CN109400717B - 一种具有神经保护作用的小肽及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有神经保护作用的小肽,属于生物医药技术领域,该小肽的氨基酸序列为YGRKKRRQRRRERMESPID。本发明根据GluK2蛋白LBD结构域高度保守序列与NETO2的CUB结合区域设计小肽,并在其前端加上穿梭小肽,使其进入细胞而干扰Gluk2与NETO2的结合,本发明的小肽其可干扰GluK2和NETO2相互结合,明显改善KA诱导癫痫造成的神经元存活情况,因此以该小肽为有效成分的药物可以作为抗癫痫药物,用于癫痫疾病的治疗,这对癫痫疾病的治疗提供新药物作用靶点具有重要意义,可解决现有技术中抗癫痫药物存在不良反应的问题行。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有神经保护作用的小肽,属于生物医药技术领域。
背景技术
癫痫(Epilepsy)是一种慢性中枢神经系统疾病,由中枢神经系统某些神经元群发生突然过度和同步性异常放电所引起的行为异常,在当今六大中枢神经系统疾病的流行程度排名位居第三。目前,全球范围内有超过5000万人患有癫痫,我国约有900万癫痫患者,并且我国每年新增病例40万。癫痫发作引起患者精神障碍或精神发育迟缓,造成脑部疾病,严重威胁着患者的身体健康和生命安全,给个人、家庭和社会带来严重的负面影响,癫痫已经成为一个重要的公共卫生问题。
癫痫动物模型研究表明,癫痫发作可导致海马、杏仁核、大脑皮质、丘脑及小脑等部位神经元丧失,尤其是海马神经元丢失最为明显。关于治疗癫痫的药物目前主要集中在钠通道调节、GABA受体激活剂、兴奋性氨基酸受体拮抗剂及钙离子通道阻断剂等,其中谷氨酸受体拮抗剂主要集中在AMPA和NMDA受体,尽管这些抗癫痫药物在动物实验中对神经元有一定的保护作用,但临床应用上存在一些不良反应,比如,苯二氮卓类有明显的中枢抑制作用,易发生共济失调,久用产生耐受性和依赖性;折叠苯巴比妥和扑米酮具有镇静、嗜睡、眩晕和共济失调等症状;托吡酯(妥泰)具有共济失调、注意力受损、意识模糊、头晕、疲劳、感觉异常、嗜睡和思维异常等不良反应。因此,积极探索癫痫致神经元损伤或丧失的分子机制,对于预防癫痫后神经元损伤,并寻找更好的治疗癫痫的药物作用靶点具有非常重要的理论和临床意义。
癫痫发作时中枢神经系的兴奋性和抑制性失衡与海人藻酸受体(Kainatereceptors,KARs)密切相关,并且脑室注射海人藻酸(kainic acid,KA)诱导的颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)动物模型已经成为研究癫痫发病机制的重要工具。KARs广泛分布在中枢神经系统,在海马组织的突触结构中高度表达,尤其是海马CA3区。KARs既可以定位于突触前末梢,也可以定位于突触后部位,参与调节神经递质释放、突触形成及大脑疾病病理生理过程。在海马DG区至CA3区的苔藓纤维(mossyfibers,MFs)突触前和突触后部位存在的KARs,主要是GluK4和GluK5与GluK2形成的异源四聚体形式,在这一突触结构中,KARs参与突触生理(可塑性)和病理(癫痫)过程。神经纤毛和特罗德样蛋白(neuropilinand tolliod-like proteins,NETO proteins)是近期发现的作为KARs辅助亚基的相互作用蛋白,可以改变KARs的功能及门控特性。NETO蛋白包括NETO1和NETO2两种类型,NETO2可以减慢GluK2谷氨酸门控电流的去激活及脱敏现象,增加通道开放可能性及开放次数。KARs的胞外氨基末端M3-S2门控链接区可以与NETO2结合,进而通过NETO2调节KARs的功能及通道特性。目前,关于NETO2与KARs相互作用方面的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中抗癫痫药物存在不良反应的问题,本发明人对NETO2与KARs相互作用进行深入研究,旨在寻找新的治疗癫痫的药物作用靶点,最终设计出一种具有神经保护作用的小肽,用于干扰GluK2和NETO2相互结合。
技术方案
一种具有神经保护作用的小肽,其氨基酸序列为:YGRKKRRQRRR ERMESPID。
本发明人研究发现,KA诱导大鼠癫痫过程中,海马神经元在KA注射后48小时已经看不到明显的存活细胞,而应用上述小肽干扰GluK2和NETO2相互结合,则明显改善KA诱导癫痫造成的神经元存活情况,这说明NETO2-KARs相互作用可能为治疗癫痫提供一定的药物作用靶点。
上述小肽用于制备抗癫痫药物的用途。
所述抗癫痫药物包含上述小肽和药学上可接受的载体或赋形剂。
所述抗癫痫药物的剂型为注射剂。
本发明的有益效果:本发明提供了一种具有神经保护作用的小肽,其可干扰GluK2和NETO2相互结合,明显改善KA诱导癫痫造成的神经元存活情况,因此以该小肽为有效成分的药物可以作为抗癫痫药物,用于癫痫疾病的治疗,本发明对癫痫疾病的治疗提供新药物作用靶点具有重要意义。
附图说明
图1为KA诱导癫痫大鼠海马组织尼氏染色后的光学显微镜图;
图2为KA诱导癫痫大鼠海马组织的神经细胞数量统计结果;
图3为Neto2-GluK2相互作用及其蛋白表达的免疫印迹结果图;
图4为图3的数据统计结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1具有神经保护作用的小肽的设计
根据GluK2蛋白LBD结构域高度保守序列与NETO2的CUB结合区域(ERMESPID)设计小肽,并在其前端加上穿梭小肽(YGRKKRRQRRR),使其进入细胞而干扰Gluk2与NETO2的结合。具有神经保护作用的小肽的氨基酸序列为:YGRKKRRQRRRERMESPID。小肽由上海强耀生物科技有限公司合成。
实施例2小肽对KA诱导癫痫后神经元损伤的保护作用
(1)大鼠癫痫模型建立
侧脑室给予KA(0.6μg/10μl)致癫痫模型(对照组给予同等剂量的溶剂),SD大鼠(230-250g)借助动物麻醉机用异氟烷麻醉,固定于鼠脑立体定位仪,使颅骨保持水平位置。消毒皮肤,切开头皮暴露颅骨,并用H2O2烧灼暴露前囟点。定位侧脑室:前囟点后0.8mm,右侧旁开1.5mm,颅骨表面向下深度3.5mm。1.5mm钻头钻孔,用微量注射器回抽脑脊液以鉴定位置的正确性。KA诱导癫痫模型建立标准按照Racine分级:1级表现为闭眼,胡须动,面部抽搐,2级为点头,咀嚼伴面部抽搐,3级为一侧前肢抬起、阵挛,4级表现站立常伴两侧前肢痉挛,5级表现站立、扭转并伴有摔倒。出现4级及以上症状时,说明癫痫模型建立成功。
(2)取KA给药致痫后2d时间、给予小肽和对照肽(sham,KA 48h,Tat-GluK2+KA,Tat-scramble-GluK2+KA)的SD雄性大鼠制备石蜡切片,厚度6μm,45℃温水中贴片于明胶处理过的载玻片上,40℃烘烤过夜,再经过3次二甲苯脱蜡,100%、90%、70%梯度乙醇浸水,0.1%焦油紫(Cresyl violet)染色40min,按常规方法70%、80%、95%、100%梯度乙醇脱色,二甲苯透明,中性树脂封片阴干后,光学显微镜观察海马CA3区神经元存活情况,KA诱导癫痫大鼠海马组织尼氏染色后的光学显微镜图见图1,KA诱导癫痫大鼠海马组织的神经细胞数量统计结果见图2。
图1为KA诱导癫痫大鼠海马组织尼氏染色后的光学显微镜图,图2为KA诱导癫痫大鼠海马组织的神经细胞数量统计结果,统计数据分别选取图1海马CA1、CA3/DG区1mm长度内细胞进行计数,ap<0.05 vs CA1 sham组,bp<0.05 vs CA3 sham组,cp<0.05 vs KA 48hCA1组,dp<0.05 vs KA 48h CA3组,由图1和2可以看出,和KA48h组比较,给予干扰肽Tat-GluK2后,存活神经元数量明显增加,这表明Tat-GluK2对KA诱导癫痫性神经元损伤具有保护作用。
实施例3小肽对KA诱导癫痫后GluK2-NETO2相互结合的影响
(1)样品制备
SD雄性大鼠随机分为假手术组sham和KA给药建模后6h、给予小肽和对照肽(sham,KA6h,Tat-GluK2+KA,Tat-scramble-GluK2+KA)。然后快速断头取脑,置于冰冷的PBS中,分离海马CA1区和CA3/DG区,置于液氮中冻存备用。匀浆提取胞浆蛋白,操作在冰浴中进行:液氮中取出海马,按1:10(w/v)加入冰冷的匀浆缓冲液,用Glas-Col匀浆机高速匀浆,每个样品匀浆时间及次数固定,接着用Eppendorf-5840R台式离心机14,000rpm,4℃,30min,转移上清,上清主要为胞浆蛋白。然后用BCA法测定蛋白质浓度,按实验需要分装样品,冻存于-80℃冰箱中。
(2)免疫沉淀和免疫印迹检测GluK2-NETO2相互结合
取等量蛋白样品(800μg分装),分别加入400μl含有蛋白酶抑制剂的免疫沉淀缓冲液(IP buffer),40μl蛋白A预吸附1h,4℃,3000rpm离心5min,取上清,加入1-2μg抗体(anti-NETO2或GluK2)和40μl蛋白A,然后置于旋转混合仪上,4℃过夜。10,000g,4℃,5min离心免疫沉淀样品,弃去上清,再分别加入800μl含有蛋白酶抑制剂的IP buffer,颠倒混匀后,10,000g,4℃,5min离心,重复3次,吸干上清,再分别加入15μl IP buffer和相同体积的2X蛋白上样缓冲液,混匀后100℃沸水中5min,10,000g,3min离心后吸取上清上样,进一步免疫印迹。
取等量样品蛋白质(20μg)或免疫沉淀样品,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分离后,湿转至0.22μm的PVDF膜。将PVDF膜置于封闭液(3%BSA)中室温孵育2-3h或者4℃过夜,加入稀释的一抗(anti-NETO2,anti-GluK2,anti-actin等),4℃孵育过夜或者更长时间,TBST洗膜(3次X 5min),加入HRP标记的二抗,室温孵育40min-1h,TBST洗膜(6次X 5min)。用ECL曝光显色:显影液中显色,定影液中终止反应定影。用扫描仪扫描胶片上的条带并用image J软件分析处理。通过数据分析,观察KA诱导癫痫后GluK2-NETO2相互结合变化。Neto2-GluK2相互作用及其蛋白表达的免疫印迹结果见图3,数据统计结果见图4。
图3中,第一个条带表示Neto2-GluK2相互作用的结果图,第二、三个条带分别为GluK2和Neto2的蛋白表达结果图,第四个条带为内参actin的结果图,从图3中可以看出给予干扰小肽Tat-GluK2可以减弱Neto2-GluK2相互作用,而对照小肽Tat-scram-GluK2则没有明显影响;并且干扰小肽和对照小肽对GluK2和Neto2的蛋白表达没有影响,这表明干扰小肽Tat-GluK2可以特异性阻止Neto2-GluK2相互结合。
根据图3中条带扫描灰度值,并以sham组数据进行标准化,最后进行统计分析(n=3)作图得到图4,图4中,“+”表示进行相应的操作或给予对应的药物,“-”则表示没有。图3结合图4可以得出干扰小肽Tat-GluK2可特异阻止Neto2-GluK2相互结合。
综上:海人藻酸诱导大鼠癫痫过程中,增强GluK2和Neto2相互作用,从而促使海马神经元丢失;而干扰Neto2和GluK2结合则可逆转这一过程,从而对癫痫造成的神经元损伤起保护作用。
Claims (4)
1.一种具有神经保护作用的小肽,其特征在于,其氨基酸序列为:YGRKKRRQRRRERMESPID。
2.权利要求1所述小肽用于制备抗癫痫药物的应用。
3.如权利要求2所述应用,其特征在于,所述抗癫痫药物包含权利要求1所述 小肽和药学上可接受的载体或赋形剂。
4.如权利要求2所述应用,其特征在于,所述抗癫痫药物的剂型为注射剂。
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