MX2011004643A - Compuestos acenafto heterocíclico, compuestos de inclusión y complejos con ciclodextrina y sus usos en la fabricación de inhibidores de proteínas de la familia bcl-2, análogos de bh3. - Google Patents
Compuestos acenafto heterocíclico, compuestos de inclusión y complejos con ciclodextrina y sus usos en la fabricación de inhibidores de proteínas de la familia bcl-2, análogos de bh3.Info
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Abstract
La presente invención se relaciona con compuestos heterocíclicos acenafto, sus compuestos de inclusión y complejos con ciclodextrina y con sus usos en la fabricación de inhibidores de proteínas de la familia Bcl-2, análogos de BH3. Los compuestos heterocíclicos acenafto se obtienen al introducir grupos oxo-, tio-, carbonilo, éster o acilo en las posición 3-, 4- y 6- del 8-oxo-8H- acenafto[1,2-b]pirrol-9-carbonitrilo o la posterior sustitución del grupo 9-ciano con carboxilo, éster o amida. Los compuestos pueden simular la proteína BH3-only, unirse en forma competitiva y antagonizar a las proteínas Bcl-2, Bcl-XL y Mcl-in vitro o vía intracelular, para inducir apoptosis celular. Los compuestos de inclusión y complejos con ciclodextrina pueden mejorar los efectos. Por lo tanto, se pueden usar en la fabricación de compuestos antineoplásicos.
Description
COMPUESTOS HETEROCÍCLICOS ACENAFTO, COMPUESTOS DE INCLUSIÓN Y COMPLEJOS CON CICLODEXTRINA Y SUS USOS EN LA FABRICACIÓN DE INHIBIDORES DE PROTEÍNAS DE LA FAMILIA BCL-2, ANÁLOGOS
DE BH3
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con un nuevo tipo de compuestos heterocíclicos acenafto y sus compuestos de inclusión o complejos con ciclodextrina, preparados por medio de nanotecnología . Los compuestos pueden simular la proteína BH3 -only, unirse en forma competitiva y antagonizar a las proteínas Bcl-2, Bcl-xL y Mcl-1 in vitro e in vivo, para inducir apoptosis celular. Por lo tanto, se pueden usar como compuestos antineoplasicos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El medicamento antineoplásico de molécula dirigida se está convirtiendo en un punto crítico en la investigación y desarrollo de nuevos medicamentos y en una nueva generación de productos en comercialización después de los agentes citotóxicos, como antineoplásicos . La proteína Bcl-2 es el objetivo o blanco molecular más importante para antagonizar e invertir la inmortalidad de tumores malignos. Por lo tanto, al antagonizar de manera específica la proteína Bcl-2 se lograrán las metas de la
7375.0001
terapia para combatir el cáncer. Entre los inhibidores de Bel-2, los análogos de BH3 (miméticos de BH3) exhiben el efecto antineoplásico más notable, la mayor actividad farmacodinámica y los efectos secundarios menos tóxicos. Por otra parte, estos inhibidores también tienen que tener capacidad antagónica de amplio espectro respecto a los miembros antiapoptósicos (que incluyen las proteínas Bcl-2, Bcl-xL y Mcl-1) de la familia Bcl-2.
Sin embargo, hasta ahora, aun no se comercializan productos antineoplásicos que utilicen la Bcl-2 como objetivo. Entre los 19 inhibidores de Bcl-2 preclínicos existentes, 3 productos óptimos están en pruebas clínicas de fase I, fase II y fase III, respectivamente, éstos son ABT-737 investigado y desarrollado por Abbott Laboratories, Illinois, EE.UU; Obatoclax (GX15-070) investigado y desarrollado por Gemin X; y AT-101 investigado y desarrollado por Ascenta en EE.UU. Todos éstos son análogos de BH3. La constante de unión competitiva llega hasta grado n con la proteína Bcl-2, que es mucho mayor que otras 15 moléculas similares. Sin embargo, todas tienen las siguientes deficiencias: el grado en el que son análogos de BH3 el gosipol y el obatoclax es insuficiente, no son análogos absolutos de BH3 , es decir, tienen citotoxicidad independiente de BAX/BAK. Esto indica que existen otros puntos como objetivo, así que tienen efectos secundarios
tóxicos. Debido a esta deficiencia, el ocbatoclax se enfrenta con el riesgo de eliminación. Aun cuando el ABT-737 es el análogo absoluto del BH3, no puede reaccionar con Mcl-1 y no puede inhibir las proteínas de la familia Bcl-2 con amplio espectro, lo cual limita mucho el alcance de su aplicación.
Los inventores de la presente describieron una serie de compuestos heterocíclicos acenafto del 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo y expusieron que estos compuestos tenían actividad para inhibir el crecimiento tumoral al inducir apoptosis celular (patente china, Comunicado autorizado Núm. CN1304370C) . Sin embargo, como medicamento antineoplásico con base en la apoptosis, su investigación y desarrollo enfrenta las mismas dificultades que los medicamentos similares, la complejidad del acceso de la señal de apoptosis, la potencial e intensiva citotoxicidad así como la inevitable ceguera que resulta de tomar la medicina. Todas, son importantes razones que llevan a la ineficacia en el desarrollo de estos medicamentos similares. Por lo tanto, se deberá enfatizar en forma destacada el efecto dirigido de los medicamentos en el transcurso de la investigación.
Por otra parte, las propiedades fisicoquímicas de los medicamentos son factores que tienen gran influencia en la aparición del efecto farmacológico y también pueden
influir en la exactitud de la evaluación del efecto farmacológico durante el desarrollo de medicamentos. Estos aspectos se han señalado durante el periodo de investigación inicial. Anteriormente, el estudio y la aplicación de estos compuestos estuvieron muy limitados debido a la poca solubilidad en agua.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención está dirigida a proporcionar compuestos heterocíclicos acenafto, que tienen mayor capacidad de direccionamiento y se pueden usar como inhibidores de proteínas de la familia Bcl-2 (que incluye las proteínas Bcl-2, Bcl-xL y Mcl-1) , análogos de BH3 ; y sobre esta base mejorar la solubilidad en agua y la disponibilidad biológica al combinarse con la nanotecnología contemporánea por medio de la inclusión o formación de complejos con ciclodextrina para desarrollar totalmente sus usos como formulación antineoplásica dirigida.
Los compuestos heterocíclicos acenafto de la presente invención tienen la siguiente fórmula estructural:
R1, R2, R3 y R4 son los grupos sustituyentes en las posiciones 3-, 4-, 6- y 9-, respectivamente,
en donde :
(I) R1=XR5, tiofeno metoxilo, tiofeno metilamino o tiomorfolinilo, R2=H, R3 =H, R4=CN, COOH, COOR6 o CONHR7;
(II) R^H, R2=XR5, tiofeno metoxilo, tiofeno metilamino o tiomorfolinilo, R3=H, R4=CN, COOH, COOR6 o CONHR7 ;
(III) R'=H, R2=H, R3=H, XR5, tetrahidropiran-4-oxi-, tetrahidrotiapiran-4-oxi- , tiofen metoxilo, tiofen metilamino o tiomorfolinilo, R4=CN;
(IV) R^XR5, R2=H, R3=XR5, R=CN;
en donde :
X=0, S, carbonilo, éster o amida;
R5= a: (CH2)nAr -(o,m,p) Y, Y = CH3, N02, Ph, F,
Cl, Br, CF3, OCH3( SCH3 O NH2 ; n=0~4;
b: tetrahidropirano o tetrahidrotiapirano;
R6 = CH3 o C2H5;
R7 = CH3, C2H5 o Ar.
Los compuestos de la presente invención se pueden sintetizar a través de las dos rutas siguientes:
En la primera ruta, la materia prima 8-oxo-8íí-acenafto [1 , 2 -b] irrol-9-carbonitrilo que tiene excelente coplanaridad rígida e intensa deficiencia de electrones tiende a la reacción de sustitución nucleofílica de
hidrógenos aromáticos con reactivos nucleofílieos como alcohol, tioalcohol, fenol o tiofenol y se obtienen 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9-carbonitrilos sustituidos en 3-, 4- ó 6-. Después de que el carbonitrilo se hidroliza, esterifica y forma la amida, se obtienen el éster y la amida del ácido correspondientes. La fórmula de la reacción es la siguiente:
El 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo en el disolvente (tetrahidrofurano, acetonitrilo, piridina, dimetilformamida o dimetil sulfóxido) reacciona con la cantidad correcta de reactivos nucleofílieos como alcohol, tioalcohol, fenol o tiofenol a la temperatura de 20-100°C durante 0.5-24 horas. Después de enfriamiento, algo de disolvente se evapora bajo condiciones de descompresión. Luego, se puede obtener el producto 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo 3 ó 6 monosustituido, por filtración o directamente por cromatografía en columna.
En presencia de ácido sulfúrico concentrado, el 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo 3- ó 6-monosustituido se puede hidrolizar formando los ácidos
correspondientes, luego, al reaccionar con los alcoholes y aminas correspondientes, se pueden obtener los respectivos compuestos ésteres o amidas.
En la segunda ruta, la materia prima acenafteno quinina y el ácido sulfúrico concentrado se adicionan en bromo líquido y se someten a reflujo durante 2 horas para obtener bromoacenafteño quinina. El bromoacenafteño resultante reacciona con alcohol, tioalcohol, fenol o tiofenol para obtener la correspondiente acenafteno quinina sustituida. La acenafteno quinina sustituida resultante reacciona con acetonitrilo en condiciones débilmente acidas, por ejemplo, en gel de sílice, para obtener 3- (2-oxo-2H-acenafteño) -malonitrilo . Después, los productos de reacción se catalizan con K2C03 y se someten a reflujo con acetonitrilo durante 0.5-6 horas. Luego se enfría y se evapora algo de disolvente en condiciones de descompresión. El producto oxi-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo 3 ó 4 monosustituido, se obtiene por filtración o directamente por cromatografía en columna. Las condiciones de la posterior hidrólisis, esterificación, amidación son iguales a las de la primera ruta.
La diferencia entre la primera y la segunda ruta es: la sustitución ocurre antes de la formación del ciclo, de esta manera, se pueden obtener los dos isómeros, en las posiciones 3-, 4- además de las posiciones 3-, 6-. La
fórmula de la reacción es la siguiente:
Se han usado muchos métodos para detectar el nivel de análogos de BH3 y la inhibición frente a cl-1 y Bcl-2 para los compuestos obtenidos por las rutas anteriormente mencionadas. Los resultados demostraron que los compuestos heterocíclicos acenafto anteriormente mencionados tienen un nivel muy alto de análogo de BH3 y pueden inhibir con eficacia las proteínas Mcl-1 y Bcl-2. Debido a estos atributos, los compuestos se pueden usar para preparar inhibidores de proteínas de la familia Bcl-2,
análogos de BH3 , que se pueden usar para preparar medicamentos antineoplásicos con alta capacidad de direccionamiento .
Durante el proceso de investigación de compuestos heterocíclicos acenafto, también se ha descubierto que la poca solubilidad en agua es el aspecto más sobresaliente que limita mucho el estudio y la aplicación de los compuestos. Por favor, véase Modern Technique of Drug Preparation (Cyclodextrin Chemistr —preparation and application, Chemical Industry Press, 2009; ß-Cyclodextrin Inclusión Technique and Application, Medicine Innovation Research , 2006, 3(3): 31-33; Chem. Phar . Bull , 2006, 54(1) 26-32) . Otro aspecto de la presente invención consiste en formar compuestos de inclusión o complejos al introducir o acomplejar estos compuestos con ciclodextrina, por medio de lo cual se mejora la solubilidad en agua y aumenta de disponibilidad biológica.
Según la presente invención, los compuestos de inclusión con ciclodextrina a partir de los compuestos heterocíclicos acenafto anteriormente mencionados, se pueden preparar según el siguiente método:
0 pesar una cantidad de ciclodextrina y adicionarla a una cierta cantidad de agua, luego, calentar con agitación hasta que se forme la solución saturada, en donde la ciclodextrina es ß-ciclodextrina, ?-ciclodextrina ,
2-hidroxipropil-p-ciclodextrina, metil-p-ciclodextrina o hidroxipropil-y-ciclodextrina;
(D pesar una cantidad del compuesto heterocíclico acenafto para inclusión, en donde, la relación molar entre el compuesto y la ciclodextrina es 1:3-10;
(D disolver el compuesto heterocíclico acenafto para inclusión en acetona con una concentración de 5-10 mg/mL y añadir gota a gota la solución resultante a la solución acuosa de ciclodextrina en líneas, después calentar y agitar durante 1 a 6 días a temperatura de 40 a 65 °C hasta que el depósito se separa de allí;
© filtrar la solución obtenida y lavar la torta de filtración con una pequeña cantidad de agua destilada, luego, extraer los compuestos en estado libre con una pequeña cantidad de acetona. Después de secar a una temperatura de 50 a 70 °C y condiciones de vacío durante 24-48 horas, se obtiene el compuesto de inclusión en ciclodextrina del compuesto heterocíclico acenafto según la reivindicación 1.
Según la presente invención, los complejos con ciclodextrina a partir de los compuestos heterocíclicos acenafto anteriormente mencionados, se pueden preparar según el siguiente método:
© pesar ciclodextrina seca y el compuesto heterocíclico acenafto que va a formar el complejo, la
relación molecular entre la ciclodextrina y el compuesto heterocíclico acenafto es 1:1.5-3; en donde la ciclodextrina es ß-ciclodextrina, ?-ciclodextrina, 2-hidroxipropil-P-ciclodextrina, metil-P-ciclodextrina o hidroxipropil-?-ciclodextrina ;
(D mezclar el compuesto heterocíclico acenafto que formará el complejo, con N, ' -carbonildiimidazol en una relación molar de 1:1-2, luego, disolverlo en sulfóxido de dimetilo (DMSO) hasta que la concentración del compuesto heterocíclico acenafto que formará el complejo sea 0.2-0.5mmoles/mL en solución de DMSO, luego, agitar a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos,- ® Adicionar la ciclodextrina que se pesó en el paso © y adicionar 0.1-0.3 mmoles/mL de trietanolamina en la solución de DMSO y dejar que la reacción se lleve a cabo durante 18 a 24 horas a temperatura ambiente ,- © adicionar 0.50-1.0 mg/mL de acetona en el sistema de reacción del paso 3, la materia depositada se separa de allí en condiciones de descompresión;
© después de filtrar, purificar se obtiene el complejo de ciclodextrina del compuesto heterocíclico acenafto según la reivindicación 1.
La purificación se puede llevar a cabo en columna de intercambio iónico. Las condiciones consisten en utilizar una resina de intercambio iónico Diaion™ HP-20
como adsorbente y para la resolución una mezcla de disolventes constituida por metanol y agua. La cantidad de metanol en la mezcla disolvente se aumenta gradualmente y se usa cromatografía en capa fina para evaluar el proceso de elución. Cuando la cantidad de metanol en agua, en el eluyente llega a 40-55%, se obtienen algunos complejos al eluir. Después de que el metanol en el eluato resultante se elimina por centrifugación a presión reducida, la solución remanente se congela y se seca para obtener el complejo.
Según la presente invención, los compuestos de inclusión o complejos con ciclodextrina resultantes obtenidos a partir de los compuestos heterocíclicos acenafto, se caracterizan por técnicas de identificación como son el método de solubilidad de fase, el método espectrofluorométrico, espectroscopia de dicroísmo circular, espectrometría de infrarrojo, análisis termogravimétrico, microscopio electrónico de barrido y resonancia magnética nuclear protónica, espectrometría de masas, difracción de rayos X de monocristal, etc., y por la solubilidad de los compuestos heterocíclicos acenafto antes y después de la inclusión o la formación del complejo y se detecta la inhibición de las proteínas Mcl-1 y Bcl-2 con fines de comparación. Los resultados demostraron que los métodos de tratamiento al utilizar ciclodextrina, aumentan en forma notable la solubilidad en agua de los compuestos
heterocíclicos acenafto y detecta la capacidad de inhibición frente a las proteínas Mcl-1 y Bcl-2 para extender. La formulación también se puede usar para preparar inhibidores de proteínas de la familia Bcl-2, análogos de BH3 y utilizarlos después para preparar medicamentos antineoplásicos de alto direccionamiento .
Por lo tanto, otro objetivo de la presente invención es proporcionar los usos de los compuestos heterocíclicos acenafto anteriormente mencionados, sus compuestos de inclusión y complejos con ciclodextrina , en la fabricación de inhibidores de proteínas de la familia Bcl-2, análogos de BH3.
Los inhibidores de proteínas de la familia Bcl-2 anteriormente mencionados o los medicamentos antineoplásicos correspondientes, pueden consistir de la simple sustancia, los compuestos de inclusión o complejos con ciclodextrina de los compuestos o una composición que contenga una dosis eficaz de los compuestos heterocíclicos acenafto o sus compuestos de inclusión o complejos con ciclodextrina, en una cantidad moderada de coadyuvante farmacéutico, y se pueden disponer en la formulación deseada con base en los requisitos farmacéuticos y el método para preparar una formulación farmacéutica según la técnica anterior.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
En la presente invención se muestran 14 figuras, en donde :
La Figura 1 es la curva dinámica de los compuestos y el péptido FAM-Bid en unión competitiva con la proteína Bcl-2 detectada por el método de polarización de fluorescencia;
La Figura 2 muestra las interacciones entre Bcl-2 y Bax a nivel celular con interferencia de los compuestos (diferente concentración) ;
La Figura 3 muestra las interacciones entre Bcl-2 y Bax a nivel celular con interferencia de los compuestos (diferente tiempo de acción) ;
La Figura 4 muestra los resultados positivos del grado en el que son análogos de BH3 de los compuestos detectados por la proteína Bax y localización conjunta del condriosoma;
La Figura 5 muestra los resultados negativos del grado en el que son análogos de BH3 de los compuestos detectados por la proteína Bax y localización conjunta del condriosoma;
La Figura 6 muestra los resultados de toxicidad celular de los compuestos dependiente de BAX/BAK (el gosipol es una comparación no específica) ;
La Figura 7 es un electroferograma de
transferencia western que muestra la inhibición de los compuestos frente a Mcl-1;
La Figura 8 es un electroferograma de transferencia western que muestra la inhibición de los compuestos frente a Bcl-2;
La Figura 9 es la curva semicuantitativa que muestra la inhibición del compuesto 3-tiomorfolina-8-???-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo frente a la proteína Mcl-1;
La Figura 10 es la curva semicuantitativa que muestra la inhibición del compuesto 3-tiomorfolina-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo frente a la proteína Bcl-2;
La Figura 11 es un electroferograma de transferencia western que muestra la inhibición de los compuestos heterocíclicos acenafto y sus compuestos de inclusión y complejos con ciclodextrina frente a Mcl-1 y Bcl-2;
La Figura 12 es la curva semicuantitativa que muestra la inhibición del compuesto 3-tiomorfolina-8 -oxo-8íí-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9-carbonitrilo y sus compuestos de inclusión frente a la proteína Mcl-1;
La Figura 13 es la curva semicuantitativa que muestra la inhibición del compuesto 3 -tiomorfolina-8-???-8H-acenafto [1 , 2-b] pirrol- 9-carbonitrilo y sus compuestos de
inclusión frente a la proteína Bcl-2;
La Figura 14 es un electroferograma de transferencia western que muestra la inhibición de los compuestos y sus compuestos de inclusión frente a la proteína Mcl-1 en un modelo tumoral in vivo, en donde: 1. grupo de control blanco; 2. grupo de control ©; 3. grupo de control ©; 4. grupo experimental ©; 5. grupo experimental © ; 6. grupo experimental © ; 7. grupo experimental ©
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS
Ahora, se describirán en forma más completa varias modalidades de la presente invención considerando las figuras que la acompañan.
Parte I: Preparación y caracterización de compuestos heterocxclicos acenafto
Ejemplo 1: Síntesis y caracterización de 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo.
0.1 moles de acenafteno quinona, 0.11 moles de malononitrilo y 150 mL de acetonitrilo se adicionaron de manera consecutiva en matraz de una boca de 500 mL. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 4 horas hasta que el color cambió de amarillo pálido turbio a rojo naranja transparente. Después de que la mezcla de reacción
se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y se recolectó la torta de filtración de color rojo naranja para obtener el l-dicianometilen-2-oxo-acenafteño. 0.05 moles de 1-dicianometilen-2-oxo-acenafteño, lg de K2C03 y 200 mL de acetonitrilo se adicionaron de manera sucesiva en una matraz de boca única de 500 mL, la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 4 horas. Se separa gran cantidad de un sólido de color amarillo parduzco. Se filtró y se recolectó la torta de filtración y se lavó con abundante agua tibia, luego se secó y se pesó, el rendimiento fue de 95%.
P.f. 275-277°C; ?? NMR (400M, DMSO) : d 8.705 (d, J=8.0Hz,lH), 8.662 (d, J=8.8Hz, 1H) , 8.631 (d, J=8.0Hz,
1H) , 8.411 (d, J=8.0Hz, 1H) , 8.06 (t, J=8.0Hz,lH), 7.984 (t, J=8.0Hz, 1H) .
Ejemplo 2: Síntesis y caracterización de 3- (4-metilfenoxi) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2 -Jb] pirrol-9-carbonitrilo
lg de 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo y 0.47g de p-metilfenol se adicionaron a 50 mL de acetonitrilo. La mezcla se sometió a reflujo y agitación durante 3 horas. Se evaporó cierta cantidad de disolvente. El producto 3- (4-metilfenoxi) - 8 -oxo- 8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo se obtuvo a través de cromatografía en columna con un rendimiento de 40%.
Resultados de la determinación de la estructura. P.f. 232-233°C; 1H R (400M, CDC13 ) : d 8.916 (dd, J=8.8Hz, 1H), 8.623 (d, J=8.8Hz, 1H) , 8.447 (d, J=6.4Hz, 1H) , 7.859 (t, J=8.0Hz, 1H) , 8.324 (d, J=8.4Hz, 2H) , 7.101 (d, J=8.4Hz, 2H) , 7.016 (d, J=8.4Hz, 1H) , 3.256 (s, 3H) .
Ejemplo 3: Síntesis y caracterización de 3-fenoxi-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b]pirrol-9-carbonitrilo (A) y 4-fenoxi-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo (B)
0.93g de fenoxi acenafteno quinona y 0.3g de malononitrilo se pesaron y se disolvieron en diclorometano . La mezcla se aplicó en una columna de gel de sílice y se eluyó rápidamente. Después de que toda la mezcla pasó a través de la columna, se secó por centrifugación. Se obtuvo un residuo sólido de color rojo con un peso de 10.1 g y rendimiento de 92%. 0.08g de K2C03 y 20 mL de acetonitrilo se adicionaron a 0.6g de 3-fenoxi- (2-oxo-2J:í-acenafteño) -malononitrilo. La mezcla se calentó y sometió a reflujo durante 3 horas. Al término de la reacción, la solución de reacción se secó por centrifugación y se separó en columna de cromatografía (CH2C12: éter de petróleo = 2:1) y se obtuvo un sólido de color rojo naranja. La relación de isómeros es 1: 0.3 determinada por resonancia magnética nuclear. Los dos isómeros resultantes se separaron mediante separación en fase líquida.
El primer componente A: P.f. 265-267°C; XH NMR (400M, CDC13) : d 8.927 (d, J=8.0Hz, 1H) , 8.630 (d, J=8.8Hz, 1H) , 8.450 (d, J=7.2Hz, 1H) , 7.876 (t, J=8.0Hz,lH), 7.754 (t, J=8.0Hz,2H), 7.392 (t, J=7.6Hz, 1H) , 7.233 (d, J=7.6HZ, 2H) , 7.028 (d, J=8.4Hz,lH) .
El segundo componente B: P.f. 282-283°C; XH NMR (400M, CDC13) : d 9.047 (dd, J=8.0Hz, 1H) , 8.850 (dd, J=7.6Hz, 1H) , 8.213 (d, J=8.2Hz, 1H) , 7.999 (t, J=8.0Hz, 1H) , 7.561 (t, J=8.0Hz,2H), 7.410 (t, J=7.0Hz, 1H) , 7.251 (d, J=8.8Hz, 2H) , 6.899 (d, J=8.4Hz,lH) .
Ejemplo 4: Síntesis y caracterización de 3-(p-metilfenoxi) -8-oxo-8ff-acenafto [1, 2-b] irrol-9-carbonitrilo (A) y 4- (p-metilfenoxi) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] irrol-9-carbonitrilo (B)
lg de p-metilfenoxi acenafteno quinona y 0.3g de malononitrilo se disolvieron en diclorometano . La mezcla se aplicó en una columna de gel de sílice y se eluyó rápidamente. Después de que toda la mezcla pasó a través de la columna, se secó por centrifugación. Se obtuvo un residuo sólido de color rojo con un peso de 11.2 g y rendimiento de 93%. 0.08g de K2C03 y 20 mL de acetonitrilo se adicionaron a 0.7g de 3-fenoxi- (2-oxo-2H-acenafteño) -malononitrilo. La mezcla se calentó y sometió a reflujo durante 4 horas. Al término de la reacción, la solución de
reacción se secó por centrifugación y se separó en columna de cromatografía (CH2C12: éter de petróleo = 1:1) y se obtuvo un sólido de color rojo naranja. La relación de isómeros es 1: 0.4 determinada por resonancia magnética nuclear. Los dos isómeros resultantes se separaron mediante separación en fase líquida.
El primer componente A: P.f. 232-233°C; 1H NMR (400M, CDC13) : d 8.916 (dd, J=8.8Hz, 1H) , 8.623 (d, J=8.8Hz, 1H) , 8.447 (d, J=6.4Hz, 1H) , 7.859 (t, J=8.0Hz, 1H) , 8.324 (d, J=8.4Hz, 2H) , 7.101 (d, J=8.4Hz, 2H) , 7.016 (d, J=8.4Hz, 1H) , 2.351(8, 3H) .
El segundo componente B: P.f. 258-260°C; 1K NMR (400M, CDCI3) : d 8.987 (dd, J=8.8Hz, 1H) , 8.858 (d, J=8.8Hz, 1H) , 8.208 (d, J=8.4Hz, 1H) , 7.986 (t, J=8.0Hz, 1H) , 8.333 (d, J=8.4Hz, 2H) , 7.112 (d, J=8.4Hz, 2H) , 6.889 (d, J=8.4Hz, 1H) , 2.349(s, 3H) .
Ejemplo 5: Síntesis y caracterización de 3-(m-metilfeniltio) -8 -oxo-8H- acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo (A) y 4- (m-metilfeniltio) -8-OXO-8H-acenafto [1,2 -b] pirrol-9-carbonitrilo (B)
lg de m-metilfeniltio acenafteño quinona y 0.3g de malonitrilo se disolvieron en diclorometano . La mezcla se aplicó en una columna de gel de sílice y se eluyó rápidamente. Después de que toda la mezcla pasó a través de
la columna, se secó por centrifugación. Se obtuvo un residuo sólido de color rojo con un peso de 12.2 g y rendimiento de 91%. 0.08 g de K2C03 y 20 mL de acetonitrilo se adicionaron a 0.7 g de 2-feniltio- (2-oxo-2H-acenafteño) -malonitrilo. La mezcla se calentó y sometió a reflujo durante 4 horas. Al término de la reacción, la solución de reacción se secó por centrifugación y se separó en columna de cromatografía (CH2C12: éter de petróleo = 1:1) y se obtuvo un sólido de color rojo. La relación de isómeros es 1: 0.25 determinada por resonancia magnética nuclear. Los dos isómeros resultantes se separaron mediante separación en fase líquida.
El primer componente A: P.f. 255-257°C; ?? MR (400 , CDClj) : d 8.826 (dd, J=8.8Hz, 1H) , 8.513 (d, J=8.8Hz, 1H) , 8.327 (d, J=6.4Hz, 1H) , 7.659 (t, J=8.0Hz, 1H) , 8.014 (d, J=8.4Hz, 2H) , 6.901 (d, J=8.4Hz, 2H) , 6.896 (d, J=8.4Hz, 1H) , 2.353 (s, 3H) .
El segundo componente B: P.f. 269-271°C; H NMR (400M, CDClj) : d 8.877 (dd, J=8.8Hz, 1H) , 8.748 (d, J=8.8Hz, 1H) , 8.108 (d, J=8.4Hz, 1H) , 7.856 (t, J=8.0Hz, 1H) , 8.123 (d, J=8.4Hz, 2H) , 6.892 (d, J=8.4Hz, 2H) , 6.679 (d, J=8.4Hz, 1H) , 2.355 (s, 3H) .
Ejemplo 6: Síntesis y caracterización de 6-(tienil-2 -metoxi) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] irrol-9-
carbonitrilo
lg de 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo y 0.5 g de tieniltnetanol se adicionaron a 50 mL de acetonitrilo . La mezcla se sometió a reflujo durante 3 horas. Se evaporó cierta cantidad de disolvente. El producto 6- (2-tienilmetoxi) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b]pirrol-9-carbonitrilo se obtuvo a través de cromatografía en columna con un rendimiento de 45%.
P.f. 241-243°C; XH NMR (400M, CDC13) : d 8.685 (dd, J=8.7Hz,lH), 8.433 (d, J=8.7Hz, 1H) , 8.014 (d, J=6.4Hz, 1H) , 7.75 (t, J=8.0Hz, 1H) , 7.251 (t, J=8.4Hz, 1H) , 7.181 (d, J=8.4Hz, 1H) , 6.985 (d, J=8.4Hz, 1H) , 6.232 (d, J=8.4Hz, 1H) , 3.454 (s, 2H) .
Ejemplo 7: Síntesis y caracterización de 3- (3-fluorofenilformil) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo (A) y 4- (3-fluorofenilformil) -8-oxo-8ff-acenafto [1,2 -b] irrol-9-carbonitrilo (B)
lg de m-fluorofenilcarbonil acenafteno quinona y 0.4 g de malonitrilo se disolvieron en diclorometano . La mezcla se aplicó en una columna de gel de sílice y se eluyó rápidamente. Después de que toda la mezcla pasó a través de la columna, se secó por centrifugación. Se obtuvo un residuo sólido de color rojo carmesí con un peso de 10.5 g y rendimiento de 85%. 0.08g de K2C03 y 20 mL de acetonitrilo
se adicionaron a 0.8g de 2-fluorocarbonil- (2-oxo-2H-acenafteño) -malonitrilo y la mezcla se calentó y sometió a reflujo durante 3 horas. Al término de la reacción, la solución de reacción se secó por centrifugación y se separó en columna de cromatografía (CH2C12: éter de petróleo = 2:1) y se obtuvo un sólido de color rojo carmesí. La relación de isómeros es 1: 0.2 determinada por resonancia magnética nuclear. Los dos isómeros resultantes se separaron mediante separación en fase líquida.
El primer componente A: P.f. 285-287°C; H NMR
(400M, CDC13) : d 8.726 (dd, J=8.8Hz, 1H) , 8.423 (d, J=8.8Hz, 1H) , 8.015 (d, J=6.4Hz, 1H) , 7.598 (t, J=8.0Hz, 1H) , 8.003 (d, J=8.4Hz, 2H) , 6.853 (d, J=8.4Hz, 2H) , 6.756 (d, J=8.4Hz, 1H) .
El segundo componente B: P.f. 269-271°C; XH NMR
(400M, CDCI3) : d 8.568 (dd, J=8.8Hz, 1H) , 8.478 (d, J=8.8Hz, 1H) , 8.006 (d, J=8.4Hz, 1H) , 7.568 (t, J=8.0Hz, 1H) , 8.045 (d, J=8.4Hz, 2H) , 6.908 (d, J=8.4Hz, 2H) , 6.596 (d, J=8.4Hz, 1H) .
Ejemplo 8: Síntesis y caracterización de 3- (W-fenilformil) -8-OXO-8H- acenafto [1, 2 -b] pirrol- 9 -carbonitrilo (A) y 4- (iV-fenilformil) - 8-oxo- 8H- acenafto [1 , 2 -b] irrol- 9 -carbonitrilo (B)
lg de fenilamida acenafteño quinona y 0.4g de
malonitrilo se disolvieron en diclorometano . La mezcla se aplicó en una columna de gel de sílice y se eluyó rápidamente. Después de que toda la mezcla pasó a través de la columna, se secó por centrifugación. Se obtuvo un residuo sólido de color rojo carmesí con un peso de 11.2 g y rendimiento de 86%. 0.08 g de K2C03 y 20 mL de acetonitrilo se adicionaron a 0.8g de fenilamida- (2-oxo-2H-acenafteño) -malonitrilo . La mezcla se calentó y sometió a reflujo durante 3 horas. Al término de la reacción, la solución de reacción se secó por centrifugación y se separó en columna de cromatografía (CH2C12: éter de petróleo = 2:1) y se obtuvo un sólido de color rojo carmesí. La relación de isómeros es 1: 0.4 determinada por resonancia magnética nuclear. Los dos isómeros resultantes se separaron mediante separación en fase líquida.
El primer componente A: P.f. 281-283 °C; H NMR (400M, CDC13) : d 9.112 (d, J=8.0Hz, 1H) , 8.945 (d, J=8.8Hz, 1H) , 8.682 (d, J=7.2Hz, 1H) , 8.452 (t, J=8.0Hz,lH), 8.312 (s, 1H),7.986 (t, J=8.0Hz,2H), 7.627 (t, J=7.6Hz, 1H) , 7.433 (d, J=7.6Hz, 2H) , 7.241 (d, J=8.4Hz,lH).
El segundo componente B: P.f. 293 -294 °C; XH NMR (400M, CDCI3) : d 9.213 (dd, J=8.0Hz, 1H) , 9.012 (dd, J=7.6Hz, 1H) , 8.685 (d, J=8.2Hz, 1H) , 8.428 (t, J=8.0Hz,lH), 8.320 (s, 1H),7.896 (t, J=8.0Hz,2H), 7.675 (t, J=7.0Hz, 1H) , 7.531 (d, J=8.8Hz, 2H) , 7.015 (d,
J=8.4HZ, 1H)
Ejemplo 9: Síntesis y caracterización de 3-(tetrahidro-2ff-piranil-4-oxo) -8-oxo-8ií-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo (A) y 4- (tetrahidro-2H-piranil-4-oxo) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo (B)
1.0 g de tetrahidropiraniloxi acenafteno quinona y 0.4 g de malonitrilo se disolvieron en diclorometano . La mezcla se aplicó en una columna de gel de sílice y se eluyó rápidamente. Después de que toda la mezcla pasó a través de la columna, se secó por centrifugación. Se obtuvo un residuo sólido de color rojo carmesí con un peso de 11.2 g y rendimiento de 86%. 0.08g de K2C03 y 20 mL de acetonitrilo se adicionaron a 0.8 g de 4 - tetrahidropiranil- (2 -oxo-2H-acenafteno) -malonitrilo . La mezcla se calentó y sometió a reflujo durante 9 horas. Al término de la reacción, la solución de reacción se secó por centrifugación y se separó en columna de cromatografía (CH2C12: éter de petróleo = 2:1) y se obtuvo un sólido de color rojo obscuro. La relación de isómeros es 1: 0.4 determinada por resonancia magnética nuclear. Los dos isómeros resultantes se separaron mediante separación en fase líquida.
El primer componente A: P.f. 230-231°C; lH NMR (400M, CDC13) : d 8.601 (d, J=8.0Hz, 1H) , 8.134 (d, J=8.8Hz, 1H) , 7.945 (dd, J=8.0Hz, 1H) , 7.452 (d, J=8.4Hz,lH), 3.822
(t, J=4.8HZ ,4H), 3.815(t, J=5. OHz , 4H) , 3.766 (t, J=5.2Hz, 1H) .
El segundo componente B: P.f. 242-244°C; XH NMR
(400M, CDCI3) : d 8.568 (d, J=8.0Hz, 1H) , 8.115 (d, J=8.8Hz, 1H) , 7.856 (dd, J=8.0Hz, 1H) , 7.326 (d, J=8.4Hz,lH), 3.796
(t, J=4.8Hz ,4H), 3.807(t, J=5.0Hz ,4H), 3.791 (t, J=5.2Hz, 1H) .
Ejemplo 10: Síntesis y caracterización del ácido 3-fenoxi-8-oxo-8if-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carboxílico
60 mL ácido sulfúrico concentrado o 25ml de ácido sulfúrico fumante se adicionaron en un matraz de 50 mL de una sola boca. Se le adicionaron 0.05 moles de 3-fenoxi-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo en porciones y a una temperatura de 0-5°C en el transcurso de 1 hora. Después, la reacción se llevó a cabo durante otra 16 horas a temperatura ambiente y la mezcla de reacción resultante se presentó como un producto viscoso de color rojo pardo intenso. La mezcla resultante se adicionó lentamente sobre hielo triturado y se agitó bastante. Después, la mezcla se dejó reposar y se filtró. La torta de filtración se lavó con abundante agua hasta que se neutralizó. La torta de filtración se secó y se obtuvo un producto de color amarillo intenso con un rendimiento de 96%.
P.f. 248°C; XH NMR (400M, CDC13) : d 11.42
(s,lH),8.965 (dd, J=8.0Hz, 1H) , 8.750 (dd, J=7.8Hz, 1H) , 8.313 (d, J=8.2Hz, 1H) , 7.999 (t, J=8.2Hz , 1H) , 7.561 (t, J=8.2Hz,2H), 7.410 (t, J=7.0Hz, 1H) , 7.251 (d, J=8.8Hz, 2H) , 6.963 (d, J=8.4Hz,lH).
Ejemplo 11: Síntesis y caracterización de 3-fenoxi - 8 -oxo- 8H- acenaf o [ 1 , 2 -b] pirrol - 9 - carboxilato
0.01 moles de 3-fenoxi-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9-carbonitrilo, 50 mL de acetonitrilo como disolvente, 0.02 mmoles de 2C03 como reactivo de gasificación y yodometano en proporción diez veces mayor, se adicionaron en forma sucesiva en un matraz de 100 mi de una sola boca. En atmósfera inerte de nitrógeno, la mezcla se calentó hasta 40°C y la reacción se dejó durante 15 horas. El acetonitrilo se evaporó en condiciones de descompresión y el reactivo se disolvió por completo por adición de diclorometano . Después de la filtración, el filtrado se secó por centrifugación y se obtuvo un producto crudo de color amarillo. El producto de color amarillo intenso se obtuvo por separación en cromatografía en columna con gel de sílice (agente revelador: diclorometano-metanol = 40:1). El rendimiento fue de 92%.
P.f. 213°C; 'H NMR (400M, CDC13) : d 9.102 (d, J=7.2Hz,lH), 8.965 (dd, J=8.0Hz, 1H) , 8.850 (dd, J=7.8Hz, 1H) , 8.233 (d, J=8.2Hz, 1H) , 7.856(t, J=8.2Hz , 1H) , 7.453 (t,
J=8.2Hz,2H), 7.350 (t, J=7.2Hz, 1H) , 7.325 (d, J=8.4Hz, 2H) , 3.213 (s, 3H) .
Ejemplo 12: Síntesis y caracterización del ácido 3 - fenoxi - 8 -oxo- 8H-acenafto [1,2 -b] pirrol - 9 -N-ter-butilamida
0.01 moles de ácido 3-fenoxi-8-oxo-8tf-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9-carboxílico, 50 mi de dimetilformamida (DMF) como disolvente, 0.02 mmoles de trietilamina, 0.01 mmoles de (EtO) 2P (=0) CN y ter-butilamida en proporción diez veces mayor, se adicionaron en forma sucesiva un matraz de 100 mi de una sola boca y se dejaron reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Al término de la reacción se obtuvo un sólido de color amarillo. El rendimiento fue de 85%. P.f. 237°C; ? N R (400M, CDC13) : d 8.746 (dd, J=8.0Hz, 1H) , 8.650 (dd,
J=7.8Hz, 1H) , 8.213 (d, J=8.2Hz, 1H) , 7.846 (t, J=8.0Hz, 1H) , 7.352 (t, J=8.0Hz,2H), 7.210 (t, J=7.4Hz, 1H) , 7.051 (d, J=8.4Hz, 2H) , 6.963 (d, J=8.4Hz,lH), 3.721(s, 3H) , 3.113 (m, 2H) , 1.568 (dd, J=5.6Hz , 2H) , 1.421 (m, J=5.7Hz ,2H), 0.968 (t, J=6.2Hz , 3H) .
Ejemplo 13: Síntesis y caracterización de 3- (4-bromofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9 -carbonitrilo lg de 8-oxo-8H-acenafto [1 , 2-b] pirrol-9-carbonitrilo y 3.2 g de 4 -bromotiofenol se adicionaron a 50
mL de acetonitrilo y se dejaron reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Se evaporó cierta cantidad de disolvente. El compuesto 3- (4-bromofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo se obtuvo a través de cromatografía en columna con un rendimiento de 40%.
P.f. 262-263°C; 1H NMR (400M, CDC13): d 8.852 (dd, J=8.8Hz, 1H) , 8.813 (d, J=8.8Hz, 1H) , 8.015 (d, J=6.4Hz, 1H) , 7.945 (t, J=8.0Hz, 1H) , 7.560 (d, J=8.4Hz, 2H) , 7.096 (d, J=8.4Hz, 2H) , 7.006 (d, J=8.4Hz, 1H) .
Ejemplo 14: Síntesis y caracterización de 3,6-di (4-bromofeniltio) - 8 -oxo-8ff-acenafto [1, 2-b] irrol-9-carbonitrilo
lg de 8 -OXO-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo y 6.5 g de 4 -bromotiofenol se adicionaron a 50 mL de acetonitrilo y se dejaron reaccionar durante 36 horas a temperatura ambiente. Se evaporó cierta cantidad de disolvente. El compuesto 3 , 6-di (4 -bromofeniltio) - 8 -oxo- 8H-acenafto [1 , 2-b] pirrol-9-carbonitrilo se obtuvo a través de cromatografía en columna con un rendimiento de 20%.
P.f. 262-263°C; 1H NMR (400M, CDC13): d8.815 (dd, J=8.8Hz , lH), 8.671 (d, J=8.8Hz, 1H) , 7.881 (t, J=6.4Hz,
1H) , 7.551(q, J=8.0Hz, 4H) , 7.215 (q, J=8.4Hz, 4H) , 6.472 (S, 1H) .
Ejemplo 15: Síntesis y caracterización de 6- (4-
aminofeniltio) -8-oxo-8ií-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo lg de 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo y 2.5 g de 4 -aminotiofenol se adicionaron a 50 mL de acetonitrilo y se dejaron reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Se evaporó cierta cantidad de disolvente. El compuesto 6- (4 -aminofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9 -carbonitrilo se obtuvo a través de cromatografía en columna con un rendimiento de 30%.
P.f. 255-257°C; XH NMR (400M, CDC13) : d 8.832 (dd, J=8.8Hz, 1H) , 8.801 (d, J=8.8Hz, 1H) , 7.985 (d, J=6.4HZ, 1H) , 7.925 (t, J=8.0Hz, 1H) , 7.570 (d, J=8.4Hz, 2H) , 6.997 (d, J=8.4Hz, 2H) , 7.006 (d, J=8.4Hz, 1H) , 6.271 (s, 2H) .
Ejemplo 16: Síntesis y caracterización de 3,6-di (4-aminofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo
lg de 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo y 5.0 g de 4 -aminotiofenol se adicionaron a 50 mL de acetonitrilo y se dejaron reaccionar durante 30 horas a temperatura ambiente. Se evaporó cierta cantidad de disolvente. El compuesto 3 , 6-di (4-aminofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo se obtuvo a través de cromatografía en columna con un rendimiento de 25%. P.f. 288-290°C; XH NMR (400M, CDCl3): d 8.835 (dd, J=8.8Hz, 1H) , 8.682 (d, J=8.8Hz, 1H) , 7.973 (t, J=6.4Hz, 1H) , 7.581(q,
J=8.0Hz, 4H) , 7.234 (q, J=8.4Hz, 4H) , 6.651 (s, 1H) , 6.269 (s, 4H) .
Parte II: Preparación y caracterización de compuestos de inclusión y complejos de ciclodextrina con compuestos heterocíclicos acenafto
Esta parte incluye la preparación y caracterización de compuestos de inclusión y compuestos de compuestos heterocíclicos acenafto con ciclodextrina Los métodos de caracterización utilizados incluyen espectroscopia de ultravioleta, métodos espectrofluorométricos , espectroscopia de dicroísmo circular, espectroscopia de infrarrojo, análisis termogravimétrico y SEM. Por favor, consultar las siguientes fuentes para los instrumentos y métodos de detección ya que en esta Parte no se expondrá una explicación especial:
Diagrama de solubilidad de fases: se genera según el método descrito en J. Agrie. Food Chem. , 2007, 55 (9), 3535-3539.
Espectroscopia de ultravioleta: HP8453 (America) ; véase, Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 173 (2005) 319-327 para el método de detección.
Método espectrofluorométrico: PTI-700 (America) ; véase, J Fluoresc (2008) 18:1103-1114 para el método de
detección.
Espectroscopia de dicroísmo circular: J-810 (Japón); véase, J. Phys . Chem. B, 2006, 110 (13), 7044-7048 para el método de detección.
Espectroscopia de infrarrojo: FT/IR-430 (Japón) ; véase, Mol. Pharmaceutics , 2008, 5 (2), 358-363 para el método de detección.
Análisis termogravimétrico : TGA/SDT851e (Suiza) ; véase, Mol. Pharmaceutics, 2008, 5 (2), 358-363 para el método de detección.
SEM: JSM-5600LV (Japón); véase, J. Med. Chem. 2003, 46,
4634-4637 para el método de detección.
H NMR: Bruker Avancell 400M (Suiza) ; las condiciones de detección son (disolvente CDC13, 400M) .
Espectroscopia de masas: GC-Tof MS (Gran
Bretaña) ; véase, J. Org. Chem. 2000, 65, 9013-9021 para el método de detección.
Difracción de rayos X de monocristal: XD-3A
(Japón); véase, J. Org. Chem. 2008, 73, 8305-8316 8305 para el método de detección.
Ejemplo 17: Preparación y caracterización de compuestos de inclusión de b-ciclodextrina y 3-tiomorfolinil-8-oxo-8tf-acenafto [1, 2-b] pirrol - 9-carbonitrilo
En primer lugar, 1.85 g de ß-ciclodextrina (1.63
mMoles) recristalizada y totalmente seca, se adicionaron a 100 mL de agua, luego se calentaron y agitaron hasta disolución completa. Después de disolver con 35 mL de acetona, 0.179 g del compuesto a detectar (0.54 mMoles) se adicionaron gota a gota en solución acuosa de ß-ciclodextrina en líneas. La mezcla se calentó y se agitó durante 3 días a temperatura de 60°C, como resultado, algo del depósito se separó de allí. Se filtró y la torta de filtración se lavó con un pequeña cantidad de agua destilada. El compuesto en su estado libre se extrajo con una pequeña cantidad de acetona. Se obtuvo un sólido de color violeta después de secar durante 24 horas a vacío y a temperatura de 50°C.
Los resultados de la detección por medio de espectroscopia de ultravioleta indicaron que la absorción ultravioleta y la solubilidad del compuesto aumentaron con el incremento en la concentración de la ß-ciclodextrina . Esto confirmó que se habían formado los compuestos de inclusión correspondientes.
A partir de los resultados del diagrama de solubilidad de fase, se puede observar que la solubilidad del compuesto se incrementó 1.5 veces de 0.21 µ? a 0.36 µ?.
Los resultados de la detección por medio de espectroscopia de fluorescencia indicaron que el valor del espectro de fluorescencia aumento con el incremento de la
concentración de la ß-ciclodextrina en condiciones en las que la concentración del compuesto a detectar se mantuvo invariable. Cuando la longitud de onda de emisión de fluorescencia no cambió, pero aumentó la intensidad, porque después de la incorporación del compuesto en la cavidad de la ciclodextrina, el cambio ambiental en la cavidad protegió a las moléculas del compuesto en estado excitado evitando que estuvieran en contacto con gran volumen de moléculas y con el agente de inactivación. El cambio en el espectro de fluorescencia sugirió que el compuesto y la ß-ciclodextrina habían formado el correspondiente compuesto de inclusión.
Los resultados de la detección por medio de espectroscopia de dicroísmo circular indicaron que en presencia de ß-ciclodextrina, el dicroísmo circular inducido del compuesto a detectar exhibió un efecto Cotton intenso y positivo a 260 nm ~ 375 nm y un efecto Cotton débil y positivo a 400 nm ~ 500 nm. Esto sugirió que el efecto de dicroísmo circular inducido se había producido después de la entrada del compuesto en la cavidad quiral de la ß-ciclodextrina, lo cual indica que se había formado el compuesto de inclusión.
Los resultados de detección por medio de espectroscopia de infrarrojo indicaron que la ß-ciclodextrina mostró las bandas intensas de absorción a
3410.18 y 1029.22 cm"1, y mostró una serie de bandas de absorción características en la región de las huellas digitales a 579-911 cm"1. El compuesto mostró dos bandas de absorción finas características a 2218.55 cm"1 y 1625.08 cm" La intensidad reducida del pico de absorción característico a 2219.13 cm"1 y 1625.48 cm"1 y se observó en el espectro de infrarrojo un ligero desplazamiento. Mientras tanto, apareció un nuevo pico a 1706 cm"1, indicativo de que se había formado el compuesto de inclusión.
Los resultados de detección por medio de análisis termogravimétrico indicaron que la ß-ciclodextrina tuvo puntos de inflexión a 298°C y comenzó a degradarse. Sin embargo, a diferencia de la ß-ciclodextrina, el compuesto de inclusión presentó puntos de inflexión a 269°C y comenzó a degradarse, lo cual indicó que se había formado el compuesto de inclusión. El contenido de la ciclodextrina fue 73.1%, por lo tanto, el modelo de inclusión fue 1:1.
Los resultados del análisis SEM mostraron que el 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo tenía apariencia en forma de aguja, mientras que la ß-ciclodextrina tenía apariencia en forma de cuadrado más grande. El diagrama SEM de la mezcla del compuesto y la ß-ciclodextrina tenía una apariencia de formas mixtas de aguja y cuadrado. Sin embargo, el
compuesto de inclusión ß-ciclodextrina tenía apariencia en forma de diamante regular, que obviamente era diferente de los tres tipos ya mencionados. A partir de la obvia diferencia en la apariencia, se puede observar que se había formado el compuesto de inclusión.
Preparación y caracterización de otros compuestos de inclusión:
Igual que el Ejemplo 17, se incluyeron otros compuestos en la misma serie en diferentes clases de ciclodextrinas . Los productos también se caracterizaron por espectroscopia ultravioleta, método espectrofluorométrico, espectroscopia de dicroísmo circular, espectroscopia de infrarrojo, análisis termogravimétrico y SEM a fin de comprobar la formación de los compuestos de inclusión. El cambio en la solubilidad de los compuestos y sus compuestos de inclusión antes y después de la inclusión, se había determinado para fines de comparación a través del experimento de solubilidad de fases . Los resultados a detalle se presentan en la Tabla 1.
A partir de la Tabla 1 se puede observar que la solubilidad de los compuestos heterocíclicos acenafto incluidos en diferentes clases de ciclodextrinas aumentó mucho en comparación con la de los compuestos como tal.
Tabla 1
3- (4-aminofeniltio) -8-oxo-8H- 2-hidroxipropi 1 - & - 0.25 0.90 acenaf o [1 , 2-b] irrol- 9-carbonitrilo ciclodextrina
3-fenoxi-8-oxo-8íí-acenafto [1,2- 2-hidroxipropi 1 - [5 - 0.15 0.62 b] pirrol- 9-carboxilato ciclodextrina
3- (4-metoxifenoxi) -8-oxo-8/í- 2-hidroxipropi 1 - ß - 0.32 0.92 acenafto [1, 2-b] pirrol -9- carbonitrilo ciclodextrina
4- (4-isopropilfenoxi) -8-oxo-8/í- 2- idroxipropi 1- ß- 0.12 0.60 acenafto [1, 2-b] pirrol- 9-carbonitrilo ciclodextrina
3- (4 -bromofeniltio) -8-oxo-8fí- 2-hidroxipropi 1- ß- 0.18 0.91 acenafto [1, 2-b] irrol- 9-carbonitrilo ciclodextrina
6- (tienil-2-metoxi) -8-???-8?- metil-p- 0.35 0.52 acenafto [1 , 2-b] pirrol- 9-carbon trilo ciclodextrina
6- (tetrahidro-2fí-piranil-4-oxi) -8-oxo- metil- ß- 0.25 0.58 8/í-acenafto [1, 2-b] pirrol-9- ciclodextrina
carbonitrilo
6- (tienil-2-metilamino) -8-oxo-8H- metil-ß- 0.37 0.78 acenafto [1 , 2-b] irrol -9-carbonitrilo ciclodextrina
3- ( -bromofeniltio) -8-oxo-8fí- metil-ß- 0.18 0.35 acenafto [1, 2-b] pirrol- 9-carbonitrilo ciclodextrina
3- (4-aminofeniltio) -8-oxo-8íí- metil-ß- 0.25 0.61 acenafto [1 , -b] irrol - 9-carbonitrilo ciclodextrina
6- (4 -aminofeniltio) -8-oxo-8H- metil-ß- 0.28 0.85 acenaf o [1 , -b] irrol - 9-carbonitrilo ciclodextrina
3- (4 -bromofeniltio) -8-oxo-8H- hidroxipropil -?- 0.18 0.72 acenafto [1 , 2-b] irrol- 9-carbonitrilo ciclodextrina
3-feniltio-8-oxo-8fí-acenafto[l,2- hidroxipropi 1-?- 0.22 0.58 b] pirrol- 9-carbonitrilo ciclodextrina
3- (4-bromofeniltio) -8-oxo-8fí- hidroxipropil-?- 0.39 0.98 acenafto [1 , 2-b] irrol - 9-carbonitrilo ciclodextrina
3- (4 -bromofeniltio) -8-oxo-8H- hidroxipropi 1-?- 0.18 0.48 acenafto [1, -b] pirrol- -carbonitrilo ciclodextrina
3- (4-aminofeniltio) -8-oxo-8ff- hidroxipropil-?- 0.25 0.81 acenafto [1 , 2-b] pirrol- 9-carbonitrilo ciclodextrina
6- (4 -aminofeniltio) -8-oxo-8f/- hidroxipropil -?- 0.28 0.96 acenafto [1 , 2-b] irrol- 9-carbonitrilo ciclodextrina
Ejemplo 18: Preparación y caracterización de un complejo de b-ciclodextrina y ácido 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carboxílico
Ácido 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1,2-b] pirrol-9-carboxílico (0.263 g, 0.75 mmoles) y ?,?'-carbonildiimidazol (0.179 g) se disolvieron en 3 mL de DMSO. Después de que la mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente, se le adicionaron ?-ciclodextrina (0.6485 g, 0.5 mmoles) y 4 mL de trietanolamina . La reacción se dejó durante 18 h a temperatura ambiente. Al término de la reacción, se adicionaron al reactivo aproximadamente 200 mL de acetona. En condiciones de descompresión el depósito se separó. El depósito resultante se purificó en una columna de intercambio iónico y el producto resultante se lavó con una mezcla disolvente de metanol y agua, después de que la solución se liofilizó se obtuvieron 0.42 g de ácido 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carboxílico/Y-ciclodextrina con un rendimiento de 25%.
Los resultados de detección por resonancia magnética protónica y espectrometría de masas fueron los siguientes: 1H NMR (400M, D20-d6) (ppm) 8.87 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 8.58-8.55 (m, 2H) , 7.91 (t, J = 8.5 Hz , 1H) , 7.39 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 5.03 (m,8H), 3.83(m, 8H) , 3.80(m, 8H) , 3.74(m, 8H) , 3.72-3.70 (m, 3 -N (CH2* ) 2 (CH2) 2S , 4H) , 3.59 (m,
8H) , 3.52 (m, 8?) , 2.98-2.96( ra, 3 -? (CH2 ) 2 (CH2) 2*S , 4?) ; (ESI) m/z (?+?) - (1629 m/z) .
Los resultados caracterizados por difracción de rayos X de monocristal mostraron que la ?-ciclodextrina presentó una serie de picos finos a 12° y 15-23°, mientras que el compuesto ácido 3-tiomorfolinil-8-oxo-8tf-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carboxílico sólo mostró picos finos a 11° y 7o. Sin embargo, el complejo presentó un nuevo pico fino a 6° y el pico fino a 11° desapareció y también el complejo mostró una serie de picos finos a 14-18° y 20~25°. El complejo dio nuevos picos finos relativos al compuesto y la ciclodextrina, esto indicó que se había formado el complejo.
Después de que el compuesto ácido 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1 , 2-b] pirrol-9-carboxílico formó el complejo con la ?-ciclodextrina, obviamente aumentó la solubilidad en agua. La ecuación de ajuste de la curva de solubilidad de fases fue Y = 0.68 + 0.14 ? X. La solubilidad en agua del compuesto ácido 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1 , 2-b] pirrol-9-carboxílico aumentó 16.5 veces respecto a la solubilidad original 0.68 M a 11.2 M.
Preparación y caracterización de otros complejos:
Igual que el Ejemplo 18, se incluyeron otros compuestos en la misma serie que formaron complejos con
diferentes clases de ciclodextrinas . Los productos también se caracterizaron por espectroscopia ultravioleta, método espectrofluorométrico, espectroscopia de dicroísmo circular, espectroscopia de infrarrojo, análisis termogravimétrico y SEM a fin de comprobar la formación de los complejos. El cambio en la solubilidad de los compuestos y sus complejos antes y después de la formación del complejo, se había determinado para fines de comparación a través del experimento de solubilidad de fases. Los resultados a detalle se presentan en la Tabla 2.
A partir de la Tabla 2 se puede observar que la solubilidad de los compuestos heterocíclicos acenafto que formaron complejos con diferentes clases de ciclodextrinas, aumentó mucho en comparación con la de los compuestos como tal .
Tabla 2
Compuestos heterocíclicos Solubilidad de los Solubilidad de acenafto para formación de Ciclodextrinas compuestos los complejos complejos (uM) (µ?)
3- (p-raetilfenoxi) -8-oxo-8H- ?-ciclodextrina 0.58 4.32
acenafto[l, 2-b] pirrol-9-carboxamida
Ácido 3- (4-bromofeniltio) -8-oxo- ?-ciclodextrina 0.55 8.63
8H-acenafto [1, 2 -b] pirrol-9-carboxílico
3 -tiomorfolinil- 8-oxo- 8H- ?-ciclodextrina 0.65 9.85
acenafto [1 , 2-b] pirrol- 9-carboxamida
3- (p-raetilfenoxi) -8-???-8/?- 2 -hidroxipropi1- ß- 0.58 4.90 acenafto [1, 2-b] pirrol-9- ciclodextrina
carboxamida
Ácido 3- (4 -bromofeniltio) -8-oxo- metil-ß- 0.55 4.80
8/í-acenafto [1, 2 -b] pirrol- 9- ciclodextrina
carboxilico
3-tioraorfolinil-8-oxo-8H- hidroxipropi1-?- 0.65 10.20 acenaf o[l, 2-b] pirrol-9- ciclodextrina
carboxamida
Parte III: Determinación de las propiedades fisicoquímicas de compuestos heterociclicos acenafto y sus compuestos de inclusión y complejos con ciclodextrina
Ejemplo 19: Determinación del grado en el que son análogos de BH3 de los compuestos por medio del ensayo de polarización de fluorescencia
Un péptido Bid BH3 (aminoácidos: 79-99:
QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR) con 21 aminoácidos se sintetizó y se marcó con 6-carboxifluoresceína N-succinimidil éster (FAM) como etiqueta fluorescente (FAM-Bid) en el extremo N. El sistema de reacción que se utilizó en el experimento de unión competitiva fue la proteína GST-Bcl-2 (40 nM) o la proteína Mcl-1, la cual se disolvió en el amortiguador de reacción (100 mM K3P04, pH 7.5; 100 pg/ml de ?-albúmina bovina; 0.02% de azida de sodio) junto con el polipéptido FAM-Bid (5 nM) . En una placa de 96 pocilios, se adicionaron 100 µ?> del sistema de reacción en cada pocilio. Luego, se
le adicionó 1 µ?? de diferentes concentraciones de solución madre de 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo para determinación disuelto en DMSO hasta que una concentración final según los requisitos del diseño experimental. Mientras, se prepararon dos grupos de control, uno con el sistema de reacción que sólo contenía Bcl-2 o Mcl-1 y FAM-Bid (equivalente a 0% de inhibición) , el otro con el sistema de reacción que sólo contenía péptido FAM-Bid. Después de 4 horas de incubación, la placa de 96 pocilios se analizó mediante un equipo con marcador enzimático. El valor de polarización fluorescente (mP) se analizó a longitud de onda de emisión de 485 nm excitada y generada por una longitud de onda de 530 nm. El valor Ki se dedujo según la fórmula para el cálculo. Los resultados experimentales se muestran en la Figura 1. La constante de unión competitiva entre el compuesto y la proteína Bcl-2 fue 310 nM.
Los grados de análogo de BH3 de otros 9 compuestos se determinaron con el método experimental descrito en lo anterior. La constante de unión entre los compuestos y las proteínas Bcl-2 y Mcl-1 también fueron en grados nM. Los resultados a detalle se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3
Ejemplo 20: Determinación del grado en el que son análogos de BH3 de los compuestos por medio de transferencia de energía de polarización de fluorescencia intracelular (FRET - fluorescence polarization energy transfer)
2 g de plásmidos Bcl-2-CFP y Bax-YFP se transfectaron por separado o simultáneamente en células Hela según el método de coprecipitación con fosfato de calcio, 24 horas después, las células se inocularon en una placa de 6 pocilios (2xl05 células/pocilio) y se le adicionó el compuesto a determinar 3-tiomorfolinil-8-oxo-
8H-acenafto [1 , 2 -b] pirrol- 9-carbonitrilo disuelto en DMSO hasta llegar a la concentración final (2, 5, 10 y 15µ?) . 24 horas después (véase la Figura 2) , las células se lavaron con PBS tres veces. El valor de fluorescencia se determinó mediante un equipo con marcador enzimático de fluorescencia GENIOS (TECAN, Suiza) . En el experimento dependiente del tiempo, las células transfectadas se inocularon en una placa de 6 pocilios, después de lo cual, se les adicionaron 40 µ? del compuesto. 3, 6 y 24 más tarde (Figura 3), se determinaron las intensidades de fluorescencia por medio de un lector de placas. Para el grupo celular en el cual sólo de transfectó el plásmido Bcl-2-CFP, se registraron los valores a la longitud de onda de emisión de 475 nm y la longitud de onda de excitación a 433 nm. Para el grupo celular en el cual sólo de transfectó el plásmido Bax-YFP, se registraron los valores a la longitud de onda de emisión de 527 nm y la longitud de onda de excitación a 505 nm. Para el grupo celular en el que se cotransfectaron los plásmidos Bcl-2-CFP y Bax-YFP, se registraron los valores a las longitudes de onda de emisión de 527 nm y 475 y la longitud de onda de excitación de 433 nm. La relación entre las intensidades de fluorescencia a las longitudes de onda de 527 nm y 475 nm fue el valor FRET. El valor FRET para el grupo de control en el que el plásmido se transfectó solo, se fijó como 1.0. Esto significa que no se dio la
transferencia de energía de polarización de fluorescencia para las dos proteínas. En las células cotransfectadas , el valor FRET aumentó hasta 2.0 debido a la interacción de la proteína Bcl-2 y la proteína Bax y a que la interferencia con la interacción entre las dos proteínas aumentó y el valor FRET disminuyó con el incremento en la concentración del medicamento y el tiempo. La vitalidad celular se determinó con el método MTT. Los resultados experimentales se muestran en las Figuras 2 y 3. Cuando la concentración de los compuestos llegó a 2 µ?, la interacción entre Bcl-2 y Bax se pudo interferir después de 3 horas y los resultados muestran una tendencia de dependencia entre concentración y tiempo.
Otros 7 compuestos se determinaron con el mismo método experimental descrito en lo anterior, experimentalmente se ha demostrado que todos los compuestos tenían la función de simular la proteína BH3 -only en las células y es obvio que pueden interferir con la interacción entre Bcl-2 y Bax en diferentes condiciones de concentración y tiempo. Los resultados a detalle se presentan en la Tabla 4.
En donde la concentración y el tiempo significan que el compuesto detectado interfirió con la interacción entre las proteínas Bcl-2 y Bax a esa concentración durante el periodo de tiempo.
Tabla 4
Ejemplo 21: Determinación del grado en el que son análogos de BH3 de los compuestos por medio de localización conjunta entre la proteína Bax y el condriosoma
5 g del plásraido Bax-YFP se trasfectaron en células MCF-7 por el método de coprecipitación con fosfato de calcio, 24 horas más tarde, las células se inocularon en una placa de 6 pocilios (0.2xl06 células/pocilio) y se le adicionaron 10 µ? del compuesto a determinar 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo . 6 horas después, las células se lavaron con PBS y se protegieron de la luz con 50 nM de Mito Tracker
Red CMXRos (sondas específicas para condriosoma; rojo) durante 10 minutos. Luego, las células se lavaron tres veces con PBS y se generó la imagen fluorescente con microscopía confocal láser Radiance2000 (Bio-Rad, USA) . Mientras, se llevó a cabo un barrido de doble canal, un canal se usó para escanear la fluorescencia de color verde de la proteína Bax-YFP y el otro canal se usó para escanear la fluorescencia de color rojo de la sonda CMXRos indicativa del condriosoma. La circunstancia de localización conjunta se visualizó al sobreponer las imágenes de los dos canales. Cuando se localizó la proteína Bax en el condriosoma, la fluorescencia verde y roja superpuestas se convirtieron en color naranja, como se muestra en la Figura 4. En comparación, la Figura 5 mostró que la proteína BAX no se pudo inducir a desplazarse hacia el condriosoma, es decir, no funcionó la localización conjunta .
Otros 8 compuestos se determinaron con el mismo método experimental que se describió en lo anterior. Los resultados mostraron que todos los compuestos manifestaron la función de impulsar a la proteína BAX a desplazarse hacia el condriosoma, lo cual indicó que todas tenían la función de simular a la proteína BH3-only en las células. Los resultados a detalle se muestran en la Tabla 5. En donde la concentración y el tiempo se refieren a que el
compuesto detectado simuló a la proteína BH3 -only e indujo a la proteína BAX a desplazarse hacia el condriosoma a esa concentración durante el periodo de tiempo.
Tabla 5
Ejemplo 22: Evaluación experimental de la propiedad de los análogos de BH3 mediante la citotoxicidad de los compuestos en función de BAX/BAK
3 g de plásmido de interferencia BAX/BAK se trasfectaron en células MCF-7 con el método de coprecipitación con fosfato de calcio, 24 horas más tarde, las células se recolectaron. La expresión después de que las proteínas BAX y BAK interfirieron con el ARN se detectó por análisis Western y los grupos celulares sin
transfección del plásmido se trataron en forma similar y se establecieron como grupo de control . Las células transfectadas se inocularon en una placa de 96 pocilios (lxlO5 células/pocilio) , el experimento de control del grupo celular sin transfección de plásmido se llevó a cabo en paralelo. Se adicionó el compuesto 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo a determinar, según el gradiente de concentración diseñado antes del experimento. 48 horas después, la vitalidad celular se determinó por MTT. Los resultados experimentales se muestran en la Figura 6, el gosipol como análogo no especifico de BH3 se trató en paralelo. Los resultados mostraron que el 3 -tiomorfolinil- 8 -oxo- 8H-acenafto [1 , 2 -b] pirrol-9-carbonitrilo tuvo citotoxicidad de dependencia absoluta de BAX/BAK.
Otros 8 compuestos (a los que se hace referencia como compuestos (D~©) también se determinaron con el mismo método experimental descrito en lo anterior, los resultados mostraron que los evaluado también tenían características de dependencia absoluta de BAX/BAK. Estos compuestos fueron los siguientes:
© 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo; © 3- (4-bromofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9- carbonitrilo ;
® 6- (4-aminofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-
b] pirrol-9-carbonitrilo;
©3 , 6-di (4-bromofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1,2-b] pirrol-9-carbonitrilo;
©3 , 6-di (4 -aminofeniltio) - 8 -oxo- 8H-acenafto [1,2-b] pirrol-9-carbonitrilo;
© 3- (3-fluorofenilformil) -8-oxo-8H-acenafto [1,2-b] pirrol-9-carbonitrilo;
® 6- ( tienil-2-metoxi) -8 -oxo-8H-acenafto [1,2-b]pirrol-9- carbonitrilo;
® ácido 3-fenoxi-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9- carboxilico.
Ejemplo 23: Detección de la inhibición de los compuestos frente a las proteínas Mcl-1 y Bel -2 por medio de transferencia Western
Se recolectó la muestra de células y se fragmentó con solución de lisis celular 1?106/50µ1 (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8; 2% SDS; 10% glicerol; 50 mM DTT; 0.01% azul de bromofenol) a baja temperatura, luego la solución se centrifugó y se extrajo en sobrenadante proteico. La muestra se llevó a ebullición a 100°C durante 5 minutos y luego se separó por electroforesis en SDS-PAGE 12% y se transfirió. La proteína de interés se detectó por medio del anticuerpo correspondiente. La expresión de la proteína de interés en las células se detectó por medio de anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano en
combinación con el método de coloración ECL. La inhibición del compuesto de prueba 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo frente a las proteínas Mcl-1 y Bcl-2 presenta por separado en las Figuras 7 y 8. Se puede observar en las figuras que las bandas de las proteínas Bcl-2 y Mcl-1 se hacen gradualmente más ligeras y a medida que el tiempo para el compuesto de prueba actúa en las células tumorales, desaparecen. Esto significa que el compuesto presentó inhibición frente a estas dos proteínas. La concentración de las bandas de proteína en las imágenes Western se determinó por análisis semicuantitativo y tratamiento de normalización con el software de sistema de imagen KODAK Gel Logic 1500. La concentración de las bandas de proteína se muestra en las Figuras 9 y 10.
También se evaluaron los siguientes 8 compuestos utilizando el mismo método que se describió en lo anterior y se puede observar que todos ellos presentaron inhibición de las proteínas Bcl-2 y Mcl-1. Estos compuestos incluyen:
© 8 -oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo; © 3- (4-bromofeniltio(-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo;
® 6- (4-aminofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9-carbonitrilo;
©3 , 6-di (4 -bromofeniltio) - 8 -oxo- 8H-acenafto [1,2-b] pirrol-9-carbonitrilo;
©3 , 6 -di (4 -aminofeniltio) - 8 -oxo- 8H-acenafto [1,2-b] pirrol-9-carbonitrilo;
© 3-fenoxi-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-?-ter-butilamida;
® 6- (tienil-2-metoxi) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9- carbonitrilo ;
©4- (tetrahidro-2tf-piranil-4-oxi) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo .
Los resultados de regulación por disminución de la proteína cl-1 y la proteína Bcl-2 para estos compuestos a partir del análisis semicuantitativo, se presentan respectivamente, en las Tablas 6 y 7:
Tabla 6: Resultados de regulación por disminución de la proteína Mcl-1 para los compuestos ©-© a partir del análisis semicuantitativo
Tabla 7: Resultados de regulación por disminución de la proteína Bcl-2 para los compuestos ©-© a partir del análisis semicuantitativo
Compuestos © © © T © © ® ©
Control 1 1 1 1 1 1 1 1
2 horas 0.78 0.66 0.79 0.68 0.72 0.80 0.69 0.71
6 horas 0.69 0.35 0.49 0.49 0.43 0.56 0.40 0.38
Ejemplo 24: Comparación de la inhibición de las proteínas Mcl-1 y Bcl-2 entre los compuestos heterocíclicos acenafto y sus compuestos de inclusión y complejos con ciclodextrina por medio de transferencia Western
Las células se inocularon en una placa de 6 pocilios (2xl05 células/pocilio) . En el grupo del compuesto, el compuesto 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] irrol-9-carbonitrilo se disolvió en DMSO hasta que la concentración final llegó a 10 µ?. En el grupo de inclusión, se adicionó la inclusión de ?-ciclodextrina, disuelta en agua y equivalente a 10 µ? del compuesto. 24 horas más tarde, las células se lavaron tres veces con PBS, la muestra de células se recolectó y se fragmentó con solución de lisis celular 1?106/50µ1 (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8; 2% SDS; 10% glicerol; 50 mM DTT; 0.01% de azul de bromofenol) a baja temperatura, luego la solución se centrifugó y se extrajo en sobrenadante proteico. La muestra se llevó a ebullición a 100 °C durante 5 minutos y luego se separó por electroforesis en SDS-PAGE 12% y se transfirió. La proteína de interés se detectó por medio del anticuerpo correspondiente. La expresión de la proteína de interés en las células se detectó por medio de anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano en combinación con el método de coloración ECL. Los resultados
de detección se muestran en la Figura 11. En la figura se puede observar que la inhibición de los compuestos de inclusión de ?-ciclodextrina de 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo frente a las proteínas Be1-2 y Me1-1, obviamente fue mayor que las de los compuestos como tal. Es decir, es obvio que los compuestos de inclusión con ?-ciclodextrina aumentaron la capacidad de inhibición de las proteínas Bcl-2 y Mcl-1. La concentración de las bandas de proteína en las imágenes Western se determinó por análisis semicuantitativo y tratamiento de normalización con el software de sistema de imagen KODAK Gel Logic 1500. La concentración de las bandas de proteína se muestra en las Figuras 12 y 13.
En este ejemplo, el 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo incorporado en la ciclodextrina, 2-hidroxipropil- -ciclodextrina, metil- -ciclodextrina e hidroxipropil-y-ciclodextrina y los compuestos siguientes se detectaron con el mismo método descrito en lo anterior. Los resultados mostraron que los compuestos de inclusión tienen mayor capacidad de inhibición que la de los compuestos como tal, frente a las proteínas Bcl-2 y Mcl-1 en las células.
© 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9-carbonitrilo ; © 3- (4-bromofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo;
® 6- (4-aminofeniltio) - 8 -oxo- 8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo;
©3 , 6-di (4-bromofeniltio) - 8 -oxo- 8H-acenafto [1,2-b] pirrol-9-carbonitrilo;
©3 , 6-di (4-aminofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1,2-b] irrol-9-carbonitrilo;
©4- (tetrahidro-2H-piranil-4 -oxi) -8-OXO-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo .
Los resultados de regulación por disminución de la proteína Mcl-1 y la proteína Bcl-2 para estos compuestos y sus compuestos de inclusión a partir del análisis semicuantitativo, se presentan respectivamente, en las Tablas 8 y 9 :
Tabla 8: Resultados de regulación por disminución de la proteína Mcl-1 para los compuestos ©-© y sus compuestos de inclusión a partir del análisis semicuantitativo
© ® ® © © ©
Control 1 1 1 1 1 1
Compuestos 0.77 0.69 0.70 0.69 0.75 0.80
Compuestos 0.63 0.35 0.49 0.57 0.60 0.66
de
inclusión
Tabla 9: Resultados de regulación por disminución de 1 proteína Bel -2 para los compuestos ©-© y sus compuestos inclusión a partir del análisis semicuantitativo
En este ejemplo, otras clases iguales de compuestos, como 3 - (p-metilfenoxi) - 8 -oxo- 8H-acenafto [1 , 2 -b] pirrol-9-carboxamida, ácido 3- (4- bromofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9-carboxílico, 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carboxamida acomplejada con ?-ciclodextrina, 2-hidroxipropil- -ciclodextrina, metil- -ciclodextrina o hidroxipropil-y-ciclodextrina, se evaluaron con el mismo método descrito en lo anterior. Los resultados experimentales mostraron que los complejos de estos compuestos con ciclodextrina tienen mayor capacidad de inhibición que la de los compuestos como tal, frente a las proteínas Bcl-2 y Mcl-1 en las células.
Ejemplo 25: Comparación de la inhibición de las proteínas
Mcl-1 y Bcl-2, entre los compuestos y los compuestos de inclusión en un modelo tumoral in vivo, por medio de transferencia Western
Ratones Kunming (en China) se dividieron al azar en grupos, con 10 ratones en cada grupo. Las células cultivadas de carcinoma hepatoma H22 se inocularon por vía subcutánea en la axila de los ratones, en una cantidad de 200 L/ratón. Después de portar las células cancerosas durante cinco días, se formó el tumor subcutáneo. Luego, se administraron el compuesto 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo y su compuesto de inclusión con ?-ciclodextrina por inyección peritoneal, y el compuesto a detectar incorporado en la ?-ciclodextrina se administró por vía oral. Las condiciones de detección consistieron en:
Grupo de control blanco: los ratones no se trataron de ninguna forma después de contraer el cáncer;
Grupo de control ©: se administró a los ratones una inyección peritoneal de solución de DMSO cada tercer día después de contraer el cáncer, 10 días en total;
Grupo de control ©: se administró a los ratones una inyección peritoneal de solución de ciclodextrina cada tercer día después de contraer el cáncer, 10 días en total;
Grupo experimental © : se administró a los ratones una inyección peritoneal de solución en DMSO, equivalente a 0.03 mg/kg de peso corporal, del compuesto, cada tercer día después de contraer el cáncer, 10 días en total;
Grupo experimental ©: se administró a los ratones una inyección peritoneal de solución en DMSO, equivalente a 0.3 mg/kg de peso corporal, del compuesto, cada tercer día después de contraer el cáncer, 10 días en total ;
Grupo experimental ®: se administró a los ratones una inyección peritoneal de solución acuosa del compuesto de inclusión, equivalente a 0.3 mg/kg de peso corporal, del compuesto, cada tercer día después de contraer el cáncer, 10 días en total;
Grupo experimental ©: se administró a los ratones una inyección intragástrica de solución acuosa del compuesto de inclusión, equivalente a 0.3 mg/kg de peso corporal, del compuesto, cada tercer día después de contraer el cáncer, 10 días en total;
Durante el periodo experimental, cada dos semanas se determinó el diámetro longitudinal (a) y el diámetro más corto (b) , perpendicular al diámetro longitudinal, del tumor. El volumen grueso del tumor se determinó según la fórmula: l/2ab2. Se observó el tiempo de supervivencia del animal. La proporción de inhibición del tumor se calculó por el volumen del tumor en el cuadragésimo día. Los resultados mostraron que:
Grupo experimental © (grupo de inyección de la solución en DMSO de los compuestos) : La proporción de
inhibición del tumor fue 22.3%;
Grupo experimental ® (grupo de inyección de los compuestos de inclusión) : La proporción de inhibición del tumor fue 61.5%;
Grupo experimental © (grupo de administración oral de los compuestos de inclusión) : La proporción de inhibición del tumor fue 43.7%;
El tiempo promedio de supervivencia del animal en el grupo de control fue de 28 ± 2.1 días, la vida promedio del animal en el grupo del compuesto fue de 33 + 3.1 días, el tiempo promedio de supervivencia del animal en el grupo de inyección de los compuestos de inclusión fue de 48 ± 5.1 días y el tiempo promedio de supervivencia del animal en el grupo de administración oral de los compuestos de inclusión fue de 42 ± 1.1 días. El resultado del tratamiento estadístico fue de P<0.05.
Después de que los ratones murieron o se sacrificaron, el tumor subcutáneo se extrajo. Se utilizó un volumen 1:3 de solución salina fisiológica para preparar un homogeneizado de tejido que se utilizó en la preparación de una suspensión celular. La expresión de las proteínas Bcl-2, Mcl-1 en las células tumorales se detectó por medio del mismo método de detección western descrito en el Ejemplo 24. Los resultados se presentan en la Figura 14, en donde, la banda de proteína en la línea de electroforesis 6 fue
más ligera que la de la línea de electroforesis 5. Esto indicó que la capacidad de inhibición de los compuestos de inclusión frente a la proteína Bcl-2, Mcl-1 in vivo fue mayor que la de los compuestos como tal.
El 3-tiomorfolinil-8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9-carbonitrilo incorporado en -ciclodextrina, 2-hidroxipropil- -ciclodextrina, metil- -ciclodextrina e hidroxipropil-y-ciclodextrina y los compuestos siguientes tuvieron los mismos efectos antitumorales in vivo:
© en las mismas condiciones que el grupo experimental ©, la proporción de inhibición del tumor del 8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo fue aproximadamente de 60%; en las mismas condiciones que el grupo experimental ®, la proporción de inhibición del tumor del compuesto 29-1 incorporado en la y-ciclodextrina fue aproximadamente de 80%;
© en las mismas condiciones que el grupo experimental ©, la proporción de inhibición del tumor del 3- (4-bromofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo fue aproximadamente de 40%; en las mismas condiciones que el grupo experimental ®, la proporción de inhibición del tumor del compuesto 29-2 incorporado en 2-hidroxipropil- -ciclodextrina fue aproximadamente de 60%;
® en las mismas condiciones que el grupo experimental ©, la proporción de inhibición del tumor del
6 - (4 -aminofeniltio) -8 -oxo- 8H-acenafto [1 , 2 -b] pirrol- 9-carbonitrilo fue aproximadamente de 30%; en las mismas condiciones que el grupo experimental (D, la proporción de inhibición del tumor del compuesto 29-3 incorporado en ?-ciclodextrina fue aproximadamente de 40%;
© en las mismas condiciones que el grupo experimental ©, la proporción de inhibición del tumor del 3 , 6-di (4- bromofeniltio) - 8 -oxo- 8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo fue aproximadamente de 78%; en las mismas condiciones que el grupo experimental ®, la proporción de inhibición del tumor del compuesto 29-4 incorporado en metil- -ciclodextrina fue aproximadamente de 85%;
© en las mismas condiciones que el grupo experimental ®, la proporción de inhibición del tumor del 3 , 6-di (4 -aminofeniltio) - 8 -oxo- 8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carbonitrilo fue aproximadamente de 50%; en las mismas condiciones que el grupo experimental ®, la proporción de inhibición del tumor del compuesto 29-5 incorporado en ?-ciclodextrina fue aproximadamente de 60%;
© en las mismas condiciones que el grupo experimental ©, la proporción de inhibición del tumor del 4- (tetrahidro-2H-piranil-4-oxi) -8-oxo-8Jí-acenafto [1,2-b]pirrol-9- carbonitrilo fue aproximadamente de 40%; en las mismas condiciones que el grupo experimental ©, la proporción de inhibición del tumor del compuesto 29-6
incorporado en -ciclodextrina fue aproximadamente de 55%;
La proporción de inhibición del tumor de los otros compuestos fue entre 30% y 50%. La proporción de inhibición del tumor de los compuestos de inclusión con ciclodextrina, en general, fue mayor que la de los compuestos como tal (P<0.05).
Los siguientes compuestos acomplejados con ?-ciclodextrina, 2-hidroxipropil-P-ciclodextrina, metil- -ciclodextrina, hidroxipropil-y-ciclodextrina, también manifestaron tener mayor capacidad de inhibición de las proteínas Bcl-2 y Mcl-1 y mayor proporción de inhibición del tumor que las de los compuestos como tal .
En donde :
La proporción de inhibición del tumor del 3- (p-metilfenoxi) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol- 9-carboxamida fue de 30%, y al formar complejo con metil- -ciclodextrina, la proporción de inhibición del tumor llegó aproximadamente a 38%;
La proporción de inhibición del tumor del ácido 3- (4-bromofeniltio) -8-oxo-8H-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carboxílico fue de 45%, y al formar complejo con hidroxipropil- -ciclodextrina, la proporción de inhibición del tumor llegó aproximadamente a 55%;
La proporción de inhibición del tumor del 3-tiomorfolinil-8-oxo-8íí-acenafto [1, 2-b] pirrol-9-carboxamida
fue de 45%, y al formar complejo con 2-hidroxipropil- -ciclodextrina, la proporción de inhibición del tumor llegó aproximadamente a 60%;
Claims (6)
1. Un compuesto heterocíclico acenafto que tiene la siguiente fórmula estructural: en donde : (I) R^XR5, tiofeno metoxilo, tiofeno metilamino o tiomorfolinilo, R2=H, R3 =H, R4=CN, COOH, COOR6 o CONHR7; (II) R^H, R2=XR5, tiofeno metoxilo, tiofeno metilamino o tiomorfolinilo, R3=H, R4=CN, COOH, COOR6 o CONHR7 ; (III) R=H, R2=H, R3=H, XR5, tetrahidropiran-4 -oxi-, tetrahidrotiapiran-4-oxi- , tiofen metoxilo, tiofen metilamino o tiomorfolinilo, R4=CN; (IV) R^XR5, R2=H, R3=XR5, R4=CN; en donde : X=0, S, carbonilo, éster o amida; R5= a: (CH2)nAr -{o,m,p)Y, Y = CH3, N02, Ph, F, Cl, Br, CF3, 0CH3, SCH3 O NH2 ; n=0~4; b: tetrahidropirano o tetrahidrotiapirano; R6 = CH3 o C2HS; R7 = CH3, C2H5 o Ar.
2. El compuesto de inclusión con ciclodextrina del compuesto heterocíclico acenafto según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de inclusión con ciclodextrina se prepara según el método siguiente: © pesar una cantidad de ciclodextrina y adicionarla a una cierta cantidad de agua, luego, calentar con agitación hasta que se forme la solución saturada, en donde la ciclodextrina es -ciclodextrina, -ciclodextrina, 2-hidroxipropil- -ciclodextrina, metil- -ciclodextrina o hidroxipropil- -ciclodextrina; pesar una cantidad del compuesto heterocíclico acenafto para inclusión, en donde, la relación molar entre el compuesto y la ciclodextrina es 1:3-10; (3) disolver el compuesto heterocíclico acenafto para inclusión en acetona con una concentración de 5-10 mg/mL y añadir gota a gota la solución resultante a la solución acuosa de ciclodextrina en líneas, después calentar y agitar durante 1 a 6 días a temperatura de 40 a 65 °C hasta que el depósito se separa de allí; © filtrar la solución obtenida y lavar la torta de filtración con una pequeña cantidad de agua destilada, luego, extraer los compuestos en estado libre con una pequeña cantidad de acetona. Después de secar a una temperatura de 50 a 70 °C y condiciones de vacío durante 24- 48 horas, se obtiene el compuesto de inclusión en ciclodextrina del compuesto heterocíclico acenafto según la reivindicación 1.
3. El complejo con ciclodextrina del compuesto heterocíclico acenafto según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de inclusión con ciclodextrina se prepara según el método siguiente: © pesar ciclodextrina seca y el compuesto heterocíclico acenafto que va a formar el complejo, la relación molecular entre la ciclodextrina y el compuesto heterocíclico acenafto es 1:1.5-3; en donde la ciclodextrina es -ciclodextrina, ?-ciclodextrina, 2-hidroxipropil- -ciclodextrina, metil- -ciclodextrina o hidroxipropil-y-ciclodextrina; (D mezclar el compuesto heterocíclico acenafto que formará el complejo, con N, N' -carbonildiimidazol en una relación molar de 1:1-2, luego, disolverlo en sulfóxido de dimetilo (DMSO) hasta que la concentración del compuesto heterocíclico acenafto que formará el complejo sea 0.2-0.5 mmoles/mL en solución de DMSO, luego, agitar a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos; (3) Adicionar la ciclodextrina que se pesó en el paso © y adicionar 0.1-0.3 mmoles/mL de trietanolamina en la solución de DMSO y dejar que la reacción se lleve a cabo durante 18 a 24 horas a temperatura ambiente; © adicionar 0.50-1.0 mg/mL de acetona en el sistema de reacción del paso 3, la materia depositada se separa de allí en condiciones de descompresión; © después de filtrar y purificar se obtiene el complejo de ciclodextrina del compuesto heterocíclico acenafto según la reivindicación 1.
4. Uso del compuesto heterocíclico acenafto según la reivindicación 1, en la fabricación de inhibidores de proteínas de la familia Bcl-2, análogos de BH3.
5. Uso del compuesto de inclusión con ciclodextrina del compuesto heterocíclico acenafto según la reivindicación 2, en la fabricación de inhibidores de proteínas de la familia Bcl-2, análogos de BH3.
6. Uso del complejo con ciclodextrina del compuesto heterocíclico acenafto según la reivindicación 3, en la fabricación de inhibidores de proteínas de la familia Bcl-2, análogos de BH3.
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