CN110256465A

CN110256465A - 一种含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶及其应用

Info

Publication number: CN110256465A
Application number: CN201910632176.1A
Authority: CN
Inventors: 赵培亮; 刁鹏程
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2019-07-13
Filing date: 2019-07-13
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-07-13
Also published as: CN110256465B

Abstract

本发明涉及一种含二氢吡喃并噻唑的2,4‑二氨基嘧啶，该2,4‑二氨基嘧啶的化学结构如下式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，R为氨基或甲基。本发明所述的含二氢吡喃并噻唑的2,4‑二氨基嘧啶能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)，特别是CDK2，控制宫颈、结肠、肝肿瘤细胞增殖的效果显著。

Description

一种含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶及其应用

技术领域

本发明涉及含氮杂环化合物，具体涉及含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶。该化合物可以抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)。

背景技术

近年来，肿瘤已超越心血管疾病，成为全球第一大死亡疾病。研究发现，恶性肿瘤的发生、发展均与细胞周期调控功能紊乱有关，因此，调节或阻断细胞周期是治疗肿瘤的重要途径。

CDKs已经成为当前新型抗癌药物研发的热点领域。目前发现的CDK亚型共有21个(CDK1–21)，不同亚型的CDKs都含有一个约300个氨基酸组成的保守性催化中心。在细胞周期不同时期中，不同cyclins的集聚与相应CDKs结合并被激活。根据经典的细胞周期模型，直接参与细胞周期各时相转换即在细胞周期调控中起重要作用的CDK，包括CDK1、CDK2、CDK4、CDK6等亚型。Cyclin D与CDK4及CDK6结合后在G1期发挥着重要作用；CDK2/cyclin E可以促使细胞从G1期进入S期；cyclin A分别与CDK2及CDK1结合后，可以促使细胞周期完成S期的转换，准备进入M期；而M期的进入和调节则是在CDKl/cyclinB的控制下完成的。其中，CDK2可与周期蛋白E1结合使底物磷酸化，控制G1时期的进行，由于正常细胞通常在G0～G1时期之间休眠，要缓解肿瘤细胞对正常细胞的威胁，在G1阶段抑制肿瘤细胞生长要比在细胞周期的其它阶段的程度大，且对正常细胞的毒副作用较小，因此，近年来，CDK2已经成为基于CDKs抗肿瘤药物设计中最吸引人的一个靶标，同时也已被列为最具前景的肿瘤治疗靶点之一，因而备受关注。此外，CDK靶向治疗与现有药物进行组合治疗，可获得更好的临床效果。相比许多现有的抗肿瘤药物，CDK靶向抗癌治疗具有更多的潜在性优点，因为它们不直接与DNA相互作用，所以应当能够降低继发的肿瘤发展的风险。

公开号为CN 107903256 A专利申请公开了一种含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶，该化合物能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)，控制乳腺或结肠肿瘤细胞增殖；公开号为WO 03/018022A1专利申请的实施例7公开了一种3-[4-(5-叔丁基异恶唑-3-基氨基)-嘧啶-2-基氨基]苯磺酰胺，该化合物对蛋白激酶CDK1-4具有抑制作用，具有治疗结肠癌、肺癌、宫颈癌的效果。但是上述两种化合物抑制宫颈、肝癌或结肠肿瘤细胞增殖的效果仍不够理想。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶，该2,4-二氨基嘧啶控制宫颈、肝癌或结肠肿瘤细胞增殖的效果显著。

本发明解决上述技术问题的方案如下：

一种含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶，该2,4-二氨基嘧啶的化学结构如下式(Ⅰ)所示，

式(Ⅰ)中，R为氨基或甲基。

本发明所述的含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶优选为下述化合物之一：

N²-(4-磺酰胺基苯基)-N⁴-(6,7-二氢-4H-吡喃并[4,3-d]噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶，

N²-(4-甲磺酰基苯基)-N⁴-(6,7-二氢-4H-吡喃并[4,3-d]噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶。

上述含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基-5-甲基嘧啶的制备方法包括以下步骤：

(1)将化学式II所示的2,4-二氯-5-甲基嘧啶和化学式III所示的2-氨基-6,7-二氢-4H-吡喃并[4,3-d]噻唑按照反应式(V)反应，制备得化学式IV所示的N⁴-(6,7-二氢-4H-吡喃并[4,3-d]噻唑-2-基)-2氯-5-甲基嘧啶；

(2)将化学式(IV)所示的N⁴-(6,7-二氢-4H-吡喃并[4,3-d]噻唑-2-基)-2氯-5甲基嘧啶和化学式VI所示的取代苯胺按照反应式(VII)反应，制备得到化学式(I)所示的含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基-5-甲基嘧啶。

上述反应式(VII)中，R为胺基或甲基。

上述的含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶具有抑制CDK2的活性，控制宫颈、肝或结肠肿瘤细胞增殖的效果显著，可用于制备抗肿瘤药物；所述的抗肿瘤药物由所述的含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶和医学上可接受的辅料组成。

以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

具体实施方式

下述实施例1-7所述制备方法的反式均为发明内容中的反应式(V)和(VII)。

实施例1[制备化合物N²-(4-磺酰胺基苯基)-N⁴-(6,7-二氢-4H-吡喃并[4,3-d]噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰa)]

将2.2mmol N⁴-(6,7-二氢-4H-吡喃并[4,3-d]噻唑-2-基)-2-氯-5-甲基嘧啶，2.0mmol 4-磺酰胺基苯胺和4.4mmol无水氯化铝加入15ml无水乙二醇甲醚中，冰浴下搅拌1小时后，加入2.2mmol DIPEA，继续在冰浴下搅拌30分钟后，开始升温加热至120℃反应15-20小时，TLC检测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相用饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用石油醚：乙酸乙酯进行柱层析得到白色固体粉末0.135克，mp290.1–291.3℃。

将所得到的白色固体采用核磁共振谱、高分辨质谱进行鉴定，鉴定结果为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:2.17(s,3H,CH₃),2.71(s,2H,CH₂),3.96(s,2H,CH₂),4.73(s,2H,CH₂),7.16(s,2H,NH₂),7.71(d,J＝7.2Hz,2H,ArH),7.95(d,J＝7.2Hz,2H,ArH),8.07(s,1H,ArH),9.36(s,1H,NH),10.77(s,1H,NH).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:157.22,156.38,144.25,136.26,126.72,118.70,65.04,63.56,27.16,13.61.HRMS(ESI)m/z:calcd forC₁₇H₁₈N₆O₃S₂[M+H]⁺419.0960,found 419.0954.由上述鉴定结果可知，所得白色固体为N²-(4-磺酰胺基苯基)-N⁴-(6,7-二氢-4H-吡喃并[4,3-d]噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为66.2％。

实施例2[制备N²-(4-甲磺酰基苯基)-N⁴-(6,7-二氢-4H-吡喃并[4,3-d]噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰb)]

将2.2mmol N⁴-(6,7-二氢-4H-吡喃并[4,3-d]噻唑-2-基)-2-氯-5-甲基嘧啶，2.0mmol 4-甲磺酰基苯胺和4.4mmol无水氯化铝加入15ml无水乙二醇甲醚中，冰浴下搅拌1小时后，加入2.2mmol DIPEA，继续在冰浴下搅拌30分钟后，开始升温加热至120℃反应15-20小时，TLC检测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，静置分液，有机相用饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体，将固体用石油醚：乙酸乙酯进行柱层析得到白色固体粉末0.129克，mp256.7–258.2℃。

将所得到的白色固体采用核磁共振谱、高分辨质谱进行鉴定，鉴定结果为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:2.18(s,3H,CH₃),2.71(s,2H,CH₂),3.15(s,3H,CH₃),3.96(s,2H,CH₂),4.74(s,2H,CH₂),7.79(d,J＝8.4Hz,2H,ArH),8.07(t,J＝9.0Hz,3H,ArH),9.50(s,1H,NH),10.80(s,1H,NH).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:157.05,156.30,145.92,132.36,128.18,118.78,65.03,63.56,44.44,13.63.HRMS(ESI)m/z:calcd for C₁₈H₁₉N₅O₃S₂[M+H]⁺418.1007,found418.0999.由上述鉴定结果可知，所得白色固体为N²-(4-甲磺酰基苯基)-N⁴-(6,7-二氢-4H-吡喃并[4,3-d]噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为经计算本例所述方法的产率为65.5％。

实施例3(抗肿瘤活性研究)

本发明化合物的抗肿瘤活性采用如下方法测试所证明。这些效果表明本发明化合物可用于治疗癌症，特别是治疗实体肿瘤，如结肠癌、宫颈癌和肝癌。具体测试方法如下：

采用MTT法检测实施例1～4所制备的化合物(编号依次为Ⅰa～Ⅰd)的体外抗肿瘤活性。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，以4×10³-5×10³个/mL接种于96孔板，孵育12-24h。待细胞贴壁后，加入不同浓度的药物，设置1.875，3.75，7.5，15，30，60μmol/l共6个浓度梯度，每个浓度4个复孔。置37℃、5％CO₂培养箱，开始计时培养。在加药48h后取出96孔板，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃继续培养4h。然后，小心吸弃孔内上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min，使结晶物溶解。选择570nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(OD值)。最后进行数据统计，以OD值(570nm)为纵轴，处理时间为横轴，描绘药物对细胞生长的抑制作用效果。按下列公式计算抑制率，抑制率＝(1-加药组OD值/对照组OD值)×100％。用CompuSyn软件计算半数抑制量IC₅₀。

测活性结果如表1所示：

将实验得到的数据采用GraphPad Prism 5.01软件进行统计分析，结果见下表1。

表1抗肿瘤活性的比较

阳性对照品和对照品分别与样品Ⅰa～Ⅰb比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

上表中的阳性对照品是公开号为WO 03/018022A1专利申请实施例7中所公开的化合物3-[4-(5-叔丁基异恶唑-3-基氨基)-嘧啶-2-基氨基]苯磺酰胺，其结构式为对照品是公开号为CN 107903256 A专利申请实施例7所公开的化合物N^2-(4-甲磺酰基苯基)-N⁴-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶，其结构式为

根据上述体外实验结果，我们可以看出具有式(Ⅰ)结构的化合物对HCT116、Hela和HepG2三种人类肿瘤细胞具有较强的抑制作用，效果均明显优于上述阳性对照品及对照品的抑制活性。

实施例4(CDK2酶抑制活性实验)

(1)药物的配制：用DMSO配制成10 mM的母液，超声加速溶解，后用DMSO

及激酶缓冲液进行梯度稀释，保证DMSO的终浓度小于1％；(2)激酶反应缓冲液的成份：40 mM Tris，pH 7.4，10 mM MgCl2，0.1 mg/ml BSA,1 mM DTT，10μM ATP；(3)详细的实验步骤为：在白色的酶标板上，每孔加1 ul的药物，然后加入10μl CDK2/Cyclin A2酶混匀，再加5μl的Histone H1底物，后加入34μl的分析缓冲液，混匀，在30℃孵育40分钟，然后加入ATP检测液50μl，室温反应5分钟，立即

在酶标仪上检测化学发光信号，酶活性大小与化学发光数值成反比，将数值代入如下公式，计算活性百分率：

％activity＝{(Lu药物–Lu本底)/(Lu酶–Lu本底)}×100％用Graphpad Prism5软件处理，计算出化合物的IC50值。

表2为本发明化合物的体外酶学抑制活性结果。

表2化合物Ⅰa～Ⅰd的CDK2酶活性

样品Ⅰa～Ⅰb与阳性对照品和对照品比较，***P<0.001

本实施例中的阳性对照品和对照品均与实施例3相同。

实验结论：

从表2可见，本发明化合物均对CDK2蛋白激酶有较强的抑制作用，体外酶学抑制活性(IC₅₀)均小于0.05μM，体外活性较好，效果显著优于阳性对照品和对照品。

Claims

1.一种含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶，该2,4-二氨基嘧啶的化学结构如下式(Ⅰ)所示，

式(Ⅰ)中，R为氨基或甲基。

2.根据权利要求1所述的一种含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶，该2,4-二氨基嘧啶为下述化合物中的一种：

3.权利要求1或者2所述的含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物由所述的含二氢吡喃并噻唑的2,4-二氨基嘧啶和医学上可接受的辅料组成。