CN103159832A - 具有神经保护作用的肽及其制备方法、药物组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肽、编码所述肽的核苷酸序列、包含所述肽的药物组合物以及所述肽的制药用途。本发明提供的肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。所述肽可以干扰MLK3与PSD-95的结合，抑制神经细胞凋亡过程中MLK3的活化及其下游的细胞信号转导，从而产生神经保护作用，具有良好的药物应用前景。

Description

具有神经保护作用的肽及其制备方法、药物组合物和用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体而言，本发明涉及一种具有神经保护作用的肽、其制备方法、含有这种肽的药物组合物及所述肽的制药用途。

背景技术

MLK3(混合性谱系激酶，Mixed lineage kinase 3)是MAPKKK(促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶)家族的MLKs亚家族成员，它通过磷酸化作用激活MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)通路的丝/苏氨酸蛋白激酶，是JNK3(c-Jun N末端激酶家族成员)上游重要激酶(Gallo KA等人，Nature reviews，2002年9月，3(9)：663-72；Ip YT等人，Curr Opin Cell Biol，1998，10：205-219)。MLK3由SH3(Src homology 3)结构域、激酶结构域、亮氨酸拉链结构域、Cd4c2/Rac相互作用的结构域组成，可以通过277位苏氨酸和281位丝氨酸发生自身磷酸化，又可通过其自身SH3结构域的连接发挥自身抑制功能，MLK3的自身磷酸化和它的激活有着密切的关系(Hua Z等人，J Biol Chem，2001，276：45598-45603)。

研究发现，阻断MLK3-MKK7-JNKs信号通路对脑缺血、β-淀粉样肽(Aβ)诱导的神经元损伤有显著的保护作用(Pan J等人，Neuroscience2005；131(1)：147-59)。以上结果提示，MLK3信号通路参与中枢神经系统疾病，它和许多促凋亡和抗凋亡因子相互作用并最终决定细胞的生与死，这种平衡的失常将会导致各种疾病的发生。因此，MLK3是中枢神经系统疾病新的治疗靶点。目前受体酪氨酸激酶TrkA(酪氨酸激酶)抑制剂K252a虽然可抑制MLK3，以抑制细胞的凋亡，促进细胞的生长发育(Kaneko M等人，J Med Chem，1997，40：1863-1869)，但K252a并不是特异性的MLK3抑制剂。CEP1347和CEP11004虽然是MLK3抑制剂，但它抑制病理状态下过度活化的MLK3的同时也抑制了MLK3的生理功能，在Ⅱ期临床实验中失败(Parkinson Study Group PRECEPT Investigators.Neurology 2007；69：1480-1490)。

研究表明，PSD-95(突触后致密物质95，postsynaptic density-95)与MLK3的特异结合可促进MLK3的活化。PSD-95是组成兴奋性突触的突触后致密物质的一个关键蛋白，它属于膜相关的鸟苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinases，MAGUK)蛋白家族中的一员，又被称为脚手架蛋白，在兴奋性突触的PSD中募集信号蛋白(Kennedy MB，TrendsNeurosci，1997，20：264-268；Sheng M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2001，98：7058-7061；Sheng M等人，Science，2002，298：776-780；Sheng M.J Cell Sci，2001，114(Pt 7)：1251)。PSD-95由N-端3个PDZ(PSD-95/Dlg/ZO-1)结构域，1个SH3结构域和C-端无活性的鸟苷酸激酶(GK)结构域组成(AndersonJM.1996 Curr Biol，6：382-384；Gonzalez-Mariscal L等人，Semin Cell Dev Biol，2000，11：315-324)。PSD-95通过其SH3结构域与MLK3的C末端富含脯氨酸(proline-rich region domain，PRD)的结构域结合形成PSD-95-MLK3复合体(Whitmarsh AJ等人，Davis RJ.Science，1998，281：1671-1674；SavinainenA等人，JBiol Chem，2001，276：11382-11386)。本发明人的研究表明MLK3在生理状态下活性较低，与PSD-95不结合，但病理状态下MLK3与PSD-95结合增加，并且被激活，从而导致下游信号通路激活而引起细胞凋亡，因此阻断MLK3与PSD-95在病理状态下的结合从而阻断下游信号通路的激活对细胞损伤具有保护作用。

发明内容

本发明人研究发现靶向于PSD-95-MLK3复合体的肽对病理状态下过度激活的MLK3有抑制作用，从而可用作神经保护药物。因此，开发这种MLK3特异性肽抑制剂对研究和开发神经元保护药物，预防和/或治疗脑卒中、神经退行性疾病、癫痫以及疾病的免疫炎性反应等的治疗药物具有重要意义。

因此，本发明的一个目的为针对现有MLK3抑制剂的不足，提供新型肽，所述肽可以与MLK3竞争性结合PSD95的SH3结构域，从而抑制病理状态下MLK3-JNK3信号通路的过度激活。

本发明的另一个目的为提供可以表达所述肽的核苷酸；

此外，本发明的再一个目的为提供包含所述肽的药物组合物；

本发明的目的还在于提供所述肽的制药用途。

本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种具有神经保护作用的肽，所述肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示：

SEQ.ID.NO.1：Pro Glu Pro Glu Glu Pro Arg Arg Ser Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

在下文其它部分，SEQ.ID.NO.1所示肽又被简称为P2。P2中未加下划线的部分可以竞争性地结合PSD95，干扰MLK3与PSD-95的结合，抑制神经细胞凋亡过程中MLK3的活化及其下游的细胞信号转导，产生神经保护作用；带下划线部分的序列为穿膜肽序列，其帮助小肽进入细胞。穿膜肽序列是一种带正电荷的短肽，具有穿膜活性，能将外源性的生物学分子如多肽、寡核苷酸、DNA、蛋白、质粒甚至颗粒型物质携带入多种哺乳动物活细胞，并且对细胞不会产生毒副作用，这种设计已被公认(Vives E等人，J Biol Chem，1997，272：16010-16017)。P2中的穿膜序列可以是其他任何能帮助该肽进入细胞的序列，因此将其修改为本领域现有或未来开发的穿膜序列而得到的肽都应该在本发明的保护范围之内。下表1列举了一些常用的穿膜序列，除此之外新型穿膜肽或穿膜序列仍在不断被报道，本发明不能一一列举。

表1现有常用穿膜序列

表1中Ac-为乙酰基；Cya为半胱胺。

本发明还提供了一种编码上述肽的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ.ID.NO.2所示。

上文所述肽或核苷酸可以通过常规的生物合成或化学合成方法制备。因此，本发明还提供了所述肽或核苷酸的制备方法，该方法为生物合成或化学合成方法。

本发明还提供一种构建体，该构建体包含编码上述核苷酸序列。这种构建体可以是将所述核苷酸转移到宿主细胞的转化载体或在宿主细胞中表达上述肽的表达载体。

实验证明，上文所述肽可以广泛应用于开发神经元保护药物及缺血性脑中风、神经退行性疾病等的预防和/或治疗药物。因此，再一个方面，本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上述肽、核苷酸序列或者构建体中的一种或多种。优选地，该药物组合物包含上述肽。

根据治疗和给药需要，所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。载体可选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂，调味剂等。

本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液及注射液等多种形式。上述各种剂型均可以按照药学领域的常规方法制备。

又一个方面，本发明还提供了上述肽、核苷酸或构建体在制备用于预防和/或治疗神经系统疾病、免疫炎性疾病的药物和/或神经元保护药物中的用途。其中，神经系统疾病选自神经退行性疾病，例如包括老年痴呆和帕金森病；癫痫以及脑卒中中的一种或几种。

所述药物可以为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液或注射液。

综上所述，本发明提供的肽可以干扰MLK3与PSD-95的结合，抑制神经细胞凋亡过程中MLK3的活化及其下游的细胞信号转导，从而产生神经保护作用。因此，采用本发明提供的肽可以作为活性成分用于制备神经元保护药物，预防和/或治疗脑卒中、神经退行性疾病(例如老年痴呆、帕金森病)、癫痫以及疾病免疫炎性反应等的预防和/或治疗药物，其在医学领域、尤其是神经医学领域具有良好的应用前景。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示了本发明提供的肽P2对Aβ诱导的神经元凋亡的保护作用；

图2显示了本发明提供的肽P2对Aβ诱导的神经元毒性的最佳抑制作用的浓度和时间；

图3显示了本发明提供的肽P2对Aβ诱导的MLK3与PSD-95的结合的特异性抑制；

图4显示了本发明提供的肽P2对大鼠全脑缺血再灌注诱导的海马神经元损伤具有保护作用。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

其中，部分试剂和试验肽购买情况如下：

抗-PSD-95(1∶1500)、抗-Pyk2(1∶1000)购自Sigma公司；抗-MLK3(1∶1500)、抗-肌动蛋白(1∶1000)、抗-GluR6(1∶1500)购自Santa Cruz生物技术公司；抗-Src(1∶1000)、抗-NR2A(1∶1000)购自Upstate生物技术公司。

Aβ25-35购自Sigma公司，并且将Aβ25-35溶于无菌双蒸水中，配成1mmol/L的贮存液，在37℃放置7天后成为寡聚化的Aβ25-35，工作浓度10μmol/L；

试验肽P1(SEQ.ID.NO.3)、P2(SEQ.ID.NO.1)、P3(SEQ.ID.NO.4)，对照肽C1(SEQ.ID.NO.5)和C2(SEQ.ID.NO.6)合成于上海生工生物工程技术服务有限公司。

以pcDNA3.1(+)(购自Promega公司)为载体，参考生产商说明和常规分子克隆方法，并根据文献(1)金磊等人，徐州医学医学院学报，2010年，30(2)：82-85、(2)岳军等人，“徐州医学医学院学报，2007年，27(6)：354-357、(3)齐静等人，徐州医学医学院学报，2007年，27(1)：20-22、(4)J.-H.Luo等人，Neuropharmacology 2002年，42：306-318、和(5)Cai-Ping Du等人，Biochem.J.2009年，417：277-285等构建GluR6、Src、Pyk2、MLK3、PSD-95表达质粒，其分别能表达GluR6、Src、Pyk2、MLK3、PSD-95，用于研究相互作用。NR2A表达质粒为浙江大学罗建红教授惠赠，其表达NR2A。

采用SigmaStat软件分析统计实验数据，实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)，多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法(LSD)，实验组之间比较采用q检验(Newman-keuls test)，P＜0.05为统计学有显著性差异。

实施例中采用免疫印迹(immunoblot；IB)用于检测蛋白质的表达。按裴林等人建立的方法(Acta Pharmacol Sin，2000，21：695-700)。蛋白质样品经SDS-PAGE分离后，电转至NC膜上，1％BSA中封闭3h，一抗4℃孵育过夜，洗膜，二抗30℃孵育2h，洗膜后加入显色剂(BCIP/NBT；Promega，Madison，WI)，流水洗涤终止反应，扫描，图象分析软件(Bio-Rad)分析。

实施例中采用免疫沉淀(immunoprecipitation；IP)用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。按裴林等人建立的方法(Acta Pharmacol Sin，2000，21：695-700)。样品蛋白中加入缓冲液稀释四倍。加入蛋白A/G-Sepharose孵育45min/4℃，离心除去非特异结合的蛋白质。上清与特异抗体4℃孵育4h，蛋白A/G-Sepharose孵育2h/4℃，离心收集免疫沉淀物，用上述IP缓冲液洗涤三次，收集沉淀样品用于免疫印迹。

实施例1 P2对β-淀粉样肽(Aβ)诱导的神经毒性的抑制作用

本发明人前期研究结果证明Aβ可以诱导神经元的凋亡，MLK3-MKK7-JNK3信号通路参与了Aβ诱导的神经细胞的凋亡(参见Xu Y，Hou XY，*Liu Y，and Zong YY.Journal of Neuroscience Research，2009，87：918-927)，因此本实施例研究了试验肽P1、P2和P3是否能够抑制Aβ诱导的神经细胞的凋亡。

将怀孕17-19天SD大鼠(清洁级，购自上海Sippr-BK公司)断头处死，速取胎鼠至冰冷的高糖DMEM中，体视镜下剥取皮质，0.25％胰酶消化，终止反应后分散成单细胞，计数，以0.5×10⁵/cm²的密度接种于多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，每3-4小时更换无血清培养基，隔日半换液一次，培养14天后的皮质神经元用于实验。其中，多聚赖氨酸预处理具体包括：将无菌L型多聚赖氨酸(购自sigma公司)用硼酸(0.15mol/L，pH 8.4)配制成终浓度为0.1mg/ml的无菌溶液，铺满培养瓶或培养板底部，置于37℃，5％CO2培养箱中，4小时后取出用无菌双蒸水洗3遍后待用。

1、三种试验肽P1、P2和P3的凋亡抑制作用

在采用上述方法培养了14天的皮质神经元培养物中加入寡聚化的Aβ25-35(使其在培养物中的终浓度为10μmol/L)，培养条件同上。在Aβ25-35加入后9小时以10μmol/L的终浓度分别加入三种肽P1、P2和P3中的各一种，同时将不加入Aβ25-35和试验肽、并在同等条件下培养的皮质神经元作为空白对照。使各组自加入寡聚化的Aβ25-35时总共培养24小时，培养条件同上。

根据已建立的DAPI染色法(参见Jiang Q等人，Brain Res，2000，887：285-292；Gu Z等人，Neuroreport，2001，12：897-900)检测细胞凋亡。DAPI染色结果显示，神经元的自然凋亡率(空白对照)是28.6％，Aβ作用24小时后凋亡率可高达72.0％，P2可以使Aβ诱导的凋亡率降低至46.9％(P＜0.05)，而P1和P3均没有降低Aβ诱导的神经元的凋亡。结果具体见图1，其中图1A为DAPI染色的培养神经元的荧光显微镜照片照片，其中箭头指示凋亡的神经元；图1B的柱状图显示了凋亡细胞的百分比。上述结果表明：P2可以抑制Aβ诱导的神经元的凋亡。

为了进一步研究P2对Aβ诱导的神经元凋亡的最佳保护作用的浓度与时间，进行了下列实验：

2、P2的凋亡抑制浓度

在培养了14天的皮质神经元中加入寡聚化的Aβ25-35(使其在培养物中的终浓度为10μmol/L)，培养条件同上。在Aβ25-35加入后9小时分别加入P2(终浓度分别为5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L)，同时将不加入Aβ25-35和试验肽、并在同等条件下培养的皮质神经元作为空白对照。Aβ25-35作用24小时后DAPI染色检测神经元凋亡率。结果显示：神经元的自然凋亡率(空白对照)是29.1％，Aβ作用24小时后神经元凋亡率达到75.2％，5μmol/L P2使神经元的凋亡率降低至65.9％，10μmol/L P2使神经元的凋亡率降低至51.5％，20μmol/L P2使神经元的凋亡率降至46.9％(结果见图2A)。

3、P2的凋亡抑制作用曲线

为了检测P2的作用时间曲线，在培养了14天的皮质神经元中加入寡聚化的Aβ25-35(使其在培养物中的终浓度为10μmol/L)，分别于Aβ25-35加入后6小时、9小时和12小时分别加入10μmol/L P2、对照肽C1和C2(10μmol/L)，同时将不加入Aβ25-35和试验肽、并在同等条件下培养的皮质神经元作为空白对照，于Aβ25-35加入24小时后DAPI染色检测神经元凋亡率。结果显示：P2在Aβ作用后9小时加入保护作用最明显，细胞凋亡率为47.6％，与Aβ组相比神经元凋亡率降低了25.8％(图2B)。而在Aβ作用后9小时加入对照肽C1和C2(10μmol/L)，结果显示：C1和C2均不能降低Aβ诱导的神经元的凋亡。

上述结果提示：P2在Aβ作用后9小时加入保护作用最明显，最佳作用浓度为10μM。

实施例2 P2对Aβ诱导的MLK3与PSD-95结合的特异性抑制

PSD-95是一种脚手架蛋白，可以结合多种信号蛋白，PSD-95通过其PDZ结构域结合N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体亚单位2A(NR2A)、人海藻酸受体亚基(GluK2)、Src激酶；PSD-95以其SH3结构域结合MLK3、富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2等。为了检测P2在抑制PSD-95和MLK3的结合的同时是否会抑制PSD-95与其他信号蛋白的结合，进行了以下实验：

在含10％胎牛血清的DMEM中培养COS7细胞(购自中国科学院上海细胞库)。其中，将COS7细胞以2×10⁶/ml接种于培养皿中，于5％CO₂孵箱中培养24h至COS7细胞密度为80～90％左右时，使用LipofectAMINE2000(Invitrogen)，根据生产商说明在COS7细胞中分别共转染表达NR2A和PSD-95、GluR6和PSD-95、Src和PSD-95、Pyk2和PSD-95、MLK3和PSD-95的重组表达质粒，转染18小时后分别加入P2，使P2在培养液中的终浓度为10μmol/L，加入6小时后收获细胞，进行下述检测。

如图3A所示，在共转染NR2A和PSD-95、GluR6和PSD-95、Src和PSD-95重组表达质粒的实验组中，分别用NR2A、GluR6、Src的抗体进行免疫印记(IP)，接着用PSD-95的抗体进行免疫沉淀(IB)检测NR2A-PSD-95、GluR6-PSD-95和Src-PSD-95之间的相互作用。分别用NR2A、GluR6、Src和PSD-95的抗体通过免疫印迹法检测各蛋白的表达水平。结果显示：P2不能抑制NR2A-PSD-95、GluR6-PSD-95和Src-PSD-95的结合。

如图3B所示，分别用MLK3，Pyk2抗体进行IP，接着用PSD-95的抗体IB检测Pyk2-PSD-95和MLK3-PSD-95的相互作用。分别用MLK3，Pyk2，PSD-95的抗体通过免疫印迹法检测各蛋白的表达水平。图中肌动蛋白actin的表达显示各泳道蛋白质上样量一致。结果显示：P2可以特异性抑制MLK3-PSD-95的结合，但不能抑制Pyk2-PSD-95的结合。

上述实验结果显示：P2不影响NR2A、GluR6、Src和PSD-95的结合(图3A)，P2也没有影响Pyk2和PSD-95的结合，但可以明显的抑制MLK3和PSD-95的结合(图3B)。因此P2可以特异性抑制PSD-95和MLK3的结合。

实施例3 P2对海马神经元损伤的保护作用

大鼠海马CA1区神经元是对全脑缺血再灌注损伤最敏感的区域，为检测P2对大鼠全脑缺血再灌注诱导的海马神经元损伤是否具有保护作用，进行了下列实验：

采用四动脉结扎法，参照Liu Y等人，Brain Res，2001，909：51-58建立SD大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，其中全脑缺血15分钟，在缺血前侧脑室注射待检测药物或对照药物。在脑缺血再灌注第5天，焦油紫染色观察注射药物对缺血再灌注损伤后海马CA1区锥体神经元存活的影响。具体操作如下：

P2及对照肽C1都溶于双蒸水中且终浓度为5mmol/L，于缺血前30min侧脑室注射给药，剂量为50nmol/只大鼠。建立假手术组(sham)和缺血对照组(I/R5d)，其中假手术组(sham)同实验组一样建立全脑缺血模型，但不进行缺血，不注射任何药物；缺血对照组(I/R5d)同实验组一样建立全脑缺血模型，同样进行缺血15分钟，但不注射任何药物。

侧脑室注射方法：乙醚麻醉大鼠后，将其固定于大鼠脑立体定位仪上。切开头皮暴露颅骨，使颅骨保持水平位置。双氧水(H₂O₂)擦拭暴露前囟点。12号针头钻孔，位置为：前囟后0.8mm，旁开：1.5mm，下针深度：从颅骨表面向下3.5mm。注射速率：1μl/min，体积为10μl，注射完后留针5min。

结果显示：正常细胞，呈圆形，核淡染，细胞膜及细胞核清晰可见(图4A中a和e“假手术”组)。缺血再灌注5天，存活的正常细胞非常少，锥体细胞大量死亡，可观察到核深染固缩(图Fig4A中的b和f)。与缺血再灌组相比，P2组明显减少了海马CA1区锥体神经元的损伤(图Fig4A中的c和g)，而对照肽C1组与缺血再灌注相比无明显差别(图Fig4A的d和h)。结果提示：P2能够抑制大鼠全脑缺血再灌注诱导的海马CA1区神经元的损伤，而对照肽C1则无的神经保护作用。

图4B为图4A的统计图。结果显示：P2组与对照组相比有统计学意义，结果提示：P2对缺血再灌注造成的神经元损伤有明显的保护作用。

总之，本发明研究结果表明本发明设计的肽P2可以干扰MLK3与PSD-95的结合，抑制神经细胞凋亡过程中MLK3的活化及其下游的细胞信号转导，从而产生神经保护作用。因此，本发明设计的肽P2为活性成分的药物可以作为神经元保护药物，脑卒中、神经退行性疾病(老年痴呆、帕金森病)、癫痫以及疾病的免疫炎性反应等的预防和/或治疗药物。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种具有神经保护作用的肽，所述肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.编码根据权利要求1所述肽的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.根据权利要求1所述肽和根据权利要求2所述核苷酸的制备方法，所述制备方法为生物合成或化学合成方法。

4.一种构建体，所述构建体包含根据权利要求2所述的核苷酸序列。

5.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的肽或根据权利要求2所述的核苷酸序列或者根据权利要求4所述的构建体；

优选地，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的肽。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、调味剂、香味剂等的一种或多种；

优选地，所述药物组合物为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液或注射液。

8.根据权利要求1所述的肽或根据权利要求2所述的核苷酸序列或者根据权利要求4所述的构建体在制备用于预防和/或治疗神经系统疾病、免疫炎性疾病的药物和/或神经元保护药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述神经系统疾病选自神经退行性疾病、癫痫以及脑卒中中的一种或几种；

优选地，所述神经退行性疾病例如包括老年痴呆和帕金森病。

10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述药物选自片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液和注射液。

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