CN102558357B - 一种可以治疗心肌缺血再灌注损伤的p38α拮抗肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一条具有穿膜功能的多肽，该多肽能够特异阻断p38α和TAB1相互作用，抑制TAB1介导的p38α自我磷酸化，并能够在心肌缺血再灌注损伤中减轻心肌梗死面积和心肌酶释放。本发明涉及该多肽的氨基酸序列，该多肽与p38α的作用模式，以及该多肽的活性鉴定。具体而言，分别在293T细胞中、大鼠原代心肌细胞中和大鼠动物模型中，分别观察到了该多肽对于p38α和TAB1相互作用的阻断效应，对p38α自我磷酸化的抑制作用，和对缺血再灌注心肌的保护作用。本发明还公开了该多肽对于p38α自我磷酸化即旁路活化的抑制作用，并由于该作用，使得该多肽能够在体内减轻心肌缺血再灌注损伤。该多肽所涉及的氨基酸构成在制备抗心肌损伤药物中具备潜在用途。

Description

一种可以治疗心肌缺血再灌注损伤的p38α拮抗肽

技术领域

本发明涉及基于人p38α功能表位结构特征设计获得新型非ATP竞争型p38α拮抗肽。具体而言，即利用p38α-TAB1相互作用复合物模型及两者之间相互作用特异表位的结构信息，通过计算机辅助高通量筛选方法获得一条靶向p38α的拮抗肽；经生物信息学相关手段确定其合适的基因序列或者蛋白序列，应用分子生物学技术进行基因全合成或者拮抗肽的合成，并通过细胞生物学实验或者动物实验对拮抗肽的功能进行评价。 

背景介绍 

p38属于MAPKs信号家族成员，在细胞分化、增殖、死亡和炎症反应中发挥重要作用。p38能够在多种胞外刺激下活化，从而介导体内多样的生物学过程[Ono K，Han J.The p38 signal transduction pathway：activation and function.Cell Signal.2000 Jan；12(1)：1-13.Zarubin T，Han J.Activation and signaling of the p38MAP kinase pathway.Cell Res.2005 responses from molecular mechanisms to therapeutics.Trends Mol Med.2009 Aug；15(8)：369-79.Epub 2009 Aug 6.Review.Wagner EF，Nebreda AR.Signal integration by JNK and p38 MAPK pathways in cancer development.Nat Rev Cancer.2009 Aug；9(8)：537-49.Review.Chang CI，Xu BE，Akella R，et al.Crystal structures of MAP kinase p38 complexed to the docking sites on its nuclear substrate MEF2A and activator MKK3b.Mol Cell.2002Jun；9(6)：1241-9.Ge B，Gram H，Di Padova F，et al.MAPKK-independent  activation of p38alpha mediated by TAB1-dependent autophosphorylation ofp38alpha.Science.2002 Feb 15；295(5558)：1291-4.]。p38有两种活化模式：经典活化模式和旁路活化模式。在经典活化模式中，p38经由MAP3Ks(MAPK Kinase Kinases)→MKKs(MAPK Kinases)→MAPKs的蛋白级联磷酸化模式而活化；在旁路活化模式中，主要是由接头蛋白TAB1介导，p38α发生自我磷酸化而活化。TAB1介导的p38的旁路活化仅发生在p38α亚型而不发生于其他亚型，这是因为TAB1特异的与p38α发生相互作用，而且具有特异的相互作用表位[Salvador JM，Mittelstadt PR，Guszczynski T，et al.Alternative p38 activation pathway mediated by T cell receptor-proximal tyrosine kinases.Nat Immunol.2005Apr；6(4)：390-5.Epub 2005 Feb 27.Tanoue T，Adachi M，Moriguchi T，et al.A conserved docking motif in MAP kinases common to substrates，activators and regulators.Nat Cell Biol.2000 Feb；2(2)：110-6.Tanoue T，Maeda R，Adachi M，et al.Identification of a docking groove on ERK and p38 MAP kinases that regulates the specificity of docking interactions.EMBO J.2001 Feb 1；20(3)：466-79.Zhou H，Zheng M，Chen J，et al.Determinants that control the specific interactions betweenTAB1 and p38alpha.Mol Cell Biol.2006 May；26(10)：3824-34.Tanno M，Bassi R，Gorog DA，et al.Diverse mechanisms of myocardial p38 mitogen-activated protein kinase activation：evidence for MKK-independent activation by a TAB1-associated mechanism contributing to injury during myocardial ischemia.Circ Res.2003 Aug 8；93(3)：254-61.Epub 2003 Jun 26.Lu G，Kang YJ，Han J，et al.TAB-1 modulates intracellular localization of p38 MAP kinase and downstream signaling.J Biol Chem.2006 Mar 3；281(9)：6087-95.Epub 2005 Dec 28.]。 

近年来的研究发现，TAB1与p38α相互作用在一些病理性反应中发挥重要作 用，如心肌缺血再灌注损伤。在心肌缺血再灌注损伤中，再灌后的心肌细胞凋亡是再灌注损伤的主要原因。研究发现，TAB1诱导的p38α旁路途经活化是介导心肌细胞凋亡的主要分子基础。所以，抑制再灌注中p38α的旁路活化是防止心肌缺血再灌注损伤的关键[Galasso G，Schiekofer S，Sato K，et al.Impaired angiogenesis in glutathione peroxidase-1-deficient mice is associated with endothelial progenitor cell dysfunction.Circ Res.2006 Feb 3；98(2)：254-61.Epub 2005 Dec 22.Fiedler B，Feil R，Hofmann F，et al.cGMP-dependent protein kinase type I inhibitsTAB1-p38 mitogen-activated protein kinase apoptosis signaling in cardiac myocytes.J Biol Chem.2006 Oct 27；281(43)：32831-40.Epub 2006 Aug 29.Shi J，Guan J，Jiang B，et al.Amyloidogenic light chains induce cardiomyocyte contractile dysfunction and apoptosis via a non-canonical p38alpha MAPK pathway.Proc Natl Acad Sci U S A.2010 Mar 2；107(9)：4188-93.Epub 2010 Feb 11.]。相关研究表明，TAB1与p38α相互作用的区域具有一定特异性，不同于其他激酶或底物与p38α结合，阻断两者相互作用对炎症信号的传递影响不明显，效应专一。所以针对TAB1与p38α相互作用是作为设计防治心肌缺血再灌注损伤药物的理想策略。而目前，尚没有特异阻断TAB1与p38α相互作用从而抑制p38旁路活化的抑制分子。 

本发明利用计算机辅助分子设计方法，基于获得的TAB1与p38α相互作用表位特征，从理论上获得了一条特异性阻断两者相互作用的短肽(PT5)，并通过细胞和动物实验对其活性进行了评价。 

发明内容

本发明提供了以前未有过的特异阻断TAB1与p38α相互作用的一条p38α拮抗肽，并公开了该拮抗肽的氨基酸序列。 

本发明提供的p38α拮抗肽，基于TAB1与p38α相互作用特异性表位设计并筛选。TAB1与p38α相互作用特异性表位由专利“人p38α与TAB1新功能表位以及用途(专利号申请：201010123504.4)”提出并保护。 

本发明公开的p38α拮抗肽的特征是设计获得的功能性拮抗分子，能够在体外阻断TAB1与p38α相互作用，并抑制p38α自我磷酸化。 

本发明公开的p38α拮抗肽能够在心肌缺血再灌注过程中，减轻心肌梗死面积和心肌酶释放。 

本发明公开了p38α拮抗肽的合成及生物学活性验证过程。 

图1、基于人p38α-TAB 1相互作用结构信息通过计算机辅助分子设计，获得人p38α拮抗肽PT5，及其与p38α相互作用模式。 

图2、293T细胞中，PT5阻断p38α与TAB1相互作用。 

图3、293T细胞中，PT5抑制TAB1介导的p38α自我磷酸化。 

图4、原代心肌细胞中，PT5抑制缺、复氧过程中p38α旁路活化。 

图5、大鼠心肌缺血再灌注过程中，PT5显著减轻心肌梗死面积。A：对照组；B：4mg/kg给药组；C：8mg/kg给药组；^*：p＜0.05；^**：p＜0.01；图中深色部分为正常心肌，箭头所指浅色部分为梗死灶。 

图6、大鼠心肌缺血再灌注过程中，PT5显著降低心肌酶乳酸脱氢酶的释放。con：假手术组；model：生理盐水组；L30：结扎后30分钟给药组；B15：结扎前15分钟给药组；L55：结扎后55分钟给药组。 

下面将描述p38α拮抗肽生物学活性鉴定方法。说明相关方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的方法，或者采用修改的方法。 

1、p38α拮抗肽的合成 

利用人p38α空间结构信息以及p38α与TAB1相互作用复合物空间结构信息，通过计算机辅助分子设计，获得能够特异性阻断人p38α-TAB1相互结合的新型拮抗肽；并按照相关氨基酸理化性质设计了阴性对照肽，该阴性对照肽不与p38α结合，在生物学实验中作为阴性对照使用。为了方便描述，p38α特异性拮抗肽称为PT5，阴性对照肽称为PT1 

PT5由27个氨基酸组成。PT5在C-端为穿膜序列，为HIV-TAT蛋白序列，共10个氨基酸分子；N-端为p38α拮抗肽活性序列，共15个氨基酸分子；中间以两个脯氨酸(Proline)连接。PT1与PT5的穿膜策略相同，在C-端为HIV-TAT蛋白序列，N-端为无功能序列。由于在动物体内多肽易受二肽酶等作用而发生降解，我们同时合成了反向D构型的PT5和PT1。设计获得的PT5、PT1由杭州多肽合成公司合成，并经过HPLC分析，得到纯度大于95％的多肽200mg。 

2、p38α拮抗肽的生物学活性鉴定 

a)阻断TAB1与p38α相互作用实验 

在293T细胞中，转染TAB1和p38α的真核表达载体；6h后，加入PT5或者PT1，；18h后，裂解细胞，收集细胞裂解液上清，加入ProteinA/G琼脂糖珠子和抗FLAG抗体，4℃混旋3h；用缓冲液洗涤琼脂糖珠子3次，最后向珠子中加入电泳上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳和Western Blot分析。 

b)抑制过表达TAB1诱导的p38α自我磷酸化实验 

在293T细胞中，转染TAB1和p38α的真核表达载体；6h后，加入PT5或者PT1；16h后，裂解细胞，收集细胞裂解液上清，进行SDS-PAGE电泳和WesternBlot分析。 

c)抑制心肌细胞缺、复氧过程中的p38α旁路活化 

分离并培养大鼠心肌细胞，在细胞大部分贴壁并搏动后，缺氧培养4小时，复氧15分钟后，裂解细胞，进行SDS-PAGE电泳和Western Blot分析。 

d)大鼠心肌缺血再灌注中的心肌梗死面积测定实验 

6-8周龄的大鼠，结扎心脏左前降支1小时，恢复左前降支供血，24小时候取心脏，进行横切，并使用四氮唑蓝染色的方法，确定并计算心肌梗死面积。 

e)大鼠心肌缺血再灌注中的心肌酶释放试验 

6-8周龄的原代大鼠，结扎心脏左前降支1小时，恢复左前降支供血，72小时后取外周血上清，进行心肌酶乳酸脱氢酶(LDH)的测定。 

实施例 

一、材料 

p38α野生型质粒在5’端带有FLAG标签，TAB 1野生型质粒在5’端带有XPRESS标签，两个片段分别均克隆到pCDNA3.1(+)载体中；p38α对照肽PT1和p38α拮抗肽PT5为杭州中肽公司合成，纯度在95％以上；293T细胞为实验室常规保存；脂质体购自Invitrogen公司；SD乳鼠为12h内，Wistar大鼠为6-8周的体重在260g-280g的雄性鼠，购自军事医学科学院实验动物中心；其它常用试剂为国产分析纯。 

PT1及PT5的序列见下表以及说明书附表。 

多肽名称	氨基酸序列
		PT1	SEQ ID：1
PT5	SEQ ID：2
		D-PT1	SEQ ID：3
D-PT5	SEQ ID：4

二、方法 

1.在293T细胞中，PT5阻断TAB1和p38α相互作用。 

实验设立阴性对照组，阳性对照组，对照肽组(PT1)和效应肽组(PT5)，共四组。在293T细胞中，过表达TAB1和p38α的真核表达质粒，然后将对照肽PT1和PT5分别加入细胞培养基中；培养一定时间后，将细胞裂解，进行免疫共沉淀实验。具体实施方式如下： 

a)293T细胞处于对数生长期，将其按照4×10⁵/孔种于六孔板中，每组3个孔；24h后，用脂质体2000进行转染，每孔TAB1和p38α各1μg；转染后6h后加入PT1或者PT5，使其终浓度为50μM，继续培养16h。 

b)将6孔板内的细胞上清去净，用PBS洗细胞一次后放于冰上；加入细胞裂解液，每孔200μl，用细胞刮收取细胞，将细胞裂解液收到1.5ml的EP管中；待四组样都收完毕，统一在冰上放置30min；4℃离心15min，12000rpm；离心完毕收取上清，取出20μl作为内参，其余加入Protein A/G beads 20μl，抗FLAG抗体1μ1，在4℃混旋4h；混旋完毕后用洗液洗beads，向EP管内加入1ml洗液，混旋3min后，离心30s，去上清；洗beads的步骤重复4次，混旋和离心均在4℃进行；洗完最后一遍，弃尽上清，向beads中加入2×蛋白上样缓冲液，将beads浸润，于沸水中煮10min后上样。 

c)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 

配制12％丙烯酰胺浓度的电泳胶，电泳条件为每块胶20mA，持续时间为2h。 

d)转印 

转印用PVDF膜在使用前用甲醇浸泡1min；转印使用60V恒压的条件，转印3h。 

e)抗体孵育 

使用抗TAB1和抗FLAG的抗体作为一抗，对转印膜进行孵育，抗体按照1∶1000的比例溶解于5％BSA/TBST溶液中；一抗在4℃孵育过夜；次日取出转印膜，用TBST缓冲液洗膜，每次10min；用辣根酶标记的山羊抗兔二抗对膜进行孵育，室温ih；取出转印膜，用TBST缓冲液洗膜，每次10min。 

f)显影曝光 

使用增强型化学发光液在暗室进行显影，显影使用医用X-光片；显影时间视发光强弱而掌握。 

2.在293T细胞中，PT5抑制TAB1诱导的p38α自我磷酸化。 

实验设立阴性对照组，阳性对照组，对照肽组(PT1)和效应肽组(PT5)，共四组。在293T细胞中，过表达TAB1和p38α的真核表达质粒，然后将对照肽PT1和PT5分别加入细胞培养基中；培养一定时间后，将细胞裂解，进行免疫印迹实验。具体实施方式如下： 

a)293T细胞处于对数生长期，将其按照4×10⁵/孔种于六孔板中，每组1个孔；24h后，用脂质体2000进行转染，每孔TAB1和p38α各1μg；转染时即加入PT1或者PT5，使其终浓度为50μM，继续培养12h。 

b)使用细胞裂解液裂解细胞，每孔120μl；用细胞刮刮取细胞，收集裂解 液于1.5ml的EP管中，12000rpm离心12min；裂解和离心均在4℃进行；离心完毕保留上清，从上清中取出15μl，加入5μl 4×蛋白上样缓冲液，沸水中煮10min，进行蛋白电泳。 

c)余下步骤同“方法1”中的步骤“c”-步骤“f”。抗体为抗FLAG抗体，抗TAB1抗体，抗磷酸化p38抗体。 

3.心肌细胞中，PT5对p38α自我磷酸化的抑制作用 

我们采用心肌细胞先缺氧再复氧的方法在体外模拟缺血再灌注进程。实验设立阴性对照组，对照肽组(PT1)两组和效应肽组(PT5)两组，共五组。分离并培养SD乳鼠的心肌细胞，待细胞大部分都贴壁并已搏动之后，置于氧含量为0.3％的培养箱中培养，3.5h后，加入对照肽或者效应肽始终浓度为50μM，过30min后，换到正常氧含量培养箱中继续培养15min。而后裂解细胞，进行免疫印迹分析。 

a)分离乳鼠心肌细胞 

取12h内的SD乳鼠，酒精消毒后，迅速剪破胸腔，此时乳鼠心脏外露，迅速摘取心脏并置于生理盐水中；取10只心脏后，将心脏用生理盐水洗一遍，去掉生理盐水，用手术剪将心脏剪碎成小组织块状。用胰酶与胶原酶的混合消化液重悬组织块；然后转入50ml消化瓶内消化，加转子以辅助消化；每次消化15分钟，共消化4次；第一次消化上清丢弃，余下三次，每次消化后将上清取出加入到预先准备的血清中。最后将三次消化收集的总细胞一起于2000rpm离心5min；去上清，将细胞用培养基重悬起来，过一次200目筛网，得到细胞悬液，种于6孔板里培养。 

b)心肌细胞培养 

细胞体外培养后24h，心肌细胞应已贴壁并搏动，而此时成纤维细胞还未进入增殖期，六孔板中的心肌细胞一般可以占到80％以上，可以进行实验。 

c)心肌细胞缺、复氧 

大鼠原代细胞分离并培养一天后，实验组更换为缺氧支持液，放入0.3％氧气浓度的低氧培养箱中放置3.5h；分别加入L型、D型的PT1或者PT5，继续放置0.5h；更换为预热的无血清DMEM培养基，在常规培养箱中放置15min，诱导p38α自我磷酸化发生。 

d)余下步骤同余下步骤同“方法1”中的步骤“c”-步骤“f”。一抗为抗大鼠TAB1抗体，抗p38抗体，抗磷酸化p38抗体，抗Actin抗体；二抗为山羊抗兔或者山羊抗鼠抗体。 

4.大鼠心肌梗死面积保护试验 

实验选择体重240-260g的雄性鼠进行试验。实验分为生理盐水对照组，4mg/kg给药组和8mg/kg给药组，每组实验动物保持在10只以上。大鼠采用冠状动脉左前降支结扎法进行缺血再灌注。再灌后，大鼠观查24h；24h后，对存活的大鼠进行解剖，取出心脏进行切片，切片后用四氮唑蓝染色法确定梗死面积。 

a)对大鼠施行麻醉，按照16mg/kg的剂量注射利多卡因。大鼠麻醉后剪开胸腔，暴露心脏，用尼龙丝结扎左前降支；结扎后0.5h经尾静脉按照4mg/kg或者8mg/kg的剂量给大鼠注射穿膜肽PT5，对照组注射等体积生理盐水；0.5h后，去掉尼龙丝，使血液再灌注。 

b)24h后处死存活的大鼠，对心脏进行等距切片，切为5片。配制新鲜红四氮唑染液，按照1％m/v将红四氮唑溶于PB溶液中。对心肌切片进行红四氮 唑染色，37℃，10min；而后10％甲醛固定4h，放于生理盐水中拍照。 

c)用图像软件进行对梗死面积进行计算。实验遵循随机双盲原则。 

5.大鼠心肌酶释放抑制实验 

实验选择体重240-260g的雄性鼠进行试验。实验分为生理盐水对照组和8mg/kg给药组，8mg/kg给药组按照给药时间不同又分为3组，每组实验动物保持在10只以上。大鼠采用冠状动脉左前降支结扎法进行缺血再灌注。再灌注后，大鼠观查72h；72h后，对存活的大鼠抽血，离心后取血清进行心肌酶乳酸脱氢酶(LDH)的浓度测定。 

a)大鼠麻醉后剪开胸腔，暴露心脏，用尼龙丝结扎左前降支；给药时，时间选择为结扎前15min(B15)、结扎后30min(L30)和结扎后55min(L55)，给药量均为8mg/kg。 

b)去掉尼龙丝使血液再灌注。大鼠饲养72h；72h后，取存活的大鼠的外周血，6000rpm离心后取上清，即血清，进行血清心肌酶浓度分析。 

c)使用全自动生化分析仪对心肌酶谱中乳酸脱氢酶(LDH)浓度进行测定。 

Claims (4)

1.人p38α拮抗肽PT5，其是基于人p38α-TAB1相互作用结构信息通过计算机辅助分子设计设计而成，其序列为SEQ ID NO：2。

2.权利要求1的人p38α拮抗肽PT5，其中肽的核心序列为Val⁵，Ser⁶，Lys⁹，Thr¹¹，Asp¹²。

3.权利要求1的人p38α拮抗肽在制备治疗心肌细胞缺血再灌注损伤相关疾病的药物中的用途。

4.权利要求3所述的用途，其中心肌细胞缺血再灌注损伤相关疾病为急性心肌梗死或冠心病。