)thiophene-2-carboxamide(C12)
Figure GDA0003520123460000132
Chemical Formula:C15H10ClN3O3S Exact Mass:347.0131Mp℃:188.8～189.0；ESI-MS[M+H]+:348.111H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.164(d，J＝4.5Hz,1H,Thiophene-H,8.095(s,1H,Pyrimidine-H)，8.047(s，1H,Thiophene-H)，7.392(s,1H,Thiophene-H),7.375(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H),7.317(d,J＝8.0Hz,2H,Ar-H)13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):171.563,170.265,162.356,160.231,155.845,148.236,139.453,131.542,130.236,129.811,123.265,116.451,102.654.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)furan-2-carboxamide(C13)
Figure GDA0003520123460000133
Chemical Formula:C15H10ClN3O4Exact Mass:331.0360Mp℃:207.8～209.0；ESI-MS[M+H]+:332.061H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.01(s,1H,Pyrimidine-H)，7.958(s，1H,Furan-H),7.556(d，J＝3.5Hz，1H,Furan-H),7.296(d,J＝8.5Hz,2H，Ar-H),7.229(d，J＝8.5Hz,2H，Ar-H),6.772(d,J＝1.0Hz,1H,Furan-H)13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.151,161.580,156.359,154.592,150.208,148.610,146.786,142.911.
4-chloro-N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)benzamide(C14)
Figure GDA0003520123460000141
Chemical Formula:C17H11Cl2N3O3Exact Mass:375.0177Mp℃:217.8～218.0；ESI-MS[M+H]+:377.061H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.101(s,1H,Pyrimidine-H)，7.955(d,2H,J＝6.5Hz,Ar-H),7.614(d,2H,J＝6.5Hz,Ar-H),7.296(d,J＝8.5Hz,2H，Ar-H),7.229(d，J＝8.5Hz,2H，Ar-H)13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.456,172.146,165.396,160.145,155,148.561,138.698,133.423,130.794,129.426,123.561,118.739,103.569.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-2,3,4-trimethoxybenzamide(15)
Figure GDA0003520123460000142
Chemical Formula:C20H18ClN3O6Exact Mass:431.0884Mp℃:201.8～202.0℃；ESI-MS[M+H]+:432.181H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.111(s,1H,Pyrimidine-H)，7.567(d,1H,J＝6.0Hz,Ar-H),7.296(d，J＝8.5,2H，Ar-H)，7.229(d，J＝8.5Hz,2H，Ar-H)13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.563,172.456,165.236,160.758,153.456,150.375,148.456,143.521,125.365,122.856,118.694,111.259,105.753,104.951.
2-bromo-N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)benzamide(C16)
Figure GDA0003520123460000151
Chemical Formula:C17H11BrClN3O3Exact Mass:418.9672Mp℃:196.8～198.0℃；ESI-MS[M+H]+:420.281H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.111(s,1H,Pyrimidine-H)，7.764(d,1H,J＝3.5Hz,Ar-H),7.697(d,1H,J＝3.5Hz,Ar-H),7.535(t,1H,Ar-H),7.429(d,1H,J＝3.5Hz,Ar-H),7.296(d，J＝8.5Hz,2H，Ar-H)，7.229(d，J＝8.5Hz,2H，Ar-H)13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.894,171.561,165.265,161.236,160.456,155.236,148.357,131.267,133.269,127.569,126.456,125.286,118.345,117.389,103.486.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)cinnamamide(C17)
Figure GDA0003520123460000152
Chemical Formula:C19H14ClN3O3Exact Mass:367.0724Mp℃:183.8～185.0℃；ESI-MS[M+H]+:368.171H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.111(s,1H,Pyrimidine-H)，7.822(d,2H,J＝3.5Hz,Ar-H),7.318(t,2H,J＝3.5Hz,Ar-H),7.821(t,1H,Ar-H),7.612(s,1H,-CH＝CH-),7.286(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H),7.217(d，J＝8.5Hz,2H，Ar-H)13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):173.458,172.526,167.369,160.412,154.269,148.561,142.478,138.862,129.845,128.759,126.934,119.269,118.476,102.561.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-4-methylbenzamide(C18)
Figure GDA0003520123460000153
Chemical Formula:C18H14ClN3O3Exact Mass:355.0724Mp℃:192.1～194.0℃；ESI-MS[M+H]+:356.081H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.047(d,J＝6.5Hz,2H,Ar-H)，7.999(s,1H,Pyrimidine-H),7.430(d,J＝6.5Hz,2H,Ar-H)，7.327(d,J＝6.5Hz,2H,Ar-H)，7.264(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H)13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):164.579,163.597,161.526,155.764,154.595,153.236,150.048,147.590,144.532.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-4-methoxybenzamide(C19)
Figure GDA0003520123460000161
Chemical Formula:C18H14ClN3O4Exact Mass:371.0673Mp℃:187.3～189.6℃；ESI-MS[M+H]+:372.061H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.165(d,J＝6.5Hz,2H,Ar-H)，8.017(s,1H,Pyrimidine-H)，7.684(d,J＝6.5Hz,2H,Ar-H)，7.350(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H),7.277(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H),4.895(s,3H,H-OCH3)13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):164.224,163.176,161.585,154.598,150.143,147.513,143.627,130.181,129.201,128.636,122.836,122.646.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-3,5-dimethoxybenzamide(C20)
Figure GDA0003520123460000162
Chemical Formula:C19H16ClN3O5Exact Mass:401.0778Mp℃:191.3～193.0℃；ESI-MS[M+H]+:402.061H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.15(s,1H,Pyrimidine-H)，7.340(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H)，7.267(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H)，6.4521(s,1H,Ar-H),6.4512(s,1H,Ar-H),6.4418(s,1H,Ar-H),3.98(s,6H,-OCH3)13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):171.265,172.451,165.326,162.412,161.562,155.241,148.356,132.458,123.269,107.345,103.023,102.234,57.236.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-3-nitrobenzamide(C21)
Figure GDA0003520123460000171
Chemical Formula:C17H11ClN4O5Exact Mass:386.0418Mp℃:185.8～187.0℃；ESI-MS[M+H]+:387.261H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.951(s,1H,Ar-H),8.525(d,1H,J＝3.0Hz,Ar-H),8.453(d,1H,J＝3.0Hz,Ar-H),8.121(s,1H,Pyrimidine-H),7.921(t,3H,Ar-H),7.340(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H)，7.267(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H)13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):172.369,171.235,164.451,160.269,155.589,148.364,135.239,134.289,128.349,127.478,124.561,123.426,118.259,103.534.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-4-fluorobenzamide(C22)
Figure GDA0003520123460000172
Chemical Formula:C17H11ClFN3O3Exact Mass:359.0473Mp℃:159.6～161.7℃；ESI-MS[M+H]+:361.361H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.251(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H),8.162(s,1H,Pyrimidine-H),7.571(d,J＝6Hz,2H,Ar-H),7.340(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H)7.267(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H)13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):173.598,171.693,167.487,165.413,160.269,154.358,147.641,130.596,129.526,124.036,118.029,103.098.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)methacrylamide(C23)
Figure GDA0003520123460000173
Chemical Formula:C14H12ClN3O3Exact Mass:305.0567Mp℃:229.8～231.0℃；ESI-MS[M+H]+:306.161H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.102(s,1H,Pyrimidine-H),7.551(d,J＝6Hz,2H,Ar-H),7.340(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H)5.859(s,1H,-CH＝),5.6491(s,1H,-CH＝),1.981(s,3H,Ar-H)13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):172.364,171.269,163.459,160.784,153.584,148.469,141.258,123.349,118.267,117.358,102.298.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-3-fluorobenzamide(C24)
Figure GDA0003520123460000181
Chemical Formula:C17H11ClFN3O3Exact Mass:359.0473Mp℃:201.7～203.4℃；ESI-MS[M+H]+:361.231H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.122(s,1H,Pyrimidine-H),7.732(d,J＝8.5Hz,1H,Ar-H),7.644(d,J＝6Hz,1H),7.454(t,1H,Ar-H)7.441(s,1H,Ar-H),7.340(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H)，7.267(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H)13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):177.280,176.069,165.230,164.261,160.842,155.459,143.532,138.269,130.349,123.296,122.349,119.489,118.487,103.561.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-4-morpholinobenzamide(C25)
Figure GDA0003520123460000182
Chemical Formula:C21H19ClN4O4Exact Mass:426.1095MP℃：182.2～183.8℃；ESI-MS:427.25[M+H]+1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.212(s,1H,Pyrimidine-H),7.496(d,J＝4.0Hz,2H,Ar-H),7.132(d,J＝4.0Hz,2H,Ar-H),7.011(d,J＝4.0Hz,2H,Ar-H),6.913(d,J＝4.5Hz,2H,Ar-H),3.841(d,J＝4.0Hz,2H,Morpholine-H),3.213(d,J＝3.5Hz,2H,Morpholine-H)13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):172.133,170.621,163.265,160.213,153.145,151.236,148.354,130.023,123.234,118.125,111.234,103.215,68.145,53.236.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)isonicotinamide(C26)
Figure GDA0003520123460000183
Chemical Formula:C16H11ClN4O3Exact Mass:342.0520MP℃:202.2～203.8℃；ESI-MS:343.05[M+H]+1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.901(d,2H,Py-H),8.033(d,2H,Py-H)13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):163.606,163.151,161.589,154.598,153.623,152.269,150.888,150.355,147.250.
N-(5-chloro-6-(4-hydroxyphenoxy)pyrimidin-4-yl)-3,4,5-trifluorobenzamide(C27)
Figure GDA0003520123460000191
Chemical Formula:C17H9ClF3N3O3Exact Mass:395.0285MP℃:202.2～203.8℃；ESI-MS:396.35[M+H]+1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.122(,s,1H,2-pyrimidine-H),7.326(s,2H,Ar-H),7.340(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H)，7.267(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H).13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):172.598,171.613,163.269,160.248,154.036,148.387,142.891,132.286,123.364,118.478,109.561,103.426.
本发明所合成目标化合物的性状及其溶解性如下：
目标化合物产率普遍较高。化合物C1-27均为白色絮状固体；化合物易溶于乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、DMSO、DMF、DMAC；微溶于石油醚、甲醇、乙醇；不溶于甲苯。本发明合成的目标化合物，在MS谱图中均显示了[M+1]+峰，且信号较强，部分化合物存在着同位素峰。1H-NMR谱图结果显示，所有目标化合物的氢信号，以及其化学位移，在图谱上都能清晰的看出。以DMSO-d6为溶剂时，核磁氢谱数据显示完全，即化合物氢的理论个数，与核磁氢谱图上氢的个数相吻合；而以CDCl3为溶剂时，大多数的目标化合物的核磁氢谱数据显示不完全，核磁氢谱图上通常没有脲基胺上的两个氢。13C-NMR谱图结果显示，目标化合物碳峰位移及数目基本上与理论数据相符。
实施例2化合物抗肿瘤细胞活性(激酶实验)
2.1实验操作步骤
(1)配制1×Kinase buffer。
(2)化合物浓度梯度的配制：受试化合物测试浓度为10μM，复孔检测，在384孔板中配置成100倍终浓度的溶液。然后用Echo550转移250nl到384反应板中备用。阴性对照孔和阳性对照孔中分别加250nl的100％DMSO。
(3)用1×Kinase buffer配制2.5倍终浓度的激酶溶液。
(4)在化合物孔和阳性对照孔分别加入10μL的2.5倍终浓度的激酶溶液；在阴性对照孔中加10μL的1×Kinase buffer。
(5)1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育10分钟。
(6)用1×Kinase buffer配制25/15倍终浓度的ATP和Kinase substrate的混合溶液。
(7)加入15μL的25/15倍终浓度的ATP和底物的混合溶液，起始反应。
(8)将384孔板1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育25分钟。
(9)加入30μL终止检测液停止激酶反应，1000rpm离心30秒，振荡混匀。
(10)用Caliper EZ Reader读取转化率。
(11)加入30μL终止检测液停止激酶反应，1000rpm离心30秒，振荡混匀。用CaliperEZ ReaderⅡ读取转化率。计算公式：Inhibition＝(Conversion％_max-Conversion％_sample)/(Conversion％_max-Conversion％_min)*100。其中：Conversion％_sample是样品的转化率读数；Conversion％_min：阴性对照孔均值，代表没有酶活孔的转化率读数；Conversion％_max：阳性对照孔比值均值，代表没有化合物抑制孔的转化率读数。
2.2实验结果
表3：DDR1激酶实验结果
编号 抑制率(％) 编号 抑制率(％) 编号 抑制率(％)
C4 17.7 C14 15.2 C24 15.5
C5 46 C15 4.4 C25 24.8
C6 28.2 C16 4.4 C26 3.3
C7 6.3 C17 5 C27 31.9
C8 15.5 C18 0.1 C28 22.5
C9 22.3 C19 43.3 C29 9.7
C10 12.4 C20 18.9 Yfq07 26
C11 25.2 C21 -7.1 C1 92.2
C12 21.9 C22 -0.1 C2 4.4
C13 13.7 C23 -8
2.3实验结果分析
上述激酶实验筛选出了对DDRI效果好的化合物，其中C1的在10μM下对DDR1的活性达到了92％。我们对效果比较好的化合物C1测定了DDR1激酶的IC50值，C1的IC50值分别为2.159微摩尔。
实施例3MTT法测定目标化合物对肿瘤细胞系的抑制作用
用DMSO溶解所有目标化合物并且配制成1mM的初始溶液，放于药品阴凉储存柜保存备用。初筛浓度为10μM，IC50测试所选浓度分别为10μM,5μM,1μM,0.5μM,0.1μM,0.01μM。首先，采用MTT法测定目标化合物在10μM浓度下对正常肺细胞BEAS-2B的增殖影响，即毒性作用。进一步地，对所有化合物在10μM浓度下进行抗肿瘤活性初筛，所选的细胞种类包括：BEAS-2B、A431、PC-9GR。最后，选择对这些细胞株抗增殖活性都比较好的化合物，在10μM,5μM,1μM,0.5μM,0.1μM,0.01μM这六个浓度下做IC50实验。
这些细胞均为贴壁细胞，均在完全的RPMI-1640或DMEM培养基中培养。当细胞铺满整个培养瓶或培养皿时，应先用移液枪将培养基吸尽，并用1～2mL的PBS清洗两次，以免残留物使胰酶消化作用减弱。加入胰酶一会后，将细胞培养瓶或培养皿放置于显微镜下观察，待细胞收缩，变圆、变亮或少数脱落后，立马加入新鲜完全培养基使消化停止。轻轻吹打瓶底或皿底使细胞分散成单个悬浮细胞。1000r/min离心5分钟，弃上清，用3mL的新鲜完全培养基重新培养细胞，铺板进行实验或者继续培养。所有进行实验的细胞复苏后传代少于30代。
3.1耐药细胞的构建及DDR1高表达细胞的选取
用相应完全培养基培养对EGFR-TKI高度敏感的人非小细胞肺癌细胞株PC-9作为母系细胞株，取处于对数生长的PC-9细胞采用药物浓度递增的方法来诱导耐药构建耐药细胞株。首先选择PC-9对吉非替尼的半抑制浓度(50％inhibiting concentration,IC50)作为起始给药浓度，毎2天更换新鲜完全培养基并给药除去死亡细胞继续进行传代培养，一直到给药后未出现明显的细胞死亡现象后，增加2倍浓度的给药剂量进行共培养，如此反复换液，传代，定期进行细胞耐药性检测，如此不间断给药培养60天，使细胞耐药后IC50值对比母系细胞株大于100倍。之后再对细胞株进行无药培养，使得耐药株细胞保持稳定，得到PC-9吉非替尼耐药细胞株(PC-9gefitinib-resistance,PC-9GR)进行冻存，以便进行生物学分析。分析结构如图1和图2所示。
其中，图1为耐药细胞DDR1磷酸化的表达结果，图2为DDR1在A549细胞中的mRNA水平及WB表达水平，根据Liyun Miao等人(Med Oncol(2013)30:626)的报道，A549细胞在mRNA水平是正常细胞的三倍，同时WB也验证A549细胞中DDR1高表达。
3.2MTT操作步骤
(1)选取对数生长的正常肺细胞BEAS-2B,A431,PC-9,PC-9GR,并且将这些细胞消化，收集，并用细胞计数板进行计数。接着，将记过数的细胞稀释至合适的浓度(5*10^4个/mL～8*10^4个/mL)，按每孔100μL将稀释的细胞悬液用排枪加入96孔板中进行培养，并在同一块孔板上设置只含培养基的空白对照孔；
(2)加药处理：铺板过夜培养后，更换为新鲜培养基，每孔加入一系列浓度梯度稀释的，受试目标化合物药物作用72小时后，检测细胞的存活率；
(3)加入MTT进行检测：将20μL的MTT检测液，加入到96孔板的每个孔中，后将96孔板放置在37℃培养箱中，孵育四小时。
(4)吸出上清液，后用150μLDMSO溶解震荡10分钟，再用酶标仪在490nm波长下测出吸光度，并用公式算出抑制率。
3.3实验结果
3.3.1化合物对正常肺细胞BEAS-2B的毒性作用
本实验采用MTT法，在10μM的浓度下，检测正常肺细胞BEAS-2B在被受试目标化合物作用下的存活率，以作为接下来实验的一个最基本的参考。结果如图3所示，在10μM下，所有受试目标化合物对应的细胞存活率，均在70％以上。表明这批化合物在10μM下安全可靠，可做进一步的研究与探讨。
3.3.2化合物对三种非小细胞肺癌细胞的作用
本实验采用的也是MTT法，在10μM的浓度下，检测所有4,6-二取代嘧啶二胺类衍生物对三种肿瘤细胞(PC-9(EGFR L858R突变)、A549细胞和PC-9GR细胞)的抑制作用，结果见图4～6，其中，图4为10μM下化合物对PC-9(EGFR L858R突变)细胞的抑制率，图5为10μM下化合物对A549细胞的抑制率，图6为化合物对PC-9GR细胞的抑制率，由图4～6可知，部分化合物的效果超过了50％。
根据以上受试化合物对两种肺癌细胞的初筛结果，归纳分析可得化合物C1、对两种细胞都起作用，且效果不错。我们进一步筛选出了C1,对A549(DDR1高表达)和PC-9GR(DDR1高表达)的IC50值。为这些化合物设定六种浓度(20μM，10μM，1.0μM，0.50μM，0.10μM和0.01μM)。分别用不同浓度的各种化合物处理两种肺癌细胞系，包括A549和PC-9GR。获得光密度(OD)值并计算抑制率，并通过GraphPad Prism 5软件计算不同化合物的IC50。结果如表4所示。结果表明化合物C1对两种细胞的IC50分别为3.18±0.68和1.59±0.36，而且特别是对PC-9GR细胞活性优于先导YFQ07的IC50值1.8±0.81。
表4
Figure GDA0003520123460000231
实施例4集落实验
4.1实验操作步骤
(1)取对数生长期的A549细胞观察其形态和数量，当培养到生长状态较好，基本可以满足实验要求的时候，再用胰酶消化细胞，并用血细胞计数器进行计数，随后在六孔板中以2000个每孔，每孔2ml培养基加入六个孔。然后在37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中培养。
(2)加药：待到细胞贴壁了，再换2ml的含10％胎牛血清的1640培养基，每孔依次加入不同浓度的C1 2μL，浓度依次为1μM，2.5μM，5μM，10μM，并且设置DMSO为阴性对照组。将细胞培养皿放置在37℃，5％CO2的培养箱中培养，每隔两天换一次培养基，并且加入对应浓度的药。一般培养15天。
(3)结晶紫染色：当培养皿底部出现肉眼可见的克隆时，停止培养，吸出培养基，并用PBS洗涤两至三次，每次每孔加入2mL，再用4％的多聚甲醛固定20min后，用PBS洗涤三次2-3次，每次加2mL PBS，把多聚甲醛去除干净，再用结晶紫染色10min后，PBS洗涤2-3次，把结晶紫除去干净，最后用照相机拍照。试验结果见图7。
4.2分析与讨论
非小细胞肺癌细胞往往对环境有较强的独立生存能力和较大的适应性，细胞集落形成率很高，能在极低密度下迅速生长繁殖，形成细胞团并最终生长成癌灶。本文应用非小细胞肺癌细胞集落形成实验考察C1对肺癌细胞集落形成能力的影响。结果表明，在A549细胞中，C1浓度依耐性(1μM、2.5μM、5μM)地抑制细胞集落形成能力。
实施例5迁移实验
5.1实验操作步骤
(1)在铺板前，在六孔板底部用记号笔划三条平行的直线，每孔都画，保持位置一致。
(2)取对数期生长的A549铺到六孔板中，5×105个/孔，贴壁长满为宜。
(3)用黄枪头比着直尺，在垂直于步骤(1)中三条平行线的地方划痕，并保持每孔划痕位置一致。吸去培养基，用PBS洗三次，加入含FBS的培养基1ml/孔，拍照，作为空白对照。
(4)向两种细胞中加入药物C1，在2.5，1，0.5，0.1，0.05，0.01μM浓度下检测其对细胞的迁移作用。
(5)在0，6，12，24,48h下检测拍照。每个时间点拍照之前将细胞用PBS洗三次。结果见图8。
5.2实验结果
C1在不同时间点对A549的迁移抑制作用肿瘤细胞除了过分增殖与抗凋亡之外，还有迁移侵袭的特点，因此，本实验还通过细胞划痕的方法，在5，1，0.5μM三个浓度下，分别测试C1对A549细胞的在不同时间点0，6，12，24,48h下的迁移抑制作用，观察C1对相应敏感细胞有无迁移阻滞作用。
5.3分析与讨论
本实验通过细胞划痕的方法，在2.5，1，0.5μM三个浓度下分别测试C1对A549细胞的在不同时间点0，6，12，24,48h下的迁移抑制作用，结果如图8所示。从A549迁移结果中可以看出，C1在0.05μM已经显示出了明显的抑制作用，随着时间的增长，其抑制作用相对于空白对照来说有明显的效果，且迁移抑制作用可持续48h。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类靶向DDR1小分子抑制剂，其特征在于，所述化合物为C1，结构式如下:
Figure FDA0003520123450000011
2.一种如权利要求1所述的N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类靶向DDR1小分子抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于治疗癌症。
3.根据权利要求2所述的N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类靶向DDR1小分子抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于抑制结肠癌或肺癌。
4.根据权利要求2所述的N-取代(5-氯-6-(取代苯氧基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺类靶向DDR1小分子抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。
CN202010576531.0A 2020-06-22 2020-06-22 一种4-酰胺取代嘧啶类靶向ddr1抑制剂及其制备和抗肿瘤活性的应用 Active CN112110864B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010576531.0A CN112110864B (zh) 2020-06-22 2020-06-22 一种4-酰胺取代嘧啶类靶向ddr1抑制剂及其制备和抗肿瘤活性的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010576531.0A CN112110864B (zh) 2020-06-22 2020-06-22 一种4-酰胺取代嘧啶类靶向ddr1抑制剂及其制备和抗肿瘤活性的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112110864A CN112110864A (zh) 2020-12-22
CN112110864B true CN112110864B (zh) 2022-07-22

Family

ID=73799639

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010576531.0A Active CN112110864B (zh) 2020-06-22 2020-06-22 一种4-酰胺取代嘧啶类靶向ddr1抑制剂及其制备和抗肿瘤活性的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112110864B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113956234B (zh) * 2021-10-27 2023-07-21 温州医科大学 一种n-苯基取代1h-吲唑-3-胺类化合物及其制备和抗肿瘤活性的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ547517A (en) * 2004-02-27 2009-04-30 Eisai R&D Man Co Ltd Novel pyridine and pyrimidine derivatives for hepatocyte growth and tumour inihibition
CN108368060B (zh) * 2017-12-21 2020-09-15 中国科学院合肥物质科学研究院 一类嘧啶类衍生物激酶抑制剂
CN109053593B (zh) * 2018-08-07 2020-12-04 温州医科大学 1-(2,6-氯苯基)-3-(取代嘧啶-4-基)脲类化合物及其制备和应用
CN110563657B (zh) * 2019-07-05 2024-05-03 温州医科大学 一种1-(2,6-二氯苯基)-3-取代脲类结肠癌抑制剂及其制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112110864A (zh) 2020-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104292170B (zh) 具有抗肿瘤作用的喹唑啉-芳基脲衍生物及其应用
EP1870414A1 (en) Thienopyridine derivative, or quinoline derivative, or quinazoline derivative, having c-met autophosphorylation inhibiting potency
EP2896620A1 (en) Alkynyl heteroaromatic ring compound and application thereof
EP3312180A1 (en) Use of pteridinone derivative serving as egfr inhibitor
CN104367575B (zh) 一种Bouchardatine和Bouchardatine衍生物及其制备方法和应用
CN108101926B (zh) 含喹啉酮的嘧啶并五元杂环类化合物、制备方法及其应用
CN105705493A (zh) 喹唑啉衍生物、其制备方法、药物组合物和应用
CN112110864B (zh) 一种4-酰胺取代嘧啶类靶向ddr1抑制剂及其制备和抗肿瘤活性的应用
Mularski et al. The p53 stabilizing agent CP-31398 and multi-kinase inhibitors. Designing, synthesizing and screening of styrylquinazoline series
CN116987066A (zh) 一种嘧啶类化合物及其制备方法和应用
RU2468022C2 (ru) Производные дигидроиндолона
CN107721975A (zh) 具有抗肿瘤活性的brd4小分子抑制剂、合成方法及其应用
CN109320473A (zh) 噻唑氨基苯甲酰胺乙酸衍生物及其用途
CN109053592A (zh) 1-(2,5-二甲氧基苯基)-3-(取代嘧啶-4-基)脲类化合物及其制备和应用
CN109053593A (zh) 1-(2,6-氯苯基)-3-(取代嘧啶-4-基)脲类化合物及其制备和应用
CN110357852B (zh) 苯并嘧啶类化合物、制备方法和用途
CN115466245B (zh) 一种嘧啶联吡啶的异羟肟酸类衍生物及其制备方法与应用
CN113583007B (zh) 一种吡咯并嘧啶类btk抑制剂及其制备方法与应用
CN109456279A (zh) 噻唑氨基苯甲酰胺乙酸酯衍生物及其用途
CN111777562B (zh) 一种6-苯氧基取代嘧啶类靶向ddr1抑制剂及其制备和抗肿瘤活性的应用
CN109053594A (zh) 1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(取代嘧啶-4-基)脲类化合物及其制备和应用
KR101789934B1 (ko) 상피세포성장인자수용체 변이체를 가진 종양 진단 및 종양 성장 억제 활성을 갖는 신규 화합물 및 이를 포함하는 의학적 용도
CN114805304A (zh) 一类含1-甲基-1h-吲哚结构的4-甲氧基苯基-1,3-二胺衍生物及其应用
WO2014071824A1 (zh) 4-氨基喹唑啉杂环化合物及其用途
CN110256465A (zh) 一种含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wang Xuebao

Inventor after: Chen Bo

Inventor after: Ye Faqing

Inventor after: Du Zongxuan

Inventor after: Yang Xiaojiao

Inventor after: Qian Jinheng

Inventor after: Tu Sijun

Inventor after: Xie Zixin

Inventor after: Zhang Yuan

Inventor before: Ye Faqing

Inventor before: Chen Bo

Inventor before: Du Zongxuan

Inventor before: Yang Xiaojiao

Inventor before: Qian Jinheng

Inventor before: Tu Sijun

Inventor before: Xie Zixin

Inventor before: Zhang Yuan

Inventor before: Wang Xuebao

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant