CN107903256A - 一种含取代噻唑的2,4‑二氨基嘧啶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含取代噻唑的2,4‑二氨基嘧啶,该2,4‑二氨基嘧啶的化学结构如下式(Ⅰ)所示,式(Ⅰ)中,R1是氢、氟或甲基,R2为氢,R3是氢、甲基,R4为4‑甲磺酰基苯基、4‑磺酰胺基苯基、4‑甲氧基苯基、3,4,5‑三甲氧基苯基或3‑硝基苯基。本发明所述的含取代噻唑的2,4‑二氨基嘧啶能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs),特别是CDK2,控制乳腺或结肠肿瘤细胞增殖的效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及含氮杂环化合物,具体涉及含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶。该化合物可以抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)。
背景技术
肿瘤是一类渐进性细胞周期调控机制被破坏的疾病,恶性肿瘤的发生、发展均与细胞周期调控功能紊乱有关,因此,调节或阻断细胞周期是治疗肿瘤的重要途径。
近年来,随着对细胞周期调控机制的深入研究,尤其是揭示了细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)在细胞周期调控中的核心地位以来,CDKs已经成为当前新型抗癌药物研发的热点领域。目前发现的CDK亚型共有13个(CDK1–13),不同亚型的CDKs都含有一个约300个氨基酸组成的保守性催化中心。在细胞周期不同时期中,不同cyclins的集聚与相应CDKs结合并被激活。根据经典的细胞周期模型,直接参与细胞周期各时相转换即在细胞周期调控中起重要作用的CDK,包括CDK1、CDK2、CDK4、CDK6等亚型。Cyclin D与CDK4及CDK6结合后在G1期发挥着重要作用;CDK2/cyclin E可以促使细胞从G1期进入S期;cyclin A分别与CDK2及CDK1结合后,可以促使细胞周期完成S期的转换,准备进入M期;而M期的进入和调节则是在CDKl/cyclinB的控制下完成的。其中,CDK2可与周期蛋白E1结合使底物磷酸化,控制G1时期的进行,由于正常细胞通常在G0~G1时期之间休眠,要缓解肿瘤细胞对正常细胞的威胁,在G1阶段抑制肿瘤细胞生长要比在细胞周期的其它阶段的程度大,且对正常细胞的毒副作用较小,因此,近年来,CDK2已经成为基于CDKs抗肿瘤药物设计中最吸引人的一个靶标,同时也已被列为最具前景的肿瘤治疗靶点之一,因而备受关注。
美国专利US2008/0096899A1披露了一种治疗肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌等癌症的Imatinib及其类似物的制备方法。Imatinib(商品名:Gleevec)是最早上市的小分子蛋白激酶抑制剂,用于治疗慢性粒细胞白血病以及胃肠道间质细胞瘤的治疗。虽然刚上市时在肿瘤治疗中取得了令人瞩目的成就,但是随着使用时间的延长及治疗病例的增多,问题逐渐暴露出来。其中一是由耐药性问题而造成药物的肿瘤治疗效果明显下降;二是此类药物的使用面相当局限,必须是其靶激酶高表达或过度激活的病例才能发挥其疗效。因此,为了扩大肿瘤适应症研究范围,进一步提高药物的肿瘤治疗效果,寻找和发现新型的蛋白激酶抑制剂作为抗肿瘤药物,具有非常迫切的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶,该2,4-二氨基嘧啶控制乳腺或结肠肿瘤细胞增殖的效果显著。
本发明解决上述技术问题的方案如下:
一种含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶,该2,4-二氨基嘧啶的化学结构如下式(Ⅰ)所示,
式(Ⅰ)中,R1是氢、氟、氯、甲基或甲氧基,R2为氢,R3是氢、甲基或氟,R4为4-甲磺酰基苯基、4-磺酰胺基苯基、4-甲氧基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基或3-硝基苯基。
本发明所述的含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶优选为下述化合物之一:
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(3-硝基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶。
上述含取代噻唑的2,4-二氨基-5-取代嘧啶的制备方法包括以下步骤:
(1)将化学式II所示的2,4-氨基-5-取代嘧啶和化学式III所示的2-氨基-4,5-二取代噻唑按照反应式(V)反应,制备得化学式IV所示的N4-取代噻唑基-2氯-5-取代嘧啶;
(2)将化学式(IV)所示的N4-取代噻唑基-2氯-5-取代嘧啶和化学式VI所示的取代苯胺按照反应式(VII)反应,制备得到化学式(I)所示的含取代噻唑的2,4-二氨基-5-取代嘧啶
上述反应式(V)和(VII)中,R1是氢、氟、氯、甲基或甲氧基,R2为氢,R3是氢、甲基或氟,R4为4-甲磺酰基苯基、4-磺酰胺基苯基、4-甲氧基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基、3-硝基苯基或4-溴苯基、4-氟苯基。
上述的含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶具有抑制CDK2的活性,控制乳腺或结肠肿瘤细胞增殖的效果显著,可用于制备抗肿瘤药物;所述的抗肿瘤药物由权利要求1所述的含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶和医学上可接受的辅料组成。
采用MTT法标准操作程序测定本发明所述的含取代噻唑的2,4-二氨基-5-取代嘧啶的抗肿瘤活性,发现该类化合物具有较好的抗肿瘤活性。采用流式细胞仪技术进一步研究了对结肠癌细胞细胞周期的影响,发现该类化合物能明显的将细胞生长阻滞在G2/M期,并表现出剂量依赖效应。
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为本发明所述的2,4-二氨基嘧啶对不同细胞浓度肿瘤细胞HCT116周期影响的流式结果图,其中,A图为Control,B图的细胞浓度为0.2μM,C图的细胞浓度为0.4μM,D图的细胞浓度为0.8μM。
具体实施方式
下述实施例1-18所述制备方法的反式均为发明内容中的反应式(V)和(VII)。
实施例1、制备N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰa)
将2.2mmol N4-(噻唑-2基-)-2-氯-嘧啶和2.0mmol 4-甲磺酰基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中,搅拌,加热至回流,反应30分钟后,加入0.2ml浓盐酸,TLC监测,反应结束后,将反应液倾入100mL水中,用乙酸乙酯(100mL×3)萃取,静置分液,有机相分别用5%的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,抽滤,减压除去乙酸乙酯得白色固体,将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.305克,mp278.1–279.2℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定,鉴定结果为:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.17(s,3H,CH3),6.62(d,J=5.6Hz,1H,ArH),7.24(d,J=3.6Hz,1H,ArH),7.47(d,J=3.6Hz,1H,ArH),7.82(dd,J1=1.8Hz,J2=7.0Hz,2H,ArH),8.07(dd,J1=2.0Hz,J2=7.2Hz,2H,ArH),8.25(d,J=5.6Hz,1H,ArH),9.75(br,1H,NH),11.56(br,1H,NH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:44.4,100.7,113.6,114.8,119.2,128.2,132.7,138.3,145.6,157.0,157.9,158.8,159.0.ESI-MS:m/z=346.6[M+1]-.Anal.Calcd.forC14H13N5O2S2:C 48.40,H 3.77,N 20.16,S 18.46;Found C48.03,H 3.92,N 20.29,S18.57.由上述鉴定结果可知,所得白固体为N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,其结构式为经计算本例所述方法的产率为44.0%。
实施例2、制备N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰb)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-2氯-嘧啶和2.0mmol 4-磺酰胺基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中,搅拌,加热至回流,反应30分钟后,加入0.2ml浓盐酸,TLC监测,反应结束后,将反应液倾入100mL水中,用乙酸乙酯(100mL×3)萃取,静置分液,有机相分别用5%的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,抽滤,减压除去乙酸乙酯得白色固体,将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.609克,mp277.2–279.8℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定,鉴定结果为:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:6.59(d,J=6.0Hz,1H,ArH),7.19(br,2H,NH),7.21(d,J=3.6Hz,1H,ArH),7.46(d,J=3.2Hz,1H,ArH),7.74(d,J=8.4Hz,2H,ArH),7.96(d,J=8.4Hz,2H,ArH),8.22(d,J=5.6Hz,1H,ArH),9.61(br,1H,NH),11.53(br,1H,NH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:100.3,113.5,119.1,126.8,136.7,138.3,143.9,157.1,157.9,159.0,159.1.ESI-MS:m/z=347.5[M+1]-.Anal.Calcd.For C13H12N6O2S2:C 44.82,H 3.47,N24.12,S 18.41;Found C 44.84,H 3.639,N 24.31,S 18.49.由上述鉴定结果可知,所得白固体为N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,其结构式为经计算本例所述方法的产率为87.8%。
实施例3、制备N2-(4-甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰc)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-甲氧基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中,搅拌,加热至回流,反应30分钟后,加入0.2ml浓盐酸,TLC监测,反应结束后,将反应液倾入100mL水中,用乙酸乙酯(100mL×3)萃取,静置分液,有机相分别用5%的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,抽滤,减压除去乙酸乙酯得白色固体,将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.518克,mp 237.8–240.9℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定,鉴定结果为:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.74(s,3H,OCH3),6.41(d,J=5.6Hz,1H,ArH),6.89(d,J=8.8Hz,2H,ArH),7.14(d,J=3.6Hz,1H,ArH),7.42(d,J=3.6Hz,1H,ArH),7.58(d,J=8.8Hz,2H,ArH),8.09(d,J=5.6Hz,1H,NH),9.00(br,1H,NH),11.37(br,1H,NH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:55.6,98.6,113.3,114.0,122.9,133.5,138.1,155.1,157.1,157.7,159.2,159.8.ESI-MS:m/z=298.3[M+1]-.Anal.Calcd.for C14H13N5OS:C 56.17,H 4.38,N23.40,S 10.71;Found C 56.45,H 4.59,N 23.71,S 10.31.由上述鉴定结果可知,所得白固体为N2-(4-甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,其结构式为经计算本例所述方法的产率为86.7%。
实施例4、制备N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰd)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 3,4,5-三甲氧基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中,搅拌,加热至回流,反应30分钟后,加入0.2ml浓盐酸,TLC监测,反应结束后,将反应液倾入100mL水中,用乙酸乙酯(100mL×3)萃取,静置分液,有机相分别用5%的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,抽滤,减压除去乙酸乙酯得白色固体,将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.567克,mp210.4–212.3℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定,鉴定结果为:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.64(s,3H,OCH3),3.75(s,6H,2×OCH3),6.46(d,J=5.6Hz,1H,ArH),7.16(d,J=4.0Hz,3H,ArH),7.44(d,J=3.6Hz,1H,ArH),8.16(d,J=6.0Hz,1H,ArH),9.03(s,1H,NH),11.44(s,1H,NH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:56.1,60.6,98.7,99.2,113.2,133.0,136.7,138.2,152.9,157.1,157.7,159.1,159.4.ESI-MS:m/z=360.9[M+1]+.Anal.Calcd.for C16H17N5O3S:C 53.47,H 4.77,N 19.49,S 8.92;Found C 53.14,H4.838,N 19.59,S 8.563.由上述鉴定结果可知,所得白固体为N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,其结构式为经计算本例所述方法的产率为78.6%。
实施例5、制备N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰe)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-磺酰胺基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中,搅拌,加热至回流,反应30分钟后,加入0.2ml浓盐酸,TLC监测,反应结束后,将反应液倾入100mL水中,用乙酸乙酯(100mL×3)萃取,静置分液,有机相分别用5%的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,抽滤,减压除去乙酸乙酯得白色固体,将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.341克,mp270.3–272.7℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定,鉴定结果为:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.18(br,2H,NH),7.27(d,J=4.0Hz,1H,ArH),7.51(d,J=4.0Hz,1H,ArH),7.73(d,J=8.8Hz,2H,ArH),7.91(d,J=8.8Hz,2H,ArH),8.28(d,J=3.2Hz,1H,ArH),9.62(br,1H,NH),11.97(br,1H,NH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:112.9,113.7,118.7,126.8,127.8,136.5,140.5,141.6,141.8,142.9,144.0,147.7,148.4,154.8,159.5.ESI-MS:m/z=365.3[M+1]-.Anal.Calcd.for C13H11FN6O2S2:C42.62,H 3.03,N22.94,S 17.50;Found C 42.26,H 3.286,N 22.98,S 17.67.由上述鉴定结果可知,所得白固体为N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶,其结构式为经计算本例所述方法的产率为46.7%。
实施例6、制备N2-(3-硝基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰf)
将2.2mmol N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 3-硝基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中,搅拌,加热至回流,反应30分钟后,加入0.2ml浓盐酸,TLC监测,反应结束后,将反应液倾入100mL水中,用乙酸乙酯(100mL×3)萃取,静置分液,有机相分别用5%的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,抽滤,减压除去乙酸乙酯得白色固体,将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.367克,mp292.7–295.5℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定,鉴定结果为:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:2.34(s,3H,CH3),7.16(s,1H,ArH),7.57(t,J=8.0Hz,1H,ArH),7.80(d,J=7.6Hz,1H,ArH),8.13(d,J=8.0Hz,1H,ArH),8.26(s,J=2.4Hz,1H,ArH),8.79(s,1H,ArH),9.69(br,1H,NH),11.86(br,1H,NH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:11.9,113.5,116.0,125.5,125.8,130.0,141.2,141.4,142.3,148.4,149.1,154.8,158.7.ESI-MS:m/z=345.4[M+1]-.Anal.Calcd.for C14H11FN6O2S:C 48.55,H3.20,N 24.27,S 9.26;Found C 48.37,H 3.472,N 24.42,S 9.567.由上述鉴定结果可知,所得白固体为N2-(3-硝基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶,其结构式为经计算本例所述方法的产率为53.1%。
实施例7、制备N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰg)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-甲磺酰基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中,搅拌,加热至回流,反应30分钟后,加入0.2ml浓盐酸,TLC监测,反应结束后,将反应液倾入100mL水中,用乙酸乙酯(100mL×3)萃取,静置分液,有机相分别用5%的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,抽滤,减压除去乙酸乙酯得白色固体,将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.278克,mp278.1–280.2℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定,鉴定结果为:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.16(s,3H,CH3),7.29(d,J=3.6Hz,1H,ArH),7.51(d,J=4.0Hz,1H,ArH),7.81(d,J=8.8Hz,2H,ArH),8.02(d,J=8.8Hz,2H,ArH),8.30(d,J=3.2Hz,1H,ArH),9.76(br,1H,NH),12.08(s,1H,NH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:44.4,113.7,118.7,128.3,132.6,136.0,140.7,141.5,141.7,145.6,148.5,154.6,159.6.ESI-MS:m/z=364.3[M+1]-.Anal.Calcd.for C14H12FN5O2S2:C 46.02,H3.31,N 19.17,S 17.55;Found C 46.03,H 3.245,N 19.29,S 17.32.由上述鉴定结果可知,所得白固体为N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶,其结构式为经计算本例所述方法的产率为38.1%.
实施例8、制备N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰh)
将2.2mmol N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-甲磺酰基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中,搅拌,加热至回流,反应30分钟后,加入0.2ml浓盐酸,TLC监测,反应结束后,将反应液倾入100mL水中,用乙酸乙酯(100mL×3)萃取,静置分液,有机相分别用5%的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,抽滤,减压除去乙酸乙酯得白色固体,将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.342克,mp290.7–292.3℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定,鉴定结果为:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:2.37(s,3H,CH3),3.16(s,3H,CH3),6.58(d,J=6.0Hz,1H,ArH),7.12(d,J=1.2Hz,1H,ArH),7.82(d,J=8.8Hz,2H,ArH),8.07(d,J=8.8Hz,2H,ArH),8.21(d,J=4.0Hz,1H,ArH),9.69(br,1H,NH),11.35(br,1H,NH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:11.7,44.4,100.6,119.3,126.4,128.2,132.8,135.3,145.6,156.9,157.3,157.9,158.8.ESI-MS:m/z=360.3[M+1]-.Anal.Calcd.for C15H15N5O2S2:C49.84,H 4.18,N 19.38,S 17.74;Found C 50.04,H 4.115,N 19.59,S 17.63.由上述鉴定结果可知,所得白固体为N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,其结构式为经计算本例所述方法的产率为47.4%
实施例9、制备N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰi)
将2.2mmol N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-甲磺酰基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中,搅拌,加热至回流,反应30分钟后,加入0.2ml浓盐酸,TLC监测,反应结束后,将反应液倾入100mL水中,用乙酸乙酯(100mL×3)萃取,静置分液,有机相分别用5%的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,抽滤,减压除去乙酸乙酯得白色固体,将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.34克,mp286.1–288.2℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定,鉴定结果为:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:2.37(s,3H,CH3),6.55(d,J=5.6Hz,1H,ArH),7.12(d,J=1.2Hz,1H,ArH),7.19(br,2H,NH),7.73(d,J=8.8Hz,2H,ArH),7.97(d,J=8.8Hz,2H,ArH),8.19(d,J=5.6Hz,1H,ArH),9.56(br,1H,NH),11.32(br,1H,NH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:11.7,100.2,119.3,126.4,126.7,135.2,136.7,143.9,156.7,157.4,157.9,158.9.ESI-MS:m/z=361.3[M+1]-.Anal.Calcd.for C14H14N6O2S2:C46.40,H3.89,N 23.19,S 17.6;Found C 46.34,H 3.847,N 23.00,S 17.95.由上述鉴定结果可知,所得白固体为N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,其结构式为经计算本例所述方法的产率为47.1%
实施例10、制备N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰj)
将2.2mmol N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-甲磺酰基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中,搅拌,加热至回流,反应30分钟后,加入0.2ml浓盐酸,TLC监测,反应结束后,将反应液倾入100mL水中,用乙酸乙酯(100mL×3)萃取,静置分液,有机相分别用5%的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,抽滤,减压除去乙酸乙酯得白色固体,将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.345克,mp 239.5–241.3℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定,鉴定结果为:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:2.18(s,3H,CH3),2.38(s,3H,CH3),3.16(s,3H,CH3),7.17(s,1H,ArH),7.80(d,J=8.4Hz,2H,ArH),8.06(t,J=6.2Hz,3H,ArH),9.50(br,1H,NH),10.60(br,1H,NH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ;11.7,13.7,44.5,108.8,118.9,126.5,128.2,132.3,146.0,156.2,156.7,157.2,157.9.ESI-MS:m/z=374.3[M+1]-.Anal.Calcd.forC16H17N5O2S2:C 51.18,H 4.56,N 18.65,S 17.08;Found C 51.34,H 4.626,N 19.0,S17.23.由上述鉴定结果可知,所得白固体为N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶,其结构式为经计算本例所述方法的产率46.2%
实施例11、制备N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶(Ⅰk)
将2.2mmol N4-(噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶和2.0mmol 4-磺酰胺基苯胺加入15ml无水乙二醇乙醚中,搅拌,加热至回流,反应30分钟后,加入0.2ml浓盐酸,TLC监测,反应结束后,将反应液倾入100mL水中,用乙酸乙酯(100mL×3)萃取,静置分液,有机相分别用5%的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,抽滤,减压除去乙酸乙酯得白色固体,将固体用热的甲醇洗涤三次得到白色固体粉末0.347克,mp238.4–239.3℃。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱、质谱及元素分析技术进行鉴定,鉴定结果为:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:2.20(s,3H,CH3),7.16(br,2H,NH),7.24(s,1H,ArH),7.51(d,J=2.8Hz,1H,ArH),7.72(d,J=8..4Hz,2H,ArH),7.95(d,J=8.8Hz,2H,ArH),8.09(s,1H,ArH),9.41(br,1H,NH),10.75(br,1H,NH).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:13.7,108.4,113.8,118.6,126.8,136.2,137.8,144.3,156.5,157.3,159.5.ESI-MS:m/z=361.4[M+1]-.Anal.Calcd.for C14H14N6O2S2:C 46.40,H 3.89,N 23.19,S 17.69;Found C 46.20,H3.774,N 23.26,S 17.39.由上述鉴定结果可知,所得白固体为N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶,其结构式为经计算本例所述方法的产率为48.3%。
实施例12(抗肿瘤活性研究)
本发明化合物的抗肿瘤活性采用如下方法测试所证明。这些效果表明本发明化合物可用于治疗癌症,特别是治疗实体肿瘤,如结肠癌、宫颈癌和肺癌。具体测试方法如下:
采用MTT法检测实施例1~18所制备的化合物(编号依次为Ⅰa~Ⅰr)的体外抗肿瘤活性。收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,以6×103-8×103个/mL接种于96孔板,孵育12-24h。待细胞贴壁后,加入不同浓度的药物,设置1.875,3.75,7.5,15,30,60ug/ml共6个浓度梯度,每个浓度4个复孔。置37℃、5%CO2培养箱,开始计时培养。在加药48h后取出96孔板,每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL,37℃继续培养4h。然后,小心吸弃孔内上清液,每孔加入150μL DMSO,震荡10min,使结晶物溶解。选择570nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(OD值)。最后进行数据统计,以OD值(570nm)为纵轴,处理时间为横轴,描绘药物对细胞生长的抑制作用效果。按下列公式计算抑制率,抑制率=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%。用CompuSyn软件计算半数抑制量IC50。
测活性结果如表1所示:
表1化合物Ⅰa~Ⅰt的抗肿瘤活性
上表中的阳性对照品为市适用售的氟尿嘧啶,对照品是公开号为US2008/0096899A1的美国专利申请实施例中所公开的4-(4-甲基-1-哌嗪)甲基-N-4-甲基-3-4-(3-吡啶)-2-嘧啶氨基苯基-苯甲酰胺,该化合物所制成的药物已上市,名称为Imatinib(中文名为伊马替尼)。
根据上述体外实验结果,我们可以看出具有式(Ⅰ)结构的化合物对HCT116、Hela和HepG2三种人类肿瘤细胞具有较强的抑制作用,均明显优于阳性对照品氟尿嘧啶与对照品Imatinib的抑制活性。
3、CDK2酶抑制活性
(1)药物的配制:用DMSO配制成10mM的母液,超声加速溶解,后用DMSO
及激酶缓冲液进行梯度稀释,保证DMSO的终浓度小于1%;(2)激酶反应缓冲液的成份:40mM Tris,pH 7.4,10mM MgCl2,0.1mg/ml BSA,1mM DTT,10μM ATP;(3)详细的实验步骤为:在白色的酶标板上,每孔加1ul的药物,然后加入10μl CDK2/Cyclin A2酶混匀,再加5μl的Histone H1底物,后加入34μl的分析缓冲液,混匀,在30℃孵育40分钟,然后加入ATP检测液50μl,室温反应5分钟,立即
在酶标仪上检测化学发光信号,酶活性大小与化学发光数值成反比,将数值代入如下公式,计算活性百分率:
%activity={(Lu药物–Lu本底)/(Lu酶–Lu本底)}×100%
用Graphpad Prism5软件处理,计算出化合物的IC50值。
上述体外酶活性实验的结果在下表中给出。
表2化合物Ⅰa~Ⅰt的CDK2酶活性
4、实施例9所制备的化合物Ⅰi对肿瘤细胞周期的影响
在MTT检测结果的基础上,我们采用流式细胞仪对实施例13所制备的化合物Ⅰi对结肠癌细胞HCT116细胞周期的影响进行了检测,结果如图1所示。
由图1可见,化合物Ⅰi可以改变结肠癌细胞HCT116在各周期数目分布的比例,明显的将细胞生长阻滞在G2/M期,而G1期细胞数目都相应的有所下降,并表现出剂量依赖效应。
Claims (4)
1.一种含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶,该2,4-二氨基嘧啶的化学结构如下式(Ⅰ)所示,
式(Ⅰ)中,R1是氢、氟或甲基,R2为氢,R3是氢、甲基,R4为4-甲磺酰基苯基、4-磺酰胺基苯基、4-甲氧基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基或3-硝基苯基。
2.根据权利要求1所述的一种含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶,该2,4-二氨基嘧啶为下述化合物中的一种:
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(3-硝基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-氟-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-甲磺酰基苯基)-N4-(5-甲基-噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶,
N2-(4-磺酰胺基苯基)-N4-(噻唑-2-基)-5-甲基-2,4-二氨基嘧啶。
3.权利要求1或者2所述的含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的抗肿瘤药物由权利要求1所述的含取代噻唑的2,4-二氨基嘧啶和医学上可接受的辅料组成。
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